Способ получения фосфолипидной суспензии и способ получения фосфолипидной смеси

1 Область изобретения Настоящее изобретение в целом относится к способам получения липидной смеси и однородной фильтруемой фосфолипидной суспензии, содержащей липидную смесь; такая суспензия полезна в качестве ультразвукового контрастного вещества. Предпосылки изобретения Получение фосфолипидного контрастного вещества может быть разделено на следующие стадии:(2) смешивание основного объема раствора, включающее гидратацию и диспергирование липидной смеси, по существу, в водной среде для получения липидной суспензии;(3) фильтрация основного объема раствора через стерилизующий фильтр(ы) с целью избавления суспензии от микробных загрязнителей;(4) распределение стерильной суспензии в отдельные ампулы в контролируемом асептическом участке;(5) загрузка распределенных ампул в камеру лиофилизатора для замещения газа в верхней свободной части ампулы на перфторпропан(6) перенос герметизированных ампул после газообмена в автоклав для конечной стерилизации. Этот процесс имеет следующие основные проблемы: (1) однородность липидной смеси;(2) гидратация липидной смеси; (3) однородность и размер частиц суспензии; (4) стерильная фильтрация суспензии через стерилизующий фильтр(ы). Фосфолипидные смеси обычно получают,растворяя или суспендируя требуемые липиды в соответствующей водной или безводной системе растворителей, а затем уменьшая объем или лиофилизацией или дистилляцией. В идеальном случае в результате этого процесса получают смешанные твердые вещества с высокой однородностью и чистотой. Однако, хорошо срабатывая в небольшом, лабораторном масштабе,этот простой подход часто становится проблематичным при его применении в промышленном масштабе. Эти проблемы включают: (1) сохранение однородности смеси на стадии удаления растворителя (из-за дифференциальных растворимостей); (2) сохранение чистоты (что зачастую является проблемой при использовании воды из-за гидролитических побочных реакций); (3) повышение уровня чистоты; (4) минимизация объема растворителя; и 5) выделение конечных твердых веществ (например, неудобно соскабливать твердые вещества из большого реактора). После получения липидной смеси, конечное смешивание обычно включает введение смеси в водную среду. Поскольку фосфолипиды являются гидрофобными и с трудом растворяются в воде, то добавление фосфолипидов или липидной смеси 2 непосредственно в водный раствор вызывает агрегацию липидного порошка и образование комков,диспергируемых с большой трудностью. Таким образом, процесс гидратации не может быть проконтролирован в рамках разумной продолжительности процесса. Прямая гидратация фосфолипидов или липидной смеси в водной среде приводит к получению мутной суспензии с частицами, размер которых составляет от 0,6 до 100 мкм. Из-за относительно высокого распределения частиц по размерам суспензию нельзя фильтровать при температуре окружающей среды, когда температура суспензионного раствора ниже температуры фазового перехода липидов из геля в жидкие кристаллы. Липиды накапливаются в фильтрах, вызывая ограничение скорости потока, и, в большинстве случаев,через короткое время фильтры оказываются полностью забитыми. Дальнейшее уменьшение размера частиц суспензии не может быть обеспечено в результате традиционного периодического процесса даже после длительного перемешивания (например 6 ч) при повышенных температурах (например 4080 С) обычно используемым гребным винтом. Несмотря на возможность фильтрации при повышенных температурах, например при температуре выше температур фазового перехода липидов, существенное количество липидных частиц большего размера все-таки исключается при использовании нормального фильтровального давления. В свою очередь, концентрации стерильного фильтрата имеют переменное содержание липидов от партии к партии в зависимости от способа начальной гидратации липидов, что, в свою очередь, определяется физическими характеристиками, например, морфологией, исходного материала. Процесс непосредственной гидратации липидов или липидной смеси для получения однородной суспензии и ее фильтрации через стерилизационный фильтр(ы) может оказаться трудным и дорогостоящим для применения в какомлибо разумном промышленном масштабе, например 20 л. Таким образом, заявляемые способы получения липидной смеси и последующей фосфолипидной суспензии направлены на разрешение вышеуказанных проблем путем разработки практичного процесса, масштаб которого может быть легко увеличен и приспособлен к различным производственным средствам без больших изменений или существующего оборудования или изготовления нового оборудования. Краткое описание изобретения Соответственно, одной из целей данного изобретения является обеспечение нового способа получения липидной смеси. Другой целью данного изобретения является обеспечение нового способа получения фосфолипидной суспензии из липидной смеси. Эти и другие цели, которые станут очевидными во время изучения нижеследующего полного описания, были достигнуты в результа 3 те открытия, сделанного авторами данного изобретения, что растворение липидной смеси в подходящем неводном растворителе до введения водного раствора обеспечивает получение фосфолипидной суспензии. Подробное описание изобретения 1. Таким образом, в первом варианте воплощения данное изобретение обеспечивает новый способ получения фосфолипидной суспензии, включающий(1) контактирование липидной смеси с неводным растворителем, в результате чего липидная смесь, по существу, растворяется в неводном растворителе; и(2) контактирование раствора со стадии (1) с водным раствором с получением липидной суспензии. 2. В предпочтительном варианте воплощения неводный растворитель выбирают из пропиленгликоля, этиленгликоля и полиэтиленгликоля 300. 3. В наиболее предпочтительном варианте воплощения неводный растворитель представляет собой пропиленгликоль. 4. В другом предпочтительном варианте липидная смесь содержит(c) N-(метоксиполиэтиленгликоль 5000 карбамоил)-1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин, мононатриевую соль. 5. В другом предпочтительном варианте на стадии (1) неводный растворитель нагревают до температуры приблизительно 30-70 С до контактирования с липидной смесью. 6. В другом, еще более предпочтительном варианте неводный растворитель нагревают до температуры приблизительно от 50-55 С до контактирования с липидной смесью. 7. В другом предпочтительном варианте отношение липидной смеси к неводному растворителю составляет от приблизительно 5 мг липидной смеси на мл неводного растворителя до приблизительно 15 мг/мл. 8. В другом, еще более предпочтительном варианте отношение липидной смеси к неводному растворителю составляет приблизительно 10 мг/мл. 9. В другом предпочтительном варианте на стадии (2) водный раствор выбирают из воды,солевого раствора, смеси солевого раствора и глицерина и смеси солевого раствора, глицерина и неводного растворителя. 10. В другом, еще более предпочтительном варианте водный раствор представляет собой смесь солевого раствора и глицерина. 11. В другом, еще более предпочтительном варианте водный раствор представляет собой смесь солевого раствора, глицерина и пропиленгликоля. 4 12. В другом, еще более предпочтительном варианте присутствуют 6,8 мг/мл хлористого натрия, 0,1 мл/мл глицерина, 0,1 мл/мл пропиленгликоля и приблизительно 0,75-1,0 мг/мл липидной смеси. 13. В еще более предпочтительном варианте присутствуют 0,75 мг/мл липидной смеси. 14. В другом, еще более предпочтительном варианте присутствует 1,0 мг/мл липидной смеси. 15. В другом предпочтительном варианте на стадии (2) водный раствор перед контактированием с раствором со стадии (1) нагревают до температуры приблизительно от 45 до 60 С. 16. В другом, еще более предпочтительном варианте водный раствор перед контактированием с раствором со стадии (1) нагревают до температуры приблизительно 50-55 С. 17. В другом предпочтительном варианте способ дополнительно включает(3) нагревание липидной суспензии со стадии (2) до температуры, приблизительно равной или выше наивысшей температуры перехода геля в жидкокристаллическую фазу липидов,присутствующих в суспензии. 18. В другом, более предпочтительном варианте на стадии (3) липидную суспензию нагревают до температуры, по меньшей мере,примерно 67 С. 19. В другом, более предпочтительном варианте способ дополнительно включает(4) фильтрацию липидной суспензии через стерилизующий фильтр. 20. В другом, еще более предпочтительном варианте на стадии (4) фильтрацию проводят,используя два стерилизующих фильтрующих элемента. 21. В дополнительном предпочтительном варианте на стадии (4) стерилизующие фильтрующие элементы имеют температуру от приблизительно 70 до 80 С. 22. В другом дополнительном предпочтительном варианте на стадии (4) используют 0,2 мкм гидрофильные фильтры. 23. В другом, еще более предпочтительном варианте способ дополнительно включает(5) распределение отфильтрованного раствора со стадии (4) в ампулу. 24. В следующем дополнительном предпочтительном варианте способ дополнительно включает(6) замену газа в верхней свободной части ампулы со стадии (5) на перфорированный углеводород. 25. В следующем дополнительном предпочтительном варианте перфторированный углеводород представляет собой перфтор-пропан. 26. В следующем дополнительном предпочтительном варианте замену газа в верхней свободной части осуществляют с применением камеры для лиофилизации. 5 27. В другом дополнительном предпочтительном варианте способ дополнительно включает (7) стерилизацию ампулы со стадии (6). 28. В еще дополнительном предпочтительном варианте на стадии (7) ампулу стерилизуют при температуре около 126-130 С в течение 110 мин. 29. Во втором варианте воплощения данное изобретение обеспечивает новый способ получения липидной смеси, включающий(b) концентрирование раствора до густого геля;(c) контактирование густого геля со вторым неводным растворителем; и(d) сбор полученных твердых веществ. 30. В предпочтительном варианте, на стадии (а), липиды представляют собой:(iii) N-(метоксиполиэтиленгликоль 5000 карбамоил)-1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин, мононатриевую соль. 31. В другом предпочтительном варианте на стадии (а) первый неводный растворитель представляет собой смесь метанола и толуола. 32. В другом предпочтительном варианте,на стадии (с), второй неводный растворитель представляет собой метил трет-бутиловый эфир. 33. В другом предпочтительном варианте на стадии (а) раствор нагревают до температуры, достаточной для завершения растворения липидов в растворителе. 34. В другом предпочтительном варианте на стадии (а) раствор нагревают до температуры приблизительно от 25 до 75 С. 35. В другом предпочтительном варианте на стадии (d) собранные твердые вещества промывают метил трет-бутиловым эфиром и сушат в вакууме. 36. В третьем варианте воплощения данное изобретение обеспечивает новую фосфолипидную суспензию, содержащую(e) воду; при этом суспензию получают способом, включающим(1) контактирование липидной смеси с неводным растворителем, посредством чего липидная смесь, по существу, растворяется в неводном растворителе;(2) контактирование раствора со стадии (1) с водным раствором для получения липидной суспензии;(3) нагревание липидной суспензии со стадии (2) до температуры, приблизительно равной или выше наивысшей температуры перехода геля в жидкокристаллическую фазу липидов,присутствующих в суспензии; и(4) фильтрацию липидной суспензии через стерилизующий фильтр. 37. В другом предпочтительном варианте воплощения липидная смесь содержит(c) N-(метоксиполиэтиленгликоль 5000 карбамоил)-1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин, мононатриевую соль. 38. В другом, более предпочтительном варианте неводный растворитель нагревают до температуры приблизительно 50-55 С до контактирования с липидной смесью. 39. В другом, более предпочтительном варианте отношение липидной смеси к неводному растворителю составляет примерно 10 мг/мл. 40. В другом, более предпочтительном варианте водный раствор представляет собой смесь солевого раствора, глицерина и пропиленгликоля. 41. В еще более предпочтительном варианте присутствуют 0,75 мг/мл липидной смеси. 42. В другом, более предпочтительном варианте водный раствор нагревают до температуры приблизительно 50-55 С до контактирования с раствором со стадии (1). 43. В другом, более предпочтительном варианте на стадии (3) липидную суспензию нагревают до температуры, по меньшей мере,примерно 67 С. 44. В другом дополнительном предпочтительном варианте на стадии (4) используют два 0,2-мкм гидрофильных фильтра. Состав Предполагается, что данное изобретение будет осуществляться для количеств, по меньшей мере, в несколько граммов, килограммов,несколько килограммов или в промышленном масштабе. Количество нескольких граммов, как использовано в данном описании, - это, предпочтительно, количество, при котором, по меньшей мере, один исходный материал присутствует в количестве 10 г или более, более предпочтительно, по меньшей мере, 50 г или более, и даже более предпочтительно, по меньшей мере, 100 г или более. Количество несколько килограммов, как использовано в данном описании, подразумевает количество, при котором используют более одного килограмма, по меньшей мере, одного исходного материала. Промышленный масштаб, как использовано в данном описании, подразумевает масштаб, от 7 личный от лабораторного и достаточный для получения (поставки) продукта, достаточного или для клинических испытаний или для распределения потребителям. Липидная или фосфолипидная смесь в соответствии с данным изобретением подразумевает два или более смешанных липидов. Липидная смесь обычно находится в виде порошка. Предпочтительно, по меньшей мере, один из липидов представляет собой фосфолипид. Предпочтительно, липидная смесь содержит 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин (DPPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3 фосфатидную, мононатриевую соль (DPPA) и(MPEG5000-DPPE). Количество каждого липида, присутствующего в смеси, зависит от требуемого конечного продукта. Предпочтительные отношения каждого липида указаны в разделе Примеры. В данном способе может быть использовано большое разнообразие других липидов, например, описанных в Unger et al.,патенте США 5 469 854, включенных в описание в качестве ссылки. Фосфолипид, как использовано в данном изобретении, представляет жирное вещество,содержащее масляную (гидрофобную) углеводородную цепь (цепи) с полярной (гидрофильной) фосфорной группой. Фосфолипиды являются амфифильными. Они спонтанно образуют границы и закрытые пузырьки в водной среде. Фосфолипиды составляют примерно 50% массы животной клеточной плазменной мембраны. Получение липидной смеси Липидная смесь может быть получена в результате процесса лиофилизации из водной суспензии или процесса растворения-осаждения органическим растворителем с применением органических растворителей. В процессе лиофилизации из водной суспензии требуемые липиды суспендируют в воде при повышенной температуре и затем концентрируют лиофилизацией. Предпочтительно, применяют процедуру растворения. Стадия (а) Процедура растворения-осаждения органическим растворителем включает контактирование требуемых липидов (например, DPPA,DPPC и MPEG5000 DPPE) с первой системой неводного растворителя. Эта система обычно представляет собой сочетание растворителей,например, СНСl3/МеОН, CH2Cl2/MeOH и толуол/МеОН. Предпочтительно, первый неводный растворитель представляет собой смесь толуола и метанола. Может быть желательным нагреть липидный раствор до температуры, достаточной для обеспечения полного растворения. Такая температура предпочтительно составляет приблизительно 25-75 С, более предпочтительно приблизительно 35-65 С. 8 После растворения, может возникнуть необходимость удаления нерастворившихся примесей горячей фильтрацией или охлаждением до комнатной температуры и затем фильтрацией. Могут быть использованы известные методы фильтрации (например, гравитационное фильтрование, вакуумное фильтрование или фильтрование под давлением). Стадия (b) Затем раствор концентрируют до густого геля/полутвердого состояния. Концентрированно предпочтительно осуществляют вакуумной дистилляцией. Могут быть также использованы другие методы концентрирования раствора, такие как роторное выпаривание. Температура на этой стадии предпочтительно составляет приблизительно 20-60 С, более предпочтительно 30-50 С. Стадия (с) Затем густой гель/полутвердое вещество диспергируют во втором неводном растворителе. Смесь суспендируют предпочтительно при температуре, близкой к температуре окружающей среды(например 15-30 С). Полезными вторыми неводными растворителями являются те растворители,которые вызывают осаждение липидов из отфильтрованного раствора. Вторым неводным растворителем предпочтительно является метил третбутиловый эфир (МТВЕ). Могут быть использованы другие простые эфиры и спирты. Стадия (d) Твердые вещества, полученные после добавления второго неводного растворителя, затем собирают. Предпочтительно, собранные твердые вещества промывают еще одной порцией второго неводного растворителя (например,МТВЕ). Сбор может быть проведен путем вакуумной фильтрации или центрифугирования предпочтительно при температуре окружающей среды. После сбора твердые вещества предпочтительно сушат в вакууме при температуре,приблизительно 20-60 С. По следующим причинам процесс растворения-осаждения органическим растворителем предпочтителен перед процессом водного суспендирования/и лиофилизации: 1) Поскольку липиды полностью растворимы в толуоле/метаноле, объемы растворителя существенно снижаются (по сравнению с водной процедурой). 2) Благодаря этой повышенной растворимости температура процесса также ниже по сравнению с водной процедурой, предотвращая таким образом гидролитическую неустойчивость сложных эфиров жирных кислот. 3) При охлаждении вновь до комнатной температуры, раствор толуола/метанола липидов остается гомогенным, позволяя проводить фильтрацию при комнатной температуре для удаления твердых примесей. 4) Осаждение при помощи МТВЕ обеспечивает быстрое и легкое выделение твердых 9 веществ липидной смеси. При проведении водного процесса для выделения материала применяют длительный процесс лиофилизации. 5) Осаждение при помощи МТВЕ также обеспечивает удаление любых примесей, растворимых в МТВЕ, попадающих в отработанный поток фильтрата. Эта возможность удаления примесей не реализуется, когда раствор непосредственно концентрируют или лиофилизируют в твердое вещество. 6) Данный способ обеспечивает получение однородных твердых веществ. Получение липидной суспензии Стадия (1) На первой стадии, липидную смесь подвергают контактированию с неводным растворителем, при этом липидная смесь, по существу,растворяется в нем. Альтернативно, отдельные липиды могут быть подвергнуты контакту с неводным растворителем в следующем порядке:DPPA. Поскольку DPPA является наименее растворимым и содержит наименьшее количество липидов, его не добавляют первым. Добавление одного из других липидов перед или одновременно с добавлением DPPA облегчает растворение DPPA. При другой альтернативе отдельные липиды могут быть объединены в их твердых формах и сочетание твердых веществ может быть подвергнуто контакту с неводным растворителем. Существенное растворение обычно отмечают, когда смесь липидной смеси и неводного растворителя становится прозрачной. Как отмечалось ранее, обычно фосфолипиды нерастворимы в воде. Таким образом, непосредственное введение фосфолипидной смеси в водную среду вызывает агрегацию липидной смеси и образование комков, которые очень трудно диспергируются. Данное изобретение устранят это ограничение путем растворения липидной смеси в неводном растворителе перед введением водного раствора. Это позволяет равномерно диспергировать липидную смесь в жидкости. Жидкая дисперсия затем может быть введена в требуемую водную среду. Термин неводный означает растворитель или смесь растворителей, в которых количество присутствующей воды достаточно низкое, чтобы не препятствовать растворению липидной смеси. Количество необходимого неводного растворителя зависит от растворимости липидной смеси, а также от конечной требуемой концентрации каждого компонента. Как будет понятно специалисту в данной области, количество воды, присутствующей в неводном растворителе, которое может быть допустимым, будет изменяться в зависимости от водорастворимости отдельных липидов в липидной смеси. Чем больше водорастворимы отдельные фосфолипиды, тем большее количество 10 воды может присутствовать на стадии (1). Предпочтительно, в качестве неводного растворителя используют пропиленгликоль. Однако могут быть использованы и другие вещества из семейства полиолов, такие как этиленгликоль и полиэтиленгликоль 300. Для достижения полного растворения может потребоваться механическое перемешивание липидной смеси и неводного растворителя. Специалисту в данной области известно, что существует множество способов перемешивания. Предпочтительным является применение гомогенизатора с большими сдвиговыми усилиями. Специалисту в данной области понятно,что повышение температуры растворителя способствует растворению липидной смеси. Температура, при которой можно проводить стадию(1), может изменяться от температуры окружающей среды до температуры кипения выбранного растворителя. Предпочтительно, температура составляет от приблизительно 30 до приблизительно 70 С, более предпочтительно от приблизительно 45 до приблизительно 60 С,а еще более предпочтительно приблизительно 50, 51, 52, 53, 54 или 55 С. При использовании этиленгликоля или полиэтиленгликоля 300 предпочтительно, чтобы температура составляла от приблизительно 50 до приблизительно 60 С, более предпочтительно примерно 55 С. Поддерживание раствора при повышенной температуре снижает вязкость раствора и облегчает получение состава. Предпочтительными процедурами растворения липидной смеси являются следующие: (а) поместить пропиленгликоль в соответствующий контейнер для взвешивания; (b) нагреть пропиленгликоль до температуры приблизительно 4080 С в нагревательной ванне; (с) отвесить липидную смесь в отдельный контейнер; (d) когда пропиленгликоль достигнет требуемой температуры, перенести раствор в контейнер, содержащий липидную смесь; (е) поместить контейнер опять в нагревательную ванну до тех пор, пока раствор не станет прозрачным; (f) механически перемешать раствор липидная смесь/пропиленгликоль для дополнительного обеспечения полного растворения и однородного диспергирования липидной смеси. Отношение липидной смеси к неводному растворителю будет ограничено, конечно, растворимостью липидной смеси. На это отношение будет оказывать влияние требуемое количество липидной смеси в конечном составе. Предпочтительно, отношение составляет от приблизительно 1 мг липидной смеси на мл растворителя (мг/мл) до приблизительно 100 мг/мл. Более предпочтительно, липидная смесь присутствует в количестве примерно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14 или 15 мг/мл. Еще более предпочтительно, липидная смесь присутствует в количестве примерно 10 мг/мл. 11 Стадия (2) Вторая стадия включает контактирование раствора со стадии (1) с водным раствором для получения липидной суспензии. Водным раствором может быть вода, солевой раствор, смесь солевого раствора и глицерина или смесь солевого раствора, глицерина и неводного растворителя. Неводным растворителем является такой,как указано ранее, предпочтительно пропиленгликоль. Термин суспензия, как определено в данном описании, означает дисперсию, в которой нерастворимые частицы диспергированы в жидкой среде. После полного растворения липидной смеси (стадия (1, полученный раствор может быть затем добавлен к водному раствору. Водный раствор может содержать один или более компонентов, выбранных из хлористого натрия,глицерина и неводного растворителя. Предпочтительно, водный раствор содержит глицерин и хлористый натрий. Предпочтительно, перед добавлением раствора со стадии 1 в водном растворе присутствует достаточное количество пропиленгликоля, чтобы обеспечить достижение конечной требуемой концентрации пропиленгликоля. Предполагается, что порядок добавления требуемых компонентов не влияет серьезно на получаемую липидную суспензию. Однако предпочтительно раствор липидной смеси добавляют к воде, которая может уже содержать вышеуказанные дополнительные компоненты. Затем могут быть добавлены дополнительные необходимые компоненты. Более предпочтительно, раствор липидной смеси добавляют к раствору воды и хлористого натрия (т.е. солевому раствору). Дополнительно предпочтительно раствор липидной смеси добавляют к раствору воды, хлористого натрия и глицерина. Еще более предпочтительно, раствор липидной смеси добавляют к раствору воды, хлористого натрия, глицерина и пропиленгликоля. Предпочтительно, количество NaCl составляет 6,8 мг на мл состава. Предпочтительно,количество глицерина составляет 0,1 мл на мл состава. Предпочтительной является конечная концентрация, составляющая 0,1 мл пропиленгликоля на мл состава. Конечный рН состава предпочтительно составляет приблизительно 5,5-7,0. Липидная смесь предпочтительно присутствует в количестве 0,75-1,0 мг/мл состава. Температура водного раствора может изменяться от температуры окружающей среды до 70 С. Предпочтительно, температура составляет приблизительно 45-60 С, при этом еще более предпочтительной является температура, составляющая 50, 51, 52, 53, 54 или 55 С. Для достижения полного растворения смесь необходимо взбалтывать, предпочтительно, перемешивать. Может также потребоваться регулирование рН раствора в зависимости от требуемого конечного состава. Для этого может быть до 002978 12 бавлена или кислота (например, НСl) или основание (например, NaOH). Липидная суспензия будет содержать жидкие частицы различных размеров. Одним из преимуществ данного изобретения является возможность постоянного получения небольших частиц, имеющих почти одинаковый размер. Таким образом, предпочтительно, чтобы большая часть получаемых частиц имела диаметр менее чем 100 нм, более предпочтительно менее чем 50 нм. Предпочтительной процедурой растворения липидной смеси являются следующие: (а) поместить воду для инъекций (ВДИ) в емкость для перемешивания; (b) начать перемешивание и обеспечить температуру 50-55 С; (с) добавить в емкость для перемешивания хлористый натрий. Перед осуществлением следующей стадии, подождать, пока твердое вещество не растворится полностью; (d) добавить в емкость для перемешивания глицерин и дать достаточно времени для полного перемешивания; (е) добавить оставшийся пропиленгликоль, которого не было в растворе липидной смеси и пропиленгликоля. Дать достаточно времени для тщательного перемешивания; (f) уменьшить скорость перемешивания для снижения турбулентности в емкости для перемешивания; (g) добавить раствор липидной смеси и пропиленгликоля в емкость для перемешивания; (h) подрегулировать перемешивание до начальной скорости; (i) при необходимости добавить дополнительную воду для инъекций; (j) продолжать перемешивание в течение приблизительно 25 мин и обеспечить полное перемешивание; (k) проверить и довести раствор до необходимого уровня рН. Стадия (3) Стадия 3 включает нагревание липидной суспензии, полученной на стадии (2) , до температуры, приблизительно равной или выше наивысшей температуры перехода геля в жидкокристаллическую фазу липидов, присутствующих в растворе. Одной из целей данной стадии является получение фильтруемой суспензии. Раствор/суспензия считается фильтруемой, если на протяжении нормального процесса не происходит существенного снижения скорости потока, а также не происходит существенного увеличения падения давления в фильтрационный системе. Экспериментальные данные показывают,что липиды в составе не должны находиться в состоянии перехода из гелевой в жидкокристаллическую фазу для упрощения стерильной фильтрации. Когда липиды имеют температуру ниже температуры фазового перехода, частицы суспензии являются твердыми. Однако, если их температура выше их соответствующих температур перехода из гелевой в жидкокристаллическую фазу, то они имеют более свободно организованную конфигурацию и, следовательно,могут быть легче отфильтрованы.DPPC и DPPA имеют температуры фазового перехода, составляющие 41 и 67 С, соответственно.MPEG5000-DPPE растворим в воде, поэтому он не имеет перехода из гелевой в жидкокристаллическую фазу, характерную для большинства гидратированных липидных суспензий. Поскольку липиды в предпочтительном составе все имеют различные переходы из гелевой в жидкую фазу, то для фильтрации раствора предпочтительно используют наивысшую температуру фазового перехода, составляющую 67 С. Поддерживая температуру при 67 С или выше, все липиды находятся вне их соответствующего фазового перехода, обеспечивая свободную конфигурацию при прохождении через фильтры. Нагревание может быть достигнуто путем снабжения емкости для перемешивания теплообменным змеевиком. Горячая вода/пар из контролируемого источника, например, горячей водяной ванны или водного нагревателя, дают достаточно тепла для поддержания смешиваемого раствора при заданной температуре. Могут быть также использованы другие источники тепла,известные специалистам в данной области. Стадия (4) Стадия (4) включает фильтрацию липидной суспензии через стерилизующий фильтр. Целью этой стадии является получение суспензии, по существу свободной от бактерий. Фильтрат считается по существу свободным от бактерий, если вероятность содержания в фильтрате, по меньшей мере, одного колониеобразующего микроорганизма составляет менее чем 10-6. Фильтрацию предпочтительно проводят,используя стерилизующие фильтрующие элементы. Могут также понадобиться средства нагнетания раствора через фильтры (например,подача насосом или под давлением). Поскольку фильтруемый раствор необходимо поддерживать при температуре равной или выше наивысшей температуры перехода геля в жидкокристаллическую фазу липидов, присутствующих в растворе, фильтрацию следует проводить при приблизительно такой же температуре. Для этого фильтры (например, стерилизующие фильтрующие элементы) предпочтительно заключают в кожухи для фильтра, снабженные рубашкой, которые непрерывно нагревают, например, потоком горячей воды из водяной ванны с контролируемой температурой, чтобы обеспечить температуру суспензии, превышающую температуры фазового перехода липидов. Температура стерилизующего фильтра предпочтительно составляет от 50 до 100 С,более предпочтительно от 60 до 90 С и еще более предпочтительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,77, 78, 79 или 80 С. Для фильтрации суспензии могут быть использованы один или более стерилизующих фильтров. Требуемое количество зависит от эффективности фильтра при удалении бактерий. 14 Предпочтительно применять два фильтра. Размер пор фильтра будет ограничиваться необходимостью обеспечения свободной от бактерий суспензии. Предпочтительно применение 0,2 мкм гидрофильных фильтров. Основной объем раствора предпочтительного состава непрерывно фильтруют через два 0,2 мкм гидрофильных фильтра в течение вплоть до трех часов при скорости, приблизительно 1 л/мин, т.е. пропуская в целом 180 л раствора суспензии через фильтры. Экспериментальные результаты показывают, что видимой закупорки фильтров не происходит. Анализы липидов показывают, что во время фильтрации не происходит измеримых потерь (благодаря накоплению в среде фильтра). Основной объем раствора предпочтительного состава смешивают при 40-80 С, и суспензию перед стерильной фильтрацией охлаждают до температуры окружающей среды. Очевидной закупорки фильтров не наблюдается, что означает что распределение частиц по размерам суспензии значительно ниже 0,2 мкм размера пор фильтра. Во время фильтрации желательно применять нагревание, чтобы обеспечить максимальное восстановление липидной смеси в стерильном фильтре (т.е. чтобы свести к минимуму потенциальное удержание липидных частиц в среде фильтра). Для фильтрования липидной суспензии предпочтительной является следующая процедура: (а) убедиться, что все фильтры, снабженные рубашкой, имеют температуру 70-80 С; (b) убедиться, что все клапаны фильтрационного узла закрыты; (с) соединить рукав входного отверстия для фильтрации с выходным отверстием емкости для перемешивания; (d) открыть клапаны, пропуская раствор через фильтры; (е) перед сбором фильтрата пропустить 3 л раствора через фильтры; (f) продолжать фильтрацию до ее завершения. Стадия (5) Распределение отфильтрованного раствора в ампулы завершает стадию (5). Предпочтительно, эту стадию проводят в контролируемом асептическом участке. Специалисту в данной области понятно, что выбор ампулы и количество суспензии, помещаемой в нее, зависят от конечного назначения липидной суспензии. Распределение можно проводить различными способами, включая пипетку, ручное шприцевое распределяющее устройство (например, шприцевая распределяющая машина Filamatic) или промышленную автоматическую распределяющую машину (например, машина для автоматического наполнения Cozzoli или TL). Стадия (6) Стадию (6) осуществляют заменой газа в верхней свободной части ампул со стадии (5) на перфторированный углеводород. Предпочтительный способ замены представляет загрузку наполненных ампул в камеру лиофилизатора и замену газа в верхней свободной части ампул на перфторированный углеводород. Предпочтительным газом является перфторпропан (PFP). Могут быть также использованы другие способы замены газа в верхней свободной части ампул, известные специалистам в данной области. Ампулы запечатывают по окончании цикла по замене газа в их верхней свободной части. Затем давление в камере лиофилизатора вновь доводят до атмосферного, подавая в камеру перфторпропан. Чтобы запечатать ампулы, в них вставляют пробки. Стадия (7) Стадия (7) включает окончательную стерилизацию ампулы после стадии (6). Один из способов окончательной стерилизации включает применение автоклава. Запечатанные ампулы также могут быть окончательно стерилизованы в паровом стерилизаторе с целью дополнительного повышения надежности стерильности продукта. Во время процесса стерилизации необходимо проявлять осторожность, поскольку в результате автоклавирования может наблюдаться некоторая деградация липидов. Предпочтительно, ампулу стерилизуют при температуре приблизительно 126-130 С в течение 1-10 мин. Другие признаки данного изобретения станут очевидными в ходе следующих описаний иллюстративных вариантов, приводимых для иллюстрации изобретения, а не для его ограничения. ПРИМЕРЫ Таблица 1. Целевой состав липидной смеси Название липида Процедура получения липидной смеси В колбу загружают толуол (3,3 л), метанол(1,2 л), DPPA (59,6 г), DPPC (535 г) и МРЕG5000 DPPE (405 г). После промывания контактных поверхностей твердых веществ 0,9 л метанола, суспензию нагревают до 45-55 С до завершения растворения. Раствор фильтруют и затем концентрируют в вакууме при 35-45 С до густого геля. Добавляют метил трет-бутиловый эфир (МТВЕ,5,4 л) и смесь суспендируют при 15-30 С. Твер 16 дые белые вещества собирают центрифугированием или вакуумной фильтрацией и промывают МТВЕ (0,9 л). Твердые вещества затем помещают в вакуумную печь и сушат до постоянной массы при 40-50 С. Высушенную липидную смесь переносят в бутыль и хранят при температуре от -15 до -25 С. В другом варианте процедуры получения липидной смеси в соответствии с данным изобретением может быть также использована следующая процедура. Альтернативная процедура получения липидной смеси Количества фосфолипидов приводят в соответствие с чистотой на основании величины Использовать какиз сертификатов анализа. Размер партии (общая масса фосфолипидов) в этом эксперименте составляет 2 кг. В колбу для роторного выпаривания загружают последовательно толуол (3.300 мл), метанол(1.200 мл), DPPA (122,9 г; приведенный в соответствие с чистотой Использовать как , составляющей 97,0%), DPPC (1.098,5 г в целом; 500,8 г из партии с чистотой Использовать как 98,4% и 597,7 г из партии с чистотой Использовать как 96,7%) и MPEG5000 DPPE (815,7 г; приведенный в соответствие с чистотой Использовать как, составляющей 99,3%). После промывания остаточных твердых веществ в колбе метанолом (900 мл) колбу помещают в роторный испаритель(без вакуума) и суспензию нагревают до температуры от 45 до 55 С (наружная). Завершив растворение, наружную температуру понижают до 35-45 С, применяют вакуум и раствор концентрируют до белого полутвердого вещества. Колбу удаляют из испарителя и твердые вещества разбивают шпателем. Колбу вновь помещают в испаритель и продолжают концентрирование. После достижения конечной точки (конечное вакуумное давление 20 мбар; белое, гранулированное, комковатое твердое вещество),через загрузочную трубу роторного испарителя добавляют МТВЕ (5.400 мл), вакуум отключают и смесь суспендируют в течение 15-45 мин 1530 С. Твердые вещества выделяют либо фильтрацией центрифугированием либо вакуумной фильтрацией, промывают МТВЕ (3.800 мл) и сушат до постоянной массы в вакуумной печи(40-50 С). Перед переносом в полиэтиленовые бутыли с полипропиленовыми крышками, твердые вещества избавляют от комков, просеивая через сито (0,079 дюймов (0,2 см) меш) и получая 1.966,7 г (98%) липидной смеси (SG896) в виде твердого белого вещества. Предпочтительная липидная суспензия содержит: 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфотидную, мононатриевую соль (DPPA); 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин (DPPC);(MPEG5000-DPPE); пропиленгликоль (Фармакопея) США (USP); глицерин, Ф США; хлористый натрий, Ф США; и воду для инъекций, Ф США. Таблица 2. Предпочтительные составы контрастного вещества КомпонентNaCl, Ф США Глицерин, Ф США Пропиленгликоль, Ф США Липидная смесь Перфторпропан рH Состав А содержит 1 мг/мл липидной смеси. Состав В имеет концентрацию липидной смеси, составляющую 0,75 мг/мл.Липидная смесь состоит из 53,5 маc.%MPEG5000-DPPE. Таблица 3. Предпочтительный контейнер и перегородка Компонент Ампула Пробка Уплотнение Объем наполнения готового продукта может составлять от 1,0-2,0 мл на ампулу. При получении предпочтительного состава, когда липидную смесь непосредственно гидратируют с водным матричным раствором, содержащим воду для инъекций, хлористый натрий, глицерин и пропиленгликоль, фильтраты содержат меньше липидов по сравнению с основным объемом раствора до фильтрации. Потеря липидов составляет от 12 до 48%. Эти результаты показывают, что процесс стерильной фильтрации контролируется неэффективно, и поэтому содержание липидов в конечном продукте сильно варьируется. В отличие от этого, при использовании описываемого способа результаты анализа липидов показывают полное восстановление липидов во время процесса фильтрации. Непосто 18 янство результатов анализа вокруг теоретических расчетов находится в пределах нормального непостоянства метода анализа. Распределение частиц по размерам по количеству, объему и интенсивности отражения суспензии, полученной путем первой солюбилизирующей липидной смеси в пропиленгликоле, показывают,что размер большинства частиц составляет менее или 50 нм в основном объеме раствора до фильтрации при 55 С, а также при 70 С. Профиль распределения частиц не изменяется после фильтрации. Полезность Заявляемый способ полезен для получения ультразвуковых контрастных веществ. Такие вещества могут быть использованы для получения различных изображений, включая усиление контраста на эхокардиографических и радиологических ультразвуковых снимках. Очевидно, в свете вышеприведенных указаний возможны различные модификации и вариации данного изобретения. Следовательно,необходимо понимать, что в объеме прилагаемой формулы изобретения, данное изобретение может быть осуществлено иначе, чем раскрыто в описании. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения фосфолипидной суспензии, включающий(a) контактирование, по меньшей мере,двух липидов с первым неводным растворителем с образованием раствора;(b) концентрирование раствора до густого геля;(c) контактирование густого геля со вторым неводным растворителем с образованием раствора;(d) концентрирование раствора со стадии(e) контактирование липидной смеси с третьим неводным растворителем, в результате чего липидная смесь, по существу, растворяется в третьем неводном растворителе с образованием раствора и(f) без удаления третьего неводного растворителя контактирование раствора со стадии(е) с водным раствором с образованием фосфолипидной суспензии. 2. Способ по п.1, в котором на стадии (а) первый неводный растворитель представляет собой смесь метанола и толуола. 3. Способ по п.1, в котором на стадии (с) второй неводный растворитель представляет собой метил трет-бутиловый эфир. 4. Способ по п.1, в котором на стадии (а) раствор нагревают до температуры, достаточной для полного растворения липидов в растворителе. 5. Способ по п.1, в котором на стадии (а) раствор нагревают до примерно 25-75 С. 6. Способ по п.1, в котором на стадии (d) липидную смесь промывают метил третбутиловым эфиром и сушат в вакууме. 7. Способ по п.1, в котором неводный растворитель стадии (е) выбирают из группы, состоящей из пропиленгликоля, этиленгликоля и полиэтиленгликоля 300. 8. Способ по п.7, в котором неводный растворитель стадии (е) представляет собой пропиленгликоль. 9. Способ по п.7, в котором липидная смесь содержит(c) N-(метоксиполиэтиленгликоль 5000 карбамоил)-1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин, мононатриевую соль. 10. Способ по п.7, в котором неводный растворитель стадии (е) перед контактированием с липидной смесью нагревают до температуры приблизительно 30-70 С. 11. Способ по п.10, в котором неводный растворитель стадии (е) перед контактированием с липидной смесью нагревают до температуры приблизительно 50-55 С. 12. Способ по п.7, в котором отношение липидной смеси к неводному растворителю стадии (е) составляет от примерно 5 мг липидной смеси на мл неводного растворителя до примерно 15 мг/мл. 13. Способ по п.12, в котором отношение липидной смеси к неводному растворителю стадии (е) составляет примерно 10 мг/мл. 14. Способ по п.7, в котором на стадии (f) водный раствор выбирают из группы, состоящей из воды, солевого раствора, смеси солевого раствора и глицерина и смеси солевого раствора, глицерина и неводного растворителя. 15. Способ по п.14, в котором водный раствор представляет собой смесь солевого раствора и глицерина. 16. Способ по п.14, в котором водный раствор представляет собой смесь солевого раствора, глицерина и пропиленгликоля. 17. Способ по п.16, в котором присутствуют 6,8 мг/мл хлористого натрия, 0,1 мл/мл глицерина, 0,1 мл/мл пропиленгликоля и приблизительно 0,75-1,0 мг/мл липидной смеси. 18. Способ по п.17, в котором присутствуют 0,75 мг/мл липидной смеси. 19. Способ по п.17, в котором присутствуют 1,0 мг/мл липидной смеси. 20. Способ по п.7, в котором на стадии (f) водный раствор перед контактированием с раствором со стадии (е) нагревают до температуры приблизительно 45-60 С. 21. Способ по п.20, в котором водный раствор перед контактированием с раствором со 20 стадии (е) нагревают до температуры приблизительно 50-55 С. 22. Способ по п.1, дополнительно включающий (g) нагревание липидной суспензии со стадии (f) до температуры, приблизительно равной или выше наивысшей температуры перехода геля в жидкокристаллическую фазу липидов,присутствующих в суспензии. 23. Способ по п.22, в котором на стадии (g) липидную суспензию нагревают до температуры, по меньшей мере, примерно 67 С. 24. Способ по п.22, дополнительно включающий (h) фильтрацию липидной суспензии через стерилизующий фильтр. 25. Способ по п.24, в котором на стадии (h) фильтрацию проводят с использованием двух стерилизующих фильтрующих элементов. 26. Способ по п.25, в котором на стадии (h) стерилизующие фильтрующие элементы имеют температуру от приблизительно 70 до 80 С. 27. Способ по п.26, в котором на стадии (h) используют 0,2 мкм гидрофильные фильтры. 28. Способ по п.24, дополнительно включающий (i) распределение отфильтрованного раствора со стадии (h) в ампулу. 29. Способ по п.28, дополнительно включающий (j) замену газа в верхней свободной части ампулы со стадии (i) на перфторированный углеводород. 30. Способ по п.29, в котором перфторированный углеводород представляет собой перфторпропан. 31. Способ по п.30, в котором замену газа в верхней свободной части (ампулы) проводят,используя камеру лиофилизатора. 32. Способ по п.29, дополнительно включающий (k) стерилизацию ампулы со стадии (j). 33. Способ по п.32, в котором на стадии (k) ампулу стерилизуют при температуре приблизительно 126-130 С в течение 1-10 мин. 34. Способ получения фосфолипидной смеси, включающий(a) контактирование, по меньшей мере,двух фосфолипидов с первым неводным растворителем с образованием раствора;(b) концентрирование раствора до густого геля;(c) контактирование густого геля со вторым неводным растворителем с образованием раствора;(d) концентрирование раствора со стадии(с) до твердых фосфолипидов и(e) сбор твердых липидов; где первым неводным растворителем является смесь метанола и толуола, и где вторым неводным растворителем является метил третбутиловый эфир.