Способ микробиального производства ценного соединения

012617 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области производства ценного соединения, предпочтительно белка, или вторичного метаболита или биомассы как таковой микробиальным культивированием. Уровень техники Культивирование микроорганизмов для производства ценного соединения обычно может быть выполнено при условиях, при которых по меньшей мере одно питательное вещество подается в культуру в количествах, приводящих к ограниченному росту, особенно в фазе образования продукта в процессе культивирования. Как правило, лимитированное количество питательного вещества приводит к недостатку азота, углерода или обоих компонентов у культивируемого микроорганизма. Вследствие возрастающей промышленной важности производства белков и других ценных соединений, с одной стороны, и низкого выхода биомассы, образованной на потребленный грамм сахара или моль кислорода, с другой стороны, все еще существует необходимость в разработке улучшенного способа производства белков и других ценных соединений из микроорганизмов. Настоящее изобретение обеспечивает улучшенный способ производства белков и других ценных соединений с высокой эффективностью. Краткое описание чертежей Фиг. 1: выход биомассы на потребленный кислород (Yxo) в зависимости от удельной скорости роста. Фиг. 2: выход биомассы на потребленный сахар (Yxs) в зависимости от удельной скорости роста. Фиг. 3: выход фитазы на потребленный кислород (Ypo), произвольные единицы измерения в зависимости от удельной скорости роста. Фиг. 4: выход фитазы на потребленный сахар (Yps), произвольные единицы измерения в зависимости от удельной скорости роста. Раскрытие сущности изобретения Согласно первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ производства ценного соединения культивированием микроорганизма, включающий культивирование микроорганизма в среде, в которой обеспечивают избыток всех питательных веществ в течение всего периода культивирования и питание культуры надлежащим количеством кислорода для ее поддержания в условиях ограниченной подачи кислорода. Состав питательной среды, которая используется для культивирования микроорганизма, не имеет для изобретения решающего значения при условии, что все питательные вещества подаются в избытке в течение всего периода культивирования. Термин "подается в избытке" подразумевает, что все питательные вещества подаются в достаточном количестве, чтобы избежать установления лимитирования в росте микроорганизма. В этом контексте питательные вещества могут быть поданы только партией, т.е. поданы только в исходную среду, или могут дополнительно подаваться в культуру в течение процесса культивирования. Предпочтительно,чтобы одно или несколько питательных веществ вводились в культуру после подачи в исходную среду. Более предпочтительно, чтобы вводимые питательные вещества представляли собой, по меньшей мере,источник углерода и/или азота. Очевидно, питательные вещества не должны подаваться в таком количестве, которое может вызвать ингибирующие или токсические эффекты. Согласно изобретению соответствующее количество кислорода подается в культуру, чтобы поддержать культуру в условиях лимитирования по кислороду. Термин соответствующее количество кислорода определяется как количество кислорода, поданного в культуру, которое обеспечивает условие лимитирования кислорода в течение культивирования. В контексте изобретения OTR (скорость переноса кислорода) - скорость, с которой кислород переносится из газовой фазы в жидкую фазу (культуральный бульон).OTR выражается как количество кислорода в единицу времени (например, моль/ч). OTR удобно определять как разность между количеством кислорода, входящего в ферментер, и количеством кислорода,измеренного на выходе газа. Обычно кислород будет подаваться в виде воздуха. Однако в культуральный бульон может вводиться чистый кислород и/или воздух, обогащенный кислородом, и/или отдельные потоки воздуха и кислорода. В контексте изобретения OUR (скорость потребления кислорода) - скорость, с которой микроорганизм потребляет кислород, поданный в культуральный бульон. Чтобы поддержать бульон в условиях ограниченного количества кислорода согласно изобретению,количество кислорода, поданного в культуральный бульон, не должно превышать количество кислорода,потребляемое микроорганизмом. Другими словами, OTR должна быть, по существу, идентична OUR. Термин "по существу, идентична" означает, что OTR идентична OUR с предпочтительным отклонением плюс или минус 10%, более предпочтительно 5%. Предпочтительно, чтобы в культуру подавалось соответствующее количество кислорода, с тем чтобы далее обеспечить как можно более высокое значениеOTR, т.е. соответствующее, например, конфигурации ферментера и/или концентрации кислорода в подаваемом газе, при условии немедленного потребления кислорода микроорганизмом. Однако для специалиста в данной области должно быть ясно, что процесс культивирования может быть осуществлен в ус-1 012617 ловиях лимитированного количества кислорода при значении OTR, которое ниже максимально достигаемого значения OTR и составляет, например, 80 или 90% от максимального значения OTR. Когда OTR, по существу, идентичен OUR, концентрация растворенного кислорода в культуральном бульоне обычно будет постоянной и если ограничение по кислороду контролирует культивирование,количество растворенного кислорода будет нулевым или близким к нулю. Предпочтительный способ установления наличия лимитирования по кислороду в процессе культивирования согласно изобретению заключается в определении эффекта увеличения подачи питательных веществ на OTR. Если увеличение подачи питательных веществ не сопровождается увеличением OTR,лимитирование кислорода существует. Наиболее предпочтительный способ установления существования лимитирования по кислороду в процессе культивирования согласно изобретению заключается в проверке влияния на OTR, например в результате незначительного уменьшения скорости вращения перемешивающего устройства (например, на 5%). Если OTR также уменьшается, то лимитирование кислорода существует. Если OTR не уменьшается и/или снижается только концентрация растворенного кислорода,лимитирование по кислороду не существует. Меры, которые могут быть предприняты для модулирования (изменения) OTR, обычно известны специалисту в данной области. Предпочтительно, если условия модулируемой скорости переноса кислорода (OTR) установлены регулировкой по меньшей мере одного из следующих параметров, выбранных из группы, состоящих из увеличения скорости перемешивания, увеличения аэрации, увеличения избыточного давления, увеличения процентного содержания кислорода во входящем потоке газа (обогащение кислородом), уменьшения массы бульона, уменьшения общей вязкости бульона. Чтобы модулировать общую вязкость бульона, могут предприниматься меры, касающиеся состава среды, разведения среды,изменения температуры, импульсной подачи питательных веществ с паузой (например, углеводов согласно WO 03/029439). Предпочтительно, чтобы общая вязкость бульона регулировалась изменением температуры бульона на уровне 2-6 С выше или ниже температуры, при которой происходит оптимальный рост. Более предпочтительно, если общая вязкость бульона уменьшается при увеличении температуры бульона на 2-6 С выше уровня, при котором происходит оптимальный рост, в частности для таких мицелиальных грибов,как Aspergillus niger. Разумеется, что при необходимости могут быть предприняты противоположные меры для уменьшения переноса кислорода. В этом случае общая вязкость бульона увеличивается при уменьшении температуры бульона на 2-6 С ниже температурного значения, обеспечивающего оптимальный рост. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения микробную культуру поддерживают в условиях лимитирования по кислороду в результате регулярного измерения OTR, например, каждые 1 или 2 ч, и коррекции OTR (например, изменяя скорость мешалки) в зависимости от измеренного значения OTR относительно заданного значения OUR. Заданное значение OUR будет зависеть от культивируемого микроорганизма и схемы процесса культивирования, обычно включающей, например, тип камеры культивирования, конфигурацию мешалки, тип культуральной среды и условия подачи питательного вещества. В связи с этим заданное значениеOUR для конкретного процесса культивирования устанавливается эмпирически, путем определения значения OUR, которое соответствует как можно более высокому значению OTR, при условии, что перенесенный кислород немедленно потребляется микроорганизмом. Поддержание культуры в условиях лимитированного количества кислорода может быть реализовано во всем процессе культивирования. Предпочтительно, если культура поддерживается в условиях лимитирования по кислороду в течение фазы образования продукта. В этом случае условие лимитирования по кислороду устанавливается и поддерживается после того, как произошел достаточный рост микроорганизма. Специалисту в данной области ясно, что минимальная плотность биомассы является обязательным требованием для того, чтобы происходило лимитирование по кислороду, т.е. лимитирование по кислороду устанавливается после достаточного роста. Другими словами, лимитирование по кислороду предпочтительно устанавливается и поддерживается в продукционной фазе процесса культивирования,т.е. в стадии производства ценного соединения (полезного вещества). Как правило, способ микробиального культивирования может быть разделен на фазу роста, направленную на образование биомассы и продукционную стадию, направленную на производство ценного соединения. Специалист в данной области должен понимать, что две стадии культивирования могут не быть строго разделены во времени, но в некоторой степени могут перекрываться. Кроме того, специалист в данной области должен понимать,что на любой из стадий культивирования микроорганизма продукция ценного соединения будет иметь пролонгированный характер. Среда культивирования, необходимая для осуществления процесса культивирования согласно изобретению, не имеет решающего значения. Питательные вещества добавляются в процесс согласно потребностям рассматриваемого организма при условии, что питательные вещества вводятся в избытке. В контексте изобретения питательное вещество не является кислородом. Удобно, когда среда культивирования содержит источник углерода, источник азота, также как дополнительные вещества, требуемые для роста микроорганизма и/или образования ценного соединения.-2 012617 Например, дополнительные вещества могут быть необходимы для стимулирования продукции ценного соединения. Примеры соответствующих источников углерода, известных специалисту в данной области, включают глюкозу, мальтозу, мальтодекстрины, сахарозу, гидролизованный крахмал, крахмал, мелассу, масла. Примеры источников азота, известных специалисту в данной области, включают соевую муку, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, аммиак, аммониевые соли, нитратные соли, мочевину. Примеры дополнительных веществ включают фосфат, сульфат, микроэлементы и/или витамины. Общее количество углеродного и азотного источника добавляемого в процессе культивирования согласно изобретению может изменяться, например, в зависимости от потребностей микроорганизма и/или продолжительности процесса культивирования. Соотношение между количеством источников углерода и азота в процессе культивирования может значительно меняться, в связи с чем одним из определяющих факторов для оптимального соотношения между источниками углерода и азота является элементный состав образующегося продукта. Дополнительные вещества, необходимые для роста микроорганизма и/или для образования продукта, такие как фосфат, сульфат или микроэлементы, могут быть добавлены в количествах, которые могут варьироваться для микроорганизмов различных классов, т.е. для грибов, дрожжей и бактерий. Кроме того, количество добавляемого дополнительного вещества, может быть определено типом образующегося ценного соединения. Как правило, количество компонентов среды, необходимых для роста микроорганизма, может быть определено относительно количества источника углерода, используемого в культивировании, так как количество образованной биомассы будет, прежде всего, определяться количеством используемого источника углерода. Способ культивирования согласно изобретению предпочтительно осуществляют в промышленном масштабе. Промышленный масштаб процесса, как понимают, охватывает процесс культивирования в масштабе объема ферментера, большего или равного 0,01 м 3, предпочтительно большего или равного 0,1 м 3, предпочтительно большего или равного 0,5 м 3, предпочтительно большего или равного 5 м 3, предпочтительно большего или равного 10 м 3, более предпочтительно большего или равного 25 м 3, более предпочтительно большего или равного 50 м 3, более предпочтительно большего или равного 100 м 3,наиболее предпочтительно большего или равного 200 м 3. Любой микроорганизм, который продуцирует ценное соединение (полезное веществ) или который используется как биомасса, может быть подвергнут культивированию согласно способу изобретения,например бактерии, дрожжи и грибы. Так, например, штаммы микроорганизмов, которые являются подходящими для культивирования согласно изобретению, включают штаммы грибов, такие какSaccharomyces, Pichia, Phaffia, или штаммы Kluyveromyces и штаммы бактерий, такие как Bacillus,Escherichia или штаммы Actinomycete. Мицелиальные организмы особенно выгодны при применении лимитирования по кислороду в процессе культивирования согласно изобретению. Мицелиальные организмы могут быть нитчатыми бактериями, как Actinomycetes, предпочтительно Streptomyces, или могут быть мицелиальными грибами. Мицелиальные штаммы грибов без конкретных ограничений включают штаммы Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola,Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Piromyces, Schizophyllum,Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, и Trichoderma. Предпочтительные мицелиальные грибные клетки принадлежат роду Aspergillus или Trichoderma и более предпочтительно - виду Aspergillus Niger, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae или Trichoderma reesei. Наиболее предпочтительные виды Aspergillus Niger - Aspergillus Niger CBS513.88 и его производные. Некоторые штаммы мицелиальных грибов легко доступны для общественного пользования в ряде коллекций культур, таких как the American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung vonAspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576,ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 или ATCC 48272,Trichoderma reesei ATCC 26921, или ATCC 56765, или ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC 11906,Chrysosporium lucknowense ATCC44006 и их производные. Штамм микроорганизма, подвергаемый обработке согласно способу изобретения, может представлять собой встречающийся в природе микроорганизм или штамм микроорганизма, полученный из любого подходящего родственного штамма с использованием технологии мутагенеза любого вида, например классического процесса мутагенеза, или технологии генной инженерии. Ценное соединение, произведенное микроорганизмом, подвергаемым обработке согласно способу изобретения, предпочтительно представляет собой полипептид, например фермент или фармацевтически-3 012617 активный белок. Однако способ также подходит для производства метаболита, например каротиноида или витамина, или для производства биомассы как таковой. Ценное соединение может быть закодировано одиночным геном или серией генов, составляющих биосинтетический или метаболический путь, или может являться прямым результатом образования продукта одиночного гена или продуктов серии генов. Ценное соединение может быть нативным или гетерологичным относительно микроорганизма. Термин "гетерологичное соединение" определен в настоящем документе как соединение, которое не является нативным по отношению к клетке; или нативное соединение, в котором структурные модификации были произведены, чтобы изменить нативное соединение. Ценное соединение, произведенное по изобретению, может быть полипептидом. Полипептид может представлять собой любой полипептид, обладающий биологической активностью, представляющей интерес. Термин "полипептид", как предполагается здесь, не относится к определенной длине закодированного продукта и поэтому охватывает пептиды, олигопептиды, и белки. Термин "полипептид" также охватывает два или несколько полипептидов, объединенных друг с другом с образованием закодированного продукта. Полипептиды также включают гибридные полипептиды, которые содержат комбинацию частичной или полной полипептидной последовательности, полученной по меньшей мере из двух различных полипептидов, в которой один или больше могут быть гетерологичными к нитевидной грибной клетке. Полипептиды далее включают встречающиеся в природе аллельные и генноинженерные вариации вышеупомянутых полипептидов и гибридных полипептидов. Полипептид может быть коллагеном или желатином либо их вариантом или гибридом. Полипептид может представлять собой антитело или части этого антиген, фактор свертываемости крови, фермент, гормон или гормональный вариант, рецептор или его части, регуляторный белок, структурный белок, репортерный или транспортный белок, белок, участвующий в процесс секреции, белок, участвующий в процесс свертывания, белок, участвующий в укладке других белков (шаперон), транспортер аминокислоты пептида, гликозилирующий фактор, фактор транскрипции, синтетический пептид или олигопептид, внутриклеточный белок. Внутриклеточный белок может быть ферментом, таким как протеаза, церамидаза, эпоксидный гидролитический фермент,аминопептидаза, ацилаза, альдолаза, гидроксилаза, аминопептидаза, липаза. Полипептид может быть ферментом, выделяемым внеклеточно. Такие ферменты могут принадлежать группам оксидоредуктазы,трансферазы, гидролитического фермента, лиазы, изомеразы, лигазы, каталазы, целлюлозы, хитиназы,кутиназы, дезоксирибонуклеазы, декстраназы, эстеразы. Фермент может быть карбоксигидразой, например целлюлазой, такой как эндоглюканаза, -глюканаза, целобиогидролаза или -глюкозидаза, гемицеллюлазой или пектиназой, такой как ксиланаза, ксилозидаза, маннаназа, галактаназа, галактозидаза, эстераза метила пектина, лиаза пектина, пектат лиазы, эндополигалактуроназа, экзополигалактороназа рамногалактороназа, арабиназа, арабинофуранозидазой, арабиноксилан гидролитическикими ферментами,галактороназой, лиазой, или амилазой; гидролитическим ферментом, изомеразой или лигазой, фосфатазой, такой как фитаза, эстеразой, такой как липаза, протеолитическим ферментом, оксидоредуктазой,такой как оксидазой, трансферазой, или изомеразой. Фермент может быть фитазой. Фермент может быть аминопептидазой, амилазой, карбоксигидразой, карбоксипептидазой, эндопротеазой, металлопротеазой,каталазой протеазы серина, хитиназой, кутиназой, циклодекстрином, дезоксирибонуклеазой, эстеразой,-галактозидазой, -галактозидазой, глюкоамилазой, -глюкозидазой, -глюкозидазой, галопероксидазой, протеолитическим ферментом, инвертазой, лакказой, липазой, маннозидазой, мутаназой, оксидазой,пектиназой, пероксидазой, фосфолипазой, полифенолоксидазой, рибонуклеазой, трансглутаминазой, дезаминазой, аспарагиназой, оксидазой глюкозы, оксидазой гексозы, монооксигеназой. Ценное соединение, полученное согласно способу изобретения, может быть полисахаридом. Полисахарид может быть любым полисахаридом, без конкретных ограничений включающим мукополисахарид (например, гепарин и гиалуроновую кислоту), и полисахаридом, содержащим азот (например, хитин). В более предпочтительном варианте полисахарид представляет собой гиалуроновую кислоту. Термин "метаболит" охватывает как первичные, так и вторичные метаболиты; метаболит может быть любым метаболитом. Предпочтительный метаболит - лимонная кислота. Метаболит может быть закодирован одним или несколькими генами, например, путем реализации биосинтетического или метаболического путей. Первичные метаболиты являются продуктами первичного или общего метаболизма клетки, который связан с энергетическим метаболизмом, ростом и структурой. Вторичные метаболиты - продукты вторичного метаболизма (см, например, R.В. Herbert, TheBiosynthesis of Secondary Metabolites, Chapman and Hall, New York, 1981). Первичный метаболит, полученный согласно способу изобретения, без конкретных ограничений может быть представлен аминокислотой, жирной кислотой, нуклеозидом, нуклеотидом, сахаром,триглицеридом или витамином. Вторичный метаболит, полученный согласно способу изобретения, без конкретных ограничений может быть представлен алкалоидом, кумарином, флавоноидом, поликетидом, хинином, стероидом, пептидом или терпеном. Вторичный метаболит может представлять собой антифидинг, аттрактант, бактерицид, фунгицид, гормон, инсектицид или родентицид. Способ культивирования согласно изобретению может быть осуществлен как периодический, по-4 012617 вторный периодический, подпитывающий периодический, повторный подпитывающий периодический или непрерывный процесс культивирования. В периодическом процессе все компоненты среды добавлены прямо в целом к среде перед началом процесса культивирования. В повторном периодическом процессе частичный сбор бульона, сопровождаемый частичным дополнением полной среды, необязательно повторяется несколько раз. В периодическом процессе с подпиткой часть веществ, необходимых для микробного роста и/или образования продукта, подаются в исходную среду, предпочтительно до начала процесса культивирования. В ходе процесса культивирования дополнительный источник углерода, источник азота и/или дополнительные вещества, по желанию, могут быть введены в процесс в виде одного потока или отдельных потоков каждого вещества. В периодическом процессе с повторной подпиткой или непрерывном процессе культивации полная исходная среда дополнительно подается в ходе культивирования. Исходная среда может быть подана в виде полного или отдельных потоков, например источника углерода и азота. В периодическом процессе с повторной подпиткой часть культурального бульона, содержащего биомассу, удаляется через определенные интервалы времени, тогда как в непрерывном процессе удаление части культурального бульона происходит непрерывно. Таким образом, процесс культивирования пополняется частью свежей среды,гарантирующей постоянный объем и/или массу бульона. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения применяется процесс с подпиткой или повторной подпиткой, в котором источник углерода и/или азота и/или дополнительные соединения подаются в процессе культивирования. Согласно более предпочтительному варианту источник углерода и/или азота подается в процессе культивирования. Еще один аспект изобретения затрагивает технологию производства и выделения целевого продукта из культурального бульона. Использование лимитирования по кислороду согласно способу изобретения упрощает технологию производства и выделения целевого продукта особенно из-за высокого выхода ценного соединения и низкого количества побочных продуктов. Технология производства и выделения целевого продукта может включать этапы как подготовки, так и выделения. Предпочтительно, чтобы ценное соединение, полученное кислородлимитирующим способом изобретения, выделялось из культурального бульона и/или формировалось в виде подходящей композиции. После окончания процесса культивирования ценный продукт может быть выделен из культурального бульона с использованием стандартной технологии, разработанной для выделения представляющего интерес ценного соединения. Таким образом, применяемая соответствующая технология производства и выделения целевого продукта зависит от природы и клеточной локализации ценного соединения и желательного уровня чистоты такого соединения. В типичном процессе регенерации биомасса отделяется от культивационной жидкости, например, с использованием центрифугирования или фильтрации. Далее ценное соединение выделяется из биомассы в том случае, когда ценное соединение накоплено внутри или связано с микробными клетками. Разумеется, что биомасса может быть использована как таковая. Иначе, когда ценное соединение экскретируется микробной клеткой, оно восстанавливается из культуральной жидкости. Биомасса и/или ценное соединение могут формироваться в виде жидкого или твердого продукта. Предпочтительно, чтобы ценное соединение, полученное согласно способу изобретения,выделялось из культурального бульона и/или формировалось в виде соответствующей композиции. Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующим примером, который не ограничивает объем притязаний изобретения. Пример. Промышленное производство фитазы Aspergillus niger.Aspergillus niger CBS513.88 сверхпродуцирующая фитаза была разработана и сконструирована согласно WO 98/46772. Рабочие банки клеток в количестве 1 мл хранились в пробирках при -80 С. Процедура инокуляции. Содержание одной пробирки было добавлено в предкультуральную среду: 2 л встряхиваемая колба с перегородками (20 г/л твердого кукурузного экстракта, 20 г/л глюкозы, рН 6,5 (с NaOH), 300 мл среды,паровая стерилизация в течение 30 мин при 121 С). Предшественника культуры выращивали в течение 40 ч при 34 С при встряхивании со скоростью 220 об/мин. Время может, конечно, быть адаптировано к конфигурации встряхиваемой колбы и жизнеспособности в пробирке. Непрерывные культуры (монокультуры). Среда состояла из смеси глюкозы и мальтодекстринов, а также солевой фракции. Солевая фракция удовлетворяла WO 98/37179, табл. 1, с. 12. Отклонения от этой таблицы были: MgSO47H2O 0,25 г/л,CaCl22H2O 0,22 г/л, (NH4)2SO4 6 г/л, лимонная кислота 1H2O 0,2 г/л (хелатирующий агент). Состав среды был идентичен для партии и подачи. Концентрация глюкозы была 22,5 или 45 г/л при лимитировании углерода или лимитировании кислорода соответственно, в то время как мальтодекстрины были 2,5 или 5,0 г/л соответственно. Среда была стерилизована паром в две стадии, одна из которых содержала сахара,а другая - хлорид кальция. рН фракции солевой среды был 4,5 (серная кислота) до стерилизации, и тот же самый рН поддерживался (серная кислота, аммиак) после соединения фракций в ферментере. Температу-5 012617 ра поддерживалась 34 С. Поток воздуха был 1,0 или 0,5 vvm (объем воздуха на объем бульона в минуту) при лимитировании углерода или лимитировании кислорода соответственно. Биореакторы были инокулированы 6% посевной культурой в разведении. Рабочий объем был 10 л. Для углеродлимитирующей ферментации DOT поддерживался при 20% от DOT бульона перед инокулированием. Термин "DOT"(содержание растворенного кислорода) определен как мера растворенного кислорода и выражается как процент растворенного кислорода при насыщении воздуха при атмосферном давлении, т.е. DOT 100% максимальное количество кислорода, которое может раствориться при атмосферном давлении. Контролирующая ферментация DOT - типичная углеродлимитирующая ферментация. Для кислородлимитирующей ферментации скорость переноса кислорода контролировалась (благодаря скорости перемешивания) при 80% значения, измеренного при лимитировании углерода для той же самой скорости разбавления, устанавливая таким образом лимитирование кислорода. Clerol использовался как противовспениватель при периодическом способе: 2 с каждые 30 мин в течение первых 24 ч, затем 2 с после каждого часа. Чтобы достичь устойчивого состояния, по меньшей мере 5 изменений объема были сделаны. Новая ферментация была выполнена для каждого устойчивого состояния. Выводы. Как можно увидеть из фиг. 1-4 (каждая точка в диаграммах представляет отдельное устойчивое состояние), лимитирование кислорода обеспечивает, очевидно, более высокие выходы биомассы на глюкозе и на кислороде по сравнению с лимитированием углерода. Более интересно, выходы фермента на глюкозе и на кислороде также увеличены, несмотря на более низкую скорость потребления кислорода. Это,очевидно, трансформируется в более высокую производительность и более эффективную стоимость процесса, когда ферментация проводится при лимитировании кислорода. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ производства полипептида, метаболита, полисахарида или биомассы путем культивирования мицелиального гриба, включающий культивирование мицелиального гриба в среде, в которой все питательные вещества обеспечивают в избытке в ходе всего периода культивирования, а кислород подают в культуру в количестве, которое обеспечивает поддержание условий лимитированного количества кислорода в ходе образования продукта. 2. Способ по п.1, в котором соответствующее количество кислорода подают в культуру для того,чтобы гарантировать значение скорости переноса кислорода, идентичное значению скорости потребления кислорода с отклонением 10%. 3. Способ по п.2, в котором соответствующее количество кислорода подают в культуру для того,чтобы далее гарантировать как можно более высокое значение скорости переноса кислорода. 4. Способ по п.2 или 3, в котором скорость переноса кислорода модулируют коррекцией по меньшей мере одного из следующих параметров, выбранных из группы, состоящей из перемешивания, аэрации, избыточного давления, процентного содержания кислорода во входящем потоке газа, массе бульона, общей вязкости бульона. 5. Способ по п.4, в котором общую вязкость бульона модулируют изменением температуры бульона на 2-6 С или ниже уровня, где происходит оптимальный рост. 6. Способ по п.5, в котором общую вязкость бульона понижают в результате увеличения температуры бульона на 2-6 С выше уровня, при котором происходит оптимальный рост. 7. Способ по п.5, в котором общую вязкость бульона увеличивают уменьшением температуры бульона на 2-6 С ниже уровня, где происходит оптимальный рост. 8. Способ по любому из пп.1-7, в котором полученный полипептид, метаболит, полисахарид или биомассу выделяют из культурального бульона и/или формируют в виде соответствующей композиции. 9. Способ по любому из пп.1-8, в котором полипептид представляет собой фермент.