Способ получения флударабин фосфата

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЛУДАРАБИН ФОСФАТА Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и может быть использовано в производстве фармацевтической субстанции для получения противоопухолевого препарата "Флударабел". Объектом изобретения является способ, заключающийся в том, что флударабин фосфорилируют двукратным молярным избытком фосфора в триметилфосфате при температуре 0-4C в течение 3-3,5 ч в атмосфере азота, реакционную смесь разлагают добавлением льда, нейтрализуют с помощью гидроксида натрия и выделяют целевой продукт на катионообменной смоле при контролируемой температуре с последующей его кристаллизацией из водного раствора. Квасюк Евгений Иванович,Новик Татьяна Павловна, Кипнис Александр Маратович, Григорян Грант Оганесович, Трухачева Татьяна Викторовна, Корсик Марат Юрьевич, Фроленков Константин Александрович, Грецкая Мария Александровна (BY)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: РЕСПУБЛИКАНСКОЕ УНИТАРНОЕ ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ Область техники Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, в частности к усовершенствованному способу получения флударабин фосфата [9-(-D-арабинофуранозил)-2-фтораденин 5'-монофосфата] - модифицированного пуринового нуклеотида, который применяется при лечении агрессивных и индолентных лимфопролиферативных заболеваний и может быть использован в производстве фармацевтической субстанции для получения противоопухолевого препарата "Флударабел". Уровень техники Известен способ получения флударабин фосфата в солевой форме, который заключается во взаимодействии флударабина [9-(-D-арабинофуранозил)-2-фтораденина] с хлорокисью фосфора (3.3 мол.экв. по отношению к флударабину) в триэтилфосфате при температуре 0C в течение 3.5 ч, обработке реакционной смеси ледяной водой и последующей нейтрализации щелочью, экстракции триэтилфосфата хлороформом, обработке полученного водного раствора смесью активированного угля и целита в течение 20 мин, отделении сорбентов фильтрованием и их промывке водой до отсутствия в ней продукта, последующей экстракции флударабин фосфата из объединенного водного раствора смесью растворителей, содержащих гидроксиламин, и лиофилизации полученного щелочного раствора. Аналитический образец флударабин фосфата в виде свободной кислоты (Н+-форма) получают с помощью анионообменной хроматографии. Недостатком данного способа получения флударабин фосфата является его трудоемкость и невозможность получения в больших количествах соединения, пригодного для приготовления лекарственной формы, о чем свидетельствует отсутствие в описании способа данных о чистоте получаемого продукта. Описан также способ получения флударабин фосфата, который заключается во взаимодействии флударабина с хлорокисью фосфора (1.8-3.8 мол.экв. по отношению к флударабину) в триэтилфосфате при температуре -10C в течение 29 ч, последующей обработке реакционной смеси холодной водой, экстракции триэтилфосфата с помощью дихлорметана, кристаллизации флударабин фосфата из полученного водного раствора и его последующим высушиванием при температуре 40C в течение 24 ч. Недостатком данного способа получения флударабин фосфата является отсутствие в нем стадии очистки целевого продукта от сопутствующих примесей, количество которых по данным Государственной фармакопеи Республики Беларусь доходит до 10. Обычная кристаллизация целевого продукта из реакционной смеси, содержащей такое количество побочных соединений, не позволяет получить субстанцию, пригодную для изготовления на ее основе лекарственной формы препарата. По этой причине вопрос о степени чистоты получаемого флударабин фосфата просто умалчивается. Дополнительная очистка флударабин фосфата его перекристаллизацией из воды с добавлением активированного угля или ионообменных смол также не позволяет получить препарат необходимого качества, так как он разрушается в процессе перекристаллизации. Наиболее близким к заявляемому является способ получения флударабин фосфата (прототип) фосфорилированием флударабина путем постепенного добавления хлорокиси фосфора (2 мол.экв. по отношению к нуклеозиду) к суспензии флударабина в триэтилфосфате при -10-15C в течение 1 ч и дальнейшим перемешиванием реакционной смеси при этой же температуре в течение 48 ч с последующей ее обработкой толуолом (40-кратный объем), отделением выпавшего осадка фильтрованием, растворением осадка в воде и подщелачиванием полученного раствора до pH 11 раствором гидроксида натрия, перемешиванием полученного раствора в течение 15 мин с ионообменной смолой Дауэкс в Н+-форме, отделением смолы фильтрованием и промывке ее водой до отсутствия в промывных водах флударабин фосфата, концентрированием объединенного водного раствора в вакууме до начала кристаллизации и отделением выпавшего осадка фильтрованием с его последующим высушиванием в вакууме при 60C до постоянного веса. Таким образом получают флударабин фосфат с 97.5% степенью чистоты и выходом 40%. Перекристаллизация полученного соединения из воды дает целевой продукт - флударабин фосфат(Н+-форма) с чистотой более 99% (без выхода). Недостатком способа-прототипа получения флударабин фосфата является многостадийность, трудоемкость и длительность процесса, а также низкий выход и недостаточная степень чистоты целевого продукта, что обусловлено длительным периодом нахождению нуклеотида в кислом водном растворе(pH 3), приводящем к образованию побочных продуктов. Сущность изобретения Задачей предполагаемого изобретения является повышение выхода и чистоты целевого продукта, а также упрощение процесса его получения. Поставленная задача решается путем взаимодействия флударабина с хлорокисью фосфора в триметилфосфате при 0-4C в течение 3-3,5 ч, обработке реакционной смеси льдом, последующей ее нейтрализации раствором гидроксида натрия до pH 7-8, выделении флударабин фосфата с помощью хроматографии на катионообменной смоле в H+-форме и кристаллизации целевого продукта из содержащих его фракций. Заявляемый способ описывается следующим уравнением реакции: Отличительными особенностями способа являются использование в реакции фосфорилирования триметилфосфата и двукратного молярного избытка хлорокиси фосфора при 0-4C в течение 3-3,5 ч, обработка реакционной смеси льдом и последующая нейтрализация раствором гидроксида натрия, очистка флударабин фосфата хроматографией на термостатированной при 30-35C колонке с катионообменной смолой с высокой степенью сшивки Дауэкс 50W8 (200-400 меш) в Н+-форме и выделение целевого продукта методом кристаллизации. Предлагаемые условия фосфорилирования и обработки реакционной смеси являются оптимальными для образования целевого продукта и существенно предотвращают его последующее разрушение. Использование стадии хроматографии на катионите позволяет отделить флударабин фосфат от присутствующих в реакционной смеси побочных продуктов. Повышение температуры до 30-35C в ходе хроматографии способствует ускорению обменных процессов, протекающих в хроматографической колонке,уменьшению объема элюента (воды) и сокращению времени, необходимого для выделения целевого продукта. Использование ионообменной смолы с высокой степенью сшивки способствует сохранению объема сорбента в колонке в процессе хроматографии, что увеличивает его разрешающую способность. Присутствие триметилфосфата в составе разделяемой реакционной смеси, наносимой на хроматографическую колонку, способствует повышению растворимости образующегося в процессе ионного обмена флударабин фосфата в Н+-форме, что предотвращает кристаллизацию целевого продукта непосредственно в хроматографической колонке. По мнению авторов, только сочетание указанных выше признаков способа приводит к решению поставленной задачи. Это сочетание признаков не встречается в общедоступной научно-технической и патентной литературе и является новым и неочевидным. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Заявляемый способ иллюстрируется нижеприведенными примерами его осуществления. Пример 1. Получение флударабин фосфата в оптимальных условиях проведения синтеза и выделения целевого продукта. К охлажденной до 0-4C смеси триметилфосфата (20 мл) и хлорокиси фосфора (5.36 г, 35.0 ммоль,3.26 мл) в атмосфере азота добавляют флударабин (5 г, 17.5 ммоль), перемешивают реакционную смесь 3-3,5 ч, затем медленно выливают на 60 г колотого льда и добавляют при перемешивании 9-11% раствор гидроксида натрия до pH 6-8. Полученный раствор концентрируют в вакууме при температуре 30C до 40-50 мл и наносят на термостатированную при 30-35C хроматографическую колонку (3.525 см), заполненную катионообменной смолой Дауэкс 50W8 (200-400 меш) в H+-форме. Колонку элюируют нагретой до 30-35C водой со скоростью 3-4 мл/мин, и собирают фракции объемом 15-20 мл. Контроль над содержанием флударабин фосфата во фракциях осуществляют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках "Kieselgel 60 F254" фирмы "Merck" (Германия) в системе растворителей: изопропанол/25%ный водный аммиак/вода (7:2:2 об./об./об.). Фракции, содержащие продукт, хроматографическая подвижность которого совпадает с таковой для заведомого образца флударабин фосфата, объединяют (суммарный объем 580 мл), упаривают на ротационном испарителе в вакууме при температуре 30C до начала кристаллизации и оставляют раствор при температуре 2-5C (бытовой холодильник) на 16-18 ч. Выпавший осадок целевого продукта отфильтровывают, промывают на фильтре ледяной водой, спиртом и сушат в вакууме при 50C до постоянного веса. Получают 4.5 г (70% выход) флударабин фосфата с чистотой 99.85%, определенной методом ВЭЖХ. Т.пл. целевого продукта 201-203C. УФ-спектр, (Н 2 О), макс нм : 261 (13600); 268 плечо (10600). 1H-ЯМР-спектр, (DMSO-d6): 3.94 (м, 1 Н, Н-4'), 4.06-4.09 (м, 3H, Н-3', Н-5', Н-5"), 4.14 (дд, 1 Н, Н-2'),5.73 (ус, 2 Н, ОН-2', ОН-3'), 6.14 (д, 1 Н, Н-1'), 7.76 и 7.86 (2 ус, по 1 Н от NH2), 8.13 (с, 1 Н, Н-8). Пример 2. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что для фосфорилирования флударабина используют трехкратный молярный избыток хлорокиси фосфора, а содержащийся в водном растворе триметилфосфат предварительно экстрагируют дихлорметаном перед выделением флударабин фосфата на ионообменной смоле. Получают 2.88 г (45% выход) целевого продукта с чистотой 99.80%. Пример 3. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что для выделения флударабин фосфата используют ионообменную смолу Дауэкс 50W4 (200-400 меш) (H+-форма). Получают 3.60 г (56% выход) целевого продукта с чистотой 99.71%. Пример 4. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что при хроматографическом выделении флударабин фосфата колонку с ионообменной смолой элюируют водой при температуре 18-20C. Получают 3.80 г (60% выход) целевого продукта с чистотой 99.75%. Приведенные выше примеры свидетельствуют о том, что использование предлагаемого способа получения флударабин фосфата обеспечивает преимущества в виде увеличения выхода целевого продукта с 40 до 70%, повышения степени чистоты с 97 до 99.85% и упрощение процесса. Источники информации: 1. Patent US 4357324. Prodrug derivatives of 9-(3-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine / J.A. Montgomery, A.T. Shortnacy. 2. Patent Application Publication US 2006/0240529 A1. Procedure for the preparation of fludarabine phosphate from 2-fluoroadenine and fludarabine phosphate salts with amines or ammonia / P. Farini, L. Petrucciani,P. Colombo, G. Caprioli. 3. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Том 3. Контроль качества фармацевтических субстанций. Изд. "Победа", Молодечно. 2009. Стр. 610. 4. DE 19543052 A1. Verfaren zur Herstellung von Fludarabin-Phosphat und die Verwendung von saurenIonenaustaushern in Verfaren / Schering AG. 5. Patent Application Publication US 2007/0060745 A1. Procedure for the preparation of fludarabine phosphate / G. Cotticelli, B. Verzola. (Прототип). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения флударабин фосфата фосфорилированием флударабина действием хлорокиси фосфора в эфире фосфорной кислоты, обработкой реакционной смеси и сорбции флударабин фосфата на ионообменной смоле, его десорбции водой и выделением целевого продукта из водного раствора кристаллизацией, отличающийся тем, что флударабин прибавляют к охлажденной до 0-4C смеси триметилфосфата и двукратного молярного избытка хлорокиси фосфора в атмосфере азота, перемешивают реакционную смесь 3-3,5 ч, выливают ее на измельченный лед, добавляют при перемешивании 9-11% раствор гидроксида натрия до pH 6-8, полученный раствор концентрируют в вакууме и наносят на термостатированную при 30-35C хроматографическую колонку, заполненную катионообменной смолой с высокой степенью сшивки в Н+-форме, колонку элюируют нагретой до 30-35C водой со скоростью 3-4 мл/мин, собирают фракции, содержащие флударабин фосфат, которые упаривают на ротационном испарителе в вакууме до начала кристаллизации и оставляют смесь при температуре 2-5C на 16-18 ч,выпавший осадок целевого продукта отфильтровывают, промывают на фильтре ледяной водой, спиртом и сушат в вакууме при 50C до постоянного веса.