Лечебно-профилактическое средство, применение средства и способ его получения

010742 Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается способа получения лечебно-профилактического средства (ЛПС), выделенного из растительного сырья, и содержащего смесь флавоноидов и аминокислот, и которое может быть использовано для изготовления лекарственных препаратов специфического действия для лечения и профилактики патологических состояний, преимущественно для лечения инфекций, вызванных вирусом герпеса, для комплексного лечения гепатита В и гепатита С, а также для лечения больных с иммунодефицитом. Известен способ получения ЛПС с противоопухолевой активностью, в котором в качестве растительного сырья используют зеленые части растений семейства Pittosporacea, преимущественно растения рода Pittosporum, и который заключается в том, что экстрагирование компонентов из сырья осуществляют путем мацерации в органическом растворителе, стряхивания раствора с другим растворителем, обработки каждой фазы еще одной органической жидкостью, деления и сбора выделенных компонентов,причем перед каждой стадией процесса проводят их осушение и очистку. В качестве органического растворителя используют спирт этиловый. При этом соотношение растительного сырья к экстрагенту составляет 1:10-10:1. Время обработки - от 5 мин до 3 месяцев, а температура обработки - от 5 до 100 С(патент Украины 26321, кл. МПК А 61 К 35/78, 1999). Лечебно-профилактическое средство растительного происхождения, полученное данным способом,имеет по сравнению с другими лекарственными препаратами довольно высокую активность и низкую токсичность, однако, вышеописанный способ их получения является очень сложным, материалоемким и трудоемким из-за наличия множества операций и применения специальных реактивов. Известен способ получения ЛПС для профилактики и лечения патологических состояний (международная заявка WO 91/11191, кл. МПК А 61 К 35/78, 1991), при котором в качестве растительного сырья используют зеленые части злаковых растений семейства Gramineae, собранные на стадии их развития, и который включает выделение из данного сырья жидких водо- и жирорастворимых фракций в виде сока и очистку их от твердых примесей путем центрифугирования с последующей высококачественной тонкой фильтрацией частиц, оставшихся после центрифугирования. Извлечение сока из растительного сырья преимущественно осуществляют путем выжимания, раздавливания или дробления растений. Полученное лечебно-профилактическое средство стабилизируют или путем сгущения с помощью распылительного(сублимационного) сушения, или введения специального консерванта-стабилизатора, причем стабилизацию ЛПС рекомендуют проводить в пределах 2 ч после его экстрагирования. Недостатком данного способа получения лечебно-профилактического средства также является сложность технологического процесса, состоящего из суммы трудоемких, материало- и энергоемких операций, из-за использования такого энергоемкого оборудования, как центрифуга, дробилка, пресс, и применения специальных реактивов, а также осуществления операции очистки экстракта в две стадии: путем центрифугирования и тонкой фильтрации. Кроме этого, к недостаткам данного способа относится длительность технологического процесса. Кроме того, использование в качестве сырья ценных хлебных зерновых культур, в частности пшеницы, ржи, ячменя, овса, риса и других подобных злаковых, для получения ЛПС в экономическом отношении невыгодно. Упоминание о возможности использования для данных целей дикорастущих трав семейства Gramineae не является конкретным, поскольку данное семейство на Украине представлено 334 видами (98 родами) растений. Полученное данным способом ЛПС не может применяться самостоятельно в качестве лекарственного препарата для лечения патологических состояний, а требует смешивания с фармакологически приемлемым жидким носителем. К тому же это ЛПС имеет относительно небольшую противоопухолевую специфическую активность и недостаточно высокую противовирусную активность. Наиболее близким к заявляемому способу по совокупности признаков является способ получения ЛПС для профилактики и лечения патологических состояний (патент Украины 22549 А, кл. МПК А 61 К 35/78, 1997), согласно которому в качестве растительного сырья используют зеленые части злаковых растений семейства Gramineae в виде смеси растений рода Calamagrostis Adans и рода DeschampsiaBeauv, собранные после выметывания и до начала цветения колосков, включающий раздельное высушивание растений до содержания влаги в количестве 8-20%, смешивание их при соотношении по массеCalamagrostis Adans 40-60% и Deschampsia Beauv 60-40%, выделение из данного сырья жидких водорастворимых фракций путем экстрагирования их 92-99,8% этиловым спиртом при массовом соотношении сырья к спирту как 1:3-1:8 методом мацерации при температуре 18-47 С с одновременным периодическим контролем показателя преломления экстракта, и после достижения этим показателем значения 1,362-1,364 проводят очистку водорастворимых фракций от твердых примесей путем фильтрации их через крупнопористый фильтр до получения конечного продукта. Данный способ получения ЛПС проще, чем способ, описанный в прототипе, поскольку исключает использование ряда таких трудоемких и энергоемких операций, как выдавливание сока из сырья, очистку его путем центрифугирования и высокоэффективной тонкой фильтрации, а также стабилизацию экстракта. Но этот способ получения ЛПС предусматривает использование смеси диких злаковых растений рода Calamagrostis Adans и рода Deschampsia Beauv, которые берут в узком интервале компонентных соотношений, что не позволяет получить ЛПС с широким спектром специфического действия. Поэтому ле-1 010742 карственные препараты, приготовленные на основе этого ЛПС, будут иметь узкую лечебную способность. Кроме того, сбор указанных растений осуществляют тоже на узкой стадии их развития: после выметывания стеблей и до начала цветения колосков, что приводит к уменьшению количества экстрактивных веществ в сырье. Все это приводит к сужению степени использования указанной сырьевой базы одного сезона. Недостатком этого известного способа является также необходимость измерения в процессе экстрагирования водорастворимых фракций показателя преломления экстракта, что делает технологический процесс более сложным и энергоемким. И к тому же необходимо иметь аналитический прибор - рефрактометр. В основу изобретения поставлена задача создания простого и эффективного способа получения стабильного ЛПС с высокой специфической активностью и низкой токсичностью путем расширения интервала соотношений компонентов в смеси диких злаковых растений семейства Gramineae рода CalamagrostisAdans и рода Deschampsia Beauv для выделения ЛПС, расширения срока их сбора и упрощения технологического процесса получения ЛПС за счет исключения сложной операции измерения показателя преломления и применения вместо нее простой операции взвешивания для определения сухого остатка экстракта. Решение поставленной задачи разрешает не только расширить пределы использования известной сырьевой базы для получения ЛПС растительного происхождения, но и создать ЛПС такого состава, который обеспечивает широкий спектр избирательного специфического фармакологического влияния его на организм человека и, соответственно, высокий лечебный эффект при низкой его токсичности. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения лечебно-профилактического средства из растительного сырья, в котором в качестве растительного сырья используют зеленые части растений рода Calamagrostis Adans и рода Deschampsia Beauv семейства Gramineae, раздельно высушенные до содержания влаги 8-20%, из вышеуказанного растительного сырья выделяют водорастворимые вещества экстрагированием этиловым спиртом с последующей очисткой полученной экстрагированной смеси,согласно изобретению указанное растительное сырье представляет собой смесь зеленых частей растенийCalamagrostis Adans и Deschampsia Beauv, взятых в следующих соотношениях, мас.%: (61-80):(20-39), где указанные растения собраны в период после выметывания стеблей и до окончания цветения колосков, а экстрагирование проводят при массовом соотношении сырья к спирту 1:1-1:10, причем экстрагирование прекращают при значении показателя массы сухого остатка экстракта 0,5-1,5%. Экстрагирование осуществляют методом мацерации и/или ремацерации при температуре 18-47 С 90-99,8% этиловым спиртом. Объектами изобретения являются лечебно-профилактическое средство, полученное в соответствии с указанным способом, и применение лечебно-профилактического средства, полученного из растительного сырья способом, в котором в качестве сырья берут зеленые части растений рода Calamagrostis Adans и рода Deschampsia Beauv семейства Gramineae, собранные на стадии после выметывания стеблей и до окончания цветения колосков, раздельно высушивают до содержания влаги 8-20%, выделяют водорастворимые вещества путем экстрагирования этиловым спиртом с последующей очисткой полученной экстрагированной смеси, причем указанное растительное сырье представляет собой смесь растений CalamagrostisAdans и Deschampsia Beauv в соотношении, мас.%: 40-60, 60-40, для лечения вирусной инфекции. Суть способа получения заявляемого ЛПС состоит в том, что, используя смесь злаковых растений семейства Gramineae рода Calamagrostis Adans и рода Deschampsia Beauv в указанном соотношении компонентов, повышают содержание полученных экстрактивных веществ, расширяя спектр избирательного специфического фармакологического действия на организм человека. Кроме того, на качественный и количественный состав ЛПС, полученный согласно заявляемому способу, важное влияние оказывает срок сбора растений рода Calamagrostis Adans и рода DeschampsiaBeauv, поскольку в указанный конкретный период их вегетации - после виметывания стеблей и до окончания цветения колосков - зеленые части этих растений содержат максимальное количество флавоноидных соединений, имеющих максимальную избирательную специфическую активность. Также не менее важное значение имеет компонентный состав смеси растений, поскольку от этого зависит содержание экстрактивных веществ в экстракте, а это скажется на специфичности действия ЛПС. Причем количественное содержание трав в смеси находится в прямой зависимости от погодных условий и сезонности их сбора. Кроме параметров выбора конкретных компонентных соотношений растений в смеси не менее важным для способа получения ЛПС из этого растительного сырья является разработка условий проведения операций технологического процесса. Согласно данному изобретению лечебно-профилактическое средство получают таким образом. Собирают надземные части указанных выше диких злаковых растений в конкретный период их вегетации, собранные растения сушат отдельно до тех пор, пока их влажность не будет равняться 8-20%. Высушенную смесь злаковых растений берут при следующем соотношении компонентов, мас.%:Calamagrostis Adans и Deschampsia Beauv=(80-20):(20-80). Потом полученную смесь трав помещают в сосуд и заливают 90-99,8% этиловым спиртом при массовом соотношении сырья к спирту в пределах 1:1-1:10. После смачивания сырья сосуд герметизируют с целью исключения доступа воздуха. Экстракцию осуществляют путем мацерации и/или ремацерации в затемненном сосуде при температуре 18-47 С с одновременным периодическим проведением контроля показателя массы сухого остатка экстракта. Если показатель массы сухого остатка равняется величине 0,5-1,5%, экстрагирование водорастворимых фракций прекращают, а выделенный экстракт сливают че-2 010742 рез стеклянный крупнопористый фильтр в посуду для хранения. Полученное лечебно-профилактическое средство является высокостабильным средством, пригодным для использования в качестве лекарственного препарата или активного начала для приготовления лекарственных препаратов. Указанный интервал влажности растений, до которого высушивают исходное сырье, является оптимальным, потому что высушивание растений до влажности, которая будет ниже 8%, приведет к потере связанной воды и, вследствие этого, к разрушению действующих экстрактивных веществ, а высушивание растительного сырья до влажности, которая будет больше 20%, приведет к тому, что содержание свободной воды в экстракте будет превышать количество свободной воды, необходимой для разведения ею экстрактивных веществ, находящихся в растениях, а это приведет к снижению содержания активного начала в экстракте. Массовое соотношение сырья к экстрагенту, составляющее 1:1-1:10, также является оптимальным,потому что при соотношении указанных компонентов больше чем 1:1, то есть содержание экстрагента по массе будет меньше, чем сырья, количество экстрактивных веществ в экстракте будет составлять более 1,5%, а это означает, что состоится коагуляция экстрагента и лекарственный препарат будет неэффективным для лечения больных. Если же массовое соотношение сырья к экстрагенту будет меньше чем 1:10, то есть если масса экстрагента превысит больше чем в 10 раз массу сырья, сухой остаток будет составлять менее 0,5%, что тоже приведет к снижению эффективности лекарственного препарата. Определение показателя массы сухого остатка экстракта осуществляют для того, чтобы установить конец процесса экстрагирования растительного сырья органическим растворителем. Выбранный интервал этого показателя, составляющий 0,5-1,5%, позволяет своевременно прекратить процесс экстракции,чтобы получить высокоэффективный конечный продукт. Причем, когда показатель массы сухого остатка будет составлять менее 0,5%, активность лечебно-профилактического средства, которая будет замедляться под действием ингибиторов, будет ниже принятых в мире рекомендаций по отбору лекарственных препаратов, то есть ниже 2 логарифмов инфекционной дозы, вследствие чего препарат будет неэффективным. Если же показатель массы сухого остатка экстракта будет составлять больше 1,5%, в полученном биологически активном веществе будет образовываться осадок, а это означает, что оно тоже будет неэффективным в качестве лекарственного препарата. Таким образом, только при массовом соотношении сырья и спирта в интервале 1:1-1:10 и при значении показателя сухого остатка в пределах 0,5-1,5% полученное ЛПС будет высокоэффективным лекарственным препаратом специфического действия. Указанный температурный интервал мацерации и/или ремацерации спиртового экстракта позволит наиболее полно проводить процесс экстрагирования ЛПС из растений, потому что при температуре ниже 18 С снижается процент выхода целевого продукта, а при температуре выше 47 С происходит разложение экстрактивных веществ путем коагуляции растительных аминокислот. Для обеспечения максимального выделения экстрактивных веществ из высушенных растений родаCalamagrostis Adans и рода Deschampsia Beauv очень важно проводить экстракцию 90-99,8% этиловым спиртом, потому что при концентрации спирта ниже 90% полнота выделения активных начал из растений значительно уменьшается, а при концентрации спирта более 99,8% выход целевого продукта не увеличивается, зато имеет место перерасход спирта. Были приготовлены 5 составов смесей растений для получения ЛПС заявляемым способом, отличавшихся друг от друга количественным содержанием компонентов (минимальное, оптимальное, максимальное и два запредельных значения), которые представленные в табл. 1. Таблица 1 Ниже приводятся конкретные примеры получения ЛПС. Пример 1. Не измельченное растительное сырье, высушенное до содержания влаги 14%, берут в следующих количествах: травы щучки дернистой 800 г (80%) и вейника наземного 200 г (20%) помещают в мацерационный бак, заливают 96% спиртом этиловым ректифицированным, нагретым до температуры экстракции 30 С, в количестве 12822 мл, причем массовое соотношение сырья к экстрагенту (спирту) в этом примере составляет 1:1. После полного смачивания сырья мацерационный бак герметизируют и термо-3 010742 статируют при температуре 30 С. Экстракцию путем мацерации и/или ремацерации осуществляют с одновременным периодическим наблюдением за показателем массы сухого остатка. Когда показатель массы сухого остатка достигает величины, равной 0,5-1,5%, процесс мацерации прекращают. Готовый экстракт сливают через стеклянный крупнопористый фильтр в затемненную стеклянную посуду и хранят при температуре 15-40 С. Выход целевого продукта ЛПС составляет 85% от массы сырья. Примеры 2-5. ЛПС получают в соответствии со способом, описанным в примере 1, но при других параметрах содержания растительных компонентов и технологического режима, которые приводятся в табл. 2. Таблица 2 ЛПС, выделенное из смеси растительного сырья согласно примерам 1-5 при указанных режимах способа получения, было исследовано в лабораторных условиях. Причем полученное ЛПС исследовали как лечебное средство в объеме доклинических испытаний. Антигерпетическую активность изучали на модели герпесвирусного менингоэнцефалита у белых беспородных мышей in vivo. ЛПС вводили по 0,25 per os до инфицирования и ежедневно на протяжении 3 суток (профилактическая схема) и через 24 ч после заражения вирусом герпеса (лечебная схема). Доза введения ЛПС составляла 0,068 мг/кг. Оценку активности ЛПС проводили путем сравнения показателей его летальности в исследовательской и контрольной группах. При этом учитывали % летальности мышей, кратность защиты (КЗ) и индекс эффективности (ИЭ). Кратность защиты (КЗ) - кратность уменьшения количества погибших мышей в исследовательской группе по сравнению с контрольной. Результаты исследований приводятся в табл. 3. Таблица 3-4 010742 Из табл. 3 видно, что экстракты ЛПС, полученные согласно предложенному способу из смеси растений компонентного состава согласно примерам 1-3, имеют выраженное профилактическое действие и эффективное лечебное действие, потому что индекс эффективности ИЭ, равный 30,0 и выше, является показателем антигерпетической активности in vivo на модели менингоэнцефалита. Экстракты ЛПС, полученные предложенным способом из смеси растений согласно примерам 4-5, имеют низкое профилактическое и слабое лечебное действие. Кроме пригодности для лечения герпеса ЛПС может также применяться для комплексного лечения гепатита В и гепатита С и лечения больных с иммунодефицитом, то есть оно обладает эффективным антивирусным действием. Кроме того, его можно использовать для изготовления лекарственных препаратов противоопухолевого действия. Полученная согласно заявляемому способу ЛПС - это жидкость зеленого цвета, имеющая горьковатый вкус и характерный запах. При смешивании ее с одинаковым объемом воды выпадает хлопьевидный осадок зеленого цвета. Состав ЛПС определяют по фармакопейным методикам (ФС к регистрационному свидетельству подР.02.01/02777 от 14.02.2001 р.). Количество флавоноидов определяли методом спектрофотометрии: спектр поглощения раствора комплекса ЛПС с алюминием хлористым приводится на фиг. 1. Оценка безопасности использования ЛПС, полученного согласно заявляемому способу, проводилась в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.007-76. Результаты исследований токсичности данного ЛПС показали, что значение LD50 составляет для мышей (9453,3-10315,8), а для крыс - (8107,0-8865,9) мг/кг. Исходя из данных, указанных в описании способа-прототипа, можно сделать вывод, что значение показателя токсичности LD50 активного вещества, полученного этим способом, равняется 350 мг/кг для мышей и 300 мг/кг для крыс. Из этого следует,что для мышей и крыс показатель токсичности ЛПС, полученного согласно заявляемому способу, почти в 30 раз превышает этот же показатель ЛПС, полученного согласно способу-прототипу. Таким образом, проведенные фармакологические исследования подтверждают, что заявляемый способ получения ЛПС по сравнению со способом-прототипом позволяет достичь более высокой эффективности избирательного специфического фармакологического влияния ЛПС на организм человека при низких показателях его токсичности. Определение признаков, характеризующих действенность ЛПС, проводили согласно методикам Государственной Фармакопеи Украины, 1 издание, Харьков, 2001 г., с использованием физико-химических методов анализа спектрофотометрии и метода тонкослойной хроматографии в соответствии с Фармакопейной статьей к регистрационному свидетельству Р.02.01/02777 от 14.02.2001 г. Видимый и ультрафиолетовый спектры поглощения жидкостного экстракта ЛПС, полученного согласно заявляемому способу, приводятся на фиг. 2, 3. Тонкослойная хроматография раствора ЛПС в системе растворителей хлороформ-ацетон (20:1) вызывает появление на полученной хроматограмме 3 пятен. Одновременно, при тех же самых условиях, хроматографируют стандартный образец раствора вещества-свидетеля: раствор хлорфилипта (фиг. 4). Параллельно с определением действенности ЛПС согласно указанной Фармакопейной статье изучали стабильность свойств ЛПС во времени. Для этого было проведено тестирование 5 производственных серий на протяжении 36 месяцев с интервалом в 6 месяцев. Оценивали действенность и стабильность ЛПС путем описания его визуальных свойств и исследования его физико-химических параметров путем использования вышеуказанных физико-химических методов анализа. Полученные результаты исследований подтвердили действенность и стабильность во времени ЛПС,полученного согласно заявляемому способу, из-за того, что на протяжении 36 месяцев описательные и основные физико-химические свойства всех 5 серий ЛПС соответствовали описанным в методиках Фармакопейной статьи, то есть на протяжении 36 месяцев ЛПС не теряло своей специфической активности. Заявляемый способ получения ЛПС может быть использован в промышленности для изготовления лекарственных препаратов без любых ограничений. Он апробирован на оборудовании ОАО Фитофарм в г.Артемовске Донецкой области. Предложенный новый способ получения ЛПС при осуществлении всей совокупности технологических операций обеспечивает получение следующего положительного результата: упрощение технологического процесса путем замены сложной операции измерения показателя преломления с помощью рефрактометра на простую операцию измерения показателя массы сухого остатка путем взвешивания; расширение интервала срока сбора дикорастущих трав семейства Gramineae конкретного рода, что позволяет повысить эффективность использования растительного сырья одного сезона для получения ЛПС; расширение интервала соотношения сырья к этиловому спирту от 1:3-1:8 в способе-прототипе до 1:1-1:10 в предложенном способе, что обеспечивает получение высокоэффективного ЛПС из-за повышения количества экстрактивных веществ (до 1,5%), обеспечивает снижение энергоемкости процесса получения лечебно-профилактического средства специфического действия из-за исключения операции опре-5 010742 деления показателя преломления экстракта с помощью дорогого аналитического прибора - рефрактометра, вследствие чего снижается его себестоимость. Заявляемый способ имеет следующий общеполезный результат: расширяет сырьевую базу для получения лечебно-профилактического средства специфического действия, предлагая использовать для этого смесь диких злаковых растений семейства Gramineae конкретного рода в широком интервале компонентного соотношения, причем сырьевая база этих диких трав достаточна для обеспечения промышленного выпуска лечебно-профилактического средства и лечебных средств на его основе; обеспечивает получение лечебно-профилактического средства специфического действия с высокой избирательной антивирусной активностью и намного более низкой токсичностью по сравнению с другими биологически активными веществами данного назначения; расширяет ассортимент биологически активных веществ, пригодных для приготовления новых лекарственных препаратов специфического действия для лечения патологических состояний, прежде всего,для лечения вирусных инфекций, вызванных вирусом простого герпеса, герпеса 1-го и 2-го типа, а также для комплексного лечения гепатита В и гепатита С и лечения больных с иммунодефицитом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения лечебно-профилактического средства из растительного сырья, в котором в качестве растительного сырья используют зеленые части растений рода Calamagrostis Adans и родаDeschampsia Beauv семейства Gramineae, раздельно высушенные до содержания влаги 8-20%, из вышеуказанного растительного сырья выделяют водорастворимые вещества экстрагированием этиловым спиртом с последующей очисткой полученной экстрагированной смеси, отличающийся тем, что указанное растительное сырье представляет собой смесь зеленых частей растений Calamagrostis Adans иDeschampsia Beauv, взятых в следующих соотношениях, мас.%: (61-80):(20-39), где указанные растения собраны в период после выметывания стеблей и до окончания цветения колосков, а экстрагирование проводят при массовом соотношении сырья к спирту 1:1-1:10, причем экстрагирование прекращают при значении показателя массы сухого остатка экстракта 0,5-1,5%. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстрагирование осуществляют методом мацерации и/или ремацерации при температуре 18-47 С. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что экстрагирование осуществляют 90-99,8% этиловым спиртом. 4. Лечебно-профилактическое средство, полученное в соответствии со способом по пп.1-3. 5. Применение лечебно-профилактического средства, полученного из растительного сырья способом, в котором в качестве сырья берут зеленые части растений рода Calamagrostis Adans и родаDeschampsia Beauv семейства Gramineae, собранные на стадии после выметывания стеблей и до окончания цветения колосков, раздельно высушивают до содержания влаги 8-20%, выделяют водорастворимые вещества путем экстрагирования этиловым спиртом с последующей очисткой полученной экстрагированной смеси, причем указанное растительное сырье представляет собой смесь растений CalamagrostisAdans и Deschampsia Beauv в соотношении, мас.%: 40-60, 60-40, для лечения вирусной инфекции.