Линейный ацилазидный пегилирующий агент, способ его получения и способ получения пегилированного интерферона
Номер патента: 23360
Опубликовано: 31.05.2016
Авторы: Маркова Инна Николаевна, Гапонюк Петр Яковлевич, Гапонюк Полина Петровна, Марков Илья Александрович, Маркова Елена Алексеевна
Формула / Реферат
1. Линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I)
где а - целое число от 100 до 1800 и
b - целое число от 1 до 9,
имеющий молекулярную массу от 5 до 80 кДа.
2. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (a1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) w-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2)
где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, при этом продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей
полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4)
образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;
ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения R-OH, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты
который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
эфир фенилаланина
в котором Alk' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30°С в присутствии органического основания, выбранного из группы, состоящей из триэтиламина, N-метилморфолина, в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диоксана, тетрагидрофурана, ацилируют активированным эфиром (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола
и соединение (ab6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
эфир (ab6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100°С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II)
которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и
соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;
при этом в указанных выше формулах (a1), (b1), (ab2)-(ab6) и (II) значения а и b такие, как определено в п.1.
3. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (al) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) w-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2)
где А1k выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, при этом продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона, водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей
полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4)
образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;
ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab5-2)
который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
эфир фенилаланина
в котором Alk' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в среде безводного диметилформамида в присутствии основания, выбранного из триэтиламина, метилдиэтиламина или N-метилморфолина, ацилируют хлорангидридом (ab5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты
и соединение (ab6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
эфир (ab6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100°С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II)
которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и
соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;
при этом в указанных выше формулах (a1), (b1), (ab2)-(ab6) и (II) значения а и b такие, как определено в п.1.
4. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (a1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) w-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2)
где А1k выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, при этом продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей
полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4)
образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;
эфир фенилаланина
в котором Alk' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в атмосфере азота или аргона, в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, диоксана, тетрагидрофурана, ацетонитрила, при температуре от -30 до 30°С в присутствии органического основания, выбранного из группы, состоящей из триэтиламина, N-метилморфолина, в присутствии карбодиимида, выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, ацилируют ПЭГ-карбоновой кислотой (ab4)
и соединение (ab6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
эфир (ab6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100°С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II)
которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и
соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;
при этом в указанных выше формулах (a1), (bl), (ab2)-(ab6) и (II) значения а и b такие, как определено в п.1.
5. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (al) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) w-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2)
где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей
полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4)
и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;
ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения R-OH, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты
который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
фенилаланин в водной или водно-органической среде, которая является смесью органической среды, выбранной из группы, состоящей из ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, с водой в любых соотношениях в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С ацилируют активированным эфиром (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола
и продукт осаждают диэтиловым эфиром, затем соединение (ab6') действием избытка гидразингидрата в водной среде в присутствии водорастворимого карбодиимида (CD), выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, N-циклогексил-N-(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимида, N-циклогексил-N-(4-диметиламиноциклогексил)карбодиимида, превращают в соединение (II)
которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, после чего соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;
при этом в указанных выше формулах (al), (bl), (ab2)-(ab6') и (II) значения а и b такие, как определено в п.1.
6. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (al) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) w-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2)
где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей
полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4)
и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, затем ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab5-2)
который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
фенилаланин в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в водной, водно-органической или в органической среде, где органическая среда выбрана из группы, состоящей из диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, а водно-органическая среда является смесью органической среды с водой в любых соотношениях, в присутствии основания, выбранного из гидроксидов, карбонатов или гидрокарбонатов щелочных и щелочно-земельных металлов, оксида или гидроксида магния, триэтиламина или их смесей, ацилируют хлорангидридом (ab5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты
и продукт осаждают диэтиловым эфиром;
соединение (ab6') действием избытка гидразингидрата в водной среде в присутствии водорастворимого карбодиимида (CD), выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, N-циклогексил-N-(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимида, N-циклогексил-N-(4-диметиламиноциклогексил)карбодиимида, превращают в соединение (II)
которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и
соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;
при этом в указанных выше формулах (a1), (bl), (ab2)-(ab6') и (II) значения а и b такие, как определено в п.1.
7. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (al) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) w-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2)
где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона, водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей
полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4)
и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром;
ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения R-OH, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты
который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
фенилаланин в водной или водно-органической среде, которая является смесью органической среды, выбранной из группы, состоящей из ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, с водой в любых соотношениях в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С ацилируют активированным эфиром (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола
продукт осаждают диэтиловым эфиром;
соединение (ab6') действием гидроксилсодержащего соединения R-OH, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), такого как циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид, переводят в соответствующий активированный эфир (ab7-1), в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола
и активированный эфир (ab7-1) выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
соединение (ab7-1) подвергают гидразинолизу избытком гидразингидрата в водной, водно-органической или органической среде с образованием соединения общей формулы (II)
соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и
соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;
при этом в указанных выше формулах (al), (bl), (ab2)-(ab7-l) и (II) значения а и b такие, как определено в п.1.
8. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (al) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) w-галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100°С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2)
где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей
полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4)
и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, затем ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab5-2)
который выделяют осаждением диэтиловым эфиром;
фенилаланин в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30°С в водной, водно-органической или в органической среде, где органическая среда выбрана из группы, состоящей из диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, а водно-органическая среда является смесью органической среды с водой в любых соотношениях, в присутствии основания, выбранного из гидроксидов, карбонатов или гидрокарбонатов щелочных и щелочно-земельных металлов, оксида или гидроксида магния, триэтиламина или их смесей, ацилируют хлорангидридом (ab5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты
и продукт осаждают диэтиловым эфиром;
соединение (ab6') в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100°С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab7-2)
который выделяют осаждением диэтиловым эфиром, соединение (ab7-2) подвергают гидразинолизу избытком гидразингидрата в водной, водно-органической или органической среде с образованием соединения общей формулы (II)
соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и
соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10°С с удалением избытка азотистой кислоты, добавлением азида щелочного металла по окончании реакции;
при этом в указанных выше формулах (a1), (b1), (ab2)-(ab7-2) и (II) значения а и b такие, как определено в п.1.
9. Способ получения пегилированного интерферона α-2b (IFN α-2b), характеризующийся тем, что способом по любому из пп.2-8 готовят раствор линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I), затем к раствору IFN α-2b в фосфатном буфере с рН 8,0-8,7 при 0-5°С добавляют 4-5-кратный мольный избыток раствора линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I)
где а - целое число от 100 до 1800 и
b - целое число от 1 до 9,
с молекулярной массой от 5 до 80 кДа, по достижении степени превращения IFN α-2b 70-85% реакцию останавливают прибавлением избытка глицина, реакционную смесь разбавляют в 5-15 раз, устанавливают значение рН 4,5-5,5, требуемое для хроматографического разделения продуктов на CN-сефарозе, после чего проводят градиентное элюирование от 0,1 до 0,8М NaCl, отбирают фракции, которые анализируют обращенно-фазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГ-IFN α-2b, по результатам которого определяют целевые фракции, которые далее очищают до степени, достаточной для приготовления лекарственного препарата.
Текст
ЛИНЕЙНЫЙ АЦИЛАЗИДНЫЙ ПЕГИЛИРУЮЩИЙ АГЕНТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕГИЛИРОВАННОГО ИНТЕРФЕРОНА Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к пегилирующему агенту, способному присоединяться к свободным аминогруппам белков с образованием амидной связи посредством реакции азидной конденсации, а также к способу его получения и способу пегилирования биологически активных белков, например интерферонов. Изобретение обеспечивает способы получения линейного ацилазидного пегилирующего агента и соответствующие способы пегилирования интерферонов (IFN), в частности IFN -2b. Техническим результатом изобретения является пегилирующий агент - производное ПЭГ-фенилаланина,способный присоединяться к свободным аминогруппам белков с образованием амидной связи посредством азидной конденсации, не вызывая рацемизации субстрата, который может быть легко качественно идентифицирован в УФ-области по ароматическому фрагменту и количественно определн. Марков Илья Александрович,Маркова Елена Алексеевна, Гапонюк Полина Петровна, Маркова Инна Николаевна (RU), Гапонюк Петр Яковлевич (умер) Скибневский А.Ю. (RU) Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к пегилирующему агенту,способному присоединяться к свободным аминогруппам белков с образованием амидной связи посредством реакции азидной конденсации, а также к способу его получения и способу пегилирования биологически активных белков, например интерферонов. Пегилированные интерфероны могут найти применение для приготовления противовирусных лекарственных средств. Предшествующий уровень техники Полиэтиленоксид (полиэтиленгликоль, ПЭГ) является широко распространенным полимером для ковалентной модификации (пегилирования) биологических макромолекул, например полипептидов, что имеет большое значение в современной медицине. Цель пегилирования - предотвращение деградации белков протеолитическими ферментами и защита от антигенных и иммуногенных эпитопов. Кроме того,пегилирование увеличивает размеры полипептидов, уменьшая почечную фильтрацию, а также изменяет объем биораспределения. Вс это способствует удлинению времени пребывания модифицированных физиологически активных белков в организме пациента, что повышает их ценность в качестве лекарственных средств. Молекула ПЭГ не способна непосредственно взаимодействовать с молекулами белков, поскольку не содержит реакционноспособных функциональных групп, которые могут реагировать с какими-либо функциональными группами протеинов. Поэтому в молекулу данного полимера требуется ввести такие реакционноспособные группы или их предшественники, которые переводят в активную форму незадолго до проведения реакции с белками. Наибольшее значение при пегилировании полипептидов имеет выбор пегилирующего агента и способа конъюгации, от которых зависит вид и структура конечного конъюгата, а, следовательно, его биологическая активность, стабильность и время циркуляции в крови. Так, например, противовирусная активность пэгилированных интерферонов (ИНФ) в значительной степени зависит как от размера и геометрии молекулы ПЭГ, так и от места и способа присоединения полимера к молекуле белка, т.е. от функциональной группы ИНФ, с которой непосредственно взаимодействует соответствующий пегилирующий агент (Roberts M.J. et al. "Chemistry for peptide and protein PEGylation". Adv. Drug Delivery Rev, vol. 54 (2002), р. 459-476). Введение различных активных функциональных групп, способных взаимодействовать с функциональными группами протеинов в мягких условиях с получением соответствующих ковалентных конъюгатов, описано, в частности, Kozlowski A. et al. "Development of Pegylated Interferons for the Treatment ofChronic Hepatitis C". BioDrugs,15(7) (2001), р. 419-29. Из химии пептидов (Гринштейн Дж., Виниц М. Химия аминокислот и пептидов. М.: Мир. 1965) известно, что при образовании амидной связи с оптически активными -аминокислотами, как правило, в той или иной мере наблюдается рацемизация субстрата, причем в наименьшей степени рацемизация наблюдается при использовании азидного метода, который заключается во взаимодействии ацилазида соответствующей защищенной амнокислоты или пептида со свободной аминогруппой соответствующего аминного субстрата. Основным недостатком ацилазидов является их низкая стабильность, ацилазиды получают из соответствующих стабильных гидразидов обработкой азотистой кислотой или ее эфирами непосредственно перед применением (Гершкович А., Кибирев В. Химический синтез пептидов. Киев:"Наукова Думка", 1992). В настоящее время известен достаточно широкий ассортимент гидразидных производных ПЭГ, которые используются в качестве пэгилирующих агентов, при этом, как правило, именно в гидразидной форме без переведения в ацилазид и применения азидной конденсации. В патенте ЕР 0605963 (опубл. 13.07.1994) раскрыты, в частности, гидразидные производные ПЭГ с молярной массой от 2 до 12 кДа, имеющие структуры где Р представляет ПЭГ, а также способы их получения и применения. Указанными производными ПЭГ модифицируют, например, эритропоэтин, предварительно окисленный периодатом, с образованием гидразонной связи между полимерным и белковым доменами. В заявке US 2005118227 (опубл. 02.06.2005) описаны гидразидные соединения с ангиогенной активностью, которые получают взаимодействием дигидразида ПЭГ с соответствующими производными карбоновых кислот, активированных, например, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом. В свою очередь, дигидразид ПЭГ получают обработкой полиэтиленгликоля (молярная масса около 2 кДа) избытком фосгена, а затем N-гидроксисукцинимидом в присутствии триэтиламина. Полученный дисукцинимидилкарбонат ПЭГ переводят в дигидразид ПЭГ избытком гидразина. В патенте US 4101380 (опубл. 18.07.1978) раскрыт пегилирующий агент, который способен взаимодействовать с протеином посредством азидной конденсации. Например, таким пегилирующим агентом является сшиваюший агент (молярная масса около 2,5 кДа), представляющий собой диацилазид полиэтиленгликоля. Указанный агент получают непосредственно перед сшиванием белков из дигидразида ПЭГ. Дигидразид ПЭГ, в свою очередь, получают обработкой дигликолята полиэтиленоксида тионилхлоридом с последующим переведением образовавшегося диацилхлорида в гидразид действием гидразингидрата. Данный сшивающий агент применяют при получении белковых мембран. В патенте US 4179337 (опубл. 18.12.1979) описан ПЭГ-азид (молярная масса около 0,75 кДа), который получают из ПЭГ-гидразида обработкой нитритом натрия в солянокислом растворе непосредственно перед конъюгацией с уриказой. Необходимый ПЭГ-гидразид получают взаимодействием полиэтиленгликоля с метиловым эфиром хлоруксусной кислоты в среде жидкого аммиака в присутствии металлического натрия, что приводит к образованию метилового эфира ПЭГ-гликолевой кислоты, который далее переводят в соответствующий гидразид гидразинолизом сложноэфирной группы. В качестве ближайшего аналога настоящего изобретения авторы рассматривают ПЭГ-гидразид с молярной массой 5 кДа, раскрытый в заявке WO 1992/016555 (опубл. 01.10.1992), являющийся производным -аланина. Указанный ПЭГ-гидразид получают способом, включающим стадии (а) обработки монометоксиполиэтиленгликоля фосгеном с образованием ПЭГ-хлорформиата, (б) обработки полученного продукта избытком гидрохлорида этилового эфира -аланина в присутствии избытка триэтиламина с образованием этилового эфира ПЭГаланина и (в) обработки этилового эфира ПЭГаланина гидразином с образованием гидразида ПЭГаланина или с углеводным фрагментом гликозилированного белка (Glycoprotein), окисленным периодатом, с последующим "закреплением" образовавшейся гидразонной связи восстановлением цианборогидридом натрия в соответствующий амин Возможность применения данного ПЭГ-агента в реакции азидной конденсации в известном изобретении не предполагается. Основными недостатками рассматриваемого пегилирующего агента является наличие относительно легко гидролизуемой карбаматной связи, применение в качестве линкера нефизиологичной аминокислоты (-аланина) и использование при получении ПЭГ-агента в качестве одного из промежуточных реагентов высокотоксичного фосгена. Кроме того, к недостаткам можно отнести отсутствие в его структуре фрагментов, по которым можно было бы легко произвести качественное и количественное определение ПЭГ-агента, что значительно упрощает анализ и очистку как самого ПЭГ-агента, так и реакционной смеси при конъюгации с белками. Таким образом, технической задачей настоящего изобретения является разработка пегилирующих агентов, пригодных для получения стабильных производных белков и расширение арсенала пегилирующих агентов и способов пегилирования биологически активных белков, например интерферонов. Техническим результатом изобретения является пегилирующий агент - производное ПЭГ-2 023360 фенилаланина, способный присоединяться к свободным аминогруппам белков с образованием амидной связи посредством азидной конденсации, не вызывая рацемизации субстрата, который может быть легко качественно идентифицирован в УФ-области по ароматическому фрагменту и количественно определн,и способы его получения. Сущность изобретения В результате обширных исследований авторы установили, что недостатки известного уровня техники могут быть преодолены созданием и применением линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) где а - целое число от 100 до 1800 иb - целое число от 1 до 9,имеющего молекулярную массу от 5 до 80 кДа. Настоящее изобретение также представляет способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) где а - целое число от 100 до 1800 иb - целое число от 1 до 9,с молекулярной массой от 5 до 80 кДа, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (a1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1)-галоген-карбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного третбутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы,состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100 С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4) и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа,тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана,тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения R-OH, выбранного из Nгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодии-3 023360 который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; или ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100 С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы,состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab5-2) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; эфир фенилаланина в котором Alk' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30 С в присутствии органического основания, выбранного из группы, состоящей из триэтиламина, N-метилморфолина, в среде безводного органического растворителя, выбранного из из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диоксана, тетрагидрофурана, ацилируют активированным эфиром (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола и соединение (ab6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром; или соответствующий эфир фенилаланина в среде безводного диметилформамида в присутствии основания, выбранного из триэтиламина, метилдиэтиламина или N-метилморфолина, ацилируют хлорангидридом (ab5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты и соединение (ab6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром; или соответствующий эфир фенилаланина в атмосфере азота или аргона в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена,тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, диоксана, тетрагидрофурана, ацетонитрила, при температуре от -30 до 30 С в присутствии органического основания, выбранного из группы, состоящей из триэтиламина, N-метилморфолина, в присутствии карбодиимида, выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, ацилируют ПЭГ-карбоновой кислотой и соединение (ab6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром; эфир (ab6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100 С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена,тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10 С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции. Далее изобретение предоставляет способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) где а - целое число от 100 до 1800 иb - целое число от 1 до 9,с молекулярной массой от 5 до 80 кДа, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (a1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) -галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного третбутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла, амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100 С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4) и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа,тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана,тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформа-5 023360 мида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения R-OH, выбранного из Nгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; или ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100 С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы,состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab5-2) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; фенилаланин в водной или водно-органической среде, которая является смесью органической среды,выбранной из группы, состоящей из ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, с водой в любых соотношениях в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С ацилируют активированным эфиром (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола и продукт осаждают диэтиловым эфиром,или фенилаланин в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С в водной,водно-органической или в органической среде, где органическая среда выбрана из группы, состоящей из диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, а водноорганическая среда является смесью органической среды с водой в любых соотношениях, в присутствии основания, выбранного из гидроксидов, карбонатов или гидрокарбонатов щелочных и щелочноземельных металлов, оксида или гидроксида магния, триэтиламина или их смесей, ацилируют хлорангидридом (ab5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты и продукт осаждают диэтиловым эфиром,соединение (ab6') действием избытка гидразингидрата в водной среде в присутствии водорастворимого карбодиимида (CD), выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида,N-циклогексил-N-(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимида,N-циклогексил-N-(4 диметиламиноциклогексил)карбодиимида, превращают в соединение (II) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром,или соединение (ab6') действием гидроксилсодержащего соединения R-OH, выбранного из N-6 023360 гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), такого как циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид,переводят в соответствующий активированный эфир (ab7-1), в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола,пентахлорфенола или пентафторфенола и активированный эфир (ab7-1) выделяют осаждением диэтиловым эфиром. или соединение (ab6') в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100 С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab7-2) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; соединения (ab7-1) или (ab7-2) подвергают гидразинолизу избытком гидразингидрата в водной,водно-органической или органической среде с образованием соединения общей формулы (II) соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром,или действием на соединение (ab6') избытком гидразингидрата в водной среде получают в присутствии водорастворимого карбодиимида (CD), выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимид,N-циклогексил-N-(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимид,Nциклогексил-N-(4-ди-метиламиноциклогексил)карбодиимид, получают соединение (II) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты,бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10 С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции. Изобретение также обеспечивает способ получения пегилированного интерферона -2b (IFN -2b),характеризующийся тем, что способом по п.2 или 3 готовят раствор линейного ацилазидного пегили-7 023360 рующего агента общей формулы (I); к раствору IFN -2b в фосфатном буфере с рН 8,0-8,7 при 0-5 С добавляют 4-5-кратный мольный избыток раствора линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) где а - целое число от 100 до 1800 иb - целое число от 1 до 9,с молекулярной массой от 5 до 80 кДа; по достижении степени превращения IFN -2b 70-85% реакцию останавливают прибавлением избытка глицина; реакционную смесь разбавляют в 5-15 раз, устанавливают значение рН 4,5-5,5, требуемое для хроматографического разделения продуктов на СМ-сефарозе,после чего проводят градиентное элюирование от 0,1 до 0,8 М NaCl; отбирают фракции, которые анализируют обращенно-фазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГ-IFN -2b, по результатам которого определяют целевые фракции, которые далее очищают до степени, достаточной для приготовления лекарственного препарата. Выражение "выбранный из группы, состоящей из" помимо индивидуальных альтернатив также включает возможные и рациональные комбинации двух или более таких альтернатив. Например, выражение "хлорированный растворитель, выбранный из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа,трихлорэтилена, тетрахлорида углерода" включает, в частности, смеси дихлорэтана и хлороформа, хлороформа и тетрахлорида углерода, ирихлорэтилена и тетрахлорида углерода. Далее способы получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) будут подробно описаны со ссылками на маршруты синтеза и схемы превращений на каждой стадии маршрутов. В контексте настоящего изобретения термин "маршрут синтеза" определяет направления химических превращений от исходных веществ до конечного продукта посредством условных обозначений промежуточных продуктов с указанием стадий синтеза, их связывающих. Маршрут синтеза 1. Условные обозначения соединений, данные в круглых скобках, указывают на присутствие в их молекулах полимерного фрагмента -(О-СН 2-СН 2)а- (а), -(СН 2)b- (b) или обоих фрагментов (ab). Число после буквенного обозначения определяет номер стадии, на которой соединение или соединения являются исходными веществами. Второе число, если указано, определяет вариант промежуточного соединения. Обозначения в квадратных скобках указывают стадии синтеза. В соответствии с изобретением пегилирующий агент общей формулы (I) может быть получен из монометоксиполиэтиленгликоля с применением нескольких синтетических подходов. В первом варианте способа получения синтез начинают с алкилирования гидроксильной группы монометоксиполиэтиленгликоля соответствующим эфиром -галогенкарбоновой кислоты (стадия [1]) На стадии [1] монометоксиполиэтиленгликоль (a1) обрабатывают алкиловым эфиром (b1) соответствующей -галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя в присутствии основания В с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2). Основание выбирают из металлического лития, металлического натрия или металлического калия,амида лития, амида натрия или амида калия, бутиллития, третбутилата лития, третбутилата натрия или третбутилата калия, уходящей группой X является Cl, Br или I, Alk выбран из метила, этила, пропила,изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила. Мольное соотношение основания к монометоксиполиэтиленгликолю составляет от 1:1 до 50:1. Мольное соотношение -галогенкарбоновой кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю составляет от 1:1 до 50:1. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100 С или при кипении в среде безводного органического растворителя, выбранного из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного третбутанола или их смеси. Продукт реакции осаждают диэтиловым эфиром. Количество сложноэфирных групп, содержащихся в ПЭГ-карбоксиэфире, устанавливают либо микроопределением числа омыления, либо спектрофотометрически в видимой области с реагентом FeCl3 после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты. Далее сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу (стадия Щелочной гидролиз ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) (стадия [2]) проводят в атмосфере азота или аргона,водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей. Последующим подкислением реакционной массы после завершения стадии 2 получают соответствующую ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) (стадия [3]). Для подкисления применяют водный раствор кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, хлорной кислоты, бромистоводородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей. Образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром. Количество карбоксильных групп в (ab4) определяют либо потенциометрическим микротитрованием раствором сильного основания, либо спектрофотометрически в видимой области в виде соли с бриллиантовым зеленым или метиленовым синим. Далее ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) превращают в активированный эфир (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты (стадия [4 а]) Превращение ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4) в соответствующий активированный эфир (ab5-1) на стадии 4 а проводят действием гидроксилсодержащего соединения R-OH в присутствии карбодиимида(CD) в среде безводного органического растворителя. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С. Безводный органический растворитель выбирают из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата или их смесей. Карбодиимидом является циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид. Гидроксилсодержащее соединение выбрано из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4 динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола. Мольное соотношение гидроксилсодержашего соединения R-OH к ПЭГ-карбоновой кислоте (ab4) составляет от 1:1 до 50:1. Мольное соотношение карбодиимида (CD) к ПЭГ-карбоновой кислоте (ab4) составляет от 1:1 до 50:1. Активированный эфир (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты выделяют осаждением диэтиловым эфиром. Количество сложноэфирных групп, содержащихся в (ab5-1), устанавливают либо микроопределением числа омыления, либо спектрофотометрически в УФ-области или в видимой области с реагентомFeCl3 после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты. Получение хлорангидрида (ab5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты осуществляют обработкой ПЭГкарбоновой кислоты избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе или без такового. Безводный органический растворитель выбирают из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетра-9 023360 хлорида углерода или их смесей. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100 С. Продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром. Количество хлорангидридных групп, содержащихся в (ab5-2), определяют либо потенциометрическим микротитрованием либо спектрофотометрически в видимой области с реагентом FeCl3 после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты. Далее соответствующий эфир фенилаланина, в котором Alk' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, ацилируют, применяя в качестве ацилирующего агента активированный эфир (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола (стадия [5 а]) Эфир фенилаланина ацилируют в присутствии основания в среде безводного органического растворителя, выбранного из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата,диметилформамида, диоксана, тетрагидрофурана или их смесей. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30 С. Органическим основанием является триэтиламин, Nметилморфолин или их смесь. Мольное соотношение эфира фенилаланина к активированному эфиру(ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты составляет от 1:1 до 50:1. Продукт реакции выделяют осаждением диэтиловым эфиром. Количество фрагментов эфира фенилаланина, присоединнных к активированному эфиру (ab5-1),устанавливают либо микроопределением числа омыления, либо спектрофотометрически в УФ-области или в видимой обрасти с реагентом FeCl после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты. Альтернативно, в качестве ацилирующего агента применяют хлорангидрид (ab5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты в присутствии в качестве основания алифатического амина, выбранного из триэтиламина, метилдиэтиламина или N-метилмлрфолина. Реакцию предпочтительно проводят в среде диметилформамида (стадия [5 в]) Выделение и характеризацию продукта проводят, как описано для стадии [5 а]. Альтернативно ацилирование метилового или этилового эфира фенилаланина ведут непосредственно ПЭГ-карбоновой кислотой (ab4) в присутствии карбодиимида и органического основания в среде безводного органического растворителя (стадия [5 б]) Безводный органический растворитель выбирают из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена,тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, диоксана, тетрагидрофурана, ацетонитрил или их смесей. Органическим основанием является триэтиламин, N-метилморфолин или их смесь. Карбодиимидом является циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -30 до 30 С. Мольное соотношение эфира фенилаланина к ПЭГ-карбоновой кислоте (ab4) составляет от 1:1 до 50:1. Мольное соотношение карбодиимида к ПЭГ-карбоновой кислоте (ab4) составляет от 1:1 до 50:1. Продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром. Количество фрагментов эфира фенилаланина, присоединнных к ПЭГ-карбоновой кислоте (ab4),устанавливают либо микроопределением числа омыления, либо спектрофотометрически в УФ-области или в видимой обрасти с реагентом FeCl после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты. На стадии [6] метиловый или этиловый эфир (ab6) ПЭГ-фенилаланина гидразинолизом превращают в соединение (II) Стадия [6] Гидразинолиз проводят действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100 С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении. Соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром. Количество гидразидных групп, введенных в (ab6), определяют спектрофотометрически в видимой области с реагентом 4-диметиламинобензальдегидом. В другом альтернативном варианте способа получения соединения общей формулы (II) применяют последовательность химических реакций, описываемую маршрутом синтеза 2. Маршрут синтеза 2. Стадии синтеза [1]-[3], [4 а], [4 б] и условия их проведения аналогичны маршруту синтеза 1, раскрытому выше. В настоящем варианте способа синтеза в качестве промежуточного соединения применяют непосредственно фенилаланин, который ацилируют активированным эфиром (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из Nгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола (стадия [5 г]) Ацилирование проводят в водной или водно-органической среде. Водно-органической средой является смесь органической среды, выбранной из ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола или их смесей, с водой в любых соотношениях. Мольное соотношение фенилаланина к активированному эфиру(ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты составляет от 1:1 до 50:1. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С. Продукт осаждают диэтиловым эфиром. Альтернативно, ацилирование фенилаланин осуществляют действием хлорангидрида (ab5-2) ПЭГкарбоновой кислоты в водной, водно-органической или в органической среде в присутствии основания Органической средой являются диметилформамид, диметилсульфоксид, ацетонитрил, метанол, этанол, изопропанол или их смеси. Водно-органической средой являются смесь органической среды с водой в любых соотношениях. Основанием являются гидроксиды, карбонаты или гидрокарбонаты щелочных и щелочно-земельных металлов, оксид или гидроксид магния, триэтиламин или их смеси. Мольное соотношение фенилаланина к активированному эфиру (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты составляет от 1:1 до 50:1. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С. Продукт осаждают диэтиловым эфиром. В обоих вариантах количество присоединнных фенилаланин-карбоксильных групп определяют либо потенциометрическим микротитрованием, либо спектрофотометрически в видимой области в виде соли с бриллиантовым зеленым или метиленовым синим. Присутствие ароматического остатка фенилаланина доказывают спектрофотометрически по характерному поглощению в УФ-области. Далее соединение (ab6') превращают в соединение (II) действием избытка гидразингидрата в присутствии водорастворимого карбодиимида (CD) в водной среде (стадия [6 в]) Стадия [6 в] Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30 С. Водорастворимым карбодимидом является 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид,N-циклогексил-N-(2 морфолинил-(4)-этил)карбодиимид, N-циклогексил-N-(4-диметиламиноциклогексил)карбодиимид или их смесь. Мольное соотношение карбодиимида к (ab6') составляет от 1:1 до 50:1. Соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей с последующим осаждением диэтиловым эфиром. Количество введенных в (ab6') гидразидных групп определяют спектрофотометрически в видимой области с реагентом 4-диметиламинобензальдегидом. Присутствие ароматического остатка фенилаланина доказывают спектрофотометрически в УФ-области по характерному поглощению. В альтернативном варианте гидразинолизу предшествует переведение соединения (ab6') в соответствующий активированный эфир (ab7-1), в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола (стадия [6 а]) действием гидроксилсодержащего соединения R-OH, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4 нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида(CD), такого как циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 20 С в среде безводного органического растворителя, выбранного из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата или их смеси. Активированный эфир (ab7-1) ПЭГ-карбоновой кислоты выделяют осаждением диэтиловым эфиром. Мольное соотношение гидроксилсодержашего соединения R-OH к соединению (ab6') составляет от 1:1 до 50:1. Мольное соотношение карбодиимида CD к соединению (ab6') составляет от 1:1 до 50:1. Количество сложноэфирных групп, содержащихся в соединении (ab7-1), устанавливают либо микроопределением числа омыления, либо спектрофотометрически в УФ-области или в видимой области с реагентом FeCl после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты. В другом альтернативном варианте гидразинолизу предшествует переведение соединения (ab6') в соответствующий хлорангидрид (ab7-2) (стадия [6 б]) обработкой соединения (ab6')избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе или без такового. Безводный органический растворитель выбирают из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температу- 12023360 ре от -10 до 100 С. Продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром. Количество хлорангидридных групп, содержащихся в хлорангидриде ПЭГ-фенилаланина, определяют либо потенциометрическим микротитрованием, либо спектрофотометрически в видимой области с реагентом FeCl3 после предварительного переведения в форму соответствующей гидроксамовой кислоты. Присутствие ароматического остатка фенилаланина доказывают спектрофотометрически в УФобласти по характерному поглощению. Далее на стадиях [7 а] или [7 б] соединения (ab7-1) или (ab7-2) подвергают гидразинолизу с образованием соединения общей формулы (II) Стадия[7 б] Для этого активирований эфир (ab7-1), в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, или хлорангидрид (ab7-2) обрабатывают избытком гидразингидрата в водной,водно-органической или органической среде. Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30 С. Органической средой является метанол, этанол, ацетонитрил, диоксан, тетрагидрофуран, диметилформамид, диметилсульфоксид или их смеси. Водно-органической средой является смесь органической среды с водой в любых соотношениях. Соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром. Количество введенных гидразидных групп определяют спектрофотометрически в видимой области с реагентом 4-диметиламинобензальдегидом. Присутствие ароматического остатка фенилаланина доказывают спектрофотометрически в УФ-области по характерному поглощению. Альтернативно, соединение (II) может быть непосредственно получено гидразинолизом ПЭГкарбоновой кислоты (ab6') в присутствии водорастворимого карбодиимида (CD), такого как 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимид,N-циклогексил-]N-(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимид,Nциклогексил-N-(4-диметиламиноциклогексил)карбодиимид или их смеси, в водной среде (стадия [6 в]) Стадия [6 в] Реакцию ведут в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30 С. Мольное соотношение карбодиимида к соединению (ab6') составляет от 1:1 до 50:1. Выделение и характеризацию продукта проводят, как описано для стадии (7 а) или (7 б). Основной целью изобретения является получение стабильно пегилированных белков, обладающих полезными биологическими свойствами, особенно интерферонов, и в частности интерферона -2b (IFN а-2b). Для этого соединение (II) непосредственно перед пегилированием белка превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент (I) обработкой избытком азотистой кислоты при пониженной температуре в интервале от -5 до 10 С. Источником азотистой кислоты является смесь нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты,бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей. По окончании реакции избыток азотистой кислоты удаляют добавлением азида щелочного металла,после чего образовавшееся соединение (I) без выделения используют для конъюгации с белком По достижении степени превращения белка 70-85% реакцию останавливают прибавлением избытка глицина. Реакционную смесь разбавляют устанавливают значение рН 4,5-5,5, требуемое для хроматографического разделения продуктов на CN-сефарозе, после чего проводят градиентное элюирование от 0,1 до 0,8 М NaCl. Отобранные фракции анализируют обращенно-фазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГIFN -2b, по результатам которого отбирают целевые для последующей очистки и приготовления лекарственного препарата. Далее достижение технического результата изобретения будет показано на предпочтительных примерах осуществления. Все примеры были воспроизведены для двух фракций монометоксиполиэтиленгликоля ПЭГ 20 и ПЭГ 30 с молекулярными массами 20 и 30 кДа соответственно. Присутствие фрагмента фенилаланина в соединениях (ab5-1), (ab6), (ab6'), (ab7-1) и (II) было подтверждено спектрофотометрически по наличию полосы поглощения с максимумами при 251, 257 и 263 нм, имеющей выраженную колебательную структуру, характер которой совпадает с описанным в публикации Ingle J.R., Busch К.W.,Busch M A. "Chiral analysis by multivariate regression modeling of spectral data using cyclodextrin guest-hostcomplexes-Methods for determining enantiomeric composition with varying chiral analyte concentration". Talanta, vol. 75 (2) Apr. 2008, p. 572-584. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения. Пример 1. Получение ПЭГ-карбоксиэфира (стадия [1]). В атмосфере аргона при нагревании в 50 мл толуола растворяют 100 мкмоль монометоксиполиэтиленгликоля. Полученный раствор кипятят 15 мин и отгоняют около 25 мл растворителя, после чего раствор охлаждают до комнатной температуры и приливают раствор 1000 мкмоль третбутоксида калия в 20 мл абсолютного третбутанола. Реакционную смесь перемешивают 1 ч в атмосфере аргона при комнатной температуре и приливают раствор 1000 мкмоль метилового эфира -бромкарбоновой кислоты с числом атомов b от 1 до 9 в 10 мл толуола и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Затем раствор выпаривают при пониженном давлении и ПЭГ-карбоксиэфир осаждают диэтиловым эфиром, отфильтровывают и дважды переосаждают из дихлорметанового раствора диэтиловым эфиром и высушивают в вакуум-эксикаторе. Выход: 94-98%. Содержание сложноэфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 96-102%. Пример 2. Получение ПЭГ-карбоновой кислоты (стадии [2] и [3]). ПЭГ-карбоксиэфир, полученный в примере 1, растворяют в 50 мл 2 М NaOH и перемешивают в течение ночи в атмосфере аргона, после чего подкисляют 10%-ной серной кислотой до рН 1-2 и трижды экстрагируют дихлорметаном порциями по 20 мл. Объединенные экстракты промывают 10%-ным сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный раствор фильтруют, упаривают и ПЭГ-карбоновую кислоту осаждают диэтиловым эфиром и отфильтровывают. Полученный осадок дважды переосаждают диэтиловым эфиром из раствора в абсолютном изопропаноле и высушивают в вакуум-эксикаторе. Выход: 90-96%. Содержание сложноэфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 98-103%. Пример 3. Получение нитрофенилового эфира ПЭГ-карбоновой кислоты (стадия [4 а]). К охлажденному до 0 С раствору 100 мкмоль ПЭГ-карбоновой кислоты, полученной в примере 3, в 80 мл этилацетата приливают этилацетатный раствор 500 мкмоль 4-нитрофенола, перемешивают и добавляют 500 мкмоль дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 10 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Раствор фильтруют и продукт выделяют добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают, дважды переосаждают эфиром из раствора в дихлорметане и высушивают в вакуум-эксикаторе. Выход: 97-100%. Содержание нитрофенильных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 93-101%. Пример 4. Получение хлорангидрида ПЭГ-карбоновой кислоты (стадия [4 б]). К раствору 100 мкмоль ПЭГ-карбоновой кислоты, полученной в примере 3, в 50 мл дихлорметана приливают 10 мл свежеперегнанного тионилхлорида и перемешивают в атмосфере аргона в течение ночи при комнатной температуре. Затем реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 20 мл метиленхлорида и продукт выделяют добавлением диэтилового эфира. Хлорангидрид ПЭГ-карбоновой кислоты отфильтровывают, дважды переосаждают эфиром из раствора в дихлорметане и высушивают в вакуум-эксикаторе. Выход: 97-100%. Содержание хлорангидридных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 89-94%. Пример 5. Получение метилового эфира ПЭГ-фенилаланина (стадия [5 а]). В 40 мл дихлорметана расторяют 100 мкмоль нитрофенилового эфира ПЭГ-карбоновой кислоты,полученного в примере 3. Параллельно готовят раствор, содержащий по 1000 мкмоль гидрохлорида метилового эфира Z-фенилаланина и триэтиламина в 10 мл диметилформамида. Растворы смешивают и оставляют на ночь в атмосфере аргона. Продукт осаждают добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают и дважды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле. Полученный метиловый эфир ПЭГ-фенилаланина высушивают в вакууме. Выход: 92-98%. Содержание эфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 92-97%. Пример 6. Получение метилового эфира ПЭГ-фенилаланина (стадия [5 в]). В 40 мл дихлорметана расторяют 100 мкмоль хлорангидрида ПЭГ-карбоновой кислоты, полученного в примере 4. Параллельно готовят раствор, содержащий по 1000 мкмоль гидрохлорида метилового эфира L-фенилаланина и триэтиламина в 10 мл диметилформамида. Растворы смешивают и оставляют на ночь в атмосфере аргона. Продукт осаждают добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают и дважды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле. Полученный метиловый эфир ПЭГ-фенилаланина высушивают в вакууме. Выход: 94-98%. Содержание эфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 88-95%. Пример 7. Получение метилового эфира ПЭГ-фенилаланина (стадия [5 б]). К охлажденному до 0 С раствору 100 мкмоль ПЭГ-карбоновой кислоты, полученной в примере 2, в 50 мл этилацетата приливают диметилформамидный раствор 500 мкмоль гидрохлорида метилового эфира L-фенилаланина, содержащего 500 мкмоль триэтиламина, перемешивают и добавляют 500 мкмоль дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 10 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем раствор фильтруют и продукт выделяют добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают, дважды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле и высушивают в вакуум-эксикаторе. Выход: 95-99%. Содержание эфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 92-100%. Пример 8. Получение ПЭГ-фенилаланина (стадия [5 г]). 100 мкмоль нитрофенилового эфира ПЭГ-карбоновой кислоты, полученной в примере 3, растворяют в 50 мл водного раствора, содержащего по 1000 мкмоль L-фенилаланина и 1000 мкмоль триэтиламина. Раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем желтую реакционную смесь трижды экстрагируют дихлорметаном порциями по 50 мл. Объединенные экстракты промывают 10%-ным сульфатом натрия в 1% NaHCO3, затем 10%-ным сульфатом натрия, подкисленным до рН 1-2 серной кислотой и в конце - чистым 10% сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный раствор фильтруют, выпаривают и ПЭГ-фенилаланин осаждают диэтиловым эфиром и отфильтровывают. Полученный осадок полимера дважды переосаждают диэтиловым эфиром из раствора в абсолютном изопропаноле и высушивают в вакууме. Выход: 87-96%. Содержание карбоксильных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 90-97%. Пример 9. Получение ПЭГ-фенилаланина (стадия [5 д]). 100 мкмоль хлорангидрида ПЭГ-карбоновой кислоты, полученного в примере 4, расторяют в 40 мл дихлорметана. Параллельно готовят раствор, содержащий по 1000 мкмоль L-фенилаланина и триэтиламина в 10 мл диметилформамида. Растворы смешивают и оставляют на ночь в атмосфере аргона. Продукт осаждают добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают и дважды переосаждают эфиром из раствора в изопропанола. Полученный ПЭГ-фенилаланин высушивают в вакуум-эксикаторе. Выход: 93-98%. Содержание эфирных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 89-94%. Пример 10. Получение гидроксисукцинимидного эфира ПЭГ-фенилаланина(стадия [6 а]). К охлажденному до 0 С раствору 100 мкмоль ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 8 или 9, в 80 мл этилацетата приливают этилацетатный раствор 500 мкмоль N-гидроксисукцинимида, перемешивают и добавляют 500 мкмоль дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 10 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем раствор фильтруют, и продукт выделяют добавлением диэтилового эфира, отфильтровывают, дважды переосаждают эфиром из раствора в дихлорметане и высушивают в вакуум-эксикаторе. Выход: 96-99%. Содержание гидроксисукцинимидных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 95-103%. Пример 11. Получение хлорангидрида ПЭГ-фенилаланина (стадия [6 б]). К раствору 100 мкмоль ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 8 или 9, в 50 мл дихлорметана приливают 10 мл свежеперегнанного тионилхлорида и перемешивают в атмосфере аргона в течение ночи при комнатной температуре. После реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 20 мл метиленхлорида и продукт выделяют добавлением диэтилового эфира. Хлорангидрид ПЭГ-фенилаланина отфильтровывают, дважды переосаждают эфиром из раствора в дихлорметане и высушивают в вакуум-эксикаторе над твердым КОН или конц. H2SO4. Выход: 98-100%. Содержание хлорангидридных групп в полимере по данным титриметрических и спектрофотометрических анализов составляет 88-98%. Пример 12. Получение гидразида ПЭГ-фенилаланина (II) (стадия [6]). К раствору 100 мкмоль метилового эфира ПЭГ-фенилаланина, полученного в примерах 5, 6 или 7, в 30 мл метанола приливают 10 мл гидразингидрата и кипятят с обратным холодильником в атмосфере аргона 24 ч. Далее раствор выпаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 30 мл 10% сульфата натрия, подкисляют 5%-ной серной кислотой до рН 1-2 и 5-кратно экстрагируют дихлорметаном порциями по 30 мл. Органический слой промывают 10%-ным сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный дихлорметановый раствор ПЭГгидразида фильтруют, выпаривают при пониженном давлении, и продукт осаждают добавлением диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и трижды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле. Выход: 91-96%. Содержание гидразидных групп в полимере по данным спектрофотометрического анализа составляет 83-92%. Пример 13. Получение гидразида ПЭГ-фенилаланина (II) (стадия [7 а]). В 30 мл охлажденного до 0 С 1%-ного водного раствора гидразингидрата растворяют 100 мкмоль гидроксисукцинимидного эфира ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 10. Смесь перемешивают 5 ч в атмосфере аргона при комнатной температуре, подкисляют 5%-ной серной кислотой до рН 1-2 и 5 кратно экстрагируют дихлорметаном порциями по 30 мл. Органический слой промывают 10%-ным сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный дихлорметановый раствор ПЭГгидразида фильтруют, выпаривают при пониженном давлении, и продукт осаждают добавлением диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и трижды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле. Выход: 92-95%. Содержание гидразидных групп в полимере по данным спектрофотометрического анализа составляет 91-94%. Пример 14. Получение гидразида ПЭГ-фенилаланина (II) (стадия [7 б]). В 25 мл охлажденного до 0 С диметилфлормамида, содержащего 10 ммоль гидразингидрата, растворяют 100 мкмоль хлорангидрида ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 11. Смесь перемешивают в атмосфере аргона 2 ч при комнатной температуре, выпаривают при пониженном давлении, растворяют в 30 мл воды, подкисляют 5%-ной серной кислотой до рН 1-2 и 5-кратно экстрагируют дихлорметаном порциями по 30 мл. Органический слой промывают 10%-ным сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный дихлорметановый раствор ПЭГгидразида фильтруют, выпаривают при пониженном давлении, и продукт осаждают добавлением диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и трижды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле. Выход: 89-94%. Содержание гидразидных групп в полимере по данным спектрофотометрического анализа составляет 86-92%. Пример 15. Получение гидразида ПЭГ-фенилаланина (II) (стадия [6 в]). К 30 мл охлажденного до 3 С водного раствора 100 мкмоль ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 8 или 9, содержащему 10 ммоль гидразингидрата, приливают водный раствор 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)-карбодиимида (500 мкмоль/10 мл). Смесь перемешивают при охлаждении в течение 3 ч и далее в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона, подкисляют 5%-ной серной кислотой до рН 1-2 и 5-кратно экстрагируют дихлорметаном порциями по 30 мл. Органический слой промывают 10%-ным сульфатом натрия до нейтральной реакции и высушивают над безводным сульфатом натрия в течение ночи. Высушенный дихлорметановый раствор ПЭГгидразида фильтруют, выпаривают при пониженном давлении, и продукт осаждают добавлением диэтилового эфира. Осадок отфильтровывают и трижды переосаждают эфиром из раствора в изопропаноле. Выход: 92-98%. Содержание гидразидных групп в полимере по данным спектрофотометрического анализа составляет 82-89%. Пример 16. Получение пегилирующего линейного ацилазидного агента общей формулы (II). К охлажденному до 0 С раствору 5 мкмоль гидразида ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 13, 14 или 15, в 3 мл 0,5 М HCl приливают раствор 50 мкмоль NaNO2 в 1 мл воды. Смесь перемешивают при охлаждении в течение 20 мин, далее избыток азотистой кислоты удаляют прибавлением 50 мкмольNaN3 в 0,5 мл воды и сразу же используют для конъюгации с белком. Пример 17. Получение пегилированного интерферона (ПЭГ-IFN -2b). Раствор 5 мкмоль азида ПЭГ-фенилаланина, полученного в примере 16, приливают к охлажденному до 0-5 С раствору 1 мкмоль IFN -2b в фосфатном буфере с рН 8,5. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают в течение 3 ч. Далее реакцию останавливают прибавлением избытка глицина. Реакционную смесь разбавляют в 10 раз, добавлением СН 3 СООН устанавливают рН 5,0 и наносят на CN-сефарозу, предварительно уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером с рН 5,0. После нанесения реакционной смеси элюируют уравновешивающим буфером, а затем - градиентом от 0,1 до 0,8 М NaCl. Отобранные фракции анализируют обращенно-фазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГ-IFN -2b. Целевые фракции объединяют и повторно анализируют, определяя чистоту и содержание моно-ПЭГ-IFN 2b. Выход очищенного продукта (в пересчете на IFN -2b): для ПЭГ-IFN -2b составляет 54% при чистоте 95,5%; для ПЭГ 30-IFN -2b составляет 42% при чистоте 97,3%. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) где а - целое число от 100 до 1800 иb - целое число от 1 до 9,имеющий молекулярную массу от 5 до 80 кДа. 2. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (a1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) -галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла,амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100 С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, при этом продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4) образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана,тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида, этилацетата, действием гидроксилсодержащего соединения R-OH, выбранного из Nгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; в котором Alk' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 30 С в присутствии органического основания, выбранного из группы, состоящей из триэтиламина, N-метилморфолина, в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диоксана, тетрагидрофурана, ацилируют активированным эфиром (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола и соединение (ab6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром; эфир (ab6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100 С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочноземельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10 С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции; при этом в указанных выше формулах (a1), (b1), (ab2)-(ab6) и (II) значения а и b такие, как определено в п.1. 3. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (al) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) -галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла,амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100 С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) где А 1k выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, при этом продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона, водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4) образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100 С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab5-2) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; эфир фенилаланина в котором Alk' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в среде безводного диметилформамида в присутствии основания, выбранного из триэтиламина, метилдиэтиламина или Nметилморфолина, ацилируют хлорангидридом (ab5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты и соединение (ab6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром; эфир (ab6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100 С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочноземельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10 С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции; при этом в указанных выше формулах (a1), (b1), (ab2)-(ab6) и (II) значения а и b такие, как опреде- 19023360 лено в п.1. 4. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (a1) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) -галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла,амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100 С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) где А 1k выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, при этом продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочно-земельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4) образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа, тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; эфир фенилаланина в котором Alk' обозначает алифатический алкил, выбранный из метила или этила, в атмосфере азота или аргона, в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, диоксана, тетрагидрофурана, ацетонитрила, при температуре от -30 до 30 С в присутствии органического основания, выбранного из группы, состоящей из триэтиламина, N-метилморфолина, в присутствии карбодиимида, выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида,ацилируют ПЭГ-карбоновой кислотой (ab4) и соединение (ab6) выделяют осаждением диэтиловым эфиром; эфир (ab6) ПЭГ-фенилаланина действием избытка гидразингидрата в среде спиртового растворителя, выбранного из метанола, этанола или их смеси, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 10 до 100 С при повышенном давлении или при температуре кипения растворителя при атмосферном давлении превращают в соединение (II) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочноземельного металла и кислоты, выбранной из группы, состоящей из серной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10 С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции; при этом в указанных выше формулах (a1), (bl), (ab2)-(ab6) и (II) значения а и b такие, как определено в п.1. 5. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (al) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) -галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла,амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100 С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4) и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа,тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида,этилацетата,действием гидроксилсодержащего соединенияNгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; фенилаланин в водной или водно-органической среде, которая является смесью органической среды, выбранной из группы, состоящей из ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, с водой в любых соотношениях в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С ацилируют активированным эфиром (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола и продукт осаждают диэтиловым эфиром, затем соединение (ab6') действием избытка гидразингидрата в водной среде в присутствии водорастворимого карбодиимида (CD), выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида,N-циклогексил-N-(2-морфолинил-(4)-этил)карбодиимида, N-циклогексил-N-(4-диметиламиноциклогексил)карбодиимида, превращают в соединение (II) которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, после чего соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10 С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции; при этом в указанных выше формулах (al), (bl), (ab2)-(ab6') и (II) значения а и b такие, как определено в п.1. 6. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (al) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) -галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла,амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100 С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4) и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа,тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, затем ПЭГ-карбоновую кислоту(ab4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100 С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab5-2) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; фенилаланин в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С в водной, водноорганической или в органической среде, где органическая среда выбрана из группы, состоящей из диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, а водноорганическая среда является смесью органической среды с водой в любых соотношениях, в присутствии основания, выбранного из гидроксидов, карбонатов или гидрокарбонатов щелочных и щелочноземельных металлов, оксида или гидроксида магния, триэтиламина или их смесей, ацилируют хлорангидридом (ab5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты и продукт осаждают диэтиловым эфиром; соединение (ab6') действием избытка гидразингидрата в водной среде в присутствии водорастворимого карбодиимида которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочноземельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромистоводородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10 С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции; при этом в указанных выше формулах (a1), (bl), (ab2)-(ab6') и (II) значения а и b такие, как определено в п.1. 7. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (al) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) -галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла,амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100 С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона, водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4) и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа,тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; ПЭГ-карбоновую кислоту (ab4) в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из диоксана, тетрагидрофурана, дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, диметилформамида,этилацетата,действием гидроксилсодержащего соединенияNгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), выбранного из циклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, превращают в активированный эфир (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; фенилаланин в водной или водно-органической среде, которая является смесью органической среды, выбранной из группы, состоящей из ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, с водой в любых соотношениях в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С ацилируют активированным эфиром (ab5-1) ПЭГ-карбоновой кислоты, в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола продукт осаждают диэтиловым эфиром; соединение (ab6') действием гидроксилсодержащего соединения R-OH, выбранного из Nгидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пентахлорфенола или пентафторфенола, в присутствии карбодиимида (CD), такого как циклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид,переводят в соответствующий активированный эфир (ab7-1), в котором R обозначает остаток гидроксилсодержащего соединения, выбранного из N-гидроксисукцинимида, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола,пентахлорфенола или пентафторфенола и активированный эфир (ab7-1) выделяют осаждением диэтиловым эфиром; соединение (ab7-1) подвергают гидразинолизу избытком гидразингидрата в водной, водноорганической или органической среде с образованием соединения общей формулы (II) соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочноземельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромистоводородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10 С с удалением избытка азотистой кислоты добавлением азида щелочного металла по окончании реакции; при этом в указанных выше формулах (al), (bl), (ab2)-(ab7-l) и (II) значения а и b такие, как определено в п.1. 8. Способ получения линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) по п.1, характеризующийся тем, что монометоксиполиэтиленгликоль (al) алкилируют соответствующим алкиловым эфиром (b1) -галогенкарбоновой кислоты в среде безводного органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из бензола, толуола, ксилола, тетрагидрофурана, диоксана, безводного трет-бутанола, в присутствии основания В, выбранного из группы, состоящей из щелочного металла,амида щелочного металла, алкоголята щелочного металла или бутиллития, в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от 0 до 100 С или при кипении органического растворителя с образованием соответствующего ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) где Alk выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, втор-бутила или трет-бутила, а уходящей группой X является Cl, Br или I, и продукт выделяют осаждением диэтиловым эфиром; сложноэфирную группу ПЭГ-карбоксиэфира (ab2) подвергают щелочному гидролизу в атмосфере азота или аргона водным раствором щелочи, выбранной из гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов или их смесей полученный продукт подкисляют для получения ПЭГ-карбоновой кислоты (ab4) и образовавшуюся ПЭГ-карбоновую кислоту выделяют из водного раствора экстракцией хлорсодержащим растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, трихлорэтилена, хлороформа,тетрахлорметана, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, затем ПЭГ-карбоновую кислоту(ab4) в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100 С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab5-2) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром; фенилаланин в атмосфере азота или аргона в диапазоне температур от -10 до 30 С в водной, водноорганической или в органической среде, где органическая среда выбрана из группы, состоящей из диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола, а водноорганическая среда является смесью органической среды с водой в любых соотношениях, в присутствии основания, выбранного из гидроксидов, карбонатов или гидрокарбонатов щелочных и щелочноземельных металлов, оксида или гидроксида магния, триэтиламина или их смесей, ацилируют хлорангидридом (ab5-2) ПЭГ-карбоновой кислоты и продукт осаждают диэтиловым эфиром; соединение (ab6') в атмосфере азота или аргона при температуре от -10 до 100 С обработкой избытком тионилхлорида в органическом безводном растворителе, выбранном из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, или без такового превращают в хлорангидрид (ab7-2) который выделяют осаждением диэтиловым эфиром, соединение (ab7-2) подвергают гидразинолизу избытком гидразингидрата в водной, водно-органической или органической среде с образованием соединения общей формулы (II) соединение (II) выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода, с последующим осаждением диэтиловым эфиром, которое выделяют экстракцией хлорированным растворителем, выбранным из дихлорметана, хлороформа, трихлорэтилена, тетрахлорида углерода или их смесей, с последующим осаждением диэтиловым эфиром; и соединение (II) превращают в линейный ацилазидный пегилирующий агент общей формулы (I) обработкой избытком азотистой кислоты, полученной смешением нитрита щелочного или щелочно- 26023360 земельного металла и кислоты, выбранной из серной кислоты, хлористо-водородной кислоты, бромистоводородной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты или их смесей, при пониженной температуре в интервале от -5 до 10 С с удалением избытка азотистой кислоты, добавлением азида щелочного металла по окончании реакции; при этом в указанных выше формулах (a1), (b1), (ab2)-(ab7-2) и (II) значения а и b такие, как определено в п.1. 9. Способ получения пегилированного интерферона -2b (IFN -2b), характеризующийся тем, что способом по любому из пп.2-8 готовят раствор линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I), затем к раствору IFN -2b в фосфатном буфере с рН 8,0-8,7 при 0-5 С добавляют 4-5 кратный мольный избыток раствора линейного ацилазидного пегилирующего агента общей формулы (I) где а - целое число от 100 до 1800 иb - целое число от 1 до 9,с молекулярной массой от 5 до 80 кДа, по достижении степени превращения IFN -2b 70-85% реакцию останавливают прибавлением избытка глицина, реакционную смесь разбавляют в 5-15 раз, устанавливают значение рН 4,5-5,5, требуемое для хроматографического разделения продуктов на CN-сефарозе, после чего проводят градиентное элюирование от 0,1 до 0,8 М NaCl, отбирают фракции, которые анализируют обращенно-фазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГ-IFN -2b, по результатам которого определяют целевые фракции, которые далее очищают до степени, достаточной для приготовления лекарственного препарата.
МПК / Метки
МПК: A61K 47/48, C07K 14/715
Метки: агент, линейный, интерферона, пегилированного, пегилирующий, способ, ацилазидный, получения
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/28-23360-linejjnyjj-acilazidnyjj-pegiliruyushhijj-agent-sposob-ego-polucheniya-i-sposob-polucheniya-pegilirovannogo-interferona.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Линейный ацилазидный пегилирующий агент, способ его получения и способ получения пегилированного интерферона</a>
Разветвленный ацилазидный пегилирующий агент, способ его получения и способ получения пегилированного интерферона
Номер патента: 23323
Опубликовано: 31.05.2016
Авторы: Маркова Инна Николаевна, Маркова Елена Алексеевна, Гапонюк Полина Петровна, Гапонюк Петр Яковлевич, Марков Илья Александрович
МПК: A61K 47/48, C07K 14/715
Метки: пегилирующий, способ, агент, ацилазидный, получения, пегилированного, интерферона, разветвленный
Формула / Реферат:
1. Разветвленный ацилазидный пегилирующий агент (ПЭГ-агент) общей формулы (I)где n - целое число в интервале от 200 до 950;q - целое число в интервале от 1 до 5;m - целое число в интервале от 1 до 5.2. Способ получения разветвленного ацилазидного пегилирующего агента (ПЭГ-агента) общей формулы (I)где n - целое число в интервале от 200 до 950;q - целое число в интервале от 1 до 5;m - целое число в интервале от 1 до 5,характеризующийся тем, что...
Способ получения гликозилированного интерферона бета
Номер патента: 15901
Опубликовано: 30.12.2011
Авторы: Фишер Дина, Бернар Ален, Дюкоммен Поль, Росси Мара
МПК: C07K 1/20, C07K 1/18, C07K 1/22...
Метки: интерферона, гликозилированного, beta, получения, способ
Формула / Реферат:
1. Способ получения гликозилированного рекомбинантного интерферона бета человека, включающий стадию культивирования клетки, продуцирующей интерферон бета человека, в бессывороточной среде, где бессывороточная среда содержитот приблизительно 10 до приблизительно 30 мМ HEPES, предпочтительно 20 мМ HEPES;от приблизительно 0,5 до приблизительно 3 мМ пролина, предпочтительно приблизительно 1 мМ пролина;от приблизительно 5500 до приблизительно 7000...
Полимерный конъюгат модификаций интерферона – β, фармацевтические продукты на его основе и способ их получения
Номер патента: 8866
Опубликовано: 31.08.2007
Авторы: Мартинез Алекса Л., Сейфер Марк Г.П., Шермэн Мэрри Р., Уильямс Л.Дэвид
МПК: A61K 38/21
Метки: beta, фармацевтические, получения, основе, модификаций, продукты, способ, полимерный, интерферона, конъюгат
Формула / Реферат:
1. Способ повышения биологической активности негликозилированного интерферона-b, отличающийся тем, что осуществляют селективное связывание одного или более синтетических водорастворимых полимеров с аминоконцевой аминокислотой указанного интерферона-b, которая находится в отдалении от его рецепторсвязывающего домена(ов). 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную биологическую активность измеряют с использованием анализа на клеточных...
Бета-нуклеирующий агент для полипропилена и способ его получения
Номер патента: 14524
Опубликовано: 30.12.2010
Авторы: Вольфшвенгер Йоханнес, Галяйтнер Маркус
МПК: C07C 51/41, C07C 55/16, C07C 55/02...
Метки: способ, агент, полипропилена, бета-нуклеирующий, получения
Формула / Реферат:
1. Способ получения b-нуклеирующего агента путем осуществления твердофазной реакции между соединением металла Группы II с двухосновной органической кислотой при температуре 120°С или выше, причем процесс проводят в отсутствие любых растворителей или жидких (расплавленных) материалов, таких как жидкий (расплавленный) полимерный материал.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что соединение металла Группы II представляет собой соединение кальция.3....
Латексный агент, снижающий сопротивление течению, способ его получения
Номер патента: 13163
Опубликовано: 26.02.2010
Авторы: Андерсон Винсент С., Смит Кеннет У., Харрис Уильям Ф., Миллиган Стюарт Н., Джонстон Рэй Л.
МПК: C09K 3/00
Метки: получения, сопротивление, агент, снижающий, латексный, течению, способ
Формула / Реферат:
1. Латексный агент, снижающий сопротивление течению, включающий:(a) однородную фазу и(b) множество частиц высокомолекулярного полимера, диспергированных в указанной однородной фазе, гдеуказанные полимерные частицы получены эмульсионной полимеризацией,указанный латексный агент, снижающий сопротивление течению, имеет константу скорости растворения в углеводороде, составляющую по меньшей мере 0,004 мин-1 в керосине при 20°С;указанная однородная...
Предыдущий патент: Композиции для защиты древесины, пригодные для обработки грибов, устойчивых к меди
Следующий патент: Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа a/h5n1
Случайный патент: Прибор для обеззараживания водных сред