Лечение воспалительного заболевания кишечника

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента ЛЕЧЕНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ КИШЕЧНИКА Способ лечения воспалительного заболевания кишечника (IBD) включает сбор регуляторных Тклеток в активированном или неактивированном состоянии из сигнальных лимфатических узлов пациента, дренирующих сегменты кишечника с IBD или без него, возможно, активирование клеток посредством их контактирования с цитокином и антигенным экстрактом, полученным из воспаленного сегмента кишечника, размножение Т-клеток in vitro и реинфузию размноженных Т-клеток пациенту. Также раскрыты способы получения сигнальных узлов, размножения Т-клеток, восстановления TH1/TH2-баланса у пациента, страдающего от болезни Крона, и соответствующие применения размноженных Т-клеток, цитокинов и антигенного экстракта, а также соответствующих активированных и размноженных Т-клеток.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: АйТиЭйч ИММЬЮН ТЕРАПИ ХОЛДИНГЗ АБ (SE) 015989 Область изобретения Настоящее изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания кишечника и средству осуществления этого способа. Предшествующий уровень техники Стойкие выздоровления от воспалительного заболевания кишечника (IBD), такого как болезнь Крона (CD) и неспецифический язвенный колит (UC), редки. В Швеции IBD ежегодно диагностируют у 1400 новых пациентов с пиком заболеваемости в возрасте 20 лет, что приводит к пожизненному лечению кортизоном и/или иммунодепрессивными лекарственными средствами с тяжелыми побочными эффектами. Более того, IBD часто приводит к хирургической резекции кишки и постоянной стоме, которая представляет собой значительный дефект. Неспецифический язвенный колит также увеличивает риск рака толстой кишки. Считают, что IBD представляет собой аутоиммунное заболевание из-за аномалий иммунного ответа на обычно безвредные антигены слизистой. На основании вовлеченных цитокинов, воспаление при CD характеризуют как иммунный ответ, опосредованный TH1-клетками. Предполагают, что UC имеет иммунный ответ, опосредованный TH2-клетками, хотя это не было четко показано [Fuss I.J. et al., 1996. J.Immunol. 157:1261-70; Mullin G.E. et al., 1996. Inflamm. Bowel Dis. 2:16-26]. Цитокины действуют как регуляторы иммунологических ответов, поскольку они стимулируют дифференцировку и пролиферацию вовлеченных клеточных элементов. CD4+ хелперные Т-клетки могут дифференцироваться в две главные субпопуляции клеток-эффекторов, в TH1 -клетки, при стимуляции IL12 (интерлейкином-12), и в ТН 2-клетки, при стимуляции IL-4. TH1-клетки секретируют IFN- (интерферон), который стимулирует фагоцитарные и цитолитические Т-клеточно-зависимые реакции против внутриклеточных микробов, таких как вирусы или внутриклеточные бактерии. TH2-клетки секретируют IL-4 и IL-5, которые стимулируют продукцию IgE и опосредованную эозинофилами/тучными клетками защиту против паразитов. TH2 также функционирует для понижающей регуляции TH1-ответов. Задача изобретения Задачей изобретения является предложение способа, который лечит воспалительное заболевание кишечника или, по меньшей мере, сдерживает его на протяжении длительных периодов времени. Также в задачу изобретения входит предложение средства для применения в способе. Другие аспекты задачи станут очевидны из следующего краткого изложения сущности изобретения, нескольких графических материалов, иллюстрирующих его, описания его предпочтительных воплощений, а также из приложенной формулы изобретения. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение основано на представлении, что воспалительное заболевание кишечника, в частности болезнь Крона и/или неспецифический язвенный колит, могут быть навсегда вылечены или,по меньшей мере, удержаны в дремлющем или неактивном состоянии посредством введения регуляторных Т-клеток (Treg), собранных из сигнальных узлов пациента и размноженных in vitro. Таким образом уменьшают воспаление кишечника и могут даже полностью его подавить без необходимости прибегать к медикаментозному лечению, такому как кортикостероиды. Отсутствие ответа иммунной системы на вводимые перорально антигены определяют как пероральную толерантность. Вероятно, этот механизм предотвращает неверную иммунную реакцию против кишечного содержимого, и считают, что он опосредован по меньшей мере двумя процессами: во-первых,активацией регуляторных Т-клеток (Treg, CD4+ CD25+), которые являются членами семейства клеток Тхелперов (CD4+), и, во-вторых, индукцией делеции клона или анергии Т-клеток. Первый процесс, ответственный за толерантность к экспозиции низким дозам антигенов, предположительно, имеет место в локальной лимфоидной системе кишечника и зависит от продукции цитокина TGF-. Второй (делеционный) процесс, предположительно, имеет место в системной лимфоидной ткани, стимулированной профильтрованными антигенами, и похож на толерантность, вызванную предшествующим механизмом, к вводимым внутривенно антигенам в отсутствие иммунологического адъюванта. По-видимому, этот последний толерогенный механизм более выражен после экспозиции высоким дозам антигена. Активация Т-клеток находится под строгой регуляцией с целью поддержания баланса в иммунной системе посредством избегания чрезмерного и неверно направленного иммунного ответа, как наблюдают при аутоиммунитете. У пациентов с болезнью Крона мезентериальные лимфатические узлы сильно увеличены, как признак неконтролируемой регуляции активации Т-клеток. Поскольку IBD представляет собой воспаление, мезентериальные лимфатические узлы, соседние по отношению к воспалительному очагу, в первую очередь, ответственны за дренирование этого очага. Первые узлы, расположенные по прямому пути от воспаленной области, называют сигнальными узлами. По первому предпочтительному аспекту изобретения регуляторные Т-клетки в активированном состоянии собирают из лимфатических узлов пациента (сигнальных узлов), дренирующих сегменты кишечника с IBD, размножают in vitro и вводят обратно пациенту. По второму предпочтительному аспекту изобретения регуляторные Т-клетки в неактивированном состоянии собирают из лимфатических узлов пациента, дренирующих здоровые сегменты кишечника, то-1 015989 есть сегменты кишечника, не пораженные IBD, размножают in vitro и вводят обратно пациенту. Активированные, а также неактивированные регуляторные Т-клетки, собранные таким образом, могут (дополнительно) быть активированы in vitro посредством подходящих агентов, таких как цитокины. По третьему предпочтительному аспекту изобретения регуляторные Т-клетки в активированном состоянии или неактивированном состоянии собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с IBD или без него, соответственно, и размножают in vitro. Размножение может быть непрерывным или с интервалами, такое как с фазами, разделенными фазой (фазами) покоя. Размножаемые регуляторные Т-клетки активируют (стимулируют) цитокином (цитокинами) в комбинации с антигенным экстрактом из воспаленного сегмента кишечника. Альтернативно, регуляторные Т-клетки, собранные из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с IBD или без него, активируют (стимулируют) таким образом перед размножением или между фазами размножения. Один цитокин, предпочтительно два или более цитокинов, выбранных из IL-2, IL-7, IL-10, TGF-, TSLP, такие как цитокиновый коктейль, включающий IL-2, IL-7, IL-10, TGF-, в особенности TGF-1, TSLP, применяют в комбинации с антигенным экстрактом из воспаленного сегмента кишечника для получения активации Treg. Также предпочтительно предусмотреть дополнительную активацию Treg посредством применения анти-CD3,анти-CD28 и рапамицина. После размножения размноженные и активированные регуляторные Т-клетки вводят обратно пациенту. Лечение аутологическими регуляторными Т-клетками имеет преимущество уменьшения или даже отсутствия побочных эффектов и высокой эффективности. По первому варианту третьего предпочтительного аспекта регуляторные Т-клетки в активированном состоянии собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с IBD или без него, от пациента с болезнью Крона, активируют антигенным экстрактом из воспалительного очага в комбинации с низкой дозой цитокина IL-2 для размножения, предпочтительно в дополнительной комбинации с антителами против IFN- и/или TNF- для подавления TH1 -отклонения и TH2-размножения. Также предпочтительно регулировать культуральную среду с интервалами, такими как от каждого дня до каждого пятого дня, в особенности каждый день в течение периода времени от одной недели и более, в особенности в течение периода времени от трех до четырех недель. Таким образом, получают популяциюTH2-клеток, которые используют в аутотрансфузии для восстановления TH1/TH2-баланса у пациента. Размножение может быть поддержано посредством дополнительной активации CD3-антителом. Для улучшения TH2-отклонения при размножении может дополнительно быть использовано антитело противCD28 в комбинации с антителом против IL-12. По второму варианту третьего предпочтительного аспекта регуляторные Т-клетки в активированном состоянии собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с IBD или без него, от пациента с неспецифическим язвенным колитом, активируют антигенным экстрактом из воспалительного очага в комбинации с одним или более из цитокинов IL-2, IL-12 и IFN- для размножения,предпочтительно в дополнительной комбинации с антителами против IL-4 и/или против IL-10. Также предпочтительно регулировать культуральную среду с интервалами, такими как от каждого дня до каждого пятого дня, в особенности каждый день в течение периода времени от одной недели и более, в особенности в течение периода времени от трех до четырех недель. Могут быть предложены дополнительные стимулы, такие как CD3 и CD28, в особенности к концу периода размножения. По четвертому предпочтительному аспекту изобретения предложены один или более цитокинов в фармацевтически приемлемом носителе для in-vitro активации регуляторных Т-клеток, собранных от пациента с IBD, в особенности из сигнальных узлов, пораженных IBD. По пятому предпочтительному аспекту изобретения предложен способ получения сигнальных лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с IBD, включающий введение окрашивающего лимфу агента, такого как патентованный синий, в пораженные области кишечника пациента, страдающего от IBD, идентификацию лимфатической ткани, окрашенной агентом, возможно, мечение окрашенной ткани швами и резекцию окрашенной ткани. Резецированную ткань тщательно исследуют (производят осмотр, такой как посредством микроскопии), после чего из ткани иссекают сигнальные лимфатические узлы, дренирующие сегменты кишечника с IBD. По шестому предпочтительному аспекту изобретения предложен способ выделения регуляторных Т-клеток из сигнального лимфатического узла, дренирующего сегмент кишечника с IBD, включающий оказание давления на лимфатический узел, сбор суспензии клеток, удаленных таким образом из узла, и выделение регуляторных Т-клеток из суспензии. По седьмому предпочтительному аспекту изобретения предложены регуляторные Т-клетки, выделенные из сигнального лимфатического узла, дренирующего сегмент кишечника с IBD. Другие предпочтительные аспекты изобретения включены в приложенную формулу изобретения. Сейчас изобретение будет объяснено более подробно посредством ссылки на предпочтительные, но неограничивающие воплощения изобретения, проиллюстрированные несколькими графическими материалами.-2 015989 Краткое описание графических материалов На фиг. 1 представлена диаграмма, показывающая активированные Treg в образце Treg, идентифицированные по экспрессии двух поверхностных маркеров; на фиг. 2 - диаграмма, показывающая функциональный анализ Treg; на фиг. 3 показан PT-PCR(полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией)-анализ мРНК,экстрагированной от размноженных Treg; на фиг. 4 представлена диаграмма, показывающая регулирующую способность Treg-популяции до и после размножения; на фиг. 5 - диаграмма, показывающая активацию иммунокомпетентных клеток человека эндогенным экстрактом из воспаленного отдела кишечника; на фиг. 6 - диаграмма, показывающая зависимость доза-ответ аналогично активированных Treg, полученных из сигнальных узлов; на фиг. 7 показана экспрессия CCR5 как маркера для TH2; на фиг. 8 показана секреция IL-4 в Treg от пациентов с UC; на фиг. 9 показана секреция IFN- в Treg от пациентов с CD. Описание предпочтительных воплощений Пример 1. Идентификация сигнальных узлов, дренирующих воспаленные сегменты кишечника. Методику сигнальных узлов использовали в течение десяти лет для установления стадий злокачественных опухолей, главным образом злокачественной меланомы и рака молочной железы. Сигнальный узел идентифицируют во время хирургического вмешательства посредством выделения лимфатического дренажа от рака с применением окрашивающего лимфу агента, такого как патентованный синий (CAS 129-17-9) и патентованный синий V (CAS 3536-49-0; часто поставляемый как кальций-хелатированный димер), который вводят в пораженные области кишечника. Идентифицированные таким образом сигнальные узлы метят швами или другими средствами. Затем кишечные поражения совместно с непораженными краевыми зонами и брыжейкой, включая сосуды и регионарные лимфатические узлы, резецируют общепринятым способом. Резецированную ткань тщательно исследуют и сигнальные узлы идентифицируют и удаляют. Этот способ применяют к сигнальным узлам, дренирующим и воспаленный, и непораженный кишечник, у пациентов с неспецифическим язвенным колитом или болезнью Крона. В дополнение от пациента собирают образец венозной крови. Образец периферической крови и узлов совместно с препаратами из воспалительных очагов, а также сегментов кишечника, не пораженных заболеванием, затем обрабатывают в лаборатории для иммунологического анализа и размножения Т-клеток. Лейкоциты периферической крови (PBL) очищают посредством Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Amersham). Получают одноклеточные суспензии клеток лимфатического узла посредством мягкого давления с применением стеклянного гомогенизатора со свободной посадкой. Приготавливают антигенные экстракты из образцов кишечника посредством гомогенизации фрагментов ткани в гомогенизаторе Даунса с последующей денатурацией в течение 5 мин при 97 С. Клетки затем подвергают функциональному анализу. Пример 2. Выделение популяций Т-клеток. Лимфоциты и моноциты очищают из образцов крови или лейкоцитарных пленок с применением Ficoll-Hypaque Plus (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). Рассматриваемую лейкоцитарную пленку или образец крови разбавляли забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и тщательно наслаивали на раствор Ficoll-натрия диатризоата, после чего двухфазную систему центрифугировали при 400 g в течение 30 мин. Лимфоциты и моноциты собирали в интерфазе между раствором Ficoll и плазмой, в то время как эритроциты и гранулоциты собирали на дне пробирок. Слой лимфоцитов удаляли с применением пипетки Пастера и клетки отмывали HBSS для удаления избытка Ficoll-Hypaque Plus,плазмы и тромбоцитов. Когда клетки не использовали немедленно, их хранили при 37 С в среде RPMI,содержащей 10% HuS, 1% PeSt и 1% глутамин. Обыкновенные CD4+ Th-клетки и CD4+CD25+ клетки очищали с применением autoMACS Separator (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Клетки подсчитывали, центрифугировали при 300 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость полностью удаляли пипеткой и клетки растворяли в 90 мкл буфера MACS (0,5% BSA, 2 мМ ЭДТА, 0,01% азида натрия вPBS) и 10 мкл Biotin-Antibody Cocktail на 107 клеток. Это помечало популяции всех не-CD4+ клеток. Через 10 мин инкубации при 4 С добавляли 20 мкл Anti-Biotin MicroBeads на 107 клеток и инкубировали в течение дополнительных 15 мин при 4 С. Клетки отмывали приблизительно 20 объемами буфера MACS,центрифугировали при 300 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость полностью удаляли и клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера MACS на 108 клеток. Проводили магнитное разделение в autoMACSSeparator для очистки образца от He-CD4+ клеток. Для выделения CD4+/CD25+ клеток из CD4+ популяции CD4+ клетки подсчитывали, центрифугировали при 300 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость полностью удаляли и осадок растворяли в 90 мкл буфера MACS и в 10 мкл CD25 MicroBeads на 107 клеток. Через 15 мин инкубации при 4 С клетки отмывали, как описано выше, и CD25+ клетки выделяли положительной селекцией в autoMACS Separator. Аликвоты от всех популяций анализировали проточной цитометрией. Пример 3. Характеристика клеток посредством проточной цитометрии. Проточную цитометрию (FACS) использовали для исследования экспрессии различных поверхно-3 015989 стных маркеров на выделенных популяциях клеток. Клетки помещали в 4 мл FACS-пробирки, промывали 2 мл буфера FACS (2% FCS (фетальная телячья сыворотка), 0,05% азида натрия в PBS), центрифугировали при 300 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливали и осадок ресуспендировали в 100 мкл буфера FACS. Добавляли 7 мкл каждого антитела, подлежащего применению, и инкубировали в течение по меньшей мере 30 мин при 4 С, после чего клетки промывали еще раз буфером FACS, центрифугировали, как ранее, и ресуспендировали в 1 мл FACS лизирующего раствора для фиксации клеток и лизиса эритроцитов, перемешивали и инкубировали в течение 10 мин при 4 С перед тем, как их промыть и центрифугировать еще раз, как описано выше. Надосадочную жидкость сливали и клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера FACS на пробирку, после чего проводили анализ с применением аппарата Becton Dickinson FACSCalibur (Franklin Lakes, NJ, USA). Пример 4. Анализы пролиферации. Исследовали супрессивную способность очищенных CD4+CD25+ клеток. 96-Луночные круглодонные планшеты инкубировали с 25 мкл 5 мкг/мл анти-CD3 IgG в PBS при 37 С в течение 90 мин. Лунки промывали три раза 200 мкл PBS, после чего добавляли три различные популяции клеток. 100 мкл 500000 клеток/мл CD4-клеток, облученных 25 g, добавляли в каждую лунку совместно с 30000CD4+CD25- клеток-респондеров и 1 мкг/мл растворимого CD28 (конечная концентрация). CD4+CD25+ клетки добавляли в лунки в различных количествах для создания нескольких различных клеточных отношений CD4+CD257CD4+CD25+. В качестве контроля равные количества CD4+CD25-клеток добавляли к клеткам-респондерам в дополнительном наборе лунок. Планшеты содержали при 37 С в течение четырех или пяти дней перед тем, как в каждую лунку добавляли 1 мкКи [3 Н]-тимидина и планшеты инкубировали в течение 18 ч, после чего их замораживали при -20 С. Клетки размораживали и содержимое лунки перемещали на стекловолоконный фильтр (Wallac, Turku, Finland) коллектором клеток (ТОМТЕС, Hamden, CT, USA). Пластинки сцинтилляционного счетчика MeltiLex A - Melt-on (Wallac, Turku, Finland) помещали на верхнюю часть фильтров и плавили при 85 С. Радиоактивность измеряли с применением сцинтилляционного счетчика 1205 Betaplate LiquidCD4+CD25- клетки приготавливали из лейкоцитарной пленки, как описано выше. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали от другого донора и облучали (25 Гр). 3106 CD4+ клеток затем аллоактивировали посредством 1,25106 РВМС в объеме 2 мл/лунка на 6-луночных планшетах с или без 1 нг/мл TGF-31. Планшеты содержали при 37 С. На 2, 5 и 7 дни брали образцы клеток для анализа проточной цитометрией и экстракции РНК. Пример 6. Экстракция РНК и синтез кДНК (комплементарной ДНК). Экстракцию РНК от различных популяций клеток для дальнейшего применения в ПЦР(полимеразная цепная реакция)-анализах проводили следующим образом. Клетки лизировали в 1 млTRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) на 5-6106 клеток, после чего образец или немедленно замораживали при -70 С для хранения, или инкубировали 5 мин при комнатной температуре перед тем, как добавляли 0,2 мл хлороформа на мл реагента TRIzol, и пробирки энергично встряхивали. Через 2-3 мин пробирки центрифугировали при 12000 g в течение 15 мин при 4 С. Прозрачную водную фазу перемещали в чистую пробирку, РНК осаждали 0,5 мл изопропанола на мл TRIzol, использованного на первой стадии,и инкубировали 10 мин при комнатной температуре перед центрифугированием при 12000 g в течение 10 мин при 4 С. Надосадочную жидкость удаляли и осадок промывали 1 мл 75% этанола на мл TRIzol, использованного на первой стадии. Пробирки встряхивали и центрифугировали при 7500 g в течение 5 мин при 4 С, после чего осадок кратко высушивали на воздухе (5-10 мин), растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКазы, и инкубировали при 55 С в течение 10 мин. Синтез кДНК проводили посредством iScriptcDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) в соответствии с протоколом изготовителя. Пример 7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественная ПЦР в реальном времени. Синтезированную кДНК от различных популяций клеток использовали в ПЦР. Целью ПЦР было выявление экспрессии FoxP3, GAPDH и РНК-полимеразы II (RPH). Праймеры получали от Cybergene Для обычной ПЦР использовали ThermoPol Reaction Buffer и ДНК-полимеразу Taq (New EnglandBiolabs, Frankfurt am Main, Germany), в то время как в количественной ПЦР в реальном времени использовали iQSYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Реакции проводили в термоблоке MyCycler или системе детекции iCycler iQ Real-Time PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), соответственно, по протоколу: 30 с при 95 С, 30 с при 48-65 С и 30 с при 72 С в течение по меньшей мере 40 повторяющих-4 015989 ся циклов. Для реакций количественной ПЦР в реальном времени применяли способ относительного количественного определения, как рассмотрено Ginzinger D G, Exp. Hematol. 2002 30:503-12. ПЦРпродукты разделяли на 2% агарозном геле и бэнды выявляли по УФ-излучению инкорпорированного бромида этидия. Пример 8. Исследование Treg, полученных из сигнальных узлов пациентов с IBD. Сигнальные узлы от всего 20 пациентов с IBD были получены хирургическим вмешательством и исследованы. Полученные из сигнальных узлов лимфоциты (SEAL) были охарактеризованы в отношении экспрессии поверхностных маркеров CD4, CD8, CD3, Т-клеточного рецептора (TCR), CD25, CD69,CD45RA, CD45RO и CD14. Исследовали количество CD4+CD25hi Treg-популяции (фиг. 1). Было обнаружено, что число Treg-клеток в сигнальных узлах, дренировавших воспаленный сегмент кишечника, было нормальным по сравнению с числом Treg в сигнальных узлах, дренировавших непораженные области кишечника.Treg (CD4+CD25hi), очищенные из сигнальных узлов, дренировавших воспаленный сегмент, и Treg(CD4 CD25hi), очищенные из сегмента кишечника, не вовлеченного в воспаление, тем не менее, существенно отличались по их регуляторной активации Т-клеток: Treg из сигнальных узлов, дренировавших воспалительный очаг, были неудовлетворительны в регуляции активации Т-клеток (фиг. 2). Другими словами, способность регулировать Т-клеточный ответ у Treg из сигнальных узлов, дренирующих пораженные области, отчетливо нарушена. Пример 9. Размножение регуляторных Т-клеток. Для индукции и размножения Treg CD4+CD25- Т-клетки периферической крови стимулировали IL2, CD28, аллогенными питающими клетками и TGF-. После размножения более 85% CD4+ Т-клетки экспрессировали высокие уровни CD25, указывающие на Treg-фенотип, как исследовано посредствомFACS (не показано). RT-PCR продемонстрировала, что размноженная популяция содержала специфичный для Treg транскрипт FoxP3, который не присутствовал в CD4+CD25- популяции перед размножением(фиг. 3). Индуцированную и размноженную Treg-популяцию подвергали функциональному тестированию для демонстрации ее способности ингибировать активацию Т-клеток. Размноженная CD4+CD25+ FoxP3+ популяция (фиг. 3) показывала Treg-регуляторные свойства, как продемонстрировано ее ингибированием пролиферации Т-хелперных клеток уже в соотношении 1:10 (фиг. 4). По-видимому, число Treg в сигнальных узлах, дренировавших воспаленные сегменты кишечника у пациентов с IBD, было нормальным; по-видимому, их недостаточно для ингибирования ответа стимулированных Т-клеток. Посредством стимулирования и размножения наивных Т-клеток эффективные Т-регуляторные свойства могут быть урегулированы. Пример 10. Распознавание антигенов, имеющих происхождение из воспалительного очага, регуляторными Т-клетками, полученных из сигнальных узлов. Регуляторные Т-клетки, полученные из сигнальных узлов, негативных узлов, кишечного эпителия и лейкоцитов периферической крови, инкубировали в различных концентрациях гомогенатов кишечных клеток в течение от пяти до семи дней. Для Treg из сигнальных узлов, стимулированных антигенным экстрактом из воспаленной области, наблюдали пролиферацию (фиг. 5). Тем не менее, когда регуляторные Т-клетки, полученные из сигнальных узлов, стимулировали антигенными экстрактами, полученными из невоспаленных участков, наблюдали очень слабые ответы или их отсутствие (не показано). Данные от пациентов с болезнью Крона были сходны с таковыми от пациентов с неспецифическим язвенным колитом. Сигнальные узлы, дренирующие пораженные области в слепой кишке и в сигмовидной ободочной кишке, и распознают, и пролиферируют против одного и того же антигенного экстракта, полученного из воспалительного очага (фиг. 6). Данные указывают на то, что существует общий антиген, ответственный за размножение клона Т-клеток. Наблюдаемая высокая спонтанная пролиферация существует благодаря размножению клона Т-клеток in vivo в сигнальном узле. Регуляторные Т-клетки, полученные из сигнального узла, отвечают пропорционально дозе антигенного экстракта. Регуляторные Т-клетки, полученные из сигнальных узлов, показывают повышенную экспрессию цитокинов. CD4+ Т-клетки из сигнальных узлов являются CD45RO+/CCR5+ у пациентов с UC, что наводит на мысль о состоянии увеличенного TH2-воспалительного ответа против воспаленной слизистой(фиг. 7). Сигнальные узлы от пациентов с UC секретируют увеличенные количества IL-4, TH2-цитокина, при активации антигенным экстрактом из воспалительного очага (фиг. 8). Регуляторные Т-клетки, полученные из сигнальных узлов от пациентов с болезнью Крона, отвечают на антиген-специфическую активацию повышенной продукцией TH1-цитокина INF- (фиг. 9). Данные указывают, что Т-клетки, полученные из сигнальных узлов от пациентов с UC, имеют увеличенный пролиферативный ответ против антигенов из воспалительного очага и что регуляторные Тклетки, полученные из сигнальных узлов, реагируют TH2-ответом, как подсказывает увеличенная экспрессия CCR5 (фиг. 7) и увеличенная продукция TH2-цитокинов, таких как IL-2 (фиг. 8). Т-клетки, полу-5 015989 ченные из сигнальных узлов от пациентов с болезнью Крона, показывают противоположный тип активации с преимущественной продукцией TH1-цитокинов, таких как INF-. Эндотелиальные клетки из язвы при UC или воспалительного очага в кишечнике пациентов с UC или болезнью Крона проходят апоптоз или некроз и затем подвергаются эндоцитозу профессиональными антиген-представляющими клетками (АРС). АРС подвергают эндоцитозу дезинтегрированные эндотелиальные клетки и мигрируют через лимфатические сосуды в дренирующий лимфатический узел, сигнальный узел, где АРС процессирует и представляет белки (антигены), имеющие происхождение из эндотелиальных клеток, Т-клеткам. Т-клетки становятся активированными, претерпевают клональное размножение и покидают лимфатический узел в поисках областей воспаления, где они становятся клеткамиэффекторами и вносят вклад в воспаление. Пример 11. Лечение IBD.IBD, в частности болезнь Крона и/или неспецифический язвенный колит, можно лечить посредством сбора регуляторных Т-клеток из сигнальных узлов пациента, дренирующих воспаленную область, их размножения и их активации in vitro и введения их обратно пациенту посредством инфузии. В частности,размножение регуляторных Т-клеток in vitro антиген-специфичным способом имеет преимущество клонально размноженных Treg, накопленных в сигнальных узлах. Treg из сигнальных узлов от пациентов сIL-2, IL-7, IL-10, TGF-3 совместно с антигенным экстрактом из воспаленного сегмента кишечника для достижения антиген-специфичного размножения Treg. Эффективность активации оценивают посредством RT-PCR, FACS и анализов ингибирования in vitro, как описано (фиг. 4). Дополнительная активация анти-CD3, анти-CD28 и рапамицином может быть использована для получения оптимального размножения и функциональности IBD Treg. Альтернативно,если Treg из сигнальных узлов, дренирующих воспаленный сегмент кишечника, не удовлетворительны в отношении их числа и/или функции, рассматривают размножение Treg из сигнальных узлов, дренирующих невоспаленные сегменты, с применением тех же протоколов. Разумное объяснение этому альтернативному подходу состоит в том, что невоспаленный сегмент можно рассматривать как подходяще регулируемый, таким образом Treg функциональны, хотя их слишком мало в количестве, чтобы поддерживать регуляцию в соседних сегментах кишечника. Размноженные Treg любого типа вводят обратно как аутотрансфузию для восстановления правильной иммунорегуляции. Подписи к графическим материалам. Фиг. 1. Treg, идентифицированные по экспрессии поверхностных маркеров CD4+ и высокому уровню CD25, CD4+CD25hi IL-2-рецептора. Фиг. 2. Функциональный анализ Treg. Очищенные Treg из сигнальных узлов, дренирующих воспаленный сегмент кишечника, (незакрашенные круги) и невоспаленный сегмент (закрашенные круги), инкубировали с CD4+CD25- T-хелперными клетками, очищенными из периферической крови и активированными анти-CD3 и анти-CD28. 3 Н-тимидин добавляли в культуры в течение последних 16 ч. Фиг 3. Размножение Treg-клеток. CD4+CD25- клетки активировали IL-2, TGF-, анти-CD28 и питающими клетками с целью стимулировать размножение Treg-клеток. Из размноженных CD4+CD25Treg экстрагировали мРНК и демонстрировали транскрипт FoxP3 посредством RT-PCR, идентифицируя размноженную популяцию как Treg. Фиг. 4. Регуляция стимулированных Т-хелперных клеток-респондеров. Популяция перед размножением, содержащая CD4+CD25- клетки, неспособна регулировать (закрашенные круги), в то время как адекватную регуляцию получают с использованием размноженных CD4+CD25+ клеток (незакрашенные круги). Фиг. 5. Активация иммунокомпетентных клеток человека. Клетки, полученные из сигнальных лимфатических узлов, несигнальных лимфатических узлов, кишечника, а также лимфоциты периферической крови активировали эндогенным антигенным экстрактом, полученным из воспаленного отдела кишечника пациента с неспецифическим язвенным колитом. Фиг. 6. Диаграмма доза-ответ. Показана зависимость доза-ответ регуляторных Т-клеток, полученных из сигнальных узлов, дренирующих слепую кишку и сигмовидную ободочную кишку, активированных эндогенным антигенным экстрактом, полученным из того же воспаленного отдела кишечника. Фиг. 7. Экспрессия CCR5 как маркера TH2. Регуляторные Т-клетки, полученные из сигнальных узлов от пациента с UC, имеют повышенную экспрессию CCR5 на CD4+CD45RO+ клетках памяти, как признак активации ТН 2. Фиг. 8. Секреция ТН 2-цитокина IL-4 в регуляторных Т-клетках от пациентов с UC. Клетки из несигнальных узлов (nSLN) и из сигнальных узлов (SLN) стимулировали в течение 48 ч воспалительными антигенными экстрактами. Секретируемый IL-4 измеряли в культивируемых надосадочных жидкостях с применением сэндвич-твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Фиг. 9. Секреция TH1-цитокина INF- регуляторными Т-клетками, полученными из сигнальных узлов от пациентов с болезнью Крона. Клетки из несигнальных узлов (nSLN) и из сигнальных узлов (SLN1 и SLN2) стимулировали в течение 48 ч воспалительным антигенным экстрактом. Секретируемый INF-6 015989 измеряли в культивируемых надосадочных жидкостях с применением сэндвич-твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий (а) сбор регуляторных Тклеток в активированном или неактивированном состоянии из сигнальных лимфатических узлов пациента, дренирующих сегменты кишечника с воспалительным заболеванием кишечника (IBD) или без него,(б) размножение собранных Т-клеток in vitro и (в) реинфузию размноженных Т-клеток пациенту. 2. Способ по п.1, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона. 3. Способ по п.2, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой неспецифический язвенный колит. 4. Способ по любому из пп.1-3, где указанные регуляторные Т-клетки собирают в активированном состоянии. 5. Способ по любому из пп.1-3, где указанные регуляторные Т-клетки собирают в неактивированном состоянии. 6. Способ по п.4 или 5, где регуляторные Т-клетки собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника без IBD. 7. Способ по п.5 или 6, где собранные Т-клетки активируют одним или более цитокинами в комбинации с антигенным экстрактом, полученным из воспаленного сегмента кишечника. 8. Способ по п.7, где активация предшествует размножению. 9. Способ по п.7, где активация сопутствует размножению. 10. Способ по п.7, где за размножением следует активация. 11. Способ по п.7, где один или более цитокинов выбраны из IL-2, IL-7, IL-10,TGF-1,TSLP. 12. Способ по пп.7-11, включающий дополнительную активацию собранных Т-клеток анти-CD3,анти-CD28 и/или рапамицином. 13. Способ по п.2, где регуляторные Т-клетки собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с IBD или без него, и активируют посредством их контактирования с антигенным экстрактом, полученным из воспалительного очага, в комбинации с низкой дозой цитокина IL-2 и размножают. 14. Способ по п.13, дополнительно включающий активацию посредством контактирования указанных регуляторных Т-клеток с антителом против IFN- (IFN - интерферон) и/или TNF- (TNF - фактор некроза опухоли) для подавления TH1-отклонения и TH2-размножения. 15. Способ по п.13 или 14, включающий кондиционирование культуральной среды с интервалами,такими как от каждого дня до каждого пятого дня, в частности каждый день в течение периода времени от одной недели или более, в особенности в течение периода времени от трех до четырех недель. 16. Способ по любому из пп.13-15, включающий активацию антителом против CD28 в комбинации с антителом против IL-12 для улучшения TH2-отклонения. 17. Способ по п.3, где регуляторные Т-клетки собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с IBD или без него, и активируют посредством их контактирования с антигенным экстрактом, полученным из воспалительного очага, в комбинации с одним или более из цитокинов IL-2,IL-12 и IFN- и размножают. 18. Способ по п.17, где дополнительную активацию обеспечивают посредством контактирования регуляторных Т-клеток с CD3 и/или CD28. 19. Применение одного или более цитокинов в фармацевтически приемлемом носителе для in vitro активации регуляторных Т-клеток, собранных из сигнального лимфатического узла пациента с IBD. 20. Применение по п.19, где IBD представляет собой болезнь Крона или неспецифический язвенный колит. 21. Способ получения сигнальных лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника, пораженные воспалительным заболеванием кишечника (IBD), включающий: (а) введение окрашивающего лимфу агента в пораженную область кишечника пациента, страдающего от IBD, (б) идентификацию лимфатической ткани, окрашенной агентом, (в) возможно, мечение окрашенной ткани, такое как посредством шва (швов), (г) резекцию окрашенной ткани, (д) исследование окрашенной ткани для идентификации сигнальных лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с IBD, иссечение идентифицированных сигнальных лимфатических узлов из ткани. 22. Способ по п.14, где IBD представляет собой болезнь Крона или неспецифический язвенный колит. 23. Способ выделения регуляторных Т-клеток из иссеченного сигнального лимфатического узла,дренирующего сегмент кишечника с IBD, включающий: (а) оказание давления на сигнальный лимфатический узел, (б) сбор суспензии клеток, удаленной из узла, (в) выделение регуляторных Т-клеток из суспензии клеток. 24. Способ размножения регуляторных Т-клеток, полезных в лечении IBD, включающий: (а) обес-7 015989 печение в подходящей культуральной среде регуляторных Т-клеток, собранных из сигнального узла пациента с IBD, (б) активирование клеток посредством их контактирования с цитокином, (в) размножение активированных клеток. 25. Способ по п.24, где часть или всю активацию проводят во время размножения. 26. Способ восстановления TH1/TH2-баланса у пациента, страдающего от болезни Крона, включающий: (а) сбор регуляторных Т-клеток в активированном состоянии из лимфатических узлов пациента,дренирующих сегменты кишечника с болезнью Крона или без нее; (б) активирование собранных таким образом Т-клеток антигенным экстрактом из воспалительного очага в комбинации с низкой дозой цитокина IL-2; (в) размножение клеток; (г) возможно, контактирование клеток во время размножения с антителом против IFN- и/или TNF- для подавления TH1-отклонения и TH2-размножения. 27. Способ по п.26, сочетающий кондиционирование культуральной среды с интервалами. 28. Способ по п.27, где кондиционирование представляет собой кондиционирование от каждого дня до каждого пятого дня. 29. Способ по п.28, включающий стимуляцию размножения посредством контактирования указанных клеток с CD3-антителом. 30. Применение цитокина, выбранного из IL-2, IL-7, IL-10, TGF-1, TSLP, для активации регуляторных Т-клеток, полученных из сигнального узла пациента, страдающего от IDB. 31. Применение антигенного экстракта, полученного из воспаленного сегмента кишечника пациента, страдающего от IBD, в комбинации с цитокином для активации регуляторных Т-клеток, полученных из сигнального узла пациента. 32. Применение по п.31, где цитокин выбран из IL-2, IL-7, IL-10, TGF-1, TSLP.