Модулирование экспрессии eif4e

009670 Область техники Настоящее изобретение относится к композициям и способам модулирования экспрессии eIF4E. В частности, данное изобретение относится к одно- или двухцепочечным антисмысловым соединениям, в частности, олигонуклеотидным соединениям, которые гибридизуются с молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими eIF4E. Здесь показано, что такие соединения модулируют экспрессию eIF4E. Известный уровень техники Эукариотическая генная экспрессия должна регулироваться таким образом, чтобы клетки могли быстро реагировать на широкий спектр различных условий. Процесс трансляции мРНК является одной из стадий с высокой степенью регуляции генной экспрессии. Под действием гормонов, факторов роста,цитокинов и питательных веществ животные клетки, как правило, активируют трансляцию для подготовки к пролиферативному ответу. Скорость белкового синтеза обычно снижается в стрессовых условиях, таких как окислительный или осмотический стресс, повреждение ДНК или нехватка питательных веществ. Активация или угнетение трансляции мРНК происходит на протяжении минут, и контроль над этим процессом, как считают, осуществляется на стадии инициации белкового синтеза (Rosenwald et al.,Oncogene, 1999, 18, 2507-2517; Strudwick and Borden, Differentiation, 2002, 10, 10-22). Инициация трансляции требует координации действия нескольких эукариотических факторов инициации (eIF) - белков, которые принято определять по их цитоплазматическому местонахождению и способности регулировать стадию инициации белкового синтеза. Один из этих факторов, эукариотический фактор инициации 4 Е (eIF4E) (известный также как эукариотический фактор инициации трансляции 4 Е,эукариотический фактор 4 Е-подобный инициации трансляции 1 (eIF4EL1), кэп-связывающий белок(СВР) и матричная РНК кэп-связывающего белка) был выделен первоначально в виде 25 кДа мРНК кэпсвязывающего белка, участвующего в трансляции (Rychlik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 945949), и в настоящее время стал одним из наиболее изученных eIF. eIF4E, присутствующий в ограниченных количествах по сравнению с другими факторами инициации, является одним из компонентов комплекса инициации eIF4F, включающего в себя также структурный (scaffold) белок eIF4G и РНК-геликазуeIF4A. В цитоплазме eIF4E катализирует лимитирующую стадию синтеза кэп-зависимых белков путем специфического связывания с 5'-концевой 7-метилированной GpppX кэп-структурой, присутствующей почти во всех зрелых клеточных мРНК, которые обеспечивают доставку мРНК к комплексу eIF4F. После связывания комплекс eIF4F осуществляет сканирование в направлении от 5'- к 3'-концу кэпа, обеспечивая возможность проявления РНК-геликазной активности eIF4A для распознавания каких-либо вторичных структур, присутствующих в 5'-нетранслируемой области (UTR), тем самым, выделяя кодон инициации трансляции и способствуя связыванию рибосомы с мРНК (Graff et al., Clin. Exp. Metastasis, 2003,20, 265-273; Strudwick et al., Differentiation, 2002, 70, 10-22). Доступность eIF4E для включения в комплекс eIF4E регулируется путем фосфорилирования, а также посредством связывания белков-ингибиторов. eIF4E представляет собой фосфопротеин, фосфорилированный на серине 209 с помощью митоген-активируемой киназы Mnk1, взаимодействующей с протеинкиназой (Flynn et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 21684-21688; Wang et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 93739377; и Waskiewicz et al., Embo J., 1997, 16, 1909-1920). Фосфорилирование eIF4E повышает его сродство к кэпам мРНК, тем самым увеличивая скорость трансляции (Waskiewicz et al., Mol. Cell Biol., 1999, 19,1871-1880). Повышенное фосфорилирование eIF4E под действием форболовых эфиров, клеточных стрессов и цитокинов связано с сигнальными путями р 38 митоген-активируемой (MAP) киназы и/илиErk, которые, в свою очередь, стимулируют активность Mnk1. Другие стрессы, такие как тепловой шок,сорбит и перекись водорода, стимулируют р 38-МАР-киназу и повышают активность Mnk1, однако эти стимулы увеличивают связывание eIF4E с eIF4E-связывающим белком 1 (4 Е-ВР 1) (Wang et al., J. Biol.Chem., 1998, 273, 9373-9377). Связывание 4 Е-ВР 1 с eIF4E блокирует фосфорилирование eIF4E под действием Mnk1 (Wang et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 9373-9377). 4 Е-связывающие белки 1 и 2 действуют как эффективные ингибиторы трансляции путем конкуренции с eIF4G за связывание с дорсальной поверхностью eIF4E (Ptushkina et al., Embo J., 1999, 18, 4068-4075). Фосфорилирование связывающих белков MTOR вызывает их диссоциацию от eIF4E, создавая возможность проявления активности eIF4E. Растущее число наблюдений позволяет предположить, что факторы трансляции локализованы и функционируют в ядре, а также в цитоплазме. Транскрипция и трансляция традиционно считаются пространственно разделенными у эукариотов; однако сопряженная транскрипция и трансляция наблюдается в ядрах клеток млекопитающих (Iborra et al., Science, 2001, 293, 1139-1142). Фракция eIF4E локализуется в ядре, что позволяет предположить, что этот фактор трансляции может осуществлять определенный контроль над трансляцией в ядре (Lejbkowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 9612-9616). eIF4E импортируется в ядро по пути импортина альфа/бета ядерно-цитоплазматическим челночным белкомтранспортером eIF4E (4E-T) (Dostie et al., Embo J., 2000, 19, 3142-3156). В ядре eIF4E может быть непосредственно связан белком промиелоцитарного лейкоза (PML), являющимся важным регулятором клеточного роста и апоптоза у млекопитающих (Cohen et al., Embo J., 2001, 20, 4547-4559). PML, посредством своего RING-домена, модулирует активность eIF4E, значительно снижая его сродство к 5'-кэповым структурам мРНК (Cohen et al., Embo J., 2001, 20, 4547-4559). Избыток eIF4E не приводит к глобальному повышению скоростей трансляции, но селективно уве-1 009670 личивает синтез белков, кодируемых мРНК, которые классифицируются как eIF4E-чувствительные,включая белки-стимуляторы роста, такие как фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), орнитиндекарбоксилаза (ODC) и циклин D1 (Kevil et al., Int. J. Cancer, 1996, 65, 785-790; Rosenwald, Cancer Lett.,1995, 98, 77-82; и Shantz et al., Cancer Res., 1994, 54, 2313-2316). Если уровни белков ODC и VEGF повышаются за счет усиления инициации трансляции, то уровни циклина D1 повышаются вследствие усиления транспорта мРНК циклина D1 в цитоплазму (Kevil et al., Int. J. Cancer, 1996, 65, 785-790; Rosenwald,Cancer Lett., 1995, 98, 77-82; Rousseau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 1065-1070). Таким образом, помимо своей роли в инициации трансляции, eIF4E может также влиять на ядерноцитоплазматический транспорт мРНК. Функция eIF4E является существенным фактором, определяющим общий белковый синтез и рост клеток (De Benedetti et al., Mol. Cell. Biol., 1991, 11, 5435-5445). В нормальных клетках, eIF4E присутствует в незначительных количествах, что ограничивает трансляцию. мРНК, кодирующие белки, необходимые для клеточного роста и выживания, обычно содержат сложный, сильно структурированный 5'UTR, что делает такие мРНК плохими субстратами для трансляции. Многие из этих мРНК, однако, хорошо транслируются в присутствии избытка eIF4E, а также подвержены повышающему регулированию опухолями (Graff and Zimmer, Clin. Exp. Metastasis, 2003, 20, 265-273). Трансляция мРНК, связанных с дифференцировкой клеток, может также усиливаться eIF4E, поскольку повышенные уровни eIF4E наблюдаются в некоторых дифференцирующихся клеточных линиях, включая клеточные линии эпителиальных опухолей легких (Walsh et al., Differentiation, 2003, 71, 126-134). Сверхэкспрессия eIF4E была описана для многих раковых опухолей и производных от раковых клеточных линий человека, а также приводит к онкогенной трансформации клеток и инвазивному/метастатическому фенотипу на животных моделях. В отличие от нетрансформированных культивируемых клеток, трансформированные клеточные линии экспрессируют eIF4E независимо от присутствия сывороточных факторов роста (Rosenwald, Cancer Lett., 1995, 98, 77-82). Избыток eIF4E приводит к аберрантному росту и неопластической морфологии в клетках HeLa, а также вызывает канцерогенную трансформацию в фибробластах NIH 3 Т 3 и Rat2, по результатам определения безъякорного роста, образования трансформированных очагов в культуре и онкогенеза у голых мышей (De Benedetti et al., Proc.Natl. Acad. Sci . USA, 1990, 87, 8212-8216/ и Lazaris-Karatzas et al., Nature, 1990, 345, 544-547). Кроме того, неопластическая трансформация, проявляемая клетками со сверхэкспрессией eIF4E, ассоциирована с повышенной трансляцией ODC (Lazaris-Karatzas et al., Nature, 1990, 345, 544-547). Дополнительно, повышенный ядерный экспорт циклина D1, ассоциированный с повышенной экспрессией eIF4E, непосредственно связан с трансформирующей активностью (Cohen et al., Embo J., 2001, 20, 4547-4559). Эти результаты демонстрируют, что eIF4E, когда присутствует в избытке, может повышать экспрессию или ядерный экспорт мРНК регуляторов роста. Вследствие этого, пораженные клетки могут пролиферировать независимо от механизмов контроля нормального роста. Повышенное фосфорилирование eIF4E наблюдается в клетках, трансформированных онкобелком src-тирозинкиназой, что позволяет предположить, что повышенная активность eIF4E, в дополнение к сверхэкспрессии, приводит к потере регуляции роста в трансформированных клетках (Frederickson et al., Mol. Cell. Biol., 1991, 11, 2896-2900). Повышенные уровни eIF4E наблюдаются при некоторых раковых опухолях человека, включая, но без ограничения, неходжкинские лимфомы, аденомы и карциномы ободочной кишки и раковые опухоли гортани, головы и шеи, простаты, молочной железы и мочевого пузыря (Crew et al., Br. J. Cancer, 2000,82, 161-166; Graff et al., Clin. Exp. Metastasis, 2003, 20, 265-273; Haydon et al., Cancer, 2000, 88, 2803-2810;Kerekatte et al., Int. J. Cancer, 1995, 64, 27-31; Rosenwald et al., Oncogene, 1999, 18, 2507-2517; Wang et al.,Am. J. Pathol., 1999, 155, 247-255). Повышающая регуляция eIF4E является ранним событием в канцерогенезе ободочной кишки и часто сопровождается повышением уровней циклина D1 (Rosenwald et al.,Oncogene, 1999, 18, 2507-2517). Избыток eIF4E является также надежным прогностическим фактором рецидива опухоли при карциномах головы и шеи, подвержен селективной повышающей регуляции при инвазивных карциномах мочевого пузыря и коррелирует с плохими гистологическими показателями и более поздними степенями метастазирования при плоскоклеточной карциноме гортани (Crew et al., Br. J.Cancer, 2000, 82, 161-166; Liang et al., Laryngoscope, 2003, 113, 1238-1243; и Nathan et al., Oncogene, 1997,15, 579-584). Эти результаты позволяют предположить, что повышенные уровни eIF4E участвуют в развитии, а также в инициации раковых опухолей. Ингибирование экспрессии и активности eIF4E достигается путем использования антисмысловых механизмов. Антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие 3'-выступающие нуклеотиды, модулируют связывание eIF4E с 5'-копированными олигорибонуклеотидами (Baker et al., J. Biol. Chem., 1992, 267,11495-11499). Введение в клетки HeLa эписомного вектора, сконструированного для экспрессии олигонуклеотида, комплементарного 20 нуклеотидам в области начала трансляции eIF4E, понижает уровниeIF4E и сопровождается уменьшением скорости клеточного роста и белкового синтеза, показывая, чтоeIF4E необходим для пролиферации клеток (Bommer et al., Cell. Mol. Biol. Res., 1994, 40, 633-641; DeBenedetti et al., Mol. Cell. Biol., 1991, 11, 5435-5445). Уровни eIF4G, компонента структурного белка комплекса eIF4F, также снижаются. Несмотря на пониженные уровни трансляции после ингибированияeIF4E, синтез некоторых белков продолжается, и многие из них были идентифицированы как стресс-2 009670 индуцируемые белки или белки теплового шока (Joshi-Barve et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 21038-21043). Этот же вектор снижает eIF4E на 50-60% в эмбриональных фибробластах крыс, что достаточно для ингибирования ras-опосредованной трансформации и канцерогенеза этих клеток (Graff et al., Int. J. Cancer,1995, 60, 255-263; Rinker-Schaef f er et al., Int. J. Cancer, 1993, 55, 841-847). Кроме того, было обнаружено,что уменьшаются трансляция ODC и транспорт полиаминов, что позволяет установить связь между rasиндуцируемой злокачественностью, активностью eIF4E и метаболизмом полиамина (Graff et al., Biochem.Biophys. Res. Commun., 1997, 240, 15-20). Стабильная трансформация линии клеток карциномы молочной железы и головы и клеточной линии плоскоклеточной карциномы шеи антисмысловым векторомeIF4E приводит к снижению экспрессии фактора роста фибробластов-2 (FGF-2) и ингибированию канцерогенной и ангиогенной способности клеток у мышей, что позволяет предположить причинную рольeIF4E в васкуляризации опухоли (DeFatta et al., Laryngoscope, 2000, 110, 928-933; Nathan et al., Oncogene,1997, 15, 1087-1094). Целенаправленная инактивация характерного для Caenorhabditis elegans гомолога eIF4E человека,IFE-3, малой интерферирующей РНК, введенной путем инъекции молодым взрослым червям, приводит к эмбриональной смертности 100% потомства (Keiper et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 10590-10596). Применение малой интерферирующей двухцепочечной РНК, нацеленной на eIF4E, показало также, что отсутствие регуляции eIF4E влияет на клеточную трансформацию. Функциональная инактивация eIF4E с использованием ген-специфической 21-нуклеотидной малой интерферирующей РНК, нацеленной на участок кодирующей области eIF4E человека, приводит к значительному снижению безъякорного роста злокачественных холангиоцитов - фенотипа, ассоциированного с трансформированными клетками. Кроме того, фосфорилирование eIF4E в злокачественных холангиоцитах зависит от передачи сигнала р 38 МАРкиназы, демонстрируя наличие связи между передачей сигнала р 38 МАР-киназы и регуляцией белкового синтеза в процессе роста холангиокарциномы (Yamagiwa et al., Hepatology, 2003, 38, 158-166). В качестве дополнительного подтверждения того, что ингибирование активности eIF4E снижает канцерогенный потенциал клеток, можно указать на клетки рака молочной железы, экспрессирующие конститутивно активную форму ингибитора eIF4E 4 ЕВР-1, что вызывает остановку клеточного цикла,ассоциированную с понижающей регуляцией циклина D1 и повышающей регуляцией циклинзависимой киназы p27Kip1 (Jiang et al., Cancer Cell Int., 2003, 3,2). Сверхэкспрессия 4 Е-ВР 1 в желудочно-кишечных раковых опухолях, где уровни eIF4E значительно выше, чем в нормальной ткани, коррелирует со снижением отдаленных метастазов (Martin et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol., 2000, 32, 633-642). В патенте США 5646009 описан и раскрыт гибридный вектор, в котором один сегмент ДНК кодирует кэп-связывающий белок, включающий в себя eIF4E, фактор eIF4E или его мутант. В этом патенте также раскрыта последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей eIF4E человека. В патенте США 6171798 раскрыт способ лечения рака у пациента путем введения в раковые клетки антисмысловой конструкции, включающей в себя по меньшей мере 12 нуклеотидов кодирующей последовательности гена, выбранного из группы, включающей в себя eIF4E человека, с ориентацией от 3'- к 5'-концу по отношению к промотору, контролирующему его экспрессию. В патенте США 6596854 заявлены и раскрыты изолированные молекулы нуклеиновой кислоты,кодирующие варианты eIF4E человека, в которых указанные варианты имеют аминокислотные замены в области аминокислот 112 и 114-121, или в положении 118, или в положении 119, или в положении 115,или в положении 121. В Европейской патентной заявке 1033401 и Японской патентной заявке 2001269182 заявлена очищенная нуклеиновая кислота, включающая по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов из последовательности, выбранной из группы EST-связанных последовательностей, содержащих участок молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей eIF4E человека. В этих публикациях раскрыто также получение и применение антисмысловых конструкций и олигонуклеотидов, предназначенных для генной терапии. В публикациях РСТ WO 01/96388 и WO 01/96389 раскрыты и заявлены изолированные полинуклеотиды, включающие в себя последовательность, выбранную из последовательностей, комплементов последовательностей, последовательностей, состоящих по меньшей мере из 20 непрерывно расположенных остатков последовательности, последовательностей, гибридизующихся с последовательностью, или последовательностей, имеющих по меньшей мере 75% или по меньшей мере 95% тождественности с последовательностью, указанной в перечне последовательностей, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую eIF4E человека. В этой публикации также заявлен способ лечения рака у пациента, включающий в себя введение пациенту композиции заявляемых полинуклеотидов. В публикации РСТ WO 03/039443 заявлен и раскрыт способ приготовления фармацевтической композиции для лечения лейкемии, отличающийся тем, что антисмысловой олигонуклеотид, комплементарный полинуклеотиду, кодирующему белок, соответствующий маркеру, выбранному из группы, включающей в себя молекулу нуклеиновой кислоты eIF4E человека, смешивают с фармацевтическими компонентами. В публикации заявки США 20030087852 раскрыта плазмида, кодирующая антисмысловую мРНКeIF4E, и культура мышиных клеток с введенной плазмидой.-3 009670 В публикации заявки США 20030144190 раскрыты антисмысловые молекулы, которые могут быть использованы для уменьшения или прекращения экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты или белка согласно изобретению, включая eIF4E. Раскрыты также плазмида, кодирующая антисмысловую мРНК eIF4E, и культуры фибробластов крыс, конститутивно экспрессирующие эту плазмиду. Вследствие вовлеченности eIF4E во многие болезни сохраняется давно существующая потребность в дополнительных агентах, способных эффективно регулировать eIF4E. Ингибирование как таковое особенно важно при лечении рака, поскольку повышающая регуляция экспрессии eIF4E ассоциирована с очень многими разными типами рака. Антисмысловая технология является эффективным средством понижения экспрессии специфических генных продуктов и, как было показано, обеспечивает получение уникальных результатов в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских областях применения. В настоящем изобретении предложены композиции и способы модуляции экспрессии eIF4E. Сущность изобретения Настоящее изобретение касается олигомерных соединений, таких как антисмысловые соединения, и их фармацевтически приемлемых солей, которые нацелены на молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую eIF4E, и ингибируют экспрессию eIF4E. Олигомерные соединения могут быть РНК-подобными или ДНК-подобными олигомерными соединениями, включая олигонуклеотиды. Олигомерные соединения могут быть одноцепочечными или частично или полностью двухцепочечными олигомерными соединениями и могут быть химически модифицированными или немодифицированными. Предлагаются также фармацевтические и другие композиции, включающие эти соединения. Далее предлагаются способы скрининга модуляторов eIF4E и способы модулирования экспрессииeIF4E в клетках, тканях или в организме животных, включающие в себя введение указанных клеток, тканей или животных в контакт с одним или несколькими соединениями или композициями согласно изобретению. Описаны также способы лечения животного, в частности, человека. Такие способы включают в себя введение терапевтически или профилактически эффективного количества одного или нескольких соединений или композиций согласно изобретению. Подробное описание изобретения А. Краткое описание изобретения. В настоящем изобретении предложены олигомерные соединения, такие как антисмысловые соединения, одно- или двухцепочечные олигонуклеотиды и аналогичные продукты для использования в модулировании функции или эффекта молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих eIF4E. Это достигается путем создания олигомерных соединений, которые специфически гибридизуются с одной или несколькими молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими eIF4E. В данном описании термины "нуклеиновая кислота-мишень" и "молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая eIF4E", используются для удобства описания ДНК, кодирующей eIF4E, РНК (включая пре-мРНК и мРНК или их участки), транскрибированные с таких ДНК, а также кДНК, производные от таких РНК. Такое модулирование функции нуклеиновой кислоты-мишени соединениями, которые гибридизуются с ней, обычно называется "антисмысловым". Функции ДНК, в которые должно осуществляться вмешательство, могут включать в себя репликацию и транскрипцию. Репликация и транскрипция, например, могут производиться с эндогенной клеточной матрицы, вектора, плазмидной конструкции или других источников. Функции РНК, в которые должно осуществляться вмешательство, могут включать в себя такие функции, как транслокация РНК к сайту трансляции белка, транслокация РНК к участкам внутри клетки, отдаленным от места синтеза РНК,трансляция белка с РНК и каталитическая активность или комплексообразование с участием РНК, в которых РНК может принимать участие или протеканию которых она может способствовать. Одним из результатов такого вмешательства в функционирование нуклеиновой кислоты-мишени является модулирование экспрессии eIF4E. В контексте настоящего изобретения "модулирование" и "модулирование экспрессии" означает увеличение (стимулирование) или уменьшение (ингибирование) количества или уровней молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей ген, например, ДНК или РНК. Ингибирование представляет собой одну из форм модулирования экспрессии, и мРНК часто является нуклеиновой кислотой-мишенью. В контексте настоящего изобретения "гибридизация" означает спаривание, по существу, комплементарных цепей олигомерных соединений. В настоящем изобретении один механизм спаривания включает в себя образование водородных связей, которые могут быть водородными связями по модели Уотсона-Крика, хугстиновскими или обратными хугстиновскими, между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями (основаниями нуклеиновых кислот) цепей олигомерных соединений. Например, аденин и тимин являются комплементарными основаниями нуклеиновых кислот, которые спариваются посредством образования водородных связей. Гибридизация может происходить в меняющихся условиях. Антисмысловое соединение является "специфически гибридизуемым", если связывание соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью приводит к изменению нормальной функции нуклеиновой кислоты-4 009670 мишени, вызывающему потерю активности, и имеется достаточная степень комплементарности во избежание неспецифического связывания антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновых кислот в условиях требуемого специфического связывания, т.е. в физиологических условиях в случае анализов in vivo или медицинского лечения, и в условиях проведения тестирования в случае анализов in vitro. В настоящем изобретении фраза "жесткие условия гибридизации" или "жесткие условия" относится к условиям, в которых соединение согласно изобретению гибридизуется со своей последовательностьюмишенью, но с минимальным числом других последовательностей. Жесткие условия являются зависимыми от вида последовательности и будут различаться при различных обстоятельствах, и в контексте настоящего изобретения "жесткие условия", в которых олигомерные соединения гибридизуются с последовательностью-мишенью, определяются природой и составом олигомерных соединений и используемыми для их исследований методами анализа. В общем, жесткие условия гибридизации включают в себя низкие концентрации (0,15 М) солей с неорганическими катионами, такими как Na+ или K+ (т.е. низкая ионная сила), температуру выше 20-25 С и ниже Tm комплекса олигомерное соединение:последовательность-мишень, и присутствие денатурирующих агентов, таких как формамид, диметилформамид, диметилсульфоксид или детергент додецилсульфата натрия (ДСН). Например, скорость гибридизации уменьшается на 1,1% на каждый 1% формамида. Примером условий гибридизации высокой жесткости является 0,1 буфер хлорид натрия-цитрат натрия (SSC)/0,1% (мас./об.) ДСН при 60 С в течение 30 мин."Комплементарный" в используемом в настоящем описании значении относится к способности к точному спариванию между двумя основаниями нуклеиновых кислот на одной или двух олигомерных цепях. Например, если основание нуклеиновой кислоты, находящееся в определенном положении антисмыслового соединения, способно к образованию водородных связей с основанием нуклеиновой кислоты, находящимся в определенном положении нуклеиновой кислоты-мишени, где указанная нуклеиновая кислота-мишень представляет собой ДНК, РНК или олигонуклеотидную молекулу, то положение водородных связей между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью считается комплементарным положением. Олигомерное соединение и дополнительная ДНК, РНК или олигонуклеотидная молекула являются комплементарными по отношению друг к другу, если достаточное число комплементарных положений в каждой молекуле занято основаниями нуклеиновых кислот, способными образовывать водородные связи друг с другом. Таким образом, "специфически гибридизуемый" и "комплементарный" являются терминами, используемыми для указания достаточной степени точности спаривания или комплементарности по достаточному числу оснований нуклеиновых кислот, таким образом, чтобы происходило стабильное и специфическое связывание между олигомерным соединением и нуклеиновой кислотой-мишенью. Специалисты считают, что последовательность олигомерного соединения не должна быть на 100% комплементарной ее нуклеиновой кислоте-мишени для специфической гибридизации. Кроме того, олигонуклеотид может гибридизироваться по одному или нескольким сегментам, так что промежуточные или прилегающие сегменты не принимают участия в событии гибридизации (например, петлевая структура, структура несовпадения или шпилечная структура). Олигомерные соединения согласно настоящему изобретению имеют комплементарность последовательности по меньшей мере примерно 70%, или по меньшей мере примерно 75%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%,или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 99%, по отношению к участку-мишени последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, служащей для них мишенью. Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 оснований нуклеиновых кислот антисмыслового соединения являются комплементарными участку-мишени и поэтому специфически гибридизуются, будет иметь 90% комплементарности. В данном примере оставшиеся некомплементарные основания нуклеиновых кислот могут быть собраны в группы или перемежаться с комплементарными основаниями нуклеиновых кислот и не должны образовывать непрерывную цепочку друг с другом или с комплементарными основаниями нуклеиновых кислот. По существу, антисмысловое соединение, имеющее в длину 18 оснований нуклеиновых кислот и содержащее 4 некомплементарных основания нуклеиновых кислот, по обе стороны от которых находятся два участка полной комплементарности с нуклеиновой кислотой-мишенью, будет иметь 77,8% общей комплементарности нуклеиновой кислоте-мишени и, таким образом, будет входить в объем настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения участку нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен в рабочем порядке с помощью известных специалистам в данной области программ BLAST (поисковые инструменты основных локальных совпадений) и PowerBLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215,403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). Процент гомологии, тождественности или комплементарности последовательностей может быть определен, например, с помощью программы GapPark, Madison WI) с использованием стандартных настроек, в которой используется алгоритм Смита и Уотермана (Smith and Waterman) (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489). Олигомерные соединения согласно настоящему изобретению также включают в себя варианты, в-5 009670 которых в одной или нескольких нуклеотидных положениях в соединении присутствуют разные основания. Например, если первый нуклеотид является аденозином, то могут быть получены варианты, содержащие в данном положении тимидин, гуанозин или цитидин. Это может относиться к любому из положений антисмыслового соединения. Такие соединения затем испытывают описанными в настоящем описании способами с целью определения их способности ингибировать экспрессию мРНК eIF4E. В некоторых вариантах осуществления гомология, тождественность последовательностей или комплементарность между антисмысловым и соединениями-мишенями составляет примерно от 50% примерно до 60%. В некоторых вариантах осуществления гомология, тождественность последовательностей или комплементарность составляет примерно от 60% примерно до 70%. В некоторых вариантах осуществления гомология, тождественность последовательностей или комплементарность составляет примерно от 70% примерно до 80%. В некоторых вариантах осуществления гомология, тождественность последовательностей или комплементарность составляет примерно от 80% примерно до 90%. В некоторых вариантах осуществления гомология, тождественность последовательностей или комплементарность составляет примерно 90%, примерно 92%, примерно 94%, примерно 95%,примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или примерно 100%. В. Соединения согласно изобретению. В контексте настоящего изобретения термин "олигомерное соединение" относится к полимерной структуре, способной гибридизоваться с участком молекулы нуклеиновой кислоты. Этот термин включает в себя олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, олигонуклеотидные аналоги, олигонуклеотидные миметики и их химерные комбинации. Олигомерные соединения обычно получают с линейной конфигурацией,но они могут быть соединены с образованием замкнутых циклов, и могут также включать в себя разветвления. Олигомерные соединения могут включать в себя двухцепочечные конструкции, такие как, например, две цепи, гибридизованные с образованием двухцепочечного соединения или одиночную цепь с достаточной самокомплементарностью, обеспечивающей возможность гибридизации и образования полностью или частично двухцепочечного соединения. В одном варианте осуществления изобретения двухцепочечные антисмысловые соединения включают в себя короткие интерферирующие РНК (siPHK). В используемом в настоящем описании значении термин "siPHK" определяется как двухцепочечное соединение, имеющее первую и вторую цепи и включающее в себя центральный участок, комплементарный между указанными первой и второй цепями, и конечные участки, необязательно комплементарные между указанными первой и второй цепями или мРНК-мишенью. Каждая цепь может иметь в длину примерно от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот, от 10 до 50 оснований нуклеиновых кислот, от 12 или 13 до 30 оснований нуклеиновых кислот, от 12 или 13 до 24 оснований нуклеиновых кислот или от 19 до 23 оснований нуклеиновых кислот. Центральный комплементарный участок может иметь в длину примерно от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот, от 10 до 50 оснований нуклеиновых кислот, от 12 или 13 до 30 оснований нуклеиновых кислот, от 12 или 13 до 24 оснований нуклеиновых кислот или от 19 до 23 оснований нуклеиновых кислот. Конечные участки могут иметь в длину от 1 до 6 оснований нуклеиновых кислот. siPHK могут также не иметь конечных участков. Две цепи siPHK могут иметь внутренние связи, оставляющие свободными 3'- или 5'-концы, или могут быть связаны с образованием непрерывной шпилечной или петельной структуры. Шпилечная структура может содержать выступающий участок на 5'- или 3'-конце, образующий одноцепочечный выступ. В одном варианте осуществления изобретения двухцепочечные антисмысловые соединения представляют собой канонические siPHK. В используемом в настоящем описании значении термин "каноническая siPHK" определяется как двухцепочечное олигомерное соединение, имеющее первую цепь и вторую цепь, причем каждая цепь имеет в длину 21 основание нуклеиновых кислот, и цепи комплементарны по 19 основаниям нуклеиновых кислот и имеют на 3'-конце каждой цепи дезокситимидиновый димер(dTdT), играющий в двухцепочечном соединении роль выступающего 3'-конца. В другом варианте осуществления двухцепочечные антисмысловые соединения представляют собой siPHK с тупыми концами. В используемом в настоящем описании значении термин "siPHK с тупыми концами" определяется как siPHK, не имеющая на концах выступающих участков. Это означает, что по меньшей мере один конец двухцепочечного соединения является тупым. siPHK, будь то канонические или с тупыми концами, вызывают выделение ферментов dsPHKa3 и запускают рекрутмент или активацию антисмыслового механизма PHKi. В другом варианте осуществления предусматриваются одноцепочечные PHKi (ssPHKi) соединения, действующие по антисмысловому механизму PHKi. Могут быть произведены другие модификации двухцепочечных соединений, которые могут включать в себя конъюгированные группы, присоединенные к одному из концов, выбранному положению основания нуклеиновой кислоты, положению сахара или к одной из межнуклеозидных связей. Альтернативно, две цепи могут быть связаны через фрагмент ненуклеиновой кислоты или линкерную группу. При образовании из всего лишь одной цепи, dsPHK может принимать форму самокомплементарной молекулы типа шпильки, которая сцеплена сама с собой, с образованием сдвоенного участка. Таким образом,dsPHK могут быть полностью или частично двухцепочечными. При образовании из двух цепей или из одной цепи, принимающей форму самокомплементарной молекулы типа шпильки, сложенной вдвое, с образованием сдвоенного участка, две цепи (или сдвоенные участки одиночной цепи) представляют со-6 009670 бой комплементарные РНК-цепи с комплементарными основаниями, в соответствии с моделью УотсонаКрика. В соответствии с настоящим изобретением "антисмысловые соединения" включают в себя антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, олигонуклеотиды внешней направляющей последовательности(EGS), siPHK-соединения, одно- или двухцепочечные РНК-интерферирующие (PHKi) соединения, такие как siPHK соединения, и другие олигомерные соединения, гибридизующиеся по меньшей мере с участком нуклеиновой кислоты-мишени и модулирующие ее функцию. По существу, они могут быть ДНК,РНК, ДНК-подобными, РНК-подобными соединениями или их смесями или могут быть миметиками одного или нескольких из них. Эти соединения могут быть одноцепочечными, двухцепочечными, кольцевыми или шпилечными олигомерными соединениями и могут содержать структурные элементы, такие как внутренние или концевые вздутия, несовпадения или петли. Антисмысловые соединения обычно получают с линейной конфигурацией, но они могут быть соединены или получены другими способами с кольцевой формой и/или разветвленными. Антисмысловые соединения могут включать в себя конструкции, такие, например, как две цепи, гибридизованные с образованием полностью или частично двухцепочечного соединения, или одиночную цепь с достаточной самокомплементарностью, обеспечивающей возможность гибридизации и образования полностью или частично двухцепочечного соединения. Две цепи могут быть внутренне связаны, оставляя свободными 3'- или 5'-концы, или могут быть связаны с образованием непрерывной шпилечной структуры или петли. Шпилечная структура может содержать выступающий участок на 5'- или 3'-конце, образующий одноцепочечный выступ. Двухцепочечные соединения необязательно могут включать в себя выступающие участки на концах. Далее модификации могут включать в себя конъюгированные группы, присоединенные к одному из концов, выбранным положениям оснований нуклеиновой кислоты, положениям Сахаров или к одной из межнуклеозидных связей. Альтернативно, две цепи могут быть связаны через фрагмент ненуклеиновой кислоты или линкерную группу. При образовании из одной цепи, dsPHK может принимать форму самокомплементарной молекулы типа шпильки, сцепленной сама с собой с образованием сдвоенного участка. Таким образом,dsPHK могут быть полностью или частично двухцепочечными. Специфическое ингибирование генной экспрессии может быть достигнуто путем стабильной экспрессии шпилек dsPHK в трансгенных клеточных линиях (Hammond et al., Nat. Rev. Genet., 1991, 2, 110-119; Matzke et al., Curr. Opin. Genet. Dev., 2001,11, 221-227; Sharp, Genes Dev., 2001, 15, 485-490). При образовании из двух цепей или из одной цепи,принимающей форму самокомплементарной молекулы типа шпильки, сцепленной сама с собой с образованием сдвоенного участка, две цепи (или сдвоенные участки отдельной цепи) являются комплементарными РНК цепями со спариванием оснований по модели Уотсона-Крика. После введения в систему соединения согласно изобретению могут вызывать действие одного или нескольких ферментов или структурных белков, приводя к расщеплению или другим модификациям нуклеиновой кислоты-мишени, или могут действовать по механизмам, связанным с доступностью связывания. В общем, нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть описаны как "ДНКподобные" (т.е. имеющие обычно один или несколько 2'-дезоксисахаров и, как правило, Т-основания вместо U-оснований) или "РНК-подобные" (т.е. имеющие обычно один или несколько 2'гидроксилированных или 2'-модифицированных сахаров и, как правило, U-основания вместо Тоснований). Спирали нуклеиновой кислоты могут иметь более чем один тип структуры, обычно, А- и Вформы. Считается, что, в общем, олигонуклеотиды, имеющие структуру, подобную В-форме, являются"ДНК-подобными", а имеющие структуру, подобную А-форме, - "РНК-подобными." В некоторых (химерных) вариантах осуществления антисмысловое соединение может содержать участки как А-, так и Вформы. Одним из примеров фермента, модифицирующего нуклеиновую кислоту-мишень, является РНКаза Н, клеточная эндонуклеаза, расщепляющая цепь РНК сдвоенной структуры РНК:ДНК. Специалистам известно, что одноцепочечные антисмысловые соединения, содержащие "ДНК-подобные" участки (например, 2'-дезоксиучастки), имеющие длину более чем примерно 3 или 4 последовательных основания нуклеиновых кислот, способны рекрутировать РНКазу Н. Активация РНКазы Н, соответственно, приводит к расщеплению РНК-мишени, тем самым значительно повышая эффективность олигонуклеотидопосредованного ингибирования генной экспрессии. Недавно было выдвинуто предположение, чтоdsPHKаза принимает участие в расщеплении РНК-цепи РНК:РНК дуплекса, наблюдаемого в процессе РНК-интерференции (PHKi). Хотя одной из принятых форм антисмыслового соединения является одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид, в других контекстах пригодными будут двухцепочечная РНК или ее аналоги. Было показано, что для многих видов введение двухцепочечных структур, таких как молекулы двухцепочечной РНК (dsPHK), индуцируют сильную и специфическую опосредованную антисмысловыми соединениями редукцию функции гена или его ассоциированных генных продуктов. Это явление наблюдается как у растений, так и у животных и, как считается, эволюционно связано с антивирусной защитой и сайленсингом транспозонов (Guo et al., Cell, 1995, 81, 611-620; Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1998, 95, 15502-15507). Посттранскрипционный антисмысловой механизм, обнаруженный для Caenorhabditis elegans и вызванный воздействием двухцепочечной РНК (dsPHK), был позднее назван РНК-7 009670 интерференцией (PHKi). Этот термин в более общем значении используется для обозначения опосредованного антисмысловыми соединениями сайленсинга генов, включающего введение dsPHK, приводящего к последовательность-специфической редукции эндогенных уровней мРНК-мишени (Fire et al., Nature,1998, 391, 806-811). PHKi-соединения часто называются короткими интерферирующими РНК или siPHK. Недавно было показано, что они фактически представляют собой одноцепочечные РНК-олигомеры антисмысловой полярности по отношению к dsPHK, являющиеся сильными индукторами PHKi (Tijsterman etal., Science, 2002, 295, 694-697). Как PHKi-соединения (т.е. одно- или двухцепочечные РНК или РНКподобные соединения), так и одноцепочечные РНКаза Н-зависимые антисмысловые соединения связываются со своей РНК-мишенью путем спаривания оснований (т.е. гибридизации) и индуцируют сайтспецифическое расщепление РНК-мишени специфическими РНКазами; т.е. оба эти вида функционируют по антисмысловому механизму (Vickers et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 7108-7118). В контексте настоящего изобретения термин "олигонуклеотид" относится к олигомеру, или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) и/или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или их миметикам, химерам, аналогам или гомологам. Этот термин включает в себя олигонуклеотиды, состоящие из нативных оснований нуклеиновых кислот, сахаров и ковалентных межнуклеозидных (скелетных) связей,а также олигонуклеотиды, имеющие ненативные участки, функционирующие аналогичным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто являются предпочтительными по сравнению с нативными формами из-за желаемых свойств, таких как, например, повышенное поглощение клетками, увеличенное сродство к нуклеиновой кислоте-мишени и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз. Антисмысловые соединения в соответствии с данным изобретением могут включать в себя антисмысловой участок длиной примерно от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот (т.е. примерно от 8 примерно до 80 связанных нуклеозидов). Это относится к длине антисмысловой цепи или участка антисмыслового соединения. Другими словами, одноцепочечное антисмысловое соединение согласно изобретению включает в себя от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот, и двухцепочечное антисмысловое соединение согласно изобретению (такое как dsPHK, например) включает в себя антисмысловую цепь или участок длиной от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот. Среднему специалисту в данной области будет очевидно, что это охватывает антисмысловые участки длиной 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 оснований нуклеиновых кислот или любой промежуточный интервал значений. В одном варианте осуществления антисмысловые соединения согласно изобретению имеют антисмысловые участки длиной от 10 до 50 оснований нуклеиновых кислот. Среднему специалисту в данной области будет очевидно, что это включает в себя антисмысловые соединения, имеющие антисмысловые участки длиной 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 4 6, 47, 48, 49 или 50 оснований нуклеиновых кислот или в любом промежуточном интервале значений. В одном варианте осуществления антисмысловые соединения согласно изобретению имеют антисмысловые участки длиной от 12 или 13 до 30 оснований нуклеиновых кислот. Среднему специалисту в данной области будет очевидно, что это включает в себя антисмысловые соединения, имеющие антисмысловые участки длиной 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 2 9 или 30 оснований нуклеиновых кислот или в любом промежуточном интервале значений. В некоторых вариантах осуществления антисмысловые соединения согласно изобретению имеют антисмысловые участки длиной от 12 или 13 до 24 оснований нуклеиновых кислот в длину. Среднему специалисту в данной области будет очевидно, что это включает в себя антисмысловые соединения,имеющие антисмысловые участки длиной 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 основания нуклеиновых кислот или в любом промежуточном интервале значений. В некоторых вариантах осуществления антисмысловые соединения согласно изобретению имеют антисмысловые участки длиной от 19 до 23 оснований нуклеиновых кислот. Среднему специалисту в данной области будет очевидно, что это охватывает антисмысловые соединения, имеющие антисмысловые участки длиной 19, 20, 21, 22 или 23 основания нуклеиновых кислот, или любой промежуточный интервал значений. Антисмысловые соединения длиной 8-80 оснований нуклеиновых кислот, включающие отрезок из по меньшей мере 8 последовательных оснований нуклеиновых кислот, выбранных из иллюстративных антисмысловых соединений, также считаются пригодными антисмысловыми соединениями. Типичные соединения включают в себя олигонуклеотидные последовательности, содержащие по меньшей мере 8 последовательных оснований нуклеиновых кислот от 5'-конца одного из иллюстративных антисмысловых соединений (остальные основания нуклеиновых кислот представляют собой последовательный отрезок того же олигонуклеотида, начинающийся непосредственно слева от 5'-конца антисмыслового соединения, специфически гибридизующегося с нуклеиновой кислотой-мишенью и имеющий протяженность олигонуклеотида примерно от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот).-8 009670 Другие соединения представлены олигонуклеотидными последовательностями, которые включают в себя по меньшей мере 8 последовательных оснований нуклеиновых кислот от 3'-конца одного из иллюстративных антисмысловых соединений (остальные основания нуклеиновых кислот представляют последовательный отрезок того же олигонуклеотида, начинающийся непосредственно справа от 3'-конца антисмыслового соединения, специфически гибридизующегося с нуклеиновой кислотой-мишенью и имеющий протяженность олигонуклеотида примерно от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот). Подразумевается также, что соединения могут быть представлены олигонуклеотидными последовательностями, которые включают в себя по меньшей мере 8 последовательных оснований нуклеиновых кислот из внутреннего участка последовательности иллюстративного соединения, и могут иметь протяженность в любом или в обоих направлениях, так чтобы олигонуклеотид содержал примерно от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот. Следует отметить, что олигомерные соединения или их фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему изобретению не включают в себя последовательности оснований нуклеиновой кислоты 5'-AGTCGCCATCTTAGATCGAT-3 (SEQ ID NO:454) или 5-AGUCGCCAUCUUAGAUCGAU-3' (SEQ IDNO:455). Кроме того, олигомерные соединения или их фармацевтически приемлемые соли, охватываемые настоящим изобретением, могут состоять из, в значительной степени состоять из или включать в себя, раскрытые в настоящем описании специфические нуклеотидные последовательности. Фразы "в значительной степени состоять из", "по существу, состоять из", "по существу, состоящий из" и т.п., при использовании по отношению к олигомерным соединениям или их фармацевтически приемлемым солям,охватываемым настоящим изобретением, касаются нуклеотидных последовательностей, таких как раскрытые в настоящем описании, но содержащих дополнительные нуклеотиды (рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или их аналоги или производные, как обсуждено в данном описании). Такие дополнительные нуклеотиды, однако, существенно не влияют на основные и новые характеристики этих олигомерных соединений или их фармацевтически приемлемых солей, касающиеся модулирования, ослабления или ингибирования генной экспрессии eIF4E или функции РНК, включая специфические количественные эффекты этих молекул, по сравнению с соответствующими параметрами раскрытых в настоящем описании соответствующих олигомерных соединений или их фармацевтически приемлемых солей. Специалист в данной области, имеющий в своем распоряжении проиллюстрированные в настоящем описании антисмысловые соединения, сможет, без ненадлежащего экспериментирования, идентифицировать другие антисмысловые соединения. С. Мишени согласно изобретению."Нацеливание" олигомерного соединения на конкретную молекулу нуклеиновой кислоты в контексте настоящего изобретения может быть многостадийным процессом. Процесс обычно начинается с идентификации нуклеиновой кислоты-мишени, функцию которой требуется модулировать. Эта нуклеиновая кислота-мишень может быть, например, клеточным геном (или транскрибированной с гена мРНК),экспрессия которого ассоциирована с конкретным расстройством или болезненным состоянием, или молекулой нуклеиновой кислоты инфекционного агента. В настоящем изобретении нуклеиновая кислотамишень кодирует eIF4E. Процесс нацеливания обычно также включает в себя определение по меньшей мере одного участкамишени, сегмента или сайта в нуклеиновой кислоте-мишени для осуществления антисмыслового взаимодействия для достижения желаемого эффекта, например, модулирования экспрессии. В контексте настоящего изобретения термин "участок" определяется как участок-мишень нуклеиновой кислоты, имеющий по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику. В пределах участков-мишеней нуклеиновых кислот расположены сегменты. "Сегменты" определяются как меньшие по размеру или субфрагменты участков-мишеней нуклеиновой кислоты. "Сайты" в используемом в настоящем изобретении значении определяются как положения в нуклеиновой кислоте-мишени. Поскольку, как известно в данной области, кодоном инициации трансляции обычно является 5'AUG (при транскрипции молекулы мРНК; 5'-ATG для соответствующей молекулы ДНК), кодон инициации трансляции называется также "AUG-кодоном", "старт-кодоном" или "стартовым AUG-кодоном". Было показано, что незначительное количество генов, имеющих кодон инициации трансляции с РНК последовательностью 5'-GUG, 5'-UUG или 5'-CUG, и 5'-AUA, 5'-ACG и 5'-CUG, способны функционировать in vivo. Таким образом, термины "кодон инициации трансляции" и "старт-кодон" могут охватывать многие последовательности кодонов, несмотря на то, что в каждом случае аминокислотой-инициатором обычно является метионин (у эукариотов) или формилметионин (у прокариотов). Как известно в данной области, эукариотические и прокариотические гены могут иметь два или больше альтернативных старткодонов, любой из которых может быть предпочтительно использован для инициации трансляции в конкретном типе клеток или ткани или в конкретных условиях. В контексте изобретения "старт-кодон" и"кодон инициации трансляции" относятся к кодону или кодонам, используемым in vivo для инициации трансляции мРНК, транскрибированной с гена, кодирующего eIF4E, независимо от последовательности(последовательностей) таких кодонов. Как известно в данной области, кодон терминации трансляции (или"стоп-кодон") гена может иметь одну из трех последовательностей, а именно 5'-UAA, 5'-UAG и 5'-UGA-9 009670 Термины "область старт-кодона" и "область кодона инициации трансляции" относятся к таким участкам мРНК или гена, которые охватывают примерно от 25 примерно до 50 непрерывно расположенных нуклеотидов в любом направлении (т.е. к 5'- или 3'-концу) от кодона инициации трансляции. Аналогично, термины "область стоп-кодона" и "область кодона терминации трансляции" относятся к такому участку мРНК или гена, который охватывает примерно от 25 примерно до 50 непрерывно расположенных нуклеотидов в любом направлении (т.е. к 5'- или 3'-концу) от кодона терминации трансляции. Следовательно, "область старт-кодона" (или "область кодона инициации трансляции") и "область стоп-кодона"(или "область кодона терминации трансляции") все представляют собой участки, которые могут служить мишенями для антисмысловых соединений согласно настоящему изобретению. Открытая рамка считывания (ORF) или "кодирующая область", как известно в данной области, относится к участку между кодоном инициации трансляции и кодоном терминации трансляции, а также является участком, который может эффективно служить мишенью. В контексте настоящего изобретения одним из участков является внутригенная область, охватывающая кодон инициации или терминации трансляции открытой рамки считывания (ORF) гена. Другие участки-мишени включают в себя нетранслируемый 5'-участок (5'UTR), который, как известно в данной области, относится к участку мРНК в направлении к 5'-концу от кодона инициации трансляции и, таким образом, включает в себя нуклеотиды между кэп-сайтом 5'-конца и кодоном инициации трансляции мРНК (или соответствующие нуклеотиды гена), и нетранслируемый 3'-участок(3'UTR), который, как известно в данной области, относится к участку мРНК в направлении к 3'-концу от кодона терминации трансляции и, таким образом, включает в себя нуклеотиды между кодоном терминации трансляции и 3'-концом мРНК (или соответствующие нуклеотиды гена). Кэп-сайт 5'-конца мРНК включает в себя N7-метилированный гуанозиновый остаток, соединенный с крайним в направлении к 5'концу остатком мРНК с помощью 5'-5' трифосфатной связи. Считается, что кэп-участок 5'-конца мРНК включают в себя собственно структуру 5'-кэпа, а также первые 50 нуклеотидов, прилегающих к кэпсайту. Кэп-участок 5'-конца также являются мишенью. Хотя некоторые эукариотические транскрипты мРНК транслируются непосредственно, многие из них содержат один или несколько участков, известных как "интроны", которые вырезаются из транскрипта перед его транслированием. Оставшиеся (и потому транслируемые) участки известны как "экзоны" и соединяются вместе, с образованием непрерывной последовательности мРНК. Нацеливание на сайты сплайсинга, т.е. места стыков интрон-экзон или места стыков экзон-интрон, также может быть особенно полезно в тех случаях, когда заболевание вызывает аберрантный сплайсинг или когда заболевание связано со сверхпродуцированием конкретного продукта сплайсинга. Пригодными сайтамимишенями являются также места стыков аберрантного слияния при перегруппировках или делециях. Транскрипты мРНК, продуцируемые в процессе сплайсинга двух (или нескольких) мРНК из разных генных источников, известны как "гибридные транскрипты". Известно также, что интроны могут эффективно служить мишенями при использовании антисмысловых соединений, нацеленных, например, на ДНК или пре-мРНК. Одноцепочечные антисмысловые соединения, такие как олигонуклеотидные соединения,функционирующие по механизму РНКазы Н, являются эффективными для нацеливания на пре-мРНК. Как известно в данной области, из одной и той же геномной области ДНК могут быть получены альтернативные РНК-транскрипты. Такие альтернативные транскрипты общеизвестны как "варианты". Более конкретно, "варианты пре-мРНК" представляют собой транскрипты, полученные из одной и той же геномной ДНК, которые отличаются от других транскриптов, полученных из той же геномной ДНК,положением начала или конца трансляции и содержат как интронные, так и экзонные последовательности. После вырезания одного или нескольких экзонных или интронных участков или их фрагментов при сплайсинге, варианты пре-мРНК продуцируют меньшие по размеру "варианты мРНК". Следовательно,варианты мРНК представляют собой процессированные варианты пре-мРНК и каждый уникальный вариант пре-мРНК должен всегда продуцировать в результате сплайсинга уникальный вариант мРНК. Эти варианты мРНК известны также как "альтернативные варианты сплайсинга". Если не происходит сплайсинга варианта пре-мРНК, то вариант пре-мРНК является идентичным варианту мРНК. Как известно в данной области, варианты могут быть получены при использовании альтернативных сигналов начала или остановки транскрипции, и что пре-мРНК и мРНК могут иметь более одного старткодона или стоп-кодона. Варианты, полученные из пре-мРНК или мРНК с использованием альтернативных старт-кодонов, известны как "альтернативные старт-варианты" указанной пре-мРНК или мРНК. Транскрипты, использующие альтернативный стоп-кодон, известны как "альтернативные стоп-варианты" указанной пре-мРНК или мРНК. Одним из конкретных типов альтернативного стоп-варианта является"полиА-вариант", в котором многочисленные полученные транскрипты являются результатом выбора механизмом транскрипции одного из альтернативных "полиА стоп-сигналов", в результате чего образуются транскрипты, заканчивающиеся уникальными полиА-сайтами. В контексте изобретения типы описанных в настоящем описании вариантов также являются пригодными нуклеиновыми кислотамимишенями. Положения в нуклеиновой кислоте-мишени, в которых происходит гибридизация пригодных оли- 10009670 гомерных соединений, называются в настоящем описании "пригодными сегментами-мишенями". В используемом в настоящем описании значении термин "пригодный сегмент-мишень" определяется как фрагмент участка-мишени нуклеиновой кислоты, состоящий по меньшей мере из 8 оснований, служащий мишенью для активного олигомерного соединения. Не желая быть связанными с теорией, следует отметить, что в настоящее время считается, что такие сегменты-мишени представляют собой участки-мишени нуклеиновой кислоты, доступные для гибридизации. Хотя здесь описаны специфические последовательности некоторых пригодных сегментов-мишеней,специалисту в данной области будет понятно, что они служат для иллюстрации и описания конкретных вариантов осуществления в рамках настоящего изобретения. Дополнительные пригодные сегментымишени могут быть идентифицированы средним специалистом в данной области. Нет необходимости,чтобы "пригодный сегмент-мишень" был идентифицирован этим термином или включен в таблицу "пригодных сегментов-мишеней", если такие есть. Сегменты-мишени длиной 8-80 оснований нуклеиновых кислот, включающие отрезок из меньшей мере 8 последовательных оснований нуклеиновых кислот, выбранный из иллюстративных пригодных сегментов-мишеней, также считаются пригодными для использования в качестве мишеней. Сегменты-мишени могут включать в себя последовательности ДНК или РНК, включающие по меньшей мере 8 последовательных оснований нуклеиновых кислот из 5'-конца одного из иллюстративных пригодных сегментов-мишеней (остальные основания нуклеиновых кислот представляют собой последовательный фрагмент той же ДНК или РНК, начинающийся непосредственно слева от 5'-конца сегмента-мишени и имеющий такую протяженность, чтобы ДНК или РНК содержала примерно от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот). Аналогичные пригодные сегменты-мишени представлены последовательностями ДНК или РНК, которые включают в себя по меньшей мере 8 последовательных оснований нуклеиновых кислот из 3'-конца одного из иллюстративных пригодных сегментов-мишеней(остальные основания нуклеиновых кислот представляют собой последовательный фрагмент той же ДНК или РНК, начинающийся непосредственно справа от 3'-конца сегмента-мишени и имеющий такую протяженность, чтобы ДНК или РНК содержала примерно от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот). Подразумевается также, что пригодные олигомерные сегменты-мишени могут быть представлены ДНК- или РНК-последовательностями, которые включают в себя по меньшей мере 8 последовательных оснований нуклеиновых кислот из внутреннего участка последовательности иллюстративных пригодных сегментов-мишеней, и могут иметь такую протяженность в любом или в обоих направлениях, чтобы олигонуклеотид содержал примерно от 8 примерно до 80 оснований нуклеиновых кислот. Специалист в данной области, имеющий в своем распоряжении пригодные сегменты-мишени, проиллюстрированные в настоящем описании, сможет без ненадлежащего экспериментирования идентифицировать другие пригодные сегменты-мишени. После идентификации одного или нескольких участков-мишеней, сегментов или сайтов, выбирают олигомерные соединения, в достаточной степени комплементарные мишени, т.е. достаточно хорошо и с достаточной специфичностью гибридизующиеся для получения желаемого эффекта. Олигомерные соединения могут также быть нацеленными на области последовательностеймишеней оснований нуклеиновой кислоты (например, таких как раскрыто в приведенных ниже примерах), включающие основания нуклеиновых кислот 1-80, 81-160, 161-240, 241-320, 321-400, 401-480, 481560, 561-640, 641-720, 721-800, 801-880, 881-960, 961-1040, 1041-1120, 1121-1200, 1201-1280, 1281-1360,1361-1440, 1441-1520, 1521-1600, 1601-1680, 1681-1760 или 1761-1842 или любую из комбинацию.D. Скрининг и проверка правильности выбора мишеней. В другом варианте осуществления идентифицированные в настоящем описании "пригодные сегменты-мишени" могут быть использованы для скрининга дополнительных соединений, модулирующих экспрессию eIF4E. "Модуляторы" представляют собой соединения, которые уменьшают или увеличивают экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей eIF4E, и которые включают в себя по меньшей мере фрагмент из 8 оснований нуклеиновой кислоты, комплементарный (т.е. антисмысловой) пригодному сегменту-мишени. Способ скрининга включает в себя стадии введения в контакт пригодного сегмента-мишени молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей eIF4E, с одним или несколькими кандидатами в модуляторы, и выбора одного или нескольких кандидатов в модуляторы, которые уменьшают или увеличивают экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей eIF4E. После того как будет продемонстрировано, что кандидаты в модуляторы или модуляторы способны модулировать (например,уменьшать или увеличивать) экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей eIF4E, модулятор может быть использован в дальнейших исследованиях функции eIF4E или в качестве исследовательского, диагностического или терапевтического агента в соответствии с настоящим изобретением. В общем, активность конструкций dsPHK коррелирует с активностью РНКаза Н-зависимых одноцепочечных антисмысловых соединений, нацеленных на этот же сайт (Vickers et al., J. Biol. Chem., 2003,278, 7108). Таким образом, последовательности, проявляющие активность в виде одноцепочечного антисмыслового соединения (например, РНКаза Н-зависимые соединения), могут быть использованы для конструирования двухцепочечных (например siPHK) антисмысловых соединений и наоборот. Пригодные сегменты-мишени согласно настоящему изобретению могут быть объединены с их соответствующими- 11009670 комплементарными антисмысловыми соединениями, с образованием стабилизированных двухцепочечных (дуплексных) соединений. Было продемонстрировано, что такие фрагменты двухцепочечных олигомерных соединений модулируют целевую экспрессию и регулируют трансляцию, а также РНКпроцессинг по антисмысловому механизму. Кроме того, двухцепочечные фрагменты могут быть подвергнуты химической модификации (Fire et al., Nature, 1998, 391, 806-811; Timmons and Fire, Nature 1998,395, 854; Timmons et al., Gene, 2001, 263, 103-112; Tabara et al., Science, 1998, 282, 430-431; Montgomery etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507; Tuschl et al., Genes Dev., 1999, 13, 3191-3197; Elbashir et al., Nature, 2001, 411, 494-498; Elbashir et al., Genes Dev. 2001, 15, 188-200). Например, было показано, что такие двухцепочечные фрагменты ингибируют мишень путем классической гибридизации антисмысловой цепи дуплекса с мишенью, тем самым, запуская ферментативное разрушение мишени(Tijsterman et al., Science, 2002, 295, 694-697). Антисмысловые механизмы на основе как РНКазы Н(обычно с использованием одноцепочечных соединений), так и siPHK (обычно с использованием двухцепочечных соединений), являются антисмысловыми механизмами, типично приводящими к утрате функции РНК-мишени. Оптимизированные siPHK и РНКаза Н-зависимые олигомерные соединения ведут себя аналогично по показателям активности, максимального эффекта, специфичности и продолжительности действия и эффективности. Более того, было показано, что, в общем, активность конструкцийdsPHK коррелирует с активностью РНКаза Н-зависимых одноцепочечных антисмысловых соединений,нацеленных на тот же сайт. Одним значительным исключением является то, что РНКаза Н-зависимые антисмысловые соединения были, как правило, активными по отношению к сайтам-мишеням в премРНК, тогда как siPHK такой активностью не обладали (Vickers et al., J. Biol. Chem., 203, 278, 7108). Олигомерные соединения согласно настоящему изобретению могут также быть применены в области поиска новых лекарственных средств и подтверждения правильности выбранной мишени. Настоящее изобретение предусматривает использование соединений и пригодных сегментов-мишеней, идентифицированных в настоящем описании, при поиске новых лекарственных средств для выявления взаимосвязей, существующих между eIF4E и болезненным состоянием, фенотипом или условиями. Эти способы включают в себя детектирование или модулирование eIF4E, включающее в себя введение в контакт образца, ткани, клетки или организма с одним или несколькими антисмысловыми соединениями согласно настоящему изобретению, измерение уровня нуклеиновой кислоты или белка eIF4E и/или связанной с ним фенотипической или химической конечной точки в определенный момент времени после обработки и, необязательно, сравнение измеренного значения с необработанным образцом или образцом, обработанным другим соединением согласно изобретению. Эти способы могут также осуществляться параллельно или в комбинации с другими экспериментами с целью определения функции неизвестных генов для подтверждения правильности выбора мишени или с целью определения пригодности конкретного генного продукта в качестве мишени для лечения или профилактики определенного заболевания, состояния или фенотипа. Е. Наборы, исследовательские реагенты, диагностические и терапевтические средства. Олигомерные соединения согласно настоящему изобретению могут быть использованы для диагностики, терапии, профилактики и в качестве исследовательских реагентов и наборов. Кроме того, олигомерные соединения, способные ингибировать генную экспрессию с высокой специфичностью, часто используются средними специалистами в данной области для выявления функции определенных генов или для обнаружения различий между функциями различных участников биологических процессов. Для использования в наборах и диагностике, соединения согласно настоящему изобретению, сами по себе или в комбинации с другими соединениями или лекарственными средствами, могут быть использованы в качестве инструментов дифференциального и/или комбинаторного анализа для определения закономерностей экспрессии части или всего комплемента генов, экспессируемых в клетках и тканях. В качестве одного неограничивающего примера, закономерности экспрессии в клетках или тканях,обработанных одним или несколькими соединениями, сравнивают с контрольными клетками или тканями, не обработанными соединениями, и полученные закономерности анализируют по различиям в уровнях генной экспрессии, связанных, например, с ассоциациями заболевания, сигнальными путями, клеточной локализацией, уровнем экспрессии, размером, структурой или функцией исследуемых генов. Эти анализы могут проводиться на стимулированных или нестимулированных клетках и в присутствии или отсутствии других соединений, влияющих на характер экспрессии. Примеры методов анализа генной экспрессии, как известно в данной области, включают в себя ДНК-матрицы или микроматрицы (Brazma et al., FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celis et al., FEBS Lett.,2000, 480, 2-16), SAGE (серийный анализ генной экспрессии) (Madden et al., Drug Discov. Today, 2000, 5,415-425), READS (амплификация рестриктаз гидролизованных кДНК) (Prashar et al., Methods Enzymol.,1999, 303, 258-72), TOGA (полный анализ генной экспрессии) (Sutcliffe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), секвенирование меток экспессируемой последовательности (EST)(Celis et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), вычитательный фингерпринтинг РНК (SuRF) (Fuchs et al., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larson et al., Cytometry, 2000,41, 203-208), вычитательное клонирование с дифференциальным отображением (DD) (Jurecic et al., Curr.Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), сравнительная геномная гибридизация (Carulli et al., J. клетка Biochem.Suppl., 1998, 31, 286-96), методы FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) (Going et al., Eur. J. Cancer,1999, 35, 1895-904) и масс-спектрометрические способы (То, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000,3, 235-41). Специфичность и чувствительность антисмысловых соединений также используется специалистами в данной области для терапевтического применения. Антисмысловые соединения использовались в качестве терапевтических компонентов для лечения болезненных состояний у животных, включая людей. Антисмысловые лекарственные препараты, включая рибозимы, использовались для безопасного и эффективного введения людям, и в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания. Таким образом было установлено, что антисмысловые соединения представляют собой полезные терапевтические методы воздействия, которые могут быть эффективно использованы в схемах лечения клеток, тканей и животных, особенно людей. Настоящее изобретение предусматривает лечение животных, выбранных из домашних животных,животных в зоопарках и сельскохозяйственных животных, включая, но без ограничения, кошек, собак,грызунов, лошадей, крупный рогатый скот, овец, свиней, коз и т.д. В терапевтических целях животное, такое как человек, с подозрением на наличие заболевания или расстройства, лечение которого может проводиться путем модулирования экспрессии eIF4E, лечат путем введения соединения в соответствии с данным изобретением. Например, в одном неорганичивающем варианте осуществления способы включают в себя стадию введения животному, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества олигомерного соединения, ингибирующего eIF4E. Воздействующие на eIF4E соединения согласно настоящему изобретению эффективно ингибируют активность или экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей РНК eIF4E. Поскольку снижение уровней РНК eIF4E может приводить также к снижению уровней белка eIF4E, может быть также измерено снижение экспрессии или уровней белка. В некоторых вариантах осуществления животному ставится диагноз болезни или расстройства перед проведением лечения. В одном варианте осуществления олигомерные соединения модулируют активность или экспрессию мРНК eIF4E по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 25%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100%. Например, снижение экспрессии eIF4E может быть измерено в сыворотке, жировой ткани, печени или любой другой жидкой среде организма, ткани или органе животного. Клетки, содержащиеся в указанных анализируемых жидкостях, тканях или органах, могут содержать молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок eIF4E, и/или сам белок eIF4E. Соединения согласно изобретению могут быть использованы в фармацевтических композициях путем добавления эффективного количества соединения к пригодному фармацевтически или физиологически приемлемому эксципиенту, разбавителю или носителю. Использование соединений и способов согласно изобретению может также быть профилактически полезным. Таким образом, настоящее изобретение охватывает применение раскрытых в настоящем описании соединений в качестве фармацевтических средств, а также применение раскрытых в настоящем описании соединений для изготовления медикаментов, предназначенных для лечения раскрытых в настоящем описании расстройств. Соединения согласно настоящему изобретению ингибируют экспрессию eIF4E. Поскольку эти соединения ингибируют эффекты активации eIF4E, они являются пригодными для лечения расстройств,связанных с экспрессией eIF4E. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению являются противораковыми агентами. Соединения согласно настоящему изобретению считаются полезными при лечении карцином, таких как опухоли центральной нервной системы: мультиформная глиобластома, астроцитома, олигодендроглиальные опухоли, эпендимальные опухоли и опухоли хориоидного сплетения, опухоли шишковидного тела, неврональные опухоли, медуллобластома, шваннома, менингиома, менингиальная саркома; неоплазмы глаз: базально-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, меланома, рабдомиосаркома,ретинобластома; неоплазмы эндокринных желез: неоплазмы гипофиза, неоплазмы щитовидной железы,неоплазмы коры надпочечника, неоплазмы нейроэндокринной системы, неоплазмы гастроэнтеропанкреатической эндокринной системы, неоплазмы половых желез; неоплазмы головы и шеи: раки головы и шеи, ротовой полости, глотки, гортани, одонтогенные опухоли; неоплазмы грудной клетки: крупноклеточная карцинома легких, мелкоклеточная карцинома легких, немелкоклеточная карцинома легких, неоплазмы грудной клетки, злокачественная мезотелиома, тимомы, опухоли первичных зародышевых клеток грудной клетки; неоплазмы пищеварительного тракта: неоплазмы пищевода, неоплазмы желудка,неоплазмы печени, неоплазмы мочевого пузыря, неоплазмы экзокринной поджелудочной железы, неоплазмы малой кишки, червеобразного отростка и брюшины, аденокарцинома ободочной и прямой кишки, неоплазмы анального отверстия; неоплазмы мочеполового тракта: почечно-клеточная карцинома,- 13009670 неоплазмы почечной лоханки и мочеточника, неоплазмы мочевого пузыря, неоплазмы уретры, неоплазмы простаты, неоплазмы полового члена, неоплазмы яичек; неоплазмы женских половых органов: неоплазмы вульвы и влагалища, неоплазмы шейки матки, аденокарцинома тела матки, рак яичников, саркомы половых органов; неоплазмы молочной железы; неоплазмы кожи: базально-клеточная карцинома,плоскоклеточная карцинома, дерматофибросаркома, опухоль из клеток Меркеля; злокачественная меланома; неоплазмы костной и мягкой ткани: остеогенная саркома, злокачественная фиброзная гистиоцитоксантома, хондросаркома, саркома Юинга, примитивная нейроэктодермальная опухоль, ангиосаркома; неоплазмы кроветворной системы: миелодиспластические синдромы, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, HTLV-1 и Т-клеточная лейкемия/лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, болезнь Ходжкина, неходжкинские лимфомы, тучноклеточный лейкоз; и детские неоплазмы: острый лимфобластный лейкоз,острые миелоцитарные лейкозы, нейробластома, опухоли костей, рабдомиосаркома, лимфомы, опухоли почек. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения восприимчивых неоплазмов, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества олигонуклеотида изолированной одноцепочечной РНК или двухцепочечной РНК, нацеленного на eIF4E. ssPHK или dsPHK олигонуклеотиды могут быть модифицированными или немодифицированными. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает применение изолированных олигонуклеотидов двухцепочечных РНК, нацеленных на eIF4E, или их фармацевтической композиции для лечения восприимчивых неоплазмов. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает использование соединений изолированных двухцепочечных олигонуклеотидов РНК в производстве лекарственного средства, предназначенного для ингибирования экспрессии или сверхэкспрессии eIF4E. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает применение изолированных двухцепочечных олигонуклеотидов РНК, нацеленных наeIF4E, в производстве лекарственного средства для лечения восприимчивых неоплазмов описанным выше способом. Соединения согласно настоящему изобретению полезны для лечения гиперпролиферативных расстройств. Конкретнее, соединения согласно настоящему изобретению пригодны для лечения рака. Соединения согласно настоящему изобретению особенно полезны для лечения солидных опухолей. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению особенно полезны для лечения рака молочной железы, рака ободочной кишки, рака простаты, рака легких, рака печени, рака мочевого пузыря, рака яичников, рака почки и глиобластомы. Антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению особенно полезны для лечения солидных опухолей.F. Модификации. Как известно в данной области, нуклеозид представляет собой комбинацию основания и сахара. Основной частью нуклеозида является обычно гетероциклическое основание (которое иногда называют"основанием нуклеиновой кислоты" или просто "основанием"). Двумя наиболее распространенными классами таких гетероциклических оснований являются пурины и пиримидины. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, которые дополнительно содержат фосфатную группу, ковалентно связанную с фрагментом сахара нуклеозида. Для нуклеозидов, включающих пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2'-, 3'- или 5'-гидроксильным фрагментом сахара. При образовании олигонуклеотидов, фосфатные группы ковалентно связывают соседние нуклеозиды друг с другом с образованием линейного полимерного соединения. В свою очередь, соответствующие концы этого линейного полимерного соединения могут быть далее соединены с образованием кольцевого соединения, однако,обычно желательными являются линейные соединения. Кроме того, линейные соединения могут обладать комплементарностью внутренних оснований нуклеиновой кислоты и могут поэтому складываться таким образом, чтобы образовывать при этом полностью или частично двухцепочечное соединение. Внутри олигонуклеотидов фосфатные группы обычно называют образующими межнуклеозидный скелет олигонуклеотида. Нормальными связями или скелетом РНК и ДНК являются фосфодиэфирные связи между 3'- и 5'-концами. Модифицированные сахара и межнуклеозидные связи. Конкретные примеры олигомерных антисмысловых соединений, пригодных для использования в данном изобретении, включают в себя олигонуклеотиды, содержащие модифицированные, например,ненативные межнуклеозидные связи. Как определено в данном описании, олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, включают в себя межнуклеозидные связи, сохраняющие атом фосфора, и межнуклеозидные связи, не содержащие атома фосфора. В целях данного описания и,как иногда указывается в известном уровне техники, модифицированные олигонуклеотиды, не содержащие атома фосфора в своем межнуклеозидном скелете, также могут считаться олигонуклеозидами. Олигомерные соединения согласно изобретению могут иметь одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. Одним видом фосфорсодержащей модифицированной межнуклеозидной связи является фосфоротиоатная межнуклеозидная связь. Другие модифицированные олигонуклеотидные скелеты, содержащие атом фосфора, включают в себя, например, фосфоротиоаты, хиральные фос- 14009670 форотиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфотриэфиры, сложные аминоалкилфосфотриэфиры, метили другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты, 5'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, сложные тионоалкилфосфотриэфиры, фосфоноацетат и тиофосфоноацетат (см. Sheehan et al., Nucleic Acids Research, 2003, 31(14), 4109-4118 и Dellinger et al., J. Am.Chem. Soc, 2003, 125, 940-950), селенофосфаты и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5' связи, их аналоги с 2'-5' связями, и соединения с обращенной полярностью, в которых одна или несколько внутринуклеотидных связей представляет собой 3'-3', 5'-5' или 2'-2' связи. Олигонуклеотиды, имеющие обращенную полярность, включают в себя одну 3'-3' связь в положении ближней к 3'-концу межнуклеотидной связи, т.е. один обращенный нуклеозидный остаток, который может иметь неосновный характер (основание нуклеиновой кислоты отсутствует или вместо него находится гидроксильная группа). Включены также разные соли, смешанные соли и формы свободной кислоты. Сообщалось, что N3'-Р 5'-фосфорамидаты обладают как высоким сродством к комплементарной цепи РНК, так и устойчивостью к нуклеазам (Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc, 1994, 116, 3143-3144). N3'P5'-фосфорамидаты были исследованы in vivo на специфическую понижающую регуляцию экспрессии гена c-myc с определенной степенью успешности (Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 3966-3971; и Faira et al., Nat. Biotechnol., 2001, 19, 40-44). Конкретные патенты США, описывающие приготовление вышеописанных фосфорсодержащих связей, включают в себя, но без ограничения, патенты 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; 5194599; 5565555; 5527899; 5721218; 5672697 и 5625050, каждый из которых включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения олигомерные соединения могут иметь одну или несколько фосфоротиоатных и/или гетероатомных межнуклеозидных связей, в частности-CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (известные как метилен (метилимино) или MMI-скелет),-CH2-O-N(CH3)-СН 2-, -СН 2-N(СН 3)-N(СН 3)-СН 2- и -O-N(CH3)-СН 2-СН 2- (где нативная сложная фосфодиэфирная межнуклеотидная связь имеет вид -O-P(=O)(ОН)-O-СН 2-). Межнуклеозидные связи MMI-типа раскрыты в вышеуказанном патенте США 5489677. Амидные межнуклеозидные связи раскрыты в вышеуказанном патенте США 5602240. Некоторые олигонуклеотидные скелеты, не содержащие атома фосфора, являются скелетами, образованными короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают в себя скелеты с морфолиносвязями (образованными частично сахаром нуклеозида); силоксановые скелеты; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые скелеты; формацетильные и тиоформацетильные скелеты; метиленформацетильные и тиоформацетильные скелеты; рибоацетильные скелеты; алкенсодержащие скелеты; сульфаматные скелеты; метилениминовые и метиленгидразиновые скелеты; сульфонатные и сульфонамидные скелеты; амидные скелеты; и другие, содержащие смешанныеN, О, S и СН 2-компоненты. Конкретные патенты США, описывающие получение вышеописанных олигонуклеозидов, включают в себя, но без ограничения, патенты США 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; 5792608; 5646269 и 5677439, каждый из которых включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Другая группа олигомерных соединений, пригодных согласно настоящему изобретению, включает в себя олигонуклеотидные миметики. Термин "миметик", в значении, применимом к олигонуклеотидам,включает в себя олигомерные соединения, в которых фуранозное кольцо или фуранозное кольцо и межнуклеотидная связь заменены новыми группами, причем замена только фуранозного кольца называется также в данной области заменителем сахара. Фрагмент гетероциклического основания или фрагмент модифицированного гетероциклического основания сохраняется для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью. Одно такое олигомерное соединение - олигонуклеотидный миметик, обладающий, как было продемонстрировано, превосходной способностью к гибридизации, называется пептидной нуклеиновой кислотой (PNA) (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500). PNA обладают благоприятными гибридизационными свойствами, высокой биологической стабильностью и являются электростатически нейтральными молекулами. В одном из недавних исследований соединения PNA были использованы для исправления аберрантного сплайсинга на трансгенных мышиных моделях (Sazani et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20,1228-1233). В олигомерных PNA-соединениях, сахарный скелет олигонуклеотида заменен амидсодержащим скелетом, в частности, аминоэтилглициновым скелетом. Основания нуклеиновых кислот связаны прямо или косвенно (-C(=O)-СН 2-, как описано ниже) с атомами азота азагрупп амидного фрагмента скелета. Конкретные патенты США, описывающие получение олигомерных PNA-соединений, включают в- 15009670 себя, но без ограничения, патенты США 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. PNA-соединения могут быть приобретены у фирмы Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). В данной области известны многочисленные модификации основного скелета PNA; особенно полезными являются PNA-соединения с одной или несколькими аминокислотами, конъюгированными с одним или обоими концами. В частности, при конъюгации с концом PNA-молекулы полезны 1-8 лизиновых или аргининовых остатков. Другой класс изученных олигонуклеотидных миметиков основан на связанных морфолиновых звеньях (морфолинонуклеиновая кислота), имеющих гетероциклические основания, присоединенные к морфолиновому кольцу. Был описан ряд линкерных групп, связывающих морфолиновые мономерные звенья в морфолинонуклеиновую кислоту. Один класс линкерных групп был выбран для получения неионного олигомерного соединения. Неионные олигомерные соединения на основе морфолина имеют меньшую вероятность нежелательных взаимодействий с клеточными белками. Олигомерные соединения на основе морфолина представляют собой неионные мимические олигонуклеотиды, имеющие меньшую вероятность нежелательных взаимодействий с клеточными белками (Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510). Олигомерные соединения на основе морфолина были исследованы на эмбрионах рыбы-зебры (см. Genesis,volume 30, issue 3, 2001 и Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214). Были также описаны другие исследования олигомерных соединений на основе морфолина (см. Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216220; и Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596). Олигомерные соединения на основе морфолина раскрыты в патенте США 5034506, выданном 23 июля 1991 г. Был получен класс олигомерных соединений на основе морфолина, имеющих различные линкерные группы, связывающие мономерные субъединицы. Линкерные группы могут меняться от хиральных до ахиральных, и от заряженных до нейтральных. В патенте США 5166315 раскрыты связи, включая -O-Р(=O)(N(СН 3)2)-О-; в патенте США 5034506 раскрыты ахиральные межморфолиновые связи; и в патенте США 5185444 раскрыты фосфорсодержащие хиральные межморфолиновые связи. Другой класс олигонуклеотидных миметиков называется циклогексенилнуклеиновыми кислотами(CeNA). Фуранозное кольцо, обычно присутствующее в молекуле ДНК или РНК, заменено циклогексенильным кольцом. Были получены CeNA DMT-защищенные фосфорамидитные мономеры, которые использовали для синтеза олигомерных соединений методами классической фосфорамидитной химии. Были получены и изучены полностью модифицированные CeNA олигомерные соединения и олигонуклеотиды, модифицированные CeNA в конкретных положениях (см. Wang et al., J. Am. Chem. Soc, 2000, 122,8595-8602). В общем, включение мономеров CeNA в цепь ДНК повышает стабильность ДНК/РНК гибрида. CeNA-олигоаденилаты образуют комплексы с РНК и ДНК комплементами, имеющие стабильность, близкую к нативным комплексам. Исследования по включению CeNA-структур в структуры природных нуклеиновых кислот методами ЯМР и кругового дихроизма показали, что процесс протекает с легкой конформационной адаптацией. Кроме того, включение CeNA в последовательность нацеливания на РНК обеспечивало стабильность к воздействию сыворотки и способность активировать РНКазу Е.coli, что приводило к расщеплении цепи РНК-мишени. Следующая модификация включает в себя бициклические фрагменты сахаров, такие как "сцепленные нуклеиновые кислоты" (LNA), в которых 2'-гидроксильная группа рибозильного кольца сахара связана с 4'-атомом углерода кольца сахара, образуя при этом 2'-С,4'-С-оксиметиленовую связь с образованием бициклического фрагмента сахара (обзор в Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8 1-7; и Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; см. также патенты США 6268490 и 6670461). Связь может быть метиленовой (-СН 2-) группой, связывающей 2'-атом кислорода и 4'-атом углерода, в этом случае бициклический фрагмент обозначается термином LNA; если в этом положении находится этиленовая группа, то используется термин ENA (Singh etal., Chem. Comraun., 1998, 4, 455-456; ENA: Morita et al., Bioorganical Medicinal Chemistry, 2003, 11,2211-2226). LNA и другие аналоги с бициклическими сахарами обладают очень высокой термической стабильностью дуплексов с комплементарными ДНК и РНК (Tm=от +3 до +10 С), стабильностью по отношению к 3'-экзонуклеолитической деградации и хорошими показателями растворимости. LNA коммерчески доступны от фирмы Proligo (Paris, France and Boulder, CO, USA). Был также исследован изомер LNA, представляющий собой -L-LNA, который, как было показано,обладает повышенной стабильностью к действию 3'-экзонуклеазы (Frieden et al., Nucleic Acids Research,2003, 21, 6365-6372). -L-LNA были включены в антисмысловые гэпмеры и химеры, которые проявляли высокую антисмысловую активность. Другой подобный полученный и исследованный бициклический фрагмент сахаров имеет мостик,проходящий от 3'-гидроксильной группы через одну метиленовую группу к 4'-атому углерода кольца сахара с образованием 3'-С,4'-С-оксиметиленовой связи (см. патент США 6043060). Определение конформации LNA методом двухмерной ЯМР-спектроскопии показало, что сцепленная ориентация LNA-нуклеотидов как в одноцепочечных LNA, так и в дуплексах, накладывает на фосфатный скелет такие ограничения, что он имеет большую популяцию конформации N-типа (Petersen etal., J. Mol. Recognit., 2000, 13, 44-53). Эти конформации ассоциированы с улучшенной упаковкой оснований нуклеиновых кислот (Wengel et al., Nucleosides Nucleotides, 1999, 18, 1365-1370). Было показано, что LNA образуют очень стабильные LNA:LNA дуплексы (Koshkin et al., J. Am.Chem. Soc, 1998, 120, 13252-13253). Было продемонстрировано, что LNA:LNA гибридизация является наиболее термически стабильным типом дуплексных систем нуклеиновых кислот, и РНК-имитирующий характер LNA был установлен на дуплексном уровне. Введение 3 мономеров LNA (T или А) значительно повышает температуры плавления (Tm=+15/+11) с комплементами ДНК. Универсальность LNAопосредуемой гибридизации подтверждается образованием очень стабильных дуплексов LNA:LNA. РНК-имитирующий характер LNA сохраняется в отношении конформационных ограничений мономеровN-типа и вторичной структуры дуплекса LNA:PHK.LNA также образуют дуплексы с комплементарными ДНК, РНК или LNA, обладающие высоким термическим сродством. Спектры кругового дихроизма (CD) показывают, что дуплексы, содержащие полностью модифицированные LNA (особенно LNA:PHK), структурно напоминают А-форму РНК:РНК дуплекса. Исследования LNA:ДНК дуплекса методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) подтвердили 3'-эндоконформацию мономера LNA. Было также продемонстрировано распознавание двухцепочечной ДНК, что позволяет предположить проникновение LNA в цепь. Исследования неспаренных последовательностей показали, что LNA подчиняются правилам спаривания оснований Уотсона-Крика, имея,как правило, повышенную селективность по сравнению с соответствующими немодифицированными эталонными цепями. Было показано, что химеры ДНК:LNA эффективно ингибируют генную экспрессию при нацеливании на различные области (5'-нетранслируемая область, область старт-кодона или кодирующая область) мРНК люциферазы (Braasch et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30, 5160-5167). Были описаны сильнодействующие и нетоксичные антисмысловые олигонуклеотиды, содержащиеLNA (Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638). Авторы продемонстрировали,что LNA придают антисмысловым агентам несколько желаемых свойств. Сополимеры LNA/ДНК не были подвержены легкой деградации в сыворотке крови и клеточных экстрактах. Сополимеры LNA/ДНК проявляли сильную антисмысловую активность в аналитических системах различного характера, таких как G-белок-сопряженный сигнальный рецептор в мозге живой крысы и детектирование репортерных генов Escherichia coli. Была также осуществлена липофектин-опосредуемая эффективная доставка LNA в живые клетки рака молочной железы человека. Другие успешные in vivo исследования LNA показали отключение дельта-опиоидных рецепторов крысы без проявлений токсичности (Wahlestedt et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 5633-5638), и еще одни исследования показали блокаду трансляции большой субъединицы РНК полимеразы II (Fluiter et al., Nucleic Acids Res., 2003, 31, 953-962). Были описаны синтез и получение LNA-мономеров аденина, цитозина, гуанина, 5-метилцитозина,тимина и урацила, а также их олигомеризация и способность к распознаванию нуклеиновых кислот(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). LNA и их препараты также описаны в WO 98/39352 иWO 99/14226. Были также получены первые аналоги LNA - фосфоротиоат-LNA и 2'-ацетат-LNA (Kumar et al.,Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Был также описан синтез аналогов сцепленных нуклеозидов, содержащих олигодезоксирибонуклеотидные дуплексы, в качестве субстратов для полимераз нуклеиновой кислоты (Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, в данной области был описан синтез 2'амино-LNA, нового конформационно ограниченного олигонуклеотидного аналога с высоким сродством(Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, ранее были описаны синтез 2'-амино- и 2'метиламино-LNA и термическая стабильность их дуплексов с комплементарными РНК- и ДНК-цепями. Другим полученным и исследованным олигонуклеотидным миметиком, применимым согласно настоящему изобретению, является треозануклеиновая кислота. Этот олигонуклеотидный миметик основан на нуклеозидах треозы вместо нуклеозидов рибозы. Начальный интерес к (3',2')L-треозануклеиновой кислоте (TNA) был направлен на выяснение вопроса о существовании ДНК-полимеразы, способной копировать TNA. Было обнаружено, что некоторые ДНК-полимеразы способны копировать ограниченные участки матрицы TNA (сообщение в CEN/January 13, 2003). В других исследованиях было определено,что TNA способны к антипараллельному спариванию оснований по Уотсону-Крику с комплементарными олигонуклеотидами ДНК, РНК и TNA (Chaput et al., J. Am. Chem. Soc, 2003, 125, 856-857). В одном из исследований была синтезирована (3',2')L-треозануклеиновая кислота и проведено ее сравнение с 2' - и 3'-амидатными аналогами (Wu et al., Organic Letters, 2002, 4(8), 1279-1282). Было показано, что амидатные аналоги связываются с РНК и ДНК, имеющими длину, сопоставимую с РНК/ДНК. Другие полученные олигонуклеотидные миметики включают в себя бициклические и трициклические нуклеозидные аналоги (см. Steffens et al., Helv. Chim. Acta, 1997, 80, 2426-2439; Steffens et al., J. Am.al., Nucleic Acids Res., 2002, 30, 2751-2757). Эти модифицированные нуклеозидные аналоги были олигомеризованы фосфорамидитным методом, и полученные олигомерные соединения, содержащие трициклические нуклеозидные аналоги, обладали повышенной термической стабильностью (Tm) при гибридизации с ДНК, РНК и сами с собой. Было показано, что олигомерные соединения, содержащие бицикли- 17009670 ческие нуклеозидные аналоги, обладают термической стабильностью, близкой к ДНК дуплексам. Другой класс олигонуклеотидных миметиков, называемых фосфономоноэфирами нуклеиновых кислот, содержит в скелете фосфорную группу. Сообщается, что этот класс олигонуклеотидных миметиков обладает полезными физическими, биологическими и фармакологическими свойствами в области ингибирования генной экспрессии (антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, смысловые олигонуклеотиды и триплексобразующие олигонуклеотиды), в качестве проб для детектирования нуклеиновых кислот и в качестве вспомогательных средств для использования в молекулярной биологии. Были получены другие олигонуклеотидные миметики, применимые согласно настоящему изобретению, в которых нативное фуранозильное кольцо заменено циклобутильным кольцом. Олигомерные соединения могут также содержать один или несколько замещенных фрагментов сахаров. Пригодные соединения могут включать в себя в 2'-положении одно из следующего: ОН; F; O-, Sили N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; или О-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенным или незамещенным C1-С 10 алкилом или С 2-С 10 алкенилом и -алкинилом. Особенно пригодными являются ОСН 2)nO)mCH3, О(СН 2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3,O(CH2)nONH2 и О(СН 2)nONСН 2)nCH3)2, где n и m имеют значения от 1 примерно до 10. Другие олигонуклеотиды включают в себя в 2'-положении одно из следующего: C1-С 10 низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br,CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие подобными свойствами. Одна из модификаций включает в себя 2'-метоксиэтоксигруппу (2'-O-СН 2 СН 2 ОСН 3,известный также как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504),т.е. алкоксиалкоксигруппу. Другие модификации включают в себя 2'-диметиламинооксиэтоксигруппу,т.е. группу О(СН 2)2ON(CH3)2, известную также как 2'-DMAOE, как описано в приведенных ниже примерах, и 2'-диметиламиноэтоксиэтоксигруппу (также известную в данной области как 2'-Одиметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е. 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2, также описанную в приведенных ниже примерах. Другие модификации включают в себя 2'-метоксигруппу (2'-O-СН 3), 2'-аминопропоксигруппу (2'OCH2CH2CH2NH2), 2'-аллил (2'-СН 2-СН=СН 2), 2'-O-аллил (2'-О-СН 2-СН=СН 2) и 2'-фтор (2'-F). Модификации в 2'-положении могут находиться в арабино (вверх) положении или рибо (вниз) положении. Одной из 2'-арабиномодификаций является 2'-F. Аналогичные модификации могут быть также произведены в других положениях олигонуклеотида, особенно, 3'-положении сахара 3'-конечного нуклеотида или 2'-5'связанных олигонуклеотидов и 5'-положении 5'-конечного нуклеотида. Антисмысловые соединения могут также содержать миметики сахаров, такие как циклобутильные фрагменты вместо пентофуранозильного сахара. Конкретные патенты США, описывающие получение таких структур с модифицированными сахарами, включают в себя, но без ограничения,4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; 5792747 и 5700920, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки. В одном аспекте настоящего изобретения олигомерные соединения включают в себя нуклеозиды,синтетически модифицированные для индуцирования 3'-эндоконформации сахара. Нуклеозид может включать в себя синтетические модификации гетероциклического основания, фрагмента сахара или оба варианта для индуцирования желательной 3'-эндоконформации сахара. Эти модифицированные нуклеозиды используются для имитации РНК-подобных нуклеозидов, чтобы можно было улучшить определенные свойства олигомерного соединения при сохранении желательной 3'-эндоконформационной геометрии. Существует очевидное предпочтение по отношению к дуплексу РНК-типа (А-форма спирали, преимущественно 3'-эндо) как необходимого условия (например, триггера) РНК-интерференции, которое частично подтверждается тем, что дуплексы, состоящие из 2'-дезокси-2'-F-нуклеозидов, по-видимому,эффективно запускают PHKi-ответ в системе С. elegans. Свойства, улучшающиеся при использовании более стабильных 3'-эндонуклеозидов, включают в себя, но без ограничения: модулирование фармакокинетических свойств посредством модификации связывания белка, скорости диссоциации белка, поглощения и выведения; модулирование стабильности к действию нуклеаз, а также химической стабильности; модулирование сродства связывания и специфичности олигомера (сродство и специфичность к ферментам, а также к комплементарным последовательностям); и увеличение эффективности расщепления РНК. Настоящее изобретение предусматривает олигомерные триггеры PHKi, содержащие один или несколько нуклеозидов, модифицированных таким образом, чтобы способствовать образованию конформации типа С 3'-эндо. Конформация нуклеозида зависит от различных факторов, включая замещение в 2'-, 3'- или 4'положениях пентофуранозильного сахара. Электроотрицательные заместители, как правило, предпочитают осевые положения, тогда как заместители со стерическими требованиями обычно предпочитают экваториальные положения (Principles of Nucleic Acid Structure, Wolfgang Sanger, 1984, Springer-Verlag).- 18009670 Модификация 2'-положения в пользу 3'-эндоконформации может быть достигнута путем сохранения 2'ОН в качестве элемента распознавания, как показано на фиг. 2, ниже (Gallo et al., Tetrahedron, 2001, 57,5707-5713. Harry-O'kuru et al., J. Org. Chem., 1997, 62(6), 1754-1759 и Tang et al., J. Org. Chem., 1999, 64,747-754). Альтернативно, предпочтительный характер 3'-эндоконформации может быть достигнут путем удаления 2'-ОН, как видно на примере 2'-дезокси-2'-F-нуклеозидов (Kawasaki et al., J. Med. Chem., 1993, 36,831-841), которые принимают 3'-эндоконформацию с расположением электроотрицательного атома фтора в осевом положении. Другие модификации кольца рибозы, например, замещение в 4'-положении с образованием 4'-F модифицированных нуклеозидов (Guillerm et al., Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters, 1995, 5, 1455-1460; и Owen et al., J. Org. Chem., 1976, 41, 3010-3017) или, например, модификация с целью получения метанокарбонуклеозидных аналогов (Jacobson et al., J. Med. Chem. Lett., 2000, 43,2196-2203; и Lee et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2001, 11, 1333-1337), также индуцируют предпочтение к 3'-эндоконформации. С использованием аналогичного подхода могут быть созданы олигомерные триггеры PHKi-ответа, состоящие из одного или нескольких нуклеозидов, модифицированных таким образом, чтобы конформация была зафиксирована в конформации типа С 3'-эндо, т.е. сцепленной нуклеиновой кислоты (LNA, Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456), и нуклеиновой кислоты с этиленовым мостиком (ENA, Morita et al., BioorganicMedicinal Chemistry Letters, 2002, 12, 73-76). Конформация модифицированных нуклеозидов и их олигомеров может быть оценена различными способами, такими как молекулярно-динамические вычисления, спектроскопия ядерного магнитного резонанса и измерения методом CD. Поэтому, для использования в модифицированных олигонуклеотидах согласно настоящему изобретению выбирают модификации, прогнозируемо индуцирующие РНКподобные конформации, геометрию дуплекса А-формы в олигомерном контексте. Синтез многочисленных модифицированных нуклеозидов, пригодных для использования согласно настоящему изобретению,известен в данной области (см., например, Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Vol 1-3, ed. Leroy B.Townsend, 1988, Plenum press, и раздел примеров ниже). Терминами, используемыми для описания конформационной геометрии гомодуплексных нуклеиновых кислот, являются "А-форма" для РНК и "В-форма" для ДНК. Соответствующая конформационная геометрия для РНК и ДНК дуплексов была определена рентгеноструктурным анализом волокон нуклеиновых кислот (Arnott and Hukins, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1970, 47, 1504). В общем, дуплексы РНК:РНК являются более стабильными и имеют более высокие температуры плавления (Tm), чем ДНК:ДНК дуплексы (Sanger et al., Principles of Nucleic Acid Structure, 1984, Springer-Verlag; New York,NY.; Lesnik et al., Biochemistry, 1995, 34, 10807-10815; Conte et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25, 26272634). Повышенная стабильность РНК объяснялась несколькими структурными характеристиками, в первую очередь улучшенными межплоскостными взаимодействиями оснований, вызванными геометрией А-формы (Searle et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2051-2056). Присутствие 2'-гидроксила в РНК смещает сахар в направлении к С 3'-эндоизлому плоскости углеводного кольца, также называемому нозерн-изломом (Northern pucker), что создает для дуплекса предпочтение к геометрии А-формы. Кроме того, 2'-гидроксильные группы РНК могут образовывать сетку опосредованных водой водородных связей, которая помогает стабилизировать РНК-дуплекс (Egli et al., Biochemistry, 1996, 35, 8489-8494). С другой стороны, для дезоксинуклеиновых кислот предпочтительным является С 2'-эндоизлом плоскости углеводного кольца, т.е. известный также как саузерн-излом (Southern pucker), который, как считается,создает менее стабильную геометрию В-формы (Sanger, W. (1984) Principles of Nucleic Acid Structure,Springer-Verlag, New York, NY). В используемом в настоящем описании значении геометрия В-формы включает в себя как С 2'-эндоизлом, так и O4'-эндоизлом. Это согласуется с представлениями Berger, et.al., Nucleic Acids Research, 1998, 26, 2473-2480, которые указали на то, что при рассмотрении фуранозных конформаций, вызывающих образование В-формы дуплексов, необходимо также учитывать вклад 04'-эндоизлома. Гибридные дуплексы ДНК:РНК, однако, являются обычно менее стабильными, чем чистые РНК:РНК-дуплексы и, в зависимости от их последовательностей, могут быть более или менее стабильны,чем ДНК:ДНК-дуплексы (Searle et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2051-2056). Структура гибридного дуплекса является промежуточной между геометриями А- и В-формы, что может приводить к слабому межплоскостному взаимодействию при укладке цепей (Lane et al., Eur. J. Biochem., 1993, 215, 297-306;al., J. Mol. Biol., 1996, 264, 521-533). Стабильность дуплекса, образованного РНК-мишенью и синтетической последовательностью, имеет первоочередное значение для терапевтического применения, такого как, но без ограничения, антисмысловой механизм и РНК-интерференция, поскольку эти механизмы требуют связывания цепи синтетического олигомера с цепью РНК-мишени. В случае антисмыслового действия эффективное ингибирование мРНК требует, чтобы антисмысловая ДНК имела очень высокое сродство связывания с мРНК. В противном случае желаемое взаимодействие между синтетической олигомерной цепью и цепью мРНК-мишени будет происходить редко, приводя к снижению эффективности. Одним обычно используемым способом модификации излома плоскости углеводного кольца является замещение сахара в 2'-положении на группу заместителя, влияющую на геометрию сахара. Влияние- 19009670 на конформацию кольца зависит от природы заместителя в 2'-положении. Было исследовано большое количество различных заместителей для определения их влияния на излом плоскости углеводного кольца. Например, исследования 2'-галогенов показали, что 2'-фтор замещение дает наибольшую популяцию(65%) С 3'-эндоформы, а 2'-йод - наименьшую популяцию (7%). Популяции для аденозина (2'-ОН) по сравнению с дезоксиаденозином (2'-Н) составляют 36% и 19%, соответственно. Кроме того, эффект 2'фтор группы димеров аденозина 2'-дезокси-2'-фтораденозин)-(2'-дезокси-2'-фтораденозин также коррелирует со стабилизацией многослойной конформации. Как ожидалось, относительная стабильность дуплекса может быть повышена путем замещения 2'ОН группы 2'-F группой, с увеличением при этом С 3'-эндопопуляции. Предполагается, что высокополярный характер 2'-F связи и очень высокая степень предпочтения С 3'-эндоизлома плоскости углеводного кольца могут стабилизировать многослойную конформацию в дуплексе А-формы. Данные УФ гипохромности, кругового дихроизма и 1 Н ЯМР также указывают на то, что коэффициент упаковки уменьшается с уменьшением электроотрицательности галоидного заместителя. Кроме того, пространственная конфигурация в 2'-положении фрагмента сахара лучше вписывается в дуплекс А-формы, чем в дуплекс В-формы. Таким образом, считается, что 2'-заместитель на 3'-конце динуклеозидмонофосфата проявляет ряд эффектов, влияющих на конформацию упаковки: стерическое отталкивание, предпочтительный излом плоскости углеводного кольца фуранозы, электростатическое отталкивание, гидрофобное взаимодействие и способность к образованию водородных связей. Считается, что эти эффекты заместителя определяются молекулярными размерами, электроотрицательностью и гидрофобностью заместителя. Температуры плавления комплементарных цепей также возрастают для 2'-замещенных аденозиндифосфатов. Неизвестно, что именно является причиной увеличения связывания - предпочтительность 3'-эндоконформации или присутствие заместителя. Однако при 3'-эндоконформации может достигаться большая степень перекрывания прилегающих оснований (межплоскостные взаимодействия). Увеличение процентной доли С 3'-эндосахаров в модифицированных олигонуклеотидах, нацеленных на цепь РНК-мишени, должно вызывать предварительную организацию этой цепи для связывания с РНК. Из нескольких модификаций сахаров, изученных и описанных в литературе, включение электроотрицательных заместителей, таких как 2'-фтор или 2'-алкоксигруппа, смещает конформацию сахара в сторону конформации 3'-эндоизлома (нозерн) плоскости углеводного кольца. Это приводит к предварительной организации олигонуклеотида, имеющего такие модификации, с образованием конформационной геометрии А-формы. Такая А-форма конформации приводит к увеличению сродства связывания олигонуклеотида с цепью РНК-мишени. Конкретные группы 2'-заместителей, применимые в настоящем изобретении и придающие образующимся дуплексам конформационные свойства А-формы (3'-эндо), включают в себя группы заместителей 2'-O-алкил, 2'-O-замещенный алкил и 2'-фтор. Пригодными группами заместителей являются различные алкильные и арильные простые эфиры и тиоэфиры, амины и моноалкил- и диалкилзамещенные амины. Далее предполагается, что могут быть произведены многочисленные модификации одного или нескольких олигомерных соединений согласно изобретению в многочисленных сайтах одной или нескольких мономерных субъединиц (пригодными примерами являются нуклеозиды) и/или межнуклеозидных связях, с целью улучшения свойств, таких как, но без ограничения, активность по выбранному назначению. Природные и модифицированные основания нуклеиновых кислот. Олигомерные соединения могут также включать в себя модификации или замещения основания нуклеиновой кислоты (которое часто называется в данной области гетероциклическим основанием или просто "основанием"). В используемом в настоящем описании значении, "немодифицированные" или"природные" основания нуклеиновых кислот включают в себя пуриновые основания аденин (А) и гуанин(G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные основания нуклеиновых кислот включают в себя другие синтетические и природные основания нуклеиновых кислот, такие как 5-метилцитозин (5-me-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2 аминоаденин, 6-метильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоидурацил и цитозин, 5-пропинил- (-СС-СН 3) урацил и -цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил- (псевдоурацил), 4-тиоурацил-, 8-галоид-, 8 амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и -гуанины, 5-галоид-, особенно, 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и -цитозины, 7-метилгуанин и 7 метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, и 3 деазагуанин и 3-деазааденин. Другие модифицированные основания нуклеиновых кислот включают в себя трициклические пиримидины, такие как феноксазинцитидин (1 Н-пиримидо(5,4-b)(1,4)бензоксазин 2(3 Н)-он), фенотиазинцитидин (1 Н-пиримидо(5,4-b)(1,4)бензотиазин-2(3 Н)-он), G-клэмпы (G-clamps),такие как замещенный феноксазинцитидин(Н-пиридо(3',2':4,5)пирроло(2,3-d)пиримидин-2-он). Модифицированные основания нуклеиновых кислот могут также включать в себя такие, в которых пуриновое или пиримидиновое основание замещено на- 20009670 другие гетероциклы, например, 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Дополнительные основания нуклеиновых кислот включают в себя раскрытые в патенте США 3687808, раскрытые в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed.Lebleu, В., ed., CRC Press, 1993. Некоторые из этих оснований нуклеиновых кислот являются особенно пригодными для увеличения сродства связывания соединений согласно изобретению. Они включают в себя 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, включая 2 аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что 5-метилцитозиновые замещения увеличивают стабильность дуплексов нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2 С и являются в настоящее время пригодными замещениями оснований, особенно в комбинации с 2'-O-метоксиэтильными модификациями сахаров. Конкретные патенты США, описывающие получение некоторых из указанных выше модифицированных оснований нуклеиновых кислот, а также других модифицированных оснований нуклеиновых кислот, включают в себя, но без ограничения, вышеупомянутый патент США 3687808, а также патенты США 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121 5596091; 5614617; 5645985; 5830653; 5763588; 6005096 и 5681941,каждый из которых включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки, и патент США 5750692, который включен в данное описание посредством ссылки. Олигомерные соединения согласно настоящему изобретению могут также включать в себя полициклические гетероциклические соединения вместо одного или нескольких фрагментов гетероциклических оснований. Ранее был описан ряд трициклических гетероциклических соединений. Эти соединения обычно используются по антисмысловому назначению для увеличения способности к связыванию модифицированной цепи с цепью-мишенью. Наиболее изученные модификации нацелены на гуанозины, которые поэтому называются G-клэмпами (G-clamps) или цитидиновыми аналогами. Типичные цитозиновые аналоги, которые образуют 3 водородные связи с гуанозином второй цепи, включают в себя 1,3 диазафеноксазин-2-он (R10=O, R11-R14=H) (Kurchavov et al., Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 18371846), 1,3-диазафенотиазин-2-он (R10=S, R11-R14=H), (Lin et al., J. Am. Chem. Soc, 1995, 117, 3873-3874) и 6,7,8, 9-тетрафтор-1,3-диазафеноксазин-2-он (R10=O, R11-R14=F) (Wang et al., Tetrahedron Lett., 1998, 39,8385-8388). Было показано, что при включении в олигонуклеотиды эти модификации оснований гибридизуются с комплементарным гуанином, и что последний также гибридизуется с аденином, повышая термическую стабильность спирали за счет усиления межплоскостных взаимодействий при укладке (см. также патент под названием "Модифицированные пептидные нуклеиновые кислоты", выданный 24 мая 2002 г.,10/155920; и патент США под названием "Нуклеаза-устойчивые химерные олигонуклеотиды",выданный 24 мая 2002 г.,10/013295, каждый из которых включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки). Дополнительные стабилизирующие спираль свойства наблюдались в тех случаях, когда цитозиновый аналог/заменитель имеет аминоэтоксидный фрагмент, присоединенный к жесткому 1,3 диазафеноксазин-2-оновому каркасу (R10=O, R11=-O-(CH2)2-NH2, R12-14=H) (Lin et al., J. Am. Chem. Soc,1998, 120, 8531-8532). Исследования связывания продемонстрировали, что единичное включение может усилить сродство связывания модельного олигонуклеотида с его комплементарной ДНК-мишенью или РНК с величиной Tm до 18 по сравнению с 5-метилцитозином (dC5me), что является наибольшим известным на настоящее время увеличением сродства для единичной модификации. С другой стороны,увеличение стабильности спирали не ухудшает специфичность олигонуклеотидов. Другие трициклические гетероциклические соединения и способы их применения, пригодные для использования в настоящем изобретении, раскрыты в патенте США 6028183, выданном 22 мая 2000 г.,и патенте США 6007992, выданном 28 декабря 1999 г., содержание которых полностью включено в данное описание посредством ссылки. Повышенное сродство связывания феноксазиновых производных наряду с их неизменной специфичностью по отношению к последовательностям делает их ценными аналогами оснований нуклеиновой кислоты для разработки более сильнодействующих лекарственных средств на основе антисмысловых соединений. Действительно, многообещающие данные были получены в in vitro экспериментах, демонстрирующих, что гептануклеотиды, содержащие феноксазиновые замещения, способны активировать РНКазу Н, увеличивают клеточное поглощение и проявляют повышенную антисмысловую активность(Lin et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 8531-8532). Усиление активности было еще более выраженным в случае G-клэмпа, для которого было показано, что единичное замещение значительно увеличивает inAcad. Sci. USA, 1999, 96, 3513-3518). Тем не менее, для оптимизации структуры олигонуклеотидов и лучшего понимания влияния этих гетероциклических модификаций на биологическую активность, важно оценить их эффект на нуклеазную стабильность олигомеров. Другие модифицированные полициклические гетероциклические соединения, пригодные для использования в качестве гетероциклического основания, раскрыты, но без ограничения, в вышеуказанном- 21009670 патенте США 3687808, а также патентах США 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5434257; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121 5596091; 5614617; 5645985; 5646269; 5750692; 5830653; 5763588; 6005096 и 5681941, и в патентной заявке США 09/996292, поданной 28 ноября 2001 г., каждый из которых включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Конъюгаты. Другая модификация антисмысловых соединений согласно изобретению включает в себя химическое связывание с олигомерным соединением одного или нескольких фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение олигонуклеотида. Эти фрагменты или конъюгаты могут включать в себя конъюгированные группы, ковалентно связанные с функциональными группами, такими как первичные или вторичные гидроксильные группы. Конъюгированные группы согласно изобретению включают в себя интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, простые полиэфиры, группы, улучшающие фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, улучшающие фармакокинетические свойства олигомеров. Типичные конъюгированные группы включают в себя холестерины, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин,фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. Группы,усиливающие фармакодинамические свойства, в контексте настоящего изобретения включают в себя группы, улучшающие поглощение, повышающие сопротивление деградации и/или усиливающие последовательность-специфическую гибридизацию с нуклеиновой кислотой-мишенью. Группы, улучшающие фармакокинетические свойства, в контексте настоящего изобретения включают в себя группы, улучшающие поглощение, распределение, метаболизм или выведение соединений согласно настоящему изобретению. Типичные конъюгированные группы раскрыты в международной патентной заявкеPCT/US92/09196, поданной 23 октября 1992 г., и патенте США 6287860, содержание которых целиком включено в данное описание посредством ссылки. Фрагменты конъюгатов включают в себя, но без ограничения, липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент, холевая кислота, тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол, тиохолестерин, алифатическая цепь, например, додекандиольный или ундецильный остатки, фосфолипид, например, дигексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний-1,2-ди-Огексадецил-rac-глицеро-3-Н-фосфонат, полиаминная или полиэтиленгликольная цепь или адамантануксусная кислота, пальмитильный фрагмент или октадециламин или гексиламинокарбонилоксихолестериновый фрагмент. Антисмысловые соединения согласно изобретению могут также быть конъюгированы с активными лекарственными веществами, например, аспирином, варфарином, фенилбутазоном, ибупрофеном, супрофеном, фенбуфеном, кетопрофеном, (S)-(+)-пранопрофеном, карпрофеном, дансилсаркозином, 2,3,5-трийодбензойной кислотой, флуфенамовой кислотой, фолиновой кислотой, бензотиадиазидом,хлортиазидом, диазепином, индометицином, барбитуратом, цефалоспорином, сульфамидным препаратом, антидиабетическим средством, антибактериальным средством или антибиотиком. Конъюгаты олигонуклеотид-лекарственное вещество и их получение описаны в патентной заявке США 09/334130 (подана 15 июня 1999 г.), которая включена в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Конкретные патенты США, которые описывают получение таких олигонуклеотидных конъюгатов,включают в себя, но без ограничения,4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241 5391723; 5416203 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Олигомерные соединения могут также быть модифицированы для введения одной или нескольких стабилизирующих групп, которые обычно присоединены к одному или обоим концам олигомерной цепи для улучшения свойств, таких как, например, устойчивость к действию нуклеаз. Стабилизирующие группы включают в себя кэп-структуры. Под "кэп-структурой или концевым кэп-фрагментом" подразумеваются химические модификации, включенные на любом конце олигонуклеотидов (см. например,Wincott et al., WO 97/26270, включенный в данное описание посредством ссылки). Эти концевые модификации защищают олигомерные соединения, имеющие концевые молекулы нуклеиновой кислоты, от разрушения экзонуклеазами, и могут способствовать доставке и/или локализации в клетке. Кэп может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп) или на обоих концах единичной цепи или на одном или нескольких концах обеих цепей двухцепочечного соединения. Эту кэп-структуру не следует путать с обращенным метилгуанозиновым "5'-кэпом", присутствующим на 5'-конце нативных молекул мРНК. В неорганичивающих примерах 5'-кэп включает в себя обращенный остаток (фрагмент) неосновного характера, 4',5'-метиленнуклеотид; 1-(бета-D-эритрофуранозил)нуклеотид, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид; 1,5-ангидрогексилнуклеотид; L-нуклеотиды; альфа-нуклеотиды; нуклеотид с модифицированными основаниями; фосфородитиоатные связи; треопентофуранозилнуклеотид; ациклический 3',4'-секонуклеотид; ациклический 3,4-дигидроксибутилнуклеотид; ациклический 3,5 дигидроксипентилнуклеотид, 3'-3'-обращенный нуклеотидный фрагмент; 3'-3'-обращенный фрагмент- 22009670 неосновного характера; 3'-2'-обращенный нуклеотидный фрагмент; 3'-2'-обращенный фрагмент неосновного характера; 1,4-бутандиолфосфат; 3'-фосфорамидат; гексилфосфат; аминогексилфосфат; 3'-фосфат; 3'-фосфоротиоат; фосфородитиоат; или мостиковый или немостиковый метилфосфонатный фрагмент(детальнее см. Wincott et al., международная публикация РСТWO 97/26270, включенная в данное описание посредством ссылки). Для siPHK-конструкций, 5'-конец (5'-кэп) является обычно, но без ограничения, 5'-гидроксилом или 5'-фосфатом. Особенно пригодные 3'-кэп-структуры включают в себя, например, 4',5'-метиленнуклеотид; 1-(бетаD-эритрофуранозил)нуклеотид; 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид; 5'-аминоалкилфосфат; 1,3-диамино-2-пропилфосфат, 3-аминопропилфосфат; 6-аминогексилфосфат; 1,2-аминододецилфосфат; гидроксипропилфосфат; 1,5-ангидрогексилнуклеотид; L-нуклеотид; альфа-нуклеотид; нуклеотид с модифицированными основаниями; фосфородитиоат; треопентофуранозилнуклеотид; ациклический 3',4'секонуклеотид; 3,4-дигидроксибутилнуклеотид; 3,5-дигидроксипентилнуклеотид, 5'-5'-обращенный нуклеотидный фрагмент; 5'-5'-обращенный фрагмент неосновного характера; 5'-фосфорамидат; 5'фосфоротиоат; 1,4-бутандиолфосфат; 5'-амино; мостиковый и/или немостиковый 5'-фосфорамидат, фосфоротиоат и/или фосфородитиоат, мостиковый или немостиковый метилфосфонат и 5'меркаптофрагменты (детальнее см. Beaucage and Tyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925; включенную в данное описание посредством ссылки). Другие 3'- и 5'-стабилизирующие группы, которые могут быть использованы в качестве кэпструктур на одном или обоих концах олигомерного соединения для придания устойчивости к действию нуклеаз, включают в себя раскрытые в WO 03/004602, опубликованном 16 января 2003 г. Химерные соединения. Нет необходимости в том, чтобы все положения в данном антисмысловом соединении были одинаково модифицированы, и в действительности несколько вышеупомянутых модификаций могут быть включены в одно соединение или даже в один нуклеозид антисмыслового соединения. Настоящее изобретение также включает в себя антисмысловые соединения, представляющие собой химерные соединения."Химерные" антисмысловые соединения или "химеры", в контексте настоящего изобретения означают одно- или двухцепочечные антисмысловые соединения, такие как олигонуклеотиды, которые содержат две или более химически различных областей, каждая из которых состоит по меньшей мере из одного мономерного звена, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Химерные антисмысловые олигонуклеотиды являются одной из форм антисмыслового соединения. Эти олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере одну область, модифицированную таким образом, чтобы придать олигонуклеотиду повышенную устойчивость к разрушению под действием нуклеазы, повышенное клеточное поглощение, изменение заряда, повышенную стабильность и/или повышенное сродство связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Дополнительная область олигонуклеотида может служить субстратом для РНКазы или других ферментов. В качестве примера, РНКаза Н представляет собой клеточную эндонкулеазу, которая расщепляет цепь РНК дуплекса РНК:ДНК. Активация РНКазы Н, таким образом, приводит к расщеплению РНКмишенью, тем самым значительно повышая эффективность олигонуклеотид-опосредованного ингибирования генной экспрессии. Расщепление РНК:РНК гибридов, аналогичным образом, может быть осуществлено под действием эндорибонуклеаз, таких как РНКаза III или РНКаза L, которые расщепляют как клеточные, так и вирусные РНК. Продукты расщепления РНК-мишени могут быть определены обычными методами гель-электрофореза и, при необходимости, ассоциированными методами гибридизации нуклеиновых кислот, известными в данной области. Химерные антисмысловые соединения согласно изобретению могут быть получены в виде составных структур, включающих два или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотида, олигонуклеозида и/или олигонуклеотидных миметика, как описано выше. Такие соединения также называются в данной области гибридами или гэпмерами. Конкретные патенты США, описывающие получение таких гибридных структур, включают в себя, но без ограничения,5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356 и 5700922, каждый из которых включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Соли, пролекарства и биоэквиваленты. Антисмысловые соединения согласно изобретению охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких эфиров или любые другие соединения, которые при введении животному, включая человека, способны приводить к образованию (прямо или косвенно) его биологически активного метаболита или остатка. Соответственно, например, описание также распространяется на пролекарства и фармацевтически приемлемые соли соединений согласно изобретению, фармацевтически приемлемые соли таких пролекарств и другие биоэквиваленты. Термин "пролекарство" означает терапевтический агент, полученный в неактивной или менее активной форме, которая превращается в активную форму (т.е. лекарственное средство) внутри организма или в его клетках под действием эндогенных ферментов или другие химических агентов и/или условий. В частности, варианты пролекарств олигонуклеотидов согласно изобретению получают в виде SATE(производных (S-ацетил-2-тиоэтил)фосфата) с использованием методов, раскрытых в WO 93/24510, на имя Gosselin et al., опубликованном 9 декабря 1993 г., или в WO 94/26764, на имя Irabach et al. Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений согласно изобретению, т.е. солям, сохраняющим желаемую биологическую активность исходного соединения и не обладающим нежелательными токсикологическими эффектами. Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания образуются с металлами или аминами, такими как щелочные и щелочно-земельные металлы или органические амины. Примерами металлов,используемых в качестве катионов, являются натрий, калий, магний, кальций и т.п. Примерами пригодных аминов являются N,N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, дициклогексиламин, этилендиамин, N-метилглюкамин и прокаин (см., например, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J.of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19). Соли присоединения основания указанных кислотных соединений получают путем введения в контакт свободной кислотной формы с достаточным количеством требуемого основания с получением соли обычным способом. Свободная кислотная форма может быть регенерирована путем контакта солевой формы с кислотой и выделения свободной кислоты обычным образом. Формы свободной кислоты несколько отличаются от их соответствующих солевых форм по некоторым физическим свойствам, таким как растворимость в полярных растворителях, но в других отношениях соли являются эквивалентными их соответствующим свободным кислотам в целях настоящего изобретения. В используемом в настоящем описании значении "фармацевтическая соль присоединения" включает в себя фармацевтически приемлемую соль кислотной формы одного из компонентов композиции согласно изобретению. Они включают в себя соли аминов с органической или неорганической кислотой. Кислые соли представляют собой гидрохлориды, ацетаты, салицилаты, нитраты и фосфаты. Другие пригодные фармацевтически приемлемые соли хорошо известны специалистам в данной области и включают в себя соли соединений основного характера с различными неорганическими и органическими кислотами,такими как, например, неорганические кислоты, такие как, например, хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота или фосфорная кислота; с органическими карбоновыми, сульфоновыми, сульфо- или фосфокислотами или N-замещенными сульфаминовыми кислотами, например,уксусной кислотой, пропионовой кислотой, гликолевой кислотой, янтарной кислотой, малеиновой кислотой, оксималеиновой кислотой, метилмалеиновой кислотой, фумаровой кислотой, яблочной кислотой, винной кислотой, молочной кислотой, щавелевой кислотой, глюконовой кислотой, глюкаровой кислотой, глюкуроновой кислотой, лимонной кислотой, бензойной кислотой, коричной кислотой, миндальной кислотой, салициловой кислотой, 4-аминосалициловой кислотой, 2-феноксибензойной кислотой, 2 ацетоксибензойной кислотой, 4,4'-метилен-бис-3-окси-2-нафтойной кислотой (embonic acid), никотиновой кислотой или изоникотиновой кислотой; и с аминокислотами, такими как 20 альфа-аминокислоты,принимающие участие в образовании белков в природе, например, глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, а также с фенилуксусной кислотой, метансульфоновой кислотой, этансульфоновой кислотой, 2-оксиэтансульфоновой кислотой, этан-1,2-дисульфоновой кислотой, бензолсульфоновой кислотой,4-метилбензолсульфокислотой, нафталин-2-сульфоновой кислотой, нафталин-1,5-дисульфоновой кислотой, 2- или 3-фосфоглицератом, глюкоза-6-фосфатом, N-циклогексилсульфаминовой кислотой (с образованием цикламатов) или с другими кислотными органическими соединениями, такими как аскорбиновая кислота. Фармацевтически приемлемые соли соединений могут также быть получены с фармацевтически приемлемым катионом. Пригодные фармацевтически приемлемые катионы хорошо известны специалистам в данной области и включают в себя щелочные, щелочно-земельные, аммониевые и четвертичные аммониевые катионы. Возможны также карбонаты или гидрокарбонаты. Для олигонуклеотидов примеры фармацевтически приемлемых солей включают в себя, но без ограничения, (а) соли, образованные с катионами, такими как натрий, калий, аммоний, магний, кальций, полиамины, такие как спермин и спермидин и т.д.; (b) соли присоединения кислоты, образованные с неорганическими кислотами, например, хлористо-водородной кислотой, бромисто-водородной кислотой,серной кислотой, фосфороной кислотой, азотной кислотой и т.п.; (с) соли, образованные с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, пальмитиновая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, птолуолсульфоновая кислота, нафталиндисульфоновая кислота, полигалактуроновая кислота и т.п.; и (d) соли, образованные с элементарными анионами, такими как хлор, бром и йод. Натриевые соли антисмысловых олигонуклеотидов являются пригодными и хорошо переносятся при терапевтическом введении людям. В другом варианте осуществления предусматриваются также натриевые соли dsPHK-соединений.G. Композиции. Соединения согласно изобретению могут также быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или другим образом ассоциированы с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, такими, например, как липосомы, молекулы, предназначенные для взаимодействия с рецепторами-мишенями, пероральными, ректальными, местными или другими композициями, для улучшения поглощения, распределения и/или всасывания. Конкретные патенты США, описывающие приготовление- 24009670 таких композиций, способствующих поглощению, распределению и/или всасыванию, включают в себя,но без ограничения,5108921; 5354844; 5416016; 5459127; 5521291; 5543158; 5547932; 5583020; 5591721; 4426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575 и 5595756, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки. Настоящее изобретение также включает в себя фармацевтические композиции и композиции, содержащие антисмысловые соединения согласно изобретению. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены несколькими путями, в зависимости от того требуется ли местное или системное лечение и от участка, на котором проводится лечение. Введение может быть местным (включая глазное и через слизистые оболочки, включая вагинальную и ректальную доставку), легочным, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая введение с помощью распылителя; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает в себя внутривенные, внутриартериальные, подкожные, интраперитонеальные или внутримышечные инъекции или инфузии; или внутричерепным, например интратекальным или интравентрикулярным, введением. Олигонуклеотиды по меньшей мере с одной 2'-Ометоксиэтильной модификацией считаются особенно пригодными для перорального введения. Было обнаружено, что промоторы всасывания увеличивают биодоступность перорально введенных олигонуклеотидов. Промоторы всасывания включают в себя поверхностно-активные вещества, желчные соли, жирные кислоты, хелатирующие агенты или нехелатообразующие поверхностно-активные вещества. Каприновая кислота (C10) и/или лауриновая кислота (С 12) и их соли относятся к жирным кислотам, эффективность которых была продемонстрирована для повышения биодоступности олигонуклеотидов; урсодезоксихолевая кислота (UDCA) и хенодезоксихолевая кислота (CDCA) относятся к желчным солям с продемонстрированной эффективностью повышения биодоступности олигонуклеотидов. Композиции с замедленным высвобождением (например, с импульсным или пульсирующим высвобождением) и композиции пролонгированного действия также полезны для повышения биодоступности. Материалы с биоадгезивными свойствами могут быть добавлены для обеспечения адгезии частиц носителя лекарственного средства к слизистым оболочкам для увеличения поглощения. Фармацевтические композиции и композиции для местного применения могут включать в себя трансдермальные пластыри, жидкие мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Обычные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или маслянистые основы,загустители и т.п. могут быть необходимыми или желательными. Полезными могут также быть презервативы с покрытием, перчатки и т.п. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, которые удобно могут быть представлены в виде единичных дозированных форм, могут быть приготовлены обычными методами,хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие методы включают в себя стадию совмещения активных ингредиентов с фармацевтическим носителем (носителями) или эксципиентом (эксципиентами). В общем, композиции готовят путем равномерного и тщательного смешивания активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкодисперсными твердыми носителями или обоими их видами, и затем, при необходимости, формования продукта. Композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены в виде любой из многих возможных лекарственных форм, таких как, но без ограничения, таблетки, капсулы, гелевые капсулы,жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции согласно настоящему изобретению могут также быть составлены в виде суспензий в водной, неводной или смешанной среде. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, включая,например, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, сорбит и/или декстран. Суспензия может также содержать стабилизаторы. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению включают в себя, но без ограничения, растворы, эмульсии, пены и композиции, содержащие липосомы. Фармацевтические композиции и композиции согласно настоящему изобретению могут включать в себя один или несколько промоторов всасывания, носителей, эксципиентов или других активных или неактивных ингредиентов. Эмульсии типично представляют собой гетерогенные системы одной жидкости, диспергированной в другой в форме капелек, обычно, более 0,1 мкм в диаметре. Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты в дополнение к диспергированным фазам и активное лекарственное вещество, которое может находиться в растворе в водной или масляной фазе или само образовывать отдельную фазу. В качестве варианта осуществления настоящее изобретение включает в себя микроэмульсии. Эмульсии и их использование хорошо известны в данной области и дополнительно описаны в патенте США 6287860,который включен в данное описание посредством ссылки. Композиции согласно настоящему изобретению включают в себя липосомальные композиции. В используемом в настоящем изобретении значении термин "липосома" означает везикулу, состоящую из амфифильных липидов, организованных в виде сферического бислоя или бислоев. Липосомы представ- 25009670 ляют собой однослойные или многослойные везикулы, имеющие мембрану, состоящую из липофильного материала и водного содержимого, включающего композицию, предназначенную для доставки. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые, как считается, взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса.pH-чувствительные или отрицательно заряженные липосомы, как считается, захватывают ДНК, а не образуют с ней комплекс. Как катионные, так и некатионные липосомы используются для доставки ДНК в клетки. Липосомы также включают в себя "стерически стабилизированные" липосомы, которые в используемом в настоящем описании значении относятся к липосомам, включающим один или несколько специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к увеличению времени циркуляции по сравнению с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Примеры стерически стабилизированных липосом включают в себя такие, в которых часть липида липосомы, образующего везикулу, содержит один или несколько гликолипидов или дериватизована одним или несколькими гидрофильными полимерами, такими как полиэтиленгликольный (PEG) фрагмент. Липосомы и их использование описаны в патенте США 6287860, который включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Фармацевтические композиции и композиции согласно настоящему изобретению могут также включать в себя поверхностно-активные вещества. Использование поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, композициях и в эмульсиях хорошо известно в данной области. Поверхностно-активные вещества и области их применения дополнительно описаны в патенте США 6287860,который включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. В одном варианте осуществления настоящее изобретение использует различные промоторы всасывания для обеспечения эффективной доставки нуклеиновых кислот, особенно, олигонуклеотидов. Помимо ускорения диффузии нелипофильных лекарственных веществ через клеточные мембраны, промоторы всасывания также повышают проницаемость липофильных лекарственных веществ. Промоторы всасывания могут быть классифицированы по принадлежности к одной из пяти обширных категорий, а именно, поверхностно-активным веществам, жирным кислотам, желчным солям, хелатирующим агентам и нехелатирующим неповерхностно-активным веществам. Промоторы всасывания и области их применения подробнее описаны в патенте США 6287860, который включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют как промоторы всасывания, включают в себя, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту (С 12),каприновую кислоту (С 10), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, рицинолеат (recinleate), моноолеин (известный также как 1-моноолеил-rac-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту,глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, моно- и диглицериды и их физиологически приемлемые соли (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат,линолеат и т.д.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33; El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654). Примерами некоторых жирных кислот являются капрат натрия (С 10) и лаурат натрия (С 12), используемые по отдельности или в комбинациях в концентрации от 0,5 до 5%. Примеры желчных солей включают в себя, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глухолевую кислоту (глухолат натрия), гликохолевую кислотуTher., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583). UDCA и CDCA эффективно использовались в качестве промоторов всасывания олигонуклеотидов, и еще более эффективно в комбинациях. Комплексные композиции, содержащие одну или несколько желчных солей и одну или несколько жирных кислот, были еще более эффективными, особенно, CDCA (с или без UDCA), в комбинации с лауратом и капратом (заявка США 09/108673, на имя Teng and Hardee, поданная 1 июля 1998 г.). Специалисту в данной области понятно, что композиции обычно составляют в соответствии с их предполагаемым использованием, т.е. путем введения. Композиции для местного применения включают в себя композиции, в которых олигонуклеотиды согласно изобретению находятся в смеси с агентом для местной доставки, таким как липиды, липосомы,жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие агенты и поверхностноактивные вещества. Липиды и липосомы включают в себя нейтральные (например, диолеоилфосфатиди- 26009670 лэтаноламин DOPE, димиристоилфосфатидилхолин DMPC, дистеароилфосфатидилхолин) отрицательно заряженные (например, димиристоилфосфатидилглицерин DMPG) и катионные (например, диолеоилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеоилфосфатидилэтаноламин DOTMA). Для местного или другого применения олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть инкапсулированы в липосомах или могут образовывать комплексы с ними, в частности, с катионными липосомами. Альтернативно, олигонуклеотиды могут образовывать комплексы с липидами, в частности, с катионными липидами. Жирные кислоты и сложные эфиры, их фармацевтически приемлемые соли и области их применения подробнее описаны в патенте США 6287860, который включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Композиции для местного применения описаны детально в патентной заявке США 09/315298, поданной 20 мая 1999 г., которая включена в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Композиции и составы для перорального введения включают в себя порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, гелевые капсулы,саше, таблетки или минитаблетки. Может быть желательным использование загустителей, вкусовых агентов, разбавителей, эмульгаторов, диспергаторов или связующих. Композиции для перорального введения представляют собой композиции, в которых олигонуклеотиды согласно изобретению вводят в сочетании с одним или несколькими промоторами всасывания - поверхностно-активными веществами и комплексообразователями. Поверхностно-активные вещества включают в себя жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Желчные кислоты/соли и жирные кислоты и области их применения подробно описаны в патенте США 6287860, который включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Также пригодными являются комбинации промоторов всасывания, например, жирные кислоты/соли в комбинации с желчными кислотами/солями. Одной из комбинаций является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA. Другие промоторы всасывания включают в себя полиоксиэтилен-9-лауриловый простой эфир, полиоксиэтилен-20 цетиловый простой эфир. Доставка олигонуклеотидов согласно изобретению может осуществляться перорально, в гранулированной форме, включая частицы, полученные распылительной сушкой, или в виде комплексов с образованием микро- или наночастиц. Агенты комплексообразования олигонуклеотидов и области их применения подробно описаны в патенте США 6287860, который включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Композиции для перорального введения олигонуклеотидов и их получение описаны детально в заявках США 09/108673 (подана 1 июля 1998 г.), 09/315298(подана 20 мая 1999 г.) и 10/071822, поданной 8 февраля 2002 г., которые включены в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Композиции и составы для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут включать в себя стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие пригодные добавки, такие как, но без ограничения, промоторы всасывания, соединенияносители и другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты. Определенные варианты осуществления изобретения предусматривают фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько олигомерных соединений и один или несколько других химиотерапевтических агентов, функционирующих по неантисмысловому механизму. Примеры таких химиотерапевтических агентов включают в себя, но без ограничения, противораковые химиотерапевтические препараты, такие как даунорубицин, дауномицин, дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин,эзорубицин,блеомицин,мафосфамид,ифосфамид,цитозинарабинозид,бисхлорэтилнитрозомочевина, бусулфан, митомицин С, актиномицин D, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексилнитрозомочевина, азотистые аналоги горчичного газа, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевина, дезоксикоформицин, 4-гидроксипероксициклофосфорамид, 5-фторурацил (5-FU), 5 фтордезоксиуридин (5-FUdR), метотрексат (МТХ), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид(VP-16), триметрексат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатин, перметрексед и диэтилстильбестрол (DES). При использовании с соединениями согласно изобретению, такие химиотерапевтические агенты могут использоваться индивидуально (например, 5-FU и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-FU и олигонуклеотид в течение определенного периода времени, а затем МТХ и олигонуклеотид) или в комбинации с одним или несколькими другими такими химиотерапевтическими агентами (например, 5-FU, МТХ и олигонуклеотид или 5-FU, лучевая терапия и олигонуклеотид). Противовоспалительные препараты, включая, но без ограничения, нестероидные противовоспалительные средства и кортикостероиды, и антивирусные препараты, включая, но без ограничения, рибивирин, видарабин, ацикловир и ганцикловир, также могут быть введены в композиции согласно изобретению. Комбинации антисмыслового соединения и других неантисмысловых препаратов также входят в объем данного изобретения. Два или более комбинированных соединений могут быть использованы вместе или последовательно. В другом близком варианте осуществления композиции согласно изобретению могут содержать одно или несколько антисмысловых соединений, особенно, олигонуклеотидов, нацеленных на первую нук- 27009670 леиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных антисмысловых соединений, нацеленных на вторую нуклеиновую кислоту-мишень. Альтернативно, композиции согласно изобретению могут содержать два или более антисмысловых соединений, нацеленных на разные участки одной и той же нуклеиновой кислоты-мишени. Многочисленные примеры антисмысловых соединений известны в данной области. Два или более комбинированных соединений могут использоваться вместе или последовательно. Н. Дозировка. В используемом в настоящем описании значении термин "пациент" относится к млекопитающему,страдающему одним или несколькими расстройствами, ассоциированными с экспрессией или сверхэкспрессией eIF4E. Следует понимать, что наиболее предпочтительным пациентом является человек. Подразумевается также, что данное изобретение относится конкретно к ингибированию экспрессии или сверхэкспрессии eIF4E млекопитающих. Подразумевается, что специалист в данной области может повлиять на расстройства, ассоциированные с экспрессией или сверхэкспрессией eIF4E, путем проведения лечения пациента, страдающего расстройствами, эффективным количеством соединения согласно настоящему изобретению. Таким образом, термины "лечение" и "воздействие" должны относиться ко всем процессам, в которых может происходить замедление, прекращение, прерывание, регулирование, задержка или остановка развития описанных в настоящем описании расстройств, но не указывают обязательно на полное устранение всех симптомов. В используемом в настоящем описании значении, термин "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" соединения согласно настоящему изобретению относится к количеству, являющемуся эффективным для лечения или профилактики описанных в настоящем описании расстройств. Составление терапевтических композиций и их последующее введение (дозирование) считается доступным специалисту в данной области. Дозировка зависит от тяжести и восприимчивости болезненного состояния, лечение которого проводится, при продолжительности курса лечения от нескольких дней до нескольких месяцев или до достижения эффекта лечения или ослабления болезненного состояния. Оптимальные схемы применения могут быть рассчитаны по результатам измерения накопления лекарственного средства в организме пациента. Средний специалист может легко определить оптимальные дозы, методы дозирования и частоту повторного приема. Оптимальные дозы могут меняться в зависимости от относительной активности индивидуальных олигонуклеотидов и могут быть, как правило, оценены по значениям ЕС 50, оказавшимся эффективными на in vitro и in vivo животных моделях. В общем,дозы составляют от 0,0001 мкг до 100 г на кг массы тела, и могут вводиться один или несколько раз в день, неделю, месяц или год, или даже один раз в 2-20 лет. В некоторых вариантах осуществления доза составляет от 0,0001 мкг до 100 г на кг массы тела, от 0,001 мкг до 10 г на кг массы тела, от 0,01 мкг до 1 г на кг массы тела, от 0,1 мкг до 100 мг на кг массы тела, от 1 мкг до 10 мг на кг массы тела, от 10 мкг до 1 мг на кг массы тела или от 100 до 500 мкг на кг массы тела, и может быть введена один или несколько раз в день, неделю, месяц или год, или даже один раз в 2-20 лет. Для двухцепочечных соединений доза должна рассчитываться с учетом повышенной нагрузки нуклеиновой кислоты для второй цепи(для соединений, включающих две цепи) или дополнительной длины нуклеиновой кислоты (для самокомплементарного соединения). Средние специалисты в данной области могут легко оценить частоту повторного приема доз на основе измеренных значений времени удерживания и концентрации лекарственного вещества в жидкостях или тканях организма. Была проведена большая работа по исследованию процессов поглощения, распределения, метаболизма и выведения (вместе называемых ADME) олигонуклеотидов. ADME является последовательностьнезависимым параметром, поскольку все последовательности с данной химией (например, все 2'-МОЕ гэпмеры с Р=S-скелетом) имеют близкие физические/химические свойства, такие как растворимость в воде, молекулярная масса (ок. 7000) и pKa. Олигонуклеотиды относительно быстро выводятся из плазмы(период полураспределения приблизительно 1 ч, распределение завершается за 24 ч) путем распределения между тканями, в первую очередь, но без ограничения, печенью, почками, селезенкой и костным мозгом. Была продемонстрирована сильная корреляция между фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами в тканях, включая почки, печень, костный мозг, жировую ткань, селезенку,лимфатические узлы, легкие (с помощью аэрозоля) и центральную нервную систему (при интрацеребровентрикулярном введении). Период полувыведения из тканей составляет 1-5 дней для антисмысловых лекарственных веществ первого поколения (2'-дезокси с фосфоротиоатным скелетом) и 10-28 дней для 2'-МОЕ гэповых олигонуклеотидов с фосфоротиоатным скелетом (Henry et al., Curr. Opin. Invest. Drugs,2001, 2, 1444-1449). После успешного лечения может быть желательным проведение для пациента поддерживающей терапии с целью предотвращения рецидивирования болезненного состояния, при которой олигонуклеотид вводят в поддерживающих дозах в интервале от 0,0001 мкг до 100 г на кг массы тела, от одного или нескольких раз в день до одного раза в 20 лет. Хотя настоящее изобретение было детально описано в соответствии с некоторыми вариантами его осуществления, приведенные ниже примеры служат только иллюстрациями изобретения, не ограничивая- 28009670 его. Все ссылки, номера доступа GenBank и т.п., приведенные в данном описании, включены в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Примеры Пример 1. Синтез нуклеозидных фосфорамидитов. Указанные ниже соединения, включая амидиты и их промежуточные соединения, получали, как описано в патенте США 6426220 и опубликованном РСТ WO 02/36743; 5'-О-диметокситритилтимидиновое промежуточное соединение для 5-метил-dC-амидита,5'-O-диметокситритил-2'-дезокси-5-метилцитидиновое промежуточное соединение для 5-метил-dCамидита,5'-О-диметокситритил-2'-дезокси-N4-бензоил-5-метилцитидиновое предпоследнее промежуточное соединение для 5-метил-dC-амидита,(5'-O-(4,4'-диметокситрифенилметил)-2'-дезокси-N4-бензоил-5-метилцитидин-3'-O-ил)-2-цианоэтилN,N-диизопропилфосфорамидит (5-метил-dC-амидит),2'-фтордезоксиаденозин,2'-фтордезоксигуанозин,2'-фторуридин,2'-фтордезоксицитидин,2'-О-(2-метоксиэтил) модифицированные амидиты,2'-О-(2-метоксиэтил)-5-метилуридиновые промежуточные соединения,5'-O-DMT-2'-О-(2-метоксиэтил)-5-метилуридиновое предпоследнее промежуточное соединение,(5'-О-(4,4'-диметокситрифенилметил)-2'-O-(2-метоксиэтил)-5-метилуридин-3'-О-ил)-2-цианоэтилN,N-диизопропилфосфорамидит (МОЕ Т-амидит),5'-О-диметокситритил-2'-О-(2-метоксиэтил)-5-метилцитидиновое промежуточное соединение,5'-О-диметокситритил-2'-О-(2-метоксиэтил)-N4-бензоил-5-метилцитидиновое предпоследнее промежуточное соединение,(5'-О-(4,4'-диметокситрифенилметил)-2'-О-(2-метоксиэтил)-N4-бензоил-5-метилцитидин-3'-О-ил)-2 цианоэтил-N,N-диизопропилфосфорамидит (МОЕ-5-Ме-С-амидит),(5'-О-(4,4'-диметокситрифенилметил)-2'-О-(2-метоксиэтил)-N6-бензоиладенозин-3'-О-ил)-2 цианоэтил-N,N-диизопропилфосфорамидит (МОЕ А-амидит),(5'-О-(4,4'-диметокситрифенилметил)-2'-О-(2-метоксиэтил)-N4-изобутирилгуанозин-3'-О-ил)-2 цианоэтил-N,N-диизопропилфосфорамидит (МОЕ G-амидит),2'-О-(аминооксиэтил)нуклеозидамидиты и 2'-O-(диметиламинооксиэтил)нуклеозидамидиты,2'-(диметиламинооксиэтокси)нуклеозидамидиты,5'-О-трет-бутилдифенилсилил-О 2-2'-ангидро-5-метилуридин,5'-O-трет-бутилдифенилсилил-2'-О-(2-гидроксиэтил)-5-метилуридин,2'-О-2-фталимидокси)этил)-5'-т-бутилдифенилсилил-5-метилуридин,5'-О-трет-бутилдифенилсилил-2'-О-2-формадоксиминоокси)этил)-5-метилуридин,5'-O-трет-бутилдифенилсилил-2'-О-(N,N-диметиламинооксиэтил)-5-метилуридин,2'-О-(диметиламинооксиэтил)-5-метилуридин,5'-O-DMT-2'-О-(диметиламинооксиэтил)-5-метилуридин,5'-O-DMT-2'-О-(2-N,N-диметиламинооксиэтил)-5-метилуридин-3'-2-цианоэтил)-N,Nдиизопропилфосфорамидит),2'-(аминооксиэтокси)нуклеозидамидиты,N2-изобутирил-6-O-дифенилкарбамоил-2'-О-(2-этилацетил)-5'-О-(4,4'-диметокситритил)гуанозин 3'-2-цианоэтил)-N,N-диизопропилфосфорамидит),2'-диметиламиноэтоксиэтоксинуклеозидамидиты (2'-DMAEOE),2'-О-(2-(2-N,N-диметиламиноэтокси)этил)-5-метилуридин,5'-O-диметокситритил-2'-О-(2-(2-N,N-диметиламиноэтокси)этил)-5-метилуридин и 5'-O-диметокситритил-2'-О-(2-(2-N,N-диметиламиноэтокси)этил)-5-метилуридин-3'-О-(цианоэтилN,N-диизопропил)фосфорамидит. 2'-Дезокси- и 2'-метоксиамидиты. 2'-Дезокси- и 2'-метокси-бета-цианоэтилдиизопропилфосфорамидиты были приобретены из коммерческих источников (например, Chemgenes, Needham, MA или Glen Research, Inc., Sterling, VA). Другие 2'-O-алкоксизамещенные нуклеозидамидиты получали, как описано в патенте США 5506351,включенном в данное описание посредством ссылки. Для олигонуклеотидов, синтезированных с использованием 2'-алкоксиамидитов, использовали стандартный цикл немодифицированных олигонуклеотидов,за исключением того, что стадию выдерживания после импульсного введения тетразола и основания увеличивали до 360 с. Олигонуклеотиды, содержащие 5-метил-2'-дезоксицитидиновые (5-Ме-С) нуклеотиды, синтезировали в соответствии с опубликованными способами (Sanghvi et. al., Nucleic Acids Research, 1993, 21,3197-3203) с использованием коммерчески доступных фосфорамидитов (Glen Research, Sterling VA или- 29009670 2'-Фторамидиты. 2'-Фторолигонуклеотиды синтезировали, как описано ранее (Kawasaki et al., J. Med. Chem., 1993, 36,831-841) и в патенте США 5670633, включенном в данное описание посредством ссылки. Кратко, синтезировали защищенный нуклеозид N6-бензоил-2'-дезокси-2'-фтораденозин, используя коммерчески доступный 9-бета-O-арабинофуранозиладенин в качестве исходного соединения и модифицируя описанную в литературе методику, в которой атом 2'-альфа-фтора вводят путем SN2-замены 2'-бета-тритильной группы. Таким образом обеспечивали селективную защиту N6-бензоил-9-бета-D-арабинофуранозиладенина с умеренным выходом промежуточного 3',5'-дитетрагидропиранила (ТНР). Удаление защитной группы ТНР и N6-бензоильной группы осуществляют стандартными методами и используют стандартные способы получения 5'-диметокситритил- (DMT) и 5'-DMT-3'-фосфорамидитных промежуточных соединений. Синтез 2'-дезокси-2'-фторгуанозина осуществляют с использованием тетраизопропилдисилоксанил(TPDS)-защищенного 9-бета-D-арабинофуранозилгуанина в качестве исходного соединения, путем его превращения в промежуточный диизобутириларабинофуранозилгуанозин. После удаления защитнойTPDS-группы вводят ТНР-защиту гидроксильной группы, получая диизобутирил-ди-ТНР-защищенный арабинофуранозилгуанин. После селективного О-деацилирования и введения трифторметансульфогруппы проводят обработку неочищенного продукта фторидом, затем удаление защитных ТНР-групп. Используют стандартные методы для получения 5'-DMT- и 5'-DMT-3'-фосфорамидитов. Синтез 2'-дезокси-2'-фторуридина осуществляют по модифицированной методике, описанной в литературе, в которой 2,2'-ангидро-1-бета-D-арабинофуранозилурацил обрабатывают 70% фтористым водородом-пиридином. Используют стандартные методики для получения 5'-DMT и 5'-DMT-3'фосфорамидитов. 2'-Дезокси-2'-фторцитидин синтезируют путем аминирования 2'-дезокси-2'-фторуридина, с последующим селективным введением защиты с получением N4-бензоил-2'-дезокси-2'-фторцитидина. Используют стандартные методики для получения 5'-DMT и 5'-DMT-3'-фосфорамидитов. 2'-О-(2-Метоксиэтил)модифицированные амидиты. 2'-О-Метоксиэтилзамещенные нуклеозидные амидиты получают по методике Martin, HelveticaChimica Acta, 1995, 78, 486-504. 2'-(Аминооксиэтил)нуклеозидамидиты и 2'-(диметиламинооксиэтил)нуклеозидамидиты. Аминооксиэтил- и диметиламинооксиэтиламидиты получают по методу патентной заявки США 6127533, которая включена в данное описание посредством ссылки. Пример 2. Синтез олигонуклеотидов и олигонуклеозидов. Олигомерные соединения, используемые в соответствии с данным изобретением, можно просто и удобно получить с помощью хорошо известного метода твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продается несколькими поставщиками, включая, например, Applied Biosystems (Foster City,CA). Дополнительно или альтернативно, могут быть использованы любые другие средства для такого синтеза, известные в данной области. Хорошо известно использование подобных методов для получения олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоаты и алкилированные производные. Олигонуклеотиды. Незамещенные и замещенные фосфодиэфирные (Р=O) олигонуклеотиды синтезируют с помощью автоматического ДНК-синтезатора (Applied Biosystems, модель 394), используя стандартную фосфорамидитную химию с окислением йодом. Фосфоротиоаты (P=S) синтезируют аналогично фосфодиэфирным олигонуклеотидам со следующими исключениями: введение тиагруппы осуществляют путем использования 10% мас./об. раствора 3,Н-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксида в ацетонитриле для окисления фосфитных связей. Время стадии проведения реакции введения тиагруппы увеличивают до 180 с и проводят перед ней обычную стадию копирования. После отщепления от колонки CPG и деблокирования в концентрированном гидроксиде аммония при 55 С (12-16 ч) олигонуклеотиды выделяют осаждением 3 объемами этанола из 1 М раствора NH4OAc. Фосфинатолигонуклеотиды получают, как описано в патенте США 5508270, включенном в данное описание посредством ссылки. Алкилфосфонатолигонуклеотиды получают, как описано в патенте США 4469863, включенном в данное описание посредством ссылки. 3'-Дезокси-3'-метиленфосфонатолигонуклеотиды получают, как описано в патентах США 5610289 или 5625050, включенных в данное описание посредством ссылки. Фосфорамидитолигонуклеотиды получают, как описано в патенте США 5256775 или патенте США 5366878, включенных в данное описание посредством ссылки. Алкилфосфонотиоатолигонуклеотиды получают, как описано в опубликованных заявках РСТPCT/US94/00902 и PCT/US93/06976 (опубликованы как WO 94/17093 и WO 94/02499, соответственно),включенных в данное описание посредством ссылки. 3'-Дезокси-3'-аминофосфорамидатные олигонуклеотиды получают, как описано в патенте США 5476925, включенном в данное описание посредством ссылки. Фосфотриэстерные олигонуклеотиды получают, как описано в патенте США 5023243, включенном в данное описание посредством ссылки.