Средство для лечения кокцидиозов у птиц и животных

СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КОКЦИДИОЗОВ У ПТИЦ И ЖИВОТНЫХ(56) Инструкция по применению Эспакокса 5% для лечения и профилактики кокцидиоза у поросят и молодняка крупного рогатого скота. Утв. Зам. Рук. Россельхознадзора, 24.09.2012 Изобретение относится к области ветеринарии. Композиция включает н-тетрадецилтри-нбутилфосфоний бромид и пентаэритрит тетранитрат (лекарственный препарат "Эринит") в качестве активных компонентов при весовом соотношении 1:2 и глюкозу как вспомогательное вещество. Композиция не токсична, обладает высокой терапевтической эффективностью при низких лечебных дозах и может быть рекомендована в качестве кокцидиостатического препарата.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "КАЗАНСКИЙ Изобретение относится к фармации, а именно к антипаразитарным фармацевтическим композициям, и может быть использовано в качестве антиэймериозного препарата в ветеринарии и медицине. Кокцидиозы - остро, подостро и хронически протекающие болезни животных и человека, вызываемые различными видами простейших, относящихся к подцарству Protozoa, типу Apicomlexa, классу Sporozoa, отряду Coccidiida, семейству Eimeriidae. Эймериозы вызываются простейшими, паразитирующими преимущественно в эпителиальных клетках кишечника. Некоторые виды паразитируют в желчных протоках печени у кроликов (Е. stiedae) и слизистой оболочке почечной лоханки гусей (Е. truncate). В организме больных эймериозом животных и птиц происходит интоксикация продуктами обмена простейших и гнилостной микрофлоры, что ведет к нарушению функций нервной системы, вызывая угнетение животных, вплоть до коматозного состояния,тремора мышц и паралича конечностей. Животные теряют в весе; мясо переболевших животных имеет низкую питательную ценность и быстро портится при хранении. У птиц снижается яйценоскость. Хозяйства несут большие расходы на приобретение препаратов для лечения, профилактики и проведение дезинвазии помещений. При сильной степени инвазии эймериозы могут вызывать массовую гибель животных (Акбаев М.Ш., Воселеевич Ф.И., Акбаев P.M. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. М.: Колос, 2008. с. 756 [1]). Для лечения эймериозов животных и птиц предложены ряд лекарственных препаратов, обладающих антиэймериозной активностью: химкокцид, трихопол, салиномицин, байкокс, нитрофурановые (фуракриллин, фуразолан, фуразолидон) и сульфаниламидные препараты (сульфадимезин, сульфадиметоксин, сульфапередозин, норсульфазол, фталазол), а также левомецетин, мономиецин и многие другие(Акбаев М.Ш., Водянов А.А., Косминков Н.Е. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. М.: Колос, 2000. с. 559 [2]; Плешаков С.А., Ларионов СВ., Розовенко М.В. Эффективность фуракриллина и фуразонала при эймериозе кроликов //Ж. "Ветеринария". 8. Саратов, 1997. с. 28-30) [3]; Плешаков С.А. Научные основы применения комплексных препаратов на базе нитрофуранов при эймериозе кроликов //Автореф. дисс. канд. вет. наук. 1999. с. 18 [4]). Однако до сих пор не найдено специфически действующих на эймерий лекарственных препаратов, а те, которые широко применяются, обладают одним или несколькими негативными свойствами: дороговизна, токсичность, кумуляция в съедобных тканях животных, иммунодепрессивное действие, опасность развития резистентных штаммов возбудителя. Несмотря на широкое использование лекарственных препаратов в качестве средств лечения и профилактики эймериозов, получить 100% показатели экстенс-и интес-эффективности не удается. Поэтому эти препараты применяются неоднократно. Например, для лечения эймериоза кроликов применяют фуразолидон по 250 мг/кг в течение 10 дней, а после 5 дневного перерыва - сульфадиметоксин - в первый день 2 г, в последующие 9 дней - по 1 г на животное (Пономаренко В.Я. К вопросу о химиопрофилактике кокцидиоза кроликов // Мат-лы научной конференции паразитологов УАССР. - 4.2. Киев, 1975. с. 116 [5]). Предложен способ лечения фуракрилином или фуразоналом в комплексе с витаминами и солями гидроксиэтилидендифосфорной кислоты, что позволяет уменьшить разовые дозы препаратов (действующего начала) до 30 мг/кг и 15 мг/кг массы тела соответственно (Патент РФ 2154470, опубл. 20.08.2000) [6]. Известен способ лечения коров, больных эймериозом, включающий скармливание с кормом кокцидина и дополнительное введение однократно 10% раствора эраконда - фитопрепарата, стимулирующего обменные процессы и повышающего резистентность организма в дозе 4,5-5,5 мг/кг массы тела (Патент РФ 2234932, опубл. 27.08.2004) [7]. Известен способ лечения эймериоза у животных и птиц, включающий двукратное с интервалом 5 дней скармливание ксимедона или ксимедонгидрохлорида в дозе 30 мг/кг массы тела мелким животным и дополнительно введение фуразолидона в дозе 20 мг/кг массы тела пятидневным курсом с интервалом 3 дня (Патент РФ 2322235, опубликован 20.04.2008, Бюл. 11) [8]. Недавно нами также был предложен новый способ лечения кокцидиозов, в частности эймериозов на основе соли четвертичного фосфония и замещенного динитробензофуроксана (Патент РФ 2473334,опубликован 27.01.2013, Бюл. 3), включающий двукратный прием с интервалом в 24 часа фармацевтическую композицию "Депрот-14" в дозе 4 мг/кг (в пересчете на действующее вещество - соль фосфония) при ЛД 50 2500 мг/кг. Заявленное техническое решение, однако, позволило создать более эффективный антиэймериозный препарат "Депрот-эрин" с более низкой одноразовой лечебной дозой 2,5 мг/кг и более высоким значением ЛД 50 10300 мг/кг и удешевить предполагаемое производство препарата, также за счет замены требующего организации синтеза динитробензофуроксанового производного уже выпускающегося в России многими фармпредприятиями лекарственного препарата эринита. Таким образом, принцип использования антиэймериозных препаратов основан на многократном их применении, что неиндифферентно для любого организма. Многие из них обладают токсическим, раздражающим и иммунодепрессивным действием. Кроме того, длительное применение одного кокцидиостатика приводит к появлению устойчивых рас эймерий, которые вызывают явления дисбактериоза, способствуют угнетению ферментативной активности желудочно-кишечного тракта и могут быть причиной других функциональных изменений в организме животных. Кроме того, при применении сульфаниламидов могут возникнуть аллергические реакции и другие побочные явления: дерматиты, лейкопения, невриты. Вследствие плохой растворимости сульфаниламиды и особенно продукты их ацетилирования, образующиеся в организме путем замещения водорода аминогруппы остатком уксусной кислоты, могут выпадать в почках в виде кристаллов и закупоривать мочевые пути (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Ч. 2. М., Медицина, 1993, с. 688.). [9]. Следовательно, изыскание новых препаратов и схем их применения для профилактики и лечения эймериозов животных, птиц и человека, воздействующих на различные звенья патологического процесса, является актуальной задачей, как фармации, так и ветеринарии. Задачей заявленного технического решения является создание эффективного нетоксичного антиэймериозного препарата нового поколения на основе соли четвертичного фосфония (которая проникает через мембрану паразита, встраиваясь в нее, как синтетический аналог - фрагмент природной мембраны паразита), обладающего характерным комплексом свойств: сверхнизкими лечебными дозами 2,5 мг/кг в пересчете на действующее вещество А - соль фосфония; высоким значением ЛД 50 10300 мг/кг; высокой эффективностью в отношении эймерий, обеспечивающей расширение арсенала известных малоэффективных, токсичных и дорогостоящих средств указанного назначения. Техническим результатом заявленного изобретения является создание новой по механизму действия нетоксичной (ЛД 50 10300 мг/кг) фармацевтической композиции "Депрот-эрин", эффективной для лечения эймериозов при 1-кратном приеме в дозе 30 мг/кг (в пересчете на действующее вещество - соль фосфония А - 2,5 мг/кг). Препарат принимается 1 раз в день в утреннее кормление. Заявленный технический результат достигается применением композиции "Депрот-эрин", содержащей н-тетрадецилтри-н-бутилфосфоний бромид (А) и пентаэритрит тетранитрат (известный лекарственный препарат "Эринит") (В) в качестве активных компонентов, при весовом соотношении 1:2 и глюкозу (вспомогательное вещество): Как нами показано, четвертичные соли фосфония обладают высокими антибактериальными свойствами вследствие взаимодействия с липидными компонентами клеточных мембран [Галкина И.В., Мельникова Н.Б., Тудрий Е.В., Галкин В.И., Жильцова О.Е., Жукова О.В., Егорова С.Н. Взаимодействие солей фосфония с липидными компонентами мембран / Фармация, 2009. 4. с. 35-38.]. Как было указано выше, нами ранее была показана высокая антиэймериозная активность фармацевтической композиции на основе соли четвертичного фосфония (А) с нитропроизводными бензофуроксанов, где последние использовались в качестве генераторов NO [Пат. РФ 2473334, опубл. 27.01.2013, Бюл. 3]. Теперь в качестве генератора NO нами предлагается дешевый и широко применяемый в медицинской практике известный препарат эринит (В) [Марцевич С.Ю., Метелица В.И. Эффективность эринита при стенокардии// Сов. мед., 1987.2. с. 67-70]. Из исследованного уровня техники не выявлены сведения о наличии антиэймериозной активности у эринита и у солей четвертичного фосфония, как по отдельности, так и в совокупности, что является доказательством соответствия заявленного технического решения критерию"новизна", предъявляемому к изобретениям. При этом широко известны антибактериальные, противогрибковые и антимикробные свойства приведенных выше солей фосфония [Галкина И.В, Тудрий Е.В.,Бахтиярова Ю.В., Егорова С.Н., Галкин В.И. Синтез, строение и исследование биологической активности солей фосфония / В сб.: Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ. Казань, 2008. с. 23; pat. JP 2002308713, publ. 23.10.2002; pat. JP 2005060332,publ. 10.03.2005; pat. JP 2000316701, publ. 21.11.2003]. Активные компоненты заявляемой композиции на основе соли четвертичного фосфония и эринита используются в заявленном техническом решении по новому для них назначению - в качестве антиэймериозного препарата, что не является очевидным для специалиста в анализируемой области техники; таким образом, заявленное техническое решение соответствует критерию "изобретательский уровень", предъявляемому к изобретениям. Заявленное техническое решение соответствует критерию "промышленная применимость", предъявляемому к изобретениям, т.к. заявленная композиция может быть получена посредством использования известных компонентов с применением стандартного оборудования и известных приемов. Сущность заявленного технического решения заключается в создании антиэймериозной композиции, содержащей н-тетрадецилтри-н-бутилфосфоний бромид и пентаэритрит тетранитрат (эринит) в ка-2 024747 честве активных компонентов при их весовом соотношении 1:2 и глюкозу как вспомогательное вещество. Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом: 1. получают первый действующий компонент (А) заявляемой композиции -н-тетрадецилтри-нбутилфосфонийбромид формулы способом, описанным в [Галкина И.В., Мельникова Н.Б., Тудрий Е.В., Галкин В.И., Жильцова О.Е.,Жукова О.В., Егорова С.Н. Взаимодействие солей фосфония с липидными компонентами мембран / Фармация, 2009. 4. с. 35-38.]: 2. второй действующий компонент - эринит - 2,2-бис-[(нитроокси)-метил]-1,3-пропандиола динитрат (ИЮПАК) формулы (В) является отечественным легкодоступным и дешевым продажным препаратом (производители: Фармапол-Волга ООО, Россия, ТАТХИМФАРМ-ПРЕПАРАТЫ. Казанское производственное химикофармацевтическое объединение, Россия и др.). По фармакологическому действию эринит близок к нитроглицерину и другим органическим нитратам. Не растворяется в воде. Оказывает сосудорасширяющее действие, влияя на центральную регуляцию кровообращения и непосредственно расслабляя гладкую мускулатуру сосудов. Отличается от нитроглицерина медленным развитием эффекта, большей длительностью действия и значительно меньшим влиянием на артериальное давление. Не изменяет или слегка уменьшает работу сердца, расслабляет гладкую мускулатуру внутренних органов. Хорошо всасывается в желудочно-кишечном тракте. Через 4-8 ч после введения внутрь в дозе 40 мг минимальная концентрация эринита в крови составляет 0,2-0,25 мкг/мл. В крови около 85% связывается с белками. Эринит разрушается преимущественно до моно- и динитратов и в меньшей мере - до пентаэритритола. Около 90% введенной дозы выводится в течение 48 ч главным образом почками. Небольшое количество препарата выводится с желчью [Машковский М.Д. Лекарственные средства (пособие для врачей). 16-е издание. Изд.: М. Новая волна, 2010. с. 398.]. Все вышеописанные параметры эринита способствуют эффективному всасыванию только в желудочно-кишечном тракте основного действующего вещества А предлагаемой нами фармацевтической композиции - соли фосфония и через 2 дня полностью через почки удаляется из организма и не обнаруживается в мясной продукции пролеченных животных. Глюкозу кристаллическую медицинскую использовали по ГОСТ 975-88 в качестве питательного вещества для простейших и наполнителя (производитель Днепропетровский крахмально-паточный комбинат). Заявленное техническое решение иллюстрируется примерами. Пример 1. Получение антиэймериозной композиции "Депрот-эрин" и лекарственных форм на ее основе. В фарфоровой ступке смешивают и растирают 99,82 г глюкозы, 0,7 г н-тетрадецилтри-нбутилфосфоний бромида А и 35 г эринита - пентаэритритила тетранитрата В до получения бесцветного однородного порошка, увлажняют 14 мл 32% сахарного сиропа (фармацевтическая композиция "Депротэрин"). Гранулируют через сито с диаметром отверстий 1,5 мм. Сушат на воздухе. Порошок является лекарственной формой для лечения птиц. Для дозирования у животных порошком наполняли облатки(дозированные закрывающиеся контейнеры из крахмала). Пероральная дозированная лекарственная форма весом 0,5 г содержала 0,0025 г соли фосфония (А), 0,005 г пентаэритрита тетранитрата (В) и 0,36 г глюкозы. Пример 2. Изучение антиэймериозной активности препарата "Депрот-эрин" в отношении смешанного эймериоза птиц и животных, вызванного эймерией: Е. meleagrimitis, E. gallopavonis, E. adenoeides, E.dispersa, E. meleagridis, E. innocua, E. subrotunda, E. tenella, E. maxima, E. acervulina, E. necatrix, E. stiedae,Е. perforans, E. magna, E. media и др. Для определения лечебной эффективности соединения "Депрот-эрин" при эймериозе птиц и животных проводили в трех опытах. В первом опыте антиэймериозная активность препарата исследована в условиях вивария кафедры паразитологии и радиобиологии ФГБОУ ВПО "Казанская государственная академия ветеринарной медицины" в апреле-мае 2013 г. на 36 индюшатах в возрасте 20 суток. Индюшат заражали смешанной культурой спорулированных ооцист эймерий (Е. meleagrimitis, E. gallopavonis, E. adenoeides, E. dispersa, E. me-3 024747leagridis, E. innocua, E. subrotunda и др.) в дозе 3 тыс. ооцист на кг птицы, после чего их разделили на 3 группы по 10 голов в каждой. При этом обращали внимание на пол и живую массу птиц. Во время эксперимента индюшата содержались в клетках вивария кафедры паразитологии и радиобиологии и питались комбикормом. Через 7 суток после заражения первая группа индюшат получила препарат "Депрот-эрин" однократно в дозе 2,5 мг/кг по действующему веществу (ДВ) или 30 мг/кг синтезированной фармацевтической композиции. 2-я группа получала сульфадимезин один раз в день в дозе 20 мг/кг 3-дневным курсом с перерывом 2 дня - всего 6 дней. 3-я группа цыплят не получала лекарственных препаратов и являлась контрольной. Помет от всех групп индюшат исследовали по методу Котельникова и Вареничева до лечения и на 3, 7 и 14 сутки после окончания лечения. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 1. Таблица 1 Сравнительная эффективность препаратов "Депрот-эрин" и сульфадимезина при лечении эймериоза индеек Данные табл. 1 показывают, что у индюшат экспериментально зараженных эймериозом до лечения интенсивность инвазии колебалась от 421,3 до 702,1 ооцист кокцидий в поле зрения микроскопа (об. 8, ок. 10). Через 3 суток после проведенной терапии в первой группе (препарат "Депрот-эрин") интенсивность инвазии составила 350,2, а интенсэффективность и экстенссэффективность 50 и 80% соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии равнялась в первой группе 180,1, интенсэффективность и экстенсэффективность лечения 74,3 и 80% соответственно. Во 2-й группе (препарат сравнения сульфадимезин) интенсивность инвазии на 3 сутки проведенной терапии составила 532,2. Интенсэффективность и экстесэффективность лечения составили 14,5 и 50% соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии составила 381,1, интенсэффективность лечения 38,8%, экстессэффективность - 60%. Во время опыта в первой группе индюшат ни одного падежа не было зафиксировано. Во 2-й группе пало двое индюшат, в контрольной - четыре. Таким образом, для освобождения индюшат второй группы от кокцидий потребовалось больше времени, чем в первой. При этом показатели интенсэффективности и экстенсэффективности были ниже, чем в первой группе. В контрольной - 3-й - группе интенсивность эймериозной инвазии в период опыта возросла с 421,3 до 1202,2 в конце опыта. Во втором опыте использовали 45 цыплят 40-дневного возраста. Цыплят заражали смешанной культурой спорулированных ооцист эймерий (, Е. tenella, E. maxima, E. acervulina, E. necatrix и др.) в дозе 15000 ооцист на голову, после чего их разделили на 3 группы по 15 голов в каждой. Через 7 суток после заражения 1-й группе цыплят скармливали препарат "Депрот-эрин" однократно, в дозе 2,5 мг/кг по действующему веществу (ДВ) или 30 мг/кг синтезированной фармацевтической композиции. Для сравнения цыплятам второй группы в утреннее кормление добавляли кокцидиовит в дозе 80 мг на кг корма (8 мг/кг веса цыпленка) в течение 5 дней. 3-я группа цыплят не получала лекарственных препаратов и являлась контрольной. Помет от каждого цыпленка во всех группах исследовали по методу Котельникова и Вареничева до лечения и на 3, 7 и 14 сутки после окончания лечения. Результаты исследований отображены в табл. 2. Таблица 2 Сравнительная эффективность препаратов "Депрот-эрин" и кокцидиовит при лечении эймериоз кур Из табл. 2 следует, что у цыплят экспериментально зараженных эймериозом до лечения интенсивность инвазии колебалась от 521,6 до 871,3 ооцист кокцидий в поле зрения микроскопа (об. 8,ок. 10). Через трое суток после проведения соответствующей терапии препаратом "Депрот-эрин" в первой группе интенсивность инвазии составила 360,2, а интенсэффективность и экстенсэффективность 58,6% и 90% соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии составила в первой группе 142,1,интенсэффективность и экстенсэффективность лечения 83,9 и 90% соответственно. Во второй группе (препарат сравнения кокцидиовит) интенсивность инвазии на третьи сутки после терапии составила 411,3. Интенсэффективность и экстесэффективность лечения составили 21,2 и 60% соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии составила 261,1, интенсэффективность лечения 50, экстенсэффективность - 70%. В контрольной третьей группе цыплят интенсивность инвазии к 14 суткам возросла и равнялась 1822,4. В третьем опыте использовали 21 кролика средним весом 2,5 кг, свободных от эймерий и гельминтов. Кроликов заражали смешанной культурой спорулизованных ооцист эймерий (Е. stiedae, E. perforans,E. magna, E. media и др.). Для этого не спорулированные ооцисты эймерий культивировали в чашках Петри в термостате при температуре 26-27 С, периодически орошая дехлорированной водой. Суспензию ооцист отмывали 2 раза водопроводной водой центрифугированием и подсчитывали количество ооцист в 1 мл. Каждому животному перорально вводили ооцисты эймерий в расчете 25000 на 1 кг массы. После заражения кролики были разделены на 3 группы. Через 10 дней после заражения животным первой группы вместе с кормом давали препарат "Депрот-эрин" в дозе 2,5 мг/кг по действующему веществу (ДВ) однократно, второй группе скармливали сульфадимезин однократно в дозе 20 мг/кг в течение 3-х дней с перерывом 2 дня (всего 6 дней). Третья группа кроликов служила в качестве контроля. Животные в течение опыта находились в одинаковых условиях содержания, предотвращающих спонтанное заражение. Кормление животных осуществлялось в соответствии с зоотехническими и ветеринарно-санитарными нормами. Ежедневно проводили клинический осмотр поголовья и обращали внимание на поведение кроликов. Пробы фекалий для исследования брали до заражения и после окончания терапии через 3, 7 и 14 дней. Для копрологических исследований проб фекалий использовали метод Кательникова и Вареничева. Данные о противоэймериозной эффективности препаратов представлены в табл. 3. Таблица 3 Сравнительная эффективность препаратов "Депрот-эрин" и сульфадимезина при лечении эймериоза кроликов Из табл. 3 видно, что до лечения все кролики были заражены кокцидиозом, интенсивность инвазии(ИИ) колебалась от 972,2 до 1421,1 ооцист эймерий в поле зрения микроскопа (об. 8, ок. 10). Через 3 суток после окончания лечения в первой группе (препарат "Депрот-эрин") интенсивность инвазии составила 670,1, а интенсэффективность и экстессэффективность 49,3 и 80% соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии составила в первой группе 3302, интенсэффективность и экстенсэффективность лечения 75 и 80% соответственно. Во второй группе (препарат сульфадимезин) интенсивность инвазии на 3 сутки после окончания терапии составила 862,4. Интенсэффективность и экстесэффективность лечения составили 39,5 и 60% соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии составила 411,3, интенсэффективность лечения 71,2, экстенсэффективность - 60%. У кроликов контрольной группы интенсивность эймериозной инвазии в ходе опыта не снижалась, и составила через трое суток 1221,6, через семь суток 1361,0, через 14 суток 1631,7. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что после лечения экспериментально зараженных эймериозом кроликов интенсэффективность соединения "Депрот-эрин" была выше, чем при лечении сульфадимезином. Пример 3. Определение острой токсичности "Депрот-Эрин". Работа по изучению острой токсичности проводилась в виварии кафедры паразитологии и радиобиологии КГАВМ им. Н.Э. Баумана в феврале 2013 года. В опыте использовались 80 белых крыс, самцов и самок, массой 220-250 г. Препарат в виде водной суспензии вводили в желудок однократно с помощью зонда. Лабораторные животные (учитывался пол, возраст, масса тела) были разделены на 8 групп: 7 опытных и одну контрольную (по 10 голов в каждой). Крысам опытных групп вводили препарат в возрастающих дозах. Крысам контрольной группы в желудок вводили дистиллированную воду. За состоянием здоровья лабораторных животных наблюдали в течение 15 дней, учитывая общее состояние животных, подвижность, прием корма. Случаи гибели регистрировали, павших животных вскрывали. Установлено, что при внутрижелудочном введении крысам LD50 составила 10300 мг/кг массы тела. Согласно ГОСТ 12.1.007-76 "Депрот-эрин" относится к веществам четвертого класса опасности - не обладающее токсичностью. Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, "Депрот-эрин" обладает выраженной антиэймериозной активностью при низких лечебных дозах и при этом не обладает токсичностью и. иными побочными действиями на организме животных и птиц. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Антиэймериозная фармацевтическая композиция, содержащая н-тетрадецилтри-н-бутилфосфоний бромид и пентаэритрит тетранитрат (лекарственный препарат "Эринит") в качестве активных компонентов при их весовом соотношении 1:2 и глюкозу как вспомогательное вещество.