Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа a/h5n1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЦЕЛЬНОВИРИОННОЙ СОРБИРОВАННОЙ НА ГИДРООКИСИ АЛЮМИНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПАНДЕМИЧЕСКОГО ГРИППА A/H5N1 Изобретение относится к медицинской биотехнологии и представляет собой способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против пандемического гриппа A/H5N1 из рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009, полученного методом обратной генетики в НИИПББ КН МОН РК, для разработки пандемической вакцины. Сущность изобретения заключается в том, что для получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа A/H5N1 применяется оптимальный (щадящий) режим инактивации штамма A/AstanaRG/6:2/2009 формалином в концентрации 0,05%, далее очищается и концентрируется при помощи хроматографических и фильтрационных методов и добавляется адъювант - гидроокись алюминия. Изобретение обеспечивает получение пандемической вакцины для профилактики гриппа A/H5N1 с высокой степенью очистки вируса, и соответственно с улучшенной безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является более технологичным и экономичным.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: РЕСПУБЛИКАНСКОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ НА ПРАВЕ ХОЗЯЙСТВЕННОГО ВЕДЕНИЯ"НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ" КОМИТЕТА НАУКИ МИНИСТЕРСТВА ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН (KZ) Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к способу получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа A/H5N1. Известен способ приготовления вакцины инактивированной цельновирионной вакцины против пандемического гриппа A/H5N1 [United States Patent Application Publication, Pub. number: US 2009/0060950 Al, Baxter International Inc. "Method for Production Viral Vaccines"]. В соответствии с данным способом два диких штамма A/Vietnaml203/2004 и A/Indonesia/05/2005 культивируются в перевиваемой культуре клеток Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки). Накопленный вирусный материал подвергается инактивации, сначала посредством обработки формалином (в конечной концентрации 0,92 г/л при температуре 322 С в течение 24 ч) для обезвреживания внеклеточного вируса, а затем ультрафиолетового облучения (20 циклов со скоростью 240 л с помощью установки VIDECO VISA с мощностью ультрафиолетовых ламп 110 В), так как в питательной среде культуры клеток Vero имеется много органических компонентов, способных адсорбировать ультрафиолетовые сигналы. Инактивированный вирусный материал далее очищается и концентрируется с помощью изопикнического проточного центрифугирования в линейном градиенте сахарозы (на лабораторной центрифуге RK-6, 35000 об/мин). Полученный при этом пиковый пул вируса для недопущения агрегирования вирусных частиц трижды обрабатывается под высоким давлением (800 бар) на гомогенизаторе NS 1001L Panda (Ni-ro Soavi S.p.A.). После чего для разрушения клеточной ДНК к гомогенизированной суспензии добавляется бензоназа (нуклеаза) в конечной концентрации 3 ед./мл. Полученная смесь под давлением фильтруется через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и инкубируется при 32 С в течение ночи. После окончания времени инкубации суспензия подвергается ультрафильтрации (30 кд, фильтрационная площадь 0,1 м 2) и последующей диафильтрации против 10-ти объемов трис-буфера. Далее снова проводится инактивация вируса формальдегидом в конечной концентрации 0,025% при комнатной температуре в течение 24 ч. Остаточное содержание формальдегида также удаляется посредством ультрафильтрации (мембраны с диаметром пор 30 кд) и диафильтрации против 5-ти объемов трис-буфера. Далее проводится микрофильтрация материала через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, при этом вирусный материал предварительно обрабатывается под высоким давлением (800 бар) на гомогенизаторе NS 1001LPanda для уменьшения потери вируса. Полученный таким образом моновалентный полуфабрикат гриппозной вакцины содержит в среднем 74,6 мкг/мл вирусного гемагглютинина (выход 38%), протеины культуры клеток Vero - 4,7 мкг/мл(уменьшение на 75%), общий белок - 385 мкг/мл (уменьшилось на 50%), клеточное ДНК - 0,27 мкг. Клинические испытания (III-фаза) данной вакцины на волонтерах в возрасте от 18 до 60 лет показали ее эффективность в режиме двукратной вакцинации с препаратом, содержащим гемагглютинин 7,5 мкг/доза. При этом процент сероконверсии на 42 сутки после вакцинации составил 73% [Ehrlich H.J.,Muller M., Oh H.M., Tambyah P.A., Joukhadar С., Montomoli E., Fisher D., Berezuk G., Fritsch S., Low Baselli A., Vartian N., Bobrovsky R., Pavlova B.G., Pollabauer E.M., Kistner O., Barrett P.N.; Baxter H5N1 Pandemic Influenza Vaccine Clinical Study Team. A clinical trial of a whole-virus H5N1 vaccine derived from cellculture. N Engl J Med. 2008 Jun 12; 358(24):2573-84]. Необходимо отметить, что данный способ получения вакцины инактивированной цельновирионной вакцины против пандемического гриппа A/H5N1 с успехом применяется компанией Baxter InternationalInc. (США), однако следует отметить, что вследствие использования в качестве субстрата для культивирования вирусов гриппа перевиваемой культуры клеток Vero, которая может содержать в себе онкогенные факторы, технологический процесс получения препарата, а именно этап очистки вируса по сравнению с технологиями, основанными на куриных эмбрионах, значительно усложнен. Более того, в процессе производства вирусный материал трижды подвергается этапу инактивации с помощью как химических, так и физических факторов, что безусловно сказывается на иммуногенности конечного препарата. Следует также отметить, что значительной проблемой для производителя является то, что все штаммы,рекомендуемые ВОЗ для производства пандемических гриппозных вакцин, не адаптированы к культурам клеток, вследствие чего выход вируса незначительный. Данное обстоятельство побуждает производителя накапливать непомерно большие объемы вирусного материала. В целом, процесс получения данной вакцины по вышеуказанному способу в технологическом отношении сложен и к тому же весьма дорогостоящий, поскольку для ее производства используются дикие штаммы, требующие обеспечение высокого уровня биологической безопасности на предприятии. Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа A/H5N1Vaccine Composition"], основанный на использовании куриных эмбрионов в качестве субстрата для культивирования вируса гриппа. Согласно данному способу куриные эмбрионы 9-11-суточного возраста заражаются штаммом A/Vietnam/1194/2004 вируса птичьего гриппа. Инфицированные эмбрионы инкубируются при оптимальной температуре в течение 48-96 ч. По истечении срока инкубации куриные эмбрионы подвергаются умерщвлению путем охлаждения при температуре 2-8 С в течение 12-60 ч и ис-1 023361 пользуют для сбора аллантоисной жидкости. Очистку вирусной суспензии от куриных белков проводят с помощью последующих технологических операций: осветление путем низкоскоростного центрифугирования (4000-14000 g); адсорбция путем добавления в осветленную суспензию геля CaHPO4, содержащего 0,5 моль/лNa2HPO4 и 0,5 моль/л CaCl2 в конечной концентрации, из расчета от 1,5 до 3,5 г на литр вирусного материала. После 8-часового осаждения сливается надосадочная жидкость, а осадок, содержащий вирусы гриппа, ресуспендируют 0,26 моль/л раствором ED-TA-Na2 в зависимости от содержания СаНРО 4; фильтрация ресуспендированного осадка через фильтры с диаметром пор 6 мкм; изопикническое проточное центрифугирование вирусного концентрата в линейном градиенте сахарозы (0,55%), содержащем 100 мкг/мл тиомерсала - 8-15 л в час. К концу центрифугирования содержание ротора с помощью рефрактометра делится на четыре фракции: 1) 55-52% сахарозы; 2) 52-38% сахарозы; 3) 38-20% сахарозы; 4) 20-0% сахарозы. Для приготовления вакцины используются фракции 2 и 3. Фракция 3 для снижения концентрации сахарозы до 6% промывается буферным раствором с помощью диафильтрации. После чего фракции 2 и 3 собираются в один пул, разводятся буферным раствором до получения конечного объема 40 л. Полученный продукт называется "моновалентный цельновирионный вирусный концентрат". Центрифугирование в градиенте сахарозы с диоксихолатом натрия. Полученный материал снова подвергается проточному центрифугированию в линейном градиенте сахарозы (0,55%), содержащем 0,7-1,5% натрия диоксихолата - 8-15 л в час. Центрифугирование проводится на ультрацентрифуге ENI-Mark II (ротор К 3). К концу центрифугирования содержание ротора делят на три фракции, при этом фракцию 2 (47-18%) используют для дальнейшей работы. Стерильная фильтрация. Материал с расщепленным вирусом фильтруется через мембранные фильтры с диметром пор 0,2 мкм. Перед фильтрованием материал разводится 5-кратно буферным раствором. Инактивация вируса. Фильтрованный моновалентный материал инкубируется при температуре 222 С в течение 84 ч. Для снижения концентрации общего белка в материале до 250 мкг/мл (максимум) он разводится с фосфатным буфером. Далее в суспензию вносят формальдегид в конечной концентрации 50 мкг/мл, смесь инкубируют при температуре 202 С в течение 72 ч. Ультрафильтрация. Инактивированный расщепленный вирусный материал концентрируется не менее чем 2 раза на ультрафильтрационной установке с целлюлозно-ацетатными мембранами (20 кД MWCO), а затем промывается фосфатно-солевым буфером. Заключительная стерилизующая фильтрация. Материал после ультрафильтрации фильтруется через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. После чего фильтры промываются фосфатно-солевым буферным раствором. Концентрация общего белка в фильтрованном материале не должна превышать 500 мкг/мл. Конечный моновалентный полуфабрикат вакцины хранится при температуре 2-8 С в течение 18 месяцев. Для приготовления готового препарата расщепленный моновалентный полуфабрикат вакцины объединяется в соотношении 1:1 с адъювантом А 1(ОН)3 на буферном растворе [дистиллированная вода - 0,8 л, NaCl - 7,699 г, KC1 - 0,2 г, MgCl26H2O - 0.1 г, Na2HPO412 Н 2 О - 2.6 г, КН 2 РО 4 - 0.373 г] и сорбируется в соответствии с оптимальным режимом. Полученный таким образом готовый препарат вакцины соответствует следующей спецификации: общий белок 600 мкг/100 мкг НА; овальбумин 2 мкг/100 мкг НА; сахароза 0,4 мг/100 мкг НА; эндотоксин 200 МЕ/100 мкг НА; А 1(ОН)3 - 0,38 мг/мл; живой вирус отсутствует; стерильна. Оценка иммуногенной активности (II-фаза клинических испытаний) данной вакцины на волонтерах в возрасте от 18 до 16 лет при двукратном введении показала, что в группе привитых вакциной в дозе 3,8,7,5, 15,0, 27 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 67, 63, 71, 90% соответственно; кратность прироста титров антител составила 10,5, 9,1, 12,4, 32,4; уровень серопротекции - 69, 63, 71,90% соответственно [Leroux-Roels I., Bernhard R., Gerard P., Drame M., Hanon E., et al. (2008) Broad Clade 2 Cross-Reactive Immunity Induced by an Adjuvanted Clade 1 rH5Nl Pandemic Influenza Vaccine. PLoS ONE 3(2): el665. doi:10.1371/journal.pone.0001665]. Следует отметить, что данный способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа A/H5N1 налажен на производственных предприятиях компанииSmithKline Beecham Pharma GmbHCo KG (Нидерланды) и позволяет получать продукцию, полностью отвечающую требованиям Европейской фармакопеи. Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что технологический процесс производства, а именно этап очистки и концентрирования вируса основан на зональной центрифужной технологии, требующей дорогостоящего оборудования и не менее дешевого обслуживания. Данное обстоятельство является значительным барьером в использовании данной технологии в странах со слаборазвитой экономикой, но не менее остро нуждающихся в качественных противогриппозных вакцинах. Сущность изобретения состоит в том, что применяется оптимальный режим инактивации формалином в концентрации 0,05%, проводимой до этапа хроматографической очистки и концентрирования с помощью последовательных технологических операций микрофильтрации, ультра/диафильтрации и гельфильтрации, стерилизующей фильтрации с использованием нового рекомбинантного штаммаA/AstanaRG/6:2/2009, полученного методом обратной генетики в НИИПББ КН МОН РК, что обеспечивает получение антигена с высокой степенью очистки с минимальным содержанием остаточного формалина в препарате для повышения безопасности и иммуногенности приготовляемой пандемической вакцины, полностью соответствующей требованиям Государственной фармакопеи Республики Казахстан и Европейской фармакопеи. В основу настоящего изобретения положена задача повышения технологичности процесса получения вакцины, расширения технологических возможностей за счет использования более щадящего метода инактивации, повышения производительности метода очистки и концентрирования, повышения безопасности и иммуногенности полученной таким способом вакцины. Техническим результатом предложенного способа является получение пандемической вакцины для профилактики птичьего гриппа A/H5N1 с высокой степенью очистки вируса и соответственно с улучшенной безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является более технологичным и экономичным. Технический результат достигается за счет а) наработки вируссодержащей суспензии с использованием рекомбинантного штаммаA/AstanaRG/6:2/2009, полученного в НИИПББ КН МОН РК методом обратной генетики из эпизоотического вируса A/chicken/Astana/6/05 (H5N1) и высокорепродуктивного штамма A/PR/8/34 (H1N1). Вакцинный штамм депонирован в коллекции микроорганизмов НИИПББ КН МОН РК подM-12-09/D от 19.10.09 г. и имеет паспорт международного образца, позволяющий его использовать для приготовления пандемической вакцины против гриппа A/H5N1,б) применения оптимального режима формалиновой инактивации, который осуще ствляется до этапа очистки вируса. Такой метод инактивации вируса с последующей очисткой обеспечивает минимальное содержание остаточного формалина в вакцине,в) комбинированного метода очистки с сочетанием хроматографической очистки и концентрирования и ультрафильтрацией в тангенциальном потоке с последующей стерилизующей фильтрацией, позволяющей получить антигены вируса с высокой степенью очистки. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения. Далее описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Представленные ниже варианты осуществления описаны в интересах лучшего понимания изобретения, и понятно,что объем настоящего изобретения не ограничивается следующим описанием. Поэтому очевидно, что специалисты в данной области могут модифицировать любой способ осуществления, который целесообразен в пределах объема настоящего изобретения, при рассмотрении представленного здесь описания. Способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против пандемического гриппа A/H5N1 заключается в том, что рекомбинантный вирус A/AstanaRG/6:2/2009 культивируют в развивающихся куриных эмбрионах, наработанную вирусную суспензию осветляют (например, через фильтры), инактивируют формалином в конечной концентрации 0,05% вначале при 371 С в течение 24 ч, далее при 51 С в течение 48 ч, соблюдая режим постоянного перемешивания. Очистку и концентрирование инактивированной вирусной суспензии проводят поэтапно, вначале осветляют путем фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 2,0/1,2 мкм, после чего подвергаются процессу очистки и концентрирования посредством комплексного метода, включающего ультрафильтрацию/диафильтрацию (20-30-кратное концентрирование, кассеты 300 кД, диализ против 10-ти объемов 1 М NaCl в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,3) и гельфильтрацию (сефароза CL-6B). Далее очищенный вирусный концентрат в цельном или разведенном до вакцинных параметров виде, объединяют в асептических условиях с рабочим раствором гидроокиси алюминия (содержание ионов А 1+3 1,0 мг/мл) в соотношении 1:1, перемешивают гомогенизатором при 3000 об/мин. Для повышения степени сорбции антигена на гидроокиси алюминия полученную смесь оставляют на 24 ч с постоянным перемешиванием(60-80 об/мин) при температуре 2-8 С. Показатель полноты сорбции антигена на гидроокиси алюминия при соблюдении вышеуказанного режима составления превышает 90%. После окончания срока инкубации смесь фасуют во флаконы нужного объема и контролируют качество на соответствие нормативному документу. Анализ полученных соединений и их специфических свойств осуществляли с использованием электронной микроскопии, что позволило оценить наличие взвеси вирионов в достаточно высокой концентрации, структурно-морфологическую характеристику и степень очистки вакцинного препарата, показать хорошую дисперсность вакцины - вирусные частицы не образуют агрегатов. Доля целых (неразрушенных) частиц составляет более 95%, что свидетельствует о сохранности вирионов. В вакцине нативная антигенная структура вирусных частиц сохраняется. Инактивированная сорбированная на гидроокиси алюминия вакцина из рекомбинантного штаммаA/AstanaRG/6:2/2009 является жидкой формой и предназначена для парентерального введения (внутримышечно или подкожно). Вводимое количество зависит от подвергаемого профилактике субъекта, в том числе, например, от способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, и если необходимо, продуцировать клеточно-опосредованный иммунный ответ. Оценка безопасности и иммуногенности вакцины проводилась путем исследования реакции иммунной системы и организма в целом на лабораторных животных и волонтерах. Изобретение выполнимо в условиях научно-производственных объединений при наличии рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа, соответствующего технологического оборудования и соблюдении предлагаемого режима приготовления вакцины. Эффективность и воспроизводимость предлагаемого способа получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против пандемического гриппа A/H5N1 из рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа подтверждена при приготовлении трех экспериментальных серий препарата в НИИПББ КН МОН РК, соответственно составлен и утвержден в установленном порядке отчет о валидации технологического процесса изготовления вакцины (торговое название Kazfluvac A/H5N1) - гриппозной аллантоисной цельновирионной адсорбированной инактивированной. На базе Национального центра экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники МЗ РК г.Алматы, НИИ гриппа СЗО РАМН г.Санкт-Петербург, Института токсикологии ФМБА г.Санкт-Петербург, Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича г.Москва, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии г.Санкт-Петербург успешно проведены доклинические испытания безопасности и специфической активности экспериментальных серий вакцины Kazfluvac. Положительные результаты доклинических исследований вакцины Kazfluvac позволили в дальнейшем провести I и II фазы клинических испытаний безопасности и иммуногенности на добровольцах в возрасте от 18 до 60 лет. Испытания были проведены на клинической базе НИИ гриппа СЗО РАМН и НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. Результаты клинических испытаний показали, что препарат обладает выраженной иммуногенностью, соответствующей европейским требованиям СРМР ЕМЕА и критериям Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека МУ 3.33.1758-03, предъявляемым к инактивированным гриппозным вакцинам, а также хорошей переносимостью, низкой реактогенностью и безопасностью. Вакцина Kazfluvac получила положительную оценку Национального Консультативного Комитета по иммунизации РК, что послужило основанием для ее регистрации и использования в широкой противоэпидемиологической практике. Примеры использования предложенного способа. Далее настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры, при этом примеры приведены лишь для иллюстрации и не имеют в виду ограничение объема иллюстрации. Предполагаются изменения формы и замена элементов на эквиваленты, когда обстоятельства могут предполагать или увеличивать целесообразность. Хотя здесь были использованы специфические термины, они были использованы для целей описания, но не для целей ограничения изобретения. Пример 1. Получение вакцины. Рекомбинантный вирус A/AstanaRG/6:2/2009 культивировали в 10-11 суточных куриных эмбрионах при температуре 331 С в течение 72 ч, наработанную вирусную суспензию осветляли через предварительные фильтры, инактивировали формалином в конечной концентрации 0,05% вначале при 371 С в течение 24 ч, далее при 51 С в течение 48 ч, соблюдая режим постоянного перемешивания. Очистку и концентрирование инактивированной вирусной суспензии проводили поэтапно, вначале осветляли через мембранные фильтры с диаметром пор 2,0/1,2 мкм, далее концентрировали на ультрафильтрационной установке Millipore Pelliconcassette system (20-30-кратное концентри рование, кассеты 300 кД, диализ против 10-ти объемов 1 М NaCl в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,3) с диафильтрацией. Полученный вирусный концентрат дополнительно очищали с помощью гельфильтрации на колонках с сефарозой CL-6B и стерилизовали через каскад мембранных фильтров. Далее очищенный вирусный концентрат в цельном или разведенном до вакцинных параметров виде объединяли в асептических условиях с рабочим раствором гидроокиси алюминия (содержание ионов А 1+3 1 мг/мл) в соотношении 1:1, перемешивали в течение 3 мин при 3000 об/мин гомогенизатором Т 25 basic UL-TRA-TURRAX, IKA (Германия). Полученную смесь инкубировали в течение 24 ч при постоянном перемешивании (60-80 об/мин) с помощью спиннера"Techne" (Франция). После окончания срока инкубации смесь фасовали во флаконы. Пример 2. Готовая форма лекарственного препарата. Вакцинный препарат Kazfluvac является жидкой формой и предназначен для внутримышечного введения. Состав вакцинного препарата Kazfluvac приведен в табл. Таблица Состав вакцинного препарата Kazfluvac Препарат выпускают по 2,5 мл (5 доз) во флаконах из нейтрального стекла марки с герметически укупоренными резиновыми пробками и обкатанными металлическими колпачками. Флаконы помещают по 10 штук в коробки из картона коробочного или укладывают непосредственно в групповую коробку или в ящик фанерный посылочный. Пример 3. Результаты контроля качества экспериментальной серии вакцины Kazfluvac. Описание: прозрачная жидкость с рыхлым осадком. После встряхивания в течение 1-2 мин образовывается гомогенная суспензия беловато-серого цвета. Идентификация: отмечается задержка гемагглютинации в реакции с типоспецифической сывороткой и отсутствует задержка гемагглютинации с сыворотками других типов и подтипов вируса гриппа в РТГА. Извлекаемый объем: 2,5 мл рН 7,1 Стерильность: стерильна Бактериальные эндотоксины: менее 200 МЕ/мл Специфическая активность: весовое содержание гемагглютинина 14,4 мкг/мл Овальбумин: 0,3 мкг/доза Тиомерсал: 99 мкг/мл Алюминий (А 1+3): 0,49 мг/мл Формальдегид: менее 0,2 мг/мл Специфическая безопасность: живой вирус отсутствует Пример 4. Доклиническое изучение безопасности и специфической активности вакцины. Доклиническое изучение безопасности, иммуногенной активности и протективного действия вакцины Kazfluvac проводилось на базе РГП на ПХВ "Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники" МЗ РК, Научно-исследовательского института гриппа СЗО РАМН (Россия), Института токсикологии ФМБА (Россия), Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича (Россия), Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (Россия). При этом препарат оценивался по следующим параметрам: острая токсичность; подострая токсичность (влияние вакцины на массу тела, потребление корма и воды, на ректальную температуру, двигательную и исследовательскую активность, сердечно-сосудистую деятельность, морфологические показатели периферической крови, биохимические показатели крови белых крыс); аллергенность (реакция общей анафилаксии, реакция непрямой дегрануляции тучных клеток, реакция иммунных комплексов, конъюнктивальная проба на морских свинках); влияние на иммунную систему (определение фагоцитарной активности макрофагов, определение титра гемагглютининов в сыворотке крови мышей, определение влияния вакцины на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа на мышах, определение числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей); пирогенность (температурная реакция кроликов на введение полуфабриката вакцины, определение бактериальных эндотоксинов); иммуногенность и протективное действие вакцины. По результатам доклинического изучения безопасности, иммуногенной активности и протективного действия иммунобиологического препарата Kazfluvac можно сделать следующие выводы: состояние животных после острого введения вакцины свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности вакцин в дозах, превышающих прививочную дозу для человека в десятки раз. Результаты токсикометрии: данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а также данные некропсии позволяют отнести вакцину Kazfluvac к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ; применение вакцин внутримышечно в двукратной прививочной дозе у крыс не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности вакцины Kazfluvac; при внутримышечном введении вакцинного препарата в исследованных дозах ни у одного живот-5 023361 ного не были выявлены признаки даже умеренного шока. Показано отсутствие аллергенных свойств в непрямой реакции дегрануляции тучных клеток, в реакции иммунных комплексов и в конъюнктивальной пробе на морских свинках. Эти данные позволяют заключить, что вакцина Kazfluvac не обладает аллергенными свойствами; проведенные экспериментальные доклинические исследования пирогенности полуфабриката вакцины Kazfluvac показали, чтовведение препарата не оказывает пирогенного действия на организм теплокровных лабораторных животных; проведенный анализ по определению содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛреактива показал, что концентрация бактериальных эндотоксинов в полуфабрикате вакцины Kazfluvac соответствует 150 ЕЭ/мл (5 ЕЭ/мкг), что в 4 раза меньше расчетного предельного содержания бактериальных эндотоксинов (20 ЕЭ/мкг). При пересчете на вводимую дозу исследуемой вакцины 0,5 мл с содержанием гемагглютинина 15 мкг концентрация бактериальных эндотоксинов составит 36 ЕЭ/0,5 мл(1,2 ЕЭ/мкг); все испытанные экспериментальные серии вакцины Kazfluvac после двукратного внутрибрюшинного введения беспородным мышам в дозах 2,5, 5 и 10 мкг ГА на мышь индуцировали выработку антигемагглютинирующих антител в диапазоне от 1:20 до 1:640. Среднегеометрический уровень антител имел дозозависимый характер и зависел от наличия адъюванта в составе вакцинного препарата. Между показателями титров антител, сформировавшихся в результате иммунизации мышей вакциной с антигенной нагрузкой 10, 5 и 2,5 мкг/мышь, достоверные различия выявлены не были (Р 0,05). Исследованный вакцинный препарат Kazfluvac обладал высокой степенью протективной активности, предупреждая при контрольном заражении развитие клинических признаков заболевания, генерализацию инфекционного процесса и гибель привитых животных. Пример 5. Рандомизированное слепое плацебо-контролируемое исследование I фазы по двукратному с увеличением дозы применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Kazfluvac) у добровольцев в возрасте 18-60 лет. Было проведено рандомизированное слепое плацебо-контролируемое исследование I фазы по двукратному с увеличением дозы применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Kazfluvac) у добровольцев в возрасте 18-60 лет. Вакцинация добровольцев препаратомKazfluvac осуществлялась в режиме двух уровней доз (содержание гемагглютинина 7,5 мкг и 15 мкг в дозе). Всего в исследование было включено 34 здоровых добровольца (12 человек для вакцинации вакциной в дозе 7,5 мкг НА, 11 человек - вакциной в дозе 15 мкг НА/дозу), которые методом случайной выборки (метод рандомизации) были распределены в соотношении 2:1 на получающих вакцину или плацебо (11 человек). Общая продолжительность участия каждого добровольца в исследовании составила 423 дня. Исследование включало стадию скрининга, 1 визит исходного уровня (первая вакцинация), визиты 2-7 (наблюдение за добровольцами в течение 6 дней после первой вакцинации), визит 8 (вторая вакцинация),визиты 9-14 (наблюдение за добровольцами в течение 6 дней после второй вакцинации) и окончательный 15 визит на 42-й день исследования. Промежуток между скрининговым визитом и визитом исходного уровня составил не более 14 дней, между исходным визитом и окончательным визитом - 423 дня. Результаты - выводы. Безопасность вакцины. В ходе исследования серьезных нежелательных явлений и нежелательных явлений сильной и средней степени выраженности отмечено не было. У добровольцев, привитых вакциной Kazfluvac в дозе 7,5 и 15 мкг НА, нежелательные явления,связанные с вакцинацией, были представлены местными побочными реакциями слабой степени выраженности (в 95% случаев - боль в месте инъекции), имели транзиторный характер (до 3-х дней) и исчезали без применения лекарственных средств. Среди добровольцев, привитых вакциной Kazfluvac в дозе 15 мкг НА, была отмечена не требующая применения лекарственных средств одна системная реакция слабой степени выраженности. Наблюдались дозозависимые различия по частоте возникновения местных поствакцинальных реакций; существенных различий по частоте возникновения НА после первой и после второй вакцинаций отмечено не было. Отклонений результатов клинико-лабораторных обследований добровольцев на 7-й, 21-й, 28-й и 42 й дни исследования от первоначальных показателей зарегистрировано не было вне зависимости от дозы вакцины. Иммуногенная активность вакцины. Оценка иммуногенной активности вакцины Kazfluvac при однократном введении по данным РТГА (с лошадиными эритроцитами и обработкой сывороток RDE) через 21 день после вакцинации показала, что в группе привитых вакциной Kazfluvac в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 66,7%; кратность прироста титров антител составила 3,4; уровень серопротекции 16,7%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа A/H5N1 - 16,8. После двух вакцина-6 023361 ций в группе привитых вакциной Kazfluvac в дозе 7,5 мкг НА было отмечено увеличение всех показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность прироста титров антител достигли 28,0 и 5,7 соответственно; уровень серопротекции достиг 66,7%, доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 75%. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) после первой вакцинации доля лиц с 4 кратными сероконверсиями составила 90,9%; кратность прироста титров антител составила 8,0; уровень серопротекции -72,7%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа A/H5N1 - 40,0. После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Kazfluvac в дозе 15 мкг НА также было отмечено увеличение большинства показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность прироста титров антител достигли 54,4 и 10,9 соответственно; уровень серопротекции достиг 90,9%, доля лиц с 4 кратными сероконверсиями составила 90,9%. Оценка иммуногенной активности вакцины по данным РМН показала, что через 21 день после вакцинации в группе привитых вакциной Kazfluvac в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 50%; кратность прироста титров антител составила 4,2; уровень серопротекции - 25%,среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа A/H5N1 - 25,2. После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Kazfluvac в дозе 7,5 мкг НА СГТ и кратность прироста титров антител достигли 53,4 и 9,0 соответственно; уровень серопротекции составил 50%, доля лиц с 4-кратными сероконверсиями достигла 100%. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) после первой вакцинации доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 72,7%; кратность прироста титров антител составила 9,1; уровень серопротекции - 54,5%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппаA/H5N1 - 54,8. После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Kazfluvac в дозе 15 мкг НА также было отмечено увеличение всех показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность при роста титров антител достигли 117,6 и 18,7 соответственно; уровень серопротекции достиг 90,9%, доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 100%. Заключение. Изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины Kazfluvac в дозах 7,5 мкг и 15 мкг НА при одно- и двукратной внутримышечной иммунизации добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет свидетельствует о хорошей переносимости, низкой реактогенности и безопасности вакцины. Показана выраженная иммуногенная активность вакцины в обеих дозах в отношении вируса гриппа A/H5N1 при одно- и двукратном введении. Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение II фазы клинических исследований вакцины Kazfluvac с целью выбора оптимальной дозы препарата (7,5 или 15 мкг гемагглютинина (НА) на 1 человека) при использовании однократной схемы введения вакцины добровольцам в возрасте от 18 до 60 лет. Пример 6. Рандомизированное слепое исследование II фазы по однократному применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Kazfluvac) у добровольцев в возрасте 18-60 лет. Было проведено рандомизированное слепое исследование II фазы по однократному применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Kazfluvac) у добровольцев в возрасте 18-60 лет. В исследование были включены только те добровольцы, у которых по данным РТГА выявлены титры антител 1:10 к подтипу вируса гриппа A/H5N1 и которые по данным ИФА были серонегативны к ВИЧ, гепатиту В и С. Вакцинация добровольцев препаратом Kazfluvac осуществлялась в режиме двух уровней доз (содержание гемагглютинина 7,5 мкг или 15 мкг в дозе). Всего в исследование было включено 80 здоровых добровольцев, которые методом случайной выборки (метод рандомизации) были распределены в соотношении 1:1 (40 человек для вакцинации вакциной в дозе 7,5 мкг НА, 40 человек - вакциной в дозе 15 мкг НА/дозу). Введение вакцины производилось в 1-й день исследования. Активное наблюдение за добровольцами проводилось в течение 7 дней после вакцинаций (в день вакцинации и в последующие 6 дней). В дальнейшем, начиная от 7-го (вечер) до 21-го дня исследования (завершение исследования), добровольцы вели дневники самонаблюдения, в которых записывали появление любых симптомов, а также всех принимаемых лекарственных препаратов. Результаты. Реактогенностъ и безопасность. В ходе исследования нежелательных явлений сильной и средней степени выраженности отмечено не было. Местные реакции слабой степени выраженности в виде боли в месте введения вакцины были отмечены в обеих группах у 25 из 80 привитых добровольцев (31%), не сопровождались развитием гиперемии или инфильтратов, имели транзиторный характер (не более 2-х дней) и исчезали без применения лекарственных средств. Различий между группами в частоте возникновения реакций отмечено не было. Системные реакции слабой степени выраженности, не требующие применения лекарственных средств,были отмечены у одного добровольца, привитого вакциной Казфлювак в дозе 7.5 мкг НА, и у двух добровольцев, привитых вакциной в дозе 15 мкг НА. Отклонений результатов клинико-лабораторных обследований добровольцев на 7-й и 21-й дни исследования от первоначальных показателей, включая уровниIgE, зарегистрировано не было вне зависимости от дозы вакцины. Не было выявлено негативного влия-7 023361 ния вакцинации на данные ЭКГ исследования - после вакцинации они оставались на уровне первоначальных значений. Ни в одном случае возникновения нежелательного явления не требовалось проведения дополнительной терапии, ни один из добровольцев не был исключен из исследования в связи с возникновением НЯ. Серьезных нежелательных явлений в ходе исследования отмечено не было. Иммуногенностъ. Оценка иммуногенной активности вакцины Kazfluvac при однократном введении по данным РТГА (с лошадиными эритроцитами и обработкой сывороток RDE) через 21 день после вакцинации показала, что в группе привитых вакциной Kazfluvac в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 55%; кратность прироста титров антител составила 3,4; уровень серопротекции 52,5%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа A/H5N1 - 17,1. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) по данным РТГА наблюдалось увеличение всех изученных показателей: доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 70%; кратность прироста титров антител составила 4,68, уровень серопротекции - 57,5%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа A/H5N1 - 23,4. Результаты, полученные при постановке реакции микронейтрализации (РМН), были сопоставимы с результатами РТГА и показали, что через 21 день после вакцинации в группе привитых вакциной Kazfluvac в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 55%; кратность прироста титров антител составила 4,2; уровень серопротекции - 40%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа A/H5N1 - 24,2. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) по данных РМН наблюдалось увеличение всех изученных показателей иммуногенной активности вакцины: доля лиц с 4 кратными сероконверсиями составила 67,5%; кратность прироста титров антител составила 7,6; уровень серопротекции - 55%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа A/H5N1 - 42,87. Оценка выработки антител по данным реакции микронейтрализации к гетерологичному штамму вируса гриппа A/H5N1 показала, что через 21 день после вакцинации в группе привитых вакцинойKazfluvac в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 35% (14 из 40 человек),а в группе привитых вакциной Kazfluvac в дозе 15 мкг НА - 52,5% (21 из 40 человек). Заключение. Изучение иммуногенной активности, реактогенности и безопасности вакцины Kazfluvac в дозах 7,5 мкг и 15 мкг НА при однократной внутримышечной иммунизации добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет свидетельствует о хорошей переносимости, низкой реактогенности и безопасности вакцины, а также достаточной иммуногенной активности вакцины в отношении вируса гриппа A/H5N1. Полученные результаты позволяют рекомендовать вакцину Kazfluvac в дозе 7.5 мкг НА/дозу для государственной регистрации в качестве профилактического средства защиты населения в возрасте от 18 до 60 лет от гриппа А подтипа в H5N1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против гриппа A/H5N1, включающий культивирование рекомбинантного вируса в куриных эмбрионах, инактивацию осветленной вируссодержащей аллантоисной жидкости формальдегидом, комбинированную схему очистки и концентрирования инактивированного вируса и добавление адъюванта гидроокиси алюминия (А 1+3) в концентрации 0,25 мг/мл, отличающийся тем, что используют рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009, депонированный в коллекции микроорганизмов НИИПББ КН МОН РК под номером M-12-09/D, который инактивируют до очистки формалином в конечной концентрации 0,05% вначале при 371 С в течение 24 ч, далее при 51 С в течение 48 ч, очищают и концентрируют с помощью последовательных технологических операций ультра/диафильтрации в тангенциальном потоке, гельфильтрации и стерилизующей фильтрации через каскад мембранных фильтров.