Насадка для поточного цитометра с высокоэффективной сортировкой клеток

1 Физическое разделение спермы для получения очищенных популяций клеток с Х- и Yхромосомами с использованием поточной цитометрии и сортировки доказала свою эффективность для предварительной селекции пола людей, крупного рогатого скота, свиней, овец и кроликов. Успех такой сортировки зависит от точности и эффективности анализа ДНК клеток спермы. Анализ ДНК клеток методом поточной цитометрии высокого разрешения затруднен из-за неравномерной флюоресценции. Из-за плоской формы головки сперматозоида, компактности хроматина и высокого показателя преломления,флюоресценция края клеток гораздо ярче, чем их плоской стороны [Gledhill et al., J CellPhysiol. 87: 367-376 (1976); Johnson et al., Cytometry 7:268-273 (1986); и Pinkel et al., Cytometry 3: 1-9 (1982)]. Этот факт в сочетании со случайной ориентацией приводит к широкому интервалу флюоресценции, маскирующему специфичные субпопуляции с разным содержанием ДНК в образце. Решение этой проблемы заключается в применении поточного цитометра с эпиосвещением, использующего характеристики коаксиального потока. Однако эта система в целом непригодна для сортировки клеток. Единственное известное решение, включающее анализ ДНК и сортировку, заключается в сборе только флюоресценции от надлежащим образом ориентированных клеток с использованием цитометра/сортировщика клеток с ортогональным потоком (Johnson et al., и Pinkel et al., см. выше). В этой ортогональной системе используется детектор флюоресценции под прямым углом(90) для обнаружения надлежащим образом ориентированных сперматозоидов. Яркий сигнал указывает, что яркий край сперматозоида обращен к 90-ному детектору, а значит его плоская сторона обращена к лазерному лучу. Для сбора флюоресценции от плоской лицевой поверхности против лазерного луча используют фронтальный (0) детектор флюоресценции,дополнительно вводят сортировщик клеток. Фронтальный сигнал флюоресценции, когда ее собирают от плоской стороны надлежащим образом ориентированной клетки дает точное измерение содержания ДНК (Johnson et al., иPinkel et al., см. выше). Усовершенствованная высокоэффективная сортировка может быть полезной для разделения сперматозоидов по полу только в случае,если соблюдены три условия: 1) точность измерения содержания ДНК не снижается (поддерживается чистота 90%); 2) стабильность сортировки не ухудшается(не теряется время на регулировку сортировщика клеток); 3) клетки могут выделяться в достаточном количестве, позволяющем использовать их для оплодотворения in vitro и искусственного осеменения. 2 Это изобретение относится к новой насадке для ориентации и сортировки большой фракции сперматозоидов независимо от пристеночной скорости жидкости и скорости пропускания образца. Уровень техники Ориентация клеток спермы в обычных сортировщиках клеток является случайной. Для половой селекции сортировщики клеток модифицируют путем замены иглы для впрыска образца на скошенную иглу [Dean et al., Biophys. J. 23:7-13 (1978); Fulwyer, J. Histochem. Cytochem. 25: 781-783 (1977); Johnson et al., см. выше;(Suppl. 7): 74 (1994)]. Эта скошенная игла обеспечивает прохождение большего количества сперматозоидов через лазерный луч в надлежащей ориентации, поскольку она изменяет форму цилиндрического потока пробы на тонкую ленту. Скошенная игла помогает ориентировать сперматозоиды, в частности их головки, например, сперматозоиды без хвостика. Поскольку часть образца, выходящая из скошенной иглы,будет в форме ленты, то к сперматозоидам прикладываются ориентирующие усилия. Однако эта лента существует только когда поток образца является узким, то есть при низком давлении и соответственно низкой скорости прохождения образца. Эти условия не подходят для эффективной сортировки сперматозоидов. Кроме того,высказывалось мнение, что улучшение ориентации, приписываемое использованию скошенной иглы, менее значительно для живых и подвижных сперматозоидов. Лишь 20-40% неповрежденных жизнеспособных сперматозоидов правильно ориентируются с помощью этой системы [Johnson, Reprod. Fertil. Dev. 7: 893-903(1995)]. Это означает, что от 60 до 80% сперматозоидов не анализируются на ДНК. Возможность сортировать неповрежденные и жизнеспособные клетки может привести к гораздо более высокой эффективности сортировки. Кэчел и др. [Kachel et al., J. Histochem. Cytochem. 25:774-780 (1977)] описывают асимметричную плексигласовую камеру для ориентации плоских частиц (фиксированных эритроцитов кур) на микроскопе. Кэчел и др. считают, что наипростейшим путем потока для приложения необходимых гидродинамических фокусирующих усилий является трубка с эллиптическим поперечным сечением, оканчивающаяся эллиптическим выпускным отверстием, имеющим длинную ось под прямыми углами к длинной оси поперечного сечения сужающейся эллиптической трубки. Это устройство не предлагалось использовать в сочетании с сортировщиком клеток. Краткое содержание изобретения Теперь мы обнаружили новую конструкцию насадки, полезную, в частности, для высокоэффективной поточной сортировки асиммет 3 ричных или "приплюснутых" клеток в сортировщике клеток. Насадка этой конструкции содержит две эллипсоидные внутренние зоны и эллиптическое выходное отверстие, выполненное с возможностью образования устойчивых капель и сортировки клеток. Особая рабочая характеристика насадки по изобретению состоит в том, что при использовании с неповрежденными жизнеспособными сперматозоидами доля ориентированных сперматозоидов по существу не зависит от подвижности сперматозоидов, скорости образца и скорости пристеночного потока. В соответствии с этим, задача изобретения состоит в создании насадки для сортировщика клеток, повышающей эффективность правильной ориентации нерадиально симметричных клеток в сепарационном потоке. Отдельной задачей изобретения является создание средства повышения точности и эффективности сортировки клеток сперматозоидов в поточном цитометре. Еще одна задача изобретения состоит в том, чтобы обеспечить применение высокоскоростных сортировщиков клеток для увеличения количества отсортированных сперматозоидов в единицу времени. Другие задачи и преимущества изобретения будут понятны из нижеследующего описания. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - вид в перспективе варианта выполнения насадки по изобретению; фиг. 2 А - вид спереди внутреннего контура насадки по изобретению; фиг. 2 В - вид сверху внутреннего контура насадки по фиг. 2 А; фиг. 3 А - вид сбоку внутренний контур насадки по изобретению; фиг. 3 В - вид сверху внутреннего контура насадки по фиг. 3 А; фиг. 4 А - гистограмма ориентации неповрежденных сперматозоидов хряка, полученная на известной системе со скошенной иглой и конической насадкой. фиг. 4 В - гистограмма ориентации неповрежденных сперматозоидов хряка, полученная на системе с обычной цилиндрической иглой и эллиптической насадкой по изобретению. Подробное описание изобретения Наиболее типичное выполнение новой конструкции насадки по изобретению, представляет собой сопло, создающее струю потока в воздухе, как описывается ниже. Однако специалисту в данной области понятно, что эта конструкция может быть использована и в других типах насадок, например, в кварцевой канальной насадке. Обращаясь к фиг. 1, отмечаем, что насадка в основном содержит корпус 1, имеющий внутреннюю резьбу 2 или другое подходящее средство для прикрепления к держателю насадки (не 4 показаны). В другом варианте осуществления можно использовать патрубок плотной посадки вместо сопрягаемой резьбы для прикрепления насадки к держателю. Внутреннее пространство насадки приспособлено для приема иглы 3 для впрыска образца, которую регулируют так, чтобы она продолжалась в насадку на достаточную глубину для поддержания ламинарного потока. Игла для впрыска может быть стандартной цилиндрической иглой или она может быть скошенной. В кончике насадка, противоположном средству прикрепления, имеется цилиндрическое отверстие 5, которое служит конечным выходом из поточной насадки. Отверстие 5 обычно просверлено в благородном камне 4,который расположен в торце корпуса 1 насадки. Обращаясь к фиг. 2 А, 2 В, 3 А и 3 В, внутреннее пространство насадки содержит первую эллипсоидную зону 8 и вторую эллипсоидную зону 9, разделенные переходной зоной 12. Предпочтительно, все поперечные сечения первой и второй зон и переходной зоны 12 могут быть выполнены, каждое, в форме эллипса,имеющего длинную ось и короткую ось. Первая зона 8 сужается от входа к переходной зоне, так что площадь поперечного сечения указанной переходной зоны меньше, чем площадь поперечного сечения входа. Вторая зона сужается от переходной зоны к выходному отверстию 15,имеющему площадь поперечного сечения меньше площади поперечного сечения переходной зоны. Длинная ось эллипса выходного отверстия ориентирована под углом около 90 к длинным осям как устья, так и переходной зоны. Отверстие 5 расположено непосредственно за эллиптическим выходным отверстием 15. Отверстие 5 концентрично выровнено с выходным отверстием 15 и также имеет меньшую площадь поперечного сечения, чем выходное отверстие. Форма внутреннего пространства насадки 1 может быть наглядно представлена в виде стандартной гибкой воронки, полученной путем сжатия противоположных сторон чаши воронки с образованием формы овала на входе и путем сжатия ствола воронки под углом 90 относительно сил сжатия, приложенных к чаше,с образованием эллиптической щели на выходе из ствола воронки. Фактические и относительные размеры внутреннего пространства насадки в предпочтительном варианте осуществления приведены ниже в таблице 1. Обозначения размеров можно найти на фиг. 2 А, 2 В, 3 А и 3 В. Размеры А и В представляют короткую и длинную оси, соответственно, входа 10. Размеры а и b представляют короткую и длинную оси, соответственно,переходной зоны 12. Размер а также представляет длинную ось выходного отверстия 15. Размер с представляет короткую ось этого отверстия. Размер X является высотой первой зоны 8,a Y является высотой второй зоны 9. Размеры,приведенные в таблице 1, считаются приблизи 5 тельно оптимальными в целях ориентации жизнеспособных неповрежденных сперматозоидов. Однако специалисту в данной области понятно,что эти размеры можно изменять в целесообразных пределах без существенного изменения функциональных возможностей насадки для сортировки с одновременной ориентацией жизнеспособных сперматозоидов или других асимметричных клеток или объектов. Допуски для этих размеров составляют, по меньшей мере,примерно 10% от значений, приведенных в таблице I. В таблице II представлены отношения различных важных размеров насадки, основанные на соотношениях, приведенных в таблице I. Эти отношения могут изменяться в пределах 20% при условии, что отношение В/А остается больше 1 и что вход 10 является эллиптическим. Как правило, отношение В/А должно составлять, по меньшей мере, около 1,1. При сравнении отношения В/А с отношением b/а очевидно,что относительные размеры длинной оси к короткой оси поперечных сечений первой зоны постепенно увеличиваются от входа этой зоны к переходной зоне. В последующих поперечных сечениях ниже по течению от переходной зоны,то есть, во второй зоне, отношение длинной оси к короткой оси начинает уменьшаться. В "инверсной" точке 20, которая находится между переходной зоной 12 и выпускным отверстием 15, оси равны и поперечное сечение внутреннего пространства второй зоны является круглым. От инверсной точки до выпускного отверстия поперечные сечения второй зоны опять являются эллиптическими, но длинные оси поперечных сечений расположены под углом 90 к длинным осям поперечных сечений выше инверсной точки. Для эллипсов, вписанных каждым последующим поперечным сечением при подходе к выходному отверстию, отношения длинных осей к коротким осям постепенно увеличиваются. Понятно, что по ходу потока в каждом поперечном сечении от входа насадки к выпускному отверстию размеры как длинной оси, так и короткой оси, уменьшаются соизмеримо с непрерывным сужением как первой, так и второй зон. Эллиптическая насадка по изобретению способна ориентировать свыше 60% сперматозоидов для их сортировки. По сравнению с известной системой, в которой применяется стандартная цилиндрическая насадка со стандартной цилиндрической иглой, а сперматозоиды пересекают лазерный луч в случайной ориентации,эллиптическая насадка позволяет достичь приблизительно трехкратного увеличения доли сперматозоидов, ориентированных для сортировки. И приблизительно двухкратное увеличение эффективности получают по сравнению со стандартной конической насадкой в сочетании со скошенной иглой. При использовании скошенной иглы для ориентации сперматозоидов,доля ориентированных сперматозоидов умень 001788 6 шается при увеличении скорости образца. Авторы изобретения обнаружили, что при эллиптической насадке доля клеток с надлежащей ориентацией поддерживается при скоростях образца, составляющих, по меньшей мере, до 15000 сперматозоидов в секунду. Такая высокая производительность выгодна для эффективной сортировки сперматозоидов. При испытаниях с бычьими сперматозоидами (пример 5) становится очевидно, что сортировщик клеток, оснащенный новой насадкой, эффективно разделяет сперматозоиды с Х- и Y-хромосомами с достижением чистоты сортировки около 90%. Предположительно, насадка по изобретению будет полезной для сортировки жизнеспособных сперматозоидов любых видов млекопитающих, а также для сортировки клеток крови(гемоцитов), семян и других асимметричных элементов. Испытания с бычьими сперматозоидами (пример 2) показывает, что на работоспособность насадки не влияет подвижность сперматозоидов. Высокоскоростной сортировщик, оснащенный насадкой по изобретению, увеличивает выход отсортированных сперматозоидов с Х- иY-хромосомами в десять раз и сделает искусственное осеменение сперматозоидами определенного пола более вероятной альтернативой оплодотворению in vitro и пересадке эмбрионов или хирургическому осеменению в процессе предварительной видовой селекции скота и других животных. Нижеследующие примеры предназначены для дополнительной иллюстрации изобретения. Примеры Подготовка и окрашивание сперматозоидов Для этого исследования использовали эякуляционную сперму от нескольких зрелых быков и хряков испытанной плодовитости, полученную согласно регулярным графикам сбора, а также сперму зрелых новозеландских белых кроликoв. Кроме того, в целях демонстрации оценивали по одному образцу спермы мыши и человека ввиду отличающихся форм головок их сперматозоидов. Подготовка и окрашивание сперматозоидов были основаны на методике Джонсона и др. [Johnson et al., Biol. Repro. 41: 199-203 (1989)] и [Johnson et al., Gamete Research 17: 203-212 (1987)]. Вкратце, аликвотные пробы чистой спермы разбавляли до концентрации от 15 х 106/мл до 100 х 106 мл в буферизованной среде Hepes, содержащей 0,1% альбумина бычьей сыворотки (АБС, рН-7,4), для сперматозоидов быков, оттаивающий раствор Белтсвилля(Tris), 58 мМ глюкозы и 67 мМ лимонной кислоты; рН=6,9) для сперматозоидов кроликов. Мышиную и человеческую сперму разбавляли в ОРБ. Сперматозоиды последовательно окрашивали с помощью 7,1 М вещества "Хехст(CalbiochemBehring Corp.), Ла-Йолла, Калифорния) и инкубировали в течение периода 40 мин при 32 С. При исследованиях сперматозоидов быков, непосредственно перед анализом добавляли иодид пропидия (ИП) (1,5 мкМ, "Калбиокем-Бехринг Корп.", Ла-Йолла, Калифорния) в сперматозоиды, окрашенные веществом "Хехст 3342". Это позволяло отличить мертвые сперматозоиды от живых сперматозоидов, как описали Джонсон и др. (1994, см. выше). Сортировка клеток Для примеров 1-5 использовали две разновидности стандартной системы сортировки клеток для сортировки жизнеспособных неповрежденных сперматозоидов с помощью насадки по изобретению: поточный цитометр - сортировщик клеток серии "ЭПИКС В" фирмы "Коултер Корпорейшн" (EPICS V, Coulter Corporation),Майами, Флорида, и "ЭПИКС 750" (модифицированная версия "ЭПИКС В"). Для примеров 6 и 7 использовали более новую систему, высокоскоростной сортировщик клеток "МоФло" фирмы "Цитомейшн Инк. (MoFlo, Cytomation Inc.),Форт Коллинз, Колорадо. Каждый сортировщик клеток был модифицирован для сортировки сперматозоидов как описано Джонсоном и др.(1986), см. выше. Основная модификация заключается в замене диодного детектора рассеяния фронтального света детектором фронтальной флюоресценции, необходимым для ориентации и сортировки неповрежденных и жизнеспособных сперматозоидов. Эта модификация обеспечивает сбор флюоресценции от более яркого края сперматозоидов (как в известном флюоресцентном 90-ном детекторе, который выбирает долю сперматозоидов, ориентированных надлежащим образом), а также от затемненной поверхности сперматозоидов, флюоресценция которой собирается детектором фронтальной флюоресценции только от ориентированных сперматозоидов. Стандартная система"ЭПИКС" использует коническую поточную насадку с размером выходного отверстия 76 мкм, которая была заменена эллиптической насадкой по изобретению, имеющей измерения,указанные в таблице I. Высокоскоростная система "МоФло" была адаптирована с помощью совершенной системы поточного счетчика клеток, подобной системе "ЭПИКС", и после этого смогла принять эллиптическую насадку. Сперматозоиды пересекали лазерный луч после прохождения через насадку, создающую струю потока в воздухе. Насадка сама ориентирует сперматозоиды и может это делать как со стандартной цилиндрической иглой, так и со скошенной иглой. Фторохром окрашенных сперматозоидов возбуждали с помощью ультрафиолетового света. Для полной демонстрации эффективности изобретения провели несколько экспериментов. Первые 5 экспериментов (примеры 1-5), опи 001788 8 санные ниже, были предназначены для количественной характеристики (t-тест Стьюдента для малых проб) улучшения ориентации и сортировки, получаемого с помощью насадки по изобретению. В последних двух экспериментах(примеры 6 и 7) насадка по изобретению применялась для высокоэффективной сортировки Х- иY-сперматозоидов с целью оплодотворения,которое в противном случае было бы невозможно. Для получения информации о чистоте сортировки образцов, определяли процентные доли путем повторного анализа методом поточной цитометрии отсортированного образца. Аликвотные пробы сперматозоидов (100000-250000 сперматозоидов) подвергали воздействию импульсов ультразвука для удаления хвостиков(что обеспечивает более высокую точность при анализе). Затем сперматозоиды затормаживали и возвращали и повторно пропускали через поточный цитометр. Получаемые гистограммы обрабатывали по двойной методике с кривой Гаусса. Пример 1. В этом примере производительность насадки по изобретению сравнивали со стандартной системой сортировки сперматозоидов и с системой, в которой используется скошенная игла с углом 12 на выпускном конце. Сперму от 8 разных быков анализировали в два разных дня с помощью стандартной конической насадки и стандартной цилиндрической иглы. Сперму от 15 разных быков анализировали в три разных дня и проводили измерения с помощью: 1) стандартной конической насадки и скошенной иглы, 2) эллиптической насадки и стандартной цилиндрической иглы. Скорости образца составляли примерно 2000 сперматозоидов в секунду. Установки выбора сигналов от ориентированных сперматозоидов были одинаковы для каждого эксперимента. Измерения сперматозоидов при использовании стандартной и эллиптической насадки проводили с помощью двух разных сортировщиков клеток ("ЭПИКС В" и "ЭПИКС 750"). Таким образом удалось избежать плохой ориентировки сперматозоидов при замене игл. Значительное улучшение ориентации сперматозоидов быков достигалось при использовании эллиптической насадки, по сравнению со стандартной насадкой, на который надевали цилиндрическую или скошенную иглу (парные разностные t-тесты, р 0,05, отдельные данные не показаны). В среднем, с помощью эллиптической насадки была получена в 3,0 раза большая доля ориентированных сперматозоидов(52,54,7%, n=15) по сравнению со стандартной конической насадкой в сочетании со стандартной цилиндрической иглой (17,30,7%, n=8) и в 2,3 раза большая доля ориентированных сперматозоидов по сравнению со стандартной на 9 садкой в сочетании со скошенной иглой(22,73,5%, n=15). Пример 2. Этот пример был предназначен для анализа влияния подвижности сперматозоидов на ориентацию посредством эллиптической насадки по изобретению. Подвижность является важным признаком жизнеспособных сперматозоидов, поскольку только образцы с подвижными сперматозоидами считаются подходящими для селекции пола и оплодотворения. Доли ориентированных неповрежденных жизнеспособных сперматозоидов сравнивали с долями ориентированных сперматозоидов без хвостиков и долями ориентированных мертвых неповрежденных сперматозоидов. Измерения проводили в четыре разных дня с использованием спермы разных быков. Скорости образцов составляли примерно 2000 сперматозоидов в секунду. Жизнеспособные сперматозоиды можно анализировать отдельно от мертвых сперматозоидов ввиду их различной флюоресценции по Хехту, так как ИП, являясь единственным веществом, окрашивающим мертвые сперматозоиды, гасит флюоресценцию по Хехту. Доли ориентированных жизнеспособных сперматозоидов быков (56,8+6,7%) были такими же, как у безхвостых сперматозоидов быков(59,84,2%) или мертвых сперматозоидов быков(53,34,3%, без значимой разницы при р 0,05,n=4), и это показывает, что подвижность оказывает пренебрежимо малое влияние на ориентацию сперматозоидов быков при использовании новой эллиптической насадки. Пример 3. Этот пример был предназначен для оценки влияния скорости образца на ориентацию. Скорость образца важна, так как предпочтительно сортировать сперматозоиды за наикратчайшее возможное время. Сперму 8-ми быков измеряли в два дня при скоростях образца 500 сперматозоидов в секунду и 2000 сперматозоидов в секунду. Были получены ориентации 52,16,4% и 52,36,5% для этих скоростей образца (n=8,парный разностный t-тест), соответственно, и это демонстрирует, что скорость пропускания пробы не влияет на ориентацию. Пример 4. В примере 4 сперматозоиды кроликов,мышей и людей, оценивали на предмет исследования ориентационной производительности эллиптической насадки для этих видов с различной морфологией сперматозоидов. Сперму 3-х разных кроликов анализировали с помощью эллиптической насадки и определяли доли правильно ориентированных сперматозоидов. Кроме того, сперматозоиды мышей и замороженные и оттаянные сперматозоиды людей анализировали с целью демонстрации использования этой насадки для этих видов. Большая доля сперматозоидов кроликов была правильно ориентирована при измерении с 10 помощью эллиптической насадки (482,4%,n=3). Доля ориентированных сперматозоидов,полученных при исследовании сперматозоидов мышей и законсервированных замораживанием и оттаянных сперматозоидов людей, составляла 44% и 45%, соответственно. Пример 5. Этот пример был предназначен для испытания способности системы с новой насадкой производить достаточные количества отсортированных популяций сперматозоидов от двух разных видов, которые затем можно отправить самолетом в разные регионы страны и использовать в тот же день для оплодотворения in vitro овоцитов в конкретном месте. Высокочистые отсортированные пробы получали во все дни эксперимента (таблица III). В среднем, для бычьих сперматозоидов были получены сортовая чистота Х-сперматозоидов 87,63,1% и сортовая чистота Y-сперматозоидов 89,32,5%. Ориентация сперматозоидов хряков в среднем, характеризовалась сортовой чистотой Х-сперматозоидов 85,32,1%, и была получена сортовая чистота Y-сперматозоидов 89,42,1%(таблица IV). Доля ориентированных сперматозоидов составляла в среднем 60,50,9%. Гистограммы ориентации, полученные с помощью системы с конической насадкой и скошенной иглой, а также с помощью эллиптической насадки и цилиндрической иглы, представлены соответственно на фиг. 4 А и 4 В, чтобы показать значительное улучшение ориентации. Парные вертикальные черточки на чертежах представляют "окно" ориентации, необходимое для эффективной сортировки сперматозоидов с Х- иY-хромосомами. Пример 6. Пример 6 демонстрирует, что можно отсортировать достаточно сперматозоидов за короткое время, и даже в количестве, достаточном для использования отсортированных сперматозоидов для обычного искусственного осеменения скота. Два миллиона отсортированных Х- иY-сперматозоидов, полученных с использованием сперматозоидов как быков, так и хряков требовалось отсортировать и выделить с чистотой около 90% (85-90%) между 9 ч и 12 и между 8 и 10 ч утра, соответственно. Эти ограничения возникли из-за необходимости успеть до рейса самолета, чтобы в тот же день провести искусственное осеменение (ИО) сотрудниками научно-исследовательских лабораторий в других штатах. Вышеописанные сортировки были успешно проведены 4 раза для ИО свиней и 6 раз для ИО коров. При ранее существовавшей технологии сортировки, которая позволяла выделять всего несколько сотен тысяч сперматозоидов в час, невозможно было бы провести эти эксперименты. Пример 7. Отсортированные Х- и Y- (в первую очередь, Х-) сперматозоиды использовали для искусственного осеменения молочных коров. Для каждого реципиента потребовалось четыре-пять миллионов сперматозоидов с чистотой около 90% (85-80%). До 5-ти реципиентов в день подвергали искусственному осеменению отсортированными сперматозоидами. Следовательно,потребовалось отсортировать до 25 миллионов Х-сперматозоидов (а всего - 50 миллионов Х- иY-сперматозоидов) в период между 9 ч утра и 4 ч дня. Это было бы невозможно без насадки по изобретению. Эти эксперименты (в которых участвовали 1-5 коров) были успешно проведены 5 раз. Таблица I. Параметры предпочтительного варианта осуществления АY Фактические (мм) 6 7 0,9 2 0,2 5,5 2,5 Относительно с 30 с 35 с 4,5 с 10 с 27,5 с 12,5c Таблица II. Важные отношения размеров предпочтительного варианта осуществления Соотношение Отношение Минус 20% Плюс 20% В/А 1,2 1,0 1,4Y/a 2,8 2,2 3,4 А/а 6,7 5,4 8 В/b 3,5 2,8 4.2 Таблица III. Сортовая чистота Х- и Y-сперматозоидов быков, достигнутая с помощью эллиптической насадки День Ориентация Сортовая Сортовая(%) чистота Xчистота Yсперматосперматозоидов (%) зоидов (%) 1 50 88,0 90,5 2 57 91,5 90,5 3 59 84,0 85,5 4 52 87,0 90,5 Среднее значение 54,54,2 87,63,1 89,22,5 среднеквадратическое отклонение Таблица IV. Чистота сортировки Х- и Yсперматозоидов хряков, достигнутая с помощью эллиптической насадки Сортовая Сортовая чистота YОриентация чистота XСутки сперматоспермато(%) зоидов зоидов (%) ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Насадка, содержащая корпус, имеющий первую внутреннюю зону и вторую внутреннюю зону, причем первая и вторая зоны разделены переходной зоной, при этом, по существу, 12 все поперечные сечения указанных первой и второй зон и указанной переходной зоны имеют форму эллипса, при этом указанная первая зона содержит вход и сужается от указанного входа до указанной переходной зоны, так что площадь поперечного сечения указанной переходной зоны меньше площади поперечного сечения входа, а отношение длинной оси к короткой оси эллипса увеличивается с уменьшением площади поперечного сечения первой зоны от входа до переходной зоны, при этом указанная вторая зона сужается по ходу потока от указанной переходной зоны до выходного отверстия, имеющего площадь поперечного сечения меньше площади поперечного сечения переходной зоны, а отношение длинной оси к короткой оси эллипса уменьшается от переходной зоны до точки во второй зоне, в которой указанная длинная и короткая оси равны, а после нее отношение длинной оси к короткой оси увеличивается и длинная ось располагается под углом около 90 к длинной оси как в указанном входе,так и в указанной переходной зоне, и при этом длинная ось в указанном выходном отверстии располагается под углом около 90 к длинным осям как в указанном входе, так и в указанной переходной зоне. 2. Насадка по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит средство прикрепления к поточной камере. 3. Насадка по п.2, отличающаяся тем, что указанное средство прикрепления представляет собой витки внутренней резьбы, примыкающие к указанной первой зоне и способные сопрягаться с витками наружной резьбы на указанной поточной камере. 4. Насадка по п.2, отличающаяся тем, что указанное средство прикрепления представляет собой средство плотной посадки. 5. Насадка по п.1, отличающаяся тем, что указанный корпус дополнительно содержит цилиндрическое отверстие, расположенное за указанным выходным отверстием и имеющее поперечное сечение меньше указанного выходного отверстия. 6. Насадка по п.1, отличающаяся тем, что отношение В/А находится в диапазоне примерно 1,1-1,4, отношение b/a находится в диапазоне примерно 1,8-2,6, отношение а/с находится в диапазоне примерно 3,6-5,4, отношение Х/А находится в диапазоне примерно 0,7-1,1, отношение Y/a находится в диапазоне примерно 2,23,4, отношение А/а находится в диапазоне примерно 5,4-8,0 и отношение В/b находится в диапазоне примерно 2,8-4,2, где А и В являются соответственно короткой и длинной осями указанного входа, а и b являются соответственно короткой и длинной осями в указанной переходной зоне, причем а также является длинной осью в указанном выходном отверстии, с является короткой осью в указанном выходном отверстии, Х является высотой указанной первой зоны, a Y является высотой указанной второй зоны. 7. Насадка по п.6, отличающаяся тем, что значение А составляет около 6 мм, значение В составляет около 7 мм, значение а составляет