Термофильный штамм микроводоросли dunaliella bardawil masazir для получения биомассы и способ получения биомассы данного штамма

MASAZIR ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ДАННОГО ШТАММАbardawil и предназначено для получения и переработки биомассы в качестве добавки в корма для птицеводства, животноводства, рыбоводства и шелководства, а также может быть использовано в фармакологии и косметологии. Термофильный штамм Dunaliella bardawil Masazir CCAP 19/38 в качестве продуцента белково-каротиновой биомассы получен путем прямого выделения из природного водоема (реликтового озера Масазыр) на Апшеронском полуострове Азербайджанской Республики. Способ получения биомассы микроводоросли фотосинтезом в водной питательной среде заключается в выращивании, перемешивании суспензии микроводорослей, периодических подпитке среды питательным раствором и отборе биомассы, после которого водную питательную среду подвергают рекультивации путем обратного осмоса. Абдулрагимбеков Юсиф Мансур оглы,Омаров Фархад Сабир оглы (AZ)bardawil и предназначено для получения и переработки биомассы в качестве добавки в корма для птицеводства, животноводства, рыбоводства и шелководства, а также может быть использовано в фармакологии и косметологии. Изобретение описывает новый штамм одноклеточной микроскопической водоросли Dunaliella bardawil (авторское имя Masazir).Dunaliella bardawil Masazir - зелная одноклеточная микроскопическая водоросль, обитающая в гиперсолных водоемах (озеро Масазыр, Апшеронский п-ов, Азербайджанская Республика). Dunaliella bardawil Masazir обладает невероятно широким диапазоном приспособленности к экстремальным воздействиям внешней среды. Это уникальный организм, который в условиях чрезвычайно высоких концентраций солей (NaCl) в водоеме способен синтезировать целый ряд полезных соединений, таких как каротин (провитамин A), глицерин, ненасыщенные жирные кислоты. В биотехнологии особый интерес представляла биомасса Dunaliella bardawill как источник -каротина [7, 8, 14], поскольку это соединение высокоэффективный природный антиоксидант (широко используется в пищевой промышленности при производстве сливочного масла, сыров), в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, а также в лечебно-профилактическом питании при профилактике и лечении онкологических,инфекционных и сердечно-сосудистых заболеваний. Наиболее важным является тот факт, что Dunaliellabardawil Masazir как пищевая добавка, является таким же организмом, как и высшие растения (к примеру, морковь), употребление которых в пищу в отличие от искусственных препаратов не влечет за собой никаких побочных эффектов. Dunaliella bardawil Masazir в определенных условиях способна к гиперсинтезу -каротина [4]. Его содержание может достигать 9% от сухой массы водорослей [14], что является наиболее высоким показателем по сравнению с другими продуцентами -каротина (морковь Daucus sativus, гриб Blakeslea trispora). Это позволяет считать микроводоросль наиболее перспективным источником -каротина для биотехнологической промышленности. Систематика Dunaliella - это планктонные одноклеточные жгутиковые зеленые солеустойчивые микроводоросли [1]. Согласно альгологической системе классификации [5] таксономическое положениеDunaliella отражает схема: Царство (Kingdom) Plantae; Класс (Class) Chlorophyceae; Отдел (Division) Chlorophycota; Порядок (Order) Volvocales; Семейство (Family) Dunaliellaceae; Род (Genus) Dunaliella; Вид (Species) Dunaliella bardawil Masazir. Наиболее близкими к предложенному являются штаммы Dunaliella из Украины и Израиля. Dunaliella salina Teodoresko ssp. Штамм Massjuk (Масюк) 1962/9 Ukraine, Crimea, salt factory in town SakiInstitute of Botany, Academy of Sciences of the Czech Republic, Centre of Phycology, Dukelskd 135, CZ-379 82. Этот штамм обладает типичными морфологическими, физиологическими и биохимическими признаками, присущими водорослям рода Dunaliella. Относительный недостаток известного штамма состоит в сравнительно низком уровне накопления биомассы в условиях культивирования 0,3-0,4 г (абс. сухого вещества) на 1 л суспензии в сутки и в нестабильности в условиях длительной непрерывной культуры(выраженном полиморфизме, значительном снижении продуктивности). Известен штамм Dunaliella bardawil Amotz and Avron, ATCC 30861, этот штамм выделен из природного соленого озера рядом с Bardawil Lagoon, Северный Синай, Израиль, 1976, штамм депонированA.Ben-Amotz, в Международной коллекции American Type Culture Collection (ATCC) P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA. Этот штамм также имеет более низкую продуктивность. Наиболее близким к заявляемому способу куьтивирования по изобретению является способ культивирования спирулины, включающий выращивание водоросли на горьковато-соленой воде в условиях естественной освещенности и температуры с барботированием суспензии водоросли воздухом при периодическом отборе биомассы и подкормка среды минеральными солями (патент UA 34839, МПК(8)A01G 33/00). Недостатком данного способа является зависимость от естественного освещения и обогрева в условиях открытых бассейнов. Задачей изобретения является получение термофильного штамма Dunaliella bardawil, обладающего повышенной способностью к накоплению биомассы и обеспечение его крупномасштабного промышленного культивирования на безотходной основе. Поставленная задача решается заявленным термофильным штаммом микроводоросли Dunaliellabardawil Masazir CCAP 19/38 в качестве продуцента белково-каротиновой биомассы и способом получения биомассы солеустойчивой микроводоросли Dunaliella bardawil Masazir фотосинтезом в водной питательной среде, включающим выращивание, перемешивание суспензии микроводорослей механически и/или барботированием воздухом и/или смесью воздуха с CO2 в соотношении (98-99,8):(0,2-2) соответст-1 017565 венно и периодические отбор биомассы и подпитку питательным раствором, в котором после отбора биомассы водную питательную среду подвергают рекультивации путем обратного осмоса. Питательный раствор содержит (г/л): нитрат натрия - 3,0; гидрофосфат калия - 0,2; сульфат магния - 0,5; гидрокарбонат натрия - (1,0-16,0); хлорид кальция - (0,02-0,04); хлорид натрия - (58,0-116,0); сульфат железа(II) 0,001; натриевая соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) - 0,03; борная кислота - 0,0029; хлорид марганца - 0,0018; сульфат цинка - 0,0002; аммоний молибденовокислый - 0,00003, хлорид кобальта - 0,00005. Фотосинтез осуществляют при естественном и/или искусственном освещении, рН питательной среды 612, температуре 10-45 С в течение 5-10 суток. Изобретение описывает новый штамм (авторское имя Masazir), выделенный из природного реликтового озера Масазыр (Апшеронский полуостров, Азербайджанская республика) в результате многолетней работы, проводившейся в условиях непрерывного мониторинга природных озер (водоемов) Азербайджана и лабораторной практики. Эти уникальные водоросли за счет массового развития и придают озеру Масазыр бардовый цвет. Предлагаемый штамм водоросли Dunaliella bardawil Masazir является более продуктивным по сравнению с известным и обладает потенциалом для широкого промышленного применения. Имеются научные данные, что Dunaliella участвовала в генезисе (образовании) нефти в Азербайджане. Штамм Dunaliella bardawil Masazir депонирован в Culture Collection of Algae and Protozoa SAMS Research Services Ltd. Scottish Association for Marine Science Scottish Marine Institute Dunbeg, Argyll, PA37 1QA, UK Web page: www.sams.ac.uk/ Catalogue web page: http://www.ccap.ac.uk Tel:(44) 1631 559000, Direct dial: (44) 1631 559386, Fax: (44) 1631 559001 под номером CCAP 19/38. Морфологические признаки Dunaliella bardawil Masazir. Клетки микроводоросли водоросли Dunaliella bardawil Masazir разнообразной формы: овальные, эллипсоидные, яйцевидные, грушевидные, иногда шаровидные, цилиндрические или веретеновидные; радиально- или билатерально-симметричные, редко дорсивентральные или слегка ассиметричные. После длительной экспозиции на солнечном свете клетки Dunaliella bardawil Masazir приобретают практически шаровидную форму. Длина может колебаться от 6 до 30 мк, ширина от 5 до 20 мк; объм клеток от 65 до 4500 куб.мк. Хлоропласт по цвету чаще всего красный (красно-бурый) или другой оттенок красного цвета (при произрастании на естественном солнечном освещении). Иногда зеленый (желто-зеленый) или другой оттенок зеленого цвета. По форме хлоропласт обычно чашевидный с пиреноидом и глазком(красного цвета), реже без них. По обе стороны от папиллы, на выпуклом апикальном конце клетки прикреплены два жгутика. Обычно жгутики одинаковой длины, равной или превышающей длину клетки. Для Dunaliella bardawil Masazir характерны вегетативный, бесполый и половой типы размножения. Первый является преобладающим и происходит путм продольного деления клеток. Физиолого-биохимические свойства Dunaliella bardawil Masazir. Химический состав Dunaliella bardawil Masazir по органическим и неорганическим показателям. Состав, %: белок - 10-57; углеводы - 10-32; липиды - 7-30; зольность - 5-7; нуклеиновые кислоты - 6-7; хлорофиллы - 0,01-6; каротиноиды - 0,03-10. Состав, г/100 г массы: углерод - 45,4; водород - 6,3; азот - 10,71; фосфор - 3,3. Применение Dunaliella bardawil Masazir. Биомасса предназначена для непосредственного применения во многих отраслях (фармацевтика,пищевая индустрия, сельское хозяйство [3, 9, 10, 11, 12, 13]. Условия хранения. Штамм хранится на агаризованных питательных средах и в обедненной питательной среде (унифицированные среды ON) (г/л): нитрат натрия - 3,0; гидрофосфат калия - 0,2; сульфат магния - 0,5; гидрокарбонат натрия - (1,0-16,0); хлорид кальция - (0,02-0,04); хлорид натрия - (58,0-116,0); сульфат железа(II) - 0,001; натриевая соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) - 0,03; борная кислота - 0,0029; хлорид марганца - 0,0018; сульфат цинка - 0,0002; аммоний молибденовокислый - 0,00003, хлорид кобальта 0,00005. Штамм Dunaliella bardawil Masazir имеет широкий спектр температуры культивирования (10-45C). Отсутствует сезонность в его размножении. Штамм не требователен к питательной среде.Dunaliella Bardawil Masazir продуцент -каротина и глицерина для фармакологии, косметологии,-2 017565 производства биоактивных витаминных добавок для сельскохозяйственных кормов. Эта микроводоросль пригодна для употребления в пищу, а также для введения в качестве компонента в другие продукты. По функциональной активности Dunaliella bardawill может быть отнесена к группе нутрицевтиков. Dunaliella bardawil Masazir - уникальный организм [2], способный синтезировать -каротин, который является мощным антиоксидантом. В пищевой промышленности -каротин используется как краситель. Кроме того, солеустойчивые экстремофильные микроводоросли Dunaliella являются источником не только -каротина, но и целого ряда биологически ценных веществ (например, жирных кислот высокой степени ненасыщенности, которые не синтезируются пресноводными видами). Способ получения биомассы Dunaliella bardawil Masazir (фактически аквакультура) включает выращивание (фотосинтез) биомассы микроводоросли в питательном растворе неорганических солей, обеспечение освещения и режима термостатирования (нагревания) культивируемой питательной среды для получения заданного состава; конструктивные и строительные особенности биореакторов; проектные решения, состав культивируемой среды; сушку и упаковку. Основное сооружение для получения биомассы - биореактор - представляет собой бетонный резервуар с глубиной жидкости 0,55 м, шириной 4 м и длиной 10 м. Бассейн разделен продольной перегородкой высотой 0,5 м, толщиной 0,2 м и длиной 8 м. Он имеет систему сдвижного накрытия прозрачной полимерной пленкой (дугообразная конструкция, в случае необходимости может быть автоматизирована). Перемешивание суспензии микроводорослей осуществляют механически и/или барботированием воздухом. Термостатирование (подогрев) суспензии (культивируемой жидкости) обеспечивают за счет солнечного освещения, а также резервной системой электрообогрева. Сооружения представляют собой резервуары, насосы, коммуникации, модули для разведения солей, блок маточной культуры (чистого посевного материала). Способ получения биомассы предусматривает поглощение углекислого газа из воздуха. Полученная биомасса отделяется от культивируемой среды при помощи сепарации через марлевые поддоны или при помощи проточной центрифуги. Биомасса сушится на специальных поддонах или же в распылительной сушилке. В среднем способ получения биомассы водорослей Dunaliella bardawil Masazir и применения в пищевой индустрии, фармакологии и сельском хозяйстве составляет 7-10 дней. Главной отличительной особенностью предложенного способа является рекультивирование питательной среды,которое осуществляется путем обратного осмоса на установке соответствующего объема. Таким образом, данный способ становится полностью безотходным. И, соответственно, практически полностью (9698%) обеспечивается возврат всей воды, применяемой в получении биомассы. Способ культивирования штамма Dunaliella bardawil Masazir представлен на конкретных примерах его исполнения. Пример 1. Штамм Dunaliella bardawil Masazir выращивают в конических колбах вместимостью 1000 мл на среде в накопительном режиме, содержащей, г/л: нитрат натрия - 3,0; гидрофосфат калия - 0,2; сульфат магния - 0,5; гидрокарбонат натрия - 16,0; хлорид кальция - 0,03; хлорид натрия - 58,0; сульфат железа(II) - 0,001; натриевая соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) - 0,03; борная кислота - 0,0029; хлорид марганца - 0,0018; сульфат цинка - 0,0002; аммоний молибденовокислый - 0,00003, хлорид кобальта 0,00005. Культивирование проводят при pH среды 8,0, температуре 25C и естественном солнечном освещении (продолжительность светового дня 12 ч) в течение 5 суток. Температурный режим "день-ночь" обеспечивает колебания порядка 5C (разница между дневной и ночной температурами). По завершении процесса культивации биомассу отделяют от жидкой фазы сепарацией, жидкую фазу направляют на стандартную установку обратного осмоса для рекультивации. Выход биомассы составил 0,3 г асв/л. Пример 2. Штамм Dunaliella bardawil Masazir выращивают в специальных стеклянных лотках (на культиваторе) объемом 10,0 л в накопительном режиме на среде, содержащей, г/л: нитрат натрия - 3,0; гидрофосфат калия - 0,2; сульфат магния - 0,5; гидрокарбонат натрия - (1,0-16,0); хлорид кальция - 0,04; хлорид натрия - 106,0; сульфат железа(II) - 0,001; натриевая соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) 0,03; борная кислота - 0,0029; хлорид марганца - 0,0018; сульфат цинка - 0,0002; аммоний молибденовокислый - 0,00003, хлорид кобальта - 0,00005. Культивирование проводят при pH среды 7,0, температуре 30C и естественном солнечном освещении (продолжительность светового дня 12 ч) в течение 5 суток. Температурный режим "день-ночь" колебания порядка 5C. Процесс перемешивания осуществлялся микрокомпрессорами (в режиме 1 ч работы /15 мин барботажа на 45 мин покоя). По завершении процесса культивации биомассу отделяют от жидкой фазы сепарацией, жидкую фазу направляют на стандартную установку обратного осмоса для рекультивации. Выход биомассы составил 0,4 г/л. Пример 3. Штамм Dunaliella bardawil Masazir выращивают в стеклотрубном культиваторе объемом 15 л на среде в проточном (непрерывном) режиме, содержащей, г/л: нитрат натрия - 3,0, двузамещенный фосфат калия - 0,2, сульфат магния - 0,5, бикарбонат натрия - 16,0, хлорид кальция - 0,02, хлорид натрия 116,0, сернокислое железо - 0,001, натриевая соль ЭДТА - 0,03, борная кислота - 0,0029, хлористый марганец - 0,0018, сернокислый цинк - 0,0002, молибденовокислый аммоний - 0,00003, хлористый кобальт 0,00005. Культивирование проводят при pH среды 10,0, температуре 45C и при постоянной облученности лампами T3 SLIM SPIRAL E27 в проточном режиме. Процесс перемешивания осуществлялся микрокомпрессорами. Интенсивность воздухообмена 70 г/л суспензии/ч. Насыщение CO2 (углекислым газом) осуществляют барботированием смесью воздух:CO2 99,5:0,5. Отбор биомассы начинается с 3-го дня-3 017565 культивирования. Средний уровень накопления биомассы 0,3-0,5 г асв/л в сутки. По завершении процесса культивации биомассу отделяют от жидкой фазы сепарацией, жидкую фазу направляют на стандартную установку обратного осмоса для рекультивации. Представленные данные свидетельствуют о значительных физиолого-морфологических отличиях предлагаемого термофильного штамма Dunaliella bardawil Masazir от известных и о его технологических преимуществах перед известными штаммами [4, 5]. Широкий спектр применимости Dunaliella bardawilMasazir складывается из двух основных направлений: использование самой биомассы и использование биомассы как сырья для получения каких-либо ценных веществ [7, 8, 9]. Литература 1. Владимирова М.Г., Семененко В.Е. Интенсивная культура одноклеточных водорослей.//М.: Издво АН СССР, 61 стр., 1962. 2. Юрина Е.В. Сравнительно-физиологическая характеристика двух видов гипергалинных водорослей.//М.: Наука, 320 стр., 1965. 3. Lee Yuan-Kun Micro algal mass culture systems and methods: Their limitation and potential//J. Appl.Phycol., vol. 13, p. 307-315, 2001. 4. Isler O. Carotenoids.//Basel; Stuttgart: Birkhauser verlag. 905 p., 1971. 5. Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. - Киев: Наук., думка, 242 стр., 1973. 6. Рамазанов 3.М., Клячко-Гурвич Г.Л., Ксенофонтов А.Л., Семененко В.Е. Влияние субоптимальной температуры на содержание бета-каротина и липидов у галофильной водоросли Dunaliella(CCAP19/18 WT) under stress conditions, DARU Volume 14, No. 3, 2006. 14. Ami Ben-Amotz, Bio-Fuel and CO2 Capture by Algae, Israel, ANR Meeting on "Third generation Biofuels", 5th February, 2009. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Термофильный штамм микроводоросли Dunaliella bardawil Masazir CCAP 19/38 продуцент белково-каротиновой биомассы. 2. Способ получения белково-каротиновой биомассы термофильного штамма микроводоросли Dunaliella bardawil Masazir CCAP 19/38 в условиях, обеспечивающих фотосинтез при естественном солнечном и/или искусственном освещении, при pH питательной среды 6-12, температуре 10-45 С путем культивирования штамма в течение 5-10 суток с периодическим отделением биомассы от жидкой фазы, направляемой на рекультивацию путм обратного осмоса, в перемешиваемой среде, содержащей, г/л: нитрата натрия - 3,0; гидрофосфата калия - 0,2; сульфата магния - 0,5; гидрокарбоната натрия - 1,0-16,0; хлорида кальция - 0,02-0,04; хлорида натрия - 58,0-116,0; сульфата железа(II) - 0,001; натриевой соли этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) - 0,03; борной кислоты - 0,0029; хлорида марганца - 0,0018; сульфата цинка - 0,0002; аммония молибденовокислого - 0,00003, хлорида кобальта - 0,00005. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что перемешивание суспензии осуществляют механически и/или барботированием воздухом или смесью воздуха с CO2 в соотношении (98-99,8):(0,2-2) соответственно. Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2