Способ прогнозирования преэклампсии и других заболеваний

1 Область изобретения Настоящее изобретение относится к способам прогнозирования и контроля заболеваний. Более конкретно, настоящее изобретение относится к диагностике преэклампсии и других заболеваний. Предпосылки к созданию изобретения Заболевание сосудов часто связано с составом протекающей по ним крови. В частности, высокие концентрации липопротеинов очень низкой плотности (VLDL) в крови оказывают повреждающее действие на целостность сосудов. Липопротеины очень низкой плотности в крови имеют тенденцию разрушаться на внутренних стенках сосудов, вызывая заболевания сосудов, включая преэклампсию, атеросклероз,инсульт, заболевание периферических сосудов,диабетическое заболевание сосудов и т.п. Способы, обеспечивающие раннее выявление заболеваний сосудов, и способы диагностики предрасположенности пациента к развитию заболевания сосудов на поздних стадиях его жизни являются желательными, поскольку в этом случае указанное заболевание можно лучше контролировать или даже избежать. Раннее выявление преэклампсии является особенно важным. Преэклампсия представляет собой токсическое заболевание сосудов, представляющее особый интерес. Преэклампсия развивается на поздних стадиях беременности и характеризуется внезапным повышением кровяного давления,избыточной прибавкой массы тела, генерализованным отеком, альбуминурией, сильными головными болями и нарушениями зрения. Кровеносные сосуды матки беременной женщины,снабжающие кровью ее плаценту и плод, во время преэклампсии сужаются, доставляя уменьшенные количества крови и кислорода плоду. Преэклампсия связана с плохим ростом плода и, в наиболее тяжелой форме, может быть смертельной как для плода, так и для матери. Естественная защита человеческой крови от деструктивного воздействия VLDL на клетки эндотелия и лейкоциты количественно определяется индексом или фактором, известным какDiabetes 31 (1982) 1098-1104). Патент США 4 699 878 описывает, что ТхРА образца крови можно оценить путем сравнения роста культуры клеток, обработанных токсичным количествомVLDL, и различными количествами образца крови до "нулевого" роста стандартной культуры клеток, которую обрабатывали тем же токсичным количеством VLDL и не обрабатывали кровью. 2 Соотношение VLDL и ТхРА также эффективно для прогнозирования заболевания сосудов in vitro. Наличие или будущее развитие преэклампсии можно предсказать с 90% точностью,используя соотношение VLDL и ТхРА (Arbogast,B.W., Leeper, S.C., Merrick, R.D., Olive, K.E. and(1996) 263-279). Сходная точность была получена для атеросклероза. (Arbogast, B.W., Gill, L.R.Atherogenic Index. Atherosclerosis, Vol. 66 (1987) 55-62). Недостатки данного способа клеточной культуры заключаются в том, что он является относительно дорогим исследованием и что он требует времени на рост клеток. Кроме того,уровень неопределенности составляет приблизительно 10%, что нежелательно высоко для медицинского исследования. Плазма крови содержит компоненты,включая альбумин, неэтерифицированные жирные кислоты (NEFA) и триглицериды, которые переносятся в различных количествах на липопротеинах очень низкой плотности (VLDL),липопротеинах низкой плотности (LDL) и липопротеинах высокой плотности (HDL). Альбумин человеческой крови существует в двух видах, которые можно разделить посредством их электрофоретической миграции к изоэлектрическим точкам при рН 4,8 и рН 5,6. (Basu, S.P.,Rao, S.N. and Hartsuck, J.A. Influence of Fatty AcidActa, Vol. 533 (1978) 66). Было установлено, что предотвращающая токсичность активность человеческой крови, в основном, обеспечивается альбумином рI 5,6. Arbogast описал, что вид альбумина рI 5,6 обеспечивает защитный эффект против повреждения VLDL клеток эндотелия кровеносных сосудов и лейкоцитов (Arbogast, B.W.Density Lipoproteins. Diabetes 31: 1098-1104,1982). Соответственно, определение концентрации альбумина рI 5,6 в крови должно быть весьма выгодным в отношении диагностики заболеваний сосудов и заболеваний, связанных с лейкоцитами. Концентрацию альбумина рI 5,6 невозможно определить по общей концентрации альбуминов, так как виды альбумина рI 5,6 и рI 4,8 существуют в плазме крови человека в непред 3 сказуемых соотношениях. ТхРА образца плазмы можно определить путем отделения альбумина рI 4,8 от альбумина рI 5,6 посредством жидкостного колоночного изоэлектрического фокусирования и определения концентрации фракции альбумина рI 5,6 посредством абсорбционной спектрометрии. Концентрацию альбумина рI 5,6 в плазме затем сравнивают со стандартной концентрацией, известной как показатель разграничения пациентов, имеющих диагноз заболеваний артерий и не имеющих диагноза заболеваний артерий (Arbogast, B.W., Leeper, S.C., Merrick, R.D., Olive, K.E. and Taylor, R.N. PlasmaPreeclampsia in Early and Late Pregnancy. Hypertension in Pregnancy, Vol. 15: 263-279, 1996). Метод электрофореза, описанный Arbogast, является достаточно громоздким и дорогим для клинического применения. Степень неопределенности метода электрофореза составляет приблизительно 10%. В свете вышесказанного было бы желательно иметь в распоряжении более простой способ диагностики наличия или склонности к развитию ингибируемых альбумином, связанных с VLDL заболеваний, включая сосудистые и несосудистые заболевания и состояния. Наиболее пригодным был бы способ, не требующий культивирования клеток или изоэлектрического фокусирующего разделения. Было бы желательным также, чтобы указанный новый способ диагностики был более точным, чем ранее существовавшие способы. Краткое описание существа изобретения Настоящее изобретение представляет собой способ определения предотвращающей токсичность способности плазмы против заболевания, имеющего корреляцию со снижением концентрации альбумина рI 5,6 в плазме крови. Настоящий способ включает следующие стадии:(a) получение образца плазмы, содержащего свободный альбумин, свободные неэтерифицированные жирные кислоты, триглицериды,липопротеины очень низкой плотности, липопротеины низкой плотности и липопротеины высокой плотности;(b) определение концентрации свободного альбумина;(c) определение концентрации свободных неэтерифицированных жирных кислот; и(d) расчет величины, показательной для предотвращающей токсичность способности плазмы, путем сравнения концентрации свободного альбумина и концентрации свободных неэтерифицированных жирных кислот. Предпочтительной индикаторной величиной является"соотношение TxPA-S", рассчитанное путем деления концентрации свободного альбумина на концентрацию свободных неэтерифицированных жирных кислот. 4 Настоящее изобретение также включает набор для анализа, пригодный для осуществления указанного способа. Набор для анализа включает следующее:(b) реагент, который приобретает окрашивание после связывания с альбумином; и(c) реагент, который приобретает окрашивание после связывания с неэтерифицированными жирными кислотами. Краткое описание фигур Фиг. 1 представляет график, показывающий отсутствие диагностического разделения,которое наблюдается при сравнении концентрации альбумина в плазме у пациентов с тяжелой преэклампсией и у контрольных пациентов. Контрольные пациенты соответствовали пациентам с преэклампсией на основе срока беременности, возраста и расы матери. Фиг. 2 представляет график, подобный фиг. 1, за исключением того, что концентрация альбумина представляет собой альбумин, обнаруженный в надосадке плазмы после удаленияVLDL и LDL путем осаждения и центрифугирования. Фиг. 3 представляет график, показывающий, что некоторое диагностическое разделение наблюдается при сравнении концентрацииNEFA представляет собой NEFA, обнаруженные в надосадке плазмы после осаждения VLDL и LDL. Фиг. 5 представляет график, показывающий улучшенное диагностическое разделение пациентов с тяжелой преэклампсией и контрольных пациентов, когда на график нанесено соотношение концентрации альбумина в плазме и концентрации NEFA в плазме. Фиг. 6 представляет график, показывающий еще более улучшенное диагностическое разделение пациентов с тяжелой преэклампсией и контрольных пациентов, когда на график нанесено соотношение концентрации альбумина в надосадке и концентрации NEFA в надосадке(соотношение TxPA-S). Фиг. 7 представляет график линейной корреляции между соотношениями TxPA-S (надосадок) и колоночными величинами ТхРА (из плазмы), измеренными в одном и том же ряде образцов крови. Фиг. 8 представляет график, подобный фиг. 1, для образцов крови, полученных от другой группы женщин, страдающих преэклампсией легкой степени, и контрольной группы женщин. Фиг. 9 представляет график, подобный фиг. 6, для образцов крови, полученных от той же группы образцов крови, который использовался на фиг. 8. 5 Фиг. 10 представляет график, подобный фиг. 9, за исключением того, что вместо одного только TxPA-S на график нанесено частное от соотношения TxPA-S, умноженное на концентрацию HDL. Этот ряд образцов был взят от группы женщин, проживающих вне Соединенных Штатов. То наблюдение, что HDL вносит значительный вклад в классификацию этих женщин, может зависеть как от области мира,где были взяты образцы, так и может представлять собой интегральную часть новой методологии для измерения TxPA-S. Подробное описание изобретения Заявитель разработал новый способ прогнозирования способности плазмы крови препятствовать повреждению клеток токсинами,присутствующими в крови, особенно обладающими VLDL-цитотоксичностью. Способ по настоящему изобретению основан на открытии заявителем того факта, что на ингибирующую токсичность активность крови может указывать особый альбумин рI 5,6, который не связывается с VLDL. Альбумин, который не связывается сVLDL, в настоящем документе упоминается как"свободный альбумин". В то время как заявитель установил, что прямое измерение свободного альбумина рI 5,6 обеспечивает показатель ингибирующей токсичность активности по настоящему изобретению, указанное прямое измерение потребует разделения альбумина рI 5,6 и альбумина рI 4,8, а также разделения свободного альбумина и альбумина, связанного сVLDL. В попытке найти альтернативу громоздкому электрофоретическому фокусирующему анализу для разделения альбумина рI 5,6 и альбумина рI 4,8, заявитель установил, что для получения очень хорошей оценки концентрации свободного альбумина рI 5,6 можно сравнивать концентрацию свободного (общего) альбумина и концентрацию неэтерифицированных жирных кислот ("NEFA"), связанных со свободным альбумином. Это обеспечивает более простой способ, поскольку оба эти количества поддаются измерению с помощью простой in vitro методики. Заявитель установил, что соотношение концентрации свободного альбумина и концентрации NEFA, связанных со свободным альбумином (в настоящем документе упоминаются как"свободные NEFA"), представляет собой улучшенный показатель способности плазмы крови препятствовать повреждению клеток токсинами,присутствующими в крови. Однако другие диагностические величины, рассчитанные, главным образом, на основе концентрации свободного альбумина и свободных NEFA, рассматриваются как модификации настоящего изобретения. Следует отметить, что диагностическое соотношение, определенное настоящим способом, основано на параметрах, отличных от величины ТхРА, которая использовалась ранее как показатель ингибирующей токсичность способности крови в патенте США 4 699 878 или 6 в изоэлектрической фокусирующей методике,используемой для выделения альбумина рI 5,6. Соответственно, указанные две величины не поддаются сравнению. С целью четкого различения нового диагностического соотношения для оценки ингибирующей токсичность способности, определенного по настоящему изобретению, и величины ТхРА, которая использовалась в данной области диагностики ранее, диагностическое соотношение, определенное по настоящему изобретению, далее в настоящем документе упоминается как "соотношение TxPA-S", где"S" обозначает, что проводится анализ надосадка плазмы. Определение соотношения TxPA-S и основанный на нем диагноз по настоящему изобретению обеспечивают точный показатель вероятности развития заболевания, ингибируемого альбумином, с использованием аналитических методов, которые являются гораздо более простыми по сравнению с электрофорезом и культивированием клеток. Настоящее изобретение включает способ определения соотношения TxPA-S в крови и способ постановки медицинского диагноза на основе определенного указанным способом соотношения TxPA-S. Настоящий способ можно осуществлять путем анализа образца крови, сыворотки или плазмы. Поскольку кровь трудно анализировать из-за коагуляции, предпочтительно использовать сыворотку или плазму,полученные из цельной крови. Конкретный тип анализа, который используется для осуществления способа по настоящему изобретению, будет определять, какая именно форма препарата крови, сыворотка или плазма, будет наиболее предпочтительной. Несмотря на то, что плазма представляет собой наиболее предпочтительную форму препарата крови для настоящего способа,термин "плазма" в настоящем документе используется для обозначения крови, сыворотки и/или плазмы. Самыми важными компонентами плазмы,которые анализируются в настоящем изобретении, являются свободный альбумин, NEFA,имеющие длину ацильной цепи от 6 до 20 атомов углерода, триглицериды, имеющие длину ацильной цепи от 6 до 20 атомов углерода, липопротеины низкой плотности ("LDL"), липопротеины очень низкой плотности ("VLDL") и липопротеины высокой плотности ("HDL").VLDL имеют плотность менее приблизительно 1,006 г/мл. LDL имеют плотность приблизительно от 1,006 до 1,063 г/мл. HLDL имеют плотность более приблизительно 1,063 г/мл. Компонент NEFA состоит из NEFA, связанных с VLDL, и NEFA, не связанных с VLDL. Поскольку было установлено, что подавляющее большинство NEFA, не связанных с VLDL,представляет собой свободные NEFA, термин"свободные NEFA" далее в настоящем документе используется взаимозаменяемым образом для 7 обозначения любого из двух типов всех NEFA,если не указано иное. Настоящее изобретение включает определение концентрации свободного альбумина (как альбумина рI 4,8, так и рI 5,6) и концентрации свободных NEFA в образце плазмы и расчет соотношения TxPA-S плазмы путем деления концентрации свободного альбумина на концентрацию свободных NEFA. Концентрацию свободных NEFA предпочтительно определяют после удаления из плазмы VLDL. Концентрацию альбумина можно измерить как в виде общего альбумина плазмы до удаления VLDL, так и в виде свободного альбумина, который остается после удаления VLDL. Однако более точное соотношение TxPA-S получают при использовании для расчета соотношения TxPA-S концентрации свободных NEFA и концентрации свободного альбумина. Более предпочтительно, чтобы измеренные концентрации свободного альбумина и свободных NEFA не включали альбумин или NEFA,связанные с LDL. Соответственно, предпочтительно удалять LDL из плазмы вместе с VLDL. Было установлено, что соотношение TxPA-S является точным, когда измеренные свободный альбумин и свободные NEFA не включают указанных веществ, связанных с LDL. После определения соотношения TxPA-STxPA-S предпочтительно используют для классификации предотвращающей токсичность способности плазмы для конкретного ингибируемого альбумином токсического заболевания или состояния путем сравнения соотношения TxPA-S со стандартной величиной TxPA-S для данного конкретного заболевания. Стандартную TxPA-S определяют, осуществляя процесс по настоящему изобретению на статистически значимом множестве образцов плазмы, имеющих известные потенциалы в отношении подозреваемого ингибируемого альбумином заболевания или состояния. Соотношение TxPA-S, определенное для каждого из стандартов плазмы, относят к определенной категории согласно независимому медицинскому диагнозу подозреваемого ингибируемого альбумином заболевания. Положительный диагноз подозреваемого ингибируемого альбумином заболевания обычно основан на имеющем место в действительности развитии заболевания за данный период. Отрицательный диагноз подозреваемого ингибируемого альбумином заболевания обычно основан на отсутствии развития заболевания за данный период. Стандарт может представлять собой единственную отметку уровня соотношения TxPA-S или,предпочтительно, диапазон соотношений TxPA-S,показательных для высокой вероятности ингибируемого альбумином заболевания. Наиболее предпочтительным стандартом является пара диапазонов соотношений TxPA-S, когда один из диапазонов представляет соотношения TxPA-S,показательные для высокой вероятности инги 005275 8 бируемого альбумином заболевания, а другой диапазон указывает низкую вероятность того же самого заболевания. Способ по настоящему изобретению обеспечивает неожиданно высокую степень разделения между указанной парой диапазонов стандартных соотношений TxPA-S высокой и низкой вероятности. Стандартные соотношенияTxPA-S, полученные от достаточно большой популяции стандартов плазмы, наиболее предпочтительно составляют, по существу, два исключающих диапазона величин, т.е. указанные два диапазона величин не перекрываются, за исключением статистически незначительного количества аномальных значений. Таким образом, точность диагноза при использовании настоящего способа выше, чем при использовании ранее существовавших способов. Образец соотношения TxPA-S, попадающий в более высокие стандартные диапазоны величин,показывает, что у пациента существует достоверно более низкая вероятность развития подозреваемого заболевания. Образец соотношения ТхРА-S, попадающий в более низкие стандартные диапазоны величин, показывает, что у пациента существует достоверно более высокая вероятность развития заболевания. Испытуемое соотношение ТхРА-S, попадающее между двумя стандартными диапазонами, будет означает неопределимый риск развития заболевания. Предрасположенность пациента к развитию ингибируемого альбумином заболевания можно определить даже еще более точно, когда указанный способ дополнительно включает стадию измерения общей концентрации триглицеридов в плазме и включение концентрации триглицеридов в диагностическое уравнение. Концентрацию триглицеридов можно принимать во внимание при определении вероятности развития заболевания у пациента с помощью оценки диаграммы соотношения TxPA-S в зависимости от концентрации триглицеридов. По указанной диаграмме можно рассчитать линейное уравнение, отделяющее плазму с высокой вероятностью заболевания от плазмы с низкой вероятностью заболевания. Диагностику образца плазмы можно легко осуществить путем ввода в уравнение как соотношения TxPA-S, так и концентрации триглицеридов. Стандартные диапазоны высокой и низкой вероятности заболевания еще более суживаются и отделяются друг от друга, когда в диагноз включается эффект концентрации триглицеридов. Однако об абсолютном улучшении точности диагноза при использовании соотношений TxPA-S вместо величин ТхРА дополнительно свидетельствует тот факт, что концентрация триглицеридов достоверно меньше влияет на степень разделения между диагностическими стандартными диапазонами на основе соотношений TxPA-S, чем на стандартные диапазоны на основе величин ТхРА. 9 Заболевания, которые можно диагностировать с помощью настоящего способа, представляют собой заболевания, имеющие корреляцию со снижением концентрации альбумина рI 5,6 в плазме. Указанный способ является особенно пригодным для прогнозирования заболеваний сосудов, вызываемых повреждением эндотелиальных клеток под действием VLDL. Термин"заболевание" используется для обозначения заболеваний и других состояний, поддающихся медицинской диагностике. Примерами указанных заболеваний являются преэклампсия, атеросклероз, инсульт, нефротический синдром(заболевание почек), заболевание периферических сосудов и диабетическое заболевание сосудов. Примерами несосудистых заболеваний и состояний, которые не признаются заболеваниями сосудов, но имеют корреляцию с концентрацией альбумина, являются рак, смертность,заболеваемость, сепсис, шок и старение. Конкретные методики, которые используются для удаления VLDL, измерения свободныхNEFA и измерения альбумина, не являются принципиально важными. Специалистам известны различные способы осуществления каждой стадии настоящего способа. Примеры подходящих методик и реагентов приведены ниже,но они не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Несмотря на то, что концентрацией NEFA,представляющих интерес, являются NEFA, связанные со свободным альбумином, определение концентрации NEFA, не связанных с VLDL, как было установлено, дает полезное приближение к NEFA, связанным со свободным альбумином,для настоящего способа. Таким образом, любая методика, которая обеспечивает дифференциацию между NEFA, связанными с VLDL, иNEFA, не связанными с VLDL, является подходящей для определения концентрации свободных NEFA. NEFA, связанные с VLDL, можно различать от свободных NEFA после удаления из плазмы VLDL.VLDL можно удалять из образца плазмы с помощью ряда методик. Примеры подобных средств разделения включают любую известную методику для удаления LDL и/или VLDL,включая ультрацентрифугирование, осаждение сульфатированными гликанами или фосфовольфрамовой кислотой в присутствии двухвалентных катионов, иммунопреципитацию, электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, методики разделения по зарядам, такие как ионообменная хроматография, методики разделения по размерам, такие как гель-фильтрационная хроматография, и т.п. Наиболее предпочтительно, VLDL удаляют из образца плазмы осаждением, за которым следует фильтрование, сифонирование или декантация надосадка с осажденных твердых веществ.VLDL можно осаждать с помощью реагента, осаждающего не связанные с альбумином 10 липиды. Предпочтительный реагент включает сульфатированный гликан, такой как декстрансульфат, и двухвалентный катион, такой как хлорид магния. Примером коммерчески доступного осаждающего реагента, пригодного для осаждения VLDL, является реагент, осаждающий HDL-холестерин, который состоит из декстрансульфата, хлорида магния, хлорида натрия и полиэтиленгликоля; указанный реагент продается компанией RefLab Medical AnalysisSystems, Inc. Указанный предпочтительный осаждающий реагент представляет собой смесь декстрансульфата (0,2 мМ), хлорида магнияLDL из образца плазмы вместе с VLDL. LDL обычно осаждается из раствора вместе с VLDL. Осажденные твердые вещества VLDL и LDL можно удалять известными способами, такими как центрифугирование раствора с последующей декантацией надосадка плазмы. Альтернативный агент, осаждающий VLDL и LDL, состоит из 30,3 мМ фосфовольфрамовой кислоты и 100 мМ хлорида магния. Указанный раствор смешивают с образцом в соотношении 1:5, а выпавшие в осадок твердые вещества VLDL иLDL удаляют, как описано выше для осаждения декстраном-магнием. После удаления VLDL концентрацию свободных NEFA можно определить в надосадке с помощью любой методики, известной для определения концентрации жирных кислот. Примеры подобных методик описаны в патентах США 4 071 413; 4 360 591; 4 349 625; 4 301 244 и 4 229 538. Подходящие способы измерения концентрации NEFA включают титрование, колориметрию и радиоизотопные методики; колориметрия является предпочтительной. Подходящие системы растворителей для экстрагирования NEFA описаны Dole, V.P.J. Clin. Invest.Vol. 35 (1956) 150. Экстрагированные NEFA можно измерить титрованием со стандартной щелочью до конечной точки с использованием кислотно-щелочного индикатора. Радиохимические методики определения концентрации NEFA включают экстрагированиеNEFA в гептановую фазу экстракта Dove и удаление из нее фосфолипидов. Экстракт затем метят радиоактивным 63Ni путем смешивания его с радиоактивным нитратом никеля. Верхнюю, органическую фазу, содержащую комплекс никель-жирная кислота, затем исследуют на предмет радиоактивности. 63Ni можно заметить на 60 Со, но это более опасно, поскольку последний является источником гаммаизлучения. Различные способы колориметрического определения концентрации NEFA известны специалистам и могут быть выполнены дляNEFA в том виде, в котором они существуют в надосадке in vitro. Методики экстрагирования 11 обычно основаны на образовании солей меди или кобальта и экстрагировании соли в неполярный органический растворитель, где она образует комплекс с хромогенной краской, для колориметрического измерения. Альтернативно,и более предпочтительно, NEFA можно измерить in vitro, используя ферментативный колориметрический метод. Один подобный метод включает действие на надосадок ацилкофермент А-синтетазой в присутствии добавленного аденозинтрифосфата (АТФ), катионов магния и СоА, для образования тиоловых эфиров СоА, известных как ацил-СоА, а также побочных продуктов аденозинмонофосфата (АМФ) и пирофосфата (PPi). Полученный таким образом ацил-СоА затем окисляют ацил-СоАоксидазой с получением пероксида водорода. Пероксид водорода в присутствии пероксидазы допускает окислительную конденсацию 3-метил-N-этил-Nгидроксиэтиланилина с 4-аминоантипирином, образуя аддукт пурпурного цвета. Концентрацию NEFA в надосадке можно определить по оптической плотности, измеренной при максимальном поглощении при 550 нм. Было установлено, что аскорбиновая кислота (витамин С), присутствующая в плазме,часто вызывает значительные помехи при определении концентрации NEFA с помощью данного колориметрического анализа. Это происходит во многом благодаря биологической роли аскорбиновой кислоты как антиоксиданта и ее способности взаимодействовать с пероксидом водорода. Следовательно, при использовании данного типа колориметрического исследования для определения концентрации NEFA предпочтительно перед колориметрическим определением концентрации NEFA удалять аскорбиновую кислоту из плазмы или надосадка плазмы. Добавление аскорбат-оксидазы (AOD) представляет собой обычный способ удаления аскорбиновой кислоты. На стадии определения концентрации альбумина предпочтительно, чтобы определяемая концентрация альбумина представляла собой концентрацию свободного альбумина. Соответственно, концентрацию альбумина предпочтительно определяют в надосадке плазмы, который остается после удаления VLDL, более предпочтительно, после удаления как VLDL, так иLDL. Концентрацию альбумина можно определять известными способами, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA),иммунологический анализ, радиоиммуноанализ(RIA), колориметрический анализ со связыванием красителя, и посредством измерения количества белка или аминокислоты после очистки альбумина с помощью осаждения, электрофореза,электрофокусирования, гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и т.п. Колориметрический анализ со связыванием красителя представляет собой предпочтительную аналитическую методику для 12 определения концентрации альбумина, поскольку он более прост и занимает меньше времени по сравнению с другими процедурами. В общем, когда краситель связывается с участком связывания в молекуле альбумина, он поддается выявлению в силу разницы в рН окружающей среды у массы альбумина и в растворе. Примеры подобных колориметрических анализов со связыванием красителя описаны в патентах США 5 182 214; 4 568 647; 3 873 272; 3 884 637; 5 194 390; 4 337 064 и 4 230 456. Предпочтительный колориметрический анализ для определения концентрации альбумина включает смешивание приблизительно от 1 до 10 мкл надосадка или плазмы с приблизительно от 50 до 200 мкл 0,030 ммоль/л бромкрезолового зеленого (рН 4,2) реагента для выявления альбумина. Концентрацию альбумина можно определить измерением оптической плотности по максимальному поглощению при 628 нм. Альтернативное средство определения величины показателя концентрации свободного альбумина рI 5,6 включает измерение концентрации альбумина и NEFA, связанных с VLDL,и вычитание указанных концентраций из общих концентраций альбумина и NEFA в сыворотке, в результате чего получают концентрацию свободного альбумина и концентрацию свободныхNEFA. Данные концентрации, таким образом,можно было бы использовать для расчета величины TxPA-S, как показано выше. Соотношение TxPA-S для данного образца плазмы рассчитывается согласно настоящему изобретению путем деления концентрации свободного альбумина на концентрацию свободныхNEFA. Единицы, в которых выражают концентрацию, не являются важными, поскольку те же единицы используют для получения стандарта соотношения TxPA-S. Например, величинуNEFA, или в виде комбинации указанных выше единиц. Следует понять, что, несмотря на то, что предпочтительный вариант осуществления настоящего способа, который включает определение соотношения TxPA-S, как описано выше,настоящее изобретение включает также способ,при котором истинная концентрация свободного альбумина рI 5,6 или любой иной его показатель определяется и используется как величина,показательная для предотвращающей токсичность способности крови при конкретном заболевании. Указанный вариант осуществления настоящего изобретения включает стадии получения образца плазмы, как описано выше, определения показателя концентрации свободного альбумина рI 5,6 в плазме и оценки предотвращающей токсичность способности плазмы против заболевания путем сравнения концентрации свободного альбумина рI 5,6 со стандартом,полученным с помощью осуществления указан 13 ных стадий (а) и (b) на множестве образцов плазмы, полученных от пациентов, имеющих известный диагноз наличия или развития указанного заболевания. Специалисту будет понятно, что прямое измерение концентрации свободного альбумина рI 5,6 не будет столь экономически уязвимым, как измерение свободного альбумина и свободных NEFA, в силу сложности выполнения электрофоретического фокусирования для разделения альбумина рI 5,6 и альбумина рI 4,8. Предпочтительный способ по настоящему изобретению включает измерение концентрации триглицеридов и постановку диагноза на основе обнаруженного уровня. Концентрацию триглицеридов можно определить с помощью ферментного колориметрического конечного анализа. Настоящее изобретение также включает набор для анализа, который представляет собой особую комбинацию реагентов, пригодных для осуществления предпочтительного способа по настоящему изобретению, при котором VLDL удаляют осаждением перед определением концентрации NEFA, а альбумин, остающийся в надосадке, определяют посредством колориметрических анализов. Набор для анализа по настоящему изобретению включает реагент, осаждающий VLDL, рН-чувствительный краситель,связывающийся с альбумином, и ферментный реагент для жирных кислот, колориметрический реагент. Набор для анализа по настоящему изобретению предпочтительно включает агент,окисляющий аскорбиновую кислоту, такой как аскорбат-оксидаза. Набор для анализа также предпочтительно включает ферментный колориметрический конечный реагент для триглицеридов. Колориметрический реагент, подходящий для связывания и выявления триглицеридов, включает соединение и фермент, которые работают вместе для гидролиза триглицеридов до глицерина и жирных кислот. Аденозинтрифосфат (АТФ) и глицерин взаимодействуют с глицерокиназой с образованием глицерин-1-фосфата и аденозиндифосфата. Глицерин-1-фосфат (G-1-P) можно окислять с получением пероксида водорода,который определяют сходным образом как с реагентом для NEFA. Альтернативно, G-1-P может взаимодействовать с никотинадениндинуклеотидом (NAD) с образованием восстановленного никотинадениндинуклеотида (NADH).NADH затем восстанавливает краситель, который после восстановления изменяет цвет, образуя формазан. Или в предыдущем исследовании к NADH можно добавлять пируват в присутствии лактат-дегидрогеназы, а полученный NAD можно определять с помощью ультрафиолетового света. В альтернативном способе триглицериды гидролизуют спиртовым KОН с образованием глицерина и жирных кислот. Глицерин и АТФ затем взаимодействуют в присутствии глицерокиназы с образованием глицерин-1 005275 14 фосфата и АДФ. На следующей стадии АДФ объединяется с фосфоэнолпируватом в присутствии пируват-киназы с образованием пирувата и АТФ. Пируват затем взаимодействует сNADH в присутствии лактат-дегидрогеназы, с образованием лактата и NAD. Затем NAD определяют с помощью ультрафиолетового света. Реагент, осаждающий VLDL, в настоящем диагностическом тест-наборе предпочтительно включает декстрансульфат в качестве сульфатированного гликана и хлорид магния в качестве двухвалентного катиона или фосфовольфрамовую кислоту и хлорид магния. рН-чувствительный краситель, связывающийся с альбумином, предпочтительно выбирают из группы красителей, состоящей из бромкрезолового зеленого, бромкрезолового пурпурного и т.п. Предпочтительным ферментным колориметрическим реагентом для жирных кислот является смесь, включающая ацилкофермент А-синтетазу, аденозинтрифосфат и кофермент А. С учетом различных реагентов в наборе по настоящему изобретению, считается,что соединение здесь демонстрирует окрашивание при связывании со всей плазмой, когда окрашивание проявляется в любое время, благодаря химической реакции, наблюдающейся во всей плазме в результате контактирования реагента с плазмой. Настоящее изобретение далее можно иллюстрировать следующими примерами, показывающими предпочтительные варианты его осуществления. Однако следует понимать, что данные примеры включены только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, если специально не указано иное. Примеры В следующих примерах образцы крови брали у беременных женщин, которые на тот момент не имели преэклампсии. Развитие преэклампсии или отсутствие развития преэклампсии у данных пациентов подтверждалось к концу беременности. Примеры 1-6 включают образцы крови, взятые у женщин с тяжелой преэклампсией, которых определяли как женщин с гипертензией на поздних сроках беременности(абсолютное кровяное давление по меньшей мере 140/90 мм рт.ст. или подъем систолического давления по меньшей мере на 30 мм рт.ст. или диастолического давления по меньшей мере на 15 мм рт.ст. по сравнению с величинами на первых 20 неделях), протеинурией (по меньшей мере 30 мг белка/дл мочи в образце, взятом катетером, или по меньшей мере 60 мг/дл в моче при самостоятельном мочеиспускании) и гиперурикемией (мочевая кислота в сыворотке 1 стандартного отклонения по сравнению с нормой для срока беременности), и не донашивающих беременность. Примеры 7-9 включают образцы крови, взятые у женщин с легкой преэклампсией, которых определяли по тем же критериям, 15 что и для тяжелой преэклампсии, за исключением того, что они были способны доносить беременность. В примерах использовались следующие реагенты: Осаждающий реагент Реагент, осаждающий HDL-холестерин,бренд RefLab; указанный реагент продается компанией Medical Analysis Systems, Inc. (USA),содержащий 0,2 мМ декстрансульфата, 63,9 мМ хлорида магния, 63,3 мМ хлорида натрия и 3,3 мМ полиэтиленгликоля. Реагент, связывающий альбумин Набор для анализов на альбумин, который продается компанией Wako Chemicals USA, Inc.; содержит 0,2 ммоль/л раствор бромкрезолового зеленого в 50 ммоль/л нитратного буфера при рН 3,8. Реагент, связывающий NEFA, с реагентом для удаления аскорбиновой кислоты Набор для анализа, который продается компанией Wako Chemicals USA, Inc.,Richmond, VA. Реагент А изготовлен с целью окисления аскорбиновой кислоты и ацетилирования кофермента А для определения NEFA. Реагент В изготовлен с целью окисления ацил-кофермента А и образования пероксида водорода для определения NEFA. Пероксид водорода затем взаимодействует с 3-метил-N-этил-Nгидроксиэтиланилином и 4-аминоантипирином, образуя пурпурную окраску. Реагент А:AOD (аскорбат-оксидаза) 15 ЕД/на флакон СоА (кофермент А) 7 мг/на флакон АТФ (аденозинтрифосфат) 30 мг/на флакон 4-аминоантипирин 3 мг/на флакон 10 мл разбавителя (0,05 М фосфатный буфер, рН 6,9, 3 мМ хлорида магния, поверхностно-активный агент и стабилизаторы) добавляли в каждый флакон реагента А для изготовления рабочего раствора А. Реагент В:POD (пероксидаза) 150 ЕД/на флакон МЕНА (3-метил-N-этил-N-4 мг/на флакон гидроксиэтиланилин) Рабочий раствор В изготавливали разбавлением реагента В 20 мл феноксиэтанола (0,3 об.%) и поверхностно-активного агента. Пример 1 (сравнительный). Фиг. 1 иллюстрирует отсутствие диагностического разделения, которое наблюдается при простом измерении концентрации общего альбумина в плазме у 11 женщин с преэклампсией и 11 парных контролей. 16 Пример 2 (сравнительный). Тот же способ измерения (общего) альбумина выполняли на тех же образцах плазмы, что и в примере 1, за исключением того, что перед измерением концентрации альбумина из плазмы удаляли VLDL. VLDL осаждали из каждого образца плазмы путем объединения 100 мкл плазмы и 100 мкл осаждающего реагента в центрифужную пробирку (в зависимости от концентрации реагента приемлемым является соотношение образца к реагенту 1:1 или 1:5). Центрифужную пробирку встряхивали в смесителе вращательного типа для тщательного смешивания, а затем центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин. Надосадок декантировали пипеткой в чистую лабораторную пробирку. Концентрацию альбумина определяли, используя полученный надосадок. Результаты представлены на фиг. 2. Сравнение данных, представленных на фиг. 1 и 2, показывает некоторое улучшение в разделении концентрации альбумина между группой образцов крови от больных с преэклампсией и группой контрольных образцов крови, когда компонент VLDL перед измерением альбумина удаляют. На фиг. 2 наблюдается меньшее перекрывание, чем на фиг. 1. Средняя концентрация альбумина для контрольных образцов крови выше средней концентрации альбумина для образцов крови от больных с преэклампсией. Пример 3 (сравнительный). Данный пример иллюстрирует разделение концентрации NEFA между 11 образцами крови больных с преэклампсией и 11 образцами крови контрольных пациентов по примеру 1. Плазму,полученную из образцов крови, исследовали на концентрацию NEFA (без удаления VLDL). Для измерения концентрации NEFA 5 мкл плазмы переносили пипеткой в лунку микротитрационного планшета с плоским дном. Добавляли рабочий раствор для реагента А (70 мкл), раствор тщательно перемешивали и планшет инкубировали при 37 С в течение 10 мин. Затем добавляли рабочий раствор для реагента В (140 мкл),содержимое планшета тщательно перемешивали и инкубировали при 37 С в течение еще 10 мин. Измеряли оптическую плотность на длине волны 550 нм на планшет-ридере для микротитрационных планшетов. Вычитали поглощение для лунки с водой и отмечали концентрацию NEFA как долю полученного поглощения по сравнению с известным стандартом. Результаты графически представлены на фиг. 3. Пример 4. Пример 4 иллюстрирует методики, которые использовались для осуществления способа по настоящему изобретению. 22 образца плазмы исследовали как в примере 3, за исключением того, что из плазмы удаляли VLDL для получения надосадка, не содержащего связанного альбумина, перед из 17 мерением концентрации NEFA. VLDL осаждали из образца плазмы путем объединения 100 мкл плазмы и 100 мкл осаждающего реагента в центрифужной пробирке. Центрифужную пробирку встряхивали в смесителе с вращением для тщательного смешивания, а затем центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин. Надосадок декантировали пипеткой в чистую лабораторную пробирку. Концентрацию NEFA определяли согласно способу, описанному в примере 3. Результаты представлены на фиг. 4. Сравнение фиг. 3 и 4 показывает, что концентрация NEFA в образцах пациентов достоверно разделяется между образцами от пациентов с преэклампсией и контрольными образцами, когда VLDL сначала удаляют из плазмы. Это показывает, что значительное количествоNEFA, связанных с VLDL, и альбумина, связанного с VLDL, позволяет произвести более точное измерение концентрации NEFA, связанных со свободным альбумином, что сильно коррелирует с предотвращающей токсичность способностью крови. Пример 5. Соотношения альбумина и NEFA рассчитывали для каждого из 22 образцов от пациентов, используя результат примеров 1-4. Данное соотношение сначала рассчитывали делением концентрации альбумина, определенной в примере 1 (образец плазмы), на концентрациюNEFA, определенную в примере 3 (образец плазмы). Данные результаты графически отражены на фиг. 5. Соотношения TxPA-S рассчитывали по настоящему изобретению для каждого из 22 образцов от пациентов делением концентрации альбумина, определенной в примере 2 (в надосадке), на концентрацию NEFA, определенную в примере 4 (в надосадке). Данные результаты графически отражены на фиг. 6. Сравнение фиг. 5 и 6 показывает значительную степень разделения при измерении концентрации альбумина и NEFA в настоящем способе, только после удаления VLDL. Фиг. 6 показывает полное разделение между образцами от пациентов с преэклампсией и контрольными образцами. Анализ результатов, показанных на фиг. 6,показывает, что соотношение ТхРА-S, попадающее в интервал приблизительно от 1,17 до 1,78, обозначает нормальный риск преэклампсии, с приблизительно 100% степенью достоверности. Соотношение TxPA-S, попадающее в интервал приблизительно от 0,63 до 0,9, обозначает высокий риск преэклампсии, с приблизительно 100% степенью достоверности. Соотношения TxPA-S, попадающие между указанными двумя интервалами, будут неопределенными. Диаграмма, показанная на фиг. 6, представляет собой пример стандарта соотношенийTxPA-S, пригодного для диагностики с использованием настоящего способа. Например, для разделения испытуемых соотношений TxPA-S для диагностических целей, если это желательно, можно использовать одну отсекающую величину соотношения TxPA-S, равную 1. Однако использование дискретных пределов является более точным, особенно на больших популяциях стандартных образцов, для получения стандартных диапазонов TxPA-S. Пример 6. Настоящий пример иллюстрирует ранее использовавшийся способ определения ТхРА на колонке и сравнивает результаты с TxPA-S.(Общую) концентрацию альбумина в образцах плазмы, полученных от 11 беременных пациенток, которым был поставлен диагноз тяжелой преэклампсии, и 11 беременных пациенток, подобранных попарно по сроку беременности,возрасту матери и расе, измеряли непосредственно с использованием аликвоты (10:1) плазмы(без удаления VLDL) путем изоэлектрического фокусирования согласно способу, описанномуArbogast в Hypertension in Pregnancy, Vol. 15. 10 мкл плазмы помещали в 10 мл сахарозы с градиентом плотности (5-50%) с 0,25 мл амфолина, рI 4-6,5. Ток подключали на 18 ч и колонку элюировали в микротитрационные планшеты. Собирали фракции по одной капле. 200 мкл реагента для альбумина смешивали с элюированным образцом и измеряли окрашивание приблизительно на 660 нм. Диаграмма, показанная на фиг. 7, иллюстрирует высокую корреляцию между результатами, показанными на фиг. 6 для колориметрического определения TxPA-S в аликвотах надосадков согласно настоящему изобретению, и определением ТхРА колоночным способом в аликвотах плазмы из тех же образцов плазмы согласно способу, описанному Arbogast в Hypertension in Pregnancy, Vol. 15. Коэффициент корреляции (R2) , выявленный между двумя рядами результатов, составлял 0,66. Вариация повторностей составляла приблизительно 10% при колоночном способе определения ТхРА, в то время как настоящий колориметрический способ с использованием надосадка имел приблизительно 2% вариацию. Примеры 7-9 иллюстрируют применение настоящего способа у женщин, которым впоследствии был выставлен диагноз легкой преэклампсии. Пример 7 (cравнительный). Фиг. 8 показывает уровни общего альбумина сыворотки у 25 женщин с преэклампсией и у 25 контрольных женщин в третьем триместре беременности, полученные с помощью способа, описанного в примере 1. Как можно видеть, ряд женщин с преэклампсией имел уровни общего альбумина (4 г/дл) ниже стандартного диапазона контролей. Наблюдается, однако,значительное перекрывание между группами, 19 которое делает уровни общего альбумина сыворотки непригодными для прогнозирования преэклампсии. Пример 8. Соотношение TxPA-S в тех же 50 образцах крови, что и в примере 7, определяли с помощью той же процедуры, что и в примере 5. Фиг. 9 показывает, что ТхРА-S, определенная в тех же двух группах женщин, обеспечивает лучшее разделение групп, чем измерение уровней общего альбумина сыворотки в примере 7. Используя горизонтальную линию, показанную на фиг. 9, в качестве диагностического раздела,76% (19 из 25) контролей можно отделить от 68% (17 из 25) пациенток с преэклампсией. Это представляет собой выраженное улучшение по сравнению с примером 7. Пример 9. В настоящем примере данные TxPA-S, определенные в примере 8, далее оценивали путем умножения каждого соотношения TxPA-S на концентрацию HDL в надосадке (после удаления VLDL и LDL). Концентрацию холестеринаHDL измеряли в надосадке после осажденияChem. 20:470-5 (1974), включенных в настоящий документ в качестве ссылок. Фиг. 10 показывает дальнейшее улучшение, достигнутое включением уровня HDL в уравнение. В этом случае 76% (19 из 25) контрольных женщин отделялись от 88% (22 из 25) женщин с преэклампсией. Несмотря на то, что настоящее изобретение было изложено с точки зрения предпочтительного на настоящий момент варианта осуществления настоящего изобретения в данном описании и примерах, следует понимать, что данное описание не должно интерпретироваться как ограничивающее описанное в настоящем документе изобретение. Нет сомнения, что после прочтения данного описания для специалистов, для которых предназначено настоящее изобретение, будут очевидны различные изменения и модификации. Прилагаемая формула изобретения предназначена для охвата всех подобных изменений и модификаций, как подпадающих под идею и объем притязаний настоящего изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ определения предотвращающей токсичность способности плазмы против заболевания, имеющего корреляцию с уменьшением 20 концентрации альбумина рI 5,6 в плазме, где указанный способ включает следующие стадии:(a) получение образца плазмы, содержащего свободный альбумин, свободные неэтерифицированные жирные кислоты, имеющие длину ацильной цепи от 6 до 20 атомов углерода,триглицериды, имеющие длину ацильной цепи от 6 до 20 атомов углерода, липопротеины очень низкой плотности, липопротеины низкой плотности и липопротеины высокой плотности;(b) определение концентрации свободного альбумина;(c) определение концентрации свободных неэтерифицированных жирных кислот; и(d) расчет величины, показательной для предотвращающей токсичность способности плазмы, путем сравнения концентрации свободного альбумина и концентрации свободных неэтерифицированных жирных кислот,где указанные определения на стадиях (b) и (с) проводят с использованием анализа без культивации клеток. 2. Способ по п.1, при котором указанная стадия расчета включает деление концентрации свободного альбумина на концентрацию свободных неэтерифицированных жирных кислот,в результате чего получают соотношение TxPAS в качестве показательной величины. 3. Способ по п.1, при котором указанную стадию определения концентрации свободного альбумина и указанную стадию определения концентрации свободных неэтерифицированных жирных кислот выполняют после стадии удаления из образца плазмы липопротеинов очень низкой плотности. 4. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию определения концентрации триглицеридов и HDL, где указанная стадия расчета (d) дополнительно включает учет концентрации триглицеридов и HDL при расчете величины. 5. Способ по п.1 или 4, дополнительно включающий стадию (е) оценки предотвращающей токсичность способности плазмы против указанного заболевания, включающую сравнение величины, рассчитанной на указанной стадии (d), со стандартом, определенным путем выполнения каждой из указанных стадий на множестве образцов плазмы, при этом каждый из множества образцов плазмы отбирают у пациента, имеющего известный диагноз наличия или развития указанного заболевания. 6. Способ по п.2, дополнительно включающий диагностику предотвращающей токсичность способности указанной плазмы путем сравнения диагностических факторов, включающих указанную величину TxPA-S, со стандартом, определенным путем выполнения способа по п.2 на множестве образцов плазмы,имеющих известную предотвращающую токсичность способность против заболевания, ингибируемого альбумином. 21 7. Способ по п.6, при котором указанный стандарт представляет собой единственную величину, единственный диапазон величин или множество диапазонов величин. 8. Способ по п.7, при котором указанные диапазоны практически исключают друг друга. 9. Способ по п.1, при котором указанное заболевание представляет собой преэклампсию,атеросклероз, инсульт, заболевание периферических сосудов, диабетическое заболевание сосудов, нефротический синдром, сепсис, шок,рак, старение. 10. Способ по п.3, при котором указанную стадию (а) удаления липопротеинов очень низкой плотности выполняют путем осаждения,указанную стадию (b) выполняют путем осуществления колориметрического анализа связывания красителя, ELISA или радиоиммунного анализа, указанную стадию (с) выполняют путем осуществления титрационного анализа, радиоизотопного анализа или колориметрического анализа, включая ферментный колориметрический анализ. 11. Способ по п.1, при котором указанный образец плазмы содержит аскорбиновую кислоту, а указанную стадию определения концентрации свободных неэтерифицированных жирных кислот выполняют после стадии удаления аскорбиновой кислоты из указанного образца плазмы. 12. Способ определения предотвращающей токсичность способности плазмы против заболевания, имеющего корреляцию с уменьшением концентрации альбумина рI 5,6 в плазме; указанный способ включает следующие стадии:(a) получение образца плазмы, включающего концентрацию общего свободного альбумина, включая концентрацию свободного альбумина рI 5,6 и концентрацию свободного альбумина рI 4,8, триглицериды, имеющие ацильные цепи длиной от 6 до 20 атомов углерода, 005275 22 липопротеины очень низкой плотности, липопротеины низкой плотности, липопротеины высокой плотности и свободные неэтерифицированные жирные кислоты, связанные с общим свободным альбумином, имеющие длину ацильной цепи от 6 до 20 атомов углерода;(b) определение величины, показательной для концентрации свободного альбумина рI 5,6; и(c) оценку предотвращающей токсичность способности плазмы против указанного заболевания путем сравнения указанной величины со стандартной величиной, полученной путем выполнения каждой из указанных стадий (а) и (b) на множестве образцов плазмы; при этом каждый из множества образцов плазмы отбирают у пациента, имеющего известный диагноз указанного заболевания. 13. Способ по п.12, при котором указанную стадию определения (b) выполняют путем определения концентрации общего свободного альбумина и определения концентрации неэтерифицированных жирных кислот, связанных с общим свободным альбумином, и путем расчета величины сравнением концентрации общего свободного альбумина с концентрацией неэтерифицированных жирных кислот, связанных с общим свободным альбумином. 14. Способ по п.12, при котором величина,определенная на указанной стадии (b), представляет собой концентрацию свободного альбумина рI 5,6 в плазме, при котором указанная стадия (b) включает удаление VLDL и альбумина рI 4,8 из плазмы для получения надосадка плазмы, а затем - измерение концентрации альбумина, оставшегося в надосадке. 15. Способ по п.12, при котором указанное заболевание представляет собой преэклампсию,атеросклероз, инсульт, заболевание периферических сосудов, диабетическое заболевание сосудов, нефротический синдром, сепсис, шок,рак, старение.