Жидкая лекарственная форма конъюгата

ЖИДКАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА КОНЪЮГАТА Настоящее изобретение относится к жидкой фармацевтической композиции, содержащей полипептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, конъюгированный с полимером,причем композиция имеет значение рН в диапазоне от 4,5 до 5,5. Композиция дополнительно содержит сурфактант и необязательно одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Дополнительно, композиция в настоящем изобретении не содержит винной кислоты и ее солей, а также янтарной кислоты и ее солей в качестве буферных веществ и не содержит аминокислот в качестве стабилизаторов. Композиция обладает хорошей устойчивостью при хранении и особенно удобна для профилактики и лечения расстройств и при медицинских показаниях, при которых композиции гранулоцитарных колониестимулирующих факторов рассматриваются как подходящие лекарственные средства. Настоящее изобретение относится к жидкой фармацевтической композиции, содержащей полипептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, конъюгированный с полимером, причем композиция имеет значение рН в диапазоне от 4,5 до 5,5. Композиция дополнительно содержит сурфактант и необязательно одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Дополнительно,композиция в настоящем изобретении не содержит винной кислоты и ее солей, а также янтарной кислоты и ее солей в качестве буферных веществ и не содержит аминокислот в качестве стабилизаторов. Композиция демонстрирует хорошую устойчивость при хранении и особенно удобна для профилактики и лечения расстройств и при медицинских показаниях, при которых композиции гранулоцитарных колониестимулирующих факторов рассматриваются как подходящие лекарственные средства. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) представляет собой гематопоэтический фактор роста, стимулирующий пролиферацию и дифференцировку гематопоэтических клетокпредшественников и активацию зрелых нейтрофилов. G-CSF может способствовать пролиферации нейтрофилов in vitro и in vivo. Человеческая форма G-CSF была клонирована группами из Японии и США в 1986 (см., например, Nagata et al. (1986), Nature 319: 415-418). Природный человеческий гликопротеин существует в двух формах, одна из которых содержит 174, а другая 177 аминокислот. Более распространенная и более активная 174-аминокислотная форма используется при разработке фармацевтических продуктов по технологии рекомбинантной ДНК. Большие количества рекомбинантного G-CSF были продуцированы с помощью полученной генетическим путем Escherichia coli и успешно применялись в медицинской практике для лечения раковых пациентов, страдающих от нейтропении, вызванной химиотерапией. Escherichia coli-продуцированный GCSF представляет собой 175-аминокислотную полипептидную цепь, содержащую дополнительный метионин на N-конце. Белок продуцировался путем экспрессии гена G-CSF в Е.coli и очистки белкового продукта до однородного состояния. Это гидрофобный белок, содержащий 5 цистеиновых остатков, четыре из которых задействованы в образовании дисульфидных связей. Свободный цистеиновый остаток обычно вовлекается в образование агрегатов большего молекулярного веса при хранении в растворе. Агрегаты белков также могут образовываться из окисленных форм белка, которые появляются путем окисления внутренних метиониновых остатков в первичной последовательности белка. Из четырех метиониновых остатков один находится на N-конце и три остальных - внутренние. Окисленные формы белка,содержащие окисленный метионин в положении 122, могут быть отделены от форм, содержащих окисленный метионин в положениях 127 или 138, и от нативного белка путем обычных процедур разделения обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (положения рассчитаны для метионил-G-CSF, состоящего из 175 аминокислот). Рекомбинантный человеческий G-CSF, синтезированный с помощью системы экспрессии Е.coli, называется филграстим (международное непатентованное наименование, МНН). Структура филграстима несколько отличается от природного гликопротеина. Другая форма рекомбинантного человеческого GCSF называется ленограстим (МНН) и синтезируется в клетках яичников китайского хомячка (СНО). Филграстим и ленограстим продаются в Европе под торговыми наименованиями Neupogen и Granocyte соответственно. Однако коммерчески доступные формы рекомбинантного человеческого G-CSF обладают кратковременным фармакологическим действием и часто должны вводиться более одного раза в день в течение всего состояния лейкопении. Молекула с большим сроком полужизни циркуляции в крови снизила бы число введений, необходимых, чтобы облегчить лейкопению и предотвратить последующие инфекционные заболевания. Другая проблема доступных в настоящее время продуктов рекомбинантного человеческого G-CSF состоит в возникновении дозозависимой боли в костях. Так как пациенты испытывают боль в костях как значительный побочный эффект лечения рекомбинантным человеческим G-CSF, то было бы желательно создать продукт рекомбинантного человеческого G-CSF, который бы не вызывал боль в костях, либо по своей природе, либо эффективный в количествах, достаточно малых, чтобы не вызывать или, по меньшей мере, вызывать меньшую боль в костях. Таким образом, очевидна необходимость в усовершенствованных молекулах G-CSF и фармацевтических композициях, содержащих молекулы G-CSF, в виде устойчивых, готовых к использованию композиций. Варианты человеческого G-CSF с измененной структурой белка были опубликованы, например,среди вариантов G-CSF, описанных в WO 01/87925, ЕР 0456200 A, US 6166183, US 6004548, US 5580755,US 5582823, US 5675941, US 5416195, US 5399345, WO 2005/055946 и WO 2006/074467. Также опубликована модификация человеческого G-CSF и других полипептидов для введения по меньшей мере одной дополнительной углеводородной цепи по сравнению с нативным полипептидом(US 5218092). Дополнительно, были опубликованы и исследованы полимерные модификации нативного человеческого G-CSF, включая присоединение полиэтиленгликольных (ПЭГ) групп (US 5824778,US 5824784, WO 96/11953, WO 95/21629 и WO 94/20069). Обычно принимается, что устойчивость белков может быть повышена, а иммунный ответ против этих белков снижен, когда эти белки связаны с полимерными молекулами. WO 94/28024 раскрывает, что физиологически активные белки, измененные ПЭГ, проявляют пониженную иммуногенность и антиген-1 020069 ность и циркулируют в кровяном русле значительно дольше, чем неконъюгированные белки, т.е. обладают сниженной скоростью выведения. В настоящей области известно присоединение синтетических полимеров к пептидному скелету в целях попытки улучшить фармакокинетические свойства гликопротеиновых лекарственных средств. Примером полимера, конъюгированного с пептидами, служит ПЭГ. Использование ПЭГ с целью получить пептидные лекарственные средства показало снижение иммуногенности пептидов. Например, патент US4179337 раскрывает неиммуногенные полипептиды, такие как ферменты и пептидные гормоны, связанные с ПЭГ или полипропиленгликолем (ППГ). В дополнение к сниженной иммуногенности,время выведения из системы кровообращения увеличено благодаря увеличенному размеру ПЭГконъюгата рассматриваемых полипептидов. Пэгфилграстим (МНН) представляет собой ковалентный конъюгат рекомбинантного метионильного человеческого G-CSF (филграстим) и одиночной 20 кДа молекулы монометокси-ПЭГ. Молекула монометокси-ПЭГ ковалентно связана с N-концевым метионильным остатком филграстима. Пэгфилграстим продается в Европе под торговым наименованием Neulasta. Основная форма присоединения ПЭГ и его производных к пептидам представляет собой неспецифическое связывание через аминокислотный остаток пептида (см., например, US 4088538, US 4496689,US 4414147, US 4055635 и WO 87/00056). Другая форма присоединения ПЭГ к пептидам - через неспецифическое окисление гликозильных остатков на гликопептиде (см., например, WO 94/05332). В данных неспецифических методах ПЭГ присоединяется случайным, неспецифическим образом, к реакционноспособным остаткам на пептидном скелете. Случайное присоединение молекул ПЭГ имеет свои недостатки, включая недостаточную однородность конечного продукта и возможность снижения биологической или ферментативной активности пептида. Следовательно, в течение последних лет были предприняты попытки разработать более сайт-специфические методы присоединения синтетического полимера или другой метки к пептиду и было обнаружено, что специфически конъюгированные однородные пептидные лекарственные средства можно получить in vitro с помощью действия ферментов. Такие конъюгаты на основе ферментов имеют преимущества региоселективности и стереоселективности. Два основных класса ферментов для применения в синтезе конъюгированных пептидов представляет собой гликозилтрансферазы(например,сиалилтрансферазы,олигосахарилтрансферазы,Nацетилглюкозаминилтрансферазы) и гликозидазы. Эти ферменты могут быть использованы для специфического присоединения сахаров, которые в дальнейшем могут быть изменены для того, чтобы содержать в себе лекарственные вещества. Альтернативно, гликозилтрансферазы и модифицированные гликозидазы могут быть использованы для точного перенесения модифицированных сахаров на пептидный скелет (см., например, US 6399336 и US 2003/0040037, US 2004/0132640, US 2004/0137557,US 2004/0126838 и US 2004/0142856). Также известны способы, сочетающие как химические, так и ферментативные синтетические элементы (см., например, US 2004/137557). Хорошо известны и подробно описаны в известном уровне технике различные способы конъюгирования полипептидов, таких как G-CSF, с полимерными фрагментами, такими как ПЭГ. Получение гликопэгилированного G-CSF описано, например, в WO 2005/055946. Другая заявка на патент, направленная на получение конъюгатов между G-CSF и фрагментами ПЭГ, - WO 2006/074467. При этом способе такие конъюгаты образуются через гликозильную линкерную группу в неизменном виде, расположенную между и ковалентно присоединенную к полипептиду G-CSF и модифицирующей группе. С помощью действия гликозилтрансферазы конъюгаты образуются как из гликозилированного, так и из негликозилированного полипептидов G-CSF. Гликозилтрансфераза сшивает фрагменты модифицированного сахара либо с аминокислотным, либо с гликозильным остатком на полипептиде. На раскрытиеWO 2005/055946 и WO 2006/074467 явным образом дается ссылка в контексте настоящего изобретения. Кроме ПЭГ, другие полимерные фрагменты также были описаны как подходящие для конъюгирования с G-CSF и другими лечебными белками. WO 02/09766 раскрывает, среди прочих, биосовместимые соединения белок-полимер, продуцированные путем конъюгирования биологически активного белка с производным биосовместимого полимера. Применяемые биосовместимые полимеры представляют собой высокоактивные разветвленные полимеры и получаемые конъюгаты содержат длинный линкер между производным полимера и белком. Примерами биосовместимых полимеров согласно WO 02/09766 служат ПЭГ, ППГ, полиоксиэтилен (ПОЭ), политриметиленгликоль, полимолочная кислота и ее производные,полиакриловая кислота и ее производные, полиаминокислоты, полиуретан, полифосфазен, поли(Lлизин), полиалкиленоксид (ПАО), водорастворимые полимеры, такие как полисахарид, декстран, а также неиммуногенные полимеры, такие как поливиниловый спирт (ПВС) и полиакриламид.WO 94/01483 раскрывает биосовместимые конъюгаты полимеров, образованные путем ковалентного связывания биологически неактивного полимера или производного полимера с фармацевтически чистым синтетическим гидрофильным полимером, через специфические типы химических связей. В качестве природных полимеров и их производных раскрыты полисахариды, такие как гиалуроновая кислота; протеогликаны, такие как хондроитинсульфаты А, В, и С, хитин, гепарин, гепаринсульфат; декстраны,такие как циклодекстран, гидроксиэтилцеллюлоза, простой эфир целлюлозы и крахмал; липиды, такие как триглицериды и фосфолипиды.WO 96/11953 описывает N-концевые химически модифицированные белковые соединения и способы их производства. В частности, описываются соединения G-CSF, получаемые путем связывания водорастворимого полимера с N-концом G-CSF. Примеры водорастворимых полимеров, перечисленные вWO 96/11953, представляют собой сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6 триоксан, сополимер этилен/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры), поли(п-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры ППГ, сополимеры оксида полипропилена/оксида полиэтилена или полиоксиэтилированные многоатомные спирты.WO 97/30148 описывает конъюгаты полипептидов с пониженной аллергенностью, содержащие полимерную молекулу-носитель с двумя или более связанными с ней молекулами полипептида. Эти конъюгаты образуются путем активации полимерной молекулы-носителя, реакции двух или более молекул полипептида с активированной полимерной молекулой-носителем и блокировкой остаточных активных групп соединения. WO 97/30148 перечисляет ряд полимерных молекул-носителей, включая природные или синтетические гомополимеры, такие как многоатомные спирты, полиамины, поликарбоновые кислоты, и гетерополимеры, содержащие по меньшей мере две разные присоединенные группы. Приводятся примеры, включающие в себя звездообразные ПЭГ, разветвленные ПЭГ, поливиниловые спирты, поликарбоксилаты, поливинилпирролидоны и поли-D,L-аминокислоты. Конъюгаты в WO 97/30148 также включают в себя такие, которые содержат декстраны, такие как карбоксиметиловый декстран, целлюлозы, такие как гидроксиэтилцеллюлоза или гидроксипропилцеллюлоза, гидролизаты хитозана, крахмалы,такие как гидроксиэтиловые крахмалы или гидроксипропиловые крахмалы, гликоген, агарозу, гуаровую камедь, инулин, пуллулан, ксантановую камедь, каррагинин, пектин, альгиновую кислоту и т.д.WO 03/074087 относится к способу связывания белков с модифицированными полисахаридами, получаемыми из крахмала. Процесс связывания между белком и полисахаридом, гидроксиалкиловым крахмалом, представляет собой образование ковалентной связи между концевой альдегидной группой или функциональной группой, получаемой путем химической модификации указанной концевой альдегидной группы молекулы гидроксиалкилового крахмала, и функциональной группой белка. В качестве реакционноспособной группы белка раскрыты аминогруппы, тиогруппы и карбоксильные группы.WO 2005/014050 описывает получение конъюгатов гидроксиалкилового крахмала (ГАК) и белка G-CSF,где по меньшей мере одна функциональная группа полимера или его производного реагирует по меньшей мере с одной функциональной группой белка, тем самым образуя ковалентную связь. Другие известные в настоящей области документы, относящиеся к ГАК-илированию, предпочтительно к ГЕКилированию (присоединению гидроксиэтилового крахмала), полипептидов, - WO 2005/014655,WO 2005/092390, WO 2007/031266, WO 2005/092928 и WO 2005/092391. Хотя в настоящей области описано несколько подходов к модификации лечебных полипептидов,таких как G-CSF, полимерными фрагментами для того, чтобы увеличить время их выведения и чтобы снизить иммуногенность, но в разработке выгодных лекарственных форм для таких полимер-G-CSFконъюгатов проделано, по-видимому, недостаточно работы. Вышеуказанный продукт Neulasta представляет собой жидкую композицию, предназначенную для подкожных инъекций. Композиция содержит пэгфилграстим, ацетат натрия, сорбит, полисорбат 20 и воду для инъекций и имеет рН, равный 4,0 (см. http://www.neulasta.com и ROTE LISTE 2007). ПродуктыNeulasta и Neupogen, оба продаваемые Amgen, почти идентичны в отношении буферного вещества,вспомогательных веществ и значения рН раствора: Neupogen содержит филграстим (вместо пэгфилграстима), ацетат натрия, сорбит, полисорбат 80 и воду для инъекций и имеет рН, равный 4,0 (см.http://www.Neupogen.com и ROTE LISTE 2007). Настоящее изобретение направлено на жидкие фармацевтические композиции, содержащие полимер-G-CSF-конъюгат, причем композиции были особым образом разработаны с учетом характеристик полимер-G-CSF-конъюгатов. Хотя в настоящей области было опубликовано несколько подходов в отношении лекарственных форм, содержащих неконъюгированныеG-CSF, об удобных композициях конъюгатов полимер-G-CSF известно мало. Хотя в патентной литературе представлены некоторые фармацевтические композиции, разработанные для неконъюгированного G-CSF, так, чтобы охватить композиции, в которых неконъюгированныйG-CSF, заменен конъюгатом ПЭГ-G-CSF, очевидно, что эти композиции предназначены и проверены только для неконъюгированного G-CSF. Например, WO 2005/042024 описывает устойчивые фармацевтические композиции, содержащие GCSF, причем композиция имеет значение рН более 4,0 и дополнительно содержит кислоту, но не содержит сурфактантов. Хотя фармацевтическая композиции, описанная в WO 2005/042024, явно была разработана для неконъюгированного G-CSF, в инструкции упоминается, что она также включает в себя GCSF, химически модифицированный ПЭГ или т.п., проявляющий такую же или повышенную биологическую активность. Другим примером служит WO 2005/039620, также направленная на устойчивую водную композицию, содержащую G-CSF. Композиция содержит янтарную кислоту, или винную кислоту, или их соли в качестве буферных веществ и имеет предпочтительное значение рН в диапазоне от 4,0 до 5,8. Согласно инструкции белок G-CSF также может быть синтетически модифицирован, например, путем ферментативного гликозилирования или химического пэгилирования. ЕР 1260230 А 1 раскрывает устойчивые лекарственные формы белка, содержащие триптофан в качестве стабилизатора. Список белков покрывает G-CSF, а также G-CSF, химически модифицированный ПЭГ и т.п. Отмечено, что лекарственные формы G-CSF предпочтительно должны иметь рН от 5 до 7,более предпочтительно от 6,0 до 6,7. Другой пример представляет собой ЕР 1336410 А 1, которая описывает инъецируемые фармацевтические лекарственные формы, содержащие физиологически активный белок в качестве активного ингредиента и по меньшей мере один сахар в качестве успокаивающего средства и имеющие рН от 6,5 до 7,4. В этом случае тоже отмечено, что G-CSF, химически модифицированный ПЭГ и т.п., также включается. ЕР 1329224 А 1 описывает лекарственную форму раствора G-CSF, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту или ее соль, предпочтительно метионин, в качестве стабилизатора. Лекарственные формы растворов G-CSF предпочтительно должны иметь рН от 5 до 7, более предпочтительно от 5,5 до 6,8. В этом случае тоже оговорено, что G-CSF, химически модифицированный ПЭГ и т.п., также включается. Однако ни одна из лекарственных форм, известных в настоящей области, не представляет собой лекарственную форму, содержащую специфический полимер-G-CSF-конъюгат. Точнее, описываемые в патентной литературе растворы разрабатывались и испытывались только для неконъюгированного GCSF. Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, - обеспечить композицию полимер-G-CSFконъюгата, предназначенного для таких конъюгатов, которая при этом была бы устойчива при повышенных температурах, т.е. выше температуры холодильника, которая обычно находится в пределах от 2 до 8 С. Дополнительно, цель настоящего изобретения - обеспечить фармацевтическую композицию, не требующую восстановления ни на одной стадии изготовления и вызывающую настолько слабое раздражение при введении пациенту, насколько это возможно. Эти проблемы решаются согласно настоящему изобретению путем получения водной фармацевтической композиции, содержащей конъюгат полимер-G-CSF, причем рН композиции находится в диапазоне от 4,5 до 5,5. Водная композиция в настоящем изобретении содержит сурфактант и необязательно одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. В предпочтительном варианте осуществления композиция не содержит аминокислот или их производных либо солей в качестве стабилизаторов и не содержит винной кислоты и ее солей, янтарной кислоты и ее солей в качестве буферных веществ. Неожиданно было обнаружено, что составление рецептуры конъюгата полимер-G-CSF в составе композиции, имеющей значение рН в диапазоне от 4,5 до 5,5, предпочтительно 5,0, предотвращает кислотный гидролиз образующей этот конъюгат связи. Такой спектр рН повышает устойчивость раствора при температурах выше температуры холодильника (2-8 С), в особенности при комнатной температуре(т.е. ниже 25 С) и даже при более высоких температурах, например при 40 С. Это означает, что композиция может храниться без охлаждения в течение длительного времени без существенной потери активности и без значительного ухудшения свойств. Дополнительно, безотносительно устойчивости при хранении, композиции в настоящем изобретении обладают преимуществом по сравнению с композициями, имеющими рН 4,0, так как менее кислая композиция вызывает более слабое раздражение при введении пациенту. Пока не указано другое, последующие определения даются для того, чтобы проиллюстрировать и определить значение и объем различных терминов, используемых здесь для того, чтобы описать настоящее изобретение. Термин "конъюгат полимер-G-CSF" относится к конъюгату между полипептидом G-CSF и полимером, причем конъюгат образуется с помощью ковалентной связи между функциональной группой полимера и функциональной группой полипептида. Конъюгаты могут содержать один или более полимерных фрагментов. Термин "G-CSF" (или полипептид G-CSF, или белок G-CSF, или пептид G-CSF) относится к белку,in vivo имеющему биологическую активность природного человеческого G-CSF, т.е. к белку, способному стимулировать дифференцировку и пролиферацию гематопоэтических клеток-предшественников. G-CSF может быть безошибочно определен как G-CSF согласно анализу, описанному у Stute, N., et al. "Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in children" (1992), Blood 79 (11), р. 2849-2854. В примерном варианте осуществления G-CSF имеет аминокислотную последовательность согласно последующей SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где SEQ ID NO: 1 отображает аминокислотную последовательность дикого типа человеческого метионил-G-CSF, такую, которая продуцируется в Е.coli, и SEQID NO: 2 отображает аминокислотную последовательность человеческого G-CSF, такую, которая продуцируется в клетках млекопитающих, например, в клетках яичников китайского хомячка (СНО). SEQ IDNO: 1 представляет собой 175-аминокислотный вариант, в котором первая аминокислота представляет собой метионин и в котором присутствует треониновый остаток на Thr 134. SEQ ID NO: 2 представляет собой 174-аминокислотный вариант, имеющий такую же последовательность аминокислот, как и 175 аминокислотный вариант, за исключением того, что первый метионин отсутствует, таким образом последовательность начинается с Т и треониновый остаток присутствует в положении 133.(174 аминокислоты) Специалист в данной области без труда поймет, что настоящее изобретение не ограничивается отображенными здесь последовательностями, но также включает в себя варианты G-CSF. Такие варианты хорошо известны в данной области. Они могут содержать удаления, замены или добавления одной или более аминокислот в отображенных выше аминокислотных последовательностях, сохраняя при этом биологическую активность природного G-CSF. В качестве примеров, но никоим образом не предназначенных для ограничения настоящего изобретения, варианты G-CSF описаны в WO 01/87925, ЕР 0456200A, US 6166183, US 6004548, US 5580755, US 5582823, US 5675941, US 5416195, US 5399345, WO 2005/055946 и WO 2006/074467. Полипептид G-CSF может быть гликозилированным или негликозилированным. В предпочтительном варианте осуществления полипептид G-CSF представляет собой рекомбинантный человеческий GCSF, продуцированный в Е.coli, т.е. имеющий аминокислотную последовательность, отображенную выше в SEQ ID NO: 1, или ее вариант. Полимер может быть любым полимером, который может быть ковалентно связан с полипептидомG-CSF и который образует терапевтически полезный полимер-G-CSF-конъюгат при ковалентном связывании с полипептидом G-CSF. Несколько подходящих полимеров уже упоминались выше во вводной части, включая поли(алкиленгликоли), такие как ПЭГ и ППГ, гидроксиалкиловые крахмалы, такие как гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), а также полимеры, описанные в WO 02/09766, WO 96/11953 иWO 97/30148 в связи с конъюгатами полимер-полипептид. В предпочтительном варианте осуществления полимер представляет собой ПЭГ. Все характеристики концентрации в мг/мл, применяемые в дальнейшем в связи с конъюгатом полимер-G-CSF, относятся только к фрагменту G-CSF. Фрагмент ПЭГ по определению не рассматривается в отношении концентрации по массе. В то время как филграстим имеет молекулярный вес около 18-19 кДа, пэгфилграстим - намного больше, благодаря фрагменту монометокси-ПЭГ, и имеет молекулярный вес около 39 кДа. Полимер-GCSF-конъюгаты в настоящем изобретении могут иметь молекулярный вес в диапазоне от 20 до 60 кДа,предпочтительно в диапазоне от 35 до 45. В настоящей области раскрыты подходящие ПЭГ, например в WO 2005/055946, WO 2006/074467 иWO 01/87329. Фрагмент ПЭГ может быть линейным или разветвленным и может иметь размеры от 5 до 40 кДа. Предпочтительно, чтобы фрагмент ПЭГ имел молекулярный вес от 15 до 25 кДа, более предпочтительно около 20 кДа. Способы производства полимер-G-CSF-конъюгатов также описаны в данной области. Документы,упомянутые выше в связи с композициями конъюгатов между полипептидами и полимерными фрагментами, настоящим включены сюда в виде ссылок. Другие полимер-G-CSF-конъюгаты, полезные в настоящем изобретении, подробно описаны в WO 96/11953, ЕР 822199 A, WO 01/51510, WO 2006/0128460, ЕР 921131 А и ЕР 744409. Настоящим явным образом делается ссылка на открытия этих документов, т.е. на описанные в них конъюгаты и способы их производства. Специалист в данной области без труда определит, что настоящее изобретение не ограничивается конъюгатами, в которых полимер, такой как ПЭГ, или ГЭК, напрямую связан с аминокислотным остатком белка, но также охватывает конъюгаты, в которых полимерный фрагмент и полипептид G-CSF связаны друг с другом через линкер. Например, удобными линкерами внутри конъюгатов в настоящем изобретении служат гликозильные линкерные группы, расположенные между полипептидом и фрагментами ПЭГ. WO 2006/074467 описывает такие полимер-G-CSF-конъюгаты, в которых полипептид G-CSF и полимерный фрагмент связаны друг с другом через гликозильный линкер или негликозильный линкер, например через замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил. На-5 020069 стоящим раскрытие WO 2006/0744467 явным образом включено сюда в виде ссылки. Термин "ПЭГ-G-CSF" (пэгилированный G-CSF) относится к белку G-CSF, который ковалентно связан с одним или более фрагментами полиэтиленгликоля, как описано ниже. Группа(ы) ПЭГ и белок GCSF могут быть связаны друг с другом либо непосредственно, либо через линкер, например гликозильный линкер. В одном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат пептида полимер-G-CSF получают согласно способу, описанному в WO 2006/074467. В предпочтительном варианте осуществления полимер-G-CSF представляет собой конъюгат пептида ПЭГ-G-CSF, имеющий гликозильную линкерную группу, расположенную между модифицирующим фрагментом ПЭГ и полипептидом G-CSF. Такой конъюгат упоминается как "гликопэгилированный" G-CSF. В примерном варианте осуществления молекулы "гликопэгилированного" G-CSF в настоящем изобретении продуцируются путем опосредованного ферментами образования конъюгата между гликозилированным или негликозилированным пептидом G-CSF и ферментативно переносимым фрагментом сахарила, включающим в себя фрагмент полиэтиленгликоля внутри своей структуры. Фрагмент ПЭГ присоединен к фрагменту сахарила напрямую (т.е. через единственную группу, образованную путем реакции двух реакционноспособных групп) или через фрагмент линкера, например через замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил и т.д. Линкерной группой гликозила могут быть фрагменты сиаловой кислоты, получаемые из ПЭГ. В предпочтительном варианте осуществления в настоящем изобретении гликозильный линкер связан с белком G-CSF через O-гликозилирование, предпочтительно через О-гликозилирование по треониновому остатку белка G-CSF. Предпочтительно, чтобы гликозильный линкер включал в себя моно-, ди- или олигосахарид, более предпочтительно, чтобы гликозильный линкер включал в себя сиаловую кислоту и Nацетилгалактозамин. В одном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат пептида полимер-G-CSF включает в себя фрагмент где R1 представляет собой фрагмент, включающий в себя линейный или разветвленный остаток полиэтиленгликоля;L представляет собой линкер, который представляет собой элемент, выбранный из пары: замещенный или незамещенный алкил и замещенный или незамещенный гетероалкил; где пептид гликозилирован гликозильным остатком и где данный фрагмент ковалентно связан с гликозильным остатком. Предпочтительно, чтобы гликозильным остатком был N-ацетилгалактозамин. В предпочтительном варианте осуществления пептид G-CSF гликозилирован по треониновому остатку, предпочтительно по треониновому остатку в 134-м положении (рассчитано для полипептида метионил-G-CSF, т.е. имеющегоN-концевой метионин и в общей сложности 175 аминокислот). В предпочтительном варианте осуществления R1 представляет собой линейный остаток полиэтиленгликоля, a L представляет собой гетероалкил. Вышеописанный конъюгат пептида G-CSF может быть получен по способу, включающему в себя(а) приведение субстрата пептида G-CSF в контакт с донором ПЭГ-сиаловой кислоты, имеющим формулу где R1 и L определены выше,а также с ферментом, способным переносить фрагмент ПЭГ-сиаловой кислоты с донора на гликозильный остаток субстрата пептида G-CSF. В предпочтительном варианте осуществления фермент представляет собой сиалилтрансферазу, например ST6GalNAcI, как описано в WO 2005/055946. Конъюгат пептида G-CSF, описанный выше, может быть получен по способу, включающему в себя(а) приведение негликозилированного субстрата пептида G-CSF в контакт с гликозильным донором и ферментом, способным переносить фрагмент гликозила с донора на субстрат пептида G-CSF, и (b) приведение гликозилированного пептида G-CSF в контакт с донором ПЭГ-сиаловой кислоты, имеющим формулу где R1 и L определены выше,а также с ферментом, способным переносить фрагмент ПЭГ-сиаловой кислоты с донора на гликозильный остаток субстрата пептида G-CSF, причем (а) и (b) представляет собой либо последовательные,либо одновременные реакции. В предпочтительном варианте осуществления донор гликозила представляет собой UDP-N-ацелилгалактозамин. В предпочтительном варианте осуществления фермент в (а) представляет собой N-ацелилгалактозаминтрансферазу, фермент в (b) представляет собой сиалилтрансферазу, например GalNAcT2 в (а) и ST6GalNAcI в (b).G-CSF может быть продуцирован путем химических методик синтеза или может происходить из любых источников, как человеческих, так и других млекопитающих, и может быть получен путем очистки из природных источников, таких как человеческая плацента, человеческая кровь или человеческая моча. Дополнительно, многие эпителиальные карциномы, клетки, пораженные острым миелолейкозом, и различные опухолевые клеточные линии способны экспрессировать этот фактор. Предпочтительно, чтобы G-CSF был продуцирован рекомбинантным путем. Это включает в себя экспрессию прокариотических или эукариотических хозяев экзогенных последовательностей ДНК, полученных из геномной ДНК, или путем клонирования кДНК, или путем синтеза ДНК. Подходящие прокариотические хозяева включают в себя различные бактерии, такие как Е.coli., где Е.coli является предпочтительным хозяином. Подходящие эукариотические хозяева включают в себя дрожжи, такие как S.cerevisiae, и клетки млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка и клетки обезьян. В настоящей области известно рекомбинантное продуцирование белка, такого как G-CSF. Как правило, оно включает в себя трансфекцию клеток-хозяев соответствующими экспрессионными векторами,культивацию клеток-хозяев при условиях, позволяющих продуцирование белка, а также очистку белка от клеток-хозяев. Для получения подробной информации см., например, Souza, L.M. et al. 1986, Recombinant(1987), 78: 1179-1181. В предпочтительном варианте осуществления G-CSF имеет аминокислотную последовательность зрелого человеческого G-CSF (см., например, Nagata, S. et al. (1986), см. выше) и может дополнительно содержать метионин на своем N-конце, становясь, таким образом, белком из 175 аминокислот (см. SEQID NO: 1 выше). Кроме того, вместо метионина G-CSF может содержать сериновый или треониновый остаток. Затем белок очищают согласно общепринятому протоколу последовательной обработки. Подходящие для G-CSF способы очистки описаны в данной области техники, например в WO 87/01132, ЕР 0719860 А, ЕР 1458757 мА, ЕР 1527188 A, WO 03/051922, WO 01/04154 и WO 2006/097944. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат пептида полимер-G-CSF получают, как описано в приведенном здесь примере 1. Этот конъюгат характеризуется тем, что полипептид G-CSF и фрагмент ПЭГ связаны через N-ацетилгалактозаминильную (GalNAc) группу и сиаловокислую (SA) группу. Конъюгат имеет следующую структуру: G-CSF-GalNAc-SA-ПЭГ где R1 и L соответствуют определенным выше; АА представляет собой аминокислотный остаток G-CSF. В примерных вариантах осуществления R1 представляет собой линейный фрагмент, связанный через сиаловокислую группу и GalNAc группу с полипептидом G-CSF, как показано ниже где L соответствует определенному выше; АА представляет собой аминокислотный остаток G-CSF;f представляет собой целое число, взятое в промежутке от 1 до 2500. В некоторых вариантах осуществления конъюгат полимер-G-CSF имеет следующую формулу: где AA представляет собой треонин 133 (треонин 134, если есть N-конечный метионин) G-CSF;f представляет собой целое, взятое в промежутке от 1 до 2500. Фармацевтическая композиция в настоящем изобретении представляет собой жидкую композицию,например, водный раствор. Для инъекций предпочтительно применять чистую воду в качестве растворителя. Впрочем, также могут быть использованы другие растворители, подходящие и общепринятые для фармацевтических композиций. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции представляют собой изотонические растворы. Дополнительно, ни на какой стадии изготовления лекарственной формы жидкого раствора в настоящем изобретении не возникает необходимости в восстановлении. Раствор представляет собой готовую к применению лекарственную форму. Фармацевтическая композиции в настоящем изобретении имеет рН в диапазоне от 4,5 до 5,5. В предпочтительном варианте осуществления значение рН находится между 4,7 и 5,3, более предпочтительно между 4,8 и 5,2 и наиболее предпочтительно между 4,9 и 5,1. Если для достижения желаемого диапазона рН требуется его регулировка, то рН регулируется с помощью подходящих растворов; с помощью кислых растворов в случае, если выявлено уменьшение значения рН, и с помощью щелочных растворов в случае, если выявлено увеличение значения рН. Подходящими кислыми растворами являются, например, соляная кислота, фосфорная кислота, лимонная кислота и кислый фосфат натрия или калия. Подходящими щелочными растворами являются гидроксиды щелочных и щелочно-земельных металлов, щелочные карбонаты, щелочные ацетаты, щелочные цитраты и двузамещенные кислые фосфаты, например, гидроксид натрия, ацетат натрия, карбонат натрия, цитрат натрия, двузамещенный фосфат натрия или калия, аммиак. Предпочтительно, чтобы регулировка рН раствора проводилась с помощью гидроксида натрия. Как следствие, лекарственная форма в настоящем изобретении может содержать ионы натрия. Натрий обычно присутствует в концентрации менее 10 ммоль/л, как правило менее 6 ммоль/л. Фармацевтическая композиция в настоящем изобретении содержит один или более сурфактантов. Типичные примеры сурфактантов включают в себя неионные сурфактанты, например сорбитановые эфиры жирных кислот, такие как монокаприлат сорбитана, монолаурат сорбитана, монопальмитат сорбитана; глицериновые эфиры жирных кислот, такие как монокаприлат глицерина, мономиристат глицерина, моностеарат глицерина; полиглицериновые эфиры жирных кислот, такие как декаглицерилмоностеарат, декаглицерилдистеарат, декаглицерилмонолинолеат; полиоксиэтиленовые сорбитановые эфиры жирных кислот, такие как полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, по-8 020069 лиоксиэтиленсорбитанмоностеарат, полиоксиэтиленсорбитанмонопальмитат, полиоксиэтиленсорбитантриолеат, полиоксиэтиленсорбитантристеарат; полиоксиэтиленовые сорбитоловые эфиры жирных кислот, такие как полиоксиэтиленсорбитолтетрастеарат, полиоксиэтиленсорбитолтетраолеат; полиоксиэтиленовые глицериновые эфиры жирных кислот, такие как полиоксиэтиленглицерилмоностеарат; полиэтиленгликолевые эфиры жирных кислот, такие как полиэтиленгликоль дистеарат; полиоксиэтиленалкиловые эфиры, такие как полиоксизтиленлауриловый эфир; полиоксизтиленполиоксипропиленалкиловые эфиры, такие как полиоксиэтиленполиоксипропиленгликолевый эфир, полиоксиэтиленполиоксипропиленпропиловый эфир, полиоксиэтиленполиоксипропиленцетиловый эфир; полиоксиэтиленалкилфениловые эфиры, такие как полиоксиэтиленнонилфениловый эфир; полиоксиэтиленовые отвержденные касторовые масла, такие как полиоксиэтиленовое касторовое масло, полиоксиэтиленовое отвержденное касторовое масло (полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло); полиоксиэтиленовые производные воска, такие как полиоксиэтиленсорбитоловый воск; полиоксиэтиленовые производные ланолина, такие как полиоксиэтиленланолин; полиоксиэтиленовые амиды жирных кислот, такие как полиоксиэтиленовый амид стеариновой кислоты с гидрофильно-липофильным балансом в диапазоне 6-18; анионовые сурфактанты, например алкиловые сульфаты, имеющие С 10-18 алкильную группу, такие как цетилсульфат натрия, лаурилсульфат натрия, олеилсульфат натрия; сульфаты полиоксиэтиленалкиловых эфиров, имеющих среднее число молей оксида этилена от 2 до 4 и С 10-18 алкильную группу, такие как полиоксиэтиленлаурилсульфат натрия; соли алкиловых эфиров сульфоянтарной кислоты, имеющие С 8-18 алкильную группу, такие как лаурилсульфосукцинат натрия; а также природные сурфактанты, например лецитин, глицерофосфолипиды; сфингофосфолипиды, такие как сфингомиелин; сахарозные эфиры жирных кислот с С 12-18 жирными кислотами. Один или более этих сурфактантов могут быть добавлены в сочетании к лекарственным формам в настоящем изобретении. Предпочтительные сурфактанты представляет собой полиоксиэтиленсорбитаналкиловые сложные эфиры, более предпочтительно Полисорбаты 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81, 85, наиболее предпочтительно Полисорбаты 20 и 80. Концентрация детергента в лекарственной форме, как правило, находится в диапазоне от 0,0005 до 0,05% (вес./об.), предпочтительно от 0,001 до 0,01% (вес./об.), более предпочтительно от 0,002 до 0,006%(вес./об.) и наиболее предпочтительно от 0,003 до 0,004% (вес./об.) в общем объеме лекарственной формы раствора. Обычно лекарственные формы по настоящему изобретению содержат сурфактант Полисорбат 20 или 80 в концентрации 0,003; 0,0033 или 0,004% (вес./об.). Полисорбат 20 является предпочтительным. Лекарственная форма в настоящем изобретении содержит физиологически приемлемое буферное вещество. В области лекарственных форм растворов известны подходящие буферы, например фосфатные буферы (предпочтительно система моногидрофосфат натрия - дигидрофосфат натрия), цитратные буферы, лактатные буферы, ацетатные буферы, карбонатные буферы, BisTris, MES, а также глицин-HCl. Предпочтительно применение ацетатных буферов, т.е. уксусной кислоты или ее соли, например щелочных или аммонийных солей. Буферное вещество обычно присутствует в лекарственной форме в концентрации от 1 до 100 ммоль/л, предпочтительно от 2 до 50 ммоль/л и наиболее предпочтительно от 5 до 20 ммоль/л. В предпочтительном варианте осуществления буфер присутствует в концентрации 10 ммоль/л, наиболее предпочтительно ацетат присутствует в концентрации 10 ммоль/л. Концентрация буфера, например ацетата, выбирается таким образом, чтобы обеспечить как достаточную буферную емкость, так и стабилизацию рН. Однако в то же время ионная концентрация и, следовательно, проводимость раствора сохраняются настолько низкими, насколько возможно, чтобы избежать образования агрегатов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения проводимость конечной лекарственной формы раствора меньше чем 1,0 мСм/см, предпочтительно меньше чем 0,8 мСм/см и более предпочтительно меньше чем 0,5 мСм/см. Дополнительно, предпочтительно, чтобы композиция не содержала винной кислоты и янтарной кислоты, а также их солей. Также предпочтительно, чтобы раствор не содержал HEPES, TES и трицина. Также предпочтительно, чтобы лекарственная форма по настоящему изобретению не содержала сульфат-ионов. Далее, в предпочтительном варианте осуществления лекарственная форма не содержит консервантов, где под консервантами подразумеваются вещества, традиционно используемые в качестве консервантов для повышения устойчивости при хранении и которые в нормальной концентрации обладают бактерицидным эффектом. В частности, лекарственная форма не содержит консервантов, таких как хлорэтан, бензиловый спирт, п-хлор-м-крезол, диалкиловый эфир пирокарбоновой кислоты и хлорид бензалкония. В варианте осуществления настоящего изобретения лекарственная форма дополнительно содержит многоатомный спирт, предпочтительно сахарный спирт, наиболее предпочтительно маннит или сорбит, в качестве регулятора тоничности. Особенно предпочтителен сорбит. Количество сахарного спирта, такого как сорбит или маннит, составляет обычно вплоть до 10,0% (вес./об.) в общем объеме раствора. Пред-9 020069 почтительно, чтобы концентрация составляла вплоть до 8,0% (вес./об.), более предпочтительно вплоть до 6% (вес./об.) и наиболее предпочтительно 5,0% (вес./об.). В предпочтительном варианте осуществления сорбит присутствует в количестве 5,0% (вес./об.). Дополнительно, предпочтительно, чтобы лекарственная форма раствора по изобретению не содержала стабилизирующих веществ, выбранных из аминокислот, их производных и солей, полимерных стабилизирующих веществ и белковоподобных стабилизирующих веществ. Лекарственные формы в настоящем изобретении, содержащие конъюгат полимер-G-CSF, обычно вводятся через парентеральные пути, такие как инъекция (подкожная, внутривенная или межмышечная инъекция), или введением через кожу, слизистую, назальное или пульмонарное, но также могут вводиться орально. Конъюгат полимер-G-CSF обычно присутствует в лекарственной форме в концентрации от 1,0 до 30,0 мг/мл, предпочтительно от 5,0 до 20,0 мг/мл и наиболее предпочтительно от 8,0 до 12,0 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления конъюгат полимер-G-CSF представляет собой ПЭГ-SAGalNAc-G-CSF, присутствующий в количестве 10,0 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления лекарственная форма содержит конъюгат полимер-GCSF в качестве активного ингредиента, сурфактант, буферное вещество, регулятор тоничности, ионы натрия и воду, и не содержит никаких других составляющих. Наиболее предпочтительна водная композиция в настоящем изобретении, содержащая гликопэгилированный G-CSF в качестве активного вещества, Полисорбат 20 и/или Полисорбат 80 в качестве сурфактанта, сорбит и/или маннит в качестве регулятора тоничности, ацетат в качестве буфера, а также натрий, и никаких других вспомогательных веществ. В другом аспекте изобретения водная композиция по изобретению, как описано выше, разбавляется для того, чтобы получить разбавленную водную композицию, годную к применению в педиатрии. Соответствующие разведения для лечения детей достигаются в настоящем изобретении путем разбавления вышеописанного раствора в соотношении от 1:2 до 1:8. Изобретение также относится к фармацевтической упаковке, содержащей водную композицию в настоящем изобретении или разбавленный раствор, полученный из нее путем разбавления. Подходящие фармацевтические упаковки известны из уровня техники. Упаковка может быть, например, шприцом,флаконом, бутылочкой для вливаний, ампулой или карпулой. В предпочтительном варианте осуществления, когда упаковка представляет собой шприц, этот шприц снабжен системой защиты иглы. Такие системы защиты иглы, хорошо известные из уровня техники, помогают снизить риск повреждений. В другом варианте осуществления, упаковка представляет собой карпулу внутри шприца-ручки. Настоящее изобретение также относится к способу получения водной композиции по изобретению,в которой конъюгат полимер-G-CSF в качестве активного вещества добавляется к водной композиции,имеющей рН в диапазоне от 4,5 до 5,5 и содержащей сурфактант и другие фармацевтические вспомогательные вещества. В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению водной композиции по изобретению для лечения или предотвращения нейтропении. Дополнительно водная композиция по изобретению может успешно применяться для лечения или предотвращения неврологических нарушений или в связи с пересадкой костного мозга. В общем случае фармацевтические растворы по настоящему изобретению полезны для активации стволовых клеток. Оказалось, что фармацевтическая жидкая лекарственная форма по настоящему изобретению проявляет очень хорошую устойчивость при хранении. В объеме настоящего изобретения под термином "устойчивый при хранении" понимается, что содержание активного конъюгата полимер-G-CSF все еще составляет 80% или более от исходной концентрации после трех месяцев хранения состава при 25 С. Предпочтительно, чтобы после хранения на протяжении трех месяцев при 25 С сохранившаяся активность G-CSF составляла по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно 95% от первоначальной активности. Активность конъюгата полимер-G-CSF может быть определена с помощью общепринятых тестов активности, как они описаны в известном уровне техники, см., например, Draft Monographie "Filgrastimdisorders, Exp. Hematol. (1989), 17, 116-119. Для измерения активности G-CSF in vivo см., например, Tanaka, H. et al. 1991, Pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor conjugatedto polyethylene glycol in rats, Cancer Research (1991), 51, 3710-3714. Дальнейшие публикации, в которых описываются тесты для измерения активности G-CSF, описаны в US 6555660; Nohynek, G.J. et al. 1997,Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colonystimulating factors in neutropenic and non-neutropenic CD rats, Cancer Chemother. Pharmacol. (1997), 39, 259266. Чистота конъюгата полимер-G-CSF, применяемого в лекарственной форме согласно настоящему изобретению, должна быть по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 99% и наиболее предпочтительно более чем 99%. Степень чистоты может быть определена средствами ВЭЖХ-анализа. Подходящие материалы и протоколы для проведения таких анализов могут быть получены из коммерческих источников, таких как Vydac или TOSOH Bioscience(http://www.tosohbiosep.de). Компоненты для получения растворов по настоящему изобретению могут быть приобретены из традиционных источников, например в компаниях, таких как Sigma или Merck. Продукция лекарственной формы в настоящем изобретении может быть получена традиционными способами. Компоненты лекарственной формы могут быть растворены в водном буфере. Или же конъюгат уже может быть получен в водном буфере в результате процесса очистки. И, наконец, готовая жидкая лекарственная форма заливается в подходящую фармацевтическую упаковку, где хранится до своего применения. Последующие примеры предназначены для того, чтобы пояснить настоящее изобретение, без ограничения его объема. Примеры Пример 1. Получение G-CSF-GalNAc-SA-ПЭГ. Следующий пример иллюстрирует получение G-CSF-GalNAc-SA-ПЭГ (а) способом из двух последовательных стадий, в котором каждый промежуточный продукт очищается перед использованием на следующей стадии, и (b) одностадийным способом с одновременным добавлением ферментов. а. Двустадийный способ. Получение G-CSF-GalNAc (pH 6,2) из G-CSF и UDP-GalNAc с использованием GalNAc-T2.G-CSF (960 мкг) в 3,2 мл запакованного буфера концентрировали путем ультрафильтрации с помощью УФ-фильтра (номинальное отсечение по молекулярной массе 5000), а затем восстанавливали 1 мл 25 мМ MES-буфера (рН 6,2, 0,005% NaN3). Затем добавляли UDP-GalNAc (6 мг, 9,24 мМ), GalNAc-T2 (40 мкл, 0,04 U), а также 100 мкМ MnCl2 (40 мкл, 4 мМ) и получившийся раствор инкубировали при комнатной температуре. Через 24 ч MALDI показала, что реакция завершена. Реакционную смесь тут же подвергали очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя SEC (Superdex 75 и Superdex 200) и элюирующий буфер, состоящий из PBS (фосфатно-солевой буфер, рН 4,9 и 0,005% Tween 80). Собранный G-CSF-GalNAc концентрировали с помощью фильтра Centricon 5 кДа MWCO до примерно 150 мкл,а затем объем доводили до 1 мл с помощью PBS (фосфатно-солевой буфер, рН 4,9 и 0,005% Tween 80). Конечная концентрация белка составляла 1 мг/мл (А 280), выход 100%. Образец хранили при 4 С. Получение G-CSF-GalNAc-SA-ПЭГ с помощью очищенного G-CSF-GalNAc, CMP-SA-ПЭГ (20 кДа) и ST6GalNAc-TI мыши (рН 6,2). Буфер раствора G-CSF-GalNAc, содержащего 1 мг белка, заменяли на буфер MES 25 мМ (рН 6,2,0,005% NaN3) и добавляли CMP-SA-ПЭГ (20 кДа) (5 мг, 0,25 мкмоль). После растворения добавлялиMnCl2 (раствор 100 мкл, 100 мМ) и ST6GalNAc-I (100 мкл, фермент мыши) и реакционную смесь медленно взбалтывали при 32 С в течение трех дней. Реакционную смесь концентрировали путем ультрафильтрации (номинальное отсечение по молекулярной массе 5000), буфер заменяли на 25 мМ NaOAc(рН 4,9) один раз и затем концентрировали до общего объема 1 мл. Затем продукт очищали с помощьюNaCl) со временем удерживания 13-18 мин и SEC (Superdex 75; PBS-pH 7,2, 0,005% Tween 80) со временем удерживания 8,6 мин (Superdex 75, поток 1 мл/мин). Нужные фракции собирали, концентрировали до 0,5 мл и хранили при 4 С.G-CSF (960 мкг белка, растворенного в 3,2 мл буфера лекарственной формы продукта) концентрировали путем ультрафильтрации (номинальное отсечение по молекулярной массе 5000) до 0,5 мл и восстанавливали 25 мМ буфером MES (рН 6,0, 0,005% NaN3) до общего объема около 1 мл или до концентрации белка 1 мг/мл. Затем добавляли UDP-GalNAc (6 мг, 9,21 мкмоль), GalNAc-T2 (80 мкл, 80 mU),CMP-SA-ПЭГ (20 кДа) (6 мг, 0,3 мкмоль) и фермент мыши ST6GalNAc-I (120 мкл), а также 100 мМMnCl2 (50 мкл). Раствор взбалтывали при 32 С в течение 48 ч и очищали при стандартных условиях хроматографии на SP-сефарозе. В результате получали 0,5 мг белка (A280) или около 50% общего выхода. Структура продукта была подтверждена с помощью анализа и MALDI, и SDS-PAGE. Однореакторный ("one-pot") процесс с использованием ST6GalNAc-I курицы (рН 6,0). 14,4 мг G-CSF концентрировали до конечного объема 3 мл, заменили буфер 25 мМ буфера MES (рН 6,0, 0,05% NaN3, 0,004% Tween 80) и объем доводили до 13 мл. Затем добавили UDP-GalNAc (90 мг, 150 мкмоль), GalNAc-T2 (0,59 U), CMP-SA-ПЭГ-20 кДа (90 мг), ST6GaNlAc-I курицы (0,44 U), а также 100 мМ MnCl2 (600 мкл). Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 60 ч. Затем реакционную смесь концентрировали с помощью УФ (номинальное отсечение по молекулярной массе 5000) и центрифугирования. Остаток (около 2 мл) растворяли в 25 мМ буфере NaOAc (рН 4,5) и снова концентрировали до конечного объема 5 мл. Данный образец очищали с помощью SP-сефарозы в течение примерно 10-23 мин, SEC (Superdex 75, 17 мин, скорость подачи 0,5 мл/мин) и дополнительного SEC(Superdex 200, 23 мин, скорость подачи 0,5 мл/мин), получив 3,6 мг (25% от общего выхода) G-CSFGalNAc-SA-ПЭГ-20 кДа (A280 и анализ методом ВСА). Пример 2. Жидкая лекарственная форма конъюгата полимер-G-CSF (ПЭГ-SA-GalNAc-G-CSF). Жидкую лекарственную форму, содержащую гликопэгилированный G-CSF (конъюгат, имеющий структуру: ПЭГ-SA-GalNAc-G-CSF), получали путем смешивания следующих компонентов в водном растворе ацетатного буфера Значение рН композиций регулировали путем добавления NaOH. Качество всех компонентов находится в соответствии с установленным Европейской фармакопеей (Ph. Eur.). Дополнительно, была получена та же композиция либо с рН 4,5, либо с рН 5,5, пропорционально меньшим или большим содержанием натрия соответственно. Также получали лекарственную форму для сравнения, имеющую рН 4,0 (как у композиции Neulasta). Пример 3. Тест на устойчивость лекарственных форм согласно настоящему изобретению. Композиции, рН 4,5, 5,0 и 5,5, приводили к равному объему по 500 мкл/флакон и хранили при 2-8 С и при 25 С. Через 1, 2, 3, 4,5, 6, 8, 12 и 15 месяцев образцы исследовали по параметрам теста, приведенным в таблице ниже. Ожидаемые характеристики были такими, как указано для композиции, имеющей рН 5,0. Все образцы, исследуемые в течение времени Т = 0, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4,5 месяца, 6 месяцев, 8 месяцев, 12 месяцев и 15 месяцев, удовлетворяли ожидаемым характеристикам. Это было обнаружено для всех исследуемых композиций, содержащих гликопэгилированный G-CSF и имеющих рН 4,5,- 12020069 5,0 или 5,5. Композиции по изобретению сравнивали с двумя лекарственными формами: Neulasta (рН 4,0) и композицией гликопэгилированного G-CSF (ПЭГ-SA-GalNAc-G-CSF), имеющим рН 4,0. Результаты показали, что по сравнению с растворами, содержащими гликопэгилированный G-CSF и имеющими рН 4,0,лекарственные формы, имеющие большие значения рН 4,5, 5,0 и 5,50, проявляют лучшую устойчивость при хранении. Собранные данные позволяют прийти к заключению, что более высокие значения рН предотвращают кислый гидролиз глико-ПЭГ связи. Дополнительно наблюдалось, что лекарственные формы по настоящему изобретению имеют устойчивость, сравнимую с устойчивостью конъюгата ПЭГ-G-CSF,известного как Neulasta. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Водная фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат полимер-G-CSF в качестве активного агента, Полисорбат 20 и/или Полисорбат 80 в качестве сурфактанта, сорбит и/или маннит в качестве регулятора тоничности, ацетат в качестве буфера и ионы натрия, в отсутствие других вспомогательных веществ, где полимер и фактор G-CSF связаны через гликозильный линкер, где полимер представляет собой полиалкиленгликоль и композиция имеет рН в диапазоне от 4,9 до 5,1. 2. Водная фармацевтическая композиция по п.1, где гликозильная связь осуществляется через Огликозилирование. 3. Водная фармацевтическая композиция по п.2, где O-гликозилирование осуществляется по треониновому остатку белка G-CSF. 4. Водная фармацевтическая композиция по п.3, где треониновый остаток представляет собой Thr 134 в аминокислотной последовательности белка метионил-G-CSF или Thr 133 в аминокислотной последовательности природного человеческого G-CSF. 5. Водная фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, где гликозильный линкер содержит моно-, ди- или олигосахарид. 6. Водная фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, где гликозильный линкер содержит сиаловую кислоту и N-ацетилгалактозамин. 7. Водная фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где сурфактант находится в концентрации 0,0001-0,05% (вес./об.). 8. Водная фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где буфер находится в концентрации 2-50 ммоль/л. 9. Водная фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где регулятор тоничности находится в концентрации 1-10% (вес./об.). 10. Водная фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция не содержит стабилизаторов, выбранных из аминокислот, полимерных стабилизаторов и белковоподобных стабилизаторов. 11. Водная фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция не содержит консервантов. 12. Водная фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция не содержит сульфат-ионов. 13. Водная фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где рН отрегулирован с помощью NaOH. 14. Водная фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, где конъюгат полимер-G-CSF находится в концентрации 1-20 мг/мл. 15. Водная фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, где конъюгат полимер-G-CSF находится в концентрации 8-12 мг/мл. 16. Разбавленная водная фармацевтическая композиция, полученная из водной композиции по любому из предшествующих пунктов, где водная фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов разбавлена в соотношении от 1:2 до 1:8. 17. Фармацевтический контейнер, содержащий водную фармацевтическую композицию по любому из предшествующих пунктов. 18. Фармацевтический контейнер по п.17, где контейнер представляет собой шприц, флакон, бутылочку для вливаний, ампулу или карпулу. 19. Фармацевтический контейнер по п.17 или 18, где контейнер представляет собой шприц, оснащенный системой защиты иглы. 20. Фармацевтический контейнер по п.17 или 18, где контейнер представляет собой карпулу внутри шприца-ручки. 21. Способ получения водной фармацевтической композиции по любому из пп.1-15, где конъюгат полимер-G-CSF в качестве активного вещества введен в водную композицию с рН в диапазоне от 4,9 до 5,1, содержащую Полисорбат 20 и/или Полисорбат 80 в качестве сурфактанта, сорбит и/или маннит в качестве регулятора тоничности, ацетат в качестве буфера и ионы натрия, в отсутствие других вспомога- 13020069 тельных веществ. 22. Применение водной фармацевтической композиции по любому из пп.1-16 для лечения или предупреждения нейтропении. 23. Применение водной фармацевтической композиции по любому из пп.1-16 для лечения или предупреждения неврологических нарушений. 24. Применение водной фармацевтической композиции по любому из пп.1-16 для лечения состояний, связанных с пересадкой костного мозга. 25. Применение водной фармацевтической композиции по любому из пп.1-16 для активации стволовых клеток. 26. Применение водной фармацевтической композиции по п.16 в качестве педиатрического лекарственного средства.