Лечение хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с использованием β-интерферона

009289 Уровень техники Хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (CIDP) является неврологическим заболеванием, характеризующимся медленно прогрессирующей слабостью и нарушением чувствительности в ногах и руках. Причиной возникновения данного заболевания является разрушение миелиновой оболочки периферических нервов. Опухание нервных корешков также является отличительным признаком данного заболевания. Хотя указанное заболевание может возникать в любом возрасте и у обоих полов, CIDP чаще проявляется у молодых людей, причем у мужчин чаще, чем у женщин. Характерными симптомами являются покалывание или онемение (начиная с пальцев ног и рук), слабость рук и ног, ноющие боли в мышцах, утрата глубоких сухожильных рефлексов (арефлексия), усталость и атипичные ощущения.CIDP взаимосвязана с некоторыми другими заболеваниями. Например, установлено, что воспалительная демиелинизирующая невропатия, например CIDP, диагностирована у трети сероположительных субъектов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), направляемых к врачу по поводу периферических нервных заболеваний. Кроме того, установлено, что CIDP встречается у субъектов,страдающих волчанкой, парапротеинемией, лимфомой или диабетом. При отсутствии лечения CIDP приводит к потере трудоспособности, требующей проведения физиотерапии и трудотерапии, применения ортопедических аппаратов и длительного лечения. Для назначения правильного лечения нужно, чтобы квалифицированный врач наблюдал больного во внебольничных условиях. Современные методы лечения CIDP включают введение кортикостероидов, таких как преднизон,который может быть назначен отдельно или в сочетании с иммунодепрессантами. Иммунодепрессанты могут быть также назначены без стероида. Плазмаферез (замена плазмы) и внутривенное введение иммуноглобулина (IVIg) также являются достаточно эффективными методами,применяемыми в настоящее время. IVIg можно использовать даже в качестве основного лечения. Кроме того, физиотерапия может увеличить мышечную силу, функциональность и подвижность конечностей и минимизировать развитие контрактур.CIDP по-разному развивается у разных людей. У некоторых людей после одного приступа CIDP может последовать спонтанное выздоровление, в то время как у других может быть много приступов с частичным восстановлением между рецидивами. Данное заболевание является поддающейся лечению приобретенной невропатией, поэтому лечение рекомендуется начинать как можно раньше, чтобы предотвратить утрату нервных клеток. Однако у некоторых субъектов сохраняется некоторое остаточное онемение или слабость конечностей. Таким образом, современные методы лечения CIDP являются вредными (например, стероиды или иммунодепрессанты), дорогостоящими (например, IVIg и плазмаферез) или неудобными (например,плазмаферез) методами. Поэтому весьма желательны эффективные терапевтические методы лечения хронических демиелинизирующих невропатий, например CIDP, которые будут менее токсичными, более дешевыми и более удобными по сравнению с современными методами. Сущность изобретения Один вариант осуществления изобретения относится к способам лечения хронической демиелинизирующей двигательной невропатии у млекопитающего. Указанный способ может включать введение млекопитающему терапевтически эффективного количества препарата IFN-. Препарат IFN- можно вводить парентерально, не прибегая к подкожным инъекциям, например внутримышечно. В предпочтительном варианте осуществления изобретения невропатия является хронической воспалительной демиелинизирующей невропатией (CIDP). Препарат IFN- может содержать человеческий IFN-. Например, препарат IFN- может содержать белок, который по меньшей мере примерно на 95% идентичен непроцессированному зрелому человеческому IFN-, имеющему SEQ ID NO:4. Препарат IFN- может также содержать непроцессированный зрелый человеческий IFN-, имеющий SEQ ID NO:4. Препарат IFN- может также содержать непроцессированный зрелый человеческий IFN-, имеющий SEQ ID NO:4, слитый с гетерологичным полипептидом, например, с константным доменом молекулы человеческого иммуноглобулина. Молекула иммуноглобулина может представлять собой тяжелую цепь IgG1. Препарат IFN- может содержать SEQ IDNO:14. Препарат IFN- может также содержать пегилированный IFN-. Препарат IFN- или содержащая его композиция может включать стабилизирующий агент, такой как белов: или аминокислота. Например, стабилизирующим агентом может быть аргинин. Препарат IFN или содержащая его композиция может иметь значение рН в пределах от около 4,0 до 7,2. Препарат IFN- можно вводить один, два или три раза в неделю. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат IFN- вводят в количестве примерно 6 или 12 миллионов международных единиц (ММЕ). Препарат IFN- можно вводить внутримышечно или подкожно. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъект является млекопитающим, предпочтительно человеком. Данное изобретение относится также к способам лечения невропатии, например CIDP, включающим введение субъекту, страдающему невропатией, фармацевтически эффективного количества препа-1 009289 рата IFN- и последующее введение субъекту иммунодепрессанта или проведение плазмафереза. Указанный способ может включать введение субъекту иммунодепрессанта, выбранного из группы, состоящей из стероида, азотиоприна, циклоспорина, циклофосфамида и микофенолята. В объем настоящего изобретения входят также способы лечения невропатии, например CIDP,включающие введение больному невропатией фармацевтически эффективного количества препаратаIFN- в сочетании с дополнительным лечением невропатии, причем препарат IFN- вводят парентеральным способом, отличным от подкожного введения. Препарат IFN- можно вводить внутримышечно. Препарат IFN- можно вводить один раз в неделю, например около 6 ММЕ препарата IFN- один раз в неделю. Когда невропатия представляет собой CIDP, дополнительное лечение может быть выбрано из группы, включающей введение стероида, введение IVIg, введение противопоспалительного средства и проведение плазмафереза. Другой вариант осуществления изобретения относится к способам лечения невропатии, напримерCIDP, включающим введение больному невропатией фармацевтически эффективного количества препарата IFN- в сочетании с дополнительным лечением невропатии, причем препарат IFN- вводят один раз в неделю. Если невропатия представляет собой CIDP, дополнительное лечение CIDP может быть выбрано из группы, включающей введение стероида, введение IVIg, введение противовоспалительного средства и проведение плазмафереза. Другой вариант осуществления изобретения относится к способам лечения CIDP у субъекта, проходящего основной курс лечения CIDP, выбранный из группы, состоящей из введения стероида, введения противовоспалительного средства, введения IVIg и проведения плазмафереза, которые помимо основного лечения CIDP включают введение препарата IFN- в количестве, эффективном для значительного уменьшения дозы или частоты проведения основного лечения CIDP, причем препарат IFN- вводят парентеральным способом, отличным от подкожного введения, для достижения эффективного ослабления симптомов CIDP. В соответствии с другим способом лечения CIDP нуждающийся субъект проходит основной курс лечения CIDP, выбранный из группы, состоящей из введения стероида, введения противовоспалительного средства, введения IVIg и проведения плазмафереза, при этом помимо основного лечения CIDP субъекту вводят препарат IFN- один раз в неделю в количестве, эффективном для значительного уменьшения дозы или частоты проведения основного лечения CIDP, для достижения эффективного ослабления симптомов CIDP. Субъекту, имеющему CIDP, может быть также назначено основное лечениеCIDP, выбранное из группы, состоящей из введения стероида, введения противовоспалительного средства и проведения плазмафереза, при этом помимо основного лечения CIDP субъекту вводят препарат IFN в количестве, эффективном для значительного уменьшения дозы или частоты проведения основного лечения CIDP, для достижения эффективного ослабления симптомов CIDP. Краткое описание чертежей На фиг. 1 А-С показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:11) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12) слитого белка, содержащего сигнальную последовательность VCAM,слитую со зрелым непроцессированным человеческим IFN- (SEQ ID NO:3 и 4), в котором глицин в положении аминокислоты 162 SEQ ID NO:4 заменен цистеином, слитым с шарнирными, СН 2- и СН 3 доменами Fc-фрагмента IgG1 человека (ZL5107). На фиг. 2 А-С показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:13) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:14) слитого белка, содержащего сигнальную последовательность VCAM,слитую со зрелым непроцессированным человеческим IFN- (SEQ ID NO:3 и 4), в котором глицин в положении аминокислоты 162 SEQ ID NO:4 заменен цистеином, слитым с линкером G4S, который в свою очередь слит с шарнирными, СН 2- и СН 3-доменами Fc-фрагмента IgG1 человека (ZL6206). Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способам лечения хронических демиелинизирующих невропатий, например CIDP, включающим введение фармацевтически эффективного количества препарата IFN. 1. Определения терминов. Для более четкого и точного изложения предмета изобретения, описанного в формуле изобретения,ниже приведены определения некоторых терминов, использованных в описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения. В значении, использованном в описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, термины в форме единственного числа имеют обобщающее значение за исключением тех случаев, когда из контекста изобретения следует обратное. Термин хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия имеет взаимозаменяемое значение с термином CIDP. Нижеследующие заболевания являются идентичными или считаются, по существу, идентичными CIDP и поэтому входят в определение термина CIDP, используемого в данном описании изобретения: хроническая рецидивная полиневропатия, хроническая идиопатическая демиелинизирующая полиневропатия, хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия и хроническая приобретенная демиелинизирующая полиневропатия (CADP).CIDP является хроническим прогрессирующим заболеванием с постепенным развитием или рецидивами(см., например, Dyck et al., (1993) in Dyck, P.J., Thomas, PlK., Griffin, J.W., Low, P.A., Poduslo, J.F., (Eds.),Peripheral Neuropathy, 3rd ed. Saunders, Philadelphia, pp. 1498-1517). Патологические признаки CIDP включают сегментную демиелинизацию и ремиелинизацию и наличие мононуклеарных клеточных инфильтратов в эндоневрие (Duck et al., см. выше). CIDP иногда определяют как периферическую разновидность рассеянного склероза (MS) (Toyka and Hartung (1996) Curr. Opin. Neurol. 9, 240-250). Данное заболевание иногда определяют также как хроническую форму синдрома Гийена-Барре. Критериями для диагностикиCIDP являются клинические, электрофизиологические исследования и анализ цереброспинальной жидкости (CSF), описанные, например, в отчете специального подкомитета Американской академии неврологии, AIDS taks force (1991) Neurology 41:617. Диагностические исследования включают иглоукалывание в девяти точках; прохождение 10 м; шкалу Ранкина или ее модифицированную форму и суммирование баллов по шкале MRC или ее модифицированной форме (Mathiowetz et al., (1985) Occupational Therapy J. of Res. 5:24; Thompson et al., (1996) J. Neurol. 243:280; Collen et al. , (1990) Int. Disability Studies 12:6; van Swieten et al. (1988) Stroke 19:604 and Kleyweg et al., (1991) Muscle Nerve 14:1103). Неврологические оценки могут также включать шкалу неврологической утраты трудоспособности (NDS); шкалу утраты трудоспособности (0, полностью здоров; 1, незначительные симптомы; 2, может ходить без помощи, но не может бегать; 3, может пройти 5 м с помощью; 4, прикован к инвалидному креслу/кровати); тест двигательной способности Хаммерсмита (НМАТ) (Dyck P.J., In Peripheral Neuropathy (1993), supra,pages 686-697; Scott et al. (1982) Muscle Nerve 5:291) и исследование проводимости нервов. Определение мышечной силы может включать оценку двигательных функций, например измерение максимального произвольного изометрического сокращения мышцы (MVIC), известное в данной области, и измерения мышечной силы. Другие исследования утраты трудоспособности включают индекс способности перемещаться; измерение функциональной независимости; шкалу неврологической утраты трудоспособности Гая (GNDS); суммирование баллов по шкале Медицинского научно-исследовательского совета; суммирование баллов по шкале чувствительности и функциональную шкалу Хьюза (Hauser et al. (1983) N. Engl.S32 and Merkies et al. (2002) Neurology 59:84). Электрофизиологические критерии диагностики CIDP были предложены специальным комитетом Американкой академии неврологии (AAN) в 1991 г. и недавно были пересмотрены (Nicolas et al. (2002) Muscle Nerve 25:26). Другим исследованием, используемым для диагностики иммуноопосредованной сенсорно-двигательной полиневропатии, например, CIDP и синдрома Гийена-Барре (GBS), является психометрическая оценка причины возникновения и лечения воспалительной невропатии (INCAT) при помощи суммирования баллов чувствительности (ISS) (Merkies et al.(2000) Neurology 54:943). Антигены лейкоцитов человека Dw3, DRw3, A1 и B8 чаще встречаются у больных CIDP, чем у здоровых людей (Zvartau-Hind et al. (2002) Chronic Inflammatory Demyelinating Polyradiculoneuropathy, адрес в Интернете www.emedicine.com/neuro). Термин IFN1a означает гликозилированную молекулу IFN-, содержащую аминокислотную последовательности человеческого IFN- дикого типа. Термин IFN1b означает негликозилированную молекулу IFN-, содержащую аминокислотную последовательность IFN- дикого типа, где цистеин в положении 17 заменен серином и отсутствует метионин в положении 1 (инициирующий метионин). Термин вариант IFN- означает белок IFN- дикого типа, содержащий одну или несколько модификаций, например, делеции, добавления, замены аминокислот, посттрансляционную модификацию или включающий один или несколько искусственных аминокислотных остатков или связей между ними. Части IFN- входят в определение термина вариант IFN-. Термин биологически активный вариантIFN- означает вариант IFN-, который обладает, по меньшей мере, некоторой активностью при лечения невропатии, например CIDP. Вариант IFN- может быть естественным IFN-, включающим, например, вставку, делецию или замену одной или нескольких аминокислот по сравнению с IFN- дикого типа, то есть естественным мутантом или полиморфным вариантом, либо искусственным IFN-. Термин международные единицы или (ME) применительно к IFN- означает единицы измерения,принятые Всемирной организацией здравоохранения (WHO) в качестве международного стандарта для измерения интерферона. Термин выделенный (имеющий взаимозаменяемое значение с термином по существу чистый) применительно к полипептидам означает полипептид, который по своему происхождению или в результате манипуляций: (i) присутствует в клетке-хозяине в качестве продукта экспрессии части экспрессирующего вектора; (ii) связан с белком или другой химической частью молекулы, не являющейся частью молекулы, с которой он связан в природе; или (iii) не встречается в природе, например, белок, который химически модифицирован путем присоединения или добавления по меньшей мере одной гидрофобной части, в результате чего белок приобретает форму, не встречающуюся в природе. Термин выделенный далее означает белок, который: (i) синтезирован химическим способом; или (ii) экспрессирован в клеткехозяине и очищен от связанных и загрязняющих белков. Данный термин обычно служит для обозначения полипептида, который был отделен от других белков и нуклеиновых кислот, вместе с которыми он встре-3 009289 чается в естественных условиях. Кроме того, указанный полипептид предпочтительно отделен от таких веществ, как антитела или гелевые матрицы (полиакриламид), используемых для его очистки. Термин выделенный (используемый взаимозаменяемо с термином по существу чистый) применительно к нуклеиновым кислотам означает полинуклеотид РНК или ДНК, часть геномного полинуклеотида, кДНК или синтетический полинуклеотид, который по своему происхождению или в результате манипуляции:(i) не связан со всем полинуклеотидом, с которым он связан в природе (например, находится в клеткехозяине в виде экспрессирующего вектора или его части); (ii) связан с нуклеиновой кислотой или другой химической частью молекулы, которая не является частью молекулы, с которой он связан в природе; или(iii) не встречается в природе. Термин выделенный далее означает полинуклеотидную последовательность, которая: (i) амплифицирована in vitro, например, в результате выполнения полимеразной реакции синтеза цепи (PCR); (ii) синтезирована химическим способом; (iii) продуцирована методами рекомбинантных ДНК путем клонирования; или (iv) очищена путем расщепления и разделения в геле. Термин многоочаговая двигательная невропатия или MMN означает хроническую иммуноопосредованную демиелинизирующую невропатию, которая характеризуется постепенным развитием асимметричной мышечной слабости и амиотрофии, локализованной в областях анатомического распределения периферических нервов (Pestronk et al. (1988) Ann. Neurol. 24:73 and Kornberg et al. (1995) Ann.Neurol. (suppl. 1) S43). Электрофизиологическим признаком многоочаговой двигательной невропатии является постоянное блокирование проводимости нервов. В клиническом отношении данное заболевание описано как асимметричный чистодвигательный вариант CIDP с многоочаговым блокированием проводимости двигательных нервов. В процессе развития многоочаговой двигательной невропатии характер данного заболевания может постепенно трансформироваться с возникновением, по существу, симметричной картины, которая в клиническом отношении напоминает двигательную форму CIDP. Исследования патологии позволили объединить эти два заболевания (Krendel et al. (1996) Ann. Neurol. 40:948 и Ohet al. (1995) Neurology 45:1828). Большинство больных многоочаговой двигательной невропатией характеризуются высоким титром антител против ганглиозида GM1 (Pestronk et al., см. выше и Kornberg et al.,см. выше). Нуклеиновая кислота функционально связана с другой нуклеиновой кислотой, когда она находится в функциональной взаимосвязи с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например,ДНК для препоследовательности или секреторной лидерной последовательности (например, сигнальной последовательности или сигнального пептида) функционально связана с ДНК, кодирующей полипептид,если данная ДНК экспрессирована в виде белка-предшественника, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию данной последовательности; и сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если его положение облегчает трансляцию. Термин функционально связанный обычно означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и, например,в случае секреторной лидерной последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания. Связывание может быть достигнуто в результате лигирования, например, на удобных сайтах рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, можно использовать синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с известной практикой. Термин процентное тождество или процентное сходство означает сходство последовательностей двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Если в определенном положении двух сравниваемых последовательностей находится одно и то же основание или мономерная аминокислотная субъединица, соответствующие молекулы считаются идентичными в данном положении. Процентная идентичность двух последовательностей определяется числом совпадающих или идентичных положений в двух последовательностях, деленным на число сравниваемых положений х 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являтся идентичными, тогда две последовательности характеризуются 60% гомологией. В качестве примера можно сравнить последовательности ДНКCTGACT и CAGGTT, которые являются гомологичными на 50% (совпадают 3 из 6 положений). Сравнение обычно выполняют при выравнивании двух последовательностей для достижения максимальной идентичности. Такое выравнивание можно произвести, например, методом Карлина и Алтскула, который более подробно описан ниже. Применительно к нуклеиновой кислоте термины процентная гомология и процентная идентичность имеют взаимозаменяемые значения, а применительно к полипептиду термин процентная гомология означает степень сходства, при которой аминокислоты, представляющие собой консервативные замены других аминокислот, считаются идентичными указанным другим аминокислотам. Термин консервативная замена остатка в эталонной последовательности представляет собой замену аминокислотой, которая физически и функционально подобна соответствующему эталонному остатку, например, имеет аналогичный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, или подобные характеристики. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются такие замены, которые удовлетворяют критерию, определяемому для принятой точковой мутации в публикации Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, chapter 22:354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C.(1978). Процентную гомологию или идентичность двух аминокислотных последовательностей или двух-4 009289 последовательностей нуклеиновых кислот можно определить при помощи алгоритма выравнивания Карлина и Алтскула (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 87:2264 (1990, модифицированного в публикации Карлина и Алтскула (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 90:5873 (1993. Указанный алгоритм вводят в программыNBLAST или XBLAST, описанные в публикации Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). Поиск методом BLAST выполняют при помощи программы NBLAST, оценка = 100, длина слова = 12, для обнаружения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиновой кислоте по данному изобретению. Поиск белка методом BLAST выполняют при помощи программы XBLAST, оценка = 50, длина слова = 3, для обнаружения аминокислотных последовательностей, гомологичных эталонному полипептиду. Для сравнения выровненных последовательностей с разрывами цепи используют метод BLAST с пробелами в соответствии с описанием, приведенным в публикации Altschul et al., Nucleic Acids Res.,25:3389 (1997). При использовании методов BLAST и BLAST с пробелами применяют параметры по умолчанию соответствующих программ (XBLAST и NBLAST). См. в Интернете http://www/ncbi.nlm.nih.gov. Качество жизни можно измерить по визуальной аналоговой шкале EuroQol и суммированию баллов по анкете EuroQoL; шкале определения состояния здоровья из 36 пунктов Medical Outcome Study (SF-36) и визуальной аналоговой шкале (VAS) (EuroQoL Group (1990) Health Policy 16:199 и Merkies et al. (2002)Neurology 59:84). Считается, что препарат IFN- обладает терапевтической эффективностью и количество препарата IFN- является терапевтически эффективным, если введение такого количества одного препаратаIFN- в комбинированной терапии достаточно для достижения клинически значимого ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания по сравнению с отсутствием лечения препаратом IFN-. В предпочтительном варианте осуществления изобретения введение терапевтически эффективного количества препарата IFN- субъекту, страдающему CIDP, вызывает ослабление по меньшей мере одного симптома CIDP, например мышечных или нервных нарушений. Термин IFN- дикого типа означает нативный или рекомбинантный IFN-, содержащий естественную аминокислотную последовательность нативного IFN-. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность нативного человеческого IFN- приведены соответственно в SEQ ID NO:1 и 2, которые являются последовательностями, представленными, например, в банке генов GenBank под номерами доступа М 28622 (и Е 00029) и ААА 36040 соответственно. 2. Препараты IFN-. Препараты IFN-, которые можно использовать в соответствии с данным изобретением, включаютIFN- дикого типа и его биологически активные варианты, например естественные и искусственные варианты. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности естественного человеческого IFN- дикого типа приведены, соответственно, в SEQ ID NO:1 и 2, которые идентичны последовательностям, представленным в банке генов GenBank под номерами доступа М 28622 и ААА 36040 соответственно. Указанные IFN-p описаны также в публикации Seghal (1985) J. Interferon Res. 5:521. Непроцессированный белок человеческий IFN- состоит из 187 аминокислот, и кодирующая последовательность SEQ ID NO:1 соответствует нуклеотидам 76-639. Сигнальная последовательность соответствует аминокислотам 1-21. Аминокислотная последовательность зрелой формы IFN- соответствует аминокислотам 22-187 (нуклеотиды 139-639 SEQ ID NO:1). Зрелый белок IFN- человека и нуклеотидная последовательность, кодирующая указанный белок, представлены соответственно в виде SEQ ID NO:4 и 3.IFN-p дикого типа гликозилирован по остатку 80 (Asn 80) зрелого полипептида SEQ ID NO:4 или остатка 101 (Asn 101) незрелого полипептида SEQ ID NO:2. Препараты IFN- также включают IFN-, отличные от человеческого, например, IFN- позвоночных, таких как млекопитающие, например приматов, кроме человека, крупного рогатого скота, овец, свиней, лошадей, кошек, собак, крыс и мышей, а также птиц или амфибий. С последовательностями IFNуказанных видов можно ознакомиться в банке генов и/или в публикациях либо определить по нуклеиновым кислотам, полученным путем гибридизации в условиях низкой строгости с геном IFN- другого вида. Варианты белков IFN- дикого типа включают белки, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90, 95, 98 или 99% идентична или гомологична IFN- дикого типа, например человеческий IFN-, имеющий SEQ ID NO:2 или 4. Варианты могут включать замены,делеции или добавления одной или нескольких аминокислот. Например, можно использовать биологически активные фрагменты белков IFN- дикого типа. В таких фрагментах могут быть удалены, добавлены или заменены 1, 2, 3, 5, 10 или до 20 аминокислот у С- или N-конца белка. Варианты могут также включать замены, делеции или добавления 1, 2, 3, 5, 10 или до 20 аминокислот. Некоторые варианты могут включать замены, делеции или добавления менее 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7 или 5 аминокислот. Для замен могут быть использованы естественные аминокислоты или их аналоги, например Dстереоизомерные аминокислоты.-5 009289 В объем данного изобретения входят варианты IFN-, кодированные нуклеиновыми кислотами,гибридизирующими в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, кодирующей естественный IFN-, например, выраженный SEQ ID NO:1 или 3, или ее комплементом. Условия соответствующей строгости,которые стимулируют гибридизацию ДНК, например, 6,0-кратный объем хлорида натрия/цитрата натрия(SSC) при температуре около 45 С с последующей промывкой 2,0-кратным объемом SSC при 50 С, известны специалистам в данной области или с ними можно ознакомиться в публикациях: Current Protocolsprobe assays, Elsevier, New York. Например, концентрацию соли на стадии промывки можно выбрать в диапазоне от условий низкой строгости, соответствующих примерно 2,0-кратному объему SSC при 50 С,до условий высокой строгости, соответствующих примерно 0,2-кратному объему SSC при 50 С. Кроме того, температуру на стадии промывки можно повысить в интервале от условий низкой строгости при комнатной температуре, около 22 С, до условий высокой строгости при температуре около 65 С. Можно изменять температуру и концентрацию соли, либо температура или концентрация соли могут иметь постоянные значения при одновременном изменении другого параметра. Типичные условия гибридизации включают гибридизацию в 6,0-кратном объеме хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) при температуре около 50 С с последующей промывкой в 0,2-кратном объеме SSC при комнатной температуре. Температуру на стадии промывки можно повысить примерно до 45, 50, 55, 60 или 65 С с целью усиления строгости гибридизации. Гибридизацию можно также выполнять в 5-кратном объеме SSC, 4-кратном объемеSSC, 3-кратном объеме SSC, 2-кратном объеме SSC, 1-кратном объеме SSC или 0,2-кратном объеме SSC. Гибридизацию можно выполнять в течение по меньшей мере 1, 2, 5, 12 или 24 ч. В процессе гибридизации может быть также использован другой агент, влияющий на строгость гибридизации, например формамид. Например, строгая гибридизация может быть выполнена в присутствии 50% формамида, который повышает строгость гибридизации при указанной температуре. Стадия промывки может быть выполнена в присутствии детергента, например SDS, в таком количестве, как 0,1 или 0,2% SDS. После гибридизации может быть выполнена промывка, включающая одну стадию или по меньшей мере две стадии, которые могут производиться при одинаковой или разной солености и температуре. Например, после гибридизации могут быть выполнены две промывки при 65 С каждая в течение примерно 20 мин в 2-кратном объеме SSC, 0,1% SDS, с последующим выполнением двух промывок при 65 С каждая в течение примерно 20 мин в 0,2-кратном объеме SSC, 0,1% SDS. Типичные строгие условия гибридизации включают гибридизацию в течение ночи при 65 С в растворе, содержащем 50% формамида, 10-кратный объем раствора Денхардта (0,2% фиколла, 0,2% поливинилпирролидона, 0,2% альбумина бычьей сыворотки) и 2 00 мкг/мл денатурированной несущей ДНК, например фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующим выполнением двух промывок при 65 С каждая в течение примерно 20 мин в 2-кратном объемеSSC, 0,1% SDS, и двух промывок при 65 С в течение примерно 20 мин в 0,2-кратном объеме SSC, 0,1%SDS. Гибридизация может включать гибридизацию двух нуклеиновых кислот в растворе или нуклеиновой кислоты в растворе с нуклеиновой кислотой, прикрепленной к твердой подложке, такой как фильтр. В некоторых случаях, например, когда одна нуклеиновая кислота находится на твердой подложке, гибридизации может предшествовать стадия предварительной гибридизации, которую выполняют в течение по меньшей мере 1, 3 или 10 ч в таком же растворе и при такой же температуре, что и в растворе для гибридизации (без зонда). В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант IFN-, гибридизируют с последовательностью SEQ ID NO:1 или 3 или ее комплементом в условиях умеренной строгости, например, включающих промывку в 2,0-кратном объемеSSC при температуре около 40 С. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант IFN-, гибридизируют с последовательностью SEQ IDNO:1 или 3 или ее комплементом в условиях высокой строгости, например, включающих промывку в 0,2-кратном объеме SSC при температуре около 65 С. Типичными модификациями являются консервативные модификации, которые оказывают минимальное влияние на вторичную и третичную структуру белка. Типичные консервативные замены включают замены, описанные в публикациях Dayhoff in the Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) иArgos in EMBO J., 8, 779-785 (1989). Например, аминокислоты, относящиеся к одной из нижеследующих групп, представлят собой консервативные замены: ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr; cys, ser, tyr, thr; val, ile,leu, met, ala, phe; lys, arg, his; и phe, tyr, trp, his. Другие модификации включают замену одной аминокислоты другой аминокислотой, которая необязательно может представлять консервативную замену. Например, можно производить замены, которые, по существу, не влияют на трехмерную структуру IFN-. Трехмерная структура негликозилированного человеческого IFN- описана, например, в публикации Radhakrishnan et al. (1996) Structure 4: 1453, и трехмерная структура гликозилированного IFN- описана, например, в публикации Karpusas et al. (1997)PNAS 94:11813. В частности, IFN- содержит пять спиралей: спираль А, включающую аминокислоты 2-6 009289 22 SEQ ID NO:4; спираль В, включающую аминокислоты 51-71 SEQ ID NO:4; спираль С, включающую аминокислоты 80-107 SEQ ID NO:4; спираль D, включающую аминокислоты 118-136 SEQ ID NO:4, и спираль Е, включающую аминокислоты 139-162 SEQ ID NO:4 (Karpusas et al., см. выше). Спирали А, В,С и Е образуют левосторонний четырехспиральный тяж типа 2. В IFN- имеется длинная верхняя петля АВ, соединяющая спирали А и В, и три более короткие петли (именуемые ВС, CD и DE), соединяющие остальные спирали (Karpusas et al., см. выше). Ранее выполненные исследования показали, что Nконцевые, С-концевые и гликозилированные области спирали С молекулы IFN- не находятся в сайте связывания рецептора (см. заявки WO 00/23472 и USSN 09/832659). Поэтому мутации в указанных областях не оказывают существенного вредного влияния на биологическую активность молекулы IFN. Кроме того, ранее было установлено, что мутации в спирали С (аминокислоты 81, 82, 85, 86 и 89 зрелого человеческого IFN-) вызывают образование молекулы, обладающей более высокой антивирусной активностью по сравнению с IFN- дикого типа (см. заявки WO 00/23472 и USSN 09/832659). Аналогичным образом было установлено, что мутанты в спирали А (аминокислоты 2, 4, 5, 8 и 11 зрелого человеческого IFN-) и петле CD (аминокислоты 110, 11, 113, 116 и 119) обладают более высовой активностью связывания с рецептором и более высокой антивирусной и антипролиферативной активностью по сравнению с естественным человеческим IFN- дикого типа (см. заявки WO 00/23472 и USSN 09/832659). Другие предпочтительные модификации или замены устраняют сайты для межмолекулярного перекрестного сшивания и неправильного образования дисульфидных связей. Например, известно, что IFNимеет три остатка cys в положениях 17, 31 и 141 SEQ ID NO:4 дикого типа. Одним вариантом IFN является IFN, в котором остаток cys (С) в положении 17 заменен остатком ser (S), как это описано, например,в патенте США 4588585. Другими вариантами IFN- являются варианты IFN-, в которых один или несколько остатков cys (С) в положении 17 заменены остатками ser (S) и остаток val (V) в положении 101 заменен остатком phe (F), trp (W), tyr (Y) или his (H), предпочтительно phe (F), при нумерации в соответствии с IFN-p дикого типа, имеющего, например, SEQ ID NO:4, аналогично описанному, например, в патенте США 6127332. Другие предпочтительные варианты включают полипептиды, содержащие последовательность IFN- дикого типа, например, SEQ ID NO:4, в которой остаток val (V) в положении 101 при нумерации в соответствии с IFN- дикого типа заменен остатком phe (F), tyr (Y), trp (W), his (H) или phe (F), как это описано в патенте США 6127332. Другие варианты IFN- представляют собой молекулы зрелого IFN-, в которых отсутствует инициирующий метионин, например, метионин 1 SEQ ID NO:4. В типичных вариантах IFN- отсутствует инициирующий метионин и заменена по меньшей мере одна аминокислота, например, в положении 17 зрелой формы, как это описано в патенте США 4588585. Молекулы IFN- можно также модифицировать путем замены одной или нескольких аминокислот одной или несколькими производными аминокислот, являющимися естественными или искусственными аминокислотами, в которых естественная боковая цепь или концевая группа модифицирована в результате выполнения химической реакции. Такие модификации включат, например, гамма-карбоксилирование, бета-карбоксилирование, пегилирование, сульфатирование, сульфирование, фосфорилирование, амидирование, этерификацию, N-ацетилирование, карбобензилирование, тозилирование и другие модификации, известные в данной области. Другие модификации включают использование аминокислотных аналогов или производных аминокислот, в которых боковая цепь удлинена или укорочена с образованием карбоксильной, аминогруппы или другой реакционноспособной функциональной группы-предшественника для циклизации, а также аминокислотных аналогов, имеющих разные боковые цепи с соответствующими функциональными группами. Например, соединение по данному изобретению может включать аминокислотный аналог,такой как, например, цианоаланин, канаванин, дьенколовая кислота, норлейцин, 3-фосфосерин, гомосерин, дигидроксифенилаланин, 5-гидрокситриптофан, 1-метилгистидин, 3-метилгистидин, диаминопимелиновая кислота, орнитин или диаминомасляная кислота. Специалистам в данной области должны быть известны другие естественные аминокислотные метаболиты или предшественники, имеющие приемлемые боковые цепи, которые входят в объем настоящего изобретения. Другие варианты IFN- включают обратные или ретро пептидные последовательности. Обратная или ретро пептидная последовательность означает часть общей последовательности ковалентносвязанных аминокислотных остатков (их аналогов или псевдоостатков), в которой нормальное образование пептидной связи в направлении от карбоксиконца к аминоконцу в аминокислотном остове было изменено таким образом, что при считывании в обычном направлении слева направо аминоконцевая часть пептидной связи предшествует (а не находится позади) карбоксиконцевой части. См. публикацию Goodman,M. and Chorev, М. Accounts of Chem. Res. 1979, 12, 423. Пептиды с обратной ориентацией, рассмотренные в данном описании изобретения, включают (а) пептиды, в которых один или несколько аминоконцевых остатков расположены в обратной (rev) ориентации (образуя таким образом второй карбоксиконец в левой части молекулы), и (b) пептиды, в которых один или несколько карбоксиконцевых остатков расположены в обратной (rev) ориентации (образуя второй аминоконец в правой части молекулы). Пептидная (амидная) связь не может быть образована на поверхности раздела между остатком с нор-7 009289 мальной ориентацией и остатком с обратной ориентацией. Поэтому некоторые обратные полипептиды по данному изобретению можно получить, используя соответствующую аминокислотную псевдочасть для связывания двух смежных частей последовательностей при помощи обратной пептидной (обратной амидной) связи. В вышеуказанной случае (a) центральный остаток дикетосоединения можно успешно использовать для связывания структур двумя амидными связями с получением псевдопептидной структуры. В вышеуказанном случае (b) центральный остаток диаминосоединения можно аналогичным образом использовать для связывания структур двумя амидными связями с образованием псевдопептидной структуры. Обратное направление связывания в таких полипептидах обычно требует дополнительной инверсии энантиомерной конфигурации обратных аминокислотных остатков для сохранения пространственной ориентации боковых цепей, которая аналогична ориентации нормального пептида. Конфигурация аминокислот в обратной части пептидов предпочтительно является D-конфигурацией, и конфигурация нормальной части предпочтительно является L-конфигурацией. Противоположные или смешанные конфигурации являются приемлемыми для оптимизации активности связывания в тех случаях, когда это возможно. Модификации полипептидов далее описаны, например, в патенте США 6399075. Препараты IFN- включают также белки IFN- и их варианты (например зрелый белок), слитые с одним или несколькими гетерологичными полипептидами. Гетерологичный полипептид может быть добавлен, например, для увеличения полупериода существования белка IFN- или усиления его продуцирования. Типичные гетерологичные полипептиды включают молекулы иммуноглобулина (Ig) или их части, например, константный домен легкой или тяжелой цепи молекулы Ig. В одном варианте осуществления изобретения белок IFN- или его вариант сливают или каким-либо другим образом связывают со всей или частью шарнирной и константной областей легкой цепи, тяжелой цепью или обеими цепями иммуноглобулина. Таким образом, данное изобретение относится к молекуле, которая включает:(1) белковую часть IFN- (то есть IFN- или его вариант),(2) второй пептид, например, пептид, увеличивающий растворимость или время существования invivo части IFN-, в частности, член надсемейства иммуноглобулинов, его фрагмент или часть, например часть или фрагмент IgG, а именно константную область тяжелой цепи IgG1 человека, например, СН 2-,СН 3- и шарнирные области. В частности, термин слитый белок IFN-/Ig означает белок, содержащий биологически активную часть IFN-, связанную с N-концом цепи иммуноглобулина. Подвидом слитого белка IFN-/Ig является слитый белок IFN-/Fc, который является белком, содержащим часть IFN-,связанную по меньшей мере с частью константного домена иммуноглобулина. Предпочтительный Fcслитый белок содержит часть IFN-, связанную с фрагментом антитела, включающим С-концевой домен тяжелых цепей иммуноглобулина. Слитый белок может содержать полипептид IFN- или его вариант, с N- и С-концами которого связаны гетерологичные полипептиды. Гетерологичный полипептид может также находиться внутри полипептида IFN- или его варианта. В одном варианте осуществления изобретения слитый белок имеет общую формулу X-Y-Z, где X означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность IFN-, его части или варианта; Y означает необязательную линкерную часть и Z означает полипептид, содержащий по меньшей мере часть полипептида, не являющуюся бета-интерфероном части X. В других вариантах осуществления изобретения слитый белок имеет формулу Z-Y-X, где полипептид, не являющийся IFN-, слит с Nконцевой частью линкера, слитой с N-концевой частью полипептида IFN-, его части или варианта. Часть Z может быть частью полипептида, содержащей иммуноглобулиноподобные домены. Примеры таких полипептидов включают CD1, CD2, CD4 и основные антигены гистосовместимости, относящиеся к классу I и классу II. См. патент США 5565335 (Capon et al) для ознакомления с примерами таких полипептидов. Часть Z может включать, например, несколько остатков гистидина или предпочтительно Fc-область иммуноглобулина; термин Fc в данном описании изобретения означает фрагмент антитела, содержащий С-концевой домен тяжелой цепи иммуноглобулина. Часть Y может быть любым линкером, позволяющим части IFN- сохранять свою биологическую активность. Часть Y может состоять из одной аминокислоты или по меньшей мере из двух аминокислот.Y может также включать от около 2 до около 5 аминокислот; от около 3 до около 10 аминокислот либо 10 или более аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления изобретения Y включает последовательность GlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO:6), кодированную, например, нуклеотидной последовательностью GGCGGTGGTGGCAGC (SEQ ID NO:5). Y может также включать сайт узнавания энтерокиназы, например, AspAspAspAspLys (SEQ ID NO:8), кодированный, например, последовательностьюGACGATGATGACAAG (SEQ ID NO:7). В другом варианте осуществления изобретения Y включает последовательность SerSerGlyAspAspAspAspLys (SEQ ID NO:10), кодированную, например, последовательностью AGCTCCGGAGACGATGATGACAAG (SEQ ID NO:9). Кроме того, часть IFN- (X) и вторая часть Z, не являющаяся IFN- (например, Fc-область иммуноглобулина), могут быть также связаны в результате осуществления любой химической реакции, которая позволяет связать две молекулы вместе при сохранении частями X и Z соответствующей активности.-8 009289 Указанное химическое связывание может включать многие химические механизмы, такие как ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляция, координационное связывание и комплексообразование. Типичные связующие агенты (то есть линкеры (Y) в общей формуле), используемые для ковалентного связывания части IFN- с частью Z, могут включать органические соединения, такие как сложные тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидоэфиры, диизоцианаты, такие как толилен-2,6-диизоцианат,глутеральдегиды, диазобензолы и гексаметилендиамины, такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин, бифункциональные производные имидоэфиров, такие как диметиладипимидат, и бис-активные соединения фтора, такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол. В вышеуказанный перечень входят разные классы химических связующих агентов, известных в данной области. Многие указанные агенты можно приобрести коммерческим путем, в частности, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP),гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC), 4-сукцинимидилоксикарбонилальфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол (SMPT; Pierce Chem. Co.,по каталогу 21558G). Предпочтительный слитый белок IFN-/Ig имеет SEQ ID NO:12, которая содержит непроцессированную зрелую форму человеческого IFN-, то есть SEQ ID NO:4, слитую с Fc-областью человеческогоIgGl (ZL5107) (см. заявки WO 00/23472 и USSN 09/832659) (см. фиг. 1). Соответствующая нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:11. ДНК, кодирующая человеческий IFN-, заканчивается у триплета нуклеотидов 568-570 (ААС, кодирующий аргинин), и ДНК, кодирующая константную область человеческого IgG1, начинается у триплета (GAC, кодирующий аспарагиновую кислоту), начинающегося с нуклеотида 574 SEQ ID NO:11. Другой предпочтительный слитый белок IFN-/Ig приведен в SEQ ID NO:14 и кодирован SEQ IDNO:13 (см. заявки WO 00/23472 и USSN 09/832659) (см. фиг. 2). Указанный слитый белок включает человеческий IFN-, слитый с линкером G4S, который в свою очередь связан с Fc-областью человеческогоIgGl (ZL6206). Линкер G4S (кодированный нуклеотидами 571-585 SEQ ID NO:7) включает аминокислотную последовательность GGGGS (SEQ ID NO:9). Способы продуцирования указанных белков описаны в заявках WO 00/23472 и USSN 09/832659. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид IFN- слит у С-конца по меньшей мере с частью Fc-области иммуноглобулина. IFN- образует аминоконцевую часть, и Fcобласть образует карбоксиконцевую часть. В указанных слитых белках Fc-область предпочтительно ограничена шарнирной областью константного домена и СН 2- и СН 3-доменами. Fc-область в указанных слитых белках может быть также ограничена частью шарнирной области, способной образовывать межмолекулярные дисульфидные связи, и СН 2- и СН 3-доменами или их функциональными эквивалентами. Указанные константные области могут быть получены у любого млекопитающего (предпочтительно человека) и выделены из любого соответствующего класса и/или изотипа, включая IgA, IgD, IgM, IgE иIgGl, IgG2, IgG3 и IgG4. Молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот, кодирующие Ig-слитые белки, могут быть получены любым методом, известным в данной области (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cole. Spring Harbor, N.Y.), или выделены из доступных клонов. Методы получения генов, кодирующих константные области тяжелой или легкой цепи иммуноглобулинов, рассмотрены, например, в заявке РСТ, Robinson, R. et al., публикация WO 87/02671. Последовательность кДНК, кодирующая молекулу интерферона или ее фрагмент, может быть непосредственно связана с кДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи Ig, или при помощи линкерной последовательности. В других вариантах осуществления изобретения может быть создана рекомбинантная векторная система для введения последовательностей, кодирующих бета-интерферон, в правильную рамку считывания с синтетической шарнирной областью. Кроме того, может быть желательно, чтобы рекомбинантная векторная система включала в виде составной части нуклеиновые кислоты, соответствующие 3'фланкирующей области гена иммуноглобулина, содержащего сайты расщепления/полиаденилирования РНК и нижние последовательности. Далее может быть желательно создать сигнальную последовательность вверху от последовательностей, кодирующих слитый белок иммуноглобулина, для облегчения секреции слитой молекулы из клетки, трансформированной рекомбинантным вектором. Настоящее изобретение относится к димерным слитым молекулам, а также к мономерным или многомерным молекулам, содержащим слитые белки. Такие многомеры можно получить, используя Fcобласти или их части молекул Ig, которые обычно являются многовалентными, такие как пентамеры IgM или димеры IgA. Очевидно, что для образования и стабилизации пентамеров IgM и димеров IgA может быть нужен соединительный полипептид J. Альтернативно, многомеры слитых белков IFN- могут быть образованы с использованием белка, обладающего сродством к Fc-области молекул Ig, такого как белок А. Например, несколько слитых белков IFN-/иммуноглобулина можно связать с агарозными гранулами,содержащими белок А. Указанные многовалентные формы являются весьма полезными, так как они имеют несколько сайтов связывания с рецепторами бета-интерферона. Например, двухвалентный растворимый IFN- может содержать два последовательных повтора аминокислот 1-166 SEQ ID NO:4 (или повторы, кодированные нуклеиновыми кислотами 1-4 98 SEQ ID NO:3) (часть X в общей формуле), разделенных линкерной об-9 009289 ластью (часть Y), причем указанные повторы связаны по меньшей мере с одной частью константного домена иммуноглобулина (часть Z). Можно также создать альтернативные многовалентные формы, например, в результате химического связывания слитых белков IFN-/Ig с любой клинически приемлемой несущей молекулой, полимером, выбранным из группы, состоящей из фиколла, полиэтиленгликоля или декстрана, при помощи обычных методов связывания. Альтернативно, IFN- может быть химически связан с биотином, и полученный конъюгат биотина и Fc-области бета-интерферона затем связывают с авидином, в результате чего образуются трехвалентные молекулы авидина/биотина/бета-интерферона. Слитые белки IFN-/Ig могут быть также ковалентно связаны с динитрофенолом (DNP) или тринитрофенолом (TNP), после чего полученный конъюгат осаждают при помощи антитела против DNP или антитела против TNP-IgM с образованием декамерных конъюгатов с валентностью 10 для сайтов связывания рецепторов бета-интерферона. Производные белков по данному изобретению включают также разные структурные формы первичного белка, сохраняющие биологическую активность. Благодаря наличию ионизируемых амино-и карбоксильных групп, белки IFN- и их варианты могут находиться в форме кислых или основных солей или в нейтральной форме. Отдельные аминокислотные остатки могут быть также модифицированы окислением или восстановлением. Кроме того, первичная аминокислотная структура (включая N- и/или С-концы) или гликан IFN- могут быть модифицированы (с получением производных соединений) путем образования ковалентных или агрегированных конъюгатов с другими химическими частями, такими как гликозильные группы, полиалкиленгликоли, в частности полиэтиленгликоль, липиды, фосфаты, ацетильные группы и тому подобные, или путем создания мутантов аминокислотной последовательности. Другие производные бета-интерферона/Ig включают ковалентные или агрегированные конъюгаты бета-интерферона или его фрагментов с другими белками или полипептидами, например, полученные в результате синтеза в рекомбинантной культуре в виде дополнительных N- или С-концов. Например,конъюгированный пептид может быть сигнальной (или лидерной) полипептидной последовательностью в N-концевой области белка, которая одновременно с трансляцией или после трансляции направляет перенос белка с сайта синтеза на функциональный сайт внутри или снаружи клеточной мембраны или стенки (например, лидерная последовательность альфа-фактора дрожжей). Например, сигнальный пептид может быть последовательностью IFN-, включающей, в частности, аминокислоты 1-21 SEQ IDNO:2, соответствующие нуклеотидам 76-138 SEQ ID NO:1. Сигнальный пептид может также иметь последовательность VCAM, то есть включать аминокислоты 1-24 SEQ ID NO:12, которая кодирована нуклеотидами 1-72 SEQ ID NO:11. Гетерологичный полипептид (например пептид) или другую молекулу можно также использовать в качестве метки или для облегчения очистки препарата IFN-. Такие пептиды хорошо известны в данной области. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению может быть слит в рамке считывания с маркерной последовательностью, определяемой также как Tag-последовательность, кодирующая Tagпептид, которая позволяет метить и/или очищать полипептид по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления изобретения маркерная последовательность представляет собой гексагистидиновую метку, например, переносимую вектором PQE-9. Многие другие Tag-пептиды можно приобрести коммерческим путем. Другие часто используемые Tag-метки включают myc-эпитопы (см.,например, Ellison et al. (1991), J. Biol. Chem. 266:21150-21157), которые содержат последовательность из 10 остатков, выделенную из с-myc, систему pFLAG (International Biotechnologies, Inc.), систему pEZZбелок A (Pharmacia, NJ) и часть белка гемагглютинина Haemophilus influenza, состоящую из 16 аминокислот. Кроме того, в качестве Tag-метки можно использовать любой полипептид, если можно получить или идентифицировать реагент, например антитело, специфически взаимодействующее с Tagполипептидом. В одном варианте осуществления изобретения белок IFN- или его вариант слит у N- или С-конца с одним из нижеследующих пептидов: HisHisHisHisHisHis (SEQ ID NO:6), который может быть кодирован нуклеотидной последовательностью САТСАТСАТСАТСАТСАТ (SEQ ID NO:15); SerGlyGlyHisHisHisHisHisHis (SEQ ID NO:18), который может быть кодирован нуклеотидной последовательностьюTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCAT (SEQ ID NO:15) и SerGlyGlyHisHisHisHisHisHisSerSerGlyAspAspAspAspLys (SEQ ID NO:20), который может быть кодирован нуклеотидной последовательностьюTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCTCCGGAGACGATGATGACAAG (SEQ ID NO:19). Аминокислотная последовательность бета-интерферона может быть также связана с пептидом AspTyrLysAspAspAspAspLys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:21) (Норр et al., Bio/Technology 6:1204, 1988). Указанная последовательность является высокоантигенной и содержит эпитоп, обратимо связывающийся специфическим моноклональным антителом, позволяя производить экспресс-анализ и простую очистку экспрессированного рекомбинантного белка. Кроме того, указанная последовательность специфически расщепляется энтерокиназой слизистой оболочки крупного рогатого скота у остатка, следующего сразу же за парой остатков Asp-Lys. В другом варианте осуществления изобретения препарат IFN- содержит белок IFN- или его вариант, слитый с белком альбумина, его вариантом или частью. Такой слитый белок можно получить спосо- 10009289 бом, описанным, например, в заявке WO 01/77137. Препарат IFN- может также содержать молекулу, которая не является полипептидом. Например,белок IFN- или его вариант может быть ковалентно или нековалентно связан с полимером, например с биологически разрушаемым полимером. Например, белок IFN- или его вариант может быть модифицирован полиэтиленгликолем, например, связан с полиэтиленгликолем (ПЭГ) способом, описанным в заявке WO 00/23114. В соответствии с широким объемом настоящего изобретения для конъюгации с IFN- может быть использована одна молекула полимера, хотя известно, что к IFN- может быть также присоединено несколько полимерных молекул. Очевидно, что для конъюгации полимера можно использовать любые группы, части или другие конъюгированные разновидности, соответствующие конечному применению. В качестве примера можно отметить, что полимер можно использовать в некоторых применениях для ковалентного связывания с функциональной частью, сообщающей полимеру устойчивость к деструкции под действием УФ-излучения, антиоксидантные или другие свойства. В качестве другого примера можно отметить, что в некоторых применениях желательно активировать полимер, чтобы сделать его реакционноспособным или перекрестно сшиваемым с целью усиления разных свойств или характеристик конъюгированного вещества. Поэтому полимер может содержать любые функциональные группы, повторяющиеся группы, связи или другие структуры, которые не ухудшают эффективность конъюгированной композиции IFN- для предполагаемого применения.IFN- предпочтительно конъюгируют при помощи концевой реакционноспособной группы в полимере, хотя конъюгацию можно также производить в виде боковой цепи при помощи неконцевых реакционноспособных групп. Полимер, имеющий одну или несколько реакционноспособных групп, определяется в данном описании изобретения как активированный полимер. Реакционноспособная группа избирательно взаимодействует со свободными аминогруппами или другими реакционноспособными группами в белке. Активированный полимер подвергают взаимодействию так, чтобы его можно было присоединить по любой имеющейся аминогруппе IFN-, такой как альфа-аминогруппы или эпсилонаминогруппы лизинов. Свободные карбоксильные группы, должным образом активированные карбонильные группы, гидроксильные, гуанидильные, окисленные углеводородные части и меркаптогруппыIFN- (при их наличии) можно также использовать в качестве сайтов присоединения. Несмотря на то, что полимер можно присоединить в любом месте цепи молекулы IFN- или его варианта либо другой аминокислоты, присоединенной при помощи прямой или непрямой связи к молекулеIFN-, наиболее предпочтительным сайтом для связывания полимера является N-конец молекулы IFN-. Вторичные сайты расположены у С-конца или рядом с ним и на всех сайтах цепи сахарных частей. Таким образом, наиболее предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают: (i) конъюгаты IFN- или его варианта с полимером, присоединенным у N-конца; (ii) конъюгаты IFN- или его варианта с полимером, присоединенным у С-конца; (iii) конъюгаты с полимером, связанные сахарными частями; (iv) конъюгаты белков IFN- или их вариантов с полимером, присоединенным у N-, Сконца и при помощи сахарных частей. Обычно используют от около 1,0 до около 10 моль активированного полимера на моль белка в зависимости от концентрации белка. Конечное количество должно представлять собой баланс между максимальным увеличением эффективности реакции и минимальным образованием неспецифических модификаций продукта, а также между созданием химической структуры, сохраняющей оптимальную активность, и оптимизацией, если это возможно, полупериода существования белка. Желательно сохранить по меньшей мере около 50% биологической активности белка и наиболее предпочтительно 100%. Указанные реакции можно выполнять любым приемлемым методом, используемым для осуществления взаимодействия биологически активных веществ с инертными полимерами, предпочтительно при рН около 5-7, если реакционноспособные группы находятся в положении альфа-аминогруппы у N-конца. Указанный процесс обычно включает получение активированного полимера (который может иметь по меньшей мере одну концевую гидроксильную группу) и последующее взаимодействие белка с активированным полимером с образованием растворимого белка, приемлемого для получения лекарственного средства. Вышеуказанная модификация реакции может быть выполнена несколькими методами, включающими одну или несколько стадий. Как указано выше, в наиболее предпочтительных вариантах осуществления изобретения используется N-конец IFN- в качестве связующего звена для полимера. Существуют приемлемые методы для избирательного получения IFN- с модифицированным N-концом. Одним методом является восстановительное алкилирование, при выполнении которого используют разную реакционную способность первичных аминогрупп разных типов (эпсилон-аминогруппы лизина по сравнению с аминогруппами Nконцевого метионина), используемых для получения производных соединений IFN-. В соответствующих избирательных условиях может быть получено производное соединение IFN-, к N-концу которого присоединяют полимер, содержащий карбонильную группу. Указанную реакцию выполняют при значении рН, позволяющем использовать преимущество различий между показателями pKa эпсилон- 11009289 аминогрупп остатков лизина и альфа-аминогруппы N-концевого остатка IFN-. Химическая реакция такого типа хорошо известна специалистам в данной области. Например, можно использовать схему реакций, в которой подобная избирательность сохраняется в результате выполнения реакций при низком значении рН (обычно 5-6) в условиях, при которых ПЭГальдегидный полимер подвергают взаимодействию с IFN- в присутствии цианоборогидрида натрия. После очистки ПЭГ-IFN- и анализа методом SDS-PAGE, масс-спектрометрии MALDI и секвенирования/картирования пептида получают IFN-, к N-концу которого направленно присоединена часть ПЭГ. Кристаллическая структура IFN- показывает, что N- и С-концы расположены близко друг к другуIFN- должны также оказывать минимальное влияние на активность. Хотя не существует простого химического метода направленной доставки полиалкиленгликоля, такого как ПЭГ, к С-концу, подобный результат может быть достигнут в результате генетического создания сайта, который можно использовать для направленного присоединения полимерной части. Например, введение остатки Cys в положение, расположенное у С-конца или рядом с ним, позволяет получить специфическую модификацию с использованием имида малеиновой кислоты, винилсульфона или полиалкиленгликоля (например, ПЭГ),активированного гелогенацетатом. Указанные производные можно специфически использовать для модификации созданных цистеинов благодаря высокой селективности данных реагентов в отношении остатков Cys. Другие методы, такие как введение гистидиновой метки, обладающей направленным действием (Fancy et al., (1996) ChemBiol. 3:551), или создание дополнительного сайта гликозилирования,представляют собой другие альтернативы для модификации С-конца IFN-. Гликан в IFN- также занимает положение, которое позволяет производить дальнейшую модификацию без изменения активности. Методы направленной доставки к сахарам, используемым в качестве сайтов для химической модификации, также хорошо известны и поэтому весьма вероятно, что полиалкиленгликоль может быть непосредственно и специфически присоединен к сахарам в IFN-, которые были активированы путем окисления. Например, можно получить гидразид полиэтиленгликоля, который образует относительно устойчивые гидразоновые связи в результате конденсации с альдегидами и кетонами. Указанное свойство было использовано для модификации белков при помощи окисленных олигосахаридных связей. См. публикацию Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179:301. В частности, обработка карбоксиметилгидразида полиэтиленгликоля нитритом позволяет получить карбоксиметилазид полиэтиленгликоля, который представляет собой электрофильно активную группу, взаимодействующую с аминогруппами. Указанную реакцию можно использовать также для получения белков, модифицированных полиалкиленгликолем. См. патенты США 4101380 и 4179337. Химическая структура, созданная при помощи тиолового линкера, может далее облегчить перекрестное сшивание белков. Указанную реакцию можно выполнить путем создания реакционноспособных альдегидов в углеводородных частях при помощи периодата натрия, образования конъюгатов цистамина с использованием альдегидов и индукции перекрестного сшивания при помощи тиоловых групп в цистаминах (см. Pepinsky, В. et al., (1991), J. Biol. Chem., 266: 18244-18249 and Chen, L.L. et al., (1991) J. Biol.Chem., 266: 18237-18243). Поэтому предполагается, что данный тип химической структуры пригоден для модификации полиалкиленгликолями, если в сахар введен линкер и полиалкиленгликоль присоединен к указанному линкеру. Хотя аминотиоловые или гидразинсодержащие линкеры пригодны для добавления одной полимерной группы, структура линкера может быть изменена с возможностью присоединения нескольких полимеров и/или изменения пространственной ориентации полимера относительно IFN-. Типичными полимерами являются водорастворимые полимеры, такие как полиалкиленгликоль. Неограничивающий список таких полимеров включает другие гомополимеры полиалкиленоксида, такие как полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и блоксополимеры. Другие примеры главной цепи приемлемых водорастворимых и непептидных полимеров включают полиоксиэтилированный полиол, полиолефиновый спирт, поливинилпирролидон, полигидроксипропилметакриламид, полигидроксикислоту, поливиниловый спирт, полифосфазен, полиоксазолин, поли-Nакрилоилморфолин и их сополимеры, тройные сополимеры и смеси. В одном варианте осуществления изобретения полимерным остовом является полиэтиленгликоль или монометоксиполиэтиленгликоль(мПЭГ) со средней молекулярной массой от около 200 Да до около 400000 Да. Должно быть понятно, что другие родственные полимеры также пригодны для осуществления настоящего изобретения, и ПЭГ или полиэтиленгликоль входит в перечень таких полимеров. Термин ПЭГ означает полиэтиленгликоль в любых формах, включая алкокси-ПЭГ, бифункциональный ПЭГ, ПЭГ с множественным разветвлением,ПЭГ с раздвоенной цепью, ПЭГ с разветвленной цепью, ПЭГ с боковыми заместителями или ПЭГ с расщепляемыми связями. В одном варианте осуществления изобретения полиалкиленгликолевые остатки С 1-С 4 алкилполиалкиленгликолей, предпочтительно полиэтиленгликоля (ПЭГ), или полиоксиалкиленгликолевые остатки таких гликолей входят в представляющие интерес полимерные системы. Таким образом, полимер, к которому присоединяют белок, может быть гомополимером полиэтиленгликоля (ПЭГ) или полиоксиэтилированным полиолом, при условии что во всех случаях полимер растворяется в воде при комнатной тем- 12009289 пературе. Неограничивающие примеры таких полимеров включают гомополимеры полиалкиленоксида, такие как ПЭГ или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные гликоли, их сополимеры и блоксополимеры, при условии сохранения водорастворимости блоксополимера. Примеры полиоксиэтилированных полиолов включают, например, полиоксиэтилированный глицерин, полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированную глюкозу и тому подобные. Глицериновый остов полиоксиэтилированного глицерина аналогичен естественному остову, существующему, например, у животных и человека в моно-, дии триглицеридах. Поэтому такое разветвление необязательно должно быть чужеродным для организма. В качестве альтернативы полиалкиленоксидам можно использовать декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, углеводородные полимеры и тому подобные. Специалистам в данной области должно быть понятно, что приведенный выше список является иллюстративным и в объем изобретения входят все полимеры, обладающие описанными свойствами. Полимер может иметь любую молекулярную массу, но предпочтительная молекулярная масса находится в пределах от около 300 до 100000, более предпочтительно от 10000 до 40000. В частности, молекулярная масса, равная 20000 или больше, лучше всего позволяет предотвратить потерю белка вследствие фильтрации в почках. Производные соединения полиалкиленгликоля обладают рядом свойств, полезных для получения конъюгатов полимер-IFN- при осуществлении настоящего изобретения, таких как лучшая водорастворимость при одновременном сохранении антигенной или иммуногенной реакции; высокая степень биосовместимости; отсутствие биоразрушения производных полиалкиленгликоля in vivo и более легкое выведение из живых организмов. Кроме того, другим объектом данного изобретения является использование IFN-, ковалентно связанного с полимером, причем в данном случае конъюгация достигается за счет расщепляемых ковалентных химических связей. Такая конъюгация позволяет контролировать время, по истечении которого полимер может быть отщеплен от IFN-. Ковалентная связь между препаратом IFN- и полимером может быть расщеплена в результате химической или ферментативной реакции. Продукт, представляющий собой IFNполимерный конъюгат, сохраняет активность на приемлемом уровне. Одновременно с этим в конъюгирующем полимере присутствуют части полиэтиленгликоля, сообщающие IFNполимерному конъюгату высокую водорастворимость и более продолжительное сохранение в кровотоке. Благодаря улучшенным характеристикам IFNполимерного конъюгата данное изобретение делает возможной парентеральную, назальную и пероральную доставку активного IFNполимерного конъюгата с последующим гидролитическим расщеплением связей, улучшает биологическую доступность IFN- при применении in vivo. Взаимодействие полимера и IFN- с образованием конъюгатов, например, продуктов, конъюгированных у N-конца, можно легко выполнить при помощи целого ряда схем реакций. Активность и устойчивость конъюгатов IFN- можно изменять разными способами, используя полимеры с разной молекулярной массой. Растворимость конъюгатов можно варьировать путем изменения пропорции и размера фрагмента полиэтиленгликоля, введенного в полимерную композицию. В одном варианте осуществления изобретения конъюгаты по настоящему изобретению получают,осуществляя взаимодействие белка с активированным соединением полиалкиленгликоля (PCG). Например, IFN можно подвергнуть взаимодействию с ПЭГ-альдегидом в присутствии восстановителя (например, цианоборогидрида натрия) при помощи восстановительного алкилирования для получения ПЭГбелкового конъюгата, соединенного амидной связью. См., например, европейский патент 0154316 В 1 и заявку на международный патентPCT/US03/01559. В некоторых вариантах осуществления изобретения человеческий IFN- ПЭГ-модифицируют с использованием следующих активированных полиалкиленгликолей: мПЭГ-O-2-метилпропиональдегид 20 кДа, мПЭГ-О-п-метилфенил-O-2-метилпропиональдегид 20 кДа, мПЭГ-О-м-метилфенил-O-2-метилпропиональдегид 20 кДа, мПЭГ-О-п-фенилацетальдегид 20 кДа, мПЭГ-О-п-фенилпропиональдегид 20 кДа и мПЭГ-О-м-фенилацетальдегид 20 кДа, получая при этом IFN-, модифицированный мПЭГ-О-2 метилпропиональдегидом 20 кДа, IFN-, модифицированный мПЭГ-О-п-метилфенил-O-2-метилпропиональдегидом 20 кДа, IFN-, модифицированный мПЭГ-О-м-метилфенил-O-2-метилпропиональдегидом 20 кДа, IFN-, модифицированный мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом 20 кДа, IFN-,модифицированный мПЭГ-О-п-фенилпропиональдегидом 20 кДа, и IFN-, модифицированный мПЭГ-Ом-фенилацетальдегидом 20 кДа. Подробное описание получения и исследования человеческого IFN-,модифицированного мПЭГ-О-2-метилпропиональдегидом: 20 кДа и мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом 20 кДа, приведено ниже, а также в заявке на международный патентPCT/US03/01559. В одном варианте осуществления изобретения пегилированный IFN- получают следующим образом. IFN-, например AVONEX (нерасфасованный промежуточный продукт IFN1a, (клиническая партия нерасфасованного лекарственного средства, прошедшая все испытания для использования при лечении человека) в количестве 250 мкг/мл в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 200 мМ NaCl) разводят- 13009289 равным объемом 100 мМ MES, рН 5,0, и доводят показатель рН до 5,0, добавляя НСl. Образец вводят в колонку FF SP-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) при 6 мг IFN-/мл смолы. Колонку промывают 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl, и продукт элюируют 30 мМ фосфата натрия, рН 6,0, 600 мМNaCl. Элюированные фракции анализируют, измеряя оптическую плотность при 280 нм, и на основании оптической плотности определяют концентрацию интерферона в образцах, используя коэффициент экстинкции, равный 1,51 для 1 мг/мл раствора. К IFN-, полученному из элюата SP, в количестве 1 мг/мл раствора, добавляют 0,5 М фосфата натрия, рН 6,0, до 50 мМ, цианоборогидрид натрия (Aldrich, Milwaukee, WI) до 5 мМ и ПЭГ-альдегид с молекулярной массой 20000 (Shearwater Polymers, Huntsville, AL) до 5 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 20 ч. Пегилированный интерферон очищают от продуктов реакции,выполняя последовательные стадии хроматографии в сортирующей колонке 6 FPLC Superose (Pharmacia) с использованием 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 150 мМ NaCl в качестве подвижной фазы и SPSepharose FF. В сортирующей колонке происходит разделение модифицированного и немодифицированного IFN-. Элюат, содержащий пегилированный бета-интерферон, собранный после гельфильтрации, разводят водой в отношении 1:1 и вводят в количестве 2 мг бета-интерферона/мл смолы в колонку SP-Sepharose. Колонку промывают 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl, после чего пегилированный бета-интерферон элюируют из колонки 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 800 мМ NaCl. Элюированные фракции анализируют в отношении содержания белка на основании оптической плотности при 280 нм. Концентрация пегилированного интерферона указана в эквивалентах интерферона, так как ПЭГ не влияет на оптическую плотность при 280 нм. Указанный метод и исследование пегилированного IFN- описаны в заявке WO 00/23114. Конъюгация IFN- с ПЭГ, по-видимому, не изменяет антивирусную активность. Кроме того, удельная активность пегилированного IFN- значительно выше (примерно в 10 раз), чем у IFN-, не модифицированного полиэтиленгликолем (WO 00/23114).IFN- можно также модифицировать ПЭГ-альдегидной частью с молекулярной массой 5000, производимой, например, компанией Fluka, Inc ( по каталогу 75936, Ronkonkoman, NY), в соответствии со способом, приведенным выше для ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 20000.IFN-, модифицированный мПЭГ-О-2-метилпропиональдегидом 20 кДа, можно получить следующим образом. 10 мл AVONEX (нерасфасованный промежуточный продукт IFN1a, (клиническая партия нерасфасованного лекарственного средства, прошедшая все испытания для использования при лечении человека) в количестве 250 мкг/мл в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 200 мМ NaCl разводят 12 мл 165 мМ MES, рН 5,0, и 50 мкл 5 н. раствора HCl. Образец вводят в 300 мкл колонку FF SP Sepharose(Pharmacia). Колонку трижды промывают 300 мкл 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 7 5 мМ NaCl и элюируют белок 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 600 мМ NaCl. Элюированные фракции анализируют в отношении оптической плотности при 280 нм и определяют концентрацию IFN- в образцах, используя коэффициент экстинкции, равный 1,51 для 1 мг/мл раствора. Соответствующие пику фракции собирают, получая при этом IFN- в концентрации 3,66 мг/мл, который затем разбавляют водой до 1,2 мг/мл. К 0,8 мл IFN-, полученного из разбавленного элюата из колонки SP-Sepharose, добавляют 0,5 М фосфата натрия, рН 6,0 до 50 мМ, цианоборогидрид натрия (Aldrich) до 5 мМ и мПЭГ-О-2 метилпропиональдегид 20 кДа до 5 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 16 ч в темноте. Пегилированный IFN- очищают от реакционной смеси в 0,5 мл колонке FF SP-Sepharose следующим образом: 0,6 мл реакционной смеси разбавляют 2,4 мл 20 мМ MES, рН 5,0, и вводят в колонку SP-Sepharose. Колонку промывают фосфатом натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl, после чего пегилированныйIFN- элюируют из колонки 25 мМ MES, рН 6,4, 400 мМ NaCl. Пегилированный IFN- затем очищают в сортирующей колонке Superose 6 HR 10/30 FPLC, используя 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 150 мМ NaCl в качестве подвижной фазы. Очистку в сортирующей колонке (25 мл) производят со скоростью 20 мл/час и собирают 0,5 мл фракции. Элюированные фракции анализируют в отношении содержания белка на основании оптической плотности при 280 нм, собирают и определяют концентрацию белка в собранном элюате. Концентрация пегилированного IFN- указана в эквивалентах IFN, так как ПЭГ не влияет на оптическую плотность при 280 нм. Отбирают образцы для анализа и остальную часть элюата разводят до 30 мкг/мл HAS-содержащим буфером, отбирают аликвоты в количестве 0,25 мл/пробирку и хранят при 70 С.IFN-, модифицированный мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом 20 кДа, можно получить следующим образом. 20 мл AVONEX (нерасфасованный промежуточный продукт IFN-, клиническая партия нерасфасованного лекарственного средства, прошедшая все испытания для использования при лечении человека, в количестве 250 мкг/мл в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 200 мМ NaCl) разводят 24 мл 165 мМ MES, рН 5,0, 100 мкл 5 н. раствора HCl и 24 мл воды. Образец вводят в 600 мкл колонку FF SPSepharose (Pharmacia). Колонку дважды промывают 900 мкл 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl и элюируют белок 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 600 мМ NaCl. Элюированные фракции анализируют в отношении оптической плотности при 280 нм и определяют концентрацию IFN- в образцах, используя коэффициент экстинкции, равный 1,51 для 1 мг/мл раствора. Соответствующие пику фракции собирают,- 14009289 получая при этом IFN- в концентрации 2,3 мг/мл. К 1,2 мл IFN1a, полученного из элюата, собранного с колонки SP-Sepharose, добавляют 0,5 М фосфата натрия, рН 6,0, до 50 мМ, цианоборогидрид натрия(Aldrich) до 5 мМ и мПЭГ-О-п-фенилацетальдегид 20 кДа до 10 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 18 ч в темноте. Пегилированный IFN- можно очистить от реакционной смеси в 0,75 мл колонке FF SP-Sepharose следующим образом: 1,5 мл реакционной смеси разводят 7,5 мл 20 мМ MES, рН 5,0, 7,5 мл воды и 5 мкл 5 н. раствора НСl и вводят в колонку SP-Sepharose. Колонку промывают фосфатом натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl, после чего пегилированный IFN- элюируют из колонки 20 мМ MES, рН 6,0, 600 мМ NaCl. Затем пегилированный IFN- очищают в сортирующей колонке Superose 6 HR 10/30 FPLC, используя 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 150 мМ NaCl в качестве подвижной фазы. Очистку в сортирующей колонке (25 мл) выполняют со скоростью 20 мл/ч и собирают 0,5 мл фракции. Элюированные фракции анализируют в отношении содержания белка на основании оптической плотности при 280 нм, собирают и определяют концентрацию белка в элюате. Концентрация пегилированногоIFN- указана в эквивалентах IFN после внесения поправки на ПЭГ (мПЭГ-О-п-фенилацетальдегид 20 кДа имеет коэффициент экстинкции при 280 нм, равный 0,5 для 1 мг/мл раствора) в оптическую плотность при 280 нм, используя коэффициент экстинкции, равный 2 для 1 мг/мл раствора пегилированногоIFN-. Отбирают образцы для анализа и остальную часть собранного продукта разводят до 30 мкг/млHAS-содержащим буфером, отбират аликвоты в количестве 0,25 мл/пробирку и хранят при -70 С. Гликозилированный IFN-, связанный с искусственным полимером, можно использовать при осуществлении способов по данному изобретению. Полимер может содержать полиалкиленгликолевую часть. Полиалкиленовая часть может быть связана с бета-интерфероном при помощи группы, выбранной из альдегидной группы, малеимидной группы, винилсульфоновой группы, галогенацетатной группы,нескольких остатков гистидина, гидразиновой группы и аминотиоловой группы. IFN- может быть связан с полиэтиленгликолевой частью, причем IFN- связывают с полиэтиленгликолевой частью при помощи неустойчивой связи, которая расщепляется в результате биохимического гидролиза и/или протеолиза. Полимер может иметь молекулярную массу от около 5 до около 40 кДа. Другой IFN-, который можно использовать, является физиологически активным бета-интерфероном композиции, включающей физиологически активный гликозилированный бета-интерферон, N-конец которого связан с полимером,содержащим полиалкиленгликолевую часть, при этом физиологически активный бета-интерферон и полиалкиленгликолевая часть расположены так, что физиологически активный бета-интерферон, входящий в состав композиции, обладает, по существу, такой же активностью, что и физиологически активный бета-интерферон, не имеющий указанной части, о чем свидетельствуют результаты измерения методом антивирусного анализа. Гетерологичные полипептиды или другие молекулы могут быть ковалентно или нековалентно связаны с белком IFN- или его вариантом. Термин ковалентно связанный означает, что разные части молекулы по данному изобретению ковалентно связаны друг с другом прямой связью или ковалентно связаны друг с другом непрямой связью при помощи одной или нескольких промежуточных частей, таких как мостик, спейсер, одна или несколько линкерных частей. Одну или несколько промежуточных частей именуют связующей группой. Термин конъюгированный имеет взаимозаменяемое значение с термином ковалентно связанный. Бета-интерфероны, предназначенные для использования в данном изобретении, могут быть гликозилированными или негликозилированными. Негликозилированные IFN- можно продуцировать в прокариотической клетке-хозяине. Белки IFN- и их варианты можно также модифицировать, присоединяя полисахариды, которые обычно отсутствуют в IFN-. 3. Методы получения препаратов IFN-. Препараты IFN- по настоящему изобретению можно получить любыми приемлемыми методами,которые включают получение нуклеиновой кислоты, кодирующей препарат IFN-, и экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в приемлемом трансформированном хозяине. При помощи такого метода можно получить препараты рекомбинантного IFN-. Препараты IFN- можно также получить химическим синтезом или комбинацией химического синтеза и методов рекомбинантных ДНК. В одном варианте осуществления изобретения нуклеиновую кислоту, кодирующую препарат IFN-,получают путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей IFN- или его вариант. Например, слитый белок IFN- можно получить методом, рассмотренным в данном описании изобретения. Естественную нуклеиновую кислоту IFN- можно получить методами, хорошо известными в данной области. Например, нуклеиновую кислоту можно выделить при помощи полимеразной реакции синтеза цепи с обратной транскриптазой (RT-PCR), используя РНК, полученную из клетки, которая, как известно, экспрессирует IFN-, например лейкоцита, и затравки на основе последовательности гена IFN-, например, SEQ ID NO:1. Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки IFN-, можно также получить в результате скрининга библиотек, например библиотек кДНК, созданных из клеток, экспрессирующих IFN, при помощи зонда, например, олигонуклеотида, содержащего часть последовательности IFN-.- 15009289 Альтернативно, полную аминокислотную последовательность можно использовать для создания гена, транслированного в обратном направлении. Можно синтезировать олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую препарат IFN-. Например, можно синтезировать несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части требуемого полипептида, и затем лигировать их друг с другом. Отдельные олигонуклеотиды обычно содержат 5'- или 3'-концевые выступы для комплементарной сборки. В нуклеиновые кислоты, кодирующие белки IFN-, можно внести изменения методами, хорошо известными в данной области. Например, можно произвести изменения при помощи сайт-специфического мутагенеза, описанного, например, в публикации Mark et al. Site-specific Mutagenesis Of the Human Fibroblast Interferon Gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66 (1984) и патенте США 4588585. Другим методом создания нуклеиновой кислоты, кодирующей препарат IFN-, является химический синтез. Например, ген, кодирующий требуемый препарат IFN-, можно синтезировать химическим путем в синтезаторе олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды создают на основе аминокислотной последовательности требуемого препарата IFN-. При выборе нуклеиновой кислоты для экспрессии в экспрессирующей системе желательно выбрать такие кодоны, которые благоприятны для клетки-хозяина или экспрессирующей системы, в которой будет продуцирован препарат рекомбинантного IFN-. Известно, например, что определенные кодоны более предпочтительно экспрессируются в прокариотических клетках по сравнению с другими (предпочтение кодонов). Последовательность ДНК, кодирующая препарат IFN-, может включать или не включать последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность. Такая сигнальная последовательность,в случае ее наличия, является последовательностью, узнаваемой клеткой, выбранной для экспрессии препарата IFN-. Сигнальная последовательность может быть прокариотической, эукариотической или комбинацией обеих последовательностей. Сигнальные последовательности хорошо известны в данной области, где описано несколько разных последовательностей. Сигнальная последовательность может быть последовательностью нативного (то есть естественного) IFN-. Введение сигнальной последовательности зависит от желания секретировать препарат IFN- в рекомбинантных клетках, в которых он продуцирован. Если выбранные клетки являются прокариотическими, обычно желательно, чтобы последовательность ДНК не кодировала сигнальную последовательность. Если выбранные клетки являются эукариотическими, обычно желательно иметь кодированную сигнальную последовательность и особенно предпочтительно использовать сигнальную последовательность IFN- дикого типа. После сборки (путем синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другим методом) нуклеиновую кислоту, кодирующую препарат IFN-, вводят в экспрессирующий вектор, в котором она функционально связана с экспрессирующей регулярной последовательностью, пригодной для экспрессии препарата IFN в требуемом трансформированном хозяине. Правильность сборки может быть подтверждена секвенированием нуклеиновой кислоты, рестрикционным картированием и экспрессией биологически активного полипептида в приемлемом хозяине или клетке-хозяине. Как известно в данной области, для достижения высоких уровней экспрессии трансфецированного гена в хозяине или клетке-хозяине указанный ген должен быть функционально связан с экспрессирующими регулярными последовательностями транскрипции и трансляции, функционирующими в выбранном экспрессирующем хозяине. Выбор экспрессирующей регулярной последовательности и экспрессирующего вектора зависит от выбора клетки-хозяина. Можно использовать разные комбинации экспрессирующего хозяина/вектора. Приемлемыми экспрессирующими векторами для эукариотических хозяев, например, эукариотических клеток-хозяев, являются векторы, содержащие экспрессирующие регулярные последовательности, выделенные из SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса, в частности, нижеследующие векторы: pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2,pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo и pHyg. Альтернативно, для временной экспрессии белков в эукариотических клетках можно использовать производные вирусов, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота (BPV-1) или вирус Эпштейна-Барра (рНЕВо, выделенный из pREP и р 205). В данной области известны разные методы получения плазмид и трансформации организмов-хозяев. Для ознакомления с другими экспрессирующими системами см. публикацию Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2nd Ed.,ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989), Chapters 16 and 17. Приемлемые экспрессирующие векторы для бактериальных хозяев включают известные бактериальные плазмиды, в частности, плазмиды, полученные из Е. coli, включающие col E1, pCR1, pBR322,pMB9 и их производные, плазмиды с более широким спектром хозяев, такие как RP4, фаговые ДНК, например многочисленные производные лямбда-фага, такие как NM989, и другие ДНК-содержащие фаги,такие как М 13 и нитчатые одноцепочечные ДНК-содержащие фаги. Приемлемые экспрессирующие векторы для дрожжевых клеток включают плазмиду 2.mu. и ее производные. Приемлемые векторы для клеток насекомых включают pVL 941. См. также публикацию Cate et al., Isolation of the Bovine And Human- 16009289 Кроме того, в указанных векторах можно использовать разные экспрессирующие регулярные последовательности. Пригодные экспрессирующие регулярные последовательности включают экспрессирующие регулярные последовательности, связанные со структурными генами вышеуказанных экспрессирующих векторов. Примеры приемлемых экспрессирующих регулярных последовательностей включают, например, ранние и поздние промоторы SV-40 или аденовируса, lac-системы, trp-системы, систему ТАС или TRC, главные операторные и промоторные области лямбда-фага, например PL, контрольные области белка оболочки вируса fd, промотор 3-фосфоглицераткиназы или другие гликолитические ферменты, промоторы кислой фосфатазы, например Pho5, промоторы системы альфа-спаривания дрожжей и другие последовательности, которые, как известно, контролируют экспрессирую генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов и разных их комбинаций. Для продуцирования препаратов IFN- можно использовать любого приемлемого хозяина, включая бактерии, грибы (в том числе дрожжи), растительные клетки, клетки насекомых, клетки млекопитающих и другие подходящие животные клетки или линии клеток, а также трансгенных животных или растения. Типичными хозяевами являются штаммы Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, грибные клетки,дрожжевые клетки, клетки насекомых, таких как Spodoptera fruaiperda (SF9), животные клетки, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки мышей, такие как NS/0, клетки африканской зеленой мартышки, такие как COS I, COS 7, BSC 1, BSC 40 и ВМТ 10, и клетки человека, а также растительные клетки в культуре ткани. Такие клетки можно получить из Американской коллекции типовых культур(АТСС). Предпочтительные клетки-хозяева для экспрессии в животных клетках включают культивируемые клетки СНО и COS 7 и особенно линию клеток CHO-DDUKY-1. Должно быть понятно, что не все векторы и экспрессирующие регулярные последовательности одинаково хорошо экспрессируют последовательности ДНК, рассмотренные в данном описании изобретения. Точно так же не все хозяева одинаково хорошо подходят для одной и той же экспрессирующей системы. Однако специалист в данной области может выбрать необходимые векторы, экспрессирующие регулярные последовательности и хозяев без излишнего экспериментирования. При этом необходимо также учесть число копий вектора, способность контролировать данное число копий и экспрессию любых других белков, кодированных данным вектором, таких как маркер устойчивости к антибиотикам. Например, предпочтительные векторы для данного изобретения включают векторы, позволяющие амплифицировать ДНК, кодирующую препарат IFN-, в виде нескольких копий. Такие амплифицируемые векторы хорошо известны в данной области. К таким векторам относятся, например, векторы, которые можно амплифицировать методом амплификации DHFR (см., например, Kaufman, патент США 4470461, публикацию Kaufman and Sharp, Construction of a Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene:Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression, Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982 или амплификации глутаминсинтетазы (GS) (см., например, патент США 5122464 и опубликованную заявку на европейский патент 338841). При выборе экспрессирующей регулярной последовательности необходимо учеcть ряд факторов. Такие факторы включают, например, относительную прочность последовательности, ее регулируемость и совместимость с действительной последовательностью ДНК, кодирующей препарат IFN-, в частности, в отношении возможных вторичных структур. При выборе хозяев необходимо учитывать их совместимость с выбранным вектором, токсичность продукта, кодированного последовательностями ДНК по данному изобретению, характеристики секреции, способность осуществлять правильную укладку полипептидных цепей, требования, предъявляемые к ферментации или культуре, и простоту очистки продуктов, кодированных последовательностями ДНК. С учетом вышеуказанных параметров специалист в данной области может выбрать разные комбинации вектора/экспрессирующей регулярной последовательности/хозяина, которые будут экспрессировать требуемые последовательности ДНК в ферментационной или крупномасштабной животной культуре, например, с использованием клеток СНО или COS 7. Использование линии клеток СНО, такой какCHO-KUKX-B1 DHFR sup, для экспрессии вариантов IFN- подробно описано в патенте США.6127332. Препарат IFN- можно также продуцировать в системе in vitro, например, системе трансляции, такой как клеточный лизат, в частности лизат ретикулоцитов. Термин система трансляции in vitro,имеющий взаимозаменяемое значение с термином бесклеточная система трансляции, означает систему трансляции, которая представляет собой бесклеточный экстракт, содержащий по меньшей мере минимум элементов, необходимых для трансляции молекулы РНК в белок. Системы трансляции in vitro обычно включают макромолекулы, такие как ферменты, факторы трансляции, инициации и элонгации, химические реагенты и рибосомы. Например, система трансляции in vitro может содержать по меньшей мере рибосомы, тРНК, инициирующий метионил-тРНКMet, белки или комплексы, участвующие в трансляции,например, eIF2, eIF3, кэп-связывающий (СВ) комплекс, включающий кэп-связывающий белок (СВР) и эукариотический фактор инициации 4F (eIF4F). В данной области хорошо известны разные системы трансляции in vitro, которые включают коммерчески доступные наборы. Примерами систем трансляцииin vitro являются лизаты эукариотических клеток, такие как лизаты ретикулоцитов кролика, лизаты ооци- 17009289 тов кролика, лизаты клеток человека, лизаты клеток насекомых и экстракты ростков пшеницы. Лизаты производятся на коммерческой основе такими компаниями как Promega Corp, Madison, Wis; Stratagene,La Jolla, Calif.; Amersham, Arlington Heights, 111.; и GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y. РНК, используемую в системах трансляции in vitro, можно продуцировать in vitro, например, при помощи промоторов SP6 или Т 7 методами, известными в данной области. В соответствии с другим способом препарат IFN- экспрессируют из эндогенного гена в клеткехозяине. Данный способ может включать введение гетерологичного промотора вверху от кодирующей области гена IFN-, например индуцируемого промотора, экспрессирующего эндогенный ген IFN-, и выделение продуцированного IFN-. Гетерологичный промотор можно ввести в клетки путем вбивания методами, известными в данной области, или альтернативно путем введения промотора в ген IFN-. Препарат IFN-, полученный способом по настоящему изобретению, может быть гликозилированным или негликозилированным в зависимости от организма-хозяина, использованного для продуцирования данного препарата. Если в качестве хозяина были выбраны бактерии, продуцированный препаратIFN- будет негликозилированным. Эукариотические клетки, с другой стороны, гликозилируют препараты IFN-. Препарат IFN-, продуцированный трансформированным хозяином, можно очистить любым приемлемым способом. Известны разные способы очистки IFN-. См., например, патенты США 4289689, 4359389, 4172071, 4551271, 5244655, 4485017, 4257938, 4541952 и 6127332. В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат IFN- очищают при помощи иммуноаффинной хроматографии, описанной, например, в публикации Okamura et al., Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography and N-Terminal Amino Acid Sequence. Biochem, 19, pp. 3831-35 (1980). Например, белки IFN- и их варианты можно выделить и очистить известными методами, такими как экстракция, преципитация, хроматография, аффинная хроматография, электрофорез или тому подобными. Например, белки и фрагменты интерферона можно очистить, пропуская раствор через колонку,содержащую иммобилизованный рецептор интерферона (см. патент США 4725669). Связанную молекулу интерферона затем можно элюировать, производя обработку хаотропной солью или водным раствором уксусной кислоты. Слитые белки иммуноглобулина можно очистить, пропуская раствор, содержащий слитый белок, через колонку, заполненную белком А или белком G, который избирательно связывается с Fc-частью слитого белка. См., например, публикацию Reis, K.J. et al., J. Immunol. 132:3098-3102(1984); заявку РСТ, публикацияWO 87/00329. Химерное антитело можно затем элюировать, производя обработку хаотропной солью или водным раствором уксусной кислоты. Альтернативно белки интерферона и молекулы, слитые с иммуноглобулином, можно очистить в колонках с антителом против интерферона или в колонках с антителом против иммуноглолубина, получив при этом по существу чистый белок. Термин по существу чистый означает, что белок не содержит загрязняющих веществ, которые связаны с ним в естественных условиях. О существенной чистоте свидетельствует одна полоса, полученная при выполнении электрофореза. Продуцированный и очищенный IFN- можно исследовать методом пептидного картирования. Например, образец препарата IFN- можно гидролизовать эндопротеиназой Lys-C и исследовать методом ВЭЖХ с обращенной фазой в соответствии с описанием, приведенным в патенте США 6127332. В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат IFN- по существу не содержит другой клеточный материал, например белки. Термин по существу чистый или очищенные препараты IFN- означает препарат IFN-, содержащий менее примерно 20% (в пересчете на сухую массу) загрязняющего клеточного материала, например нуклеиновых кислот, белков и липидов, и предпочтительно содержащий менее примерно 5% загрязняющего клеточного материала. Предпочтительные препараты IFN- содержат менее примерно 2% загрязняющего клеточного материала; еще предпочтительнее менее примерно 1% загрязняющего клеточного материала и наиболее предпочтительно менее примерно 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001% загрязняющего клеточного материала. Предпочтительные композиции на основе препарата IFN- также, по существу, не содержат других клеточных белков (определяемых также как загрязняющие белки), то есть указанные композиции содержат менее примерно 20% (в пересчете на сухую массу) загрязняющего белка и предпочтительно содержат менее примерно 5% загрязняющего белка. Предпочтительные препараты полипептидов по данному изобретению содержат менее примерно 2% загрязняющего белка; еще предпочтительнее менее примерно 1% загрязняющего белка и наиболее предпочтительно менее примерно 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001% загрязняющих белков. Чистоту и концентрацию препаратов IFN- можно определить методами, известными в данной области, например при помощи гель-электрофореза, и методами, описанными в публикации Robert K.Scopes, Protein Purification, Principles and Practice, Third Ed., Springer Verlag New York, 1993 и в ссылках,приведенных в данной публикации. Биологическую активность препаратов IFN- можно исследовать любым приемлемым методом, известным в данной области, например, путем нейтрализации антителом антивирусной активности, индук- 18009289 ции активности протеинкиназы, олигоаденилат-2,5-А-синтетазы или фосфодиэстеразы, в соответствии с описанием, приведенным в заявках ЕР-В 1-41313 и WO 00/23472. Такие анализы включают также иммуномодуляторные анализы (см., например, патент США 4753795), анализы методом торможения роста и измерение связывания с клетками, экспрессирующими рецепторы интерферона. Типичные антивирусные анализы описаны в патенте США 6127332 и заявке WO 00/23472. Пригодность препаратов IFN- для лечения гломерулонефрита можно также оценить с использованием животных моделей, например, описанных в примерах и далее в данном описании изобретения. Исследование может быть произведено в соответствии с описанием, приведенным в примерах. Препараты IFN- можно также приобрести коммерческим путем под следующими торговыми названиями: AVONEX (IFN1a) (Biogen, Inc., Cambridge, MA); REBIF (IFN1a) (Serono, S.A., Geneva, Switzerland) и BETAFERON (IFN1b) (Schering Aktiengesellschaft, Berlin, Germany), который также представлен на рынке под названием BETASERON (Berlex, Montville, NJ; IFN1b). AVONEX и REBIF представляют собой рекомбинантный гликозилированный человеческий IFN- дикого типа,продуцированный в клетках яичника китайского хомячка. BETAFERON продуцирован в бактериях. 4. Способы лечения препаратами IFN-. Настоящее изобретение относится к способам лечения и профилактики невропатии у нуждающегося субъекта, включающим введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества препарата IFN- необязательно в качестве вспомогательного средства при лечении другим препаратом. В одном варианте осуществления изобретения невропатия является демиелинизирующей невропатией, такой как хроническая демиелинизирующая невропатия. Примеры хронической демиелинизирующей невропатии включают CIDP и многоочаговую двигательную невропатию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения невропатия является CIDP. Нуждающимся субъектом может быть субъект, у которого обнаружена невропатия. Невропатия может быть диагностирована у субъекта методами, известными в данной области. В частности, CIDP может быть диагностирована методами, известными в данной области, которые более подробно описаны ниже. Лечение субъекта с диагнозом невропатии может быть начато препаратом IFN- в любое время. Кроме того, лечению может быть подвергнут субъект, у которого не обнаружена невропатия, но, повидимому, может возникнуть. Такие субъекты могут быть выявлены генетическими методами обследования. Субъекты, у которых может возникнуть невропатия, являются также субъектами, у которых обнаружены некоторые, но не все симптомы, характерные для невропатии, поэтому в некоторых случаях может быть неясно, действительно ли у субъекта может возникнуть невропатия. Лечение может проводиться в течение по меньшей мере около 1 месяца, по меньшей мере около 3 месяцев, по меньшей мере около 6 месяцев, по меньшей мере около 1 года, по меньшей мере около 3 лет, по меньшей мере около 5 лет или дольше. Нуждающимся субъектом может быть животное, в частности млекопитающее. Примеры млекопитающих включают людей, крупный рогатый скот, овец, свиней, лошадей, собак, кошек, приматов, кроме человека, мышей и крыс. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат IFN- вводят нуждающемуся субъекту в виде дополнительной терапии, то есть при одновременном проведении другого лечения. Например,субъект, страдающий CIDP, может проходить курс лечения IVIg; стероидами, такими как преднизолон; иммунодепрессантом, таким как азотиоприн, циклоспорин или циклофосфамид; или плазмаферезом помимо введения препарата IFN-. Комбинированная терапия с использованием препарата IFN- может свести до минимума применение других лекарственных средств, которые могут быть более вредными(например стероиды), более дорогими (например, IVIg) или менее удобными (замена плазмы). Поэтому в некоторых вариантах осуществления изобретения введение субъекту препарата IFN- позволяет уменьшить дозу и/или частоту введения другого лекарственного средства. Например, дозу и/или частоту введения можно уменьшить по меньшей мере примерно на 10, 30, 50, 75, 100% (то есть в два раза), пять раз,10 раз или больше. Ниже приведены действующие нормативы лечения CIDP. Один вариант осуществления изобретения относится к способу лечения хронической демиелинизирующей невропатии, например CIDP, у субъекта, проходящего основной курс лечения CIDP, выбранный из группы, состоящей из введения стероида, введения противопоспалительного средства, введения IVIg и проведения плазмафереза, который помимо основного лечения CIDP включает введение субъекту препарата IFN- в количестве, достаточном для значительного уменьшения дозы или частоты проведения основного лечения CIDP, для достижения эффективного ослабления симптомов CIDP. В настоящее время для лечения CIDP используют иммунодепрессанты. Например, установлено, что стероиды оказывают благоприятный эффект при лечения CIDP. Положительная реакция обычно наблюдается через 4 недели. Обычно используемым стероидом является преднизон (дельтазон, оразон, метикортен). Преднизон является пероральным кортикостероидом, который подавляет воспалительную и иммунную реакции и, как считают, изменяет функцию медиатора на сайте подавления воспалительных и иммунных реакций при заболевании CIDP. Хотя вводимые дозы могут быть различными, большинство взрослых субъектов начинают с дозы 0,5-1 мг/кг/сутки при пероральном введении (РО) (от около 30-40- 19009289 до 60-80 мг/сутки). Улучшение может наблюдаться в течение следующих 2 месяцев. Затем указанную дозу можно вводить через день с последующим уменьшением дозы до достижения наименьшей эффективной дозы, позволяющей поддерживать у субъекта состояние ремиссии. Другим иммунодепрессантом, который был признан эффективным для лечения CIDP, является азатиоприн (имуран), аналог пурина, уменьшающий метаболизм пуринов и ингибирующий синтез ДНК и РНК. Считается, что азатиоприн повышает трудоспособность и ослабляет симптомы CIDP, подавляя иммуноопосредованное поражение нервов. Начальная доза составляет около 50 мг при пероральном введении в сутки (ежедневно в течение месяца), которую постепенно увеличивают до общей суточной дозы,равной 2-3 мг/кг/сутки при пероральном введении. Хотя терапевтические дозы азатиоприна трудно определить для каждого субъекта, некоторые данные позволяют предположить, что показателем терапевтической дозы является повышение эритроцитов (MCV). Реакция на лечение может быть получена более чем через 6 месяцев. Еще одним иммунодепрессантом, используемым в настоящее время для лечения CIDP, является микофенолят (CellCept), который является пролекарством для такого иммунодепрессанта как микофенольная кислота. Считается, что микофенолят ингибирует синтез пурина в лимфоцитах, подавляя фермент инозинмонофосфатдегидрогеназу. Типичная доза для взрослого человека составляет от 250 мг до 3 г/сутки с возможностью изменения дозы в зависимости от клинического эффекта. Циклоспорин (сандиммун, неорал), который является циклическим полипептидом, содержащим 11 аминокислот, можно также использовать для лечения CIDP. Циклоспорин ингибирует первую фазу активации Т-клеток и не влияет на гуморальный иммунитет. Считается, что, подавляя Т-клетки, циклоспорин может иннгибировать клеточно-опосредованное поражение нервов на сайте воспалительной/иммунной реакции. Циклоспорин начинают вводить в дозе 5 мг/кг/сутки при пероральном введении (два раза в день в течение месяца) и увеличивают дозу в зависимости от реакции. Необходимо контролировать минимальные и максимальные уровни для определения эффективности и во избежание токсичности; хотя специально для CIDP не был определен требуемый минимальный уровень, при иммунологических нарушениях нижний предел обычно равен 100-250. Другим иммунодепрессантом является циклофосфамид (цитоксан), который представляет собой антинеопластический агент, не оказывающий специфического воздействия на определенную фазу клеточного цикла, и иммунодепрессант, действующий в качестве алкилирующего агента. Доза указанного препарата обычно составляет 1-2 мг/кг/сутки при пероральном введении. Другим стандартным методом лечения больных CIDP является внутривенное введение иммуноглобулина (IVIg) . Раствор для внутривенного вливания обычно в основном содержит гетерологичный IgG, а также небольшие количества IgA и IgM. В некоторых вариантах осуществления изобретения раствор для внутривенного введения является гетерогенным по отношению к эпитопам, узнаваемым антителами,например, такой раствор не является препаратом антитела, полученным в результате иммунизации животного определенным антигеном. Предполагаемый механизм действия такого препарата основан на том, что IVIg содержит произвольные наборы антител, нейтрализующих иммунные факторы, вызывающие поражение периферического нерва в случае CIDP. В среднем улучшение наблюдается на 10-й день и продолжается до 42-го дня. Полупериод существования указанного препарата в сыворотке составляет примерно 21-29 дней. Нуждающиеся субъекты обычно должны проходить повторные курсы лечения через каждые несколько недель или месяцев для сохранения ремиссии или лечения рецидивов. Обычная доза составляет от 0,4 до 2 г/кг, которую делят на 5 суточных доз по 400 мг/кг. Лечение может быть начато с более высокой дозы, равной, например, 2 г/кг, которую постепенно снижают до 0,5-1 г/кг. Частота введения указанных доз может быть различной, причем большинство субъектов принимают указанные дозы каждые 2-8 недель. Например, IVIG можно вводить в дозе от 0,4 г/кг в течение нескольких дней до 1-2 г/кг каждый 1-4 недели. Другим признанным методом лечения CIDP является плазмаферез (или замена плазмы). Считается,что указанный метод лечения позволяет удалить антитела и комплементы, ответственные за иммуноопосредованное поражение периферических нервов. Плазму удаляют из крови методом, подобным диализу. Эффективность данного метода, по-видимому, аналогична эффективности IVIg при лечении CIDP. Нуждающимся субъектамобычно заменяют плазму три раза в неделю на протяжении первых двух недель; затем частоту лечения определяют по клинической реакции. Препарат IFN- можно вводить субъекту вместе с введением иммунодепрессанта, например стероида, введением IVIg и/или выполнением плазмафереза. Препарат IFN- и вспомогательное средство можно вводить одновременно или последовательно. При последовательном введении вспомогательное средство можно вводить в тот же день или в другие дни. При объединении лечения препаратом IFN-p с плазмаферезом препарат IFN- вводят после выполнения плазмафереза во избежание выведения препарата IFN- из организма в процессе выполнения плазмафереза. При объединении лечения препаратомIFN- с лечением IVIg два разных лекарственных средства предпочтительно вводят раздельно с промежутком времени, равным по меньшей мере одному или двум часам.- 20009289 В другом варианте осуществления изобретения препарат IFN- вводят субъектам, не восприимчивым к другим вышеописанным методам лечения CIDP. В других ситуациях препарат IFN- вводят субъектам, у которых не обнаружена невосприимчивость к другим методам лечения CIDP. Например, препарат IFN- можно вводить субъектам, которые восприимчивы к одному или нескольким другим методам лечения. В других вариантах осуществления изобретения препарат IFN- вводят субъектам, которые ранее не подвергались никакому лечению CIDP. Если субъект раньше не подвергался лечению CIDP, методы лечения препаратом IFN- могут сначала включать выявление у субъекта CIDP или вероятность заболевания CIDP. Лечение может представлять собой следующее: препарат IFN- вводят субъекту, проходящему основной курс лечения CIDP, например, препаратом IVIG, при этом комбинированное лечение продолжают в течение определенного периода времени, по истечении которого основное лечение CIDP прекращают. Основное лечение CIDP может быть прекращено постепенно, например, путем уменьшения дозы и/или частоты проведения основного лечения CIDP. В иллюстративном варианте осуществления изобретения субъекту вводят IVIG один раз каждые две недели или один раз каждые четыре недели. Затем субъект вместе с лечением IVIg проходит курс лечения IFN, который включает введение препарата IFNодин раз в неделю или в две недели. Комбинированное лечение может быть продолжено в течение примерно 10-20 недель, например в течение примерно 16 недель. Во время комбинированного лечения препараты IVIg и IFN- желательно вводить с промежутком времени, равным по меньшей мере 1-3 часам,например, примерно 2 ч. Примерно через 16 недель основное лечение CIDP прекращают или сокращают. Например, субъекту затем вводят меньшие дозы IVIg или прежние дозы, но гораздо реже. Если у субъектов не наблюдается улучшения после прекращения или сокращения основного лечения CIDP, можно возобновить основное лечение CIDP и продолжить лечение препаратом IFN-. Препараты IFN- можно вводить любым способом. Например, препараты IFN- можно применять местно в виде инъекции или наносить непосредственно на пораженную ткань либо системно, например,парентерально или перорально. Местное применение включает, например, введение непосредственно в пораженную мышцу. Парентеральное введение включает аэрозоли, подкожные, внутривенные, внутримышечные, внутрисуставные, внутрибрюшинные, внутригрудинные, подоболочечные, внутрипеченочные, внутриочаговые и внутричерепные инъекции или вливания. Можно периодически инъецировать ударные дозы препарата IFN- или производить более продолжительное внутривенное или внутрибрюшинное введение из наружного резервуара (например, баллона для внутривенного вливания) или внутреннего резервуара (например, биоразрушаемого имплантата или имплантированного насоса). Препараты IFN- предпочтительно вводят в виде стерильной фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель. Термин носитель в используемом здесь значении означает приемлемые адъюванты и наполнители. Фармацевтически приемлемые носители, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях по данному изобретению, включают, не ограничиваясь ими, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполного глицерида насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат проламина, динатрийгидрофосфат, калийгидрофосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный кремнезем,трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на целлюлозной основе, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, воски, блоксополимеры полиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль, ланолин, декстроза, глицерин, этанол и тому подобные или их комбинации. Препараты IFN- можно получить в виде композиции, содержащей один или несколько других белков, используемых, например, для стабилизации препарата IFN-. Например, препараты IFN- могут быть смешаны с альбумином. При парентеральном введении препарата IFN- часть композиции предпочтительно составляет водный раствор. Указанный раствор должен быть физиологически приемлемым, чтобы не оказывать вредного влияния на электролитный и/или объемный баланс при доставке требуемого препарата IFN- в организм нуждающегося субъекта. Так, водная среда для препарата IFN- может содержать нормальный физиологический раствор (например, 0,9% NaCl, 0,15 М, рН 7-7,4). Приемлемые растворы для парентерального введения можно получить любыми методами, хорошо известными в фармацевтической области, которые описаны, например, в публикации Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed.),Mack Pub., 1990. Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильного препарата для инъекций, например стерильной инъекционной водной или масляной суспензии. Указанная суспензия может быть получена методами, известными в данной области, с использованием приемлемых диспергирующих или смачиващих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может также представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном пригодном для парентерального введения разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле. Приемлемыми наполнителями и растворителями, которые могут быть использованы в данном изобретении, являются вода, рас- 21009289 твор Рингена и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для указанной цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- и диглицериды. Для получения препаратов для инъекций можно использовать жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, а также природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, в частности, их полиоксиэтилированные формы. Указанные масляные растворы или суспензии могут также содержить длинноцепной спиртовой разбавитель или диспергатор. Фармацевтические композиции, содержащие препараты IFN-, можно также вводить перорально. Например, их можно вводить в виде любых дозированных лекарственных форм, приемлемых для перорального введения, которые включают, не ограничиваясь ими, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального введения используемые носители обычно включают лактозу и сухой кукурузный крахмал. Кроме того, в состав таблеток обычно добавляют смазыващие агенты,такие как стеарат магния. Приемлемые разбавители, используемые для перорального введения в виде капсул, обычно включат лактозу и сухой кукурузный крахмал. Если необходимо получить водные суспензии для перорального введения, активный ингредиент объединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При желании могут быть также добавлены определенные подсластители, ароматизаторы или красители. Кроме того, можно также использовать чрескожные пластыри для местного применения. Фармацевтические композиции по данному изобретению можно также вводить в виде аэрозолей или ингаляции в нос при помощи распылителя, ингалятора сухого порошка или дозирующего ингалятора. Такие композиции получают методами, хорошо известными в фармацевтической области, в виде растворов в физиологическом растворе, с использованием бензилового спирта или других приемлемых консервантов, стимуляторов абсорбции, усиливающих биологическую доступность, фторуглеродов и/или других известных солюбилизирующих или диспергирующих агентов. Препараты IFN- можно вводить в виде липосомных систем доставки, таких как мелкие однослойные пузырьки, большие однослойные или многослойные пузырьки. Липосомы могут быть образованы из разных фосфолипидов, содержащих холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины. В некоторых вариантах осуществления изобретения пленку липидных компонентов гидратируют водным раствором лекарственного средства для образования липидного слоя, инкапсулирующего лекарственное средство,как это описано в патенте США 5262564. Липосомы могут содержать поверхностные молекулы, которые направляют их в определенные клетки или ткани. Такие модифицированные липосомы можно получить методами, известными в данной области.IFN- или их варианты могут быть также связаны с растворимыми полимерами, используемыми в качестве носителей направленно доставляемого лекарственного средства. Такие полимеры могут включать поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксипропилметакриламидофенол, полигидроксиэтиласпанамидофенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный пальмитоильными остатками.IFN- или их варианты могут быть также связаны с белками, такими как, например, рецепторные белки и альбумин. Кроме того, IFN- и их варианты могут быть связаны с биоразрушаемыми полимерами, используемыми для регулируемого высвобождения лекарственного средства, такими как полимер молочной кислоты, полиэпсилон-капролактон, полигидроксимасляная кислота, полиортоэфиры, полиацетали,полидигидропираны, полицианоакрилаты и перекрестно сшитые или амфипатические блоксополимеры гидрогелей. Препарат IFN- может быть также получен в виде жидкой композиции, содержащей стабилизирующий агент. Стабилизирующий агент может присутствовать в количестве от около 0,3 до 5 мас.% препарата IFN-. В качестве стабилизирующий агента можно использовать аминокислоту, такую как кислая аминокислота (например, глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота), аргинин или глицин. Если стабилизирующим агентом является аргинин-HCl, его концентрация предпочтительно находится в пределах от 0,5% (мас./об.) до 5% и наиболее предпочтительно равна 3,13% (что эквивалентно 150 мМ аргинин-HCl). Если стабилизирующим агентом является глицин, его концентрация предпочтительно находится в пределах от 0,5% (мас./об.) до 2,0% и наиболее предпочтительно равна 0,52% (что эквивалентно 66,7 мМ - 266,4 мМ и наиболее предпочтительно 70 мМ). Если стабилизирующим агентом является глутаминовая кислота, ее концентрация предпочтительно находится в пределах от 100 мМ до 200 мМ и наиболее предпочтительно равна 170 мМ (что эквивалентно 1,47%-2,94% (мас./об.) и наиболее предпочтительно равно 2,5%). В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрации препаратов IFNв жидких составах находятся в пределах от около 30 мкг/мл до около 250 мкг/мл, в частности равно 4878 мкг/мл например около 60 мкг/мл. Указанное количество зависит, например, от удельной активности конкретного препарата IFN-. Дозировка обычно находится в пределах от около 1 миллиона международных единиц (ММЕ) до около 50 ММЕ, например около 3, 6, 9 или 12 ММЕ в одной дозе. В одном варианте осуществления изобретения аминокислотным стабилизирующим агентом является аргинин, который вводят в кислой форме (аргинин-HCl) в растворах с рН около 5,0. В данном случае предпочтительными являются полиионные наполнители. Жидкая композиция может находиться в сосу- 22009289 де, таком как шприц, в котором поверхность контактирования с жикостью покрыта материалом, инертным к IFN-, например, силиконом или политетрафторэтиленом. Предпочтительные композиции имеют значение рН от 4,0 до 7,2. В некоторых вариантах осуществления изобретения раствор, содержащий стабилизирующий агент, не лиофилизуют и/или не подвергают воздействию кислородсодержащего газа во время получения и хранения. Буферы с органическими кислотами и фосфатные буферы, предназначенные для использования в настоящем изобретении для сохранения показателя рН в пределах от около 4,0 до около 7,2, в частности,от около 4,5 до около 5,5, например 5,0, могут быть приемлемыми буферами, получаемыми из органических кислот и их солей, такими как цитратные буферы (например, смесь мононатрийцитрата и динатрийцитрата, смесь лимонной кислоты и тринатрийцитрата, смеси лимонной кислоты и мононатрийцитрата), сукцинатные буферы (например, смесь янтарной кислоты и мононатрийсукцината, смесь янтарной кислоты и гидроксида натрия, смесь янтарной кислоты и динатрийсукцината), тартратные буферы, фумаратные буферы, глюконатные буферы, оксалатные буферы, лактатные буферы, фосфатные буферы и ацетатные буферы, описанные в заявке WO 98/28007. Типичные составы, которые могут быть получены способами, описанными в заявке WO 98/38007,содержат:(i) 20 мМ ацетатного буфера с рН 5,0, который предпочтительно не был предварительно лиофилизован и содержит IFN- и по меньшей мере один ингредиент, выбиранный из (а) 150 мМ аргинин-HCl;(b) 100 мМ хлорида натрия и 70 мМ глицина; (с) 150 мМ аргинин-HCl и 15 мг/мл сывороточного альбумина человека; (d) 150 мМ аргинин-HCl и 0,1% плуроник F-68; (е) 140 мМ хлорида натрия; (f) 140 мМ хлорида натрия и 15 мг/мл сывороточного альбумина человека и (д) 140 мМ хлорида натрия и 0,1% плуроник F-68;(ii) жидкость с рН 5,0, которая включает IFN- или его вариант, 170 мМ L-глутаминовой кислоты и 150 мМ гидроксида натрия, причем указанная жидкость предпочтительно не была предварительно лиофилизована; и(iii) 20 мМ фосфатного буфера с рН 7,2, который предпочтительно не был предварительно лиофилизован и содержит IFN- и по меньшей мере один ингредиент, выбранный из: (а) 140 мМ аргинин-HCl и(b) 100 мМ хлорида натрия и 70 мМ глицина. Предпочтительные композиции содержат также полисорбат, например 0,005% (мас./об.) полисорбата 20.IFN- или его вариант можно также вводить вместе с растворимым рецептором IFN типа I или его частью, такой как IFN-связывающая цепь рецептора, способом, описанным в патенте США 6372207. Как указано в данном патенте, введение IFN типа I в виде комплекса с IFN-связывающей цепью рецептора улучшает устойчивость IFN и усиливает действие IFN. Указанный комплекс может быть комплексом,соединенным нековалентной или ковалентной связью. Препараты IFN- можно получить в виде сухого порошка, который может быть солюбилизован или суспендирован, а также не солюбилизован или суспендирован до введения нуждающемуся субъекту. В частности, установлено, что препараты IFN-, конъюгированные с полимером, например ПЭГ, являются особенно устойчивыми в сухой форме (см., например, заявки WO 00/23114 и PCT/US/95/06008). Полученные композиции могут содержать терапевтически эффективные количества препарата IFN, то есть они могут содержать препарат IFN- в таких количествах, которые обеспечивают соответствующие концентрации препарата IFN- в мышечных или других тканях в течение периода времени, достаточного для предотвращения, подавления, замедления или ослабления постоянной или прогрессирующей утраты мышечной функции или оказания другого терапевтического действия. Специалистам в данной области должно быть понятно, что концентрация препаратов IFN- в лекарственной композиции может изменяться в зависимости от ряда факторов, включающих биологическую эффективность выбранного препарата IFN-, химические свойства (например, гидрофобность) используемого препаратаIFN-, применяемые наполнители, способ введения и предполагаемый способ лечения, например введение препарата IFN- непосредственно в ткань или системное введение. Предпочтительная доза может также зависеть от таких переменных факторов, как состояние тканей субъекта, степень утраты мышечной функции и общее состояние здоровья конкретного субъекта. Доза может также зависеть от возраста,массы тела, пола, общего состояния здоровья, обмена веществ субъекта, а также от восприимчивости субъекта к побочным эффектам и введению препарата IFN- совместно с другими лекарственными средствами. Лечащий врач или ветеринар может легко определить и назначить эффективное количество препарата IFN-, необходимое для предотвращения, противодействия или замедления развития заболевания. Назначенные дозы можно вводить постоянно или ежедневно, но в настоящее время указанные дозы предпочтительно вводят один, два или три раза в неделю на протяжении всего времени сохранения удовлетворительной реакции (измеряемой, например, на основании стабилизации и/или ослабления симптомов заболевания при помощи соответствующих медицинских маркеров и/или индексов качества жизни). Дозы препарата можно вводить еще реже, например один раз в месяц. Чтобы облегчить переносимость частых вливаний, можно посоветовать имплантировать полупостоянный стент (например, внутривен- 23009289 ный, внутрибрюшинный или внутрикапсульный). Любые вышеуказанные фармацевтические композиции могут содержать 0,1-99%, 1-70% или предпочтительно, 1-50% препарата IFN- в качестве активного ингредиента. При любом способе введения можно использовать разделенные или однократные дозы. Например,препараты IFN- можно вводить один раз в день или в неделю в виде однократной дозы, или общую дозу можно разделить на две, три или четыре дозы. Препараты IFN- можно вводить в количестве от около 0,001 до около 100 мг/кг массы тела в расчете на одну дозу, например от около 0,1 до около 50 мг/кг массы тела, от около 0,1 мг/кг массы тела до около 20 мг/кг массы тела или от около 1 мг/кг массы тела до около 3 мг/кг массы тела. Указанные дозы можно вводить с интервалами в 1-14 дней, например, каждый день, через день, каждый третий день, каждый пятый день, один раз в неделю или один раз в две недели. В зависимости от удельной активности препарата IFN- его можно также вводить в дозе от около 10 до около 100 мкг/дозу, в частности от около 20 до около 50 мкг/дозу, например около 30 мкг/дозу. При вычислении в международных единицах препарат IFN- можно вводить в дозе от около 1 до 30 ММЕ/дозу, в частности, от 3 до 20 ММЕ/дозу, например от 3 до 12 ММЕ. Предпочтительные дозы содержат около 3 ММЕ, 6 ММЕ и 12 ММЕ в расчете на одну дозу. Такие дозы предпочтительно вводят примерно один или два раза в неделю. Вводимую дозу можно оптимизировать, например, путем введения препарата IFN- с последующим определением концентрации препарата IFN- в кровотоке или локальной концентрации. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат IFN- вводят в виде подкожной инъекции, обеспечивающей доставку 0,01-100 мкг/кг или более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг IFN-, например пегилированного IFN-, в течение одной недели, причем две инъекции в дозе 0,005-50 мкг/кг или более предпочтительно 0,005-5 мкг/кг можно вводить в 0-й период времени и через 72 ч. Кроме того,одним способом парентерального введения является имплантация системы с медленным или отсроченным высвобождением лекарственного средства, обеспечивающей поддержание постоянного уровня дозы, которая описана в патенте США 3710795. Дозы для перорального введения по настоящему изобретению, предпочтительно для препаратов пегилированного IFN-, находятся в пределах около 0,01-100 мкг/кг/сутки при пероральном введении или,более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг/сутки при пероральном введении. Композиции предпочтительно получают в форме рифленых таблеток, содержащих 0,5-5000 мкг или более предпочтительно 0,5-500 мкг препарата IFN-. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъекту, страдающему невропатией, например CIDP, препарат IFN- вводят в виде внутримышечных инъекций. Препарат IFNможно вводить один раз в неделю. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат IFN- вводят субъекту один раз в неделю в дозе около 6 ММЕ. В других вариантах осуществления изобретения нуждающемуся субъекту один раз в неделю вводят около 6 ММЕ препарата IFN-, причем введение необязательно является внутримышечным. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат IFN- вводят в соответствии с одной схемой в течение определенного периода времени и затем в соответствии с другой схемой. Например,субъект может принимать препарат IFN- один раз в неделю в течение двух месяцев и затем два раза в неделю на протяжении последующих месяцев. Препарат можно сначала вводить подкожно и затем внутримышечно. В соответствии с другими схемами лечения дозу, способ введения или препарат IFN- изменяют при каждом последующем введении. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения IFN- является препаратомAVONEX. AVONEX представлен на рынке в виде лиофилизованного порошка, имеющего следующий состав: Состав в расчете на 1 мл дозу: 30 мкг интерферона-b-1 а (6 миллионов международных единиц (ММЕ; 50 мМ фосфата натрия; 100 мМ хлорида натрия; 15 мг сывороточного альбумина человека; рН 7,2. Удельная активность интерферона AVONEX составляет 2 х 108 единиц/мг, то есть 200 ММЕ антивирусной активности на миллиграмм белка IFN-b-1a. Нуждающийся субъект восстанавливает порошок стерильной водой до выполнения внутримышечной инъекции в 1 мл дозе один раз в неделю. AVONEX может быть также получен в виде жидкого препарата, имеющего следующий состав: Состав в расчете на 0,5 мл дозу: 30 мкг IFN-b-1a (6 миллионов международных единиц (ММЕ; 20 мМ ацетата (ацетат натрия и уксусная кислота); 150 мМ аргинин-HCl 0,005% (мас./об.) полисорбата 20;- 24009289 вода для инъекций; рН 4,8. Препарат может быть упакован в предварительно наполненный шприц. Нуждающийся субъект может использовать шприц вручную или при помощи автоинжектора. Препарат вводят в количестве 6 ММЕ (то есть 30 мкг) внутримышечно один раз в неделю. В другом варианте осуществления изобретения IFN- является препаратом REBIF, который получают в виде лиофилизованного порошка или жидкого препарата. Лиофилизованный порошок имеет следующий состав: Состав в расчете на 2,0 мл дозу:IFN-b-1a в количестве 3 ММЕ; маннит; сывороточный альбумин человека (HSA); ацетат натрия; рН 5,5. Удельная активность интерферона REBIF составляет 2,7 х 108 единиц/мг, то есть 270 ME антивирусной активности на миллиграмм белка IFN-b-1a. Нуждающийся субъект восстанавливает порошок раствором хлорида натрия (0,9% NaCl) до выполнения подкожных инъекций три раза в неделю. Жидкий препарат RELIF имеет следующий состав: Состав в расчете на 0,5 мл дозу: 6 или 12 ММЕ IFN-b-1a; 4 или 2 мг сывороточного альбумина человека (HSA); 27,3 мг маннита; 0,4 мг ацетата натрия; вода для инъекций; Жидкий препарат, упакованный в предварительно наполненный шприц, вводят подкожно при помощи автоинжектора (Rebiject) или без него (6 или 12 ММЕ, что соответствует 66 мкг/неделю или 132 мкг/неделю) 3 раза в неделю. В другом варианте осуществления изобретения IFN- является препаратом BETASERON (компании Berlex), в котором IFN-, имеющий мутацию с заменой cys-17 на ser, продуцируют в Е. coli. Указанный негликозилированный IFN- является менее активным, чем AVONEX или REBIF, которые продуцируют в клетках СНO. Указанные препараты продают в 250 мкг (8 ММЕ) дозах в виде лиофилизованных и жидких препаратов, предназначенных для подкожных инъекций, вводимых через день. BETAFERON является еще одним коммерчески доступным препаратом IFN-, который можно вводить подкожно в соответствии с инструкциями изготовителя. Помимо препарата IFN-бета и необязательно другого лекарственного средства нуждающимся субъектам могут быть также назначены лекарственные средства от невропатических болей, например антиэпилептические средства. Двумя наиболее часто используемыми лекарственными средствами являются габапентин (нейронтин) и карбамазепин (тегретол). Альтернативно, для лечения невропатических болей можно также использовать трициклические антидепрессанты, например амитриптилин (элавил). Течение болезни и реакцию на лекарственные средства можно контролировать при помощи клинических исследований и лабораторных анализов. Эффективность лечения по данному изобретению определяют по ослаблению ранее описанных признаков и симптомов заболевания и по устранению или значительному уменьшению естественных побочных эффектов интерферона (то есть симптомов, напоминающих грипп, таких как лихорадка, головная боль, озноб, миалгия, усталость и т.д., и симптомов, относящихся к центральной нервной системе, таких как депрессия, парестезия, нарушение концентрации внимания и т.д.). Настоящее изобретение далее проиллюстрировано нижеследующими примерами, которые не ограничивают объем изобретения. Содержание всех приведенных ссылок (включая научные публикации,выданные патенты, опубликованные заявки на патент) включено в данное описание изобретения в качестве ссылки. При осуществлении настоящего изобретения можно использовать, за исключением особо оговоренных случаев, обычные методы, применяемые в биологии клетки, культивировании клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, генной инженерии и иммунологии, которые известны в данной области. Такие методы всесторонне описаны в научной литературе. См., например, нижеследующие публикации: Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and ManiatisMouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Примеры Пример 1. Лечение больных CIDP препаратом IFN1a. Больных CIDP, проходящих курс лечения IVIg, переводят на лечение препаратом IFN- следующим образом. Субъектов с установленным диагнозом CIDP, проходящих курс лечения, включающий постоянное введение IVIg один раз в две недели или один раз в четыре недели, переводят на одну из нижеследующих схем введения IFN1a при помощи внутримышечных инъекций: 30 мкг (6 ММЕ) AVONEX один раз в неделю; 30 мкг (6 ММЕ) AVONEX два раза в неделю; 60 мкг (12 ММЕ) AVONEX один раз в неделю или 60 мкг (12 ММЕ) AVONEX два раза в неделю. При введении IVIg и IFN1a в один и тот же день оба препарата вводят с промежутком времени, равным по меньшей мере двум часам. Субъекты проходят данный курс комбинированного лечения в течение 16 недель, и на протяжении указанного периода времени у них оценивают развитие болезни примерно через каждые четыре недели. В конце 16-й недели больным прекращают вводить IVIg и продолжают лечение препаратом IFN1a в соответствии с ранее применявшейся схемой лечения. У испытуемых субъектов продолжают контролировать развитие болезни. Если субъекты чувствовали себя лучше при комбинированном лечении, возобновляют курс лечения IVIg. Затем можно постепенно уменьшать введение IVIg, сокращая количество или частоту введения IVIg. Эквиваленты Специалисты в данной области должны признать или установить в результате обычного экспериментирования наличие многих вариантов, эквивалентных конкретным вариантам осуществления изобретения, рассмотренным в данном описании изобретения. Все такие эквиваленты входят в приведенную ниже формулу изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение препарата IFN- для получения лекарственного средства для лечения хронической демиелинизирующей двигательной невропатии, при этом лекарственное средство вводится субъекту,который ранее не признавался как устойчивый к лечению хронической демиелинизирующей двигательной невропатии другими способами. 2. Применение по п.1, в котором лекарственное средство вводят субъекту, которого лечили другими способами лечения хронической демиелинизирующей двигательной невропатии, и лечение дополнительно включает прекращение другого лечения. 3. Применение по п.1, где препарат IFN- вводят в комбинированном лечении, включающим второе лечение, выбранное из группы, состоящей из введения IVIg, введения иммунодепрессантов, противовоспалительных лекарственных средств и плазмафереза. 4. Применение по п.3, где вторым лечением является введение IVIg. 5. Применение по п.3, где вторым лечением является введение иммунодепрессанта. 6. Применение по п.5, где иммунодепрессант выбран из группы, состоящей из стероида, азотиоприна, циклоспорина, циклофосфамида и микофенолята. 7. Применение по п.3, где вторым лечением является введение противовоспалительного лекарственного средства. 8. Применение по п.3, где вторым лечением является плазмаферез. 9. Применение препарата IFN- для получения лекарственного средства для лечения хронической демиелинизирующей двигательной невропатии, где прапарат IFN- вводят в комбинированной терапии,включающей введение иммунодепрессанта, противовоспалительного агента или плазмаферез. 10. Применение по п.9, где препарат IFN- вводят в комбинации с введением иммунодепрессанта или с плазмаферезом. 11. Применение по п.9, где комбинированным лечением является введение препарата IFN- и иммунодепрессанта. 12. Применение по п.11, где иммунодепрессант выбран из группы, состоящей из стероида, азотиоприна, циклоспорина, циклофосфамида и микофенолята. 13. Применение по п.9, где комбинированная терапия представляет собой введение препарата IFNи противовоспалительного средства. 14. Применение по п.9, где комбинированная терапия представляет собой плазмаферез и введение препарата IFN-. 15. Применение по любому из пп.9-14, где лекарственное средство вводят субъекту у которого ранее не была обнаружена устойчивость к другим видам лечения хронической демиелинизирующей невро- 26009289 патии. 16. Применение по любому из пп.1-15, в котором препарат IFN- вводят парентеральным способом,отличным от подкожного введения. 17. Применение по п.16, в котором препарат IFN- вводят внутримышечно. 18. Применение по п.16, в котором препарат IFN- вводят внутривенно. 19. Применение по любому из пп.1-18, где хроническая демиелинизирующая двигательная невропатия является хронической демиелинизирующей невропатией. 20. Применение по любому из пп.1-19, в котором препарат IFN- содержит зрелый IFN-. 21. Применение по любому из пп.1-20, в котором в препарате IFN- отсутствует первый остаток метионина. 22. Применение по любому из пп.1-21, в котором IFN- является человеческим IFN-. 23. Применение по п.22, в котором IFN- по меньшей мере примерно на 95% идентичен непроцессированному зрелому человеческому IFN-, имеющему SEQ ID NO:4. 24. Применение по п.23, в котором IFN- содержит SEQ ID NO:4. 25. Применение по любому из пп.1-24, в котором IFN- гликозилирован. 26. Применение по любому из пп.1-24, в котором IFN- не гликозилирован. 27. Применение по п.22 в котором IFN- является IFN1a. 28. Применение по п.22, в котором IFN- является IFN1b. 29. Применение по любому из пп.1-28, в котором препарат IFN- содержит IFN-, слитый с константным доменом молекулы иммуноглобулина. 30. Применение по п.29, в котором молекула иммуноглобулина является молекулой человеческого иммуноглобулина. 31. Применение по п.30, в котором молекула иммуноглобулина является тяжелой цепью IgG1. 32. Применение по п.31, в котором IFN- содержит SEQ ID NO:14. 33. Применение по любому из пп.1-32, в котором препарат IFN- содержит пегилированный IFN-. 34. Применение по любому из пп.1-33, в котором препарат IFN- содержит стабилизирующий агент. 35. Применение по п.34, в котором стабилизирующий агент является кислой аминокислотой. 36. Применение по п.35, в котором стабилизирующий агент является аргинином. 37. Применение по любому из пп.1-36, в котором препарат IFN- имеет значение рН в пределах от около 4,0 до 7,2. 38. Применение по любому из пп.1-37, которое включает введение млекопитающему нескольких доз препарата IFN-. 39. Применение по любому из пп.1-38, в котором препарат IFN- вводят один раз в неделю в дозе около 6 ММЕ. 40. Применение по любому из пп.1-38, в котором препарат IFN- вводят два раза в неделю в дозе около 6 ММЕ. 41. Применение по любому из пп.1-38, в котором препарат IFN- вводят один раз в неделю в дозе около 12 ММЕ. 42. Применение по любому из пп.1-38, в котором препарат IFN- вводят два раза в неделю в дозе около 12 ММЕ. 43. Применение по любому из пп.1-42, в котором препарат вводят человеку. Открытая рамка считывания конструкции IFN- G162C-lg, полученной в результате прямого слияния Фиг. 1 С Открытая рамка считывания конструкции IFN- G162C-lg, полученной в результате слияния при помощи линкера G4S