Способ получения микробных масел

006979 Настоящее изобретение относится к экстракции (и последующему выделению) микробного масла(или масла из одноклеточного), предпочтительно содержащего одну или более полиненасыщенных жирных кислот (PUFA), из одноклеточных (или микро-) организмов. Способ согласно изобретению заключается в разрыве или лизисе стенок микробных клеток, с последующим отделением масла от полученного в результате клеточного остатка. Кроме того, описано микробное масло, выделяемое указанным способом и предпочтительно содержащее PUFA. Полиненасыщенные жирные кислоты, или PUFA, имеют природное происхождение, и разнообразные PUFA вырабатываются различными одноклеточными микроорганизмами (водорослями, грибками и т.п.). Такие вещества находят разнообразное применение, например, их вводят в состав пищевых продуктов (например, продуктов детского питания), пищевых добавок и фармацевтических препаратов. В большинстве процессов производства микробных PUFA микроорганизм вначале культивируют в ферментере в подходящей среде. Затем микробную биомассу собирают и подвергают обработке, способствующей проведению последующей экстракции липида из биомассы с помощью подходящего растворителя. Обычно полученный липид подвергают нескольким стадиям очистки. В ходе осуществления такого процесса следует соблюдать меры предосторожности, не допуская деградации, которая может происходить, если липиды подвергаются липолизу или воздействию окислительных условий, например, при нагревании (в присутствии кислорода) и/или воздействию липаз или липоксигеназ. В литературе отмечается, что для исключения окисления (которое может иметь место в результате воздействия кислорода при разрыве клеточной оболочки) PUFA следует экстрагировать из целых, интактных клеток с использованием растворителя (см. WO-A-97/36996 и WO-A-97/37032). Применение растворителей является общепринятой практикой удаления липидов из микробной биомассы (WO-A-98/50574). Хотя такие процессы экстракции используются уже в течение нескольких лет, их осуществление предусматривает удаление растворителя и соответствующие дополнительные затраты. Кроме того, если липид предназначается для использования в пищевых продуктах, важно, чтобы некоторые растворители,например, гексан, удалялись полностью или оставались в очень незначительных количествах. Если гексан удаляют путем выпаривания, то может потребоваться нагревание, что не только увеличивает стоимость процесса, но может привести и к деградации липида. Кроме того, с учетом экологических требований, применение растворителей для экстракции липидов становится слишком дорогостоящей и непопулярной операцией. Цель настоящего изобретения состоит в решении таких проблем или по крайней мере в частичном их решении. Авторы изобретения обнаружили, что липиды, например, те, которые содержат PUFA, могут быть эффективно экстрагированы из микробных клеток без необходимости использования растворителей. Соответственно, настоящее изобретение заключается в разработке способа получения масла (жира или липида; эти термины взаимозаменяемы) из микробных клеток, и способ этот заключается (а) в разрушении (или лизисе) клеточной стенки (микробных клеток) с выделением (или высвобождением) из них масла. Полученное масло (микробов или одноклеточных микроорганизмов) затем может быть (b) отделено по крайней мере от части полученных обломков клеточных стенок. Затем может быть осуществлена стадия (с) регенерации, очистки и/или выделения (микробного) масла (или одной или более PUFA). Хороший выход такого масла может быть достигнут при проведении указанного процесса без использования растворителя. Полученное масло предпочтительно содержит PUFA, а именно, одну или более PUFA. Рассматриваемый процесс (включая стадии (а) и (b предпочтительно проводить в отсутствие растворителя. Современные способы получения PUFA пропагандируют использование целых (интактных) микробных клеток (WO-A-97/36996). В цитированной публикации описывается способ получения PUFA, в котором микробную биомассу вырабатывают путем ферментации микроорганизма, а после ферментации клетки нагревают. Из биомассы удаляют воду, и полученный в результате материал подвергают экструзии с получением пористых гранул. Затем PUFA экстрагируют из целых клеток, содержащихся внутри гранул в результате контакта с растворителем, обычно гексаном. После этого гексан выпаривают, с получением сырого масла. В ходе осуществления рассматриваемого процесса клетки остаются целыми для предотвращения контакта PUFA с кислородом атмосферы, который, как предполагается, может вызвать нежелательное окисление. Однако авторами изобретения было обнаружено, что может быть достигнуто хорошее качество масла на основе PUFA, если клетки подвергают лизису: в этом случае любое потенциальное окисление атмосферным кислородом может быть полностью компенсировано преимуществом,состоящим в отказе от использования растворителей.PUFA и микроорганизмы Рассматриваемая PUFA может представлять собой одну полиненасыщенную жирную кислоту(PUFA) или две или более различных PUFA. Каждая из PUFA может принадлежать к семейству n-3 или n-6. Предпочтительно, такое вещество представляет собой С 18, С 20 или С 22 PUFA, или PUFA, содержащую по меньшей мере 18 углеродных атомов и 3 двойных связи.PUFA (одна или более) может быть получена в виде свободной жирной кислоты, ее соли, эфира жирной кислоты (например, метилового или этилового эфиров), в виде фосфолипида и/или в виде моно-,ди- или триглицерида. Подходящие (n-3 и n-6) PUFA включают в себя докозагексаеновую кислоту (DHA, 22:6 3), вырабатываемую такими водорослями или грибками,как (динофлагеллатные водоросли) Crypthecodinium или (грибковые микроорганизмы) Thrаustоchytrium;-линоленовую кислоту (ALA, 18:3 3); коньюгированную линолевую кислоту (октадекадиеновая кислота CLA); дигомолиноленовую кислоту (DGLA, 20:3 6); арахидоновую кислоту (ARA, 20:4 6); эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА, 20:5 6). Предпочтительные PUFA включают в себя арахидоновую кислоту (ARA), докозагексаеновую кислоту (DHA), эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА) и/или -линолевую кислоту (GLA). Особенно предпочтительной кислотой является ARA. Рассматриваемые PUFA могут иметь природное (например, растительное или морское) происхождение, или могут быть получены из одноклеточного или микробного источника. Так, например, PUFA может иметь микробное, водорослевое или растительное происхождение (или может быть получена из соответствующих источников). Главным образом, PUFA может вырабатываться бактериями, грибками или дрожжами. Предпочтительными источниками являются грибки вида Mucorales, например, Mortierella, Phycomyces, Blakeslea, Aspergillus, Thraustochytrium, Pythium или Entomophthora. Предпочтительным источником ARA могут служить Mortierella alpina, Blakeslea trispora, Aspergillus terreus, или Pythiuminsidiosum. Водоросли могут относиться к виду динофлагеллатов и/или включать в себя Porphyridium,Nitszchia или Crypthecodinium (например, Crypthecodinium cohnii). Дрожжи включают в себя микроорганизмы вида Pichia или Saccharomyces, например, Pichia ciferii. В качестве бактерий могут использоваться микроорганизмы вида Propionibacterium. Согласно способу настоящего изобретения, микробные клетки (или микроорганизмы) вначале могут соответствующим образом культивироваться или ферментироваться, например, в ферментере, содержащем культуральную среду (например, водную). Условия ферментации могут быть оптимизированы для получения высоких содержаний масла и/или PUFA в полученной биомассе. Если желательно, и, например, после завершения ферментации, микроорганизмы могут быть уничтожены и/или пастеризованы. Такую операцию проводят для инактивации нежелательных энзимов, например, тех, что способны оказывать деградирующее влияние на масло или понижать выход PUFA. Затем ферментационный бульон (содержащий биомассу и культуральную среду) может быть удален из ферментера и подан в установку для разрушения клеточных стенок (например, в гомогенизатор). При необходимости, вначале удаляют жидкость (обычно воду). Эта операция (обезвоживание) может осуществляться с помощью центрифугирования и/или фильтрации. Клетки можно промывать, используя для этой цели водный раствор (например, воду) с целью удаления внеклеточных водо-растворимых или вододиспергируемых веществ. После этого клетки считаются подготовленными для разрушения или лизиса. Лизис клеток (стадия (а Клеточные стенки микробных клеток далее могут быть подвергнуты разрушению (или лизису). Желаемый эффект может достигаться с использованием одного или более ферментативных, физических или механических методов или технологий, например, путем воздействия больших сил сдвига. Физические методы включают в себя нагревание и/или сушку клеток при достаточно высокой температуре, при которой происходит разрушение клеточных оболочек. Такая операция может представлять собой кипячение. Ферментативные способы включают в себя лизис под воздействием одного или более ферментов,например, ферментов, разрушающих клеточные стенки. В качестве такого фермента может использоваться литический энзим. Другие ферменты включают в себя (например, щелочные) протеазы, целлюллазы, гемицеллюлазы, хитиназы и/или пектиназы. Вместо или в комбинации с одним или более ферментами могут использоваться другие вещества, способные к разрушению клеточных стенок, например, соли, щелочи и/или одно или более поверхностно-активных веществ или детергентов. Предусматривается также комбинация физических, механических и/или ферментативных способов. Используемый механический метод может представлять собой гомогенизацию, проводимую, например, с помощью гомогенизатора. В качестве последнего может использоваться шаровая мельница или любое другое устройство, способное разрушать клеточные стенки. Подходящие гомогенизаторы включают в себя такие гомогенизаторы высокого давления (работающие, например, при давлении 300-500 кг/см 2 или бар) как политронный гомогенизатор. Другие гомогенизирующие технологии предусматривают смешивание с частицами материала, например, песка и/или со стеклянными шариками (например, при использовании шариковой мельницы). Альтернативные меха-2 006979 нические способы включают в себя применение размалывающих устройств, например, гомогенных смесителей. Другие методы разрушения клеточных стенок включают в себя ультразвуковую обработку,сушку и/или прессование, либо применение высокого давления. На последнюю из упомянутых технологий ссылаются как на холодное прессование: этот процесс можно проводить при давлениях 100-600 или 700 бар (атм или кг/см 2), например, при 150-500 бар, оптимально, при давлении от 200-400 бар. Предпочтительным способом разрушения клеточных стенок является гомогенизация. Обрабатываемый материал может совершать 1-3 прохода через гомогенизатор, при высоком и/или при низком давлении в ходе разрушения (например, гомогенизации). Так, например, может использоваться гомогенизатор Gaulin. Разрушение (например, гомогенизацию) можно проводить под давлением 300-900, например 400-800, и оптимально при 500-600 или 700 бар (атм или кг/см 2). При необходимости могут использоваться более низкие давления, например 150-300 бар. Таким образом, рабочие давления могут меняться в интервале от 150 до 900 бар в зависимости от типа гомогенизатора, числа проходов и т.п. Хотя лизис клеток можно осуществлять с использованием химического метода, такой способ предпочтительно не использовать, поскольку желательно, чтобы процесс (или стадия процесса) проводился без растворителя. Разрушение клеточных стенок может осуществляться в бульоне, образовавшемся в ходе ферментации, например, клетки могут все еще находиться в культуральной среде, или может присутствовать такая среда. В ходе разрушения в систему могут быть введены или находиться в ней одна или более добавок(например, соль щелочного металла, NaCl), или подобные ингредиенты могут добавляться после разрушения (например, в гомогенизированный бульон). Предпочтительно, чтобы в ходе разрыва клеточных стенок в системе не присутствовал какой-либо органический растворитель (например, МеОН, хлороформ). Может проводиться разрушение в среде биомассы (необязательно промытой и/или концентрированной), (например, после разделения системы на жидкую и твердую фазы). Таким образом, процесс разрушения клеточных стенок осуществляют в среде композиции (например, водного раствора), содержащей клетки и воду, но не содержащей растворитель. Для улучшения показателей разрушения клеточных стенок, процесс можно проводить при содержании сухого материала 10-200 г/л. Операцию можно проводить на ферментационном бульоне, например, после ферментации, или после того, как бульон подвергнут обезвоживанию и/или разделению на твердый материал и жидкость. При необходимости, на этой стадии в гомогенизированный материал может добавляться индуктор разделения, облегчающий отделение масла от остатков клеточных стенок. Отделение масла от клеточных остатков (стадия (b Микробное масло затем отделяют по крайней мере от части образовавшихся клеточных остатков. На этой стадии может образовываться масляная или липидная фаза или слой (и такие системы могут содержать PUFA). Рассматриваемый слой может представлять собой верхний слой. Этот слой может находиться сверху водного слоя, содержащего, например, клеточные остатки. Масляный слой (содержащийPUFA) далее может быть отделен от водного слоя (или фазы). Для облегчения протекания рассматриваемого процесса в системе может присутствовать или добавляться в нее одно или более поверхностноактивных веществ или детергентов. Отделение масла, по крайней мере от некоторой части остатков клеточных стенок, предпочтительно достигается с использованием механического способа, главным образом центрифугирования. Подходящие для этой цели центрифуги (полупромышленного и промышленного типа) поставляются Westfalia или Beckman (например, лабораторные центрифуги). Длительность центрифугирования (например, для лабораторных центрифуг) может составлять от 2 или 4 до 8 или 15, например от 3 или 5 до 7 или 12, оптимально от 4 или 5 до 6 или 10 мин (время пребывания в центрифуге). Сила центрифугирования (g) может составлять от 1000 или 2000 до 10000 или 25000, например, от 3000 или 5000 до 8000 или 20000, оптимально от 4000 до 6000, или 7000-9000g, хотя можно использовать центрифугирование при значениях до 12000g, 15000g, 20000g или 25000g. Скорость вращения центрифуги может составлять 4000 - 14000 об/мин, например, 6000-12000 об/мин, оптимально 8000-10000 об/мин. Может потребоваться использование одного или более циклов центрифугирования. Максимальное значение g может быть уменьшено при использовании некоторых центрифуг, например, оно может составлять 6000g при использовании центрифуги Westfalia (модель NA-7). Могут использоваться объемные скорости 100-500 л/ч, например, 150-450 л/ч, оптимально 200-400 л/ч. В результате центрифугирования может образовываться 2-фазная система (жировой или масляный верхний слой и нижний водный слой) или 3-фазная система (жировой или масляный верхний слой, средний водный слой и нижний слой,обычно содержащий клеточные остатки). В систему может добавляться индуктор сепарации или агент, облегчающий разделение. Это вещество может присутствовать или добавляться на стадии (а), после (а), но до стадии (b) или в ходе стадии(b). Введение того вещества может способствовать разделению системы на масляную и водную фазы. Индуктор способен повышать плотность водной фазы, которая может даже превосходить по плотности масляную фазу. Примерами подходящих индукторов могут служить соли щелочных металлов, например,-3 006979NaCl. Индуктор может добавляться в концентрации 10-150 г/л, например, 30-130 г/л, оптимально 50-100 г/л. Полученное масло может не содержать каких-либо каротиноидов, например, -каротин. После стадий разрушения клеточных оболочек и разделения способ согласно изобретению может включать в себя стадии экстракции, очистки или выделения масла или одной или более PUFA. Возможность избежать использование растворителя Одним из преимуществ настоящего изобретения является возможность проведения процесса без необходимости использования растворителя. (В контексте изобретения термин растворитель исключает воду, поскольку обычно используется водная культуральная среда, и клетки могут промываться водой). Таким образом, разрушение клеточных стенок на стадии (а), или отделение PUFA, по крайней мере от части остатков клеточных стенок на стадии (b), могут проводиться без использования (органического) растворителя. Предпочтительно осуществлять экстракцию, очистку, выделение масла либо одной или более PUFA без использования растворителя (например, органического). Таким образом, по существу,рассматриваемый способ может осуществляться без растворителя. Стадии (а), (b) и, необязательно, стадия (с) могут проводиться без растворителя (например, органического), так, например, отпадает необходимость использования таких растворителей для масла (или PUFA) как алканы, например, гексан, спирты (например, метанол) или галогеналканы (например, хлороформ). Предпочтительно избегать использования поверхностно-активного вещества, и в этом случае одна или обе из стадий разрушения клеточных стенок (а) и разделения (b) также могут проводиться без использования поверхностно-активного вещества, например, в отсутствие детергентов. Если масло, полученное способом согласно изобретению, содержит PUFA, то предпочтительно,чтобы PUFA преимущественно (например, на 50, 70 или даже 90 или 95%) состояли из триглицеридов. Рассматриваемое масло содержит одно или более из следующих специальных веществ (или компонентов):(а) стеролы, например, десмостерол, или клеточные остатки в количестве 0,01-1,0%, например, 0,050,5%, предпочтительно, 0,1-0,2%;(b) фосфолипиды или триглицериды в количестве 0,1-2,0%, например, 0,3-1,5%, предпочтительно 0,5-1,0%; и/или(c) диглицериды в количестве не более 0,1, 0,05 или 0,001%. При необходимости масло можно подвергать очистке и/или обработке кислотой и/или щелочью.PUFA (или масло, содержащее PUFA) могут быть подвергнуты таким дополнительным обработкам как удаление смол, нейтрализация, отбеливание, дезодорирование или вымораживание. Общий протокол Предпочтительный способ согласно изобретению включает в себя(a) культивирование микробных клеток, например, в таких условиях, когда они продуцируют микробное масло или по меньшей мере одну PUFA;(b) необязательное нагревание или пастеризацию клеток, например, в целях уничтожения клеток и/или инактивации нежелательных ферментов;(c) необязательное удаление (водной) жидкости (например, обезвоживание) с использованием таких методов как центрифугирование, фильтрация или подходящая сепарация системы твердый материалжидкость;(d) необязательную промывку микробных клеток, например, водой, с целью удаления внеклеточных веществ, растворимых или диспергируемых в воде;(e) разрушение или лизис стенок микробных клеток, например, с помощью физических, ферментативных или механических методов (например, путем гомогенизации с использованием гомогенизатора или шаровой мельницы). В результате такой операции происходит выделение некоторого количества масла и/или PUFA присутствующих в микробных клетках. (Механическое) разрушение может быть дополнено или заменено химическим и/или ферментативным разрушением клеточных оболочек. В систему может добавляться индуктор сепарации (например, с целью облегчения образования двух слоев на последующей стадии);(f) отделение микробного масла (или PUFA) от остатков клеточных стенок, например, образование и последующее отделение масляной фазы от полученных в результате остатков клеточных стенок и/или водной фазы. Рассматриваемая операция может включать в себя центрифугирование, необязательно с добавлением одной или более солей, изменение показателя рН (в сторону щелочных значений), и может предусматривать присутствие одного или более ферментов, разрушающих клетки, поверхностноактивных веществ или эмульгаторов. В результате может быть получена двухфазная система, состоящая из (например, верхней) масляной фазы и (например, нижней) водной фазы. Масляная фаза может содержать PUFA. Водная фаза может содержать клеточные остатки;(g) экстракцию, очистку или выделение масла (или PUFA из масляной фазы) с получением в результате PUFA-содержащего масла; и(h) необязательную обработку кислотой (удаление смол), щелочью (нейтрализация), отбеливание,дезодорирование, охлаждение (или вымораживание). В результате такой обработки могут быть удалены-4 006979 такие нежелательные вещества, как свободные жирные кислоты (FFA), протеины, фосфолипиды, следовые количества металлов, пигменты, углеводы, мыла, продукты окисления, сера, продукты разложения пигментов, стеролы, насыщенные триглицериды и/или моно- или диглицериды. В результате тепловой обработки или пастеризации предпочтительно инактивируется или денатурируется один или более ферментов, вызывающих деградацию масла (или PUFA). Нагревание может проводиться до температуры 70-90 С, например, 80 С. В результате могут инактивироваться или денатурироваться такие ферменты, как липазы и/или липоксигеназы. Может добавляться один или более антиоксидантов (например, растворимых в воде и/или в масле),например, витамин С, аскорбилпальмитат и/или токоферол, и такое добавление осуществляют после стадии (b) или на более поздних стадиях процесса, например, после экстракции, до или после очистки (стадия (h. Могут использоваться одна или более дополнительных стадий нагревания, предназначенных для удаления других нежелательных соединений или компонентов. Так, например, можно проводить нагревание при кислотном значении рН с целью удаления таких компонентов как фосфолипиды, следовые количества металлов, пигменты, углеводы и/или протеины. В этом случае нагревание проводят при температуре 50-80 С, например, 55-75 С, оптимально 60-70 С. рН может составлять 1-6, например, 2-5, оптимально 3-4. В результате может осуществляться удаление смол и/или удаление белков и/или веществ,растворимых или диспергируемых в воде. Вместо или совместно с указанной стадией может осуществляться еще одна стадия нагревания, но уже при щелочном значении рН. В этом случае рН имеет значение 8-13, например, 9-12, оптимально, 1011. Нагревание проводят при тех же температурах, что указаны в предыдущем абзаце. Оборудование (промышленная установка) В настоящем изобретении используется, в частности, устройство для проведения способа согласно изобретению. Таким образом, в настоящем изобретении может быть использовано(a) средство для культивирования (или ферментации) микробных клеток (например, ферментер),необязательно (например, непосредственно) связанное с ними;(b) средство для разрушения (или лизиса) стенок микробных клеток (например, гомогенизатор), необязательно связанное с ними;(c) средство для разделения (полученного в результате) масла и (полученных в результате) клеточных остатков. Клетки и культуральная среда (например, бульон) могут непосредственно пропускаться через устройства, указанные в пункте (b). Каждое из указанных устройств может быть расположено в определенном порядке, соответствующем порядку стадий способа согласно изобретению. Могут быть предусмотрены средства для осуществления любой или всех стадий разрушения клеточных стенок и разделения масла, описанных выше, например, средство для добавления индуктора разделения (например, в гомогенизированный материал), или для осуществления любой из стадий, описанных в общем протоколе (например, устройства для нагревания/пастеризации, устройства для разделения системы твердый материалжидкость и т.п.). Отличительные признаки или характеристики одного аспекта изобретения применимы к другому аспекту изобретения, и наоборот. Далее, настоящее изобретение описывается со ссылкой на представленные ниже примеры, которые приведены лишь в целях иллюстрации изобретения. Пример 1. Получение сырого масла PUFA (ARA) из ферментационного бульона, содержащего Mortierella alpina. Ферментационный бульон Mortierella alpina (предварительно пастеризованный при 65 С в течение одного часа), содержащий арахидоновую кислоту (ARA), гомогенизировали с использованием гомогенизатора МС-4 APV Gaulin при давлении 600 бар (600 атм) с целью разрушения клеточных стенок. В гомогенизированный бульон добавляли NaCl до конечной концентрации 100 г/л. Затем гомогенизированный бульон центрифугировали с использованием центрифуги Sorval RC 5 В, вращающейся со скоростью 9000 об/мин (что эквивалентно 20000g) в течение 10 мин, в результате чего получали обогащенный арахидоновой кислотой верхний масляный слой и нижний водный слой, содержащий клеточные остатки. Выделяли сырое масло, содержащее PUFA. Выход масла составил 9% (в расчете на содержание масла в клетках). (Масляный) слой имел следующий приблизительный состав: 0,1% десмостеролов; 0,7% фосфолипидов; 6,7% триглицеридов; 0,1% диглицеридов; 70% воды и 20% компонентов среды и клеточных остатков. Пример 2. Получение сырого масла PUFA (ARA) из ферментационного бульона, содержащего Mortierella alpina. Ферментационный бульон Mortierella alpine (предварительно пастеризованный при 65 С в течение одного часа), содержащий арахидоновую кислоту (ARA), гомогенизировали с использованием гомогенизатора МС-4 APV Gaulin при давлении 600 бар (600 атм) с целью разрушения клеточных стенок. Затем гомогенизированный бульон центрифугировали с использованием дисковой центрифуги Westfalia NA7, вращающейся с максимальной скоростью (около 8000 об/мин, что эквивалентно 8000g на пакете дис-5 006979 ков), в результате чего получали обогащенный арахидоновой кислотой верхний масляный слой (который извлекали из центрифуги) и нижний водный слой, содержащий клеточные остатки. Выделяли сырое масло, содержащее PUFA: выход масла составил 95% (в расчете на содержание масла в клетках). Сырое масло имело следующий приблизительный состав: 1-2% стеролов и клеточных остатков; 3-4% фосфолипидов; 4% моноглицеридов; 6% диглицеридов; остальное - триглицериды. Пример 3. Получение сырого масла PUFA (DHA) из ферментационного бульона, содержащегоCrypthecodinium cohnii. После ферментации 20 л ферментационного бульона (пастеризованного при 65 С в течение часа) на основе водорослей Crypthecodinium cohnii трижды гомогенизировали с использованием гомогенизатораAPV Gaulin (модель: Lab 60/60-10 ТВ SX), каждый раз при давлении 600 бар (атм), с целью лизиса клеточных стенок водорослей. В гомогенизированный бульон добавляли NaCl до конечной концентрации 50 г/л. Масло выделяли с использованием лабораторной центрифуги (Beckman JM/6E) в результате центрифугирования 800 мл порций бульона, каждое из которых проводили в течение 5 мин при 5000g. В результате получали DHA-обогащенный жировой верхний слой (сырое масло) и нижний водный слой. Сырое масло выделяли из жирового верхнего слоя. Пример 4. Получение сырого масла PUFA (DHA) из ферментационного бульона, содержащегоCrypthecodinium cohnii. После ферментации 20 л ферментационного бульона (пастеризованного при 65 С в течение часа) на основе водорослей Crypthecodinium cohnii трижды гомогенизировали с использованием гомогенизатораAPV Gaulin (модель: Lab 60/60-10 ТВ SX), каждый раз при давлении 600 бар (атм), с целью лизиса клеточных стенок водорослей. Масло выделяли с использованием лабораторной центрифуги (BeckmanJM/6E) в результате центрифугирования 800 мл порций бульона, каждое из которых проводили в течение 5 мин при 5000g. В результате получали DHA-обогащенный жировой верхний слой (сырое масло) и нижний водный слой. Сырое масло PUFA выделяли из жирового верхнего слоя. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения масла из микробных клеток, содержащего одну или более полиненасыщенных жирных кислот (PUFA), включающий в себя стадии(a) разрушения клеточных стенок микробных клеток с целью выделения масла и(b) отделения масла по меньшей мере от части остатков клеточных стенок, образовавшихся на стадии (а), путем центрифугирования. 2. Способ по п.1, где клетки подвергают физическому, ферментативному или механическому разрушению. 3. Способ по п.2, где разрушение включает в себя гомогенизацию. 4. Способ по п.3, где разрушение включает в себя гомогенизацию при давлении от 150 до 900 бар. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий в себя(c) экстракцию, очистку или выделение микробного масла или одной, или более PUFA. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где в результате разделения получают масляный слой и водный слой. 7. Способ по п.6, где масляный слой представляет собой верхний слой, расположенный над водным слоем. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где масло содержит PUFA, представляющую собой C18, C20 или С 22 -3 или -6 PUFA (необязательно ARA, EPA, DHA и/или GLA). 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где микробные клетки представляют собой клетки дрожжей, бактерий, грибков или водорослей. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где источник PUFA получен из Mortierellaalpina, Phycomyces, Blakeslea, Aspergillus, Pythium, Entomophthora, Porphyridium, Nitszchia, Pichia, Saccharomyces или Propionibacterium. 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадию (а) и/или (b) проводят в отсутствие органического растворителя (растворителей). 12. Способ согласно любому из пп.1-7, где на стадиях (а) и (b) и, необязательно, на стадии (с) не используют растворитель (например, для масла или PUFA). 13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где перед стадией (а) проводят культивирование или ферментацию микробных клеток в условиях, обеспечивающих получение масла, и, если необходимо, осуществляют пастеризацию и/или нагревание клеток. 14. Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий в себя перед проведением стадии(а) пастеризацию и/или нагревание клеток. 15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где для облегчения разрушения клеточных стенок применяют один или более ферментов, способствующих деградации клеточной стенки, или поверхностно-активных веществ.-6 006979 16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на стадии (b) присутствует индуктор разделения. 17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на стадии (b) присутствует одно или более поверхностно-активных веществ.