Способ получения 13с-мочевины из 13со2

1 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к способам получения мочевины, изотопно меченой по углероду, из меченого диоксида углерода. 13 Смочевина находит применение в медицинской практике при тестировании патогенных бактерий Helicobacter pylori. Предпосылки создания изобретения Недавние медико-биологические исследования показали, что некоторые заболевания желудочно-кишечного тракта, такие как язва желудка и гастрит, а также отдельные легочные заболевания (некоторые типы пневмоний), вызываются патогенными бактериями Helicobacterpylori. Проведение статистических обследований населения показало, что данный тип патогенной флоры, и, следовательно, предрасположенность к гастриту и язве желудка, имеется у 40% европейцев и более чем 60% жителей юговосточной Азии, поэтому тестирование на наличие и количество Helicobacter pylori является исключительно важным [ЕР 253927 G 01N 33/497 27.01.88; Kajiwa Masahiro et al. Am. Clin.Lab. 1997, V 16(6), P 28-29]. До недавнего времени в большинстве клиник тесты на присутствие этих патогенных бактерий были связаны с процедурой забора желудочного сока у пациентов и длительными по времени и дорогостоящими микробиологическими анализами. На данный момент разработан, прошел клинические испытания и начал применяться в медицинской практике метод дыхательных тестов, основанный на способности определяемых бактерий расщеплять мочевину с образованием аммиака и углекислого газа. При использовании в качестве тестового вещества - мочевины, обогащенной стабильным природным изотопом углерода 13 С, образующийся меченый углекислый газ, легко определяется в выдыхаемом воздухе массспектрометрически, и по его наличию и концентрации количественно определяют присутствие данных бактерий в желудочно-кишечном тракте. Кроме того, изотоп 13 С является магнитным и метаболизм соединений, меченых этим изотопом, легко отследить непосредственно в организме методом ЯМР томографии. Таким образом, разработка способа получения меченой по углероду мочевины в достаточных количествах (сотни грамм) является исключительно важной. Предшествующий уровень техники Известно множество способов получения немеченой мочевины из диоксида углерода и аммиака. Процесс осуществляют при повышенной температуре 200 С и давлении 196 атмосфер и получают целевой продукт с хорошим выходом и достаточно высокой чистоты [см.,например, патенты RU 20503351 C1, GВ 995184,DE 3133765, US 4301299]. Однако ни один из этих способов не пригоден для синтеза меченой 2 мочевины поскольку при этом имеет место изотопный обмен с растворителем и материалом реактора. Известные до настоящего времени методы синтеза 13 С-мочевины из доступного меченого диоксида углерода многостадийны [А. Мэррей,Д.Л. Уильямс. Синтезы органических соединений с изотопами углерода, Москва, ИЛ, 1962 г.] и поэтому малоприемлемы для синтеза значительных количеств меченой мочевины (сотни грамм) по причине трудоемкости, низкого суммарного выхода в пересчете на исходный диоксид углерода и невозможности масштабировать процесс. Стандартные способы синтеза меченой по углероду как стабильными, так и радиоактивными изотопами мочевины заключаются в окислении и гидролизе соответствующего меченого по углероду цианида калия [Katsumi Iida,Takesni Chiyoda, Ryo Hirasava, Akiko Iwata, Masashiro Kajiwara//J. of Labelled Соmр. And Radiopharmaceuticcals, 1997, v. 39, No. 1, p 69-78] или цианида натрия [Albert A. Plentl et. al.//Biochem.Prep., 1969, v. 12, p. 103-106], однако, используемые в качестве исходных меченые цианиды цианид натрия или цианид калия дороги, труднодоступны и в достаточной степени не стабильны, поскольку реагируют с диоксидом углерода из воздуха с образованием соответствующих карбонатов. Этот процесс, во-первых,загрязняет исходное вещество, во-вторых, приводит к частичной потере метки в виде выделяющегося в процессе реакции HCN. Кроме того, цианиды токсичны и работа с ним требует особых мер предосторожности и тщательной очистки конечного продукта. Известен также способ получения мочевины меченой изотопом 11 С из меченого диоксида углерода и гексаметилдисилазида лития в тетрагидрофуране [Chakrabotory P.K., Mangner T.J.,Chugani H.T.//Appl. Radiat. Isot., 1997, V 48, N 5,P 619-621]. Способ заключается в пропускании большого молярного избытка (около 1000/1) меченого диоксида углерода в раствор гексаметилдисилазида лития в тетрагидрофуране при 0 С с последующим гидролизом реакционной смеси водным раствором хлорида аммония. Выделение конечного продукта осуществляется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Однако для осуществления данного способа требуется неоправданно большой избыток меченого диоксида углерода, что делает этот способ небезопасным с точки зрения экологии, и при выделении целевого продукта используется дорогостоящее оборудование,кроме того, данный метод рассчитан на получение микроколичеств меченой мочевины (10-50 мг) и масштабирование процесса практически невозможно. Также в данной публикации не указан выход целевого продукта и его чистота,видимо по причине малой стабильности изотопа 11 С. 3 Известен способ получения бистриметилсилильного производного карбодиимида путем взаимодействия силилированного бисамида 2-х валентного металла: (Si(CH3)2N)2M с диоксидом углерода в растворителе при повышенном давлении [Lawerence R. Sita et.al.//J. Amer. Chem.Soc. 1996, v. 118, p. 10912-10913]. Однако в этой работе отсутствуют сведения о превращении полученного бис(триметилсилил)карбодиимида в мочевину. Этот способ основан на использовании двухвалентных металлов 14-й группы(Ge, Sn), которые дают нерастворимые соли,чем затрудняется выделение продукта реакции и возникает необходимость в дополнительной очистке от примесей неорганических соединений. Кроме того, отсутствуют сведения о возможности получения мочевины и меченых соединений. Сущность изобретения Задачей данного изобретения является разработка простого, промышленно доступного,экологически безопасного способа получения 13 С-мочевины. Предлагаемый согласно изобретению способ получения меченой по углероду 13 Смочевины заключается в обработке диоксидом углерода-13 С раствора бис(триалкилсилил)амида металла в органическом растворителе с получением 13 С-бис(триалкилсилил)карбодиимида и последующим гидролизом его водой. Способ осуществляется по следующей схеме: 2(Alk3Si)2NM (I) + 13 СО 2=Alk3SiN=13C=NSiAlk3 (II)Alk3SiN=13C=NSiAlk3 (II) + Н 2 О=(NH2)213C=O (III), где Alk = низший алкил. Прямое связывание меченого диоксида углерода согласно изобретению позволяет использовать эквивалентные или 1:1 количества меченого диоксида углерода по отношению к бис(триалкилсилил)амиду металла (I). Благодаря использованию анионной формы гексаметилдисилазана, в одну стадию с высоким выходом образуется необходимая система -N=13C=N-. Промежуточно образующийся бис(триметилсилил)карбодиимид (II) достаточно стабилен в различных средах и возможна его тщательная очистка методом вакуумной ректификации и длительное хранение (конечный продукт - 13 С-мочевина при длительном хранении,особенно в водных растворах, частично теряет аммиак и в ней накапливается примесь биурета). Способ по изобретению позволяет получить 13 С-мочевину с хорошим выходом (более 70%), высокой степенью чистоты, полностью соответствующей требованиям ГОСТа 66991-77 и требованиям к чистоте на мочевину, используемую в медицинской практике для проведения дыхательных тестов по определению присутствия и количественных оценок содержания патогенных бактерий Helicobacter pylori. Более подробно процесс осуществляют следующим образом. 4 Для проведения процесса используют термостатируемый реактор из стекла, кварца, нержавеющей стали или черных сплавов с внутренним покрытием из фторопласта объемом в 23 раза превышающим объем реакционной смеси. Реакцию проводят в атмосфере инертного газа (азот, аргон, гелий) в условиях, исключающих влагу и диоксид углерода из воздуха, в интервале температур от -70 до 25 С. Меченый диоксид углерода подают в реакционную смесь при интенсивном перемешивании через дополнительный газоввод или непосредственно через полый шток механической мешалки. Газ вводят в содержащийся в реакционной смеси раствор,например, бис(триметилсилил)амида металла(лития, натрия) в инертном растворителе (углеводороды, петролейный эфир, бензол, толуол,эфир, тетрагидрофуран, диоксан диметоксиэтан и т.п.). При необходимости могут быть использованы другие реагенты для связывания промежуточно образующегося оксида соответствующего металла. Но можно проводить процесс и без них. Образующийся в результате реакции меченый по углероду бис(триалкилсилил)карбодиимид (II) выделяется фракционированием при атмосферном или пониженном давлении и очищается дополнительной ректификацией, например при давлении 10-25 мм рт.ст. Гидролиз полученного меченого по углероду (бистриалкилсилил)карбодиимида (II) осуществляют в водном растворе или в органических растворителях, содержащих воду, диэтиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан, бензол, в присутствии кислотных или основных катализаторов. Полученную в результате гидролиза меченую по углероду мочевину очищают обычными способами (кристаллизация из органических растворителей, переосаждение из смесей органических растворителей, возгонка или зонная плавка в атмосфере аммиака). Строение продуктов реакции доказано спектральными методами и данными массспектрометрических исследований и подтверждена индивидуальность, чистота и отсутствие обмена изотопа с растворителем, другими реагентами и материалом реакционных сосудов в промежуточном и конечном продуктах. Пример. 13 С-бис(Триметилсилил)карбодиимид. В 2-литровую трехгорлую колбу из стеклаPYREX, снабженную обратным холодильником с твердым поглотителем на выходе (ВаО), магнитной мешалкой, термометром и газовводом,доходящим до дна колбы, помещают 1 л 1 М раствора гексаметилдисилазида лития (99% чистоты) в диэтиловом эфире в атмосфере чистого сухого аргона. Реакционную смесь охлаждают в бане со льдом до 0-5 С и в течение 2-4 ч пропускают ток сухого 13 СO2 изотопное обогащение 99%, следя за полнотой поглощения газа. После введения всего необходимого количества диоксида углерода, реакционную смесь нагревают на водяной бане и кипятят 1 ч. Полученный раствор с осадком быстро фильтруют на стеклянном фильтре от карбоната лития и упаривают на роторном испарителе. Остаток, содержащий бис(триметилсилил)карбодиимид и гексаметилдисилоксан подвергают фракционированию на ректификационной колонне при пониженном давлении (10-15 мм рт.ст.). Полученный продукт еще раз фракционируют и запаивают в ампулу. Выход 75-80% в пересчете на гексаметилдисилазид лития.C613CH18N2Si2 элементный анализ: вычислено С-45,45%, Н-9,62%, найдено С-45,48%, Н 9,69%; ЯМР 1H (300 MHz CDCl3 м.д.) 0,32 (s 18H). 13 С-Мочевина. 0,1 моль полученного на предыдущей стадии бис(триметилсилил)карбодиимида растворяют в смеси 100 мл диоксана ОСЧ и 5 мл бидистиллированной воды и прибавляют раствор 0,05 моль щавелевой кислоты ОСЧ в 50 мл диоксана. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником 3 ч. Выпавшую при охлаждении мочевину отфильтровывают и перекристаллизовывают из ОСЧ ацетона. Дополнительное количество целевого продукта получают, медленно добавляя к матричному раствору 100 мл чистого диэтилового эфира. Суммарный выход продукта 80-90% в пересчете на карбодиимид. Чистота соответствует ГОСТ 6691-77. 13 6 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения меченой по углероду С-мочевины, отличающийся тем, что раствор бис(триалкилсилил)амида металла в органическом растворителе подвергают обработке 13 Сдиоксидом углерода с получением меченого по углероду 13 С-бис(триалкилсилил)карбодиимида и последующим его гидролизом водой. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что промежуточно образующийся 13 С-бис(триалкилсилил)карбодиимид отделяют фильтрованием,упариванием и ректификацией при пониженном давлении. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что ректификацию осуществляют при давлении 1025 мм рт.ст. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидролиз водой ведут в присутствии кислоты и органического растворителя. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве бис(триалкилсилил)амида металла используют гексаметилдисилазид металла, при этом 13 С-диоксид углерода и гексаметилдисилазид металла берут в стехиометрическом соотношении или 1:1. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют гексаметилдисилазид щелочного металла. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что в качестве гексаметилдисилазида щелочного металла используют гексаметилдисилазид лития или натрия. 13