Способ прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом

СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ ИНФЛИКСИМАБОМ Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и представляет собой способ прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом путем определения молекулярного состава образца биопсии кожи и сыворотки крови больного псориазом до начала лечения, получения и исследования биоптата кожи и сыворотки крови больного псориазом, определения в биоптате кожи полиморфизма в позиции 676 шестого экзона гена TNFR-II, определения в сыворотке крови содержания IL-10. При выявлении гомозиготного генотипа ТТ в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II и высоком (2,7 пг/мл) содержании IL-10 в сыворотке прогнозируют высокую эффективность лечения, а при выявлении гомозиготного генотипа GG позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II и низком (1,0 пг/мл) содержании IL-10 в сыворотке прогнозируют низкую эффективность лечения. Данный способ позволяет экономить значительные материальные средства, затрачиваемые на лечение, а также избежать побочных эффектов терапии. Кубанова Анна Алексеевна,Кубанов Алексей Алексеевич,Лесная Ирина Николаевна, Фриго Наталия Владиславовна, Каганова Наталия Леонидовна, Знаменская Людмила Федоровна, Васильева Елена Леонидовна, Ротанов Сергей Владимирович, Волков Илья Алексеевич, Яковлева Светлана Васильевна, Жилова Марьяна Борисовна, Бутарева Мария Михайловна (RU) КАГАНОВА Н.Л. и др. "Возможности прогнозирования клинического ответа на лечение больных псориазом инфликсимабом". Тезисы 2 форума НАДК,Ростов-на-Дону,2008,рефератRU-A-2006112587 МАТУШЕВСКАЯ Ю.И. "Оценка эффективности терапии больных тяжелыми формами псориаза с применением генно-инженерного биологического препарата инфликсимаб на основе клинических и иммунологических показателей". Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, М., 2008, 18 с., стр. 2, 4, 5, 14-17 ГНИЛОРЫБОВ A.M. и др. "Биологическая терапия аутоиммунных заболеваний: клиническая эффективность и возможности ее прогнозирования". Украiнська Ревматологiчна школа, 1-3 березня 2007"ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНОЙ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ" (RU) 016240 Область техники, к которой относится настоящее изобретение Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и представляет собой способ определения прогноза эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом. Изобретение может быть использовано для индивидуализации терапии больных псориазом. Предшествующий уровень техники настоящего изобретения Псориаз является одним из наиболее распространенных заболеваний кожи, он поражает около 1,52% населения. В последние годы в Российской Федерации значительно участились случаи развития тяжелых форм заболевания, приводящих к нарушению трудоспособности, развитию инвалидизации и значительному снижению качества жизни. Традиционные методы лечения тяжелых форм псориаза (фотохимиотерапия, применение иммуносупрессоров и другие) часто оказывают лишь кратковременный эффект в виде непродолжительных ремиссий, что определяет актуальность разработки принципиально новых методов терапии псориаза и прогнозирования их эффективности. Одним из основных звеньев патогенеза псориаза является избыточная продукция медиаторов иммунного ответа - цитокинов, обладающих провоспалительной активностью. Ключевую роль в развитии воспалительной реакции играет фактор некроза опухоли(TNF-), который индуцирует синтез других провоспалительных цитокинов, включая IL-8, IL-6, IFN-, а также способствует индукции экспрессии молекул внутриклеточной адгезии, миграции активированных иммунокомпетентных клеток и увеличению продукции сосудистого фактора роста, что приводит к активации пролиферативных процессов в коже. Учитывая важную роль TNF- в патогенезе псориаза, с использованием биотехнологических методов были разработаны принципиально новые лекарственные средства - биологические модификаторы иммунного ответа (БМИО), механизм действия которых основан на блокаде функциональной активностиTNF-. Показаниями для назначения этих препаратов являются тяжелое течение заболевания и неэффективность других методов системной терапии псориаза. В сравнении с традиционными методами лечения псориаза биологические модификаторы иммунного ответа обладают рядом преимуществ. Благодаря специфичности воздействия на продукцию TNFбиологические агенты оказывают выраженный терапевтический эффект у большинства больных тяжелыми формами псориаза и псориатическим артритом, вызывая регресс псориатических высыпаний,уменьшение болевого синдрома, нормализацию общего состояния и улучшение качества жизни. Оказывая выраженный противовоспалительный эффект, биологические модификаторы иммунного ответа предотвращают развитие инвалидизирующих форм псориаза и псориатического артрита. Длительное сохранение высоких концентраций препарата в сыворотке крови способствует наступлению продолжительных ремиссий заболевания, в течение которых больной псориазом чувствует себя здоровым человеком. Вместе с тем, далеко не все пациенты отвечают на введение этих препаратов в одинаковой степени. У большинства больных псориазом наблюдается выраженный терапевтический эффект от применения биологических модификаторов иммунного ответа, тогда как в 25-30% случаев отмечается резистентность к проводимой терапии. В настоящее время больным тяжелыми формами псориаза в рамках приоритетного национального проекта Здоровье по профилю Дерматология за счет средств федерального бюджета оказывается высокотехнологичная медицинская помощь с использованием дорогостоящих препаратов, в том числе биологических модификаторов иммунного ответа. Затраты на лечение одного больного псориазом биологическими агентами в Российской Федерации при этом составляют в среднем около 1 млн рублей в год. С 2007 г. в соответствии с Приказом 776 от 18 декабря 2007 г. один из биологических модификаторов иммунного ответа (инфликсимаб) включен в утвержденный Минздравсоцразвития стандарт медицинской помощи больным псориатическим артритом. С 2008 г. назначение инфликсимаба вошло в утвержденный Приказом 780 Минздравсоцразвития от 18 декабря 2007 г. стандарт медицинской помощи больным псориазом. Кроме того, инфликсимаб входит в Перечень лекарственных средств, отпускаемых по рецептам врача (фельдшера) при оказании дополнительной бесплатной медицинской помощи отдельным категориям граждан, имеющим право на получение государственной социальной помощи,утвержденный Приказом 665 Минздравсоцразвития от 18 сентября 2006 г. Инфликсимаб (Remicade) - представитель группы препаратов биологических модификаторов иммунного ответа, полученных с помощью биотехнологических методов и специфично блокирующих рецепторы провоспалительных цитокинов. Инфликсимаб представляет собой химерный белок, сконструированный из фрагментов мышиного и человеческого IgG1. Он обладает высокой аффинностью к человеческому TNF-, играющему значительную роль в развитии аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в том числе псориаза и псориатического артрита. Механизм его действия основан на связывании и образовании устойчивого соединения с обеими формами человеческого TNF- (растворимой и трансмембранной). Связывание инфликсимаба сTNF- предотвращает взаимодействие последнего с его натуральными рецепторами, блокирует инициацию каскада сигналов, ведущих к генной транскрипции и последующей биологической активности. Такой механизм действия препарата обуславливает его терапевтическую эффективность.-1 016240 Специфичность инфликсимаба по отношению к TNF- подтверждена его неспособностью нейтрализовать цитотоксический эффект лимфотоксина- (LT- или TNF-) - цитокина, который может связываться с теми же рецепторами, что и TNF-. Препарат вводится больным псориазом в дозировке 5 мг/кг массы тела внутривенно капельно медленно по схеме 0-2-6 недель и затем каждые 8 недель. По данным компании Schering-Plough (США) в 2007 г. курс лечения инфликсимабом в РФ получали как минимум 300 пациентов. Из них около 200 больных получили препарат за счет средств федерального бюджета и стоимость их лечения составила не менее 200 млн руб. в год. В связи с включением данного препарата в утвержденный протокол лечения псориаза доля затраченных на приобретение инфликсимаба средств федерального бюджета может резко возрасти. Отмена препарата даже у 10% больных по причине заведомой неэффективности позволит сэкономить не менее 20 млн руб. ежегодно. Учитывая высокую стоимость лечения больных псориазом биологическими модификаторами иммунного ответа, а также возможность развития нежелательных побочных реакций на лечение у больных,особую актуальность представляет персонализированный подход к назначению такой терапии, который должен быть основан на разработке методов, позволяющих до назначения лечения прогнозировать его терапевтическую эффективность. Анализ доступной литературы и предварительные патентные исследования показали, что в настоящее время такого подхода к назначению лечения больных псориазом биологическими модификаторами иммунного ответа не существует. При проведении патентного поиска был выявлен лишь один патент, касающийся способа прогнозирования терапевтической эффективности и индивидуального подхода к лечению воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Изобретение в соответствии с международной патентной публикацией WO 2005/054850, принадлежащее Robert Bosch Gesellschaft fur Medizinische Forschung (Германия), относится к способам диагностики для прогнозирования терапевтической эффективности и индивидуального подхода к лечению воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Этот метод азатиоприновой терапии (определяется уровень 6 тиогуанозиннуклеотида в пробах) предназначен для диагностики воспалительных и аутоиммунных желудочно-кишечных болезней: болезни Крона и язвенного колита. Азатиоприн - иммунносупрессивный и противовоспалительный агент, который часто используют для лечения хронических воспалительных заболеваний, таких как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, билиарный цирроз печени. Также раскрыты новые способы терапевтического мониторинга при лечении азатиоприном (имураном) либо оптимизации клинической ответной реакции пациента на азатиоприновую терапию по изменению уровня 6-тиогуанозиннуклеотида в пробах, полученных от пациента. Однако это изобретение основано на использовании соединений, принципиально отличных от биологических модификаторов иммунного ответа как структурно, так и по механизму действия, а кроме того, не относится к способам прогнозирования терапевтической эффективности при лечении псориаза. Раскрытие настоящего изобретения Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом на уровне молекулярных мишеней его фармакологического воздействия с целью использования в качестве критерия отбора пациентов для целенаправленного проведения медикаментозной терапии инфликсимабом. Технический результат изобретения заключается в возможности прогнозирования эффективности терапии больных псориазом инфликсимабом на основании определения молекулярных маркеров в биоптате кожи и сыворотке крови больных до лечения, что позволяет экономить значительные материальные средства, затрачиваемые на лечение, а также избежать побочных эффектов терапии. Это достигается за счет того, что у больного производят забор биоптата кожи с очага поражения и забор крови из локтевой вены; осуществляют гомогенизацию биоптата кожи и производят выделение ДНК, амплификацию ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-R-II; детекцию и визуализацию продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-R-II (оценочный электрофорез); обработку амплификатов рестриктазой NlaIII; детекцию и визуализацию продуктов рестрикции (оценочный электрофорез 2) и анализ полученных результатов; стандартным способом получают сыворотку крови и в ней проводят определение содержания интерлейкина IL-10 с использованием технологии хМАР. Результатом проведенного исследования является определение генотипа больного псориазом в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II; при этом при выявлении гомозиготного генотипа ТТ в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II прогнозируют высокую эффективность лечения больного псориазом инфликсимабом, а при выявлении гомозиготного генотипа GG позиции 676 шестого экзона гена TNF-RII прогнозируют низкую эффективность лечения. Настоящее изобретение было создано в ходе выполнения научно-исследовательской работы Разработка молекулярных методов повышения эффективности лечения псориаза препаратами биологических модификаторов иммунного ответа (Государственный контракт 02.512.11.2199 от 12.05.2008 г.). Объектом исследования являлись 22 больных тяжелыми и среднетяжелыми формами псориаза, по-2 016240 лучавшие лечение инфликсимабом. Для оценки эффективности терапии больных псориазом инфликсимабом и проведения статистической обработки данных был применен объективный критерий - изменение площади поражения кожи пациентов псориатическими высыпаниями под влиянием проведенной терапии - PASI. В зависимости от результата лечения инфликсимабом больные были разделены на 2 группы: первую группу (14 человек) составили пациенты с хорошим эффектом от проведенного лечения,у которых величина PASI была 75%. Вторую группу (8 человек) составили пациенты с недостаточным эффектом или отсутствием эффекта от терапии инфликсимабом, у которых величина PASI составила менее 75%. При проведении исследований до начала лечения у пациентов проводилось изучение молекулярной структуры гена TNF-, кодирующего молекулярную мишень инфликсимаба - цитокин TNF-; молекулярной структуры генов, кодирующих рецепторы TNF- (первого экзона гена TNF-R-I и шестого экзона гена TNF-R-II); содержания провоспалительных и воспалительных цитокинов в сыворотке крови больных псориазом. В результате проведенных исследований было установлено, что между группами больных существуют различия генотипа в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II. При этом частота встречаемости гомозиготного ТТ генотипа гена в 676 положении у больных с выраженным ответом на инфликсимаб была достоверно выше (р 0,05), чем у пациентов с недостаточно выраженным ответом на препарат или отсутствием ответа. Напротив, частота встречаемости гомозиготного GG генотипа гена в 676 положении была достоверно выше (р 0,01) у больных с отсутствием ответа или ослабленным ответом на инфликсимаб в сравнении с больными с выраженным ответом на данный препарат. Полученные данные были подтверждены результатами корреляционного анализа: гомозиготный ТТ генотип гена в 676 положении ассоциировался с высокой интенсивностью ответа больного на лечение инфликсимабом, а гомозиготныйGG генотип гена в 676 положении - с ослабленным ответом на лечение инфликсимабом. Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что генотип в положении 676 в шестом экзоне гена TNF-R-II может быть ответственен за различный клинический ответ на инфликсимаб у пациентов с псориазом. В результате изучения уровня выбранных для исследования цитокинов в сыворотке крови больных псориазом (TNF-, IL-6, IL-8, IL-10) было установлено, что единственным значимым критерием, позволяющим прогнозировать эффективность терапии больных псориазом инфликсимабом (разница между группами больных статистически достоверна р 0,001), является определяемый до лечения в сыворотке крови уровень IL-10, высокие значения которого - 2,7 пг/мл (нижний предел высокого значения с учетом ошибки средней величины; средние значения по группе 2,90,3) - позволяют прогнозировать высокую эффективность лечения больных псориазом инфликсимабом, а низкие значения - 1,0 пг/мл (верхний предел низкого значения с учетом ошибки средней величины; средние значения по группе 0,70,3 пг/мл) - позволяют прогнозировать низкую эффективность лечения или отсутствие эффекта от лечения данным препаратом. При расчете корреляционных связей между уровнем интерлейкинов и результатами проведенной терапии, проведенном с использованием коэффициента Спирмена, было установлено, что концентрация IL-10 до лечения существенно и положительно коррелирует с изменением PASI, т.е. чем выше у больного уровень IL-10 до лечения, тем больше шансов на хороший результат лечения. Данный результат был получен при использовании современной технологии хМАР, обладающей высокой аналитической чувствительностью. Проведенные исследования позволили установить, что начальный (до проведения лечения) уровень в сыворотке крови IL-10 ассоциируется с различным клиническим ответом на инфликсимаб у пациентов с псориазом. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом путем определения молекулярного состава образца биопсии кожи и сыворотки крови больного псориазом до начала лечения, предусматривающему получение и исследование биоптата кожи и сыворотки крови больного псориазом и отличающемуся тем, что осуществляют определение полиморфизма в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II, а в сыворотке крови проводят определение содержания IL-10 и при выявлении гомозиготного генотипа ТТ в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II и высоком содержании IL-10 в сыворотке прогнозируют высокую эффективность лечения, а при выявлении гомозиготного генотипа GG позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II и низком содержании IL-10 в сыворотке прогнозируют низкую эффективность лечения. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения высоким содержанием IL-10 в сыворотке крови является содержание 2,7 пг/мл, а низким содержанием IL-10 в сыворотке крови является содержание 1,0 пг/мл. Приведенные ниже примеры клинического применения настоящего изобретения позволяют заключить, что разработанный способ прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом может быть применен для решения вопроса о целесообразности назначения терапии больным-3 016240 псориазом данным препаратом. Разработанный способ имеет важную медицинскую и социальную значимость. Учитывая высокую стоимость лечения биологическими модификаторами иммунного ответа и государственное финансирование курсового лечения больных тяжелыми формами псориаза, разработанный способ позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности назначения дорогостоящего курса лечения биологическими агентами конкретному пациенту и сэкономить значительные материальные средства госбюджета. Кроме того, способ позволяет предупредить развитие побочных эффектов при лечении больных псориазом биологическими модификаторами иммунного ответа. Краткое описание чертежа На чертеже изображена электрофореграмма амплифицированных и рестрицированных фрагментов ДНК шестого экзона гена TNF-R-II. 1 - после рестрикции генотип GG; 2 - после рестрикции генотип ТТ; 3 - маркер молекулярных масс 100 b.р. (100-1000); 4 - после амплификации до рестрикции. Примеры предпочтительных вариантов осуществления изобретения Пример 1. Лабораторно-диагностическая методика прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом путем определения молекулярного состава образца биопсии кожи и сыворотки крови больного псориазом до начала лечения. У больного псориазом до начала лечения производят забор биоптата кожи с очага поражения и забор крови из локтевой вены. Забор и подготовка биоптата кожи для исследования. Взятие образца из участка пораженной кожи пациента проводится в условиях малой операционной(специальной процедурной комнаты) с использованием стерильных инструментов и расходных материалов и применением местной анестезии. Для получения материала используется медицинский скальпель. Непосредственно перед забором материала проводят обработку операционного поля 70% раствором этилового спирта, местное обезболивание проводят 2% раствором лидокаина или новокаина в количестве 5 мл. Местный анестетик вводят непосредственно под кожу. Иссекаемый участок, длина которого в три раза превышает ширину, очерчивают эллипсовидным разрезом, погружая скальпель на 0,3 см. Длинная ось эллипса располагается вдоль линий натяжения кожи. Разрез делают скорее вертикально, чем под углом. Отделение лоскута кожи проводят при оттягивании лоскута пинцетом и подрезании его скальпелем с нижней части. На дефект кожи накладывают 1-2 кетгутовых шва. На операционную рану накладывают асептическую повязку. Биоптат помещают в сухие пробирки с плотно закрывающимися крышками. Биоптат немедленно передают в лабораторию для исследования. При невозможности немедленного проведения исследования биоптат помещают в сосуд Дюара с жидким азотом. Повторное замораживание и размораживание образцов не допускается. Оттаивание образца перед исследованием производится в условиях комнатной температуры (при +18-25 С) до полного оттаивания. Для проведения молекулярно-генетических исследований биоптат должен быть гомогенизирован. Измельчение биоптата кожи осуществляется механическим способом при высокоскоростном движении специальных металлических шариков с использованием автоматической станции для разрушения и гомогенизации биологических образцов TissueLyser II. Для этого каждый биоптат помещается в пластиковую одноразовую пробирку объемом 1,5 или 2 мл в зависимости от размера биоптата. В данную пробирку добавляется 200 мкл реагента Trizol (лизирующего реагента) из коммерческого набора для выделения РНК и помещается один металлический шарик размером 0,3 мм (для 1,5 мл пробирок) или 0,5 мм (для 2 мл пробирок) с помощью пинцета или специальной пипетки-дозатора соответственно. Далее пробирка помещается в прибор на 2-5 мин при частоте движения шариков 30 ударов/с до полной гомогенизации биоптата. Наступление полной гомогенизации контролируется визуально, образец должен представлять собой однородную суспензию без крупных частиц. После завершения вышеописанной процедуры 200 мкл полученного гомогената переносятся в чистую пробирку объемом 1,5 мл. В связи с тем, что металлические шарики предназначены для многократного использования, после окончания процедуры гомогенизации каждый шарик переносится в пластиковый контейнер с водным раствором моющего средства, затем промывается дистиллированной водой и автоклавируется. Проведение исследования биоптата кожи. Исследование биоптата кожи включает ряд этапов: выделение ДНК; амплификация ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-R-II; детекция и визуализация продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-R-II (оценочный электрофорез); рестрикция продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-R-II; детекция и визуализация продуктов рестрикции (оценочный электрофорез 2); анализ полученных результатов. Выделение ДНК из биоптата. После завершения процедуры гомогенизации 400 мкл полученного гомогената переносятся в чистую пробирку объемом 1,5 мл. К полученному гомогенату добавляется 12 мкл протеиназы K (конечная-4 016240 концентрация 20 мг/мл) и инкубируется в течение 20 ч при 37 С. Дальнейшее выделение ДНК осуществляется с использованием коммерческого набора реагентовDiatom DNA Prep 100. Выделение ДНК проводится в боксе биологической безопасности во избежание загрязнения помещения и последующей контаминации инкубационной смеси чужеродной ДНК при постановке ПЦР. В состав набора реагентов Diatom DNA Prep 100 входит лизирующий реагент (Lysis reagent) с гуанидинтиоцианатом, в присутствии которого ДНК активно сорбируется на сорбенте NucleoS (суспензия сорбента), затем отмывается от белков и солей спиртовым раствором. В пробирку объемом 1,5 мл к полученному лизату добавляется 400 мкл лизирующего реагента, содержимое пробирки перемешивается переворачиванием (5-10 раз). Интенсивное встряхивание смеси не рекомендуется. Далее пробирка со смесью термостатируется при 65 С в течение 1 ч. После термостатирования пробирка со смесью центрифугируется в течение 15 с при 5000 g (12000 об/мин) в том случае,если смесь содержит несолюбилизированный клеточный дебрис или другой нерастворимый остаток. Прозрачный супернатант целиком переносится в чистую пробирку объемом 1,5 мл и к нему добавляется 20 мкл суспензии сорбента NucleoS. Перед использованием NucleoS интенсивно встряхивается на вортексе. Пробирка помещается на ротатор, перемешивается в течение 30-40 мин (10-20 об/мин), затем центрифугируется в течение 15 с при 5000 g. Супернатант удаляется осторожно, не задевая осадок. К осадку добавляется 200 мкл лизирующего реагента, смесь тщательно перемешивается на вортексе до полного гомогенного состояния. Если суспендирование затруднено из-за сильного слипания сорбента, которое может быть обусловлено высоким содержанием ДНК, то сорбент необходимо вначале осторожно суспендировать пипетированием, а затем перемешать на вортексе. Затем в пробирку добавляется 1 мл рабочего раствора солевого буфера для отмывки ДНК. Содержимое пробирки перемешивается переворачиванием пробирки 5-10 раз и центрифугируется в течение 15 с при 5000 g. Супернатант удаляется осторожно, не задевая осадок. К осадку добавляется 1 мл рабочего раствора солевого буфера, содержимое пробирки перемешивается на вортексе и центрифугируется в течение 15 с при 5000 g. Супернатант удаляется осторожно, не задевая осадок. Процедура отмывки ДНК повторяется еще один раз. Осадок подсушивается при температуре 65 С в течение 4-5 мин. ДНК элюируется из сорбента путем добавления 50-100 мкл Extragene E (100 мкл добавляется, если выделение проводится из цельной крови или другой пробы,содержащей большое количество ДНК). Extragene E отбирается из пробирки при постоянном перемешивании. Далее содержимое пробирки суспендируется на вортексе в течение 5-10 с до получения гомогенной суспензии, затем термостатируется при 65 С в течение 5-10 мин, еще раз суспендируется на вортексе и центрифугируется в течение 1 мин при 10000 g. Полученный раствор, содержащий ДНК, пригоден для дальнейшего использования. Однако через 2-3 дня рекомендуется центрифугировать данный раствор,содержащий сорбент, в течение 1 мин при 10000 g и перенести супернатант с ДНК в чистую пробирку объемом 1,5 мл. ДНК хранится при температуре 4 С. При длительном хранении рекомендуется перенести пробирки с ДНК в температуру -20 С. Амплификация ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-R-II. Для выделения ДНК шестого экзона гена TNF-R-II использованы следующие праймеры, характеристика которых представлена в табл. 1. Таблица 1 Праймеры для выделения ДНК и проведения амплификации шестого экзона гена TNF-R-II Чтобы избежать контаминации, сбор амплификационной смеси проводится в стерильном ламинаре. Амплификация осуществляется с использованием коммерческого набора реагентов "Набор реагентов для проведения ПЦР" (фирма "Синтол", Россия). Перед проведением реакции подготавливается нужное количество ПЦР пробирок объемом 0,2 мл. Пробирки маркируются соответствующим образом: положительный (K+), отрицательный (K-) контроли и исследуемые пробы (указывается номер пробы). Затем приготавливается амплификационная смесь, включающая следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку (табл. 2). После приготовления смесь компонентов перемешивается и центрифугируется на вортексе. Затем в каждую пробирку объемом 0,2 мл вносится по 20 мкл приготовленной амплификационной смеси и по 5 мкл исследуемого образца ДНК или отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используется dH2O. Общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. ПЦР проводится в амплификаторе Dyad. На первой стадии образцы подвергаются тепловой денатурации при 96 С в течение 10 мин. Затем следуют 35 циклов, состоящие из стадии денатурации ДНК: 96 С, 30 с, отжига праймеров: 60 С, 30 с и синтеза ДНК: 72 С, 60 с. На последней стадии образцы подвергаются обработке при 72 С в течение 10 мин. Детекция и визуализация продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-R-II (оценочный электрофорез). А). Приговление 2%-ного агарозного геля. Приготовление геля проводится в соответствии с указаниями Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., "Мир", 1984. Для приготовления 75 мл 2%-ного агарозного геля к 1,5 г агарозы добавляется 7,5 мл 10-кратного трисборатного буфера (10 ТВЕ) и 67,5 мл дистиллированной воды. Приготовленная смесь прогревается в СВЧ-печи 5-7 мин (до полного растворения агарозы), затем в нее добавляется 8-10 мкл бромистого этидия (10 мг/мл) и перемешивается. Расплавленная агароза охлаждается до температуры 50-60 С и заливается в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов на планшет устанавливается одна или две гребенки. В некоторых случаях при установлении гребенок используются зажимы типа бульдог (в зависимости от модели камеры для горизонтального электрофореза). Раствор агарозы застывает за 15-30 мин при комнатной температуре. Б). Разделение продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-R-II методом горизонтального электрофореза. В камеру для горизонтального электрофореза помещается 1TBE буфер, приготовленный разбавлением 10 ТВЕ буфера дистиллированной водой. После застывания агарозы гребенка/гребенки осторожно вынимается/ются из геля. Планшет с агарозным гелем переносится в камеру для проведения электрофореза. 1TBE буфер должен покрывать агарозный гель на 5-7 мм. Для электрофоретического анализа продуктов амплификации выбранных генов отбирается одинаковый объем (5 мкл) инкубационной смеси из каждой пробы, полученной в результате амплификации,смешивается с 1-2 мкл раствора, предназначенного для нанесения проб в агарозный гель (содержит бромфеноловый синий), и наносится в карманы геля. Для установления точного размера амплифицируемого продукта в один из карманов агарозного геля вносится маркер молекулярной массы ДНК в растворе, предназначенном для нанесения на гель (100 bp) GeneRuler. Затем электрофоретическая камера подключается к источнику питания и задается напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/см. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации осуществляется в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль над электрофоретическим разделением осуществляется визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна пройти от старта 1,5-2 см или 6-8 см в зависимости от размера используемого агарозного геля. В). Визуализация результатов электрофореза продуктов амплификации выбранных генов. После электрофореза агарозный гель фотографируется в трансиллюминаторе в коротковолновом УФ-свете (длина волны 254-310 нм) с выводом данных на экран монитора компьютера. По полученным данным последовательно оцениваются четыре параметра: 1) отсутствие светящихся полосок в дорожке, в которую был нанесен амплифицированный отрицательный контроль; 2) прошла ли реакция амплификации (наличие/отсутствие светящихся полосок в дорожках агарозного геля, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам); 3) насколько специфично прошла реакция амплификации (наличие одной/нескольких светящихся полосок в дорожках агарозного геля, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам);-6 016240 4) соответствует ли размер амплификационного продукта ожидаемому (если реакция амплификации прошла специфично и в дорожках агарозного геля, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам, определяется одна светящаяся полоска, то сравнивается положение данной полоски на геле с положением маркера молекулярных весов ДНК). Рестрикция продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена TNF-R-II. Для проведения рестрикции продуктов амплификации используется рестриктаза NlaIII (HinIII). Перед проведением реакции подготавливается нужное количество ПЦР пробирок объемом 0,2 мл и пробирки маркируются (указывается номер пробы). Затем приготавливается рестрикционная смесь, включающая следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку (табл. 3). Таблица 3 Состав рестрикционной смеси После приготовления смесь компонентов аккуратно перемешивается и центрифугируется на вортексе. Затем в каждую пробирку объемом 0,2 мл вносится по 20 мкл приготовленной амплификационной смеси и по 10 мкл продукта амплификации ДНК или отрицательного контроля. Общий объем реакционной смеси составляет 30 мкл. Рестрикция проводится в амплификаторе Dyad. На первой стадии образцы подвергаются обработке при 37 С в течение 5 мин для осуществления рестрикции, а затем обработке при 80 С в течение 5 мин для инактивации фермента. Детекция и визуализация продуктов рестрикции (оценочный электрофорез 2). Оценочный электрофорез 2 проводится так, как оценочный форез 1, за исключением того, что в данном случае для анализа отбирается одинаковый объем (15 мкл) из каждой пробы после рестрикции ДНК, смешивается с 2 мкл раствора, предназначенного для нанесения проб в агарозный гель (содержит бромфеноловый синий), и наносится в карманы геля. Анализ полученных результатов. Если в дорожке агарозного геля видна светящаяся полоска и размер продукта соответствует 242 п.н., то генотип образца - GG. Если в дорожке агарозного геля видны две светящиеся полоски и размер продуктов соответствует 134 и 113 п.н. соответственно, то генотип образца - ТТ. Если в дорожке агарозного геля видны три светящиеся полоски и размер продуктов соответствует 242, 134, 113 п.н. соответственно, то генотип образца - GT. Примеры такого электрофоретического определения генотипа проиллюстрированы на фиг. 1. Определение содержания интерлейкина IL-10 с использованием технологии хМАР. Для определения содержания IL-10 используется набор Bio-Plex Human Cytokine 1-Plex A Panel(Bio-Rad), позволяющий выявить только IL-10, или любая более емкая панель, позволяющая проводить одновременное определение ряда цитокинов, в число которых входит IL-10, например, 8-Plex (позволяет одновременно определять содержание в образцах следующих цитокинов: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10,GM-CSF, IFN-, TNF-). Исследование проводится следующим образом. Концентрацию цитокинов в образцах сыворотки крови определяют с помощью калибровочной кривой, для построения которой используют разведения стандартов (набор Bio-Plex Human Cytokine 8-PlexA Assay (Bio-Rad. Разведения готовят согласно инструкции к набору и с использованием специального буфера - Human Serum Standart Diluent (набор Human Serum Diluent kit (Bio-Rad. Увлажняют необходимое для исследования количество лунок специального микропланшета (наборReagent kit (Bio-Rad 100 мкл буфера для исследования Bio-Plex Assay buffer (набор Reagent kit (BioRad, после чего вносят в каждую лунку по 50 мкл предварительно приготовленного рабочего раствора микросфер. Для приготовления рабочего раствора микросфер используют 25-кратный исходный растворAnti-Human 8-Plex A Conjugated Beads (Bio-Plex Human Cytokine 8-Plex A Assay (Bio-Rad и буфер для разведения Bio-Plex Assay buffer (набор Reagent kit (Bio-Rad. После внесения микросфер осуществляют 2 промывки Bio-Plex Wash buffer (по 100 мкл на лунку) с использованием предварительно откалиброванной вакуумной установки, состоящей из системы для вакуумной фильтрации Vacuum Manifold (Bio-Rad) и отсасывателя медицинского ОМ-1. Затем в соответствующие лунки микропланшета вносят по 50 мкл образца или разведения стандарта, проводят инкубацию на шейкере с непрозрачной крышкой при 1100 об/мин в течение 30 с, после чего при 300 об/мин в течение 30 мин. После завершения инкубации удаляют буфер вакуумной фильтрацией и проводят 3 промывки BioPlex Wash buffer (по 100 мкл на лунку).-7 016240 Вносят в лунки по 25 мкл рабочего раствора детектирующих антител, приготовленного из исходного раствора - Human 8-Plex A Detection Antibody (Bio-Plex Human Cytokine 8-Plex A Assay (Bio-Rad с использованием специального буфера Detection Antibody diluents (набор Reagent kit (Bio-Rad. Проводят инкубацию микропланшета на шейкере с непрозрачной крышкой при 1100 об/мин в течение 30 с, после чего при 300 об/мин в течение 30 мин. После завершения инкубации удаляют буфер вакуумной фильтрацией и проводят 3 промывки BioPlex Wash buffer (по 100 мкл на лунку). В каждую из задействованных лунок вносят по 50 мкл рабочего раствора стрептавидина-РЕ, подготовленного из исходного 100-кратного раствора Streptavidin-РЕ (набор Reagent kit (Bio-Rad с использованием буфера Bio-Plex Assay buffer. Проводят инкубацию микропланшета на шейкере с непрозрачной крышкой при 1100 об/мин в течение 30 с, после чего при 300 об/мин в течение 10 мин. После завершения инкубации удаляют буфер вакуумной фильтрацией и проводят 3 промывки BioPlex Wash buffer (по 100 мкл на лунку). Аккуратно ресуспендируют образовавшиеся в каждой лунке комплексы в 125 мкл Bio-Plex Assaybuffer и инкубируют на шейкере при 1100 об/мин в течение 30 с непосредственно перед считыванием на приборе. Проводят калибровку прибора с использованием специального набора калибраторов Calibration kit(Bio-Rad). В приложении Bio-Plex Manager задают формат микропланшета, концентрации цитокинов в разведениях стандартов и другие параметры исследования, после чего проводят измерение на приборе. Результат получают автоматически, концентрация выражается в пг/мл. Результатом проведенного исследования является определение содержания IL-10 в сыворотке крови больного псориазом; причем при высоком содержании IL-10 в сыворотке (2,7 пг/мл) прогнозируют высокую эффективность лечения больного псориазом инфликсимабом, а при низком содержании IL-10 в сыворотке (1,0 пг/мл) прогнозируют низкую эффективность лечения. Примеры клинического применения настоящего изобретения Пример 1. Я. А. И., 51 год, мари, родился и живет в г. Йошкар-Ола. Инвалид 2 группы по псориазу. Диагноз: псориатическая эритродермия, псориатический артрит. Сопутствующая патология - жировой гепатоз. Анамнестические данные: наследственность не отягощена. Заболевание псориазом началось в возрасте 28 лет. Длительность заболевания составляет 23 года. Псориатический артрит начался в возрасте 45 лет, длительность псориатического артрита составляет 5 лет. Ранее получал лечение метотрексатом с хорошим эффектом, длительно получал лечение циклоспорином с клиническим выздоровлением, неотигазоном - с улучшением, парентерально глюкокортикостероиды - с кратковременным улучшением,фототерапию не получал. В связи со значительной распространенностью и тяжелым течением кожного процесса, прогрессированием псориатического артрита проведено лечение инфликсимабом в дозе 500 мг по схеме (4 инфузии). В результате терапии инфликсимабом клинические проявления заболевания разрешились. Индекс PASI до лечения составил 50,2, после лечения - 0. Динамика регресса патологического процесса, охарактеризованная по индексу PASI (PASI), составила 100%, что соответствовало выраженному клиническому эффекту от лечения инфликсимабом. При обследовании больного до лечения по описанной выше методике были выявлены лабораторные показатели (в биоптате кожи выявлен генотип ТТ в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II; содержание IL-10 в сыворотке крови составило 3,2 пг/мл), которые позволяли до лечения прогнозировать выраженный клинический эффект от лечения инфликсимабом. Пример 2. М. Л. М., 47 лет, русская. Родилась и проживает в г. Москве. Диагноз: распространенный вульгарный псориаз, прогрессирующая стадия. Сопутствующие заболевания: сахарный диабет второго типа; тромбофлебит нижних конечностей; эрозия шейки матки; астено-депрессивный синдром; жировой гепатоз; желчекаменная болезнь, ремиссия. Анамнестические данные: наследственность отягощена псориазом страдает отец. Заболевание началось в возрасте 27 лет. Длительность заболевания составляет 20 лет. Ранее получала следующую терапию: метотрексат 15-35 мг в/м 1 раз в неделю 4 с кратковременным улучшением, фототерапию 2 курса по 15 процедур - без эффекта, парентерально глюкортикостероиды: дипроспан 1,0 в/м 1 раз в 10 дней 2 - без эффекта в 2008 г. В связи с распространенностью и тяжестью процесса, а также отсутствием эффекта от ранее проводимой терапии было проведено лечение инфликсимабом в дозе 400 мг по схеме, всего 4 инфузии. В результате проведенной терапии псориатические высыпания на коже туловища и верхних конечностей разрешились. На коже голеней остаются незначительно единичные бляшки розового цвета, без шелушения в стадии разрешения. Индекс PASI до лечения составил 49, после лечения 4,0. Динамика регресса патологического процесса, охарактеризованная по индексу PASI (PASI), составила 91,8%, что соответствовало выраженному клиническому эффекту от лечения инфликсимабом. При обследовании больной до лечения по описанной выше методике были выявлены лабораторные показатели (в биоптате кожи выявлен генотип ТТ в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II; содержание IL-10 в сыворотке крови составило 3,0 пг/мл), которые позволяли до лечения прогнозировать выра-8 016240 женный клинический эффект от лечения инфликсимабом. Пример 3. К. Л. В., 40 лет, русская, родилась и проживает в г. Саратове. Диагноз: распространенный вульгарный псориаз, псориатический артрит. Сопутствующей патологии нет. Анамнестические данные: псориаз зарегистрирован в возрасте 30 лет. Наследственность не отягощена. Длительность заболевания составляет 10 лет. Псориатический артрит диагностирован в возрасте 39 лет. Продолжительность псориатического артрита составляет 1 год. Ранее получала лечение метотрексатом без эффекта, циклоспорином без эффекта, лечение глюкокортикостероидами парентерально - с улучшением, фототерапию(ПУВА-терапия) - без эффекта. В связи с тяжелым течением заболевания и торпидностью к ранее проводимой терапии было назначено лечение инфликсимабом. Проведено 3 инфузии инфликсимабом в дозе 425 мг по схеме. Однако в процессе лечения отмечалась неудовлетворительная динамика (прогрессирование кожного процесса). 4-я инфузия не проводилась из-за развития гнойно-воспалительного осложнения. Индекс PASI до лечения составил 10,1, перед 3-й инфузией - 11,2. Динамика патологического процесса, охарактеризованная по индексу PASI (PASI), составила -14%, что соответствовало отсутствию эффекта от проведенного лечения инфликсимабом. При обследовании больного до лечения по описанной выше методике были выявлены лабораторные показатели (в биоптате кожи выявлен генотип GG в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II; содержание IL-10 в сыворотке крови составило 0,5 пг/мл), которые позволяли до лечения прогнозировать отсутствие клинического эффекта или недостаточный клинический эффект от лечения инфликсимабом. Если бы с учетом полученных лабораторных показателей данной пациентке лечение не было проведено, экономический эффект составил бы 600000 рублей (стоимость 3 инфузий инфликсимаба при проведении лечения больной весом 85 кг) и можно было бы избежать развитие гнойно-септического осложнения у пациентки. Пример 4. Ж. А. В., 41 год, русский. Родился и проживает в г. Москве. Инвалид 3 группы по псориазу. Диагноз: распространенный вульгарный псориаз, прогрессирующая стадия. Псориатическитй полиартит. Длительность заболевания составляет 26 лет. Длительность псориатического артрита составляет 4 года. Сопутствующие заболевания: гипертоническая болезнь 2 стадии, 2 степени, риск 3; жировой гепатоз; ожирение 2 степени. Наследственность: псориазом страдают отец и деды по материнской и отцовской линии. Ранее получал курс ПУВА-терапии с улучшением, метотрексат внутримышечно 1 раз в неделю и кортикостероиды внутрисуставно с кратковременным эффектом. В связи с распространенностью и тяжестью течения заболевания было проведено лечение инфликсимабом в дозе 400 мг по схеме, всего 4 инфузии. В результате проведенной терапии псориатические высыпания на коже туловища и верхних конечностей значительно побледнели, однако полного разрешения элементов не отмечалось. Отечность и ограничение активных движений в пораженных суставов сохранялись. Индекс PASI до лечения составил 23,2, после лечения 18,2. Динамика патологического процесса, охарактеризованная по индексу PASI(PASI), составила 65,2% и характеризовала недостаточный эффект от терапии инфликсимабом. При обследовании больного до лечения по описанной выше методике были выявлены лабораторные показатели (в биоптате кожи выявлен генотип GG в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II; содержание IL-10 в сыворотке крови составило 0,7 пг/мл), которые позволяли до лечения прогнозировать отсутствие клинического эффекта или недостаточный клинический эффект от лечения инфликсимабом. Если бы с учетом полученных лабораторных показателей данному пациенту лечение не было проведено, экономический эффект составил бы 640000 рублей (стоимость 4 инфузий инфликсимаба при проведении лечения больному весом 80 кг). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом путем определения молекулярного состава образца биопсии кожи и сыворотки крови больного псориазом до начала лечения, предусматривающий получение и исследование биоптата кожи и сыворотки крови больного псориазом, причем осуществляют определение полиморфизма в позиции 676 шестого экзона генаTNF-R-II, а в сыворотке крови проводят определение содержания IL-10 и при выявлении гомозиготного генотипа ТТ в позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II и высоком содержании IL-10 в сыворотке прогнозируют высокую эффективность лечения, а при выявлении гомозиготного генотипа GG позиции 676 шестого экзона гена TNF-R-II и низком содержании IL-10 в сыворотке прогнозируют низкую эффективность лечения. 2. Способ по п.1, в соответствии с которым высоким содержанием IL-10 в сыворотке крови является содержание 2,7 пг/мл. 3. Способ по п.1, в соответствии с которым низким содержанием IL-10 в сыворотке крови является содержание 1,0 пг/мл.