Применение 3-фенил-4-(4-метилсульфонилфенил)-2-(5н)-фуранона для лечения или профилактики аденомы толстой кишки

1 Предпосылки создания изобретения Данное изобретение касается применения 3-фенил-4-(4-метилсульфонилфенил)-2-(5 Н)-фуранона для лечения или профилактики аденомы толстой кишки. В частности, данное изобретение касается предотвращения или замедления трансформации аденомы толстой кишки в аденокарциному толстой кишки. Фермент простагландин G/H синтаза(PGHS, также известная как циклооксигеназа СОХ) является ключевым ферментом биосинтетического процесса, приводящего к образованию простагландинов (Watkins, W.D., Peterson,M.B., and Fletcher, J.R. ed. Prostaglandins inregulation and enzyme expression. Biochim. Biophys. Acta, 1083; 121-134, 1991). Эти простаноиды являются сильными биологическими медиаторами с разнообразными нормальными физиологическими эффектами, и они также имеют отношение к ряду патологических состояний,включая воспаление и неопластическую трансформацию (Watkins, W.D., Peterson, M.B., andG/H synthase: a new target for nonsteroidal antiinflammatory drugs. Drug Dev. Res., 25; 249-265,1992). Идентифицированы две изоформы PGHSInvest. Drugs, 3; 1171-1180, 1994). PGHS-1 обычно экспрессирует в большинство тканей и предлагалась для синтеза простагландинов, опосредующих нормальные физиологические функции. Вторая изоформа, PGHS-2, характеризуется быстрой индукцией под влиянием различных стимулов, включая митогены, гормоны,цитокины и факторы роста (Loll, P.J. and Garavito, R.M. The isoforms of cyclooxygenase:News Perspectives, 7; 501-512, 1994). При воспалительных процессах простагландины, синтезируемые PGHS-2, могут быть главными эффекторами (Masferrer, J.L., Zweifel, B.S., Manning,P.Т., Hauser, S.D., Leahy, K.M., Smith, W.G.,Isakson, P.C., and Seibert, K. Selective inhibitionAcad. Sci. USA, 91; 3228-3232, 1994). Показано,что как PGHS-1, так и PGHS-2 являются мишенью для нестероидных противовоспалительных средств (НСПВС) (Battistini, В., Botting, R., andWO 94/14977, публ. 7 июля 1994, в которой описан способ оценки активности ингибиторовPGHS-2, а также их селективности к PGHS-2 по сравнению с PGHS-1. Повышенные уровни простагландинов отмечены при различных видах рака, включая карциномы легкого и толстой кишки (McLemore,T.L., Hubbard, W.C., Litterst, C.L., Liu, M.C.,Miller, S., McMahon, N.A., Eggleston, J.C., andClin. Med., 122; 518-523, 1993). В частности,показано повышение уровней простагландинов в доброкачественных полипах аденомы и их дальнейшее увеличение в злокачественной ткани толстой кишки по сравнению с гистологически нормальной слизистой оболочкой. Так как у простаноидов отмечена иммуносупрессивная активность, эти вещества могут иметь значение для развития опухоли (Earnest, D.L., Hixson, L.J.,and Alberts, D.S. Piroxicam and other cyclooxygenase(Suppl J. Cell. Biochem., 161.); 156-166, 1992). С конца 1970-х годов исследователи рассматривают возможность того, что аспирин и подобные ему нестероидные противовоспалительные средства (НСПВС) могут быть успешно использованы для лечения некоторых видов рака, включая рак толстой кишки. Первое эпидемиологическое исследование,предполагающее, что аспирин может снижать риск возникновения рака прямой и толстой кишки, было проведено в 1988 г. с помощью ретроспективных пробных анализов в Мельбурне,Австралия (Cancer, Res., 48: 4399-4404, 1988). В результате этого исследования обнаружено 40%-ное снижение риска возникновения рака толстой кишки среди лиц, регулярно принимающих аспирин, по сравнению с теми, кто не принимает аспирин. Недавно данные Heath, etal. позволили предположить возможность применения НСПВС для профилактики новообразований прямой и толстой кишки (Heath, С.W.,Jr., Thun, M.J., Greenberg, E.R., Levin, В., andand human cancer. Cancer, 74; 2885-2888, 1994). Однако, несмотря на это и последующие исследования, не существовало надежных доказательств, связывающих применение аспирина и предотвращение рака толстой кишки, а также демонстрирующих патологическую связь между раком прямой и толстой кишки и PGHS или терапевтического ингибирования PGHS путем введения аспирина. Например, пациенты, больные артритами, просто могут иметь меньшую предрасположенность к раку толстой кишки. В данной заявке описаны исследования, в которых проанализирована экспрессия человеческого PGHS-1 и PGHS-2 белка в 25 парах нормальных и аутологичных опухолей толстой кишки, в 4 предзлокачественных полипах толстой кишки, 5 контрольных образцов ткани толстой кишки (взятых у неонкологических пациентов) и в 3 парах нормальной и раковой ткани молочной железы человека. К результатам этого исследования относятся следующие факты: уменьшение белка PGHS-1 в опухолевой ткани толстой кишки по сравнению с гистологически нормальной слизистой оболочкой толстой кишки, и наличие PGHS-2 в большинстве образцов опухолевых тканей толстой кишки, тогда как в нормальных тканях, полипах и образцах раковых тканей молочной железы этот белок практически не определяется. Увеличение уровня простагландинов в опухолевой ткани толстой кишки происходит в результате деятельности индуцируемой изоформы PGHS-2. Эти исследования подтверждают предположение авторов о том, что трансформация аденомы толстой кишки в аденокарциному опосредуется значительной и неожиданно высокой продукцией PGHS-2 в аденоме. Следовательно, неожиданно обнаружен способ замедления или предотвращения трансформации аденомы толстой кишки в аденокарциному, заключающийся во введении пациенту, страдающему FAP (Familial adenomatousPolyposis, семейный аденоматозный полипоз),или пациенту с одной или несколькими аденомами толстой кишки, нетоксичного терапевтически эффективного количества 3-фенил-4-(4 метилсульфонилфенил)-2-(5 Н)-фуранона (рофекоксиб), при этом указанное количество эффективно для ингибирования PGHS-2 в указанной аденоме. Краткое описание фигур Фиг. 1. Показательный анализ иммуноблотинга экспрессии белка PGHS-1 и PGHS-2 из нормальной слизистой оболочки толстой кишки человека и аутологичной опухолевой ткани. Фиг. 2. Количественная оценка изменений в экспрессии белка PGHS-1 и PGHS-2 в соответствующих опухолевых тканях по сравнению с аутологичной нормальной слизистой оболочкой. Фиг. 3. Анализ иммуноблотинга, демонстрирующий экспрессию PGHS-1 и PGHS-2 в полипах мышей с удаленным геном Арс 716 размером от 0,3 до 5 мм в диаметре. 4 Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к применению 3-фенил-4-(4-метилсульфонилфенил)2-(5 Н)-фуранона, являющегося нестероидным противовоспалительным средством (НСПВС),для лечения или профилактики аденомы толстой кишки. Указанное соединение известно как препарат рофекоксиб, выпускаемый фирмой Мерк под торговой маркой Vioxx. Подробное описание фигур Фиг. 1. Показательный анализ иммуноблотинга экспрессии белка PGHS-1 и PGHS-2 в нормальную слизистую оболочку толстой кишки человека и в аутологичную опухолевую ткань. Исследование иммуноблотинга проводили с использованием анти-PGHS-1 антисыворотки(фиг. 1 А) и исследование иммуноблотинга тех же образцов, что представлены на фиг. 1 А, проводили с использованием анти-РGНS-2 антисыворотки (фиг. 1 В). Очищенные стандарты PGHS и образцы микросомальных белков (50 мкг/дорожку) разделяли с помощью SDS-PAGE,переносили на нитроцеллюлозу и подвергали иммуноблотингу с использованием анти-PGHS антисывороток, регистрируя путем усиления хемилюминесценции. Номера 1-4 соответствуют образцам, взятым у 4 выбранных пациентов из 25 тестируемых пациентов. Денситометрические значения для пациентов 1-4 на этой фигуре соответствуют пациентам под номерами 17-20,как показано на фиг. 2. Буквы N и Т обозначают подходящие образцы нормальных и опухолевых тканей слизистой оболочки толстой кишки каждого пациента, соответственно. Очищенные стандарты PGHS-1 и PGHS-2 показаны в левой части рисунка. Обозначены положения маркеров молекулярного веса. Фиг. 2. Сравнительная количественная оценка изменения экспрессии белков PGHS-1 иPGHS-2 в аутологичных образцах соответствующих опухолевой и нормальной тканей слизистой оболочки. Аликвоты стандартов PGHS и микросомальных белков от 25 пациентов (50 мкг/дорожку) разделяли с помощью SDS-PAGE,переносили на нитроцеллюлозу и подвергали иммуноблотингу с использованием анти-PGHS1 и анти-РGНS-2 антисывороток, регистрируя путем усиления хемилюминесценции. Количества белка PGHS определяли с помощью денсиометрии. Для приблизительной оценки количества белка PGHS-1 и PGHS-2 в микросомальных образцах нормальной и опухолевой ткани слизистой оболочки использовали значения оптической плотности, полученные при авторадиографическом сканировании известных количеств очищенных стандартов PGHS-1 и PGHS-2. Представленные значения демонстрируют изменения экспрессии (в нг) в опухолевую ткань 5 слизистой оболочки по сравнению с нормой у каждого пациента. Фиг. 3. Исследования иммуноблотинга, демонстрирующие экспрессию PGHS-1 и PGHS-2 в полипы диаметром 0,3-5 мм (дорожки 1-5 соответствуют образцам, полученным из полипов с приблизительным диаметром 1-5 мм соответственно). Белок PGHS-1 обнаружен во всех контрольных образцах тонкой и толстой кишки и в образцах полипов. Иммунореактивность PGHS2 не обнаружена в контрольных образцах кишечника и толстой кишки. Хотя в крупных полипах кишечника (диаметр 3-5 мм) обнаружены низкие уровни белка PGHS-2 (дорожки 3, 4 и 5),были обнаружены повышенные уровни иммуноактивности PGHS-2 во всех образцах полипов толстой кишки с диаметром 1-5 мм (дорожки 15) и очень высокие уровни белка PGHS-2 найдены в полипах с диаметром 2-3 мм (дорожки 2 и 3). В качестве стандартов для электрофореза применяли очищенный бараний белок PGHS-1 иPGHS-2 (5, 10 и 20 нг), что соответственно отмечено на фигуре. Подробное описание изобретения По оценкам специалистов, ключевым событием в трансформации аденомы толстой кишки в аденокарциному толстой кишки является приобретенная способность клеток аденомы внедряться в базальную мембрану субмукозного слоя толстой кишки. Соответственно, замедление или профилактика появления способности аденомы или части ее клеток внедряться в базальную мембрану субмукозного слоя толстой кишки является важным для лечения и профилактики аденомы толстой кишки. Указанная способность аденомы, как показано, ингибируется ингибированием образования PGHS-2 в указанной аденоме. Поэтому настоящее изобретение касается применения 3-фенил-4-(4-метилсульфонилфенил)2-(5 Н)-фуранона, представленного структурной формулой и обладающего сильным избирательным ингибирующим действием в отношении PGHS2, для лечения или профилактики аденомы толстой кишки. Указанное соединение известно как препарат рофекоксиб (Rofecoxib), выпускаемый фирмой Мерк под торговой маркой Vioxx. Применение 3-фенил-4-(4-метилсульфонилфенил)-2-(5 Н)-фуранона при лечении или профилактике аденомы толстой кишки включает введение его перорально, наружно, парентерально, путем вдыхания спрея или ректально в виде стандартных лекарственных препаратов,содержащих подходящие нетоксичные фарма 005073 6 цевтически приемлемые наполнители, добавки и разбавители. Термин "парентеральный" в том смысле, в котором он здесь используется, включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутригрудинные инъекции или вливания. Рофекоксиб может эффективно применяться не только для лечения теплокровных животных, таких как мыши, крысы, лошади,рогатый скот, овцы, собаки, кошки и т.д., но и для лечения человека. Фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент, могут быть в форме,удобной для перорального применения, например в виде таблеток, облаток, лепешек, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий, твердых или мягких капсул и сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального применения, могут быть приготовлены с помощью любого метода, известного специалистам в области производства фармацевтических препаратов. Такие композиции могут содержать один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов, добавляемых для получения фармацевтически изысканных и приятных на вкус препаратов. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичной фармацевтически приемлемой средой для лекарства, применяющейся в производстве таблеток. Этими средами для лекарства могут быть, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза,фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и разрыхляющие средства, например кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие агенты, например крахмал, желатин или гуммиарабик; смазывающие агенты, например стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть не покрыты или покрыты оболочкой с помощью стандартных методик для того, чтобы замедлить распад и адсорбцию в желудочно-кишечном тракте и,таким образом, получить препарат, действующий в течение более продолжительного времени. Например, можно применять такие продлевающие действие препарата вещества, как моностеарат глицерина или дистеарат глицерина. Может быть также использован метод покрытия оболочкой с целью получения осмотических таблеток с регулируемым высвобождением препарата, который описан в U.S. Patent 4256108; 4166452 и 4265874. Композиции для перорального использования могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с водной или масляной средой, например арахисо 7 вым маслом, жидким парафином или оливковым маслом. Водные суспензии содержат активное вещество в смеси со средами, которые применяются при получении водных суспензий. Такие лекарственные среды представляют собой суспендирующие агенты, например натрийкарбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидин, клей трагакант и клей гуммиарабик; диспергирующие или увлажняющие агенты, а именно фосфатиды природного происхождения, например лецитин, или продукты конденсации алкиленоксидов с жирными кислотами, например стеарат полиоксиэтилена, или продукты конденсации оксида этилена с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации оксида этилена с неполностью этерифицированными жирными кислотами и 6-атомным спиртом (гекситол), такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбитола, или продукты конденсации оксида этилена с частично этерифицированными жирными кислотами и ангидридами гекситола, например моноолеат полиэтиленсорбитана. Водные суспензии могут также содержать один или несколько консервантов, например этиловый или н-пропиловый эфиры п-гидроксибензойной кислоты, один или несколько красителей, один или несколько ароматизаторов и один или несколько подсластителей, таких как сахароза, сахарин или аспартам. Масляные суспензии могут быть приготовлены суспендированием активного ингредиента в растительном масле, например арахисовом, оливковом, кунжутном или кокосовом, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Для получения приятного на вкус препарата для перорального применения могут быть добавлены подсластители из числа перечисленных выше и ароматизаторы. Для продления срока хранения этих композиций могут быть добавлены антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота. Диспергируемые порошки и гранулы используются для приготовления водных суспензий путем добавления воды с получением смеси активного ингредиента с диспергирующим или увлажняющим агентом, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Необходимые диспергирующие, увлажняющие и суспендирующие агенты выбирают из перечисленных выше. Могут быть также добавлены дополнительные компоненты, например подсластители, ароматизаторы и красители. Фармацевтические композиции по данному изобретению могут быть также представлены в виде масляно-водных эмульсий. В качестве масляной фазы может использоваться растительное масло, например оливковое или арахисовое, или минеральное масло, например жидкий парафин, или их смеси. В качестве эмульга 005073 8 тора могут использоваться фосфатиды природного происхождения, например лецитин соевых бобов и продукты полной или частичной этерификации жирных кислот и ангидридов гекситола, например моноолеатсорбитана, а также продукты конденсации частично этерифицированных сложных эфиров, упомянутых выше, с оксидом этилена, например моноолеат полиоксиэтиленсорбитана. Эмульсии также могут содержать подсластители и ароматизаторы. Для приготовления сиропов и эликсиров могут использоваться подсластители, например глицерин, пропиленгликоль, сорбит или сахароза. Такие препараты могут также содержать успокоительные средства, консерванты, ароматизаторы и красители. Фармацевтические композиции могут быть представлены в виде стерильных водных или масляных суспензий для инъекций. Эти суспензии могут быть приготовлены с помощью известных методов с использованием необходимых диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов,упомянутых выше. Стерильные препараты для инъекций могут быть представлены в виде стерильных растворов или суспензий для инъекций в нетоксичном разбавителе или растворителе,пригодном для парентерального введения, например в виде раствора в 1,3-бутандиоле. В качестве подходящих сред и растворителей могут использоваться вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Дополнительно в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для этих целей могут использоваться любые нераздражающие нелетучие масла, включая синтетические, моно- или диглицериды. Дополнительно такие жирные кислоты,как олеиновая кислота, могут применяться для приготовления инъекционных препаратов. 3-Фенил-4-(4-метилсульфонилфенил)-2-(5 Н)фуранон (рофекоксиб) может также использоваться в виде свечей для ректального введения препарата. Эти композиции могут быть приготовлены путем смешивания препарата с соответствующей нераздражающей средой для лекарства, которая является твердой при обычной температуре и жидкой при температуре тела, и,следовательно, свечи будут расплавляться в прямой кишке с освобождением препарата. Такими веществами могут являться кокосовое масло и полиэтиленгликоли. Для наружного применения используют кремы, мази, гели, растворы, суспензии и т.д., содержащие рофекоксиб. (В контексте данной заявки под наружным применением понимается также промывание рта и полоскание горла.) Для лечения перечисленных выше заболеваний применяют уровни дозировки, порядок которых составляет приблизительно 0,01-140 мг/кг веса тела в день или альтернативно 0,5 мг-7 г на пациента в день. Например, при лечении воспалительных заболеваний эффективная доза для введения составля 9 ет приблизительно 0,01-50 мг вещества на кг веса тела в день или приблизительно 0,5 мг-3,5 г на пациента в день. Количество активного ингредиента, которое в сочетании с наполнителями образует стандартную лекарственную форму, изменяется в зависимости от пациента и способа введения. Например, препарат, предназначенный для перорального введения человеку, может содержать от 0,5 мг до 5 г активного вещества в сочетании с соответствующим и приемлемым количеством наполнителя, которое изменяется от 5 до 95% от массы всей композиции. Дозировочные единичные формы в общем случае содержат приблизительно 1-500 мг активного ингредиента, а именно 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 мг. Допускается применение дозы 1 раз в день. Очевидным является то, что конкретный уровень дозы для каждого пациента определяется различными факторами, включая возраст,массу тела, общее состояние здоровья, пол, питание, время и метод введения, скорость экскреции, сочетание лекарств, степень тяжести переносимого заболевания. Приводимые ниже примеры раскрывают, но не ограничивают область данного изобретения. Примеры Образцы, взятые у пациентов Исследовали пары образцов раковых и нормальных тканей слизистой оболочки толстой кишки, ткани аденомных полипов, нормальной слизистой оболочки нераковых пациентов и пары образцов нормальной и раковой ткани молочной железы. Средний возраст и возрастной диапазон пациентов, у которых брали в пары образцов нормальной и раковой ткани толстой кишки, составлял 63,3 и 41-93 лет, соответственно. Образцы тканей толстой кишки были взяты из района опухоли, не подверженного некрозу, и из аутологичной нормальной слизистой оболочки того же пациента, при том, что область резекции располагалась на расстоянии более 5 см от опухоли. По данным гистологии,все опухоли толстой кишки были представлены аденокарциномами, причем у всех пациентов наблюдали спорадический рак толстой кишки. У одного пациента фокус аденокарциномы находился внутри аденомного полипа. Аденомы толстой кишки принадлежали пациентам с множественным аденомным полипозом (FAP). Получение микросомальных мембран из тканей толстой кишки Замороженные ткани оттаивают в охлаждаемом льдом буфере для гомогенизации [50 мМ фосфат калия, рН 7,1, содержащий 0,1 М хлорид натрия, 2 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту, 0,4 мМ фенилметилсульфонилфторида, 60 мкг/мл ингибитора трипсина из соевых бобов, 2 мкг/мл лейпептина (leupeptine),2 мкг/мл апротинина (aprotinine) и 2 мкг/мл пепстатина (pepstatine), полученных от SigmaChemical Co., St. Louis, МО]. Ткани дважды из 005073 10 мельчают на льду, используя размельчитель тканей (Biospec Products, Bartlesville, OK) и гомогенизируют при 4 С с помощью ультразвукового гомогенизатора типа Cole Farmer 4710(Cole Farmer Instrument Co., Chicago, IL). Клеточные обломки удаляют центрифугированием при 1000xg в течение 15 мин при 4 С и полученные супернатанты центрифугируют при 100000 хg в течение 60 мин при 4 С. Мембранные фракции ресуспендируют в буфере для гомогенизации и обрабатывают ультразвуком для получения гомогенной мембранной суспензии. Концентрации белка определяют в каждом образце с помощью набора для определения белкаPGHS-1 из семенных пузырьков барана иPGHS-2 из плаценты были получены от Cayman(Ann Arbor, MI) и использовались для получения кроличьих поликлональных антител. Самкам новозеландских белых кроликов вводили 1 мл полного адъюванта Фрейнда, содержащего 200 мкг очищенных препаратов PGHS-1 или PGHS-2. Через 2 недели после первой инъекции для усиления эффекта кроликам вводили 100 мкг очищенной PGHS-1 или PGHS-2 в 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда. Антисыворотка противPGHS селективно распознает изоформы гомологичных человеческих PGHS при приблизительно тысячекратном разбавлении. При условиях,используемых в данном исследовании, антитела против PGHS не демонстрировали значительных перекрестных реакций с альтернативными изоформами PGHS. В каждом эксперименте две концентрации стандартов как PGHS-1, так иPGHS-2 помещали на каждый гель для исследования селективности антител. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDSPAGE) и анализ методом иммуноблотирования Фракции мембран перемешивают с SDSбуфером (20 мМ трис-HCl, рН 6,8, содержащий 0,4% (вес./об.) SDS, 4% глицерина, 0,24 М меркаптоэтанола и 0,5% бромфенолового синего), кипятят 5 мин и анализируют электрофорезом (SDS-PAGE) по методике, описаннойproteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227; 680-685, 1970). Белки с помощью электрофореза переносят на нитроцеллюлозные мембраны, как описано ранееPGHS-2 применяли при конечном разведении 1:5000 и 1:7500 соответственно. Вторичные связанные с пероксидазой хрена антитела осла против кроличьих IgG (Amersham Life Sciences,Oakville, Ontario, Canada) применяют при разведении 1:3000. Иммунодетектирование проводят 11 методом индуцированной хемилюминесценции в соответствии с инструкцией производителя(Amersham). Авторадиограммы сканируют, используя компьютерный денситометр (MolecularDynamics, Sunnyvale, CA), и, используя оптическую плотность, соответствующую очищенной изоформе PGHS, рассчитывают количество (нг)PGHS в гистологически нормальной и опухолевой ткани толстой кишки. Статистические анализы Результаты этого исследования анализировали с помощью непараметрического теста Вилькоксона (Wilcoxon) с выделенным рангом для определения существенных различий между уровнями PGHS-1 и PGHS-2 в нормальной и опухолевой тканях (Freund, J.E. MathematicalJersey, 1992). Результаты Экспрессия PGHS-1 в нормальную и опухолевую ткани толстой кишки человека Фиг. 1 представляет результаты иммуноблотинга, демонстрирующие экспрессию PGHS у 4 из 25 обследованных пациентов. Полоса,соответствующая белку с молекулярным весом 72 кД, является характерной для PGHS-1 (Otto,J.C., DeWitt, D.L.S., Smith, W.L. N-glycosylationJ. Biol. Chem. 268; 18234-18242, 1993) и совпадает с очищенным стандартом PGHS-1 из семенных пузырьков барана (фиг. 1 А), а также с рекомбинантным PGHS-1 человека, экспрессированным в клетках COS-7 (данные не приводятся; 7). Количественный обсчет результатов иммуноблотирования у всех 25 пациентов проводили методом денситометрии; данные представлены на диаграмме фиг. 2. У 21 из 25 пациентов уровни PGHS-1 в опухолевой ткани были меньше, чем в нормальной ткани толстой кишки. Усредненное значение падения уровня PGHS-1 в опухолевой по сравнению с нормальной тканью для всех 25 обследованных пациентов составляло 170 нг/мг микросомального белка. В сравнении с очищенным стандартом PGHS-1 диапазон концентраций PGHS-1 в нормальной и опухолевой тканях составлял 0-760 нг (среднее значение 199,8) и 4-540 нг (среднее значение 51,1) на мг микросомального белка соответственно. Различие в экспрессии PGHS-1 между нормальной и опухолевой тканями является статистически достоверным по данным непараметрического анализа (тест Вилькоксона (Wilcoxon) с выделенным рангом, р 0,0001). Экспрессия PGHS-2 в нормальную и опухолевую ткани толстой кишки человека На фиг. 1 В представлены данные иммуноблотирования парных образцов толстой кишки 4 из 25 пациентов, полученные с использованием специфических антител против PGHS-2. Для сравнительной оценки экспрессии PGHS-1 12 ченных от одного и того же пациента, проводили двойное иммуноблотирование. В каждом из 4 образцов нормальной ткани толстой кишки иммунореактивность против PGHS-2 не была обнаружена. Напротив, иммунореактивные полосы, соответствующие молекулярному весу 7072 кД и совпадающие с очищенным PGHS-2 из плаценты овцы (фиг. 1 В) и рекомбинантнымCOS-7 (данные не приводятся; 7), были обнаружены в опухолевых тканях 3 из 4 обследованных пациентов. Вообще, PGHS-2 был обнаружен в опухолевой ткани у 19 из 25 обследованных пациентов (фиг. 2). Среднее значение прироста PGHS-2 в опухолях толстой кишки для всех 25 обследованных пациентов составляло примерно 73 нг/мг микросомального белка. Как показано в сравнении со стандартом PGHS-2,диапазон концентраций PGHS-2 в нормальной и опухолевой тканях составлял соответственно 049 нг (среднее значение 3,8 нг) и 1,6-580 нг(среднее значение 37,7) на мг микросомального белка. Различие в экспрессии PGHS-2 между нормальной и опухолевой тканями является статистически достоверным по данным непараметрического анализа (тест Вилькоксона (Wilcoxon) с выделенным рангом, р 0,0001). Опухоли толстой кишки классифицируют по Dukes на 4 стадии: А - опухоль слизистой оболочки кишечника; В - опухоль слизистой оболочки с проникновением в мышечную ткань; С - метастазы в лимфоузлах и D - метастазы в других тканях. В данном исследовании изучались опухоли толстой кишки всех стадий по классификации Dukes. Данные обследования пациентовND = иммунореактивность не обнаружена Стадии по Dukes: A = опухоль слизистой оболочки В = опухоль слизистой оболочки с проникновением в мышечную ткань С = метастазы в лимфоузлахD = метастазы в других тканях Таблица. Данные обследования пациентов. Приведена информация по каждому обследованному пациенту. При наличии данных указаны препараты, принимаемые пациентами. Стадии заболевания по Dukes соответствуют следующим сокращениям: А - опухоль слизистой оболочки; В - опухоль слизистой оболочки с проникновением в мышечную ткань; С - метастазы в лимфоузлах и D - метастазы в других тканях. Количество экспрессируемого PGHS соответствует относительному изменению в экспрессии при сравнении нормальной ткани слизистой оболочки толстой кишки и опухолевой ткани. NA: данные отсутствуют, и ND: иммунореактивность не обнаружена. Не было обнаружено взаимосвязи между стадией опухоли и изменением экспрессииPGHS-1 или PGHS-2. Данное отсутствие взаимосвязи согласуется с результатами исследования, показывающего отсутствие корреляции между уровнем простагландина E2 в опухолях толстой кишки человека и стадиями опухолей по Dukes (Rigas, В., Goldman, I.S., Levine, L.Lab. Clin. Med., 122; 518-523, 1993). Следует отметить, что экспрессия PGHS-2 была очень низкой или не обнаружена у 5 из 6 пациентов,принимавших противовоспалительные препараты в процессе исследования (таблица). Экспрессия PGHS-1 и -2 в нормальную толстую кишку, предраковые полипы и в пары образцов нормальной и опухолевой тканей молочной железы Экспрессию PGHS-1 и -2 анализировали в различных тканях человека, включая 5 образцов ткани толстой кишки нераковых пациентов, 4 предраковых полипа и 3 пары образцов нормальной и опухолевой тканей молочной железы. Несмотря на то, что PGHS-1 обнаруживали в нормальной и раковой тканях, PGHS-2 не наблюдали ни в одном из образцов.PGHS-2 наблюдали в 19 из 25 образцов опухолей толстой кишки, в то время как экспрессию этого белка обнаружили только в 2 из 25 образцов нормальной ткани. Индуцирование экспрессии PGHS-2 сопровождается уменьшением экспрессии PGHS-1 в 21 из 25 образцах опухолей по сравнению с соседней нормальной тканью слизистой оболочки толстой кишки; тем не менее, концентрации PGHS-1 имели близкие значения в контрольных образцах толстой кишки и полипов. Насколько нам известно, это исследование является первым, в котором определяли экспрессию PGHS-1 и -2 при раке толстой кишки человека. Предыдущие исследования продемонстрировали увеличение уровня эйкозаноидов, в частности PGE2, при раке толстой кишки человека (Rigas, В., Goldman, I.S., Levine, L. AlteredGut, 28; 315-318, 1987). Заявители сделали вывод, что наблюдаемое увеличение количества фермента PGHS-2 в опухолевой ткани толстой кишки приводит к повышению уровня простагландинов в этих опухолях. Более того, мы сделали вывод, что, поскольку простагландины могут иметь множественные эффекты в биологии рака, включающие стимулирование роста и модулирование иммунного надзора, повышенный уровень простаноидов в опухолях способствует их росту или развитию (Earnest, D.L.,Hixson, L.J., and Alberts, D.S. Piroxicam and otherchemoprevention. J. Cell. Biochem., 161 (Suppl.); 156-166, 1992). Интересно, что изоформа PGHS2 не обнаруживалась при исследовании образцов рака молочной железы. Таким образом, экспрессия PGHS-2 является отличительной чертой трансформации тканей от промалигнизированной к малигнизированной фазе. Эберхарт (Eberhart) и соавторы продемонстрировали увеличение уровня мРНК PGHS-2 в аденомах и аденокарциномах толстой и прямой кишки человека (Eberhart, C.E., Coffey, R.J.,Radhika, A., Giardiello, F.M., Ferrenbach, S., Dubois,R.N. Up-regulation of cyclooxygenase 2 gene expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas. Gastroenterology, 107; 1183-1188,1994). Хотя это интересное наблюдение, оно не демонстрирует действительную экспрессию фермента из-за наличия комплексной посттранскрипционной и -трансляционной регуляции мРНК PGHS-2. Например, Hoff et al. (Hoff,Т., DeWitt, D., Kaever, V., Resch, K. and Goppelt 15FEBS Lett., 320; 38-42, 1993), Lee et al. (Lee,S.H., Soyoola, E., Chanmugam, P., Hart, S., Sun,W., Zhong, H., Liou, S., Simmons, D., and Hwang,D. Selective expression of mitogen-inducible cyclooxygenase in macrophages stimulated with lipopolysaccharide. J. Biol. Chem., 267; 25934-25938,1992), а также в лабораториях заявителя была показана существенная экспрессия мРНКPGHS-2, которая не сопровождалась экспрессией PGHS-2. Следовательно, определение экспрессии PGHS является критическим моментом в вычислении концентрации PGHS-2. Нет оснований предполагать отсутствие PGHS-2 в полипах 4 пациентов, страдающих семейным аденоматозным полипозом, особенно в свете того, что некоторые препараты, такие как сулиндак (sulindac) (ингибирующие как PGHS-1, так и PGHS2), приводят к регрессии полипов. Образцы полипов человека представляли собой совокупность маленьких полипов толстой кишки, диаметр которых варьирует от 0,4 до 5 мм. На наш взгляд, экспрессия PGHS-2 происходит на более поздней стадии полип-раковой последовательности, когда полипы становятся больше в диаметре, возможно, 5 мм или более. Недавние исследования Ladenheim et al. показали, что сулиндак не приводит к регрессии единичных полипов толстой кишки; однако, они подчеркнули,что их исследования касались ранних единичных полипов (67% полипов были 5 мм), и предположили, что ответ на НСПВС мог бы быть более благоприятным в полипах с "особой стадией аденомо-карциномной последовательностиsulindac on sporadic colonic polyps. Gastroenterology, 108; 1083-1087, 1995)". Пролонгированное применение НСПВС связано с побочными эффектами, которые включают почечную токсичность, изъязвление желудочно-кишечного тракта и усиление кровотечения. Современные НСПВС, такие как аспирин, сулиндак и индометацин, имеют невысокую селективность в ингибировании как PGHS-1, так и PGHS-2 (Battistini, В., Botting, R., and Bakhle,Y.S. COX-1 and COX-2: Toward the development of 16 селективные ингибиторы PGHS-2 будут оказывать положительное терапевтическое действие и обладать пониженной способностью индуцировать побочные эффекты. Недавно было показано на крысах, что NS-398, селективный ингибитор PGHS-2, оказывает противовоспалительное,жаропонижающее и анальгезирующее действие,не вызывая при этом изъязвления (Futaki, N.,Yoshikawa, К., Hamasaka, Y., Arai, I., Higuchi, S.,Iizuka, H., and Otomo, S. NS-398, a novel nonsteroidal antiinflammatory drug with potent analgesiccyclooxygenase (COX-2) activity in vitro. Prostaglandins, 47; 55-59, 1994). В данном исследовании экспрессии PGHS-1 и PGHS-2 в толстой кишке показано, что обе изоформы PGHS характерны для опухолей. Полипы мышей У мышей с утраченным геном Арс 716USA, 92, 4482-4486, 1995) развивали множественные полипы кишечника. Небольшие полипы(от 0,3 до 5,6 мм) кишечника и толстой кишки мышей с утраченным геном Арс 716 собирали и сразу же замораживали. Были собраны полипы от 6 мышей (как самцов, так и самок), полученных в результате обратного скрещивания поколений N1, N2 и N4. Результаты Экспрессия PGHS-1 и PGHS-2 в полипах Арс 716 мышей Определяли экспрессию PGHS-1 и PGHS-2 в полипах увеличивающегося размера Арс 716 мышей. На фиг. 3 представлены результаты анализа экспрессии PGHS-1 и PGHS-2 методом иммуноблотирования в полипах, размер которых варьирует от 0,3 до 5 мм в диаметре (линии 1-5 соответствуют образцам, полученным из полипов диаметром приблизительно 1-5 мм соответственно). Продемонстрировано наличиеPGHS-1 во всех контрольных образцах кишечника и толстой кишки и в полипах. Иммунореактивность PGHS-2 не была обнаружена в контрольных образцах тканей кишечника и толстой кишки. Низкий уровень PGHS-2 обнаруживали в кишечных полипах большего размера (3-5 мм в диаметре, линии 3, 4 и 5), более высокие уровни PGHS-2 детектировали во всех полипах толстой кишки, размер которых варьирует от 1 до 5 мм в диаметре (линии 1-5), причем очень высокий уровень PGHS-2 детектировали в полипах диаметром 2-3 мм (линии 2 и 3). В каче 17 стве стандартов электрофорезу подвергали очищенные образцы бараньих PGHS-1 и PGHS2 (5, 10 и 20 нг) , которые обозначены на фигуре соответствующим образом. Мы предполагаем,что драматическая индукция СОХ-2 в процессе роста полипов отражает критическую роль это 18 го фермента в инициации трансформации аденомы в аденокарциному. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Применение 3-фенил-4-(4-метилсульфонилфенил)-2-(5 Н)-фуранона для лечения или профилактики аденомы толстой кишки.