Биопрепарат для защиты растений от болезней, стимуляции роста сельскохозяйственных и декоративных растений на основе бактерий pseudomonas putida всб-692

1 Изобретение относится к биотехнологии и касается получения экологически безопасных биологических средств борьбы с заболеваниями растений, стимулирования их роста и повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Борьба с болезнями растений, вызываемыми различными микроорганизмами, относится к важнейшим мероприятиям по их защите и охране. Что же касается сельскохозяйственных растений, то их защита от действия микрофитопатогенов представляет собой одно из основных звеньев комплекса мероприятий по повышению их урожайности. Следует заметить, что заболевания микробиогенного происхождения наносят значительный, а иногда катастрофический ущерб при выращивании как декоративных, так и сельскохозяйственных культур. Главная цель применения регуляторов роста - повышение урожайности, устойчивости к полеганию и экстремальным факторам окружающей среды, стимулирование прорастания семян, особенно при пониженных температурах и других неблагоприятных условиях. Большое значение в борьбе с болезнями растений и повышения урожайности сельскохозяйственных культур имеет выведение и возделывание устойчивых и высокопродуктивных сортов. Однако создание таких сортов требует длительного времени. Кроме того, в процессе эволюции в природе возникают все новые формы фитопатогенных организмов. Защита растений от болезней химическими методами и применение регуляторов роста химической природы в настоящее время вызывает большое беспокойство со стороны экологических служб, т.к. химические средства защиты растений эффективны далеко не против всех болезней. Помимо этого, химические вещества накапливаются в почвах и загрязняют пищевые продукты и окружающую среду. Ко многим химическим препаратам вредители уже приобрели устойчивость. Эти средства защиты лишены избирательности действия и опасны для всей фауны наземных членистоногих - опылителей и хищников. Многие из химических препаратов высоко токсичны для теплокровных и человека (1-3 классы опасности). В связи с этим значительный интерес представляют биологические методы борьбы с болезнями растений и стимуляции роста. Главное преимущество биологического метода защиты растений - высокая избирательность. Биологические средства позволяют регулировать численность одного вида или группы видов, не затрагивая природные комплексы полезных организмов. Особенно важно то, что они не оказывают неблагоприятного действия на здоровье человека. В настоящее время известно достаточно большое количество биопрепаратов для защиты растений и стимуляции роста на основе микро 003389 2 организмов (патенты РФ 2019966, 2069953,2084152, 2086128, 2104645, 2120775, 1792614). Предлагаются также комплексные биопрепараты на основе ассоциации микроорганизмов разного систематического положения (патенты РФ 2170510, 2149552). В основе действия всех известных биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенов лежат существующие в природе естественные явления паразитизма или антагонизма между микроорганизмами, обитающими на растениях и в почве. Среди биопрепаратов особо выделяют препараты, полученные на основе бактерий р.Pseudomonas, особенно представителей флуоресцирующей группы Р.aeruginosa и P.fluorescens. Бактерии р.Pseudomonas являются постоянными обитателями ризосферы разнообразных растений. Для них давно известна способность к денитрификации, а недавно признана их способность проводить азотфиксацию. Данные виды псевдомонад относятся к наиболее активным видам миколитических бактерий, т.е. видам,оказывающим литическое действие на многие почвенные грибы в т.ч. фитопатогенные. Антагонистические свойства данных бактерий обусловлены не только синтезом антибиотиков, они образуют сложный комплекс веществ, включающий антибиотические вещества, белковые соединения и пептиды группы бактериоцинов и микроцинов, литические ферменты, сидерофоры и другие биологически активные соединения. Установлено, что важную роль в защите растений от инфекции играют такие свойства псевдомонад, как способность к активной колонизации корневой системы и вытеснение тем самым из ризосферной зоны фитопатогенных микроорганизмов. Известны биопрепараты на основе бактерий Pseudomonas для защиты растений от грибных фитопатогенов. Патенты РФ 2154943,2104645 описывают препараты на основе бактерий Р.fluorescens. В патенте РФ 2121271 описан препарат на основе бактерий Р.lemoignei. В патентах 2130261, 2130262, 2069953 - препараты на основе бактерий Р.species. Все вышеперечисленные биопрепараты активны против широкого спектра заболеваний растений (пероноспороз, антрокноз, черная ножка, серая и белая гниль, фузариоз), вызываемых фитопатогенными грибамиPythium,Rhizoctonia,Fusarium, Alternaria, Phytophtora и др. Помимо веществ антибиотической природы, флуорисцирующие виды псевдомонад синтезируют вещества, стимулирующие прорастание семян и рост растений (патент РФ 2130261). Таким образом, в настоящее время создано достаточно много биологических препаратов для стимулирования роста растений и защиты их от различных заболеваний. Однако поиск новых высокоэффективных штаммов является актуальной задачей, т.к. позволяет не только 3 получить новый биопрепарат с новыми свойствами, но и значительно снизить затраты на его производство. Наиболее близким к заявленному изобретению являются биопрепараты, описанные в патентах РФ 2151586, 2130261. Согласно изобретению РФ 2130261 биопрепарат получают на основе бактерий Р.species. Препарат предназначен для защиты растений от фитопатогенной микрофлоры и для стимуляции роста растений. Для получения препарата используют среду, содержащую пептон - 1%, дрожжевой экстракт - 0,5%, NaCl - 1%. Культивирование ведут в течение 16-18 ч при 28 - 30 С. Получают суспензию, содержащую 5 х 1010 кл/мл, которую используют для обработки семян. Однако из представленного авторами описания невозможно определить, каким образом готовят рабочий раствор, т.е. в каком количестве воды разводят произведенную суспензию и каким образом проводят обработку семян, что затрудняет оценить эффективность препарата. Помимо этого, в примере 2 при оценке действия штаммапродуцента на фитопатогенные грибы использовали метод агаровых блочков, согласно которому бактерии Р.species выращивали на агаризованной среде Кинга Б, которая специально используется для синтеза и обнаружения сидерофоров - веществ ингибирующих рост фитопатогенной микрофлоры. При производстве препарата используют среду иного состава, на которой сидерофоры могут не образовываться или образовываться в недостаточном количестве,что может отразиться на эффективности препарата. В патенте РФ 2051586 предлагается препарат для стимуляции роста растений на основе штамма бактерий Pseudomonas putida ВКПМ - 4308. Стимулирующий эффект достигается путем замачивания семян растений в суспензии штамма в концентрации 1,5 х 106 - 1,5 х 107 клеток на 1 г семян. Штамм не снижает всхожести семян, хорошо сохраняется в почве и ризосфере растений, может размножаться в этих условиях. Стимулирующее действие штамма зарегистрировано в отношении 9-и технических культур (люпина, сои, фасоли, вики, чумизы,тыквы, клевера и рапса), 7-и зерновых (кукурузы, овса, пшеницы, ячменя, проса, ржи и гречихи), а также в отношении ряда овощных культур(томата, редиса, огурцов, салата, свеклы и картофеля). Штамм оказывает стимулирующее действие как на рост корневой системы, так и на рост надземной части растений. В описанном патенте рабочую суспензию препарата готовили путем смыва с косяков суточной культуры, выращенной на питательной среде с рыбным гидролизатом. Данные условия приготовления препарата позволяют оценить лишь потенциальные возможности штамма бактерий и не позволяют оценить эффективность 4 готового препарата, полученного на основе данного штамма в промышленных условиях на производственной среде. Кроме того, препарат на основе описанного штамма предлагается только как стимулирующее рост растений средство. Задачей изобретения явилась разработка нового высокоэффективного биопрепарата для защиты растений от заболеваний, стимуляции роста растений и повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Поставленная цель достигается тем, что из природных условий выделен новый штамм бактерий Pseudomonas putida ВСБ - 692. На основе данного штамма разработана технология получения биопрепарата и схема его применения для защиты растений от болезней и стимуляции их роста. Сущность изобретения заключается в следующем: на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и микроэлементы, в условиях аэрации и перемешивания выращивают бактерии Pseudomonasputida штамм ВСБ - 692 в течение 48 ч при температуре 30 С. В полученную суспензию добавляют стабилизатор, в качестве которого используют традиционные консерванты (в частности бензоат натрия, хлорид кальция, хлорид натрия и др.). В результате получают концентрированный биопрепарат, который далее используется для приготовления рабочего раствора. Рабочий раствор используют для корневой и внекорневой обработки растений, обработки почвы и семян. Пример 1. Штамм бактерий Pseudomonas putida ВСБ 692 выращивали в колбах на качалке на минеральной среде следующего состава: пептон - 20 г, глицерин - 8 мл, сульфат магния - 1,5 г, фосфат калия двузамещенный - 1,5 г, вода - 1,0 л. рН среды 7,0-7,2. Время выращивания 48 ч,температура 30 С. Далее в полученную суспензию добавляли бензоат натрия в количестве 0,6%. Данный раствор является концентрированным биопрепаратом. Рабочий раствор готовили следующим образом: 10 мл концентрированного биопрепарата разводили в 1 л воды. Объектом служила смесь газонных трав,рекомендованная для газонов футбольных полей средней полосы России, состава: овсяница луговая - 30%, райграс пастбищный - 40%, клевер белый - 10%, тимофеевка луговая - 20%. Результаты определения всхожести по ГОСТ 12038 - 84 (Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести) показали следующее: всхожесть контрольной выборки составила 53%; опытной, обработанной препаратом - 81%. Исследования процесса вегетации смеси газонных трав проводили в условиях открытого грунта на делянках в Мытищинском районе Мо 5 сковской области. Норма высева семян 120 кг на гектар. Посевы на опытной делянке дважды поливали рабочим раствором биопрепарата с интервалом в 7 дней. Контроль вегетативных органов травосмеси проводили в середине вегетационного периода вырезкой образцов дернины шириной 0,1 м и длиной 0,5 м. Исследования показали, что мощность корневой системы опытных образцов значительно превосходит контрольные, общая длина корней на одно растение в 2,5 - 3,5 раза больше в опытных образцах по сравнению с контролем,количество листовых пластин также в опытных образцах в 1,5 раза больше, чем в контроле (см. фотографии на фиг. 1 и 2). Пример 2. Условия выращивания культуры и приготовления рабочего раствора препарата такие же,как в примере 1. Семена огурцов для закрытого грунта сорт Родничок замачивали в рабочем растворе биопрепарата в течение 12 ч, затем высевали семена в грунт. В процессе выращивания рассаду поливали под корень рабочим раствором биопрепарата на стадии 2-х семидольных и 4-х настоящих листьев. Отмечена стимуляция вегетативного роста рассады огурцов (фотография на фиг. 3). Пример 3. Условия выращивания бактерий и приготовления рабочего раствора препарата такие же,как в примере 1. Объектом исследований служили листья астры новобельгийской с признаками поражения фитопатогенным грибом, вызывающим заболевание мучнистой росой. Листья опрыскивали рабочим раствором биопрепарата, помещали в чашки Петри с питательной средой суслоагар и инкубировали при температуре 30 С. Листья контрольных образцов опрыскивали стерильной водопроводной водой и также помещали в чашки Петри с агаризованной средой сусло. В кон трольном образце через 3-е суток инкубирования отмечался достаточно активный рост мицелия гриба. В опытном образце отмечалось угнетение роста гриба, воздушный мицелий не развивался, однако наблюдался очень слабый точечный рост субстратного мицелия гриба. После повторной обработки поверхности листа биопрепаратом рост гриба полностью прекратился. В контроле лист полностью покрыт мицелием гриба. Пример 4. Условия выращивания бактерий и приготовления рабочего раствора биопрепарата такие же, как в примере 1. Изучали действие биопрепарата на фитопатогенные грибы: Alternaria species, Fusariumoxysporum, Phytophtora infestans. Фитопатогенные грибы высевали на чашки Петри с агаризованной средой сусло поверхностно, инкубировали в течение 3-х суток при температуре 30 С. Далее на поверхность выросших грибов наносили стерильную почву слоем 1 см. В контрольном варианте почву опрыскивали стерильной водой, в опытном - рабочим раствором биопрепарата. Чашки Петри помещали в термостат и инкубировали в течение 5 суток. Во всех опытных образцах отмечалось значительное угнетение роста фитопатогенных грибов по сравнению с контрольными образцами. Внешний вид вегетативных органов спортивного травяного газона контрольный образец - традиционная агротехнология Внешний вид вегетативных органов спортивного травяного газона опытный образец - двукратная обработка биопрепаратом время посева семян - 4.06.2001 г.; время контроля дернины - 4.08.2001 г. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Штамм бактерий Pseudomonas putida ВСБ-692 для получения препарата против возбудителей заболеваний растений и стимуляции роста. 2. Препарат для защиты растений от заболеваний и стимуляции роста, представляющий собой суспензию штамма Pseudomonas putida ВСБ-692 с добавлением стабилизатора. время посева семян - 4.06.2001 г.; время контроля дернины - 4.08.2001 г. Вегетативный рост огурцов сорт Родничок: 1 - контроль,2 - при обработке препаратом