Термофильный штамм водоросли chlorella vulgaris buzovna для получения биомассы и способ получения биомассы данного штамма

ТЕРМОФИЛЬНЫЙ ШТАММ ВОДОРОСЛИ CHLORELLA VULGARIS BUZOVNA ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ДАННОГО ШТАММАCZ-B6-288638 Усенко О.М. и др., "Влияние раундапа на фотосинтез пресноводных водорослей",Материалы Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 70-летию кафедры зоологии и экологии ГОУ ВПО, Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований, Вологда, 2008, стр. 101-104,особенно стр. 102 Изобретение относится к биотехнологии, к получению биомассы с широким спектром использования в различных сферах человеческой деятельности: медицине, косметологии, спорте,сельском хозяйстве и ветеринарии. Термофильный штамм Chlorella vulqaris Buzovna CCAP 211/115 получен путем прямого выделения из природного водоема (реликтового озера БеюкШор) на Апшеронском полуострове Азербайджанской Республики. Способ получения биомассы штамма микроводоросли Chlorella vulqaris Buzovna CCAP 211/115 осуществляют в условиях,обеспечивающих фотосинтез при естественном солнечном и/или искусственном освещении при pH 4-10, температуре 25-40C, путем культивирования штамма в течение 5-10 суток с периодическим отделением биомассы от жидкой фазы, направляемой на рекультивацию путем обратного осмоса,в перемешиваемой унифицированной среде Тамия, содержащей (г/л): нитрата калия 0,5; сульфата аммония 0,2; фосфата кальция 0,03; гидрокарбоната натрия 1,0; сульфата магния 0,08; хлорида калия 0,0025; сульфата железа (II) 0,15; нитрата кобальта 0,00001; сульфата цинка 0,00002; аммония ванадиевокислого 0,00002; хлорида марганца 0,00001. Перемешивание суспензии осуществляют механически и/или барботированием воздухом или смесью воздух:CO2 в соотношении (98-99,8): Абдулрагимбеков Юсиф Мансур оглы,Омаров Фархад Сабир оглы (AZ) 017614 Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой термофильный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris Buzovna, предназначенный для получения и переработки биомассы в качестве добавки в корма для птицеводства, животноводства, рыбоводства и шелководства [2, 3,5, 6, 7]. Не менее важным является использование биомассы Chlorella vulgaris Buzovna для получения биологического топлива - биодизеля, очистки сточных вод и утилизации CO2. Известен термофильный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris N с температурным оптимумом 42C, полученный методом мутационной селекции с использованием нитрозометилмочевины из дикого штамма 132. Штамм депонизирован в ВКПМ под N A-29. Представлены морфологические и физиологические свойства штамма. Культивирование в лабораторных условиях на среде Тамийя, в опытно-промышленных условиях на минеральных средах. [RU, 2005777, C12N 1/12, 15.01.1994]. Недостатком штамма Chlorella vulgaris N является узкий температурный спектр (42C), приспособленность к условиям жаркого климата Средней Азии и культивированию в стеклотрубных фотореакторах промышленного типа (патент RU 2005777). Известен и штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ЛАРГ-3, предназначенный для целей промышленного производства. Температурный оптимум роста этого штамма 38C, при котором продуктивность штамма составляет 45-50 г асв/м в сутки. Известен и способ биологической очистки сточных вод рыбообрабатывающих предприятий с использованием штамма Chlorella kesslerl IPPA C-112 (патент RU 2064454). Сущность способа заключается в обработке сточных вод микроводорослями Chlorella kesslerl IPPA C-112 с целью формирования альгоценоза. Недостатком этого способа является узкий спектр очистки - только сточных вод рыбообрабатывающих предприятий - и неполная очистка от микроорганизмов.Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris N C-111, обладающий высокой продуктивностью и отвечающий требованиям промышленного культивирования (Авт. св. SU 1751981). Недостатком штамма Chlorella vulgaris N C111 является сезонность в развитии (с мая по декабрь), требовательность к составу питательной среды,стойкий цикл развития клеток, узкий спектр температуры культивирования (26-36C). Известен способ искусственного культивирования микроводорослей (патент RU 2175013, МПК 7C12N 1/12, A01G 33/00) путем фотосинтеза при воздействии на них люминесцентного оптического излучения и тепла, вызванных от источника энергии ядерных излучений. Однако использование такого способа экологически небезопасно и неэкономично. Наиболее близким к заявляемому изобретению является штамм одноклеточной зеленой водорослиChlorella vulqaris BIN, предназначенный для получения биомассы и очистки сточных вод. Штамм культивируется при 20-40C на обедненной жидкой питательной среде, приготовленный на водопроводной воде при естественном и искусственном освещении. Описаны морфологические и физиологические признаки штамма, а также способность к очистке различных категорий сточных вод. Переносит высушивание, замораживание и кратковременный перегрев до 46C. Штамм Chlorella vulqaris BIN хранится в Пензенском НИИ сельского хозяйства под 12. Недостатками данного штамма является недостаточная устойчивость к высоким температурам,низкая способность накопления биомассы, большой расход пресной воды, отсутствие рекультивации питательной среды. Задачей изобретения является получение нового термофильного, солеустойчивого штамма одноклеточной зеленой микроскопической водоросли Chlorella vulqaris Buzovna, обладающего широким спектром температуры промышленного культивирования (10-45C), не требовательного к питательной среде. Задачей изобретения является усовершенствование способа получения биомассы термофильного штамма Chlorella vulqaris Buzovna, пригодного для крупномасштабного промышленного культивирования. Поставленная задача решается заявленным термофильным штаммом микроводоросли Chlorellavulqaris Buzovna CCAP 211/115 для получения биомассы. И способом получения биомассы микроводоросли Chlorella vulqaris Buzovna фотосинтезом при естественном и/или искусственном освещении, в водной питательной среде, включающим выращивание при температуре 25-40C, перемешивание суспензии микроводорослей механически и/или барботированием воздухом или смесью воздуха с CO2 и периодические отбор биомассы и подпитку питательным раствором, в котором после отбора биомассы водную питательную среду подвергают рекультивации путем обратного осмоса, а питательный раствор содержит(грамм/литр): нитрат калия 0,5; сульфат аммония 0,2; фосфат кальция 0,03; гидрокарбонат натрия 1,0; сульфат магния 0,08; хлорид калия 0,0025; сульфат железа 0,15; нитрат кобальта 0,00001; сульфат цинка 0,00002; аммоний ванадиевокислый 0,00002; хлорид марганца 0,00001, при этом фотосинтез осуществляют при pH=4-10 в течение 5-10 суток. Термофильность Chlorella vulqaris Buzovna предполагает высокий температурный оптимум +45C для получения биомассы, а повышенная солеустойчивость позволяет клеткам этого штамма выдерживать концентрации соли NaCl до 1 М (58 г/л). Кроме этого штамм выдерживает широкий диапазон кислотности (pH) в процессе культивирования. Поставленная цель была достигнута в результате многолетней работы, проводившейся в условиях непрерывного мониторинга природных озер (водоемов) Азербайджана и лабораторной практики, что привело к заявлению высокопро-1 017614 дуктивного штамма Chlorella vulqaris Buzovna. Штамм получен путем прямого выделения из природного водоема (реликтового озера Беюк-Шор) на Апшеронском полуострове Азербайджанской Республики. Штамм Chlorella vulqaris Buzovna депонирован в Culture Collection of Algae and Protozoa SAMS ReseachChlorella vulqaris Buzovna. Суспензия культуры клеток Chlorella vulqaris Buzovna отличается однородностью и равномерностью. Молодые клетки - шаровидной или слабоэллипсоидной формы, размером от 2 до 4 мкм, взрослые клетки - шаровидные диаметром 5-8 мкм. Размножение этих микроводорослей упрощено до предела. У них полностью отсутствует половое размножение и рост культуры идет за счет формирования в материнской клетке дочерних автоспор, которых может быть в норме 2, 4, 8, 16, 32 (известно образование до 64 автоспор) в зависимости от условий культивирования. После окончания деления автоспоры выходят из клетки путем разрыва оболочки; молодые клетки, при интенсивном фотосинтезе, растут до стадии созревания, после чего весь цикл повторяется сначала. В определенные периоды развития по циклу клетки нуждаются в свете, а в другие развитие может проходить в темноте. Эта особенность облегчает получение синхронной культуры микроводорослей Chlorella (культура, в которой все клетки находятся на одной и той же стадии развития). Chlorella выращивается на жидкой унифицированной питательной среде содержащей (на 1 л): нитрат калия 0,5; сульфат аммония 0,2; фосфат кальция 0,03; гидрокарбонат натрия 1,0; сульфат магния 0,08; хлорид калия 0,0025; сульфат железа (II) 0,15; нитрат кобальта 0,00001; сульфат цинка 0,00002; аммоний ванадиевокислый 0,00002; хлорид марганца 0,00001. Окраска темно-зеленая, клетки не осаждаются, в суспензии распределены равномерно (отличные планктонные свойства, что очень важно для промышленного выращивания). Обрастание стенок культуральных сосудов (колб и других лабораторынх сосудов, включая емкости фотореакторов) не отмечается в течение 10 дней. Штамм Chlorella vulqaris Buzovna автотрофный. В лабораторных условиях растет на средах Т амия или же воде с добавлением на 1 л: комплексное азотно-фосфатно-калийное удобрение (аммофос) 1 г; поваренная соль (хлористый натрий) - 5,0 г. Штамм не требователен к источникам азотного питания, наравне с аммиачной селитрой хорошо растет на любых азотсодержащих минеральных солях. Штамм не требует подачи в культуру углекислого газа (CO2). При обеспечении 2% CO2 в воздушной смеси для барботирования (продувки) происходит 2-х кратное увеличение продуктивности. Оптимальные условия культивирования достигаются как при естественном солнечном освещении, так и при освещении культуры люминесцентными лампами, в лотках с открытой поверхностью и толщиной слоя суспензии, не превышающей 40 см, или в стеклянных (пластиковых) фотобиореакторах. Штамм обладает хорошо выраженными планктонными свойствами, т. е. способностью свободного парения и равномерного распределения в культуральной (питательной) среде. В процессе культивирования живые клетки практически не осаждаются. В состоянии покоя осаждение клеток начинается через 10-11 дней. Для культивирования штамма механического перемешивания суспензии не требуется. Оптимальная температура культивирования 30-35C, Хорошо выносит высушивание и замораживание, переносит перегрев до 55C. Стойкого цикла развития штамма не имеется, клетки в культуре развиваются асинхронно. Устойчивое развитие штамма не зависит от сезона года или источника освещения. Физиолого-биохимические свойства Chlorella vulqaris Buzovna (в % сухой биомассы): белок - 55%; липиды(жиры) - 12%; углеводы - 10,0-25,0%; зола - 7-8%. Штамм имеет чрезвычайно высокую пластичность метаболизма, то есть способность радикально менять направленность биосинтеза в зависимости от условий культивирования и при различных воздействиях. Углеводы могут быть представлены крахмалом и преимущественно гемицеллюлозами. Липиды составляют 20-30% и отличаются значительным содержанием ненасыщенных жирных кислот. Соотношение жирных кислот у хлореллы сходно с соотношением, которое характерно для большинства растительных масел. Поэтому биомассы Chlorella vulgaris Buzovna можно применять для производства биодизеля [7,8]. Содержание аминокислот зависит от состава питательных сред и уловий культивирования [1, 4](параметрическое управление направленным синтезом (г/кг воздушно-сухого вещества), следующее: глутаминовая кислота - 30,0-38,0; аспарагиновая кислота - 20,0-25,0; лейцин - 15,0-22,0; алании - 20,0-24,0; валин - 16,0-17,0; глицин - 14,0-18,0; треонин - 12,0-15,5; фенилаланин - 11,0-12,0; серии - 11,0-12,0;-2 017614 изолейцин - 10,0-11,0; пролин - 8,0-9,5; лизин - 7,0-8,0; тирозин - 8,0-9,0; аргинин - 6,0-9,0; цистин - 6,0-8,0; триптофан - 5,0-6,0; метионин - 3,0-5,0; гистидин - 1,0-3,0. В суспензии Chlorella vulgaris Buzovna синтезируется значительное количество витаминов. Как известно, витамины B12 и D растениями не синтезируются, однако в хлорелле они присутствуют в значительном количестве. В 100 г сухой биомассы хлореллы [2, 3, 4, 5] содержится 7-9 мкг витамина B12 и 100 мг витамина D. В биомассе хлореллы витамина C столько же, сколько в лимоне. Содержание в хлорелле некоторых витаминов следующее (мкг/г сухого вещества): бетта-каротин (провитамин A) - 1000,0-1300,0; токоферол (E) - 150,0-180,0; никотиновая кислота - 120,0-140,0; рибофлавин (B2) - 6,0-7,0; пиридоксин (B6) - 4,0-6,0; тиамин - 3,0-5,0. Штамм Chlorella vulgaris Buzovna проявляет хорошо выраженные антагонистические свойства к альгофлоре, бактериям, грибам, дрожжам и инфузориям. Бактерии гибнут и осаждаются на дно. Штамм строго соблюдает условия монокультуры и обладает невосприимчивостью к фагам. Штамм отличается высокой продуктивностью и способностью к очистке различных категорий сточных вод, в том числе промышленных, сельскохозяйственных и бытовых. Условия хранения. Штамм хранится на агаризованных (1-2% агар-агар) питательных средах и в обедненной питательной среде Тамия. Главной отличительной особенностью предложенного способа является рекультивирование питательной среды, которое осуществляется путем обратного осмоса на установке соответствующего объема. Таким образом, данный способ становится полностью безотходным. И, соответственно, практически полностью (96-98%) обеспечивается возврат всей воды, применяемой в получении биомассы. Способ получение биомассы Chlorella vulgaris Buzovna (фактически аквакультура), включает: выращивание (фотосинтез) биомассы микроводоросли в питательном растворе неорганических солей, обеспечение освещения и режима термостатирования (нагревания) культивируемой питательной среды для получения заданного состава; конструктивные и строительные особенности биореакторов; проектные решения, состав культивируемой среды; сушку и упаковку. Основное сооружение для получения биомассы - биореактор - представляет собой бетонный резервуар с глубиной жидкости 0,55 м (метра), шириной 4 м и длиной 10 м. Бассейн разделен продольной перегородкой высотой 0,5 м (метра), толщиной 0,2 м и длиной 8 м. Он имеет систему сдвижного накрытия прозрачной полимерной пленкой (дугообразная конструкция, в случае необходимости может быть автоматизирована). Перемешивание суспензии микроводорослей осуществляют механически и/или барботированием воздухом. Термостатирование (подогрев) суспензии (культивируемой жидкости) обеспечивают за счет солнечного освещения, а также резервной системой электрообогрева. Сооружения представляют собой резервуары, насосы, коммуникации, модули для разведения солей, блок маточной культуры (чистого посевного материала). Способ получения биомассы предусматривает поглощение углекислого газа из воздуха. Полученная биомасса отделяется от культивируемой среды при помощи сепарации через марлевые поддоны или помощи проточной центрифуги. Биомасса сушится на специальных поддонах или же в распылительной сушилке. В среднем способ получения биомассы водорослей Chlorella vulgaris Buzovna для применения в пищевой индустрии, фармакологии и сельском хозяйстве составляет 7-10 дней. Изобретение представлено примером его исполнения. Пример 1. Термофильный штамм одноклеточных микроводорослей Chlorella vulgaris Buzovna выращивают в бетонный резервуаре с глубиной жидкости 0,55 м (метра), шириной 4 м и длиной 10 м. Бассейн разделен продольной перегородкой высотой 0,5 м (метра), толщиной 0,2 м и длиной 8 м. Он имеет систему сдвижного накрытия прозрачной полимерной пленкой (дугообразная конструкция, в случае необходимости может быть автоматизирована). Для перемешивания суспензии микроводорослей используется специальный редукторная крыльчатка (лопасти для перемешивания) и дополнительно специальная система барботажа (перемешивание струей воздуха). Термостатирование (подогрев) суспензии (культивируемой жидкости) обеспечивается за счет солнечного освещения, а также резервной системой электрообогрева. Разработан состав питательного раствора для получения биомассы с корректировкой по составу в случае направленного синтеза целевых продуктов (параметрическое управление биосинтезом через состав питательных растворов). Сооружения представляют собой резервуары, насосы, коммуникации, модули для-3 017614 разведения солей, блок маточной культуры (чистого посевного материала). Способ получения биомассы предусматривает поглощение углекислого газа из воздуха. Вместимостью этого бассейнового реактора составляет от 16 до 18 куб.метров суспензии. Получение биомассы проводится на унифицированной среде Тамия в накопительном режиме, содержащей, г/л: нитрат калия 0,5; сульфат аммония 0,2; фосфат кальция 0,03; гидрокарбонат натрия 1,0; сульфат магния 0,08; хлорида калия 0,0025; сульфат железа (II)1%-ный раствор 0,15 мл; нитрат кобальта 0,00001; сульфат цинка 0,00002; аммоний ванадиевокислый 0,00002; хлорид марганца 0,00001. Культивирование проводят на нейтральной среде (pH=7,0) и при температуре 25C и естественном солнечном освещении (продолжительность светового дня 12 ч) в течение 10 суток. Применяется естественное солнечное освещение (продолжительность светового дня 8-10 ч весенней и осенний период) и 7-8 суток (продолжительность светового дня 12 ч) в летний период. Температурный режим "день-ночь" составляет порядка 5C. По завершении процесса культивации биомассу отделяют от жидкой фазы сепарацией, жидкую фазу направляют на стандартную установку обратного осмоса для рекультивации. Выход биомассы составил 45 кг (весенней и осенний период) - 65 кг (летний период). Пример 2. Термофильный штамм одноклеточных микроводорослей Chlorella vulgaris Buzovna выращивают в стеклотрубном культиваторе (закрытом фотобиореакторе) объемом 1500 л на среде. Получение биомассы проводится на унифицированной среде Тамия в накопительном режиме, содержащей, г/л: нитрат калия 0,5; сульфат аммония 0,2; фосфат кальция 0,03; гидрокарбонат натрия 1,0; сульфат магния 0,08; хлорида калия 0,0025; сульфат железа (II) 0,15; нитрат кобальта 0,00001; сульфат цинка 0,00002; аммоний ванадиевокислый 0,00002; хлорид марганца 0,00001. Культивирование проводят на нейтральной среде(pH=8,0) и при температуре 40C. Выращивание осуществляли при постоянной облученности лампамиT3 SLIM SPIRAL E27 в проточном режиме. Процесс перемешивания перистальтическим насосом. Интенсивность воздухообмена 70 г/л суспензии /ч (компрессор). Насыщение CO2 (углекислым газом) осуществляется при помощи воздушной смеси из воздуха. Общий цикл культивирования 5 дней. Отбор биомассы начинается с 3-го дня культивирования. Средний уровень накопления биомассы 0,7-0,8 г асв/л в сутки. По завершении процесса культивации биомассу отделяют от жидкой фазы сепарацией, жидкую фазу направляют на стандартную установку обратного осмоса для рекультивации. Широкий спектр применимости биомассы термофильного штамма одноклеточных микроводорослей Chlorella vulqaris Buzovna складывается из использовани биомассы в сельском хозяйстве и фармакологии. Литература 1. Zarrouck, C. Contribution a l'etude d'une cyanophycee. Influence de divers physiques et chimiques sur laenvironmental conditions. Phytochemistry, 1987, vol. 26. 8. Ciferri P., Tiboni O. The biochemistry and industrial potential of Spirulina. Ann. Rev. Microbiol, 1985,vol. 39. 9. Vonshak A., Richmond A. Mass production of the blue-green alga Spirulina: an overview. Biomass,1988, vol. 15. 10. Ed. Vonshak A. Spirulina platensis (Arthrospira): Physiology, Cell-biology and Biotechnology, London: Bristol, TaylorFrancis, 1997, 233 p. 11. Moorhead K.J., Morgan H.C. Spirulina nature's superfood. -Published by Nutrex, Inc. USA, 1995. 12. Boone L.R., Castenholz R.W., Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.1. NY, Heidelberg,Berlin: Springer-Verlag, 2001. 13. Gershwin M.E. (University of California, Davis, USA); Belay Amha (Earthrise Nutritionals, Calipatria,California, USA) Spirulina in Human Nutrition and Health, 2007, Number of Pages:328. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Термофильный штамм микроводоросли Chlorella vulgaris Buzovna CCAP 211/115 для получения биомассы. 2. Способ получения биомассы штамма микроводоросли Chlorella vulgaris Buzovna CCAP 211/115 в-4 017614 условиях, обеспечивающих фотосинтез при естественном солнечном и/или искусственном освещении при pH 4-10, температуре 25-40C, путем культивирования штамма в течение 5-10 суток с периодическим отделением биомассы от жидкой фазы, направляемой на рекультивацию путем обратного осмоса, в перемешиваемой унифицированной среде Тамия, содержащей (г/л): нитрата калия 0,5; сульфата аммония 0,2; фосфата кальция 0,03; гидрокарбоната натрия 1,0; сульфата магния 0,08; хлорида калия 0,0025; сульфата железа (II) 0,15; нитрата кобальта 0,00001; сульфата цинка 0,00002; аммония ванадиевокислого 0,00002; хлорида марганца 0,00001. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что перемешивание суспензии осуществляют механически и/или барботированием воздухом или смесью воздух:CO2 в соотношении (98-99,8):(0,2-2) соответственно.