Синтетические пептиды человека и фармацевтические композиции, содержащие их , для лечения системной красной волчанки

009465 Область техники изобретения Данное изобретение относится к созданию синтетических пептидов, а точнее синтетических пептидов, базирующихся на последовательности определяющего комплементарность участка (CDR) человеческого моноклонального антитела против ДНК, к созданию фармацевтических композиций, содержащих их, и их применению для иммуномодулирования ответных реакций, ассоциированных с системной красной волчанкой (SLE). Сокращения 16/6-Id: человеческое mAb 16/6-Id; CDR: определяющий комплементарность участок; CFA: полный адъювант Фрейнда; hCDR-пептид: пептид, базирующийся на CDR-участке человеческого mAb 16/6-Id;hCDR1: человеческий пептид с SEQ ID NO: 6; hCDR3: человеческий пептид с SEQ ID NO: 7; человеческое mAb 16/6-Id: человеческое патогенное анти-ДНК-mAb, которое несет 16/6-Id; ICD: отложения иммунных комплексов; Id: идиотип; LNC: клетки лимфотического узла; mAb: моноклональное антитело; ММР: матриксная металлопротеиназа; mCDR1: мышиный пептид с SEQ ID NO: 1; mCDR3: мышиный пептид с SEQ ID NO: 3; PBL: лимфоциты периферической крови; PBS: забуференный фосфатом физиологический раствор; rev: обратный пептид; SLE: системная красная волчанка; SLEDAI: индекс активности заболевания SLE; TGF-: трансформирующий фактор роста ; UT: не подвергнутый лечению. Предпосылки к созданию изобретения Системная красная волчанка (SLE) является аутоиммунным заболеванием, характеризующимся продукцией множества аутоантител, включая антитела к ДНК, антитела к ядерным антигенам и антитела к рибонуклеопротеинам. Прогрессирование заболевания ассоциировано с общими клиническими проявлениями и поражением тканей и органов, вызванным отложением иммунных комплексов. Подобно другим аутоиммунным состояниям, этиология SLE является мультифакторной, определяющейся генетическими факторами, факторами окружающей среды, гормональными и иммунологическими факторами. Не существует никакой специфической терапии, направленной на предупреждение или лечение SLE. Человеческое моноклональное анти-ДНК-антитело, называемое 16/6-Id, несет общий идиотип(Shoenfeld et al., 1983). Установлено, что идиотип имеет клиническую значимость у больных SLE. Так,обнаружено, что 16/6-Id экспрессируется на анти-ДНК-антителах у 54% больных SLE в активной фазе заболевания (Isenberg et al., 1984) и в пораженных органах больных SLE (Isenberg и Collins, 1985). Мыши имбредных линий, у которых не развиваются никакие спонтанные аутоиммунные заболевания, были иммунизованы указанным человеческим анти-ДНК-mAb 16/6-Id и обнаруживали основные признаки SLE у человека, а также в спонтанных мышиных моделях этого заболевания (Mendlovic et al., 1988). Таким образом, после иммунизации мыши продуцировали антитела, специфичные к 16/6-Id, антитела, которые несут 16/6-Id, и антитела, направленные против различных ядерных антигенов (дцДНК, оцДНК, Sm, рибонуклеопротеина, Ro, La и других). Серологические показатели были связаны с лейкопенией, повышенной скоростью оседания эритроцитов, протеинурией, множеством иммунных комплексов в почках и склерозом гломерул (Mendlovic et al., 1988), которые являются типичными проявлениями SLE. Мышиные анти-16/6-Id-mAb (Ab2), полученные от мышей с экспериментальной SLE, также способны индуцировать экспериментальное заболевание у мышей (Mendlovic et al., 1989), подобно 16/6-Id(Ab1). Кроме того, мышиное анти-ДНК-mAb, которое экспрессирует 16/6-Id, получали от мышей, пораженных экспериментальной SLE. Антитело Ab3, названное 5G12, взаимодействовало с антителами, специфичными к 16/6-Id. Иммунизация последним антителом приводила к индукции экспериментальнойSLE с симптомами, подобными наблюдаемым после иммунизации человеческими 16/6-Id (Ab1) и мышиными анти-16/6-Id (Ab2) mAb (Waisman et al., 1993). Описанные результаты демонстрируют важность структуры 16/6-Id для индукции и прогрессирования SLE у мышей. Для понимания механизма, посредством которого вырабатываются аутоантитела, ассоциированные с SLE, в данном изобретении получали целый ряд моноклональных аутоантител у мышей C3H.SW, у которых индуцировали экспериментальную SLE. Показано, что, как правило, моноклональные аутоантитела, способные вызывать появление антител, которые несут 16/6-Id, или взаимодействовать с ними, являются патогенными и, таким образом, способны индуцировать экспериментальную SLE у мышей(Fricke et al., 1990; Sthoeger et al., 1993). Позднее секвенировали вариабельные (V) области девяти аутоантител, которые связываются или с ДНК, или с ядерным экстрактом (NE) HeLa, полученным от мышей C3H.SW с экспериментальной SLE(Waisman и Mozes, 1993). Анализировали моноклональные антитела с различной специфичностью, чтобы определить связь между разными аутоантителами. Установлено, что три mAb связывают ДНК и, как было показано, демонстрируют последовательность, типичную для патогенных анти-ДНК-антител. Показано, что одно из названных mAb, обозначенное 2 С 4 С 2, утилизирует ген V-области тяжелой (H) цепи (VH),идентичной VH анти-ДНК-mAb, полученного от других предрасположенных к волчанке мышей, а именно (NZBNZW)F1. Ген V-области легкой (L) цепи (VL) mAb 2C4C2 имеет 98% гомологии с VL другого анти-ДНК-mAb, также выделенного от мышей (NZBNZW)F1. Другие два анти-ДНК-mAb, обозначенные 5G12-4 и 5G12-6, имеют 93% гомологии их последовательностей VH с последовательностью VH mAb 2C4C2. На основании данных анализа указанных mAb оказалось, что аутоантитела, обнаруженные у-1 009465 мышей с экспериментальной SLE, утилизируют генетические элементы, подобные элементам, утилизированным mAb, которое получено от линий мышей, у которых спонтанно развивается волчанка. Т-клетки играют важную роль в индукции и развитии экспериментальной SLE. Так, показано, что линии и клоны Т-клеток, специфичные к 16/6-Id, индуцируют экспериментальную SLE у сингенных реципиентов подобно антителу 16/6-Id. Поэтому после инокуляции активированных клеток указанных линий у мышей появлялись серологические признаки и возникало поражение почек, что является типичным для SLE (Fricke et al., 1991). Как описано выше, mAb 5G12, которое было получено от мышей с экспериментальной SLE и которое, как было показано, связывает ДНК и несет 16/6-Id, способно индуцировать экспериментальную SLE у мышей (Waisman et al., 1993). Т-клетки, которые специфически взаимодействуют с mAb при пролиферации, возможно, взаимодействуют с пептидами, представляющими последовательности из их определяющих комплементарность участков (CDR). Имеется большая вероятность того, что Т-клетки распознают V-участки вышеописанных антител, так как они не взаимодействуют с другими антителами, которые содержат такую же константную область, но различаются по специфичности. В вариабельной области участками с наиболее высокой вероятностью распознавания являются CDR, так как названные участки представляют собой участки, которые больше всего отличаются среди различных антител. УчасткиCDR последовательностей VH девяти патогенных мышиных mAb, упомянутых выше, которые индуцируют SLE у мышей, показаны на фиг. 1 Waisman и Mozes, 1993, на которой представлены полные нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности для вариабельных тяжелых цепей (VH) девяти mAb. В международной патентной публикации РСТ WO 96/30057 заявители описывают пептиды, базирующиеся на CDR-участках патогенных mAb, полученных от мышей с экспериментальной SLE, в частности пептиды от Ia до IIIa, базирующиеся на участках CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, VH-цепи мышиного mAb, названного 5G12, и пептиды IVa и Va, базирующиеся на участках CDR1 и CDR3, соответственно, VH-цепи мышиного mAb, названного 2 С 4 С 2. Упомянутые пептиды содержат, в основном,последовательности, которые обозначены SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 5, в виде следующих:mCDR1 [SEQ ID NO: 1] и mCDR3 [SEQ ID NO: 3], соответственно, при введении в PBS способны ингибировать сенсибилизацию Т-клеток или к соответствующему пептиду mCDR, или к целой анти-ДНКmAb 16/6-Id, полученному или от мыши, или человека (Waisman et al., 1997). Кроме того, установлено,что пептиды mCDR1 и mCDR3 или предупреждают, или лечат уже развившуюся SLE, которая или индуцирована человеческим анти-ДНК mAb 16/6-Id, или возникает спонтанно у предрасположенных к SLE мышей (NZBNZW)F1 или MRL/lpr/lpr (Eilat et al., 2000 и 2001). Краткое изложение изобретения Согласно данному изобретению в настоящее время установлено, что пептиды, базирующиеся на последовательности CDR человеческого моноклонального анти-ДНК-антитела 16/6-Id, способны иммуномодулировать SLE-ассоциированные ответные реакции. Так, пептиды, базирующиеся на CDR1 иCDR3 16/6-Id человека, были протестированы как показано, ингибируют пролиферацию клеток лимфатических узлов мышей, иммунизованных мышиными пептидами mCDR1 (SEQ ID NO: 1) и mCDR3 (SEQID NO: 3) или целым человеческим анти-ДНК-mAb 16/6-Id, ингибируют пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови (PBL) больных SLE на человеческое анти-ДНК-mAb 16/6-Id и уменьшают интенсивность симптомов заболевания у мышей, пораженных спонтанной или экспериментальной SLE. Представленные данные оказались совершенно неожиданными, так как не все CDR патогенных аутоантител одинаково распознаются Т-клетками больных. Как ранее было показано в лаборатории заявителя(Dayan et al., 2000), CDR анти-ДНК-аутоантитела 2 С 4 С 2 в меньшей степени распознаются Т-клетками больных SLE, чем пептиды, базирующиеся на CDR анти-ДНК-антитела 5G12. Кроме того, показано, что большинство аналогов пептидов, базирующихся на CDR мышиных аутоантител, описанных в вышеупомянутом WO 96/30057, не являются эффективными при ингибировании, и, таким образом, модификации,встречающиеся в последовательностях пептидов, базирующихся на CDR человеческого моноклонального анти-ДНК-антитела данного изобретения, не могли быть предсказаны или рассматриваться как эффективные. Кроме того, применение пептидов, базирующихся на антителе человека, следует рассматривать как предпочтительное для человека применение по сравнению с пептидами, базирующимися на последовательности антитела других животных. Таким образом, в одном аспекте данное изобретение относится к синтетическому пептиду, выбранному из группы, состоящей из:(a) пептида по крайней мере из 12 и самое большое из 30 аминокислотных остатков, содержащего последовательность, состоящую из определяющего комплементарность участка (CDR) или находящуюся-2 009465 в CDR, имеющегося в тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК-антитела 16/6-Id (в дальнейшем "последовательность hCDR"), или последовательность, полученную: (i) замещением одного или более аминокислотных остатков последовательности hCDR различными аминокислотными остатками; (ii) делецией одного или более аминокислотных остатков из последовательности hCDR; и/или (iii) присоединением одного или более аминокислотных остатков к последовательности hCDR, или соли, или химического производного указанного пептида;(b) двойного синтетического пептида, содержащего два различных типа указанного пептида (а), ковалентно связанных друг с другом или непосредственно, или через короткую связующую цепь;(c) пептидного полимера, содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и(d) пептида (а) или пептидного полимера (с), присоединенного к макромолекулярному носителю. Человеческое моноклональное анти-ДНК-антитело 16/6-Id, упоминаемое в данном описании как"человеческое mAb 16/6-Id", является патогенным человеческим моноклональным анти-ДНК-антителом,способным индуцировать SLE-подобное заболевание у мышей. Пептид согласно настоящему изобретению, содержащий последовательность hCDR, которая определена выше, называют в описании "пептид hCDR". В одном предпочтительном аспекте пептид hCDR включает в себя последовательность CDR, более предпочтительно CDR1 или CDR3, тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id, таких как, но не ограничиваясь указанными, пептиды, обозначенные в описании hCDR1 и hCDR3, по существу, имеющие следующие последовательности, обозначенные, соответственно, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7:Y Y C A R G L L R G G W N D V D Y Y G M D V [SEQ ID NO: 7] В другом аспекте в изобретении представляют фармацевтическую композицию, содержащую по крайней мере один синтетический пептид или пептидный полимер настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция особенно полезна для лечения SLE и уменьшения интенсивности клинических проявлений заболевания, в особенности посредством модулирования SLE-ассоциированных ответов, например снижения уровней активности ММР-3, и/или ММР-9,и/или IL-2, и/или IFN-, или повышения уровня активности TGF- у больного SLE. В следующем аспекте изобретение относится к способу лечения SLE, предусматривающему введение больному SLE эффективного количества пептида или пептидного полимера изобретения. Кроме того, изобретение относится к способу иммуномодулирования ответных реакций, ассоциированных с SLE,например снижения уровней активности ММР-3, и/или ММР-9, и/или IL-2, и/или IFN-, или повышения уровня активности TGF- у больного SLE, предусматривающему введение больному SLE эффективного количества пептида или пептидного полимера изобретения. Еще в одном аспекте изобретение относится к способу оценки эффективности лекарственного средства при лечении больного SLE, который включает определение в различные интервалы времени уровней ММР-3 и/или ММР-9 в образцах крови, полученных от указанного больного, которого лечат указанным лекарственным средством, причем сниженный уровень ММР-3 и/или ММР-9 коррелирует с эффективностью лекарственного средства. В другом аспекте изобретение относится к способу оценки эффективности лекарственного средства при лечении больного SLE, который включает определение в различные интервалы времени уровня IL-2 и/или IFN- в образце крови, полученном от указанного больного, которого лечат указанным лекарственным средством, причем сниженный уровень IL-2 и/или IFN- коррелирует с эффективностью лекарственного средства. Еще в одном аспекте изобретение относится к способу оценки эффективности лекарственного средства при лечении больного SLE, который включает определение в различные интервалы времени уровняTGF- в образце крови, полученном от указанного больного, которого лечат указанным лекарственным средством, причем повышенный уровень TGF- коррелирует с эффективностью лекарственного средства. Лекарственное средство, эффективность которого следует оценивать в соответствии с любым из вышеприведенных способов, может представлять собой, например, пептид настоящего изобретения или мышиный пептид, который описан в вышеупомянутой заявке WO 96/30057, не ограничиваясь перечисленным. Краткое описание фигур На фиг. 1 показано ингибирование пролиферативных ответов клеток лимфатических узлов мышей,иммунизованных человеческим mAb 16/6-Id, на различные концентрации mAb 16/6-Id (0,1-10 мкг/лунку) при лечении 300 мкг hCDR1. На фиг. 2 показано ингибирование пролиферативных ответов клеток лимфатических узлов мышей,иммунизованных человеческим mAb 16/6-Id, на различные концентрации mAb 16/6-Id (0,1-10 мкг/лунку) при лечении 50 мкг hCDR1. На фиг. 3 А-С представлен уровень цитокинов у мышей BALB/c, иммунизованных человеческим-3 009465 На фиг. 4 представлены концентрации человеческого анти-ДНК mAb 16/6-Id, необходимые для оптимального стимулирования PBL больных SLE и здоровых в качестве контролей. PBL стимулировали различными концентрациями (0,1-40 мкг/лунку) mAb 16/6-Id. Концентрацию, дающую наиболее высокий индекс стимулирования, определяли как оптимальную для стимуляции пролиферативного ответа. На фиг. 5 продемонстрирована пролиферация PBL от одного больного SLE, стимулированных митогенным фитогемагглютинином (РНА) в отсутствие или в присутствии hCDR1 или hCDR3. На фиг. 6 продемонстрирована пролиферация PBL от одного больного SLE, стимулированных человеческим mAb 16/6-Id в отсутствие или в присутствии человеческих пептидов hCDR1 или hCDR3 или мышинного пептида mCDR3. На фиг. 7 продемонстрирована пролиферация PBL от одного больного SLE, стимулированных человеческим mAb 16/6-Id в отсутствие и в присутствии человеческих пептидов hCDR1 или hCDR3 или мышинных обратных пептидов revmCDR1 и revmCDR3. На фиг. 8 представлено ингибирование секреции IL-2 PBL больных SLE, стимулированных человеческим mAb 16/6-Id в отсутствие или в присутствии hCDR1 или hCDR3. На фиг. 9 представлено повышение секреции TGF- PBL одного репрезентативного больного SLE,стимулированных человеческим mAb 16/6-Id в отсутствие или в присутствии hCDR1 или hCDR3. На фиг. 10 показаны уровни анти-ДНК-аутоантител у мышей (NZBNZW)F1, не подвергнутых лечению или подвергнутых лечению 300 мкг hCDR1 или обратным пептидом revhCDR1 (использовали как контроль). Фиг. 11A-11D являются фотографиями, демонстрирующими характерные почечные срезы от SLEпредрасположенных мышей (NZBNZW)F1, которых подвергали воздействию PBS (11 А, 11 В) или 100 мкгhCDR1 (11C, 11D), начиная с возраста 5,5 месяцев. Срезы получали от мышей, умерщвленных в возрасте 9 месяцев. Для определения отложений Ig срезы инкубировали с FITC-конъюгированными антимышиными IgG козы (специфичные к -цепи) (11 А, 11 С 100; 11 В, 11D400). Фиг. 12 А-12F являются фотографиями, демонстрирующими характерные почечные срезы от SLEпредрасположенных мышей (NZBNZW)F1, которых подвергли воздействию PBS (12A, 12 В), или 300 мкгhCDR1 (12C, 12D), или обратного пептида revhCDR1 (12E, 12F). Срезы получены от мышей, умерщвленных в возрасте 9 месяцев. Для определения отложений иммунных комплексов Ig срезы инкубировали сFITC-конъюгированными антимышиными IgG козы (специфичные к -цепи) (12A, 12C, 12 Е 100; 12 В,12D, 12F400). На фиг. 13 А-13 С представлен уровень цитокинов, который определяли с помощью ELISA-анализа в супернатантах Con А-стимулированных культур спленоцитов SLE-предрасположенных мышей (NZBNZW)F1,которых не подвергали воздействию или подвергали воздействию hCDR1 или обратным пептидомrevhCDR1. Фиг. 13 А - уровень INF-; фиг. 13 В - уровень IL-10; фиг. 13 Суровень TGF-. Фиг. 14 А-14F являются фотографиями, демонстрирующими характерные почечные срезы от мышейBALB/c с 16/6-Id-индуцированной экспериментальной SLE, подвергнутых воздействию PBS (14A, 14 В),или 200 мкг hCDR1 (14C, 14D), или обратного пептида revhCDR1 (14E, 14F). Срезы получены от мышей,умерщвленных в возрасте 9 месяцев. Для определения отложений иммунных комплексов Ig срезы инкубировали с FITC-конъюгированными антимышиными IgG козы (специфичные к -цепи) (14A, 14C,14 Е 100; 14 В, 14D, 14F400). На фиг. 15 А-15 С представлены уровни цитокинов, которые определяли с помощью ELISA-анализа в супернатантах 16/6-Id-стимулированных культур лимфатических узлов мышей BALB/c с 16/6-Id-индуцированной экспериментальной SLE, которых не подвергали лечению или подвергали лечению hCDR1(20C или 300 мкг) или обратным пептидом revhCDR1. Фиг. 15 А - уровень INF-; фиг. 15 В - уровень TNF-; фиг. 15 С - уровень IL-10; фиг. 15D - уровень TGF-; фиг. 15 Е - уровень TGF-, определенный в супернатантах 16/6-Id-стимулированных клеток селезенки. Фиг. 16 А-16F являются фотографиями, демонстрирующими характерные почечные срезы от SLEпредрасположенных мышей (NZBNZW)F1, не подвергнутых лечению (16 А, 16 В), или мышей-реципиентов спленоцитов мышей, подвергнутых лечению или 300 мкг hCDR1 (16C, 16D), или обратным пептидом revhCDR1 (16E, 16F). Для определения отложений иммунных комплексов Ig срезы инкубировали сFITC-конъюгированными антимышиными IgG козы (специфичные к -цепи) (16 А, 16C, 16E400; 16B,16D, 16F100). На фиг. 17 А-17 В изображена динамика появления ММР-3, ММР-2 и ММР-9 в сыворотках мышей(NZBNZW)F1. У мышей (NZBNZW)F1 (10 мышей/группу) брали кровь в указанные временные периоды. В объединенных сыворотках (4 мкл) мышей от каждой группы определяли уровни экспрессии ММР-3, используя метод Вестерн-блоттинга (фиг. 17 А), или активность ММР-9 и ММР-2, используя гель-зимографию (фиг. 17 В). Представлены результаты 4 аналогичных экспериментов. На фиг. 18 А-18 В изображена динамика появления ММР-3, ММР-2 и ММР-9 в сыворотках мышейPBS/CFA (10 мышей/группу) или 16/6-Id (в CFA; 10 мышей/группу), брали кровь в указанные временные периоды. В объединенных сыворотках (4 мкл) мышей от каждой группы определяли уровни экспрессии-4 009465 ММР-3, используя метод Вестерн-блоттинга (фиг. 18 А), или активность ММР-9 и ММР-2, используя гелевую зимографию (фиг. 18 В). Представлены результаты 3 аналогичных экспериментов. На фиг. 19 А-19 С представлено иммуноокрашивание на ММР-3 и ММР-9 почечных срезов иммунизованных мышей BALB/c. Неиммунизованных мышей BALB/c или мышей, которых иммунизовалиPBS/CFA или 16/6-Id (в CFA) (3 мыши/группу), умерщвляли через 5,5 месяцев после их реиммунизации 16/6-Id. Почки удаляли и их срезы (5 мкм), полученные на криостате, подвергали иммуноокрашиванию на ММР-3 (19 А) и ММР-9 (19 В). Проводили контрольное окрашивание на эффективность блокирования(19 С) (200). Результаты являются характерными для 3 аналогичных экспериментов. На фиг. 20 А-20 В представлены уровни ММР-3 и ММР-9 в сыворотках мышей (NZBNZW)F1, подвергнутых лечению mCDR1. В превентивных экспериментах мышам (10/группу) еженедельно инъецировали подкожно mCDR1 в течение 10 недель, начиная с возраста 2 месяцев. Представлены результаты исследования сывороток, взятых через 4 месяца после окончания лечения. В лечебных экспериментах мышам (10/группу) подкожно инъецировали или PBS, или 250 мкг/мышь mCDR1, начиная с возраста 5 месяцев. Представлены результаты исследования сывороток, взятых через 3 недели после окончания лечения. В объединенных сыворотках от каждой экспериментальной группы исследовали уровни ММР-3 методом Вестерн-блоттинга (20 А) и активность ММР-9, используя гелевую зимографию (20 В). UT - не подвергнутые лечению. Представлены результаты 2 аналогичных экспериментов. На фиг. 21 А-21 В представлены уровни ММР-3 и ММР-9 у мышей BALB/c, иммунизованных 16/6Id, которых подвергали лечению mCDR1. В профилактических экспериментах мышей (8/группу) подвергали лечению путем внутривенного введения mCDR1 (100 мкг/мышь). Представлены результаты исследования сывороток, взятых через 4,5 месяца после окончания лечения. В лечебных экспериментах мышей (8/группу) подвергали лечению путем подкожного введения 100 мкг/мышь mCDR1. Представлены результаты исследования сывороток, полученных после окончания лечения. В объединенных сыворотках от каждой экспериментальной группы исследовали ММР-3 методом Вестерн-блоттинга (21 А) и активность ММР-9 методом гелевой зимографии (21 В). UT - не подвергнутые лечению. Представлены результаты 2 аналогичных экспериментов. На фиг. 22 А-22 В представлено иммуноокрашивание на ММР-3 и ММР-9 почечных срезов от мышей BALB/c, иммунизованных 16/6-Id, которых подвергали воздействию mCDR1 для предупреждения(22 А) или лечения (22 В) экспериментальной SLE. Мышей умерщвляли через 8 месяцев после индукции заболевания и их почки удаляли. Криосрезы (5 мкм) получали на криостате и подвергали иммуноокрашиванию относительно ММР-3, ММР-9 и на присутствие отложений иммунных комплексов (200).(W/O) представляет контрольное окрашивание на эффективность блокирования без первого антитела. Результаты являются характерными для 2 аналогичных экспериментов. На фиг. 23 А-23 В представлены уровни ММР-3 и ММР-9 в сыворотках мышей (NZBNZW)F1, подвергнутых лечению hCDR1. В лечебных экспериментах мышам (10/группу) подкожно инъецировали илиPBS, или 100 мкг, или 30 мкг/мышь hCDR1 1 раз в неделю в течение 10 недель, начиная с возраста 7 месяцев. Представлены результаты исследования сывороток, полученных в середине лечения. В объединенных сыворотках от каждой экспериментальной группы исследовали уровни ММР-3 методом Вестернблоттинга (23 А) и активность ММР-9, используя гелевую зимографию (23 В). Представлены результаты 2 аналогичных экспериментов. На фиг. 24 изображен репрезентативный гель, демонстрирующий активность ММР-2 и ММР-9 в сыворотках больных SLE и здоровых контролей. В сыворотках (5 мкл) 40 индивидуальных больных SLE и 25 здоровых контролей исследовали их активности ММР-2 или ММР-9 методом гелевой зимографии. На фигуре представлены репрезентативные результаты исследования образцов сывороток от двух групп. На фиг. 25 изображена диаграмма, демонстрирующая количественный анализ активности ММР-2 и ММР-9 в сыворотках больных SLE (темные столбцы) и здоровых контролей (белые столбцы). В 36 образцах сывороток больных SLE и 15 образцах сывороток здоровых контролей исследовали активность ММР-2 или ММР-9, используя специальные наборы для определения активности. Результаты представлены как средняя величинаs.e.m. (средняя квадратичная ошибка) Р=0,0302. Фиг. 26 А-26 В представляют собой графики, показывающие уровни активности ММР-9 и индексы активности заболевания (SLEDAI) у больных SLE. В 35 образцах сывороток от 8 мужчин (фиг. 26 А) и 27 женщин (фиг. 26 В), больных SLE, исследовали активность ММР-9 с помощью специального набора для определения активности. Представлено распределение активности ММР-9 у больных согласно SLEDAI. Пунктирной точечной линией изображена активность ММР-9 у здоровых доноров. Фиг. 27 А-27 В представляют собой графики, показывающие характер изменения активности ММР-2(белые круги) и ММР-9 (черные круги) в сыворотках двух больных SLE, исследованных в течение 4-6 лет заболевания. В сыворотках исследовали активность ММР-2 или ММР-9 с помощью специального набора для определения активности. Исследования проводили в двух повторах. Подробное описание изобретения В одном аспекте данное изобретение относится к синтетическим пептидам, содержащим последовательность, состоящую из CDR или находящуюся в CDR, содержащемся в тяжелой или легкой цепи-5 009465 патогенного человеческого моноклонального анти-ДНК-антитела 16/6-Id (в дальнейшем определенное как "человеческое анти-ДНК-mAb 16/6-Id" или "человеческое mAb 16/6-Id"), антитело, которое индуцирует SLE-подобное заболевание у мышей. Синтетические пептиды изобретения, полученные на основе CDR человеческого mAb 16/6-Id, идентифицированные в описании как пептиды hCDR, предпочтительно базируются на CDR, находящемся в тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id. Участки CDR последовательностей VH человеческого mAb L6/6-Id включены в фиг. 4 А Waisman etal., 1995. Участки CDR тяжелых цепей человеческого mAb 16/6-Id, по существу, имеют следующие последовательности, которые обозначены SEQ ID NO: 8 - SEQ ID NO: 10: Пептиды hCDR настоящего изобретения содержат по меньшей мере 12 и самое большое 30 аминокислотных остатков и предпочтительно включают последовательность, идентичную последовательности,выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 9 и 10, или более предпочтительно последовательности, обнаруженной в указанных SEQ ID NO: 8, 9 или 10, или последовательности, полученной посредством: (i) замещения одного или более аминокислотных остатков последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 10 различными аминокислотными остатками; (ii) делеции одного или более аминокислотных остатков из последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 и 10; или (iii) присоединения одного или более аминокислотных остатков к последовательностям SEQ ID NO: 8, 9 и 10. Кроме последовательности hCDR, пептиды hCDR настоящего изобретения содержат другие аминокислотные остатки, предпочтительно аминокислотные остатки последовательностей человеческого mAb 16/6-Id, фланкирующих последовательности hCDR, или последовательностей, полученных в результате замещения одного или более аминокислотных остатков фланкирующих hCDR последовательностей различными аминокислотными остатками; в результате делеции одного или более аминокислотных остатков из фланкирующих hCDR последовательностей или в результате присоединения одного или более аминокислотных остатков к фланкирующим hCDR последовательностям. Таким образом, в следующем аспекте в данном изобретении предусматривают синтетический пептид, базирующийся на CDR1 тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id, при этом указанный участокCDR1 является, по существу, последовательностью, которая обозначена SEQ ID NO: 8, при этом указанный пептид выбирают из группы, состоящей из:(а) пептида, содержащего последовательность, состоящую из или находящуюся в SEQ ID NO: 8,или последовательность, полученную посредством: (i) замещения одного или более аминокислотных остатков указанной SEQ ID NO: 8 различными аминокислотными остатками; (ii) делеции одного или более аминокислотных остатков из указанной SEQ ID NO: 8; и/или (iii) присоединения одного или более аминокислотных остатков к указанной SEQ ID NO: 8, или соли или химического производного указанного пептида;(b) двойного синтетического пептида, содержащего два различных типа указанного пептида (а), ковалентно связанных друг с другом или непосредственно или через короткую связующую цепь;(c) пептидного полимера, содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и(d) пептида (а) или пептидного полимера (с), присоединенного к макромолекулярному носителю. В одном предпочтительном аспекте изобретения пептид, базирующийся на CDR1 тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id, является пептидом с последовательностью, по существу, обозначенной SEQ IDNO: 11: где X1 означает G или TG; X2 означает R или K; Х 3 означает Р или S; Х 4 означает G или Е; Х 5 означает K или D; и Х 6 означает Е, L или S. В более предпочтительном аспекте пептид с SEQ ID NO: 11 представляет собой 19-членный пептид,называемый здесь "пептид hCDR1" или просто "hCDR1", последовательности, которая, по существу, обозначена SEQ ID NO: 6: В hCDR1 последовательность GYYWS, заключенная в SEQ ID NO: 8, является последовательностью, за которой следует встречающаяся в природе последовательность CDR1 тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id, за исключением того, что остаток природного лейцина (L) последовательности mAb замещен остатком глутаминовой кислоты (Е) (жирный) в положении 15 пептида hCDR1. В другом аспекте пептид с SEQ ID NO: 11 является аналогом пептида hCDR1, полученным замещением и/или присоединением аминокислотных остатков к последовательности пептида hCDR1, примерами его являются пептиды с последовательностями, которые, по существу, обозначены SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 18 (в которых замещенные или присоединенные аминокислоты изображены жирным шрифтом): В следующем аспекте в изобретении предусматривают синтетический пептид, базирующийся наCDR3 тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id, при этом указанный участок CDR3 является последовательностью, по существу, обозначенной как SEQ ID NO: 10, при этом указанный пептид выбирают из группы, состоящей из:(a) пептида, содержащего последовательность, состоящую из или находящуюся в SEQ ID NO: 10,или последовательность, полученную посредством: (i) замещения одного или более аминокислотных остатков указанной SEQ ID NO: 10 различными аминокислотными остатками; (ii) делеции одного или более аминокислотных остатков из указанной SEQ ID NO: 10; и/или (iii) присоединения одного или более аминокислотных остатков к указанной SEQ ID NO: 10, или соли, или химического производного указанного пептида;(b) двойного синтетического пептида, содержащего два различных типа указанного пептида (а), ковалентно связанных друг с другом или непосредственно, или через короткую связующую цепь;(c) пептидного полимера, содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и(d) пептида (а) или пептидного полимера (с), присоединенного к макромолекулярному носителю. В одном предпочтительном аспекте изобретения пептид, базирующийся на CDR3 тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id, является пептидом с последовательностью, по существу, обозначенной SEQ IDNO: 19: где X1 означает G или F; Х 3 означает R или А; Х 3 означает G или А; Х 4 означает G или А; Х 5 означает W или A; X6 означает N или А; Х 7 означает Y или W; и Х 8 означает М или Q. В более предпочтительном аспекте пептид с SEQ ID NO: 19 является пептидом с SEQ ID NO: 1, называемым в описании "пептид hCDR3" или просто "hCDR3": В hCDR3 последовательность GLLRGGWNDVDYYYGMDV [SEQ ID NO: 10] участка CDR3 тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id модифицирована делецией одного из остатков тирозина (Y), и ей предшествует природная последовательность mAb. В другом аспекте пептид SEQ ID NO: 19 является аналогом пептида hCDR3, полученным замещением и/или присоединением аминокислотных остатков к последовательности пептида hCDR3, примерами его являются пептиды с последовательностями SEQ ID NO: 20 - SEQ ID NO: 27 (в которых замещенные или добавленные аминокислоты обозначены жирным шрифтом): Еще в одном аспекте в изобретении предусматривают синтетический пептид, базирующийся наCDR2 тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id, при этом указанный участок CDR2, по существу, представляет собой последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 9, при этом указанный пептид выбирают из группы, состоящей из:(а) пептида, содержащего последовательность, состоящую из последовательности SEQ ID NO: 9 или находящуюся в ней, или последовательность, полученную: (i) замещением одного или более аминокислотных остатков указанной SEQ ID NO: 9 различными аминокислотными остатками; (ii) делецией одного или более аминокислотных остатков из указанной SEQ ID NO: 9; и/или (iii) присоединением од-7 009465 ного или более аминокислотных остатков к указанной SEQ ID NO: 9, или соли, или химического производного указанного пептида;(b) двойного синтетического пептида, содержащего два различных типа указанного пептида (а), ковалентно связанных друг с другом или непосредственно, или через короткую связующую цепь;(c) пептидного полимера, содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и(d) пептида (а) или пептидного полимера (с), присоединенного к макромолекулярному носителю. Синтетические пептиды данного изобретения содержат 12-30, предпочтительно 17-23, наиболее предпочтительно 19-22 аминокислотных остатка и могут быть получены в результате химического синтеза или с помощью рекомбинантной технологии способами, хорошо известными в данной области. Если получение описанных выше аналогов осуществляли замещением аминокислотных остатков,оказывается важным, чтобы заместители были выбраны из заместителей, которые кумулятивно не изменяют значительно объем, гиброфобную-гидрофильную характеристику и заряд соответствующих частей незамещенного родительского пептида. Таким образом, гидрофобный остаток можно замещать гидрофильным остатком или наоборот до тех пор, пока общее воздействие значительно не изменяет объем,гиброфобную-гидрофильную характеристику и заряд соответствующего незамещенного родительского пептида. Данное изобретение также включает химические производные пептида настоящего изобретения."Химическое производное" содержит дополнительные химические составляющие, обычно не являющиеся частью пептида, и охватывается настоящим изобретением до тех пор, пока оно сохраняет по крайней мере часть функции пептида, что позволяет примененять его для предотвращения или ингибирования Тклеточных пролиферативных ответов и аутоиммунного заболевания. Например, химическое производное можно получать в результате реакции органического дериватизирующего агента, способного взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками указанного пептида, и такое производное будет сохранять по крайней мере часть функции пептида, чтобы специфически ингибировать пролиферативный ответ и секрецию цитокинов Т-лимфоцитами мышей, которые являются высокоотвечающими на SLE-индуцирующие аутоантитела организмами. Среди названных химических производных амиды представляют особый интерес, как амиды карбоксильных групп на С-конце, так и амиды свободных карбоксильных групп остатков аспарагиновой или глутаминовой кислоты. Большинство таких химических производных и способы их создания хорошо известны в данной области. Также в объем настоящего изобретения входят соли пептидов и аналогов настоящего изобретения. Используемый в описании термин "соли" относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотноаддитивным солям аминогрупп пептидной молекулы. Соли карбоксильной группы могут быть образованы способами, известными в данной области, и включают неорганические соли, например соли натрия,кальция, аммония, железа или цинка и тому подобного, и соли органических оснований, такие как соли,образованные, например, аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидином, прокаином и тому подобным. Кислотно-аддитивные соли включают, например, соли минеральных кислот,таких как, например, хлористо-водородной кислоты или серной кислоты, и соли органических кислот,таких как, например, уксусной кислоты или щавелевой кислоты. Такие химические производные и соли предпочтительно используют, чтобы модифицировать фармацевтические свойства пептида, когда речь идет о стабильности, растворимости и т.д. Согласно данному изобретению пептиды hCDR могут быть выбраны посредством тестирования их потенциала ингибирования пролиферативного ответа Т-лимфоцитов мышей, которые являются высокоотвечающими на SLE-индуцирующие аутоантитела. Как только пептид данного изобретения получают,его способность ингибировать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов мышей, которые являются высокоотвечающими на SLE-индуцирующие аутоантитела организмами, легко может быть определена любым специалистом в данной области без чрезмерного экспериментирования с использованием тестов,таких как тесты, описанные в заявке. Одним тестом, который может быть легко проведен, является определение способности пептидов ингибировать in vitro пролиферативные ответные реакции определенных линий или клонов Т-клеток, специфичных к SLE-индуцирующим аутоантителам. Линиями и клонами Тклеток могут быть, например, линии и клоны Т-клеток, специфичные к 16/6-Id-mAb (Fricke et al., 1991),выведенные из иммунизованных клеток лимфатических узлов мышей по ранее описанному способу(Axelrod, О. and Mozes, E. Immunobiology, 172, 99 (1986. Клетки подвергают воздействию стимулирующих антител, присутствующих на облученных сингенных клетках селезенки в присутствии обогащенной среды каждые 2 недели. Линии Т-клеток клонируют по стандартному методу предельных разведений. Пролиферативные ответы названных линий и клонов Т-клеток исследуют, например, по способу,описанному в WO 96/30057, в "Материалах и методах" в разделе (g). Другим тестом, который может быть проведен для того, чтобы выбрать аналоги, характеризующиеся требуемой активностью, является тест на способность синтетических пептидов ингибировать способность линий и клонов Т-клеток обеспечивать помощь пептидспецифическим В-клеткам в присутствии родительского пептида. Синтетические пептиды также могут быть исследованы в отношении их способности связываться непосредственно, после биотинилирования, с продуктами МНС класса II на антигенпредставляющих клетках соответствующих штаммов. Для этой цели проводят N-концевое биотинилиро-8 009465 вание соответствующих пептидов при 0C с избытком биотин-N-гидроксисукцинимида в водном растворе (Mozes et al., 1989). Мышиные селезеночные адгезивные клетки или PBL-адгезивные клетки(1106/образец) инкубируют с биотинилированными пептидами в PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (PBS/BSA), при 37C в течение 20 ч с последующей инкубацией с фикоэритринстрептавидином в течение 30 мин при 4C. После каждой инкубации клетки дважды промывают вышеупомянутым раствором. Затем клетки анализируют методом проточной цитометрии, используя FACScan. В каждом анализе минимально исследуют 5000 клеток (для вышеописанных способов см., например,Mozes et al., 1989). Другим тестом, который может быть проведен, является исследование способности пептидов ингибировать секрецию цитокинов линией Т-клеток, или Т-лимфоцитами, или клетками лимфатических узлов мышей, которые являются высокоотвечающими на SLE-индуцирующие аутоантитела организмами. Цитокины детектируют следующим образом. Активность IL-1 оценивают методом ELISA, используя пару ловушек и детектирующие антитела (как описано ниже для IL-4, IL-6, IL-10). IL-2 определяют непосредственно, используя IL-2-зависимую линию CTLL, или методом ELISA. Уровни IL-4, IL-6, IL-10,INF- и TNF- в супернатантах определяют методом ELISA, используя антитела к различным цитокинам(Pharmingen, San Diego, Ca., USA) в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, способность пептидов повышать уровень секреции иммуносупрессивного цитокина TGF- можно оценивать методом ELISA, как описано в нижеследующих примерах. Пептиды, тестирование которых оказалось позитивным в одном или более приведенных здесь тестов in vitro, обеспечат разумные ожидания активности in vivo. Однако исследования in vivo могут быть также проведены без чрезмерного экспериментирования. Так, например, взрослым мышам можно вводить с инъекцией пептид-кандидат или на -3 день, или на 0 день. Затем мышей иммунизуют индуцирующим заболевание аутоантителом или пептидом. Через 10 дней исследуют клетки лимфатических узлов мышей в отношении их способности пролифелировать в ответ на иммуноген для того, чтобы определить ингибиторную способность кандидата-пептида. Другой такой тест на животном in vivo заключается в определении терапевтической активности непосредственно на мышиной модели in vivo в отношении продукции SLE, как описано выше. Пептиды можно инъецировать мышам, у которых эксперимантальная SLE индуцирована различными способами при различных дозировках и разных временных схемах. Кроме того, подвергнутых лечению мышей можно периодически исследовать для того, чтобы определить влияние пептидов на ответные реакции на аутоантитела и проявления заболевания, вызванные у мышей аутоантителами, индуцирующими SLE. Следующий способ in vivo заключается в оценке способности кандидата-пептида оказывать лечебное действие на мышей, у которых спонтанно развивается SLE, например мышей (NZBNZW)F1, как описано в примерах. Таким образом, можно видеть, что, кроме предпочтительных аспектов, которые показаны как действующие в примерах настоящей заявки, каждый специалист в данной области сможет определить дополнительные аналоги, которые также будут работать, следуя общим указаниям настоящего описания без чрезмерного экспериментирования. В другом предпочтительном аспекте в данном изобретении представляют мультиэпитопный отдельный пептид, такой как двойной пептид. В одном аспекте двойной пептид состоит из двух различных пептидов, базирующихся на CDR, таких как два разных пептида, включающих последовательностьCDR1 (SEQ ID NO: 8) или CDR3 (SEQ ID NO: 10) тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id. В другом и более предпочтительном аспекте двойной пептид состоит из двух различных пептидов,каждый из которых базируется на CDR, таких как один пептид, включающий последовательность CDR1(SEQ ID NO: 8), а другой, включающий последовательность CDR3 (SEQ ID NO: 10) тяжелой цепи человеческого mAb 16/6-Id. Двойной пептид согласно настоящему изобретению предпочтительно состоит из двух различных пептидов, причем один является пептидом с SEQ ID NO: 11, а другой является пептидом с SEQ ID NO: 19,более предпочтительно один пептид выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 и NO: 12-18, а второй пептид выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7 и NO: 20-27, наиболее предпочтительно одним пептид является пептид с SEQ ID NO: 6, а другой пептид является пептидом с SEQ ID NO: 7, при этом два разных пептида являются ковалентно связанными друг с другом или непосредственно, или короткой связующей цепью, такой как участок из остатков аланина, или посредством предполагаемого сайта для протеолитического расщепления катепсином. См. относительно таких сайтов, например, патент США 5126249 и европейский патент 495049. В другом предпочтительном аспекте в данном изобретении предусматривают мультиэпитопный одиночный пептид, содержащий ряд одинаковых или разных пептидов данного изобретения в виде пептидного полимера, полученного, например, полимеризацией пептидов с помощью соответствующего полимеризирующего агента, такого как 0,1% глутаральдегид (Audibert et al., 1981, Nature 289: 593). Предпочтительно полимер может содержать от 5 до 20 пептидных остатков, предпочтительно пептид с SEQID NO: 6, 7 и 11-27. Такие пептидные полимеры также могут быть образованы поперечным сшиванием-9 009465 пептидов или присоединением многочисленных пептидов к макромолекулярным носителям. Подходящими макромолекулярными носителями являются, например, белки, такие как столбнячный анатоксин, и линейные или разветвленные сополимеры аминокислот, такие как линейный сополимер L-аланина, Lглутаминовой кислоты и L-лизина, и сополимер с разветвленной цепью L-тирозина, L-глутаминовой кислоты, L-аланина и L-лизина (T,G)-A-L-, или многоцепочечный поли-DL-аланин (M. Sela et al., 1955, J.Am. Chem. Soc. 77: 6175). Конъюгаты получают, например, сначала взаимодействием пептида с водорастворимым карбодиимидом, таким как 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид, а затем проведением сопряжения с макромолекулярным носителем, как описано Muller, G.M. et al. (1982),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 569. Содержание связанного пептида в каждом конъюгате определяют с помощью аминокислотного анализа по сравнению с составом одного носителя. Согласно следующему аспекту данного изобретения один или более активных пептидов могут быть присоединены к подходящему макромолекулярному носителю или могут быть полимеризованы в присутствии глутаральдегида. Пептиды, их полимеры или их конъюгаты с подходящими макромолекулярными носителями вводят пациентам в форме, которая обеспечивает их биодоступность, что делает их пригодными для лечения. Установлено, что, если более одного пептида настоящего изобретения проявляют значительную ингибиторную активность, эти пептиды можно давать пациентам в композиции, содержащей их смесь. Таким образом, настоящее изобретение еще относится к фармацевтическим композициям, содержащим по крайней мере один синтетический пептид или пептидный полимер согласно настоящему изобретению необязательно с фармацевтически приемлемым носителем. В одном предпочтительном аспекте фармацевтические композиции содержат по крайней мере один синтетический пептид настоящего изобретения, более предпочтительно пептид, выбранный из группы,состоящей из пептидов hCDR1 [SEQ ID NO: 6] и hCDR3 [SEQ ID NO: 7] и пептидов, полученных замещением и/или присоединением аминокислотных остатков к последовательностям hCDR1 и hCDR3, в частности пептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов с SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 18 иSEQ ID NO: 20 - SEQ ID NO: 27. Любой подходящий способ введения используют в настоящем изобретении, включая пероральный,внутривенный, подкожный, внутрисуставной, внутримышечный, ингаляционный, интраназальный, подоболочечный, внутрибрюшинный, внутрикожный, чрескожный или другие известные способы, включая энтеральный способ. В предпочтительных аспектах пептиды изобретения вводят пероральным, интраназальным или подкожным способами. Диапазоны доз для введения композиций данного изобретения должны быть достаточно большими,чтобы вызвать требуемый эффект, в результате которого, например, иммунный ответ на SLE-индуцирующие аутоантитела, который определяют по Т-клеточной пролиферации in vitro, по существу, предотвращается или ингибируется и, кроме того, при этом в значительной степени лечат заболевание. Дозы не должны быть такими большими, чтобы вызвать вредные побочные эффекты, такие как нежелательные перекрестные реакции, генерализованная иммуносупрессия, анафилактические реакции и тому подобное. Эффективные дозы пептидов данного изобретения для применения при лечении SLE находятся в области приблизительно от 1 мкг до 1 мг и вплоть до 100 мг/кг веса тела. Синтетические человеческие пептиды настоящего изобретения предназначены для ингибирования или ослабления ответов на специфические антигены у больных SLE, не затрагивая все другие иммунные реакции. Такой подход имеет наибольшее значение, так как большинство больных с установленным диагнозом являются молодыми женщинами, которых следует лечить в течение многих лет, а применяемая в настоящее время терапия SLE включает введение иммуносупрессивных агентов, таких как кортикостероиды и/или цитотоксические лекарственные средства, которые как являются неспецифическими, так и проявляют многочисленные вредные побочные эффекты. Далее изобретение также относится к способу лечения системной красной волчанки (SLE), предусматривающему введение больному SLE эффективного количества пептида или пептидного полимера настоящего изобретения. В одном предпочтительном аспекте способ предусматривает введение пептида с SEQ ID NO: 6. В другом предпочтительном аспекте способ предусматривает введение пептида с SEQID NO: 7. Кроме того, изобретение еще относится к способу иммуномодуляции ответных реакций, ассоциированных с SLE, у больных SLE, который предусматривает введение указанному больному SLE эффективного количества пептида или пептидного полимера настоящего изобретения. В одном аспекте способ предусматривает супрессивную регуляцию уровней активности матриксной металлопротеиназы (ММР)3 и/или ММР-9 у больного SLE. В другом аспекте способ предусматривает иммуномодулирование уровня активности цитокинов у больного SLE, в частности снижение уровня активности IL-2 и/или IFNи/или повышение уровня активности TGF- у больного SLE. В одном предпочтительном аспекте способ предусматривает введение пептида с SEQ ID NO: 6. В другом предпочтительном аспекте в способе предусматривают введение пептида с SEQ ID NO: 7. В изобретении также представлены способы оценки эффективности лекарственного средства при- 10009465 лечении больного SLE, которые включают определение в различные интервалы времени уровней ММР 3, ММР-9, IL-2, IFN- и/или TGF- в образце крови, полученном от указанного больного, которого лечат указанным лекарственным средством, причем сниженный уровень ММР-3, ММР-9, IL-2 и/или IFN- или повышенный уровень TGF- коррелирует с эффективностью лекарственного средства. Кроме того, изобретение относится к применению пептида или пептидного полимера настоящего изобретения для получения фармацевтической композиции, в частности, для лечения SLE, точнее для иммуномодулирования ответных реакций, ассоциированных с SLE, у больного SLE, такого как ингибирование ММР-3, и/или ММР-9, и/или IL-2, и/или IFN-, или повышения уровня TGF- у больного SLE. Далее данное изобретение будет описано более подробно в следующих неограничивающих описание примерах и сопровождающих фигурах. Примеры Материалы и методы Мыши. Самок мышей (NZBNZW)F1 получали из лаборатории Джексона (Jackson) (Bar Harbor, ME). Самок мышей BALB/с инбредной линии в возрасте 6-8 недель получали из Отдела экспериментальных животных Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel. Анти-ДНК моноклональное антитело. Человеческое анти-ДНК-mAb, которое имеет 16/6-Id (IgG1/k), ранее было охарактеризовано(Shoenfeld et al., 1982; Waisman et al., 1995). MAb секретировались клетками гибридомы, которые выращивали в культуре и очищали, используя колонку с протеин-G-сефарозой (Pharmacia, Fine Chemicals,Uppsala, Sweden). Синтетические пептиды. Синтетические мышиные пептиды mCDR1 (SEQ ID NO: 1) и mCDR3 (SEQ ID NO: 3), а также используемые в качестве контроля обратные пептиды, которые синтезировали в обратном порядке последовательностей mCDR1 и mCDR3 и в обратном порядке последовательности человеческого пептидаrevhCDR1 [SEQ ID NO: 30], соответственно, получали по описанному ранее способу (WO 96/30057) или с применением автоматического синтезатора (модель 430 А Applied Biosystems, Germany), используя протоколы компании для трет-бутилоксикарбонильного (t-Boc) способа. Обратные пептиды имели последовательности: Индукция и лечение экспериментальной SLE. Для того, чтобы индуцировать экспериментальную SLE, мышей BALB/c иммунизовали 1-2 мкг человеческого mAb 16/6-Id и повторно иммунизовали через 3 недели. Для предупреждения экспериментальнойSLE мышам внутривенно (в.в.) или подкожно (п.к.) вводили hCDR1 или hCDR3 (mCDR1 или revmCDR1 в качестве контрольного пептида в примере 12), одновременно с иммунизацией, а в дальнейшем вводили еженедельно в течение 5 недель. Лечение установленного заболевания начинали через 3,5 месяца после индукции заболевания посредством 16/6-Id, когда уже наблюдали клинические проявления. В примере 12 мыши получали 10 еженедельных инъекций (в.в. или п.к.) mCDR1 или revmCDR1 в дозе 100 мкг/мышь. Предупреждение и лечение SLE-подобного заболевания у мышей (NZBNXW)F1 пептидом hCDR1 или mCDR1. Для предупреждения SLE, прежде чем наблюдали проявления заболевания, мышам в возрасте 2 месяцев подкожно инъецировали hCDR1 (или mCDR1 в примере 12, 250 мкг/мышь) 1 раз в неделю в течение 10 недель. Для лечения установленного заболевания мышам в возрасте 5-7 месяцев инъецировалиPBL получали из гепаринизированной венозной крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-хайпакве (Pharmacia). Все анализы в трех повторах проводили в плоскодонных титрационных микропланшетах (Falcon, Becton Dickinson, Oxmard, CA, USA), в которых 2 х 105 PBL культивировали в обогащенной среде RPMI-1640, как описано (Dayan et al., 2000). PBL подвергали действию различных концентраций (0,1-40 мкг/лунку) человеческого анти-ДНК-mAb 16/6-Id с и без добавления различных пептидов, базирующихся на CDR, в концентрации по крайней мере 10-кратного избытка по сравнению с концентрацией 16/6-Id. В каждом эксперименте использовали фитогемагглютинин (РНА; 2 мкг/лунку) в качестве контроля для культуральных условий в каждом эксперименте. Культуры инкубировали в 7,5% CO2 при 37C в течение 6 дней. За 18 ч до сбора клеток во все культуры добавляли [3H]тимидин (0,5 мкКи 5 Ки/ммоль) (Nuclear Research Center, Negev, Israel). Результаты выражали как среднее включение тимидина в количестве импульсов в минуту (СРМ) от трех культур SD (стандартное отклонение) или как индекс стимуляции (S.I.; отношение среднего СРМ при оптимальной концентрации- 11009465 человеческого 16/6-Id к среднему СРМ в присутствии одной среды). S.I.2 рассматривали как позитивный ответ (Dayan et al., 2000). Ингибирование (отношение среднего СРМ в присутствии 16/6-Id и различных пептидов, базирующихся на CDR, к среднему СРМ в присутствии 16/6-Id и в отсутствие пептида,базирующегося на CDR) свыше 50% считали положительнымм. Индукция продукции цитокинов. Мышей, которых иммунизовали человеческим mAb 16/6-Id и или лечили, или не лечили пептидом,базирующимся на CDR, умерщвляли в различные периоды времени во время или после лечения пептидом. Спленоциты и клетки лимфотических узлов (LNC) собирали и инкубировали (5l06/мл) в присутствии 16/6-Id. Супернатанты собирали через 48 и 72 ч. Оценка цитокинов в супернатантах. Супернатанты собирали через 48 ч после начала культивирования и хранили при -70C. ОпределенияELISA. Вкратце, планшеты покрывали рекомбинатной человеческой TGF-1-sRII/Fc-химерой (RDSystems Inc., Minneapolis, MN, USA), а вторым использованным антителом было биотинилированное антитело к TGF-1 человека (RD Systems Inc.). TMB цветной реагент (Helix Diagnostics, West Sacramento,CA) использовали в качестве раствора субстрата и энзиматическую активность определяли, используя фильтры 570 и 630 нм. Определение клинических и патологических проявлений, ассоциированных с SLE. Протеинурию определяли полуколичественным методом, используя набор Combistix (Ames Division,Bayer Diagnostics, Newbury, U.K.). Лейкоциты (WBC, относительно лейкопении) считали после 10-кратного разведения гепаринизированной крови дистиллированной водой, содержащей 1% уксусную кислоту(об./об.). Для иммуногистологического анализа замороженные почечные срезы (6 мкм) фиксировали и окрашивали с помощью FITC-конъюгированных Ab козы к мышиному IgG (специфические к -цепи; Sigma).ELISA. Для определения анти-ДНК-Ab 96-луночные титрационные микропланшеты Maxisorb (Nunc) покрывали или метилированным BSA, или поли-L-лизином (Sigma). Затем планшеты промывали и покрывали, или 10 мкг/мл денатурированной ДНК тимуса теленка (Sigma), или двухцепочечной ДНК -фага(Boehringer Mannhein, 5 мкг/мл). После инкубации с различными разведениями сывороток в планшеты добавляли антимышиные IgG козы (специфические к -цепи), конъюгированные с пероксидазой хрена(Jackson ImmunoResearch), с последующим добавлением субстрата, 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6 сульфоновой кислоты) (Sigma). Результаты считывали, используя ELISA-ридер. Определение активности ММР-2 и ММР-9. Активность ММР тестировали методом зимографии с желатином. Объединенные сыворотки индивидуальных мышей из различных экспериментальных групп разделяли методом электрофореза в 8% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (8% SDS-PAGE) с полимеризованным желатином, 1 мг/мл. После электрофореза гели промывали 1 раз в течение 30 мин 2,5% Тритоном Х-100, чтобы удалить SDS, и 1 раз в течение 30 мин реакционным буфером, содержащим 50 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2 и 0,02% (мас./об.) Brij 35 (рН 7,5). Использованный реакционный буфер заменяли на свежий и гели инкубировали при 37C в течение 24 ч. Желатинолитическую активность выявляли окрашиванием гелей 0,5% кумасси бриллиантовым голубым. Анализ ММР-3 в сыворотке методом Вестерн-блоттинга. Образцы по 5 мкл каждой сыворотки наносили на 12% SDS/ПААГ, разделяли при восстанавливающих условиях и переносили на нитроцеллюлозу. Блоты зондировали (0,5 мкг/мл, 1 ч, при комнатной температуре) анти-ММР-3-антителами (Oncogene Research Products, MA, USA) и проявляли, используя хемилюминесценцию. Иммуноокрашивание почечных срезов на ММР-3 или ММР-9. Для иммуноокрашивания ММР-3 или ММР-9 срезы почек (5 мкм) фиксировали холодным ацетоном(5 мин при комнатной температуре), дважды промывали в PBS, пропитывали (1 мин при комнатной температуре) 0,05% Тритоном Х-100 (разведенным PBS) и дважды промывали в PBS. Для того, чтобы получить специфическое анти-ММР-окрашивание и избежать окрашивания отложений иммунных комплексовFITC-меченными антимышиными IgG козы, срезы почек блокировали (1 ч при комнатной температуре) немечеными антимышиными IgG+IgM козы (разведенными 1:1 1% BSA/PBS; Jackson ImmunoResearchChemicon International, Inc.) или анти-ММР-3 (1:50; Oncogene Research Products) антитела, разведенные в 1% BSA/PBS, добавляли и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Для всех процедур иммуноокрашивания использовали FITC-меченные антимышиные IgG+IgM козы (Jackson ImmunoResearchLaboratories), разведенные 1:30 в 1% BSA/PBS (30 мин при комнатной температуре). Статистический анализ. Результаты представлены как среднее SD (стандартное отклонение). Для статистического анализа использовали Хи-квадрат, критерии Вилкоксона (Wilcoxon), Манна-Уитни (Mann-Whitney) и t-критерии.- 12009465 Р 0,05 рассматривали как значимый. Пример 1. Синтез человеческих пептидов hCDR1 и hCDR3. Пептиды человека hCDR1 (SEQ ID NO: 1) и hCDR3 (SEQ ID NO: 3) получали по способам, хорошо известным в данной области, например посредством химического твердофазного синтеза или синтеза в сольвентной фазе, применяя автоматический синтезатор и используя протоколы производителя для методик для трет-бутилоксикарбонильной (t-Boc), фторенилметоксикарбонильной (Fmoc) или других альфааминокислотных защитных групп, по существу, как описано (см., например, Peptides: Synthesis, Structuresynthesis. Rapid, high yield assembly of difficult sequences. Int. J. Pept. Protein Res. 40: 180-193, 1992). Пример 2. In vivo ингибирование пролиферации клеток лимфатических узлов (LNC) мышей, иммунизованных mCDR1 и mCDR3 и подвергнутых лечению hCDR1 и hCDR3. Для определения ингибиторной эффективности человеческих пептидов hCDR1 и hCDR3 сначала тестировали их способность ингибировать in vivo сенсибилизацию мышей к мышиным пептидам mCDR1 и mCDR3. Для этой цели мышей BALB/c и SJL иммунизовали mCDR1 и mCDR3, соответственно. Иммунизующие мышиные пептиды (10 мкг/мышь) в CFA инъецировали внутрикожно в подошву ступней задних конечностей. Совместно с иммунизацией группам мышей BALB/c вводили подкожно (п.к.) 200 мкгhCDR1 в PBS, а группам мышей SJL аналогично вводили hCDR3. Через 10 дней после иммунизации мышей умерщвляли и извлекали их лимфатические узлы, а клетки исследовали в отношении их способности пролиферировать после стимулирования иммунизующими пептидами. Кратко, LNC иммунизованных мышей (0,5l06/лунку) культивировали (в трех повторах) в присутствии различных концентраций (120 мкг/лунку) мышиных иммунизующих пептидов в обогащенной среде RPMI-1640, дополненной 1% нормальной мышиной сывороткой. После 4 дней инкубации добавляли 3H-тимидин и инкубировали в течение дополнительных 16 ч. Затем клетки собирали и считали радиоактивность, используя -счетчик. Результаты в табл. 1A и 1 В представляют максимальный % ингибирования пролиферации LNC мышей, иммунизованных mCDR1 и mCDR3 и подвергнутых лечению hCDR1 и hCDR3, соответственно. Ингибирование рассчитывали, базируясь на пролиферации LNC мышей, которых не лечили ингибиторными пептидами hCDR1 и hCDR3. Можно видеть, что hCDR1 и hCDR3 оказались способыми ингибировать пролиферативные ответные реакции на иммунизующие мышиные пептиды CDR. Таблица 1 А Ингибирование посредством hCDR1 mCDR1-индуцированной пролиферации LNC,полученных от мышей BALB/с Пример 3. In vivo ингибирование пролиферации LNC мышей, иммунизованных человеческим антиДНК-mAb 16/6-Id и подвергнутых лечению hCDR1 и hCDR3. Так как целью работы было исследование ингибиторной способности пептидов, базирующихся на последовательности CDR человеческого аутоантитела с 16/6-Id, оказалось важным выяснить, способны ли пептиды hCDR1 и hCDR3 ингибировать сенсибилизацию к целой молекуле человеческого mAb 16/6Id. С этой целью мышей BALB/c и SJL примировали человеческим mAb 16/6-Id (2 мкг/мышь) в CFA внутрикожно в подошвы ступней задних конечностей. Примирование производили одновременно с подкожным введением 200 мкг/мышь hCDR1 в PBS группам мышей BALB/c и hCDR3-мышам SJL. Через 10 дней после иммунизации мышей умерщвляли и in vitro исследовали способность их LNC пролиферировать на различные концентрации (0,1-10 мкг/лунку) человеческого анти-ДНК-mAb 16/6-Id. Характерные результаты описанных экспериментов представлены в табл. 2 А и 2 В. Результаты представляли как максимальный % ингибирования пролиферации на иммунизующие человеческие mAb 16/6-Id клеток лимфатических узлов мышей, иммунизованных и подвергнутых леченнию пептидамиhCDR1 и hCDR3, по сравнению с мышами, которых иммунизовали 16/6-Id-mAb, но не лечили пептидами. Как можно видеть, оба пептида hCDR1 и hCDR3 оказались способными эффективно ингибировать сенсибилизацию к человеческому mAb 16/6-Id. Дальнейшие эксперименты продемонстрировали, что назальное введение 10 или даже 2 мкг/мышь пептида hCDR1 или hCDR3 одновременно с иммунизацией человеческим mAb 16/6-Id ингибировало вплоть до 100% пролиферативных ответных реакций клеток лимфатических узлов на иммунизующее антитело. В другом эксперименте мышей BALB/c иммунизовали 1 мкг человеческого 16/6-Id в CFA внутрикожно в подошвы ступней задних конечностей и или вводили подкожно 300 мкг/мышь hCDR1 в PBS,или в дальнейшем не лечили. Через 10 дней мышей умерщвляли, а их LNC исследовали в отношении их способности пролиферировать в ответ на человеческие 16/6-Id in vitro. Так, подколенные LNC (0,5106) инкубировали в присутствии различных концентраций (0,1-10 мкг/лунку) человеческих анти-ДНК-mAb 16/6-Id. В конце 4 дня инкубации в культуры добавляли 3H-тимидин и инкубировали в течение последних 18 ч инкубации. Затем клетки собирали и считали радиоактивность. На фиг. 1 представлены результаты описанных экспериментов и показано, что hCDR1 эффективно ингибировал пролиферативные ответные реакции клеток лимфатических узлов подвергнутых лечению мышей. % ингибирования пролиферации на различные концентрации 16/6-Id-mAb оказался следующим: 0,1 мкг/лунку - 47%; 1 мкг/лунку - 66%; 5 мкг/лунку - 76% и 10 мкг/лунку - 62%. Такой же эксперимент, как вышеописанный, повторяли с 50 мкг hCDR1/мышь в PBS. На фиг. 2 показано, что hCDR1 оказался очень эффективным при ингибировании in vivo сенсибилизации мышей к целой анти-ДНК-16/6-Id-макромолекуле и даже подкожное введение 50 мкг hCDR1 значительно ингибировало способность клеток лимфатических узлов пролиферировать на 16/6-Id-аутоантитела. % ингибирования пролиферации на различные концентрации 16/6-Id-mAb оказался следующим: 0,1 мкг/лунку 98%; 1 мкг/лунку - 76%; 5 мкг/лунку - 73% и 10 мкг/лунку - 64%. Пример 4. Пептид hCDR1 иммуномодулирует продукцию цитокинов. Клетки лимфатических узлов мышей BALB/с, подвергнутых лечению 50 мкг hCDR1 примера 3,также стимулировали человеческим mAb 16/6-Id, чтобы вызвать продукцию цитокинов, и в супернатантах исследовали секрецию цитокинов (INF-, TGF- и IL-10) методом ELISA. На фиг. 3 представлены результаты характерного эксперимента. Можно видеть, что hCDR1 ингибировал продукцию INF- (фиг. 3 А) и активировал секрецию TGF- (фиг. 3 В) и IL-10 (фиг. 3 С). Следует отметить, что пептид, который использовали в качестве контроля (р 259-271, который, как было показано,является миастеногенным пептидом), по существу, не оказывал влияния на продукцию INF- и IL-10 и был менее эффективным в активировании TGF-. Пример 5. Пептиды hCDR1 и hCDR3 ингибируют пролиферативный ответ PBL больных SLE на человеческие mAb 16/6-Id. 62 пациента, 9 мужчин (14,5%) и 53 женщины (85,5%), с SLE участвовали в данном эксперименте. Средний возраст при установлении диагноза составлял 32,9512,92 года (диапазон 12-61), а средний период наблюдения составлял 10,9810,76 лет (диапазон 1-32). Все пациенты соответствовали по крайней мере 4 установленным диагностическим критериям для SLE American College Rheumatology (ACR) (Tanet al., 1982). Пациентов комплектовали из трех медицинских центров Израиля (Kaplan, Rehovot; Ichilov,Tel Aviv; Asaf-Harofeh, Rishon Lezion). Активность заболевания определяли в соответствии с индексом активности волчанки SLEDAI (Bombardier et al., 1992). Контрольную группу из 36 здоровых волонтеров,подобранных по полу и возрасту, исследовали одновременно с больными SLE. Исследование одобрено Комитетом по этике Медицинского центра. Оказалось интересным исследовать, способны ли пептиды hCDR1 и hCDR3, которые базируются на последовательности CDR1 и CDR3 человеческого mAb 16/6-Id, ингибировать специфические пролиферативные ответные реакции PBL больных SLE на человеческий mAb 16/6-Id. Для этой цели сначала идентифицировали пациентов, PBL которых могут быть стимулированы к пролиферации посредством человеческого mAb 16/6-Id (респондеры).- 14009465 Поэтому PBL от 62 наблюдаемых больных SLE культивировали в присутствии человеческого 16/6Id и определяли их пролиферативные ответы и способность секретировать IL-2. PBL от 24 из протестированных 62 (39%) и 23 из протестированных 55 (42%) больных SLE отвечали пролиферацией (SI2,диапазон 2-5,6) и секрецией IL-2 (SI2, диапазон 2-60), соответственно. Частота респондеров в группе больных SLE оказалась ниже, чем частота респондеров, наблюдаемая в группе здоровых доноров, которых тестировали в качестве контрольных субъектов. Так, PBL от 21 из протестированных 36 (58%) здоровых доноров отвечали пролиферацией на 16/6-Id. Степень пролиферации (уровни SI) оказалась схожей для больных SLE и для здоровых контролей, которые отвечали на 16/6-Id. Однако, как показано на фиг. 4,оптимальную ответную реакцию PBL здоровых доноров на 16/6-Id наблюдали при более высоких концентрациях 16/6-Id по сравнению с PBL больных SLE. Никаких различий не удалось продемонстрировать в зависимости от пола и возраста между больными SLE, которые отвечали на 16/6-Id, и группой больных, которые не проявляли ответной реакции. Однако больные, PBL которых пролиферировали в ответ на 16/6-Id, оказались пациентами, которые болели в течение более короткого периода времени (среднее значение 9,788,36 против 11,7312,06 лет для респондеров и нереспондеров, соответственно, Р 0,036). В табл. 3 суммированы клинические характеристики групп больных SLE-(16/6-Id-респондеров) и нереспондеров. Как можно видеть из таблицы, обе группы оказались похожими по многим клиническим проявлениям, связанным с SLE. Показатель активности заболевания SLE (SLEDAI) и количество диагностических критериев SLE также были подобными для двух групп. Тем не менее, более высокую частоту неврологических (как эпилептических припадков,так и психозов) и гематологических поражений и более низкую степень поражений почек отмечали у группы больных-респондеров по сравнению с группой нереспондеров. Однако, вероятно, из-за низкого количества больных в соответствующих подгруппах вышеупомянутые различия не достигали статистической значимости. Кроме того, относительно меньше пациентов-респондеров обнаружили среди пациентов, подвергнутых лечению стероидами или цитотоксическими агентами во время исследования. Заслуживает внимания то, что значительно больше пациентов, которые никогда не получали стероиды,отвечали на 16/6-Id по сравнению с группой нереспондеров (54% против 21%; Р=0,023). Заслуживает внимания то, что способность пептидов, базирующихся на CDR, ингибировать пролиферативные ответные реакции PBL здоровых доноров на 16/6-Id оказалась значительно ниже, чем способность, наблюдаемая для PBL больных SLE (не показано). Таблица 3 Клиническая и лабораторная характеристика больных SLE А. Диагностические критерии. Клиническое поражение определяли согласно установленным критериям ACR. Антинуклеарные антитела (ANA) и анти-дцДНК-антитела определяли посредством клеток Hep2 и Crithidia luciliae, соответственно. Антифосфолипидные антитела (APLA) выявляли как реактивность в одном или более из следующих исследований: ошибочно положительного VDRL, волчаночного антикоагулянта (LAC) илиELISA для антикардиолипиновых антител.Противомалярийный агент, гидроксихлорохин, использовали в дозе 200-400 мг/день; стероидную терапию определяли как ежедневную дозу 5 мг преднизона; используемыми цитотоксическими агентами были циклофосфамид (0,75-1,0 г/м 2, ежемесячно) или азатиоприн (100-150 мг/день).Параметры, для которых наблюдали тенденцию к различиям между двумя группами больныхSLE-респондеров и нереспондеров. Для исследования способности пептидов hCDR1 и hCDR3 ингибировать пролиферативный ответPBL больных SLE на человеческое mAb 16/6-Id, PBL (2l05/лунку) больных SLE стимулировали in vitro с тремя повторами различными концентрациями (0,1-20 мкг/лунку) человеческого mAb 16/6-Id в отсутствие или в присутствии пептидов hCDR1 и hCDR3 (или 50 или 100 мкг/лунку). После 6 дней инкубации в каждую лунку добавляли 3H-тимидин (0,5 мкКи 5 Ки/ммоль) и инкубировали дополнительные 18 ч. Затем клетки собирали и радиоактивность считали, используя -счетчик. Результаты представляли как среднее количество импульсов в минуту (cpm) из культур от трех экспериментов. Затем рассчитывали индекс стимулирования (отношение среднего cpm при оптимальной концентрации 16/6-Id к среднемуcpm без 16/6-Id). Индекс стимулирования (SI)2 считали позитивным. Обнаружено, что PBL от 24 из всех 62 (39%) больных SLE давали пролифериративный ответ на 16/6-Id-mAb. Способность пептидов hCDR1 и hCDR3 ингибировать пролиферативные ответные реакции на целую молекулу 16/6-Id-аутоантител тестировали на PBL от 19 респондеров-больных SLE. В табл. 4 представлены результаты описанных экспериментов. Ингибирование свыше 50% пролиферативной способности считали позитивным. В таблице представлена наивысшая позитивная ингибиторная способность для каждого пептида. Можно видеть, что человеческие hCDR1 и hCDR3 ингибировали пролиферацию PBL 16/19 (84,2%) и 15/19 (78,9%), соответственно, из 19 протестированных респондеров. Оба пептида ингибировали пролиферацию PBL 18/19 (95%) протестированных респондеров. Также из таблицы видно, что величины ингибирования были подобными для обоих пептидов. Таким образом, можно заключить, что пептиды, базирующиеся на последовательности CDR1 и CDR3 человеческогоmAb 16/6-Id, являются эффективными ингибиторами пролиферации PBL больных SLE в ответ на человеческий mAb 16/6-Id. Пример 6. Специфичность ингибиторной способности hCDR1 и hCDR3. Оказалось важным продемонстрировать, что ингибиторное действие пептидов, базирующихся наhCDR, является специфичным относительно ответных реакций, ассоциированных с SLE. Для этой цели пептиды hCDR1 или hCDR3 добавляли к культурам PBL больных SLE, которых стимулировали митогенным фитогемагглютинином (РНА, 2 мкг/мл). Результаты такого эксперимента, проведенного с PBL одного больного SLE, представлены на фиг. 5. Пептиды hCDR1 и hCDR3 не могли ингибировать пролиферативные ответы (выраженные в cpm) PBL на митогенный РНА, а пролиферативные ответные реакции были одинаково высокими в отсутствие (черные столбцы) или в присутствии или hCDR1, или hCDR3. В другом эксперименте культуры PBL больных SLE стимулировали человеческим mAb 16/6-Id, а затем инкубировали с человеческими пептидами hCDR1 или hCDR3 или с мышиным пептидом mCDR3 в качестве контроля. Результаты такого эксперимента, проведенного с PBL одного больного SLE, представлены на фиг. 6. Как показано на фиг. 6, в то время, как оба пептида hCDR1 и hCDR3, базирующихся на последовательности человеческого аутоантитела, эффективно ингибировали пролиферативные ответыPBL на человеческое mAb 16/6-Id, пептид mCDR1, базирующийся на CDR3 мышиного антитела, не ингибировал пролиферацию. В описываемых экспериментах использовали два дополнительных контрольных пептида, а именно пептиды, синтезированные в обратном порядке последовательности мышиных пептидов mCDR1 иmCDR3 (revmCDR1 и revmCDR3), и результаты представлены на фиг. 7. Можно видеть, что два обратных пептида не могли значительно ингибировать пролиферативные ответные реакции PBL больного SLE на человеческое mAb 16/6-Id, в то время, как пептиды hCDR1 и hCDR3 эффективно ингибировали пролиферацию, демонстрируя, что ингибирование пролиферации человеческими пептидами, базирующимися на hCDR, является специфическим к пептидам и к SLE-ассоциированным ответным реакциям Т-клеток. Пример 7. Супрессивная регуляция секреции IL-2 PBL больных SLE в присутствии пептидовhCDR1 и hCDR3. Оказалось интересным установить, способны ли пептиды hCDR ингибировать секрецию IL-2 PBL больных SLE после стимулирования человеческим mAb 16/6-Id. Такое ингибирование также может означать, что человеческие пептиды, базирующиеся на CDR, ингибируют пролиферативные ответные реак- 17009465 ции на 16/6-Id-mAb, по крайней мере, частично в результате супрессивной регуляции секреции IL-2. Для этой цели PBL больных SLE инкубировали с человеческими mAb 16/6-Id в отсутствие или в присутствииhCDR1 или hCDR3. Супернатанты культур собирали после 48 ч инкубации. Проводили исследования,чтобы установить уровни IL-2 в супернатантах, используя IL-2-зависимую линию CTLL. Кратко, клетки линии CTLL (2l04/лунку) инкубировали в присутствии различных супернатантов в течение 24 ч с последующим добавлением 3H-тимидина и инкубировали в течение дополнительных 18 ч. Затем клетки собирали и радиоактивность считали, используя -счетчик. Результаты вычисляли на основании рекомбинантного IL-2 человека, использованного в качестве стандарта. Исследовали способность пептидов ингибировать секрецию IL-2 PBL от 23 респондеров, стимулированных человеческим 16/6-Id. Суммированные в табл. 5 результаты показывают, что hCDR1 и hCDR3 ингибировали секрецию IL-2 PBL пациентов 21/23 и 19/23, соответственно. Ингибирование пролиферативных ответных реакций PBL прямо коррелировало с ингибированием IL-2 пептидами, базирующимися на CDR. Таким образом, ингибирование секреции IL-2 наблюдали во всех случаях, где определяли ингибирование пролиферации. Результаты, полученные с PBL одного больного SLE, представленные на фиг. 8 (секрецию IL-2 выражали в пг/мл), показали, что как hCDR1, так и hCDR3 ингибировали на 100% секрецию IL-2 PBL больного SLE, стимулированного человеческим mAb 16/6-Id. Таблица 5 Ингибирование секреции IL-2 посредством hCDR1 и hCDR3 Секрецию IL-2 в присутствии одного 16/6-Id рассматривали как 100%. Ингибирование на 50% или более рассматривали как значимое. Пример 8. Активация секреции иммуносупрессивного цитокина TGF- пептидами, базирующимися на CDR. В попытке пролить свет на механизмы, посредством которых пептиды, базирующиеся на последовательности CDR, ингибируют пролиферативные ответные реакции на человеческое моноклональное анти-ДНК-антитело 16/6-Id, определяли уровни иммуносупрессивного цитокина TGF- в супернатантах клеточных культур. Рациональное обоснование этих экспериментов базируется на предварительных данных о повышенных уровнях TGF- в культурах спленоцитов мышей с SLE, или индуцированной человеческим анти-ДНК-mAb 16/6-Id, или спонтанной мыши (NZBNZW)F1, после лечения пептидами, базирующимися на последовательности CDR мыши (Eilat et al., 2000). Повышение уровней TGF- коррелировало со снижением интенсивности проявлений заболевания у подвергнутых лечению мышей. Для этой цели супернатанты удаляли из культур PBL разных больных SLE после 48 ч инкубации с человеческим mAb 16/6-Id в отсутствие или в присутствии пептидов hCDR1 или hCDR3. TGF- определяли методом ELISA согласно инструкциям производителя. Вкратце, планшеты Maxisorb (Nunc) покрывали рекомбинантной человеческой TGFsRII/Fc-химерой (RD Systems), разведеннсй PBS (100 нг/мл). После блокирования добавляли клеточный супернатант. После 18 ч инкубации добавляли детектирующие биотинилированные античеловеческие TGFантитела (RD Systems). Используемый раствор субстрата представлял собой цветной реагент ТМВ (Helix Diagnostics), а энзиматическую активность оценивали с помощью ридера MRX ELISA, используя фильтры 570 и 630 нм. Результаты суммированы в табл. 6. Результаты, представленные на фиг. 9, демонстрируют, что пептиды hCDR1 и hCDR3 стимулировали значительное повышение уровня регуляции секреции TGF- (выраженную в пг/мл) PBL от одного репрезентативного больного SLE, которые стимулировали патогенным человеческим mAb 16/6-Id. Таблица 6 Повышение секреции TGF- PBL больных SLE после 16/6-Id-индуцированной стимуляции пептидами hCDR1 и hCDR3- 18009465 Секрецию TGF- в присутствии одного 16/6-Id (среднее значение 63625 пг/мл) рассматривали как 100%. Результаты выражали как процент секреции свыше секреции в присутствии одного 16/6-Id. Пример 9. Иммуномодуляция симптомов SLE у мышей посредством hCDR1: уменьшение интенсивности проявлений заболевания после лечения мышей (NZBNZW)F1 с помощью hCDR1. Как было показано выше, пептиды, базирующиеся на последовательности CDR человеческого антиДНК-mAb 16/6-Id, были способны ингибировать сенсибилизацию клеток лимфатических узлов к 16/6-IdmAb и пролиферативные ответные реакции PBL больных SLE на 16/6-Id-mAb с одинаковой эффективностью. Таким образом, оказалось целесообразным установить, могут ли названные пептиды иммуномодулировать SLE-подобное заболевание на животных моделях. Эксперименты, имеющие целью выяснение способности человеческих пептидов лечить установленное заболевание SLE, проводили сначала с пептидом hCDR1. Для этой цели были предназначены несколько экспериментов, в которых предрасположенных к SLE мышей (NZBNZW)F1 в возрасте 5,5 месяцев лечили пептидом hCDR1, когда уже наблюдали проявления SLE-подобного заболевания (антидцДНК, протеинурию и т.д.). Пептид hCDR1 вводили в PBS подкожно еженедельно в течение 10 недель. Исследовали эффективность различных доз (50, 100 и 200 мкг/мышь) пептида hCDR1. Контрольным группам вводили носитель - PBS. Лечение приводило к умеренному снижению титров анти-дцДНК-аутоантител. Таким образом, при разведениях сывороток 1:1250 в конце лечения были определены значенияO.D. 0,5860,1, 0,270,1, 0,370,1 и 0,290,1 для сывороток обработанных PBS мышей, мышей, подвергнутых лечению 50 мкг/мышь, 100 мкг/мышь и 200 мкг/мышь hCDR1, соответственно. Проведен другой эксперимент, в котором мышей (NZBNZW)F1 в возрасте 7 месяцев лечили еженедельно в течение 10 недель 300 мкг hCDR1, который вводили подкожно в PBS. Слабое снижение титров анти-ДНК-антител можно было наблюдать в сыворотках мышей, подвергнутых лечению hCDR1. Тем не менее, в табл. 7 показано, что лечение hCDR1 приводило к снижению протеинурии и к значительному уменьшению отложений иммунных комплексов (ICD) в почках подвергнутых лечению мышей. Результаты в таблице отражают интенсивность ICD, где 0=отсутствию ICD; 1=умеренному ICD; 2=тяжелому ICD и 3=тяжелому и очень интенсивному ICD. Таблица 7 Клинические проявления у мышей (NZBNZW)F1, подвергнутых лечению hCDR1, в возрасте 7 месяцев р вычисляли по сравнению с не подвергнутой лечению группой мышей. Затем проводили дополнительный эксперимент, используя 400 мкг/мышь hCDR1, чтобы установить, можно ли достигнуть более благоприятного действия в результате увеличения дозы пептида. Лечение 400 мкг/мышьhCDR1 не оказывало большего воздействия на титры анти-ДНК-антител, и, как можно видеть из табл. 8,влияние на заболевание почек оказалось подобным влиянию, наблюдаемому после лечения дозой 300 мкг. Таблица 8 Клинические проявления у мышей (NZBNZW)F1, подвергнутых лечению hCDR1, в возрасте 6 месяцев р вычисляли по сравнению с не подвергнутой лечению группой мышей. Поэтому проводили дополнительный эксперимент, при котором мышей лечили 300 мкг hCDR1 в возрасте 7 месяцев и использовали контрольный пептид, а именно обратный hCDR1. Цель эксперимента заключалась в выяснении, модулирует ли лечение hCDR1 продукцию цитокинов в дополнение к снижению интенсивности клинических проявлений. На фиг. 10 продемонстрировано умеренное снижение уровней анти-ДНК-аутоантител. В табл. 9 показан уровень протеинурии, определенный в различные периоды времени. Эффект лечения hCDR1 можно видеть по всем параметрам. Поражение почек является одним из главных проявлений SLE-подобного заболевания у мышей (NZBNZW)F1. Десятинедельное лечение пептидом hCDR1 значительно уменьшало поражение почек. При лечении заболевания почек доза 50 мкг оказалась менее эффективной, чем дозы 100 и 200 мкг. Последние две дозы были одинаково эффективными. Фиг. 11 А-11D являются фотографиями, изображающими репрезентативные срезы почек мышей,подвергнутых лечению дозой 100 мкг hCDR1. Так, мышей в возрасте 9 месяцев умерщвляли, а их почки удаляли и немедленно замораживали в жидком азоте. Замороженные, сделанные на криостате срезы, 5 мкм,высушивали на воздухе и фиксировали в ацетоне. Для определения отложений Ig срезы инкубировали сFITC-конъгированными антимышиными IgG козы (специфичными к -цепи). На фиг. 11 А и 11 В представлены срезы почек мыши из группы, обработанной PBS (контроль), тогда как на фиг. 11 С и 11D представлены срезы почек мыши, подвергнутых лечению 100 мкг hCDR1. На фигурах можно видеть, что лечение снижало количество иммунных комплексов, а также их интенсивность (11 А, 11C100; 11 В, 11D400). Подобные результаты получали, если группы мышей (NZBNZW)F1 лечили hCDR1 в возрасте 7 месяцев, когда уже наблюдали их вполне проявившееся заболевание. Мышей лечили в течение 10 недель или 100 мкг/мышь, или 300 мкг/мышь. Лечение обеими дозами приводило к умеренному снижению титров антиДНК-аутоантител, подобно вышеописанным результатам. Также определяли снижение протеинурии по сравнению с группой, подвергнутой воздействию PBS. После лечения обеими дозами происходило снижение интенсивности заболевания почек; однако, более значительный эффект наблюдали в группе мышей, подвергнутых лечению дозой 300 мкг. На фиг. 12 А-12F изображены характерные срезы почек из каждой группы, где А, В представляют не подвергнутую лечению мышь; С, D представляют почки мыши, подвергнутой лечениюhCDR1, и Е, F - срез почки мыши, подвергнутый воздействию обратного hCDR1. А, С, Е 100 и В, D, F400. На фиг. 13 А-13 С показан уровень цитокинов (INF-, IL-10 и TGF-), который определяли методомELISA в супернатантах Con A-стимулированных культур спленоцитов мышей из 3 групп, взятых в конце лечения (10 недель подкожных инъекций). Можно видеть, что уровни INF- (фиг. 13 А) и IL-10 (фиг. 13 В,в меньшей степени) снижались у подвергнутых лечению мышей. Повышенную секрецию TGF- можно было наблюдать в супернатантах не стимулированных клеток (фиг. 13 С, левый). Con А не стимулировал клетки к большей секреции TGF- (фиг. 13 С, правый). Суммированные выше результаты указывают, что продолжительное лечение hCDR1 снижает интенсивность проявлений заболевания и иммуномодулирует секрецию цитокинов. Пример 10. Лечение мышей BALB/c человеческим пептидом hCDR1 после индукции экспериментальной SLE. Оказалось интересным выяснить, способен ли пептид hCDR1 вылечивать экспериментальную SLE,индуцированную у мышей человеческим анти-ДНК-mAb 16/6-Id. Поэтому мышей BALB/c иммунизовали и проводили повторную иммунизацию патогенными 16/6-Id-аутоантителами. Через 3,5 месяца после повторной иммунизации, когда у мышей уже появлялись симптомы заболевания, мышей делили на 3 группы. Одну группу не лечили, вторую группу лечили 100 мкг/мышь hCDR1 и третью группу лечили 300 мкг/мышь пептида hCDR1 в течение 10 недель. Следили за проявлениями заболевания у мышей. В табл. 10 представлены результаты, полученные при тестировании индивидуальных мышей в конце лечения. Наблюдали снижение интенсивности для всех определенных клинических показателей в случае обеих доз, использованных для лечения [анти-дцДНК-аутоантитела, количество лейкоцитов (WBC) и белок мочи]. Анализ почек мышей, умерщвленных в конце эксперимента (7 месяцев после бустер-инъекций) продемонстрировал отложения иммунных комплексов в почках 9/10 мышей, которых иммунизировали- 20009465 посредством 16/6-Id-mAb и не подвергали лечению. В противоположность этому, отложения иммунных комплексов обнаружили в почках только 3/10 и 2/9 мышей, которых иммунизировали посредством 16/6Id-mAb и подвергали лечению 100 и 300 мкг/мышь hCDR1, соответственно. Таким образом, показано,что человеческий пептид hCDR1 способен излечивать вполне развившуюся экспериментальную SLE. Таблица 10 Эффект лечения пептидом hCDR1, 100 или 300 мкг, мышей BALB/C, пораженных экспериментальной SLE=значительно отличаются (р 0,05) от группы, которой вводили 16/6-Id. В другом эксперименте мышей BALB/c иммунизировали и проводили бустер-иммунизацию человеческими 16/6-Id для индукции экспериментальной SLE. Через 2 месяца после бустер-иммунизации мышей разделяли на 2 группы (8 мышей на группу). Мышей лечили 200, 300 или 400 мкг/мышь в течение 10 недель. У мышей наблюдали за продукцией антител, лейкопенией, протеинурией, а после умерщвления мышей через 2 месяца после окончания лечения в их почках исследовали отложения иммунных комплексов. Результаты, суммированные в табл. 11, не показали никакого влияния лечения на 16/6-Id-специфический антительный ответ. Таблица 11 Влияние лечения мышей BALB/c, пораженных экспериментальной SLE, 200, 300 или 400 мкг пептида hCDR1 Однако лечение оказывало влияние на титры анти-ДНК-антител, лейкопению, уровни протеинурии- 21009465 и, что более важно, на отложения иммунных комплексов в почках. Контрольной группой в эксперименте были мыши BALB/c того же самого возраста, что и мыши, которых не иммунизовали или не лечили вообще. Описанный эксперимент означает, что hCDR1 эффективен при лечении экспериментальной SLE и что не наблюдается никаких преимуществ дозы 400 мкг. Поэтому проводили дополнительный эксперимент, в котором мышей лечили 200 и 300 мкг/мышь. Использованным в данном эксперименте контрольным пептидом был обратный hCDR1. Цель этого эксперимента, кроме сравнения между 200 и 300 мкг дозами лечения, заключалась в изучении влияния лечения на продукцию цитокинов у подвергнутых лечению мышей. 60 мышей BALB/c иммунизовали и реиммунизовали посредством 16/6-Id. Через 3 месяца после реиммунизации мышей разделяли на группы(15 мышей на группу), которые или в дальнейшем не лечили, или еженедельно лечили 200 или 300 мкгhCDR1. Дополнительную группу лечили 300 мкг обратного hCDR1. Пятую группу (контроль) не иммунизовали и в дальнейшем не лечили. Наблюдали за продукцией антител и проявлениями заболевания у мышей. Как видно из табл. 12, уровни анти-16/6-Id-антител (в разведении 1:10000) в сыворотках мышей не отличались между группами. Как можно видеть из таблицы, лечение как 200, так и 300 мкг снижало уровни анти-ДНК-антител (сыворотки разводили 1:1250). В табл. 12 также суммированы клинические параметры различных групп мышей. Можно видеть, что, хотя обе дозы оказались эффективными в отношении снижения лейкопении и протеинурии, эффект дозы 200 мкг в описанном эксперименте не достигал значимых величин (мышей умерщвляли через месяц после окончания лечения). Таблица 12 Влияние лечения мышей BAbB/с, пораженных экспериментальной SLE, 200 или 300 мкг hCDR1 или 300 мкг revhCDR1 На фиг. 14 А-F представлены по одной почке из каждой группы, где на А, В представлена почка не подвергнутой лечению мыши; на С, D представлена почка мыши, подвергнутой лечению hCDR1, и на Е, F представлен срез почки мыши, подвергнутой воздействию обратного hCDR1. Фиг. А, С, Е 100 и В, D, F400. На фиг. 15 А-Е показаны уровни различных цитокинов в супернатантах культур лимфатических узлов, стимулированных 16/6-Id. Последние исследования проводили в конце лечения (после 10 лечебных инъекций). Можно видеть, что лечение hCDR1 (обе дозы) ингибировало INF- (фиг. 15 А), IL-10 (фиг. 15 С) и TNF- (фиг. 15 В). С другой стороны, hCDR1 повышал уровни TGF-. Так как спленоциты обычно секретируют больше TGF- (фиг. 15D), чем клетки лимфатических узлов, TGF- также определяли в супернатантах 16/6-Id-стимулированных клеток селезенки мышей различных групп (фиг. 15 Е). Таким образом, hCDR1 снижает интенсивность симптомов заболевания и иммуномодулирует про- 22009465 дукцию цитокинов у мышей, пораженных индуцированной экспериментальной SLE. Пример 11. Перенос благоприятных воздействий на симптомы волчанки спленоцитами мышей,подвергнутых лечению hCDR1. Оказалось важным исследовать, возможен ли перенос клетками селезенки подвергнутых лечению мышей благоприятных воздействий лечения hCDR1, которые проявляются подавлением симптомов заболевания. Для этой цели проводили эксперимент, в котором 8-месячных мышей (NZBNZW)F1, которые уже страдали полностью проявившимся заболеванием, подобным волчанке, делили на 2 группы. Группу 1 не лечили, а мышам группы 2 переносили 20106 клеток селезенки 3-месячных мышей(NZBNZW)F1, которым 3 раза вводили (подкожно, через день) 300 мкг/мышь hCDR1. Все спленоциты вводили внутрибрюшинно. У мышей исследовали продукцию анти-дцДНК-аутоантител, проявления заболевания и мышей умерщвляли через 4 недели после переноса клеток. Перенос клеток мышей, подвергнутых лечению hCDR1, вызывал умеренное снижение уровней анти-ДНК-антител. В табл. 13 показано, что перенос спленоцитов мышей, подвергнутых лечению hCDR1, приводил к значительно более низкой протеинурии и к уменьшению иммунных комплексов в почках. Таблица 13 Клиническое проявление волчанки у мышей-реципиентов клеток селезенки мышей,подвергнутых лечению hCDR1 Значения р вычисляли по сравнению с gr1 (группа 1) не подвергнутых лечению мышей. Эксперимент повторяли несколько раз, используя revhCDR1 в качестве контроля. Результаты оказались подобными результатам первого эксперимента, а именно перенос клеток подвергнутых лечению мышей оказывал небольшое влияние на титры анти-ДНК-антител и значительно влиял на протеинурию и поражение почек. Клинические показатели характерного эксперимента представлены в табл. 14. Таблица 14 Клиническое проявление волчанки у мышей-реципиентов клеток селезенки мышей,подвергнутых лечению hCDR1- 23009465 Значения р вычисляли по сравнению с gr1 не подвергнутых лечению мышей. Можно видеть, что подавляющее действие лечения посредством hCDR1 может быть перенесено клетками селезенки подвергнутых лечению мышей. На фиг. 16 А-F изображены срезы почек мышей группы 1 (А, В - не подвергнутые лечению мыши),группы 2 (С, D - реципиенты спленоцитов 2-месячных мышей, подвергнутых лечению hCDR1) и группы 3 (Е, F - реципиенты спленоцитов 2-месячных мышей, подвергнутых лечению revhCDR1). А, С, Е 400; В, D, F100. Результаты вышеприведенных экспериментов указывают, что эффекты hCDR1, снижающие интенсивность проявлений заболевания, могут быть перенесены иммуноцитами здоровых мышей, которых лечили hCDR1. Пример 12. Ингибирование ММР-3 и ММР-9 мышиными пептидами mCDR. Матриксные металлопротеиназы (ММР) (Shingleton et al., 1996; Goetzl et al., 1996; Massova et al.,1998) составляют семейство цинксодержащих эндопротеиназ, которые играют важную роль в ремоделировании внеклеточного матрикса в здоровых тканях, а также участвуют в патологических процессах. Они обладают общими структурными доменами, но отличаются по субстратной специфичности, клеточному происхождению и индуцибельности. ММР синтезируются в виде зимогенподобных латентных предшественников и впоследствии превращаются в активные формы. ММР-2 и ММР-9, которые обе являются желатиназами, могут деградировать коллаген IV типа, денатурированные коллагены, коллагены V, VII, Х и XII типов, витронектин, аггрекан, галектин-3 и эластин. ММР-2 является наиболее широко распространенной ММР. Она продуцируется целым рядом клеток, и ее уровень часто повышается в метастазах злокачественных опухолей. С точки зрения белковой и доменной структуры, ММР-9 является самым большим и наиболее сложным представителем, идентифицированным до сих пор. Экспрессия ММР-9 характеризуется сложной регуляцией путем устойчивого контроля на уровнях генной транскрипции и белковой секреции медиаторов воспаления (таких, как цитокины, хемокины, эйкосаноиды) и путем действия тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP). Кроме того, активность ММР-9 модулируется в результате активации про-ММР-9, компонентами системы активации плазминогена или другими ММР (Guedez et al., 1996). Вовлечение ММР в аутоиммунные заболевания было продемонстрировано при различных аутоиммунных заболеваниях, таких как рассеянный склероз (Ozenci et al., 1999) и экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит его животной модели (ЕАЕ) (Gijbels et al., 1994), ревматоидный артрит (Keyszeret al., 1999), синдром Гийена-Барре (Creange et al., 1999), экспериментальный булезный пемфигоид (Liu etal., 1998) и экспериментальный аутоиммунный неврит (Hughes et al., 1998). Описано, что сывороточные уровни ММР-3 и TIMP-2 у больных волчаночным нефритом значительно выше, чем их уровни у здоровых контролей, но не наблюдали корреляции с активностью заболевания (Zucker, 1999; Keyszer et al., 1999). Возможное значение большинства активностей ММР в воспалительных ответных реакциях было подсказано ингибиторным действием ингибиторов ММР на некоторых животных моделях аутоиммунных заболеваний. Специфическое ингибирование ММР in vivo подавляет отек, патологическую тканевую пролиферацию и поражение специальных тканевых структур при некоторых воспалительных и аутоиммунных заболеваниях (Gijbels et al., 1994; Wallace et al., 1999; Conway et al., 1995). Согласно данному изобретению показано, что уровни ММР-3 и ММР-9 повышены как в сыворотках,так и в почках мышей, пораженных или спонтанной, или индуцированной экспериментальной SLE. Также было продемонстрировано, что лечение SLE-пораженных мышей мышиными пептидами, базирующимися наCDR, которые уменьшают интенсивность проявлений волчанки у мышей, снижало уровни ММР-3 и ММР-9 в сыворотке и почках подвергнутых лечению мышей, а также вызывало уменьшение интенсивности симптомов заболевания. Полагают, что такие же эффекты будут присущи человеческим пептидам hCDR изобретения. Пример 12(i). Динамика появления ММР-3, ММР-2 и ММР-9 в сыворотках мышей (NZBNZW)F1. В первую очередь, исследовали, связано ли развитие спонтанной SLE у мышей (NZBNZW)F1 с изменениями в уровнях ММР-3, ММР-2 и ММР-9 в их сыворотках. Так, следили за уровнями последних у мышей, начиная с возраста 2 месяцев, прежде чем наблюдали симптомы заболевания, до возраста 8 месяцев, когда мыши страдали от вполне развившегося заболевания. Результаты представлены на фиг. 17. Как можно видеть на фиг. 17 А, в сыворотках 2-месячных мышей как уровень формы ММР-3 с М.м. 34 кД,так и уровень формы с М.м. 40 кД являлись очень низкими, что показано методом Вестерн-блоттинга. Уровни всех форм постепенно повышались к возрасту 8 месяцев, последнему исследованному временному периоду. Аналогично, на фиг. 17 В показано, что активность ММР-9, которую оценивали методом гелевой зимографии, была низкой в возрасте 2 месяцев и постепенно возрастала в сыворотках мышей при прогрессировании заболевания до возраста 8 месяцев. На фиг. 17 В также видно, что уровни ММР-2 значительно не изменялись с прогрессированием заболевания. Пример 12(ii). Динамика появления ММР-3, ММР-2 и ММР-9 в сыворотках мышей BALB/c, которых иммунизовали 16/6-Id. Предварительные результаты из лаборатории заявителя показали, что SLE можно индуцировать у мышей BALB/c после иммунизации 16/6-Id (Mendlovic et al., 1988; Waisman et al., 1993). Поэтому каза- 24009465 лось интересным исследовать, похожа ли индуцированная модель SLE на модель (NZBNZW)F1 в отношении изменений в ММР-3 и ММР-9. Таким образом, в указанных экспериментальных моделях SLE следили за уровнями MMP-3 и ММР-9. Результаты, представленные на фиг. 18, указывают, что уровни ММР-3 (все изоформы) повышались через 10 дней после повторной иммунизации (4,5 недель после иммунизации) и оказались выше, чем у контрольных неиммунизованных или CFA-иммунизованных мышейBALB/c того же возраста (фиг. 18 А). Во всех группах уровни ММР-3 повышались в процессе старения,однако, уровни ММР-3 у 16/6-Id-иммунизованных мышей были всегда выше, чем в контрольных группах. В противоположность этому, никаких индуцированных изменений в активности ММР-9 невозможно было определить до тех пор, пока не прошло 2 месяца после повторной иммунизации (фиг. 18 В). Более высокую активность ММР-9 у 16/6-Id-иммунизованных мышей, чем у неиммунизованных мышей, можно было наблюдать приблизительно 4 месяца после повторной иммунизации. Пример 12(iii). Специфическая активация ММР-3 и ММР-9 в срезах почек мышей BALB/c, которых иммунизовали 16/6-Id. Так как иммунизация мышей BALB/c посредством 16/6-Id приводила к клиническим проявлениям,характеризующим SLE, включая поражение почек (Mendlovic et al., 1988; Waisman et al., 1993), и так как описано, что поражение почек у мышей (NZBNZW)F1 связано с повышением уровней ММР-3 и ММР-9(Nakamura et al., 1993), следили за экспрессией указанных ферментов в почках мышей BALB/c, которых иммунизовали 16/6-Id. В качестве контролей использовали мышей, которых иммунизовали CFA, и подобранных по возрасту неиммунизованных мышей. Обеим контрольным группам вводили PBS в момент проведения повторной иммунизации. Через 2 месяца и через 5 месяцев после повторной иммунизации 16/6-Id проводили иммуноокрашивание срезов почек мышей в отношении ММР-3 или ММР-9. На фиг. 19 представлена иммуногистология почек, взятых через 5 месяцев после повторной иммунизации. Как можно видеть на фигуре, иммунизация мышей CFA активировала экспрессию как ММР-3 (19 А), так и ММР-9 (19 В) в почках, в гломерулах и в окружающей ткани. Однако иммунизация 16/6-Id в CFA еще значительно повышала уровни экспрессии указанных двух ММР. Описанное повышение наблюдали уже через 2 месяца после повторной иммунизации 16/6-Id (данные не представлены). Также показаны неспецифические фоновые уровни окрашивания (19 С). Пример 12(iv). Мышиный пептид mCDR1 подавляет уровни ММР-3 и активность ММР-9 в сыворотках мышей (NZBNZW)F1. Так как удалось показать, что уровни ММР-3 и ММР-9 повышались в обеих экспериментальных моделях SLE, целесообразно было исследовать, сопровождается ли уменьшение интенсивности клинических симптомов SLE, наблюдаемое после лечения пептидом mCDR1 (Eilat et al., 2000; Eilat et al., 2001),снижением уровней ММР-3 и ММР-9. Так, мышей (NZBNZW)F1, у которых спонтанно развивалосьSLE-подобное заболевание, в возрасте 2 месяцев (прежде, чем наблюдали клинические проявления) лечили еженедельным введением им подкожно mCDR1 в PBS (250 мкг/мышь) в течение 10 недель. Этот профилактический протокол приводил к уменьшению интенсивности всех клинических симптомов (Eilatet al., 2000). Как можно видеть на фиг. 20, имеется снижение в двух более низких зонах ММР-3 (20 А) и в активности ММР-9 (20 В) в сыворотке. Описанное снижение связано с уменьшением клинических проявлений (Eilat et al., 2000). Как видно на фиг. 20 А, форма ММР-3 с М.м. 45 кД не затрагивалась. Также представлялось интересным исследовать, способен ли пептид mCDR1 подавлять повышенные уровни ММР-3 и активность ММР-9. С этой целью следили за уровнями ММР-3 и активностью ММР-9 в сыворотках мышей (NZBNZW)F1, которых лечили mCDR1 во время, когда уже наблюдали симптомы заболевания. В качестве контрольного пептида использовали обратный mCDR1. Как можно видеть (фиг. 20, справа), лечение больных мышей mCDR1, но не revmCDR1, специфически снижало уровни ММР-3 (20 А) и подавляло активность ММР-9 (20 В) в сыворотках. Пример 12(v). Пептид mCDR1 подавляет уровни ММР-3 и активность ММР-9 в сыворотках мышей,иммунизованных 16/6-Id. Как было показано, активность ММР-9 повышается в обеих экспериментальных моделях SLE[(NZBNZW)F1 и 16/6-Id-индуцированной]. Так как показано, что пептид mCDR1 уменьшает интенсивность заболевания в обеих моделях и снижает уровни ММР-3 и активность ММР-9 в сыворотках подвергнутых лечению мышей (NZBNZW)F1, в дальнейшем следили за влиянием лечения на указанные ферменты в сыворотках мышей BALB/c, иммунизованных 16/6-Id. На фиг. 21 представлены результаты профилактического и лечебного экспериментов. На фигуре показано, что на описанной экспериментальной модели mCDR1 также может супрессивно регулировать ММР-3 и ММР-9. Подавление уровней ММР-3 и активности ММР-9 наблюдали как в отношении профилактического, так и лечебного протоколов. Так, введение mCDR1 in vivo, или на стадии индукции заболевания, или на стадии вполне развившегося заболевания может снижать уровни ММР-3 (21 А) и ММР-9 (21 В). Описанное снижение было специфическим, так как лечение обратным mCDR1 не оказывало влияния на ММР-3 или активность ММР-9(не представлено). Предварительные результаты с использованием системы определения активности ММР-9 (от Amersham-Pharmacia Biotech. UK Limited, England) показали, что активность в сыворотках от неиммунизованных мышей BALB/c являлась сопоставимой с 7 нг/мл чистой активной ММР-9. Иммуни- 25009465 зация 16/6-Id повышает активность до 16 нг/мл, а лечение пептидом mCDR1 подавляет ее почти до нормальных уровней (8,5 нг/мл). Пример 12(vi). Влияние лечения пептидом mCDR1 на уровни ММР-3 и ММР-9 в срезах почек мышей BALB/c, иммунизованных 16/6-Id. Так как было показано, что ММР-3 и ММР-9 повышаются в почках мышей с индуцированной экспериментальной SLE, оказалось интересным исследовать влияние лечения пептидом mCDR1 на экспрессию ММР в почках подвергнутых лечению мышей. На фиг. 22 показано, что как в профилактическом(фиг. 22 А), так и в лечебном (фиг. 22 В) экспериментах mCDR1 снижал уровни экспрессии как ММР-3,так и ММР-9 в почках подвергнутых лечению мышей. Снижение уровней ММР наблюдали как в гломерулах, так и в интерстициальной ткани. Наблюдаемое снижение экспрессии ММР коррелировало со снижением окрашивания отложений иммунных комплексов при использовании анти-Ig (фиг. 22 В). Вследствие наблюдаемого вовлечения ММР-3 и ММР-9 в патогенез SLE исследовали, способен ли человеческий пептид hCDR1 снижать уровни последних в соответствии с уменьшением интенсивности симптомов заболевания. Для этой цели в объединенных сыворотках групп мышей (NZBNZW)F1, которых лечили hCDR1 подкожным введением 100 или 300 мкг/мышь 1 раз в неделю в течение 10 недель,определяли уровни MMP в различные периоды во время лечения. На фиг. 23 представлены результаты эксперимента, в котором мышей лечили, начиная с возраста 7 месяцев, когда наблюдали все клинические проявления. Результаты относятся к сывороткам, собранным в середине лечения, после 5 инъекцийhCDR1. Результаты, представленные на фиг. 23, показывают, что лечение мышей 300 мкг hCDR1 подавляет уровни ММР-3 и активность ММР-9. Полученные результаты согласуются со значительным уменьшением интенсивности проявлений заболевания после лечения hCDR1. Обсуждение Вышеприведенные результаты показывают, что как ММР-3, так и ММР-9 повышаются в сыворотках и почках мышиных моделей SLE. Мышиный пептид mCDR1 может супрессивно регулировать уровни ММР-9 и ММР-3 как в сыворотках, так и в почках мышей, пораженных SLE. Продемонстрировано, что в спонтанной модели SLE активация как ММР-9, так и ММР-3 в сыворотке происходит в первые 3,5 месяца. В индуцированной модели повышение уровня ММР-3 в сыворотках происходит очень рано (через 10 дней после бустер-иммунизации 16/6-Id), тогда как повышение активности ММР-9 имело место приблизительно на 3-4 месяца позднее. На основании результатов, полученных на 16/6-Id-индуцированной модели, позволившей проследить процесс с первых стадий заболеваия, по-видимому, ММР-3 вовлечена в индукцию заболевания, в то время, как ММР-9 участвует в прогрессии заболевания. Полученные результаты, свидетельствующие о повышении ММР-3 в мышиных моделях SLE, согласуются с результатами, демонстрирующими, что ММР-3 значительно повышена в сыворотках больных SLE (Kotajima et al., 1998) и что количество транскриптов ММР-3 существенно возрастало с прогрессированием нефрита у мышей (NZBNZW)F1 (Nakamura et al., 1993). Взятые вместе, полученные результаты позволяют предположить, что ММР-3 может участвовать в развитии поражения гломерул при волчаночном нефрите. Полученные результаты показывают, что как в индуцированной, так и спонтанной моделях SLE уровни ММР-2 в сыворотках значительно не повышались с прогрессированием заболевания. Полученные результаты сопоставимы с результатами, сообщенными ранее (Zucker, 1999), что уровни ММР-2 не возрастали при SLE. Соответственно, названный фермент не модулировался при лечении пептидом, базирующимся на CDR1 (данные не представлены). ММР-2 секретировалась коститутивно, и уровни ее также не изменялись при других патологических состояниях (подобных ретробульбарному невриту и рассеянному склерозу), тогда как уровни ММР-9 повышались по сравнению со здоровыми контролями(Gijbels et al., 1992; Paemen et al., 1994). Интересно, что пептид mCDR1, который специфически и непосредственно оказывает влияние на Тклеточные ответные реакции, ассоциированные с SLE, может супрессивно регулировать уровни ММР-3 и ММР-9, которые уже активированы (лечебный протокол), а также предупреждает их повышение (профилактический протокол). Активность ММР-9 в сыворотках не описывалась ни у больных SLE, ни в животных моделях SLE. Впервые показано, что имеется корреляция между SLE и ММР-9, и продемонстрировано, что ММР-9 повышается в сыворотках и почках мышей, пораженных SLE. Хотя повышение в сыворотках происходит относительно поздно (около 4 месяца после повторной иммунизации), повышение ММР-9 в почках наблюдали на ранних стадиях после индукции заболевания (2 месяца) (данные не представлены). Кроме того, в изобретении впервые показано, что пептиды, которые уменьшают интенсивность симптомов SLE у мышей (mCDR1 и hCDR1, как показано выше), также подавляют ММР-9 как в сыворотках, так и в почках. Последние данные также подтверждаются предварительными результатами, полученными при использовании системы определения активности ММР-9, которые показали, что иммунизация 16/6-Id повышает активность ММР-9, тогда как лечение пептидом, базирующимся на CDR1, подавляет ее активность у иммунизованных мышей. Также в изобретении впервые показано, что ММР-3 и ММР-9 отличаются по динамике их индукции- 26009465 в экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний, что, в частности, продемонстривано в описании для SLE. Это может указывать на различные роли описанных выше ММР в патогенезе заболевания. Представленные результаты демонстрируют, что пептиды, которые иммуномодулируют Т-клеточные ответные реакции, ассоциированные с SLE, супрессивно регулируют проявления заболевания, могут контролировать секрецию (хотя не обязательно самими Т-клетками) названных ММР в сыворотках и почках. Полученные результаты указывают, что ММР-3 и ММР-9 играют роль в патогенезе SLE и могут служить заместителями маркеров прогрессирования заболевания, с одной стороны, и снижения интенсивности заболевания в результате данного лечения, с другой стороны. Пример 13. Активность ММР-9 (но не ММР-2) повышается в сыворотках больных SLE. В данном примере определяли уровни ММР-9 и ММР-2 в сыворотках 40 больных SLE и продемонстрировали, что активность ММР-9, а не ММР-2, значительно повышается в сыворотках больных SLE по сравнению со здоровыми контролями. Высокая активность ММР-9 коррелировала с наличием дисковидной сыпи, феномена Рейно, пневмонии, язв слизистой и присутствием антифосфолипидных антител (APLA). Кроме того, повышенные уровни ММР-9 коррелировали с активностью SLE в группе пациентов-мужчин. Материалы и методы Пациенты. 40 пациентов, 32 женщины и 8 мужчин, с SLE участвовали в данном исследовании. Все пациенты соответствовали по крайней мере четырем из установленных диагностических критериев American Collegeof Rheumatism (ACR) для диагностики SLE (Winchester, 1996). 25 здоровых волонтеров, подобранных по полу и возрасту, служили в качестве контрольной группы в проводимом исследовании. Средний возраст пациентов при постановке диагноза составлял 299,7 (диапазон 15-48) лет, и средний период наблюдения за заболеванием составлял 1110 (диапазон 1-32) лет. Активность заболевания определяли в соответствии с индексом активности волчанки SLEDAI (Bombardier et al., 1992) и по индексу BILAG (Hay et al., 1993). Исследование одобрено комитетом по этике Медицинского центра Каплана (Kaplan), Rehovot, Israel. Измерение активности ММР-2 и ММР-9 с помощью наборов для определения активности. Активности ММР-2 и ММР-9 измеряли с помощью наборов для определения активности ММР-2 и ММР-9 Biotrak (Amersham Pharmacia Biotech. UK Limited, UK) в соответствии с инструкциями производителя. Сыворотки разводили 1:100 и 1:32 для определения активностей ММР-2 и MMP-9, соответственно. Соответствующие стандарты добавляли в каждую пробу. Для измерения общего содержания ММР проводили активацию проформ ММР, используя ацетат п-аминофениловой ртути (АРМА). Определение активностей ММР-2 и ММР-9 методом гелевой зимографии. Активности ММР-2 и ММР-9 тестировали методом гелевой зимографии. Образец сыворотки 5 мкл разделяли с помощью электрофореза в 8% SDS-ПААГ, с полимеризованным желатином 1 мг/мл. Гели промывали 1 раз в течение 30 мин в 2,5% Тритоне Х-100, чтобы удалить SDS, и 1 раз в течение 30 мин в реакционном буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2 и 0,02% (мас./об.) Brij 35(рН 7,5). Использованный реакционный буфер заменяли на свежий буфер и гели инкубировали при 37C в течение 24 ч. Желатинолитическую активность визуализировали окрашиванием гелей 0,5% кумасси бриллиантовым голубым и количественно определяли денситометрией. Статистические анализы. Данные оценивали, используя Хи-квадрат или критерий точной вероятности Фишера, несвязанныеt-критерии и двусторонние Р-значения. Также использовали коэффициенты корреляции Пирсона, Спирмена и мультивариантные анализы. Пример 13(i). Активность ММР-9, а не ММР-2, повышается при SLE. Как описано выше, показано, что ММР-9 вовлечена в развитие некоторых аутоиммунных заболеваний, а также в животных моделях SLE. Таким образом, представлялось интересным исследовать, повышается ли также ММР-9 в сыворотках больных SLE. Для этой цели исследовали сыворотки 40 больныхSLE и 25 здоровых контролей методом гелевой зимографии, с помощью которой можно выявить активности как ММР-9, так и ММР-2. Репрезентативный гель представлен на фиг. 24. Как можно видеть на данной фигуре, уровни ММР-9 повышаются в сыворотках больных SLE по сравнению со здоровыми контролями. Денситометрический анализ зимограмм сывороток 40 больных SLE и 25 здоровых контролей показал, что средняя активность ММР-9 для больных SLE составляла 1095,6 денситометрических единиц, а для здоровых контролей 76,54,2 денситометрических единиц (Р=0,0001). Величины активности выше 85 денситометрических единиц (среднее из здоровых контролей + 2 s.e. (стандартные ошибки рассматривали как высокие. Результаты показали высокие уровни активности ММР-9 у 68% больныхSLE. Только 3% здоровых контролей проявляли высокую активность ММР-9 (Р=0,001). Денситометрический анализ уровней ММР-2 в тех же образцах сывороток показал, что различия в активности ММР-2 между сыворотками больных SLE и здоровых контролей не были значимыми. Так, величины 1097 и 1235 (денситометрические единицы средней активностиs.e.) были определены для здоровых контролей и больных SLE, соответственно (Р=0,0531). Кроме того, для количественного определения уровней активности ММР-9 и ММР-2 в сыворотке использовали наборы для анализа активности. На фиг. 25 показано, что активность ММР-9 в сыворотках больных SLE повышена в 3 раза по сравнению- 27009465 с сыворотками здоровых доноров, и это повышение является статистически значимым (Р=0,0302). В противоположность этому, различия в уровнях ММР-2 между двумя группами не являются значимыми (Р=0,1254). Так как заявители, а также другие исследователи (Ebihara et al., 1998 и 1999) определяли высокие уровни ММР-9 в сыворотках больных с хроническим поражением почек, не связанным с SLE (например,сахарный диабет, гипертензия), вероятно, обусловленные удержанием фермента, анализировали корреляцию между уровнями ММР-9 и функцией почек в группе тестируемых больных SLE. Никакой корреляции не наблюдали между уровнями креатинина и уровнями ММР-9 (r2=0,01), указывая, что повышенные уровни ММР-9 у больных SLE не являются результатом удержания фермента, обусловленного почечной недостаточностью. Пример 13(ii). Корреляция активности ММР-9 с клиническими и лабораторными параметрами. Повышение уровней активности ММР-9 в сыворотках больных SLE заставило проследить за возможной корреляцией между клиническими и лабораторными параметрами и сывороточными уровнями ММР-9. Статистический анализ (Хи-квадрат или критерии точной вероятности Фишера) проводили при исследовании ряда пациентов с высокими и нормальными уровнями ММР-9 для каждого клинического симптома (табл. 15), а также принимая во внимание фактические уровни средней активности ММР-9 для пациентов, у которых присутствует или отсутствует определенный клинический симптом. Результаты оказались подобными в обоих анализах. Заслуживает внимания то, что для всех клинических симптомов процент больных с повышенными уровнями ММР-9 был значительно выше, чем процент в группе здоровых доноров. Уровни ММР-9 не коррелировали с полом, продолжительностью заболевания или периодом от его начала (Pearson, Spearman). В табл. 15 показаны клинические и лабораторные показатели больных SLE в соответствии с их уровнями активности ММР-9 (более низкие или одинаковые со здоровыми контролями = нормальным). Высокие уровни ММР-9 значительно коррелировали с наличием феномена Рейно (Р=0,0138) и APLA(Р=0,041). Строгую корреляцию можно было наблюдать с пневмонией, дисковидной сыпью, неврологическими нарушениями и язвами слизистой. Однако количество пациентов с последними проявлениями слишком небольшое, чтобы проводить статистический анализ. Мультивариантный анализ выявил, что феномен Рейно и низкие уровни комплемента (С 3, С 4) положительно коррелировали с высокими уровнями ММР-9 (Р=0,0001 и 0,0137, соответственно). В противоположность этому, светочувствительность,артрит и гематологические нарушения отрицательно коррелировали с уровнями активности ММР-9(Р=0,0381, 0,0014 и 0,0065, соответственно). Таблица 15 Клинические показатели больных SLE с высокими и нормальными активностями ММР-9 в соответствии с их уровнями ММР-9- 28009465 Клиническое поражение определяли в соответствии с установленными критериями ACR (Winchester,1996). Антинуклеарные антитела (ANA) и анти-дцДНК-антитела определяли, используя клетки Нер 2 иCrithidia luciliae, соответственно. Антифосфолипидные антитела (APLA) определяли как реактивность в случае одного или более из следующих анализов: ложнопозитивного VDR, волчаночного антикоагулянта(LAC) или анализа-ELISA для антикардиолипиновых антител. Также оценивали возможную корреляцию между SLEDAI и активностью ММР-9 у пациентов мужчин (фиг. 26 А) и женщин (фиг. 26 В). Интересно, что коэффициент корреляции был значимым и позитивным для мужчин (r2=0,6333), но незначимым и отрицательным для женщин (r2=0,0571). Подобные результаты получали, используя систему оценки BILAG. Таким образом, положительный коэффициент корреляции между активностью ММР-9 и показателями BILAG наблюдали для мужчин (r2=0,6442) и незначимый коэффициент - для женщин. Также представляло интерес определить, существует ли корреляция между применением пациентами различных лечебных терапий и активностью ММР-9. Как можно видеть из табл. 16(А), не существует значимой корреляции между текущим лечением пациентов и активностью ММР-9. Однако, когда просматривали лечение пациентов за любой период во время течения их заболевания (табл. 16(В, обнаружили, что высокие уровни ММР-9 являются ассоциированными с применением цитотоксических агентов(82%). Таблица 16 Способы лечения больных SLE согласно их уровням ММР-9 Антималярийный агент, гидроксихлорохин, использовали в дозе 200-400 мг/день. Стероидную терапию устанавливали в виде ежедневной дозы 5 мг преднизона. Использованным цитотоксическим агентом был циклофосфамид (0,5-1 г/м 2 ежемесячно) или азатиоприн (100-150 мг/день). Пример 13(iii). Изменения в активности ММР-9 в образцах сывороток, полученных от индивидуальных больных SLE в различные периоды времени. Так как активность заболевания изменялась с течением времени, определяли уровни активности ММР-9 и ММР-2 в сыворотке индивидуальных пациентов, у которых брали образцы в течение 4-6 лет наблюдения. Исследовали сыворотки 9 пациентов, взятые в различные временные периоды. Уровни ММР-2 значительно не различались между пациентами и здоровыми контролями. У 5 из 9 исследованных пациентов можно было наблюдать изменения в активности ММР-9 в образцах сывороток индивидуальных пациентов в зависимости от времени. Результаты от 2 репрезентативных больных SLE представлены на фиг. 27. Как можно видеть, активность ММР-9, а не активность ММР-2, изменялась в зависимости от времени у тех же самых больных. Наблюдаемые изменения не были связаны с индексом активности заболевания, который определяли по системам или SLEDAI, или BILAG. Изменения в активности- 29009465 ММР-9 не были установлены в сыворотках 5 здоровых доноров, у которых брали образцы в различные временные периоды (данные не представлены). У 4 других больных SLE не наблюдали существенных изменений в активности ММР-9 или ММР-2 в зависимости от времени, а уровни активности ММР-9 оставались или высокими, или низкими в зависимости от индивидуального пациента. Обсуждение Данное изучение впервые демонстирует участие ММР-9 в SLE у человека. Показано, что активность ММР-9, но не ММР-2, значительно повышена в сыворотках 68% больных SLE по сравнению со здоровыми контролями. Высокие уровни ММР-9 коррелировали с феноменом Рейно, пневмонией, неврологическими нарушениями, дисковидной сыпью и присутствием APLA. Изменения в активности ММР-9 наблюдали в сыворотке тех же самых больных в различные периоды заболевания. Уровни активности ММР-9 не коррелировали с индексом активности заболевания (SLEDAI, BILAG) у пациентовженщин, но коррелировали с активностью SLE в группе пациентов-мужчин. Представленное исследование показывает, что уровни активности ММР-2 значительно не повышались в сыворотках больных SLE. Полученные результаты сопоставимы с результатами, описанными ранее (Zucker, 1999), что уровни ММР-2 не увеличивались при SLE. Также уровни ММР-2 оказались конститутивными и не изменялись при других патологических состояниях (подобные ретробульбарному невриту и рассеянному склерозу), при которых уровни ММР-9 увеличивались относительно здоровых контролей (Gijbels et al., 1992; Paemen et al., 1994). Высказано предположение об участии дополнительной ММР, а именно ММР-3, в патогенезе SLE,так как она значительно увеличивалась в сыворотках больных SLE (Kotajima et al., 1998). Частота обнаружения больных SLE с повышенной активностью ММР-9 (68%), представленная в данном примере,напоминает частоту, описанную (Kotajima et al., 1998) для высоких уровней ММР-3 у больных SLE (76%) и RA (82%). Кроме того, показано, что число транскриптов ММР-3 значительно увеличивается при прогрессировании нефрита у мышей (NZBNZW)F1 (Nakamura et al., 1993). Происхождение повышенных ММР в сыворотках больных SLE не известно. Показано, что ММР-9 секретируется клетками периферической крови, такими как Т-клетки, нейтрофилы и макрофаги (для ознакомления см. Goetzl et al., 1996). Тот факт, что не обнаружена корреляция между уровнями активности ММР-9 и количеством клеток периферической крови у пациентов, может означать, что ММР-9 не секретируется иммунными клетками периферической крови, а, скорее, секретируется пораженными SLE органами, подобными почкам или легким/плевре. Наблюдение, что все больные SLE с пневмонией показывают высокие уровни активности ММР-9, может означать, что пораженное легкое является источником высоких уровней ММР-9. Кроме того, ассоциация между цитотоксическим лечением, которое олицетворяет тяжесть недостаточности органа, связанную с SLE, и высокими уровнями ММР-9 в сыворотках также может служить подтверждением представления о том, что пораженные органы являются источником активности ММР-9 у больных SLE. Однако еще существует вероятность, что меньшее количество лимфоцитов периферической крови секретирует более высокие уровни активности ММР-9. Показано, что TGF- и IL-1 играют важную роль в патогенезе SLE как в заболевании человека(Dean et al., 2000), так и в мышиных моделях (Segal et al., 1997; Theofllopoulos et al., 1999; Eilat et al.,2001). В нескольких системах показано, что названные цитокины индуцируют продукцию ММР-9(Guedez et al., 1996), и, следовательно, возможно, что индукция последних ММР является частью патогенного действия названных цитокинов при SLE. Описано, что ММР-9, которая секретируется спонтанно моноцитами периферической крови здоровых индивидуумов, активировалась при экспозиции с TNF- иIL-1 (Saren et al., 1996). Кроме того, ММР как Т-клеток, так и макрофагов способствуют секреции TNF посредством расщепления мембраносвязанной формы (Gearing et al., 1994). Таким образом, приведенные примеры демонстрируют взаимные регуляторные эффекты ММР на провоспалительные цитокины и наоборот. Однако тот факт, что в сыворотках некоторых пациентов уровни активности ММР-9 оставались в нормальных пределах во время наблюдаемого периода, тогда как высокие уровни активности ММР-9 определяли в сыворотках большинства пациентов, может означать вовлечение генетических факторов в регуляцию последней. Представленные в описании результаты указывают, что ММР-9 может играть роль в патогенезеSLE и что определение уровней активности названных металлопротеиназ в плазме/сыворотке может предоставить важную информацию, когда осуществляют непрерывный контроль пациентов, подвергнутых лечению лекарственными средствами, которые являются помехой для активности ММР-9. Список литературы