Способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа а/h1n1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЦЕЛЬНОВИРИОННОЙ ГИДРООКИСЬАЛЮМИНИЕВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГРИППА А/H1N1 Хайруллин Берик Мухитович,Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич,Табынов Кайсар Казыбаевич,Червякова Ольга Викторовна,Рыскельдинова Шолпан Жанбырбаевна, Асанжанова Нурика Нарынбековна, Кожамкулов Еркин Муратханович, Инкарбеков Дулат Амангельдиевич, Мамбеталиев Муратбай, Табынов Кайрат Казыбаевич (KZ) Изобретение относится к медицинской биотехнологии и представляет собой способ получения инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа A/H1N1 с гидроокисью алюминия из рекомбинантного штамма NIBRG-121xp, полученного методом обратной генетики в Национальном институте биологических стандартов и контроля (NIBSC, Великобритания) и представленного по линии Всемирной организации здравоохранения НИИПББ КН МОН РК для разработки пандемической вакцины. Сущность изобретения заключается в том, что для получения инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа A/H1N1 с гидроокисью алюминия используется рекомбинантный штамм NIBRG-121 хр вируса гриппа,который культивируется в 10-11-суточных куриных эмбрионах, подвергается химической инактивации, комбинированной схеме очистки и концентрирования и стерилизующей фильтрации с добавлением гидроокиси алюминия. Изобретение обеспечивает получение пандемической вакцины для профилактики вируса гриппа A/H1N1 с высокой степенью очистки вируса и соответственно с улучшенной безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является технологичным и экономичным.development, 06.08.2009, [он-лайн], [найдено 03.09.2012]. Найдено из Интернет URL:http://(71)(73) Заявитель и патентовладелец: РЕСПУБЛИКАНСКОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ НА ПРАВЕ ХОЗЯЙСТВЕННОГО ВЕДЕНИЯ"НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ" КОМИТЕТА НАУКИ МИНИСТЕРСТВА ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ (KZ) Изобретение относится к медицинской биотехнологии и представляет собой способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа A/H1N1 из рекомбинантного штамма NIBRG-121xp, полученного методом обратной генетики в Национальном институте биологических стандартов и контроля (NIBSC, Великобритания) и представленного по линии Всемирной организации здравоохранения НИИПББ НЦБ КН МОН РК для разработки пандемической вакцины. Известен способ получения пандемической вакцины "Celvapan" (Baxter, Чешская Республика/Австрия), инактивированной цельновирионной против гриппа A/H1N1 из вируса дикого типаA/California/7/2009 (H1N1)v, где вирусная биомасса нарабатывается в перевиваемой линии клеток Vero(клетки почки зеленой мартышки), далее инактивируется формалином в конечной концентрации 0,05%,при температуре и рН реакционной среды 37C и 7,0-7,6 соответственно, в течение 3 суток с последующим ультрафиолетовым облучением. После чего инактивированная вирусная суспензия подвергается очистке и концентрированию посредством ультрацентрифугирования на линейном градиенте сахарозы 10-50%, ультра/диафильтрации и стерилизации через фильтры диаметром пор 0,22 мкм. Полученный очищенный концентрат в зависимости от весового содержания гемагглютинина (реакция одиночной радиальной иммунодиффузии) разводится буферным солевым раствором (БСР, рН 7,2) со стабилизатором до вакцинных параметров. Адъювант и консервирующее вещество в вакцину не добавляют. Приготовленная вышеизложенным способом вакцина с содержанием гемагглютинина 2 мкг/0,2 мл у двукратно подкожно привитых мышей интервалом в 21 день формирует иммунитет напряженностью титров антител в РТГА с гомологичным антигеном 1:145. [Kistner О., Howard K., Spruth M. et al. Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses //Vaccine. - 2007. - Vol. 25(32).-P. 6028-6036]. Наиболее значимый недостаток представленного способа заключается в использовании патогенного для людей производственного вируса, требующего соблюдения максимального уровня биологической безопасности на производстве, сложного процесса инактивации вируса и отсутствии в препарате адъюванта, необходимого для формирования быстрого и продолжительного иммунитета у привитых людей в период пандемии. Существуют также способ получения пандемической вакцины "Fluval P" (Omninvest, Венгрия),инактивированной цельновирионной сорбированной против гриппа A/H1N1 из рекомбинантного штаммаNIBRG-121xp, полученного в Национальном институте биологических стандартов и контроля (NIBSC,Великобритания) методом обратной генетики из эпидемического вируса A/California/7/2009 (H1N1) и высокорепродуктивного штамма A/PR/8/34 (H1N1). Согласно указанному способу вирусная суспензия нарабатывается в 10-11-суточных куриных эмбрионах, очищается и концентрируется посредством осветления через картонные фильтры, ультрацентрифугирования на линейном градиенте сахарозы и стерилизующей фильтрации на мембранных фильтрах диаметром пор 0,22 мкм. Полученный очищенный концентрат инактивируется формалином в конечной концентрации 0,025%, при температуре и рН реакционной среды 4C и 7,0-7,6 соответственно в течение 7 суток. Далее инактивированный вирусный концентрат разводится в зависимости от весового содержания гемагглютинина (SDS-PAGE) буферным солевым раствором (БСР, рН 7,2) до вакцинных параметров, объединяется с раствором фосфата алюминия таким образом, чтобы концентрация ионов алюминия (Al+3) в препарате составляла 0,33 мг/0,5 мл и перемешивается для сорбции при 4-6C в течение 1 ч. В качестве консервирующего вещества в вакцину вносится тиомерсал (мертиолят) из расчета 0,1 мг/мл. Приготовленная по вышеизложенному способу вакцина с содержанием гемагглютинина 2,5 мкг/0,2 мл у двукратно подкожно привитых мышей с интервалом в 21 день формирует иммунитет напряженностью титров антител в реакции торможении гемагглютинации (РТГА) с гомологичным антигеном 1:460Union // Euro Surveill. - 2009. - Vol. 14 (41).-P. 19361-68]. Существенным недостатком способа является низкая производительность использованного метода очистки и концентрирования вируса и несовершенность метода сорбции. Предлагаемый способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа A/H1N1 основан на использовании рекомбинантного штамма NIBRG-121xp, полученного методом обратной генетики в NIBSC (Великобритания) из эпидемического штаммаA/California/07/2009 (H1N1) и высокорепродуктивного штамма донора A/PR/8/34 (H1N1) и представленного по линии ВОЗ НИИПББ НЦБ КН МОН РК для разработки пандемической вакцины. Сущность способа заключается в том, что рекомбинантный штамм NIBRG-121xp культивируется в 10-11-суточных куриных эмбрионах при 34C в течение 72 ч, наработанная вирусная суспензия осветляется через 8-слойные марлевые фильтры, инактивируется формалином в конечной концентрации 0,05%,вначале при 42C в течение 60 ч, далее при 371C в течение 12 ч при соблюдении режима постоянного перемешивания. Очистка и концентрирование инактивированной вирусной суспензии проводится поэтапно, вначале осветляется через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм, далее концентрируется на ультрафильтрационной установке Millipore Pelliconcassette system (Франция) и диализе про-1 021095[0,15 М натрий хлористый; 0,01 М ФБР рН 7,4; 0,001 М ЭДТА]. Полученный вирусный концентрат дополнительно очищается с помощью гель-фильтрации на колонках с сефарозой CL-6B, после чего стерилизуется через каскад мембранных фильтров с диаметром пор АР 20 - 0,45-0,22 мкм. Далее очищенный вирусный концентрат в цельном или разведенном до вакцинных параметров виде объединяют в асептических условиях с рабочим раствором гидроокиси алюминия (содержание ионов Al+3 2 мг/мл) в соотношении 1:1, перемешивают лабораторным гомогенизатором Т 25 basic ULTRA-TURRAX, IKA (Германия) в течение 3 мин при 3000 об/мин. Полученную смесь после гомогенизации переливают в специальные стаканы и инкубируют при температуре 62C в течение 24 ч при постоянном перемешивании (60-80 об/мин) с помощью спиннера "Techne" (Франция). После окончания срока инкубации смесь фасуют во флаконы нужного объема и контролируют качество на соответствие нормативному документу. Показатель полноты сорбции антигена на гидроокиси алюминия при соблюдении вышеуказанного режима составления превышает 90%. Приготовленная по предлагаемому способу вакцина с содержанием гемагглютинина 3 мкг/0,2 мл при двукратной внутрибрюшинной вакцинации мышей с интервалом 7 суток формирует у них иммунитет напряженностью 1:425 в РТГА. При контрольном заражении (интраназально под легким эфирным наркозом) вакцинированных мышей эпидемическим вирусом A/California/07/2009 (H1N1), адаптированного мышам в дозе 15 LD50/0,03, все животные оставались живыми и не проявляли признаков какой-либо болезни в течение 14-дневного срока наблюдения. Предлагаемый способ отличается от аналогов, в том числе от прототипа тем, что в технологии изготовления вакцины применяются оптимальные режимы формалиновой инактивации вируса, составления вакцины, комбинированная схема очистки и концентрирования вируса посредством хроматографических и фильтрационных методов. Изобретение выполнимо в условиях научно-производственных объединений при наличии рекомбинантного штамма NIBRG-121xp вируса гриппа, соответствующего технологического оборудования и соблюдения предлагаемого режима приготовления вакцины. Эффективность и воспроизводимость предлагаемого способа получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа A/H1N1 из рекомбинантного штаммаNIBRG-121xp вируса гриппа подтверждена при приготовлении трех производственноэкспериментальных серий этого препарата в НИИПББ НЦБ КН МОН РК, в последующем прошедших с положительными результатами доклинические испытания специфической активности и безопасности в РГП "Национальный центр экспертизы лекарственных средств", г. Алматы, Республика Казахстан, и Научно-исследовательском институте гриппа СЗО РАМН РФ, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа A/H1N1 с гидроокисью алюминия, включающий культивирование рекомбинантного штамма NIBRG-121xp вируса гриппа в 10-11-суточных куриных эмбрионах, химическую инактивацию, комбинированную схему очистки и концентрирования, стерилизующую фильтрацию вируса, добавление гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что до этапа очистки осветленную аллантоисную суспензию вакцинного вируса инактивируют формалином в конечной концентрации 0,05% сначала при температуре от 2 до 6C в течение 60 ч, затем при температуре от 36 до 38C в течение 12 ч, после чего полученную суспензию очищают на мембранных фильтрах и концентрируют с помощью ультра/диафильтрации в тангенциальном потоке против 10 объемов буфера, включающего 1,0 М натрий хлористый; 0,01 М ФБР рН 7,4; 0,001 М ЭДТА и 6 объемов буфера, включающего 0,15 М натрий хлористый; 0,01 М ФБР рН 7,4; 0,001 М ЭДТА, а также гель-фильтрации на колонках с сефарозой.