Способ и набор реагентов для определения активности 5′-нуклеотидазы

Номер патента: 5164

Опубликовано: 30.12.2004

Авторы: Тулок Иштван, Берта Андраш

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ диагностики наличия злокачественной опухоли и/или контроля результатов терапии, примененной для ее лечения, путем определения 5'-нуклеотидазной активности, в соответствии с которым биологический образец инкубируют способом и при условиях, известных per se, с нуклеотидпентозомонофосфатом в качестве субстрата, высвобожденный неорганический фосфат превращают в окрашенный комплекс путем его обработки молибдатом аммония и восстанавливающим агентом, интенсивность цвета измеряют известным способом, и на основании измеренной величины активности 5'-нуклеотидазы или количества неорганического фосфата, высвобожденного за единицу времени, рассчитывают величину, пропорциональную активности 5'-нуклеотидазы, с помощью известных вычислений и/или с помощью калибровочной кривой, отличающийся тем, что в качестве нуклеотидпентозомонофосфатов используют 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP и 5'-TMP, измерения выполняют на всех шести субстратах и полученные результаты сравнивают друг с другом и с контрольными величинами.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологический образец инкубируют с субстратом в буфере, при необходимости, в присутствии ингибитора, а затем, кроме молибдата аммония и восстанавливающего агента, добавляют в инкубационную смесь также белокрастворяющий реагент и стабилизирующий агент.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что нуклеотидпентозомонофосфатные субстраты используют в виде водных растворов с концентрацией 1-10 ммоль/л.

4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве биологического образца используют цельную кровь, сыворотку или гемолизат и инкубацию с субстратом осуществляют как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора щелочной фосфатазы.

5. Набор реагентов для осуществления способа по пп.1-4, содержащий 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP и 5'-TMP в качестве субстратов вместе со стандартными компонентами набора реагентов, применяемого для определения 5'-нуклеотидазной активности через образование неорганического фосфата, превращение полученного фосфата в окрашенный комплекс и измерение интенсивности цвета с помощью фотометрии.

6. Набор реагентов по п.5, дополнительно содержащий в качестве стандартных компонентов буфер, белокрастворяющий реагент, стабилизирующий реагент, цветной реагент, стандартный раствор, содержащий трехвалентный фосфор, и, при необходимости, ингибитор и/или другой субстрат, не являющийся нуклеотидпентозомонофосфатом.

 

Текст

Смотреть все

1 Изобретение касается способа определения активности 5'-нуклеотидазы (5'-рибонуклеотидфосфогидролазы) в жидкостях организма, тканевых препаратах и/или клеточных элементах. Изобретение касается также набора реагентов,применяемого в способе согласно данному изобретению. Из нарушений метаболизма, которые сопровождают злокачественные процессы и являются также факторами их поддержания, изменения в метаболизме нуклеотидов играют заметную роль. Это объясняет, почему воздействие на синтез ДНК/РНК и на метаболизм нуклеотидов, которые тесно связаны с этими процессами, является одной из основных целей противоопухолевой терапии. Исследование процессов метаболизма нуклеотидов имеет особое значение в определении опухолевых процессов и для того, чтобы отличить доброкачественные процессы от злокачественных. Исследование изменений в процессах метаболизма нуклеотидов также неотделимо от аспектов контроля противоопухолевой терапии,поскольку в подавляющем большинстве химиотерапевтических подходов терапевтический эффект проявляется в искусственно вызванных нарушениях нуклеотидного метаболизма и синтеза ДНК. Эти искусственно провоцируемые изменения являются решающими факторами,определяющими эффективность противоопухолевой терапии, однако они ответственны также за основные повреждения здоровых клеток и нарушения клеточных и органных функций. В обычных условиях одним из наиболее подходящих способов является определение активности 5'-нуклеотидазы (5'-рибонуклеотидфосфогидролазы), фермента, обнаруженного Райсом (Reis, J.: ber die spezifische Phosphataseder Nerwengewebe; Enzymologia 2, 110-115,1937). Этот фермент катализирует только гидролиз нуклеотидпентозомонофосфатов (5'-АМР,5'-СМР, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP, 5'-ТМР, dAMP,dCMP, dUMP и т.д.) с образованием нуклеотидов и неорганического фосфата (Bodansky, О.,Schwartz, M.K.: 5'-Nucleotidase; Adv. Clin. Chem. 11, 277-327, 1968) и может рассматриваться в качестве одного из наиболее чувствительных мембранных маркеров. Определение активности 5'-нуклеотидазы используется как для клинических целей, так и для экспериментальных исследований; в первом случае измерение обычно проводят в негемолизированной сыворотке и/или в гемолизате, тогда как во втором случае измерение можно проводить в тканях организма, в тканевых препаратах (например на плазматических мембранах) и/или на клеточных элементах (т.е. в микросомах, цитоплазме, лизосомах) (см.: Solyom, A., Trans., E.G.: EnzymeMambranes; Enzyme 13, 329-372, 1972). Так как 5'-нуклеотидаза представляет собой фермент, который специфически расщепля 005164 2 ет нуклеотидпентозомонофосфаты, широко применяющимся способом определения активности 5'-нуклеотидазы является инкубация биологического образца с нуклеотидпентозомонофосфатным субстратом и затем, после добавления соответствующего реагента, способствующего развитию цвета, колориметрическое определение (спектрофотометрия) количества неорганического фосфата, высвобожденного за единицу времени под действием фермента. Если анализируемый биологический образец содержит также компоненты, которые препятствуют"работе" 5'-нуклеотидазы (для крови или сыворотки таким компонентом является щелочная фосфатаза, для лизосомальных мембран такими компонентами являются другие сахарофосфаты), то инкубацию проводят в присутствии ингибитора, подавляющего их воздействие. В качестве реагента, способствующего развитию цвета, используют молибдат аммония в присутствии восстанавливающего агента, который обычно представляет собой хлорид олова (2),при необходимости, вместе с солью гидразина или аскорбиновой кислотой, который реагирует с неорганическим фосфатом с образованием комплекса интенсивного синего цвета. Принимая во внимание, что молибдат аммония осаждает белки, присутствующие в биологическом образце, белки либо удаляют до проведения цветной реакции, либо поддерживают в растворенном состоянии путем добавления к смеси соответствующего солюбилизирующего агента. По мнению авторов, этот способ является одним из наиболее современных колориметрических способов. При применении этого способа количество образца, необходимое для определения,может быть уменьшено до нескольких сотых долей миллилитра, а точность анализа значительно увеличена. Определение активности 5'нуклеотидазы по вышеупомянутому принципу подробно раскрыто в следующих статьях и дополнительных ссылках, которые процитированы здесь: J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 7, 18-25(1981); Adv. Clin. Chem. 11, 277-332 (1968). Характерной особенностью всех стандартных способов, применявшихся ранее для определения активности 5'-нуклеотидазы на основе вышеописанного принципа, для диагностических или экспериментальных целей, является то,что ферментативную активность измеряли только на одном субстрате. В качестве субстрата чаще всего использовали аденозин-5'монофосфат (5'-АМР), менее часто - цитидин-5'монофосфат(5'-СМР) или инозитол-5'монофосфат (5'-IМР), или - в гемолизатах уридин-5'-монофосфат (5'-UMP). В экспериментах, выполненных авторами изобретения, для определения злокачественных процессов и для контроля за эффективностью противоопухолевой терапии, активность 5' 3 нуклеотидазы в одном и том же биологическом образце измеряли параллельно на шести различных субстратах, а именно, на аденозин-5'монофосфате (5'-АМР), цитидин-5'-монофосфате (5'-СМР), уридин-5'-монофосфате (5'UMP), гуанозин-5'-монофосфате (5'-GMP), инозитол-5'-монофосфат (5-IМР) и тимидин-5'монофосфате (5'-ТМР). Активность неспецифической фосфатазы в биологическом образце измеряли на -глицерофосфатном субстрате, и последний брали в качестве поправки. Как и ожидалось на основании работ, процитированных выше, авторы изобретения наблюдали, что хотя величины 5'-нуклеотидазной активности,измеренные на различных нуклеотидпентозомонофосфатах, количественно отличаются друг от друга у здоровых и больных индивидуумов,существует строгая корреляция между величинами активности, измеренными на различных субстратах. Это объясняется тем, что при физиологических условиях в сыворотке, представляющей собой общий метаболический пул, существует динамическое равновесие процессов метаболизма нуклеотидов. С другой стороны,как и следует из литературы, авторы наблюдали,что величины 5'-нуклеотидазной активности,измеренные на указанных выше шести субстратах в сыворотке от здоровых и больных индивидуумов, отличаются друг от друга в такой степени, что не могут быть охарактеризованы только различиями в химической природе этих субстратов, но являются следствием физиологических процессов. Однако авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что вышеуказанная строгая корреляция изменяется после терапии, и значительные различия проявляются на основании того, воздействовала ли терапия на пуриновый метаболизм, на пиримидиновый метаболизм или на тимидиновый метаболизм. Таким образом, на основании результатов измерений активности, выполненных на указанных выше шести различных субстратах,можно сделать вывод о том, является ли применяемая терапия эффективной, оказывает ли она воздействие на очаг, предназначенный для воздействия, и индуцирует ли эта терапия нежелательные клеточные повреждения или нет. Это распознавание образует основу настоящего изобретения. На основании вышесказанного, настоящее изобретение касается способа диагностики наличия злокачественного процесса и/или контроля результатов терапии, примененной для его лечения, путем определения 5'-нуклеотидазной активности, в котором биологический образец инкубируют по способу и в условиях, известныхper se, с нуклеотидпентозомонофосфатом в качестве субстрата; высвобожденный неорганический фосфат превращают в окрашенный комплекс путем его обработки молибдатом аммония и восстанавливающим агентом, интенсив 005164 4 ность цвета измеряют известным способом, и из измеренной величины активности 5'нуклеотидазы или количества неорганического фосфата, высвобожденного за единицу времени,рассчитывают с помощью известных вычислений или с помощью калибровочной кривой величину, пропорциональную (коэффициент пропорциональности) активности 5'-нуклеотидазы. Согласно изобретению, 5'-АМР, 5'-СМР, 5'UMP, 5'-GMP, 5'-IMP и 5'-ТМР используются в качестве нуклеотидпентозомонофосфатов, измерения осуществляют на всех шести субстратах и полученные результаты сравнивают друг с другом и с контрольными величинами. Поскольку при химиотерапевтическом лечении наблюдаются различия в активности 5'нуклеотидазы на всех шести различных субстратах даже после короткого периода (24 ч),может быть принято обоснованное решение о продолжении, изменении или об окончании терапии в течение короткого периода времени и с меньшей неопределенностью. Для сравнения,авторы отмечают, что изменение, которое может служить основанием для решения, для большинства опухолевых маркеров можно наблюдать только по прошествии 1 недели лечения. Когда активность 5'-нуклеотидазы измеряют параллельно на всех шести вышеуказанных субстратах и суммируют эти результаты,можно поставить гораздо более надежный диагноз о состоянии индивидуума и о наличии процессов в печени и костях, чем это можно было бы получить при измерении, которое выполняется только на одном субстрате. Это может обеспечить существенную помощь на ранних этапах распознавания злокачественных процессов. На основании логически вытекающей отсюда взаимосвязи биохимических процессов,измерения активности 5'-нуклеотидазы на вышеуказанных шести субстратах могут заменить определения ферментативной активности, которые менее часто используются в экспериментальной и клинической практике, и если и используются в качестве рутинного теста, то являются гораздо более сложными и трудными для выполнения. Эти замены или возможности для замены могут быть, например, следующими: 5'-СМР-нуклеотидазацитидинкиназацитидиндезаминазацитидинтрифосфатсинтетаза; 5'-GМР-нуклеотидазагуанозиндезаминаза; 5'-IМР-нуклеотидазаIMPдегидрогеназа; 5'-ТМР-нуклеотидазатимидинкиназатимидинсинтетаза. О реагентах, необходимых для измерений,об условиях реакции и о способе расчета подробную информацию можно получить из литературы, в том числе из работ, процитированных выше. В качестве примера авторы описывают систему реагентов, которая используется для 5 измерений активности без удаления белков, которая оказалась особенно предпочтительной, а также описывают, каким образом использовать эту систему для измерений, выполняемых на образцах сыворотки, и способ расчета, но без ограничений использования этого способа изобретения системой реагентов и условиями, раскрытыми ниже. Реагенты, которые следует использовать,следующие:MgCl2 или 2.0-5.0 ммоль/л MnCl2, 1.0-5.0 ммоль/л КСl; рН раствора подводят до 9-9.5 с помощью 3-6 М водного раствора НСl.(2) Ингибитор: Ингибитор должен использоваться только тогда, когда биологический образец содержит вещество, которое препятствует определению активности 5'-нуклеотидазы. Для крови и сыворотки таким веществом является щелочная фосфатаза, которую можно заингибировать раствором, содержащим 10-20 г/л L-цистеина илиL-глицина, или эквивалентным количеством соли L-цистеина или L-глицина, или 50-250 мг/л конканавалина А, при этом растворителем является описанный выше буфер. Когда измерения выполняют на лизосомальных мембранах, используют 5-50 ммоль/л раствор L(+)-тapтpaтa в вышеописанном буфере для ингибирования присутствующих сахарофосфатов.(3) Субстраты: В качестве субстратов используют 5'-АМР,5'-СМР, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP и 5'-ТМР в виде 1-10 миллимолярных растворов в деминерализованной воде. -Глицерофосфат или динатрийфенилфосфат в качестве субстрата также должны использоваться в растворе в той же концентрации. Два последних вещества известны в качестве субстратов для определения неспецифической фосфатазной активности; эту активность также следует определять для того,чтобы, в свою очередь, точно определить активность 5'-нуклеотидазы.(4) Белокрастворяющий реагент: Чистая (концентрированная) муравьиная кислота или пропионовая кислота самой высокой степени чистоты.(5) Стабилизирующий реагент: Смесь глицерина и воды (1:9-4:6, об/об),или 0.5-5% (вес/вес) водного раствора сорбитола, или 0.25-2.5% (вес/вес) водного раствора маннитола, или смесь н-пропанола и воды (1:21:1, об/об). Целесообразно растворять небольшое количество (0.001-0.01% (вес/вес азида натрия в стабилизирующем реагенте для увеличения срока хранения реагента.(6) Цветной реагент: 5-10 г/л раствора молибдата аммония в деминерализованной воде.(7) Восстанавливающий раствор: 1-5 г/л раствора SnCl2 в 1 М водном растворе соляной кислоты или 1-5 г/л раствора аскорбиновой кислоты в деминерализованной воде.(8) Стандартный раствор, содержащий трехвалентный фосфор: 1.61 ммоль/л раствора неорганического фосфата, который разбавляют в сериях. Измерения осуществляют следующим образом. Аналитический реагент для определения количества неорганического фосфата приготавливают путем смешивания белокрастворяющего реагента в объемном соотношении:- 7:1 - 4:1 с водным раствором нпропанола,и 15-25 об.% цветного реагента от общего объема конечной смеси прибавляют к полученной смеси. Компоненты, перечисленные в первых пяти строках табл. 1, смешивают друг с другом в соотношениях, указанных в таблице, и полученную смесь инкубируют при 37 С в течение 60 мин. Затем к смеси прибавляют и другие компоненты, перечисленные в табл. 1. Полученную смесь перемешивают, выдерживают в течение 15 мин и затем измеряют абсорбцию раствора при 620-720 нм. Колонка в табл. 1 с заголовком"5'-ND+ALP" относится к измерениям, где активность 5'-нуклеотидазы измеряют вместе с активностью щелочной фосфатазы (т.е. ингибитор не используется), тогда как колонка с заголовком "5'-ND" относится к измерениям, которые проводятся в присутствии ингибитора щелочной фосфатазы. Активность неспецифической фосфатазы представлена в результатах обоих измерений. Активность неспецифической фосфатазы определяют отдельно на глицерофосфатном субстрате в присутствии ингибитора; полученное значение вычитают из предыдущих значений для того, чтобы получить активность 5'-нуклеотидазы+щелочная фосфатаза или активность 5'-нуклеотидазы, соответственно. Вычисления выполняют следующим образом:(а) Расчет разности экстинкций (величина Е):(b) Расчет ферментативной активности на основе указанных выше значений Е. где стандартная концентрация представляет собой концентрацию стандарта, а К является коэффициентом, рассчитанным из следующей формулы:(с) Расчет индивидуальной ферментативной активности или суммарной активности на основе вышеуказанных данных. Неспецифическая фосфатазная активность = активность, измеренная на -глицерофосфате. 5'-Нуклеотидазная активность, измеренная на различных нуклеотидпентозомонофосфатах = 5'ND активность - неспецифическая фосфатазная активность. Активность 5'-нуклеотидазы + щелочная фосфатаза = 5'-ND+ALP - неспецифическая фосфатазная активность. Активность щелочной фосфатазы = 5'ND+ALP-5' - ND-неспецифическая фосфатазная активность. Если биологический образец представлен не сывороткой, то измерение выполняют таким же образом, с той разницей, что иногда ингибитор не является необходимым или используют другой ингибитор. Расчеты выполняют так же,как описано выше. Таблица 1 На основании величин 5'-нуклеотидазной активности, полученных на отдельных субстратах в вышеописанных сериях измерений, можно сделать следующие биологические выводы. Оценка состояния: Картина, полученная после суммирования шести измеренных величин активности, указывает на отсутствие болезни - до 54-65 ед./л, при условии, что активность щелочной фосфатазы в то же время составляет 10-25 ед./л. Если активность щелочной фосфатазы составляет свыше 50 ед./л, и сумма величин 5'-нуклеотидазной активности в то же самое 8 время составляет 54-65 ед./л, то это указывает на возникновение злокачественного процесса в костях. Если сумма 5'-нуклеотидазных активностей выше 70 ед./л, то это является верным признаком болезненного состояния. Если же активность щелочной фосфатазы в то же самое время составляет свыше 35 ед./л, то это является верным признаком наличия поражений печени. Для опухолей печени как сумма величин 5'нуклеотидазной активности, так и активность щелочной фосфатазы в 4-10 раз выше нормальных величин. Оценка терапии: Изменение в активности,измеренное на 5'-АМР, 5'-GMP и 5'-IMP субстратах, показывает, что противоопухолевая терапия оказала воздействие на пуриновый метаболизм, тогда как изменение в активности,измеренное на 5'-СМР, 5'-UMP и 5'-ТМР субстратах, показывает, что противоопухолевая терапия оказала воздействие на пиримидиновый метаболизм. Неизмененные величины указывают на то, что терапия является бесполезной. Уменьшение активности всегда указывает на то,что терапия оказала благоприятное воздействие на процессы. Во многих случаях наблюдается следующее: после применения химиотерапии уменьшение 5'-нуклеотидазной активности является настолько выраженным, что как активности, измеренные отдельно на каждом субстрате,так и сумма этих активностей составляют менее 10 ед./л, более того, иногда могут быть получены отрицательные значения для 5'нуклеотидазной активности. Это происходит оттого, что терапия направлена на нуклеотидный метаболизм, но не воздействует на величины неспецифической фосфатазной активности; отрицательное значение активности получают тогда, когда более высокое значение неспецифической фосфатазной активности должно быть вычтено из меньшего значения 5'-ND активности. Если значения 5'-нуклеотидазной активности меньше значений, полученных для здоровых индивидуумов (контрольной группы), то это всегда является признаком цитотоксических повреждений здоровых клеток с быстрым нуклеотидным метаболизмом (прежде всего слизистой кишечника, костного мозга и эритроцитов),особенно, когда такие изменения наблюдаются в отношении всех 5'-нуклеотидазных активностей, измеренных на всех шести субстратах. В таких случаях терапия должна быть изменена или прекращена. Изобретение касается также набора реагентов, применяемого для способа настоящего изобретения, который содержит 5'-АМР, 5'СМР, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP и 5'-ТМР в качестве субстратов, кроме обычных компонентов набора реагентов, использующихся для определения 5'-нуклеотидазной активности через образование неорганического фосфата, превращение полученного фосфата в окрашенный комплекс и 9 измерение интенсивности цвета с помощью фотометрии. Стандартные компоненты из набора реагентов могут быть такими, которые используются для известных способов, например для тех,которые раскрыты в процитированных выше публикациях. Предпочтительный набор реагентов может включать следующие компоненты:- другой субстрат, не нуклеотидпентозомонофосфат (например, -глицерофосфат). Предпочтительными компонентами из обычных вышеуказанных компонентов являются компоненты, перечисленные в описании способа изобретения. Набор реагентов может содержать обычные компоненты либо в виде растворов с вышеуказанными концентрациями,либо в виде более концентрированных растворов, которые должны быть разбавлены непосредственно перед использованием, или в виде чистых веществ. В качестве примера даны результаты измерений 5'-нуклеотидазной активности, полученные на образцах сыворотки, вместе с выводами, которые можно сделать на основании этих результатов. Количества индивидуальных веществ и условия анализа были такими же, как в табл. 1. Точные композиции из индивидуальных реагентов, использованных для измерений, были следующие:(4) Белокрастворяющий реагент: Чистая (концентрированная) муравьиная кислота или пропионовая кислота самой высокой степени чистоты.(5) Стабилизирующий реагент: 300 мл глицерина самой высокой аналитической степени чистоты + 700 мл деминерализованной воды + 0.05 г NaN3.(6) Цветной реагент: 8.0 г/л раствора молибдата аммония в деминерализованной воде.(7) Восстанавливающий раствор: 0.20 г SnCl2, растворенного в 100 мл 1 М водного раствора соляной кислоты."Dyalab"(R) с концентрацией 1.61 ммоль/л (для дальнейшего разбавления в 1000 раз). Аналитический реагент: 200 мл компонента (4), смешанного с 200 мл компонента (5) и 100 мл компонента (6). Измерения проводились в следующих случаях: На здоровых индивидуумах и индивидуумах с клинически диагностируемыми опухолями до лечения. Результаты представлены в табл. 2. Для контроля ЦМФ (циклофосфамидметотрексат-5-фторурацил)-терапии пациентов после хирургического удаления опухолей молочной железы. Результаты в табл. 4 и 5. Для контроля метотрексат (агент, являющийся антагонистом фолиевой кислоты)терапии пациентов с остеосаркомой. Результаты представлены в табл. 7. С целью упрощения в табл. 2 и во всех последующих таблицах указаны только символы соответствующих субстратов, однако они всегда имеют отношение к величинам 5'нуклеотидазной активности, измеренным на данных субстратах. Из данных табл. 2 следует, что за исключением лимфомы с метастазами в костях, величины 5'-нуклеотидазной активности, измеренные на шести субстратах, значительно увеличиваются у пациентов, страдающих от засвидетельствованных злокачественных опухолей, по сравнению с величинами, полученными от здоровых пациентов. Суммарные значения 5'нуклеотидазной активности (5'-ND) показали наиболее выраженное увеличение для опухолей легкого и/или лимфом с метастазами в печени. Увеличение активности щелочной фосфатазы,по сравнению с изменением 5'-нуклеотидазной активности, было наиболее выраженным для лимфом с метастазами в костях. Как следует из табл. 3, можно найти строгую корреляцию между величинами 5'нуклеотидазной активности, имеющими отношение к отдельным субстратам, а также между активностью, измеренной на 5'-АМР, и активностью, измеренной на -глицерофосфате, которая указывает на неспецифическую фосфатазную активность, как для пациентов, страдающих от засвидетельствованных злокачественных опухолей до лечения, так и для здоровых пациентов. Таблица 3 хирургическому иссечению опухоли молочной железы и последующей химиотерапии, представлены в табл. 4 и 5. Табл. 4 суммирует данные успешных случаев, в то время как табл. 5 суммирует данные случаев, резистентных к ЦМФ-терапии. Данные, полученные после изменения терапии, также представлены в табл. 5. При изменении терапии пациенты подвергались Цис-платиновой терапии, и 5'-нуклеотидазные активности измеряли через 1 день после первой обработкии через 1 день после окончания терапии . Во всех других случаях измерения проводили через 24 ч после фактической химиотерапевтической обработки. Для сравнения также представлены величины, измеренные на здоровых пациентах. Таблица 4 Результаты измерений, использованные для контроля терапии пациентов, подвергнутых Из этих данных могут быть сделаны следующие выводы: 5'-нуклеотидазная активность,измеренная на 5'-СМР, 5'-GMP, 5'-IMP и 5'-ТМР субстратах, существенно уменьшилась уже после первой серии ЦМФ-обработок. После третьей серии ЦМФ-обработок значительно большее уменьшение можно было наблюдать в 5'нуклеотидазной активности, измеренной на 5'АМР, 5'-GMP и 5'-IMP субстратах. После шестой серии ЦМФ-обработок значительные уменьшения наблюдались в 5'-нуклеотидазной активности, измеренной на 5'-АМР, 5'-СМР, 5'GMP и 5'-IMP субстратах. Для лекарственных комбинаций воздействие, приложенное на точку атаки, трудно определить, благодаря различным точкам приложения отдельных компонентов. Таким образом, в таких примерах сравнение состояния до лечения служит в качестве руководства. Измеренные данные демонстрируют,что примененная лекарственная комбинация оказывает свое терапевтическое воздействие в двух фазах, через последствия, оказывающие влияние на пуриновый и пиримидиновый метаболизмы. Таблица 5 После неэффективной ЦМФ-терапии незначительные изменения можно было наблюдать в 5'-нуклеотидазной активности, измеренной на отдельных субстратах, поэтому продолжали терапию с использованием Цис-платина. На основании результатов авторы изобретения показали, что значительные изменения в 5'нуклеотидазной активности, имеющие отношение к индивидуальным субстратам, наблюдались уже на первом этапе обработки Цисплатином (через 24 ч после обработки; обозначенов таблице); существенное уменьшение можно было наблюдать прежде всего на субстратах, участвующих в метаболизме пуринов. Значения, измеренные в первый день после окончания лечения Цис-платином (обозначено в таблице), указывают на то, что изменения в пуриновом метаболизме по времени следуют за изменениями в пиримидиновом метаболизме, со следующим примечанием, что эти изменения в двух метаболических процессах накладываются одно на другое. Исследования авторов обнаружили неэффективность ЦМФ-терапии уже за 5 дней до измерения с помощью диагностического опухолевого маркера СА 15-3 (который также указал на неэффективность), таким образом,пациенты могли быть избавлены от 5-тидневного излишнего лечения ЦМФ. Успех и эффективность терапии также отражены тем фактом, что первоначальная строгая корреляция между величинами 5'-нуклеотидазной активности, измеренными на различных субстратах, изменяется. Величины корре 14 ляции, рассчитанные после успешной терапии,представлены в табл. 6 ниже, в которой для сравнения также представлены значения до терапии. Таблица 6 Данные табл. 6 показывают, что первоначальная строгая корреляция между 5'нуклеотидазными активностями, измеренными на различных субстратах, отсутствует, что также отражает тот факт, что измерения на различных субстратах дают возможность отдельно определять и оценивать отдельные биологические процессы, протекающие во время терапии. Определение 5'-нуклеотидазной активности на шести вышеуказанных субстратах предоставляет незаменимую часть информации в тех случаях, когда химиотерапия не оказывает прямого влияния на нуклеотидный метаболизм. Хорошим примером подобной ситуации является лечение метотрексатом пациентов с остеосаркомой. Метотрексат представляет собой вещество с антагонистическим воздействием на фолиевую кислоту, он оказывает непрямое воздействие на нуклеотидный метаболизм. Таким образом, каждое изменение в нуклеотидном метаболизме, которое имеет место при лечении метотрексатом, указывает на синтез нуклеотидов de novo, то есть на повреждение здоровых клеток. Любые повреждения, имеющие место в данном случае после лечения, практически всегда имеют серьезные последствия; таким последствием может быть, например, снижение клеточного и гуморального иммунитета, что может индуцировать также образование вторичной опухоли. Изменения в 5'-нуклеотидазной активности, измеренные на остеосаркомных пациентах,обработанных 12.0 г дозами метотрексата, просуммированы в табл. 7. Из данных, представленных в табл. 7,можно сделать следующие выводы. Результаты определения 5'-нуклеотидазной активности, полученные на шести субстратах,использованных для проверки изменений в пиримидином и пуриновом метаболизме, показывают, что на первом этапе лечение оказывает воздействие на пиримидиновый метаболизм. Различия между двумя метаболическими путями особенно выражены спустя 44 ч после лече 15 ния. Из табл. 7 также следует, что значительные различия могут наблюдаться между отдельными субстратами даже в пределах одного и того же метаболического пути. Этот феномен выражен благодаря различиям между биохимическими функциями отдельных субстратов. При контроле терапии согласно способу изобретения можно прекратить или изменить терапию до появления нарушений, которые могут привести к более серьезным изменениями и, следовательно,к более серьезным последствиям. Таблица 7 Хотя вышеописанный способ и набор реагентов согласно настоящему изобретению раскрыты для диагностического применения, объем изобретения не ограничивается таким применением. Способ и набор реагентов могут быть использованы с превосходными результатами для исследовательских целей, например для определения механизмов некоторых злокачественных процессов, для тестирования известных или новых противоопухолевых агентов и для исследования механизма их воздействия. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ диагностики наличия злокачественной опухоли и/или контроля результатов терапии, примененной для ее лечения, путем определения 5'-нуклеотидазной активности, в соответствии с которым биологический образец инкубируют способом и при условиях, известных per se, с нуклеотидпентозомонофосфатом в качестве субстрата, высвобожденный неорганический фосфат превращают в окрашенный комплекс путем его обработки молибдатом аммония и восстанавливающим агентом, интенсив 16 ность цвета измеряют известным способом, и на основании измеренной величины активности 5'нуклеотидазы или количества неорганического фосфата, высвобожденного за единицу времени,рассчитывают величину, пропорциональную активности 5'-нуклеотидазы, с помощью известных вычислений и/или с помощью калибровочной кривой, отличающийся тем, что в качестве нуклеотидпентозомонофосфатов используют 5'АМР, 5'-СМР, 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-IMP и 5'-ТМР,измерения выполняют на всех шести субстратах и полученные результаты сравнивают друг с другом и с контрольными величинами. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологический образец инкубируют с субстратом в буфере, при необходимости, в присутствии ингибитора, а затем, кроме молибдата аммония и восстанавливающего агента, добавляют в инкубационную смесь также белокрастворяющий реагент и стабилизирующий агент. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем,что нуклеотидпентозомонофосфатные субстраты используют в виде водных растворов с концентрацией 1-10 ммоль/л. 4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем,что в качестве биологического образца используют цельную кровь, сыворотку или гемолизат и инкубацию с субстратом осуществляют как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора щелочной фосфатазы. 5. Набор реагентов для осуществления способа по пп.1-4, содержащий 5'-АМР, 5'-СМР, 5'UMP, 5'-GMP, 5'-IМР и 5'-ТМР в качестве субстратов вместе со стандартными компонентами набора реагентов, применяемого для определения 5'-нуклеотидазной активности через образование неорганического фосфата, превращение полученного фосфата в окрашенный комплекс и измерение интенсивности цвета с помощью фотометрии. 6. Набор реагентов по п.5, дополнительно содержащий в качестве стандартных компонентов буфер, белокрастворяющий реагент, стабилизирующий реагент, цветной реагент, стандартный раствор, содержащий трехвалентный фосфор, и, при необходимости, ингибитор и/или другой субстрат, не являющийся нуклеотидпентозомонофосфатом.

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/42

Метки: способ, реагентов, 5'-нуклеотидазы, набор, активности, определения

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/9-5164-sposob-i-nabor-reagentov-dlya-opredeleniya-aktivnosti-5-nukleotidazy.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ и набор реагентов для определения активности 5′-нуклеотидазы</a>

Похожие патенты