Способы и композиции для лечения сердечно-сосудистого заболевания доставкой генов in vivo

008538 Заявление, касающееся финансируемого правительством исследования Определенная часть описанного здесь исследования поддерживалась отчасти грантами от правительства Соединенных Штатов с номерами грантов VA-HL0281201, HL1768218 и IP50HL53773.01, присужденными Национальными институтами здравоохранения. Правительство Соединенных Штатов может иметь определенные права в отношении данного изобретения. Перекрестная ссылка на родственные заявки Данная заявка является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/609080, поданной 30 июня 2000 г., которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/435156, поданной 5 ноября 1999 г., которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 08/722271, поданной 27 февраля 1996 г. (в настоящее время получает патент), которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 08/485472, поданной 7 июня 1995 г. (в настоящее время получила патент US Patent5792453), которая была частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 08/396207, поданной 28 февраля 1995 г.; и эта заявка является частичным продолжением международной заявки PCT/US99/02702, поданной 9 февраля 1999 г.,которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/021773, поданной 11 февраля 1998 г., которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 08/485472, поданной 7 июня 1995 г. (в настоящее время получила патент US Patent5792453); и эта заявка является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/068102, поданной 30 апреля 1998 г., которая является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 08/852779, поданной 6 мая 1997 г. и является частичным продолжением заявки Соединенных Штатов с регистрационным номером 09/132167, поданной 10 августа 1998 г. Все приведенные выше патентные заявки включены здесь в качестве ссылки. Область техники, к которой относится изобретения Данное изобретение относится к способам и композициям для лечения сердечно-сосудистого заболевания генотерапией in vivo. Более конкретно, данное изобретение относится к способам и полинуклеотидным конструкциям для лечения заболевания сердца и/или для лечения заболевания периферических сосудов доставкой in vivo ангиогенных трансгенов. Уровень техники Американской кардиологической ассоциацией (статистическое приложение 1995 года) сообщалось,что около 60 миллионов взрослых людей в Соединенных Штатах страдают от сердечно-сосудистого заболевания. Сердечно-сосудистые заболевания ответственны за почти миллион смертей ежегодно в Соединенных Штатах, что составляет более 40% всех смертей. Каждый год в Соединенных Штатах, имеются около 350000 новых случаев стенокардии (грудной жабы, angina pectoris), общего состояния коронарной артерии, характеризующегося временными периодами ишемии миокарда, приводящими к боли в груди. Подобным образом, каждый год, около 400000 пациентов диагностируются, как имеющие застойную сердечную недостаточность "CHF", другое проявление заболевания сердца, которое представляет наиболее частую неизбирательную причину госпитализации в США. В 1996 г., согласно оценке, 725000 людей страдали от заболевания периферических сосудов, из которых более 100000 нуждались в ампутации конечностей. Ишемия миокарда является аспектом дисфункции сердца, которая имеет место, когда сердечная мышца (миокард) не получает достаточного кровоснабжения и, следовательно, лишена необходимых уровней кислорода и питательных веществ. Ишемия миокарда может приводить к различным заболеваниям сердца, например, стенокардии, сердечному приступу и/или застойной сердечной недостаточности. Наиболее обычной причиной ишемии миокарда является атеросклероз (также называемый заболеванием коронарных сосудов (CAD), (т.е. ишемической болезнью сердца или ИБС), которое вызывает блокады в коронарных артериях, кровеносных сосудах, которые обеспечивают кровоток к сердечной мышце. Существующие способы лечения для миокардиальной ишемии включают в себя фармакологические терапии, хирургическое шунтирование коронарных артерий и чрескожную реваскуляризацию (восстановление кровоснабжения конечности) с использованием таких способов, как баллонная ангиопластика. Стандартная фармакологическая терапия основана на стратегиях, которые включают в себя либо увеличение кровоснабжения сердечной мышцы, либо уменьшение потребности сердечной мышцы в отношении кислорода и питательных веществ. Например, увеличенное кровоснабжение миокарда может быть достигнуто с использованием таких агентов, как блокаторы кальциевых каналов или нитроглицерин. Считается,что эти агенты увеличивают диаметр подвергнутых заболеванию артерий посредством релаксации гладкой мышцы в стенках артерий. Уменьшение потребности сердечной мышцы в кислороде и питательных веществах может быть выполнено либо агентами, которые уменьшают гемодинамическую нагрузку на сердце, такими как артериальные вазодилататоры, или агентами, которые уменьшают контрактильную реакцию сердца на конкретную гемодинамическую нагрузку, такими как антагонисты бетаадренергического рецептора. Хирургическое лечение ишемической болезни сердца обычно основывается на шунтировании заболевших артериальных сегментов стратегически помещаемыми шунтирующими-1 008538 трансплантатами (обычно трансплантатами подкожной вены или внутренней артерии молочной железы). Чрескожная реваскуляризация обычно основывается на применении катетеров для уменьшения сужения в пораженных заболеванием коронарных артериях. Все эти стратегии используют для уменьшения числа,или для ликвидации ишемических приступов, но все они имеют различные недостатки, некоторые из которых обсуждаются ниже. Многие пациенты с заболеванием сердца, в том числе многие из тех, тяжелая миокардиальная ишемия которых приводила к сердечному приступу, диагностируются как имеющие застойную сердечную недостаточность. Застойная сердечная недостаточность определяется как отклоняющаяся от нормы сердечная функция, приводящая к недостаточному минутному сердечному выбросу (минутному объему сердца) для удовлетворения метаболических потребностей (Braunwald, E. (ed.), In: Heart Disease, W.B.Saunders, Philadelphia, page 426, 1988). Согласно оценке, 5 млн людей в Соединенных Штатах страдают от застойной сердечной недостаточности. Как только симптомы CHF становятся умеренно тяжелыми,прогноз является худшим, чем в случае большинства раков, вследствие того, что только половина таких пациентов, как ожидается, проживут более 2 лет (Braunwald, E. (ed.), In: Heart Disease, W.B. Saunders,Philadelphia, page 471-485, 1988). Лекарственная терапия может в начальной стадии ослабить симптомыCHF (например, отек, непереносимость физической нагрузки, одышку) и в некоторых случаях продлить жизнь. Однако прогноз этого заболевания, даже с лекарственным лечением, остается мрачным, и частота встречаемости CHF увеличивается (см., например, Baughman, K., Cardiology Clinics 13: 27-34, 1995). Симптомы CHF включают в себя одышку, усталость, слабость, опухание ног и непереносимость физической нагрузки. При физическом обследовании пациенты с сердечной недостаточностью имеют тенденцию повышения частоты сердечных сокращений и частоты дыхания (признака наличия жидкости в легких), отека, расширения яремных вен и, обычно, увеличенное сердце. Наиболее общей причиной CHF является атеросклероз, который, как обсуждалось выше, вызывает блокады в коронарных артериях, которые подают кровь к сердечной мышце. Таким образом, застойная сердечная недостаточность наиболее часто связана с заболеванием коронарных артерий, которое является таким тяжелым по его масштабу или внезапности, что оно приводит к развитию хронической или острой сердечной недостаточности. У таких пациентов обширная и/или внезапная окклюзия одной или нескольких коронарных артерий препятствует достаточному кровотоку к миокарду, приводя к тяжелой ишемии и, в некоторых случаях, инфаркту миокарда или гибели сердечной мышцы. Последующий некроз миокарда имеет тенденцию сопровождаться прогрессирующей хронической сердечной недостаточностью или острым состоянием низкого сердечного выброса - оба из которых связаны с высокой смертностью. Большинство пациентов с застойной сердечной недостаточностью имеют тенденцию развития увеличенного, слабо сокращающегося сердца, состояния, называемого "дилатированной кардиомиопатией"(или DCM, как ее называют в данной заявке). DCM является состоянием сердца, обычно диагностируемым по обнаружению дилатированного гипоконтрактильного левого и/или правого желудочка. Опять в большинстве случаев застойная сердечная недостаточность, связанная с расширенным сердцем, является результатом заболевания коронарных артерий, часто настолько серьезным, что оно может вызывать один или несколько инфарктов миокарда. Однако, в очень небольшом числе случаев, DCM может встречаться в отсутствие характеристик заболевания коронарных артерий (например, атеросклероза). В ряде случаев,в которых дилатированная кардиомиопатия не ассоциирована с ИБС (атеросклерозом), причина DCM является известной или предполагаемой. Примеры включают в себя семейную кардиомиопатию (например, связанную с прогрессирующей мышечной дистрофией, миотонической мышечной дистрофией,атаксией Фридрайха и наследственной дилатированной кардиомиопатией), инфекции, приводящие к воспалению миокарда (например, инфекции различными вирусами, бактериями и другими паразитами),неинфекционные воспаления (например, обусловленные аутоиммунными заболеваниями, peripartumкардиомиопатией, аллергическими реакциями или отторжениями трансплантата), метаболические нарушения, вызывающие миокардит (в том числе связанные с питанием, эндокринологические и связанные с отклонениями от нормы электролитов) и подверженность действию токсических агентов, вызывающих миокардит (в том числе алкоголя, а также некоторых химиотерапевтических лекарственных средств и катехоламинов). Однако в большинстве случаев не связанной с атеросклерозом дилатированной кардиомиопатии (DCM) причина заболевания остается неизвестной, и это состояние, следовательно, называют идиопатической дилатированной кардиомиопатией (или "IDCM"). Несмотря на потенциальные различия в лежащих в основе заболевания причин, большинство пациентов с тяжелой CHF имеют увеличенные, имеющие тонкую стенку сердца (т.е. DCM) и большинство этих пациентов обнаруживают миокардиальную ишемию (даже хотя некоторые из них могут не иметь видимого атеросклероза). Кроме того,пациенты с DCM могут испытывать приступы грудной жабы (стенокардии), хотя они могут не иметь тяжелого заболевания коронарных артерий. Появление CHF выдвигает несколько главных терапевтических проблем, в том числе прогрессирующее миокардиальное повреждение, гемодинамические недостаточности, связанные с дилатированным сердцем, угрозу системных эмболов (кровяных сгустков) и риск желудочковых аритмий. Традиционная реваскуляризация не является предпочтительной для лечения не связанной с ишемической болезнью сердца (ИБС) DCM, так как окклюзивное (закупоривающее) коронарное заболевание не является-2 008538 первичной проблемой. Даже для пациентов, для которых причина DCM известна или предполагается,повреждение обычно нелегко поддается реверсии. Например, в случае индуцированной адриамицином кардиотоксичности кардиомиопатия является обычно необратимой и приводит к смерти более чем 60%,пораженных пациентов. Для некоторых пациентов с DCM сама причина является неизвестной. В результате отсутствуют обычно применяемые способы лечения для DCM. Врачи традиционно фокусировали внимание на облегчении симптомов, присутствующих у пациента, проявляющего дилатированную кардиомиопатию (DCM) (например, ослаблением удерживания жидкости диуретическими средствами и/или снижением потребности сердечной мышцы в кислороде и питательных веществах ингибиторами ферментов, превращающими ангиотензин). В результате приблизительно 50% пациентов, обнаруживающих дилатированную кардиомиопатию (DCM), умирают в пределах двух лет диагноза, часто от неожиданной остановки сердца, связанной с вентрикулярными (желудочковыми) аритмиями. "Вентрикулярное ремоделирование" является аспектом сердечного заболевания, который часто имеет место после инфаркта миокарда и часто приводит к дальнейшему повреждению вентрикулярной функции. Во многих случаях после заживления инфаркта миокарда продолжающаяся ишемия в пограничном районе между заживленным инфарктом и нормальной тканью и другие факторы приводят к дилатации (расширению) и/или ремоделированию оставшейся ткани сердца. Эти дилатация или ремоделирование, хотя сначала адаптивного характера, часто ведут к дальнейшему нарушению вентрикулярной функции. Дилатация всего сердца имеет место у приблизительно 50% пациентов, которые имеют такие инфаркты, и ремоделирование обычно развивается в пределах нескольких месяцев после инфаркта миокарда, хотя оно может происходить также рано, в диапазоне 1-2 недель после инфаркта. Слабая функция левого желудочка является самым точным и единственным прогностическим фактором неблагоприятного исхода после инфаркта миокарда. Таким образом, предотвращение вентрикулярного ремоделирования после инфаркта миокарда было бы благоприятным фактором. Одним подходом в попытке предотвращения вентрикулярного ремоделирования является лечение пациента, страдающего от инфаркта миокарда, ингибитором фермента,превращающего ангиотензин ("АСЕ") (см., например, McDonald, K.M., Trans. Assoc. Am. Physicians 103:229-235, 1990; Cohn, J. Clin. Cardiol. 18 (Suppl. IV) iV-4-IV-12, 1995). Однако эти агенты являются лишь незначительно эффективными в предупреждении вредного вентрикулярного ремоделирования, и требуются новые способы терапии. Существующие в настоящее время способы лечения для CHF включают в себя фармакологические терапии, процедуры коронарной реваскуляризации и трансплантацию сердца. Фармакологические терапии для CHF были направлены на увеличение силы сокращения сердца (посредством использования инотропных агентов, таких как дигиталис (наперстянка) и агонисты бета-адренергических рецепторов),снижение накопления жидкости в легких и в других местах (применением диуретических средств) и уменьшение нагрузки на сердце (путем применения агентов, которые снижают системное сосудистое сопротивление, таких как ингибиторы ферментов, превращающих ангиотензин). Были также испытаны антагонисты бета-адренергических рецепторов. Хотя подобные фармакологические агенты могут улучшать симптомы и потенциально продлевают жизнь, прогноз в большинстве случаев остается мрачным. Некоторые пациенты с сердечной недостаточностью вследствие связанного с ней заболевания коронарной артерии могут испытывать улучшение, по меньшей мере временное, в результате процедур реваскуляризации, таких как хирургическое шунтирование и ангиопластика коронарных артерий. Такие процедуры имеют потенциальную пользу, когда сердечная мышца не является погибшей, но может быть дисфункциональной вследствие недостаточного кровотока. Если нормальный коронарный кровоток восстанавливается, прежде дисфункциональный миокард может сокращаться более нормально, и функция сердца может улучшиться. Однако, если пациент имеет недостаточное микрососудистое (капиллярное) ложе (например, как это может быть обнаружено у более тяжелых пациентов с CHF), реваскуляризация будет редко восстанавливать сердечную функцию до нормального или почти нормального уровней, даже если иногда отмечаются слабые улучшения. Кроме того, встречаемость неудачных обходных сосудистов шунтов и рестеноза после ангиопластики выдвигает дополнительные риски для пациентов, подвергаемых лечению такими способами. Трансплантация сердца может быть предпочтительным выбором для пациентов с CHF, которые не имеют других сопутствующих заболеваний и являются относительно молодыми, но этот выбор пригоден только для малого числа таких пациентов и только при высокой стоимости. В целом, можно видеть, что CHF имеет очень слабый прогноз и слабо отвечает на существующие в настоящее время терапии. Дальнейшим осложнением физиологических состояний, связанных с CHF, являются различные природные адаптации, которые имеют тенденцию появляться у пациентов с дисфункциональным сердцем. Хотя эти природные реакции могут первоначально улучшать функцию сердца, они часто приводят к другим проблемам, которые могут обострять заболевание, приводить в тупик лечение и имеют неблагоприятные влияния на выживание. Существуют три таких адаптивных реакции, обычно наблюдаемые у пациентов с застойной сердечной недостаточностью (CHF): (i) ретенция (удержание) объема, индуцируемая изменениями в реабсорбции натрия, которая расширяет объем плазмы и первоначально улучшает минутный объем сердца; (ii) увеличение сердца (вследствие дилатации и гипертрофии), которое может увеличивать ударный объем крови, выбрасываемой желудочком за одно сокращение, при поддержании-3 008538 нормального натяжения стенок; и (iii) увеличенное высвобождение норэпинефрина из адренергических нервных окончаний, сталкивающихся с сердцем, который, посредством взаимодействия с сердечными бета-адренергическими рецепторами, стремится увеличить частоту сердечных сокращений, увеличивая тем самым минутный сердечный выброс. Однако каждая из этих трех природных адаптаций имеет тенденцию приводить в конце концов к неудаче в силу разных причин. В частности, задержка жидкости имеет тенденцию приводить к отеку, к удержанию жидкости в легких, которая нарушает дыхание. Увеличение сердца может приводить к вредному ремоделированию левого желудочка с последующей тяжелой дилатацией и увеличенным натяжением стенок, обостряя тем самым CHF. Наконец, продолжительное воздействие на сердце норэпинефрина имеет тенденцию делать сердце нечувствительным к адренергической стимуляции и связано с плохим прогнозом. Нарушения периферической сосудистой сети, подобно заболеванию сердца, часто возникают по причине уменьшенного кровотока к ткани (например, скелетной мышце), которая (подобно сердечному заболеванию) становится ишемической (малокровной), в частности, при увеличении метаболических потребностей (например, при физической нагрузке). Так, атеросклероз, присутствующий в периферическом сосуде, может вызвать ишемию в ткани, снабжаемой пораженным сосудом. Эта проблема, известная как артериосклеротическое окклюзионное заболевание периферических артерий (PAOD), наиболее часто поражает нижние конечности пациентов. Как и в случае других форм сердечно-сосудистого заболевания, это состояние или по меньшей мере некоторые из его симптомов могут лечиться с использованием лекарственных средств, таких как аспирин или другие агенты, которые снижают вязкость крови,или хирургическим вмешательством, например трансплантацией артерий, хирургическим удалением отложений жировых бляшек или эндоваскулярными способами лечения, например ангиопластикой. Хотя симптомы могут быть улучшены, эффективность таких способов лечения обычно является недостаточной, в силу причин, аналогичных описанным выше. Недавно исследования способов лечения сердечно-сосудистого заболевания обратились к терапевтическим средствам, связанным с ангиогенезом. Ангиогенезом называют обычно развитие и дифференцировку кровеносных сосудов. Известно, что ряд белков, обычно называемых ангиогенными белками,стимулируют ангиогенез. Такие ангиогенные белки включают в себя члены семейства фибробластного фактора роста (FGF), семейства васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и инсулиноподобного фактора роста (IGF) и другие (как описано более подробно ниже и в литературе в данной области). Например, члены семейств FGF и VEGF были признаны в качестве регуляторов ангиогенеза во время роста и развития. Недавно была исследована их роль в стимуляции ангиогенеза во взрослых животных (как обсуждается ниже). Была исследована ангиогенная активность семейств FGF и VEGF. Например, было показано, что кислый белок FGF ("aFGF") в покрытом коллагеном матриксе, при помещении в брюшинную полость взрослых крыс, приводил к хорошо васкуляризованной и нормально перфузируемой структуре (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 7928-7932, 1989). Инъекция основного белка FGF ("bFGF") в коронарные артерии взрослых кроликов во время коронарной окклюзии приводила к уменьшенной миокардиальной дисфункции, меньшим повреждениям миокарда и увеличению кровеносных сосудов в находящемся при риске ложе (Yanagisawa-Miwaet al., Science, 257: 1401-1403, 1992). Сходные результаты сообщались в моделях миокардиальной ишемии животных с использованием белка bFGF (Harada et al., J. Clin. Invest, 94: 623-630, 1994; Unger et al.,Am. J. Physiol., 266: H1588-H1595, 1994). Увеличение в коллатеральном кровотоке было показано у собак, обработанных белком VEGF (Band et al., Circulation 89: 2183-2189, 1994). Однако трудности, связанные с потенциальным применением инфузий таких белков для стимуляции сердечного ангиогенеза, включают в себя достижение правильной локализации в течение достаточного периода времени и гарантирование того, что этот белок находится и остается в правильной форме и концентрации, необходимых для поглощения и стимуляции ангиогенного действия в клетках миокарда. Концентрация белка, которая является первоначально высокой (например, после болюсной инъекции),но затем быстро падает (посредством клиренса организмом), может быть как токсичной, так и неэффективной. Другой трудностью является необходимость повторяемой инфузий или инъекции этого белка. Некоторые публикации постулировали применение переноса генов для лечения или предупреждения заболевания, в том числе некоторых заболеваниий сердца. См., например, French, "Gene Transfer andAdenovirus: Gene Therapy for Cardiovascular Disease." Circulation 88:1937-1942, 1993; и Mazur et al., "Coronary Restenosis and Gene Therapy," Molecular and Cellular Pharmacology, 21:104-111, 1994. Кроме того,некоторые группы предложили перенос генов in vivo в миокард с использованием плазмид, ретровируса,аденовируса и других векторов (см., например, Barr et al., Supplement II, Circulation, 84(4): Abstract 1673,1991; Barr et al., Gene Ther., 1: 51-58, 1994; French et al., Circulation, 90(5): 2402-2413, 1994; French et al.,Circulation, 90(5): 2414-2424, 1994; French et al., Circulation, 90: 1517 Abstract No. 2785, 1994; Leiden, et al.,WO94/11506 (26 May 1994); Guzman et al., Circ. Res., 73(6): 1202-1207, 1993; Kass-Eisler et al., Proc. Natl.-4 008538 Однако, в целом, эти сообщения дают немного более, чем предположения или пожелания в отношении потенциальных терапий. Из сообщений, обеспечивающих данные, полученные для животных,большинство не используют модели, достаточно сходные с действительными состояниями in vivo. Кроме того, опробованные in vivo способы обычно страдают одним или несколькими из следующих недостатков: недостаточной эффективностью трансдукции и экспрессии трансгенов; заметной иммунной реакцией на использованные векторы, в том числе воспаления и некроза ткани; и, что важно, относительной неспособностью к нацеленной трансдукции и экспрессии трансгенов для представляющего интерес органа (например, перенос генов, нацеленный на сердце, приводил к трансгену, доставляемому также в не относящиеся к сердцу участки, такие как печень, почки, легкие, головной мозг и яички испытуемых животных). В качестве примера, инсертирование трансгена в популяцию быстро делящихся клеток будет приводить к существенно уменьшенной продолжительности экспрессии трансгена. Примеры таких клеток включают в себя эндотелиальные клетки, которые создают внутренний слой всех кровеносных сосудов, и фибробласты, которые диспергированы по всему сердцу. Нацеливание трансгена таким образом,что только желательные клетки будут получать и экспрессировать этот трансген, и таким образом, что этот трансген не будет распределяться системно, является также критически важным соображением. Если это не достигается, результатом будут системная экспрессия трансгена и проблемы, связанные с этим. Например, были задокументированы воспалительные инфильтраты после опосредованного аденовирусом переноса гена в печень (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4407, 1994). Кроме того, воспалительные инфильтраты были задокументированы в сердце после прямой инъекции в миокард через иглу,вставленную в стенку миокарда (French et al., Circulation, 90(5): 2414-2424, 1994). Способ лечения ряда форм застойной сердечной недостаточности, связанный с бетаадренергической передачей сигнала, был недавно продемонстрирован Hammond et al., в РСТ-публикацииWO 98/10085, опубликованной 12 марта 1998 года. Этот способ включает в себя доставку генов, кодирующих элементы бета-адренергического пути передачи сигнала к сердцу пациента с заболеванием сердца, связанным с уменьшением бета-адренергической передачи сигнала. Сущность изобретения Данное изобретение относится к способам и композициям для лечения сердечно-сосудистого заболевания, предусматривающим доставку трансгена, кодирующего ангиогенный белок или пептид, к пораженной ткани введением вектора, содержащего этот трансген, в указанную ткань, где трансген экспрессируется, и симптомы заболевания ослабляются. Например, контрактильная (сократительная) функция и/или кровоток в средце могут быть увеличены введением содержащего трансген вектора в по меньшей мере одну коронарную артерию пациента, причем этот трансген доставляется к миокарду и экспрессируется в нем. Обеспечены также способы для применения в заболеваниях периферических сосудов, например, артериосклеротическом окклюзионном заболевании периферических артерий (PAOD). Как описано и иллстрируется здесь, эти способы, следовательно, применимы для лечения заболевания сердца, заболевания периферических сосудов и подобных нарушений. Данное изобретение обеспечивает способ увеличения кровотока в ишемической (малокровной) ткани пациента, предусматривающий доставку ангиогенного белка или пептида к ишемическому району указанной ткани введением вектора, содержащего трансген, к этой ткани, в результате чего этот трансген экспрессируется в ткани и кровоток в этой ткани увеличивается. В одном аспекте вектор, содержащий трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, вводят в ишемическую скелетную мышцу, где этот ангиогенный белок или пептид экспрессируется и вызывает увеличение в кровотоке и уменьшение ишемии в данной ткани. В альтернативном варианте вектор вводят в кровеносный сосуд, снабжающий кровью ишемическую ткань (например, введением в коронарную артерию, снабжающую миокард, или в периферическую артерию, например бедренную артерию, снабжающую кровью скелетную мышцу). Векторы, используемые в данном изобретении, могут быть плазмидой или предпочтительно вирусным вектором, например, дефектным в отношении репликации аденовирусом. Различные аспекты и терапевтические применения данного изобретения описаны и иллюстрируются ниже. В одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ увеличения контрактильной (сократительной) функции сердца пациента, предусматривающий доставку трансгена, кодирующего ангиогенный белок или пептид, к миокарду пациента введением вектора, содержащего этот трансген, к миокарду(предпочтительно доставку в одну или несколько коронарных артерий), где трансген доставляется в миокард и экспрессируется, и контрактильная функция сердца увеличивается. Трансген может быть введен, например, интракоронарной инъекцией в одну или более коронарных артерий или трансплантаты подкожной вены или внутренних артерий молочной железы, поставляющие кровь к миокарду. Трансген предпочтительно кодирует по меньшей мере один ангиогенный белок или пептид. Векторами, используемыми в данном изобретении, могут быть плазмида или предпочтительно вирусный вектор, в том числе, в качестве примера, дефектный в отношении репликации аденовирус. Инъекцией исходного раствора вирусного вектора (предпочтительно содержащего небольшое количество или не содержащего вируса дикого типа), глубоко (по меньшей мере около 1 см) в просвет одной или обеих коронарных артерий или трансплантатов (предпочтительно как в правую, так и в левую коронарные аретрии или трансплантаты) и предпочтительно в количестве 107-1013 вирусных частиц, как определено оптической денситометрией(более предпочтительно 109-1011 вирусных частиц), можно локально трансфецировать желаемое число клеток, в частности, миоцитов сердца, в пораженном миокарде кодирующими ангиогенный белок или пептид генами, максимизируя тем самым терапевтическую эффективность переноса гена и минимизируя нежелательный ангиогенез в экстракардиальных участках (участках вне сердца) и возможность воспалительной реакции на вирусные белки. При использовании кардиомиоцит-специфического промотора экспрессия может быть дополнительно ограничена миоцитами сердца таким образом, что дополнительно уменьшаются потенциально вредные действия ангиогенеза в тканях, не относящихся к сердцу, например,в сетчатке. Обеспечены также наборы и композиции, которые могут быть использованы в соответствии с этими терапевтическими способами. Краткое описание чертежей Фиг. 1 представляет графически процентное утолщение стенки во время (электро)кардиостимуляции в модели застойной сердечной недостаточности у свиньи. Процентное утолщение стенки оценивали последовательно в межжелудочковой перегородке и латеральной стенке перед кардиостимуляцией (день 0) и каждые 7 дней по мере прогрессирования сердечной недостаточности (как описано в примере 1). Символы представляют средние величины; столбики ошибок определяют одно стандартное отклонение (1 SD). Двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA (повторяемые измерения) показал, что на процентное утолщение стенки влияет продолжительность кардиостимуляции (Р 0,001) и участок (Р=0,001). Кроме того, картина изменения утолщения стенки была различной между этими двумя районами (Р 0,0001). Средние величины для процентного утолщения стенки в каждой временной точке испытывали на различия между этими двумя районами post hoc (после этого) по способу Тьюки; величины Р для этих анализов показаны под столбиками ошибок. Фиг. 2 А и 2 В представляют графически субэндокардиальный кровоток во время электрической кардиостимуляции в модели застойной сердечной недостаточности у свиньи, описанной в примере 1. Для фиг. 2 А субэндокардиальный (эндо) кровоток оценивали в межжелудочковой перегородке и латеральной стенке в условиях, перечисленных вдоль оси х. День относится к дню пролонгированной кардиостимуляции, в который получали эти измерения (0, начало кардиостимуляции; 14, 14 дней; 21-28,от дня 21 до дня 28). РАСЕ (электрическая кардиостимуляция) показывает, получали ли определения кровотока с активированным кардиостимулятором (+) или с неактивированным (0). Частота кардиостимулятора была равна 225 ударам в мин (bpm) (См. табл. 3 здесь в отношении цифровых величин). Символы обозначают средние величины; столбики ошибок определяют одно стандартное отклонение (1 SD). Двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA (повторяемые измерения) показал, что на субэндокардиальный кровоток влияет продолжительность (Р=0,0001) и район (Р=0,017) кардиостимуляции. Кроме того, картина изменения в субэндокардиальном кровотоке была различной между этими двумя районами(Р 0,006). Средние величины для субэндокардиального кровотока в каждой временной точке испытывали на различия между этими двумя районами post hoc по способу Тьюки; величины Р для этих анализов показаны под столбиками ошибок. Для фиг. 2 В субэндокардиальный кровоток на один удар оценивали в межжелудочковой перегородке и латеральной стенке в условиях, перечисленных вдоль оси х. Символы и условия соответствуют описанным на фиг. 2 А. (См. табл. 4 здесь в отношении цифровых величин). Двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA (повторяемые измерения) показал, что на субэндокардиальный кровоток на один удар влияет продолжительность (Р=0,0001) и район кардиостимуляции (Р=0,0198). Фиг. 3 А представляет графически меридиальное натяжение стенки в конце систолы, оцениваемое последовательно в межжелудочковой перегородке и латеральной стенке перед кардиостимуляцией (день 0) и каждые 7 дней по мере прогрессирования сердечной недостаточности (как описано в примере 1). Двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA (повторяемые измерения) показал, что на систолическое натяжение стенки влияет продолжительность кардиостимуляции (Р 0,0001). Однако картина систолического натяжения стенки была сходной в обоих районах. Измерения проводили с неактивированным кардиостимулятором. Фиг. 3 В представляет графически коронарное сосудистое сопротивление во время кардиостимуляции в модели застойной сердечной недостаточности у свиньи, описанной в примере 1. Индекс сопротивления коронарных сосудов оценивали последовательно в межжелудочковой перегородке и латеральной стенке в условиях, перечисленных вдоль оси х. Символы и условия являются такими же, какие описаны на фиг. 2. Двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA (повторяемые измерения) показал, что на сопротивление коронарных сосудов влияет продолжительность (Р=0,0001) и район кардиостимуляции(Р=0,013). Кроме того, картина изменения в сопротивлении коронарных сосудов была различной между этими двумя районами (Р=0,0012). Средние величины для сопротивления коронарных сосудов в каждой временной точке испытывали на различия между этими двумя районами post hoc (после этого) по анализам Тьюки. Этот анализ показал, что сопротивление коронарных сосудов было более высоким в латеральной стенке, чем с перегородке непосредственно после начала кардиостимуляции (величина Р указана под столбиком ошибки).-6 008538 Фиг. 4 показывает схематически конструирование примерного дефектного по репликации рекомбинантного аденовирусного вектора, применимого для переноса генов, как описано в примерах ниже. Фиг. 5 является схематическим изображением, которое показывает конструкцию рекомбинации спасения кодирующего трансген аденовируса. Фиг. 6 А и 6 В представляют в виде диаграмм контрактильную функцию обработанных животных,описанную в примере 5. Фиг. 6 А показывает результаты на животных, исследованных спустя 2 недели после переноса гена, а фиг. 6 В показывает результаты спустя 12 недель после переноса гена. Фиг. 7 А, 7 В и 7 С показывают диаграммы, соответствующие контрастным эхокардиографиям миокарда. Белые зоны обозначают контрастное усиление (больший кровоток), а темные зоны обозначают пониженный кровоток). Фиг. 7 А иллюстрирует острую окклюзию LCx у нормальной свиньи. Фиг. 7 В иллюстрирует различие в контрастном усилении между межжелудочковой перегородкой (IVS=MЖП) и ложем LCx спустя 14 дней после переноса гена с lacZ, что указывает на различные кровотоки в двух районах во время предсердной кардиостимуляции (200 ударов в мин (bpm. На фиг. 7 С, контрастное усиление кажется эквивалентным в ложе МЖП (IVS) и ложе LCx спустя 14 дней после переноса гена с FGF-5,что указывает на сходные кровотоки в этих двух районах во время предсердной кардиостимуляции. Эти результаты описаны в примере 5. Фиг. 8 показывает максимальное отношение контрастности (коррелирующее с кровотоком), выраженное в виде отношения максимальной интенсивности видеоизображения в ишемическом районе (ложеLCx), деленного на максимальную интенсивность видеоизображения в межжелудочковой перегородке(IVS), измеренного из видеоизображений с использованием основанной на компьютере программы видеоанализа во время предсердной кардиостимуляции (200 ударов в мин) перед переносом гена и спустя 141 дней после переноса гена с lacZ (контрольным геном) и с FGF-5, и в 5 животных, спустя 12 недель после переноса гена FGF-5 (описано в примере 5). Кровоток к ишемическому ложу оставался 50% от нормального после переноса гена с контрольным геном, но увеличивался в 2 раза выше нормального после переноса гена с FGF-5 (р=0,0018), причем этот эффект сохранялся в течение по меньшей мере 12 недель. Фиг. 9 показывает число сосудов, количественно определенных микроскопическим анализом в ишемическом и неишемическом районах после переноса гена с FGF-5 и с lacZ (описано в примере 5). Наблюдали увеличенное число капилляров, окружающих каждое волокно, в ишемическом и неишемическом районах животных, которые получали перенесенный ген FGF-5 (р 0,038), в сравнении с животными, которые получали ген lacZ. Фиг. 10 А, 10 В и 10 С получены из гелей, документирующих экспрессию ДНК, мРНК и белка после генного переноса ангиогенного трансгена, к миокарду в соответствии с данным изобретением (как описано в примере 5). Фиг. 10D получена из геля после ПЦР-амплификации, показывающей отсутствие какого-либо переноса гена к сетчатке, печени или скелетной мышце обработанных животных (как описано в примере 5). Фиг. 11 показывает сравнение утолщения стенки, достигаемого с переносом гена in vivo с использованием конструкций ангиогенных генов, FGF-4, FGF-5 и FGF-2LI +/- sp (т.е. FGF-2LI плюс или минус секреторный сигнальный пептид), как описано в примерах 6 и 7. Фиг. 12 показывает, что улучшенная функция в ишемическом районе после переноса гена FGF-4(как показано утолщением стенки) была связана с улучшенной регионарной перфузией. Фиг. 13 показывает сравнение перфузии (кровотока), получаемой от инъекции FGF-4, FGF-5 и FGF2LI +/- sp (= FGF-2LI плюс или минус секреторный сигнальный пептид), как описано в примерах 6 и 7. Фиг. 14 показывает сравнение утолщения стенки в результате переноса генов с FGF-2 плюс (FGF2LI +sp) или минус секреторный сигнальный пептид (FGF-2LI -sp), описанное в примере 7. Подробное описание предпочтительных вариантов Определения Заболевание сердца обозначает острые и/или хронические сердечные дисфункции. Заболевание сердца часто связано с уменьшением контрактильной (сократительной) функции сердца и может быть связано с наблюдаемым уменьшением кровотока к миокарду (например, в результате заболевания коронарной артерии). Манифестации заболевания сердца включают в себя миокардиальную ишемию (малокровие), которая может быть следствием стенокардии, сердечного приступа и/или застойной сердечной недостаточности. Миокардиальная ишемия является состоянием, в котором сердечная мышца не получает достаточных уровней кислорода и питательных веществ, что обычно обусловлено недостаточным кровоснабжением миокарда (например, в результате заболевания коронарной артерии). Сердечная недостаточность определяется клинически как состояние, в котором сердце не обеспечивает достаточного кровотока к телу для удовлетворения метаболических потребностей. Симптомы включают в себя одышку, усталость, слабость, опухание ног и непереносимость физической нагрузки. При физическом обследовании пациенты с сердечной недостаточностью имеют тенденцию к повышению частоты сердечных сокращений и частоты дыхания, хрипам (как признаку жидкости в легких), отеку, растяжимости яремных вен и, во многих случаях, увеличенному сердцу. Пациенты с тяжелой сердеч-7 008538 ной недостаточностью страдают от высокой смертности; обычно 50% пациентов умирают в пределах двух лет развития этого состояния. В некоторых случаях, сердечная недостаточность связана с тяжелым заболеванием коронарной артерии (ИБС, "CAD"), обычно приводя к инфаркту миокарда и либо к прогрессирующей хронической сердечной недостаточности, либо к острому состоянию с низким минутным сердечным выбросом, как описано здесь и в литературе в данной области. В других случаях сердечная недостаточность связана с дилатированной кардиомиопатией без ассоциированного тяжелого заболевания коронарных артерий. Заболевание периферических сосудов обозначает острую или хроническую дисфункцию периферической (т.е. не-сердечной) сосудистой сети и/или тканей, снабжаемых периферической сосудистой сетью. Как и в случае заболевания сердца, заболевание периферических сосудов обычно приводит к недостаточному кровотоку к тканям, снабжаемым кровью этой сосудистой сетью, причем эта недостаточность кровоснабжения может приводить, например, к ишемии или, в некоторых случаях, к гибели клеток ткани. Аспекты заболевания периферических сосудов включают в себя, без ограничения, артериосклеротическое окклюзионное заболевание периферических сосудов (PAOD) и ишемию периферических мышц. Часто симптомы заболевания периферических сосудов манифестируются в конечностях пациента, особенно в ногах. В применении здесь, термины имеющие терапевтическое действие и успешное лечение имеют по существу одно и то же значение. В частности, пациент, страдающий от заболевания сердца по существу успешно лечится в отношении этого состояния, если этот пациент обнаруживает наблюдаемое и/или измеряемое уменьшение или отсутствие одного или нескольких симптомов заболевания сердца после получения трансгена ангиогенного фактора в соответствии со способами данного изобретения. Уменьшение этих признаков или симптомов может также ощущаться пациентом. Так, показатели успешного лечения состояний заболевания сердца включают в себя демонстрацию или ощущение пациентом уменьшения любого из симптомов стенокардии (грудной жабы), усталости, слабости, одышки, опухания ног, хрипов, частоты сердечных сокращений или частоты дыхания, отека или растяжимости яремных вен. Пациент может также обнаруживать более высокую переносимость физической нагрузки, иметь меньшее сердце с улучшенной функцией желудочков и сердечной функцией и обычно нуждаться в меньшем числе посещений больницы по поводу состояния сердца. Улучшения в сердечно-сосудистой функции могут быть достаточными для удовлетворения метаболических потребностей пациента, и пациент может не обнаруживать симптомов при легком физическом напряжении или в состоянии покоя. Многие из этих признаков и симптомов можно легко наблюдать невооруженным глазом и/или они могут быть измерены рутинными процедурами, известными врачу. Признаки улучшенной сердечно-сосудистой функции включают в себя увеличенный кровоток и/или улучшенную контрактильную функцию в подвергнутых лечению тканях. Как описано ниже, кровоток в пациенте может быть измерен визуализацией с таллием (как описано Braunwald в Heart Disease, 4th ed., pp. 276-311 (Saunders, Philadelphia, 1992 или эхокардиографией (описанной в примерах 1 и 5 и в Sahn, DJ., et al., Circulation, 58:1072-1083, 1978). Кровоток до и после переноса ангиогенного гена может сравниваться с использованием этих способов. Улучшенная функция сердца ассоциируется с уменьшенными признаками и симптомами, как отмечалось выше. Кроме эхокардиографии, можно измерять фракцию выброса (левого желудочка, LV) ядерными(неинвазивными) способами, известными в данной области. Кровоток и контрактильная функция могут быть также измерены в периферических тканях, подвергнутых лечению в соответствии с данным изобретением. Ангиогенный белок или пептид обозначает любой белок или пептид, способный стимулировать ангиогенез или ангиогенную активность, т.е. развитие кровеносных сосудов. Полинуклеотид обозначает полимерную форму нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов, или их аналогов. Этот термин обозначает первичную структуру этой молекулы и, следовательно, включает в себя двухцепочечную и одноцепочечную ДНК, а также двухцепочечную и одноцепочечную РНК. Он включает в себя также модифицированные полинуклеотиды, например, метилированные и/или кэпированные полинуклеотиды."Рекомбинантный", в применении к полинуклеотиду, обозначает, что этот полинуклеотид является продуктом различных комбинаций стадий клонирования, рестрикции и/или лигирования и других процедур, которые приводят к конструкции, которая отличается от полинуклеотида, обнаруживаемого в природе."Ген" или "трансген" обозначает полинуклеотид или часть полинуклеотида, содержащие последовательность, которая кодирует белок. В большинстве ситуаций, желательно, чтобы ген также содержал промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью для эффективного промотирования транскрипции. Могут быть также включены энхансеры, репрессоры и другие регуляторные последовательности для модуляции активности гена, как хорошо известно в данной области (см., например,цитируемые ниже ссылки). Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Эти термины включают в себя также белки, которые являются посттрансляционно модифицированными посредством реакций, которые включают в себя гликозилирова-8 008538 ние, ацетилирование и фосфорилирование."Гетерологичный" компонент обозначает компонент, который вводят в отличающийся объект (организм) или который продуцируется в отличающемся объекте (организме), чем тот, в котором он природно локализован. Например, полинуклеотид, полученный из одного организма и введенный способами генной инженерии в отличающийся организм, является гетерологичным полинуклеотидом, который при экспрессии может кодировать гетерологичный полипептид. Подобным образом, промотор или энхансер,который выделен из его нативной кодирующей последовательности и функционально связан с отличающейся кодирующей последовательностью, является гетерологичным промотором или энхансером."Промотор", в применении здесь, обозначает полинуклеотидную последовательность, которая регулирует транскрипцию гена или кодирующей последовательности, с которыми он функционально связан. Большое число промоторов, в том числе конститутивных, индуцируемых и репрессируемых промоторов,из большого числа различных источников, хорошо известны в данной области (и идентифицированы в базах данных, например, в GenBank) и доступны в виде или внутри клонированных полинуклеотидных последовательностей (например, из таких депозитариев, как АТСС, а также других коммерческих или индивидуальных источников)."Энхансер", в применении здесь, обозначает полинуклеотидную последовательность, которая усиливает транскрипцию гена или кодирующей последовательности, с которыми он функционально связан. Большое число энхансеров, из большого числа различных источников хорошо известны в данной области (и идентифицированы в базах данных, например, в GenBank) и доступны в виде или внутри клонированных полинуклеотидных последовательностей (например, из таких депозитариев, как АТСС, а также других коммерческих или индивидуальных источников). Ряд полинуклеотидов, содержащих промоторные последовательности (например, общеизвестный промотор CMV), содержат также энхансерные последовательности. Функционально (оперативно) связанные обозначает непосредственное соседство двух или нескольких компонентов, где описанные таким образом компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать присущим им образом. Промотор является функционально связанным с геном или кодирующей последовательностью, если этот промотор регулирует транскрипцию этого гена или этой кодирующей последовательности. Хотя функционально связанный промотор обычно расположен против хода транскрипции (слева) от кодирующей последовательности, он необязательно является смежным с ней. Энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если этот энхансер усиливает транскрипцию кодирующей последовательности. Функционально связанные энхансеры могут быть расположены против хода транскрипции (слева) от кодирующих последовательностей, внутри или справа от кодирующих последовательностей. Последовательность полиаденилирования является функционально связанной с кодирующей последовательностью, если она расположена на правом конце (по ходу транскрипции) кодирующей последовательности, так что транскрипция проходит через кодирующую последовательность в последовательность полиаденилирования."Репликон" обозначает полинуклеотид, содержащий сайт начала репликации (ориджин), который делает возможной репликацию полинуклеотида в подходящей клетке-хозяине. Примеры включают в себя хромосомы клетки-мишени, в которые может быть интегрирована гетерологичная нуклеиновая кислота (например, ядерные и митохондриальные хромосомы), а также внехромосомные репликоны (например, реплицирующиеся плазмиды и эписомы)."Доставка гена", "перенос гена" и т.п., в применении здесь, относятся к введению экзогенного полинуклеотида (иногда называемого "трансгеном") в клетку-хозяина, независимо от способа, используемого для введения. Такие способы включают в себя большое разнообразие хорошо известных способов,таких как опосредованный вектором перенос гена (например, вирусная инфекция/трансфекция или различные комплексы доставки генов на основе белка или на основе липидов), а также способы, способствующие доставке "голых" полинуклеотидов (например, электропорация, доставка "генным ружьем" и различные другие способы, используемые для введения полинуклеотидов). Введенный полинуклеотид может быть стабильным или может быть временно сохраняемым в клетке-хозяине. Стабильное сохранение обычно требует, чтобы вводимый полинуклеотид либо содержал начало репликации, совместимое с клеткой-хозяина, либо интегрировался в репликон клетки-хозяина, например, внехромосомный репликон(например, плазмиду) или ядерную или митохондриальную хромосому. Известны ряд векторов, способных опосредовать перенос генов в клетки млекопитающих, как известно в данной области и описано здесь. Доставка генов "in vivo", перенос генов, генная терапия (генотерапия) и т.п., в применении здесь,обозначают введение вектора, содержащего экзогенный полинуклеотид, непосредственно в тело организма, например, человека или млекопитающих нечеловека, в результате чего этот экзогенный полинуклеотид вводится в клетку такого организма in vivo."Вектор" (иногда называемый "носителем" доставки гена или переноса гена) обозначает макромолекулу или комплекс молекул, содержащих полинуклеотид, подлежащий доставке в клетку-хозяина, invitro или in vivo. Подлежащий доставке полинуклеотид может содержать кодирующую последовательность, представляющую интерес в генотерапии."Кровеносный сосуд" обозначает любой из сосудов сосудистой системы млекопитающих, в том числе артерии, артериолы, капилляры, венулы, вены, синусы и сосуды сосудов. В предпочтительных аспектах данного изобретения для лечения заболевания сердца векторы, содержащие ангиогенные трансгены, вводят непосредственно в сосудистый канал, поставляющий кровь к миокарду, такие сосудистые каналы включают в себя коронарные (венечные) артерии, а также такие сосуды, как трансплантаты подкожных вен или трансплантаты внутренних артерий молочной железы."Артерия" обозначает кровеносный сосуд, через который кровь проходит из сердца. Коронарные артерии снабжают кровью ткани самого сердца, тогда как другие артерии снабжают кровью остальные органы тела. Обычная структура артерии состоит из просвета, окруженного многослойной артериальной стенкой."Обработка (лечение)" или "терапия", в применении здесь, относится к введению индивидуальному пациенту агентов, которые способны вызывать профилактическое, лечебное или другое благоприятное действие на данного индивидуума."Генотерапия", в применении здесь, обозначает введение индивидуальному пациенту векторов, содержащих терапевтические ген или гены."Терапевтический полинуклеотид" или "терапевтический ген" обозначает нуклеотидную последовательность, которая способна, при переносе в индивидуум, вызывать профилактическое, лечебное или другое благоприятное действие на данного индивидуума. Ссылки Практика данного изобретения будет применять, если нет иных указаний, общепринятые способы молекулярной биологии и т.п., которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие способы объясняются в литературе. См., например, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, (Sambrook eted., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney ed., IRL Press 1987); серия Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology (Lippincott, Williams and Wilkins publishers for the American Heart Association); серия Circulation (Lippincott, Williams and Wilkins publishers for the American Heart Association); и серия Circulation Research (Lippincott, Williams and Wilkins publishers for the American Heart Association). Дополнительные ссылки, описывающие доставку и хирургическое обеспечение, которые могут быть использованы в способах данного изобретения, включают в себя следующие ссылки: Topol, EJ (ed.),The Textbook of Interventional Cardiology, 2nd Ed. (W.B. Saunders Co. 1994); Rutherford, RB, Vascular Surgery, 3rd Ed. (W.B. Saunders Co. 1989); The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed. (W.B. 1992); и Sabiston, D,The Textbook of Surgery, 14th Ed. (W.B. 1991). Дополнительные ссылки, описывающие типы клеток, обнаруживаемые в кровеносных сосудах, и типы клеток сосудистой сети, которые могут быть использованы в способах данного изобретения, включают в себя следующую ссылку: W. Bloom and D. Fawcett, ATextbook of Histology (V.B. Saunders Co. 1975). Различные публикации сообщали об использовании переноса генов для предупреждения заболевания, в том числе заболевания сердца. См., например, Methods in Virology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (ed.), Weiss, Clifton, N.J., 1991; Mazur et al., Molecular and Cellular Biology,21:104-111, 1994; French, Herz 18:222-229, 1993; Williams, Journal of Medical Sciences 306:129-136, 1993; иSchneider, Circulation 88:1937-1942, 1993. Ссылки, цитированные в описанном выше разделе, включены тем самым в качестве ссылок здесь в той степени, в которой эти ссылки описывают способы, которые используются в применении на практике данного изобретения.- 10008538 Включение в качестве ссылки Все документы, цитируемые в данной заявке, в том числе патенты, патентные заявки и другие публикации, включены тем самым в качестве ссылки. Подробное описание различных предпочтительных вариантов Различные предпочтительные аспекты данного изобретения суммируются ниже и дополнительно описываются и иллюстрируются в последующих подробных описаниях и фигурах. Данное изобретение относится к способам и композициям для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе миокардиальной ишемии, сердечной недостаточности и заболевания периферических сосудов. В способе для лечения сердечной недостаточности векторную конструкцию, содержащую ген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, нацеливают на сердце пациента, в результате чего этот экзогенный ангиогенный белок экспрессируется в миокарде, облегчая таким образом сердечную дисфункцию посредством улучшения кровотока и/или улучшения контрактильной функции сердца. Улучшенная функция сердца в конечном счете приводит к уменьшению или исчезновению одного или нескольких симптомов заболевания сердца или сердечной недостаточности и продлевает жизнь за пределы ожидаемой смерти. Подобным образом, в лечении заболевания периферических сосудов в соответствии с данным изобретением векторную конструкцию, содержащую трансген, кодирующий по меньшей мере один ангиогенный белок или пептид, нацеливают на пораженную ткань, например, ишемическую скелетную мышцу, в результате чего синтез экзогенного ангиогенного белка облегчает или излечивает симптомы заболевания периферических сосудов, например, посредством увеличения кровотока к пораженному (например, ишемическому) участку ткани, и/или в мышце, посредством улучшения контрактильной функции пораженной мышцы. Таким образом, в предпочтительном аспекте, данное изобретение обеспечивает способ лечения заболевания сердца пациента, имеющего миокардиальную ишемию, предусматривающий доставку вектора с встроенным трансгеном к миокарду пациента интракоронарной инъекцией, предпочтительно инъекцией вектора непосредственно в одну или обе коронарные артерии (или трансплантаты), посредством чего трансген экспрессируется и кровоток и/или контрактильная функция улучшаются. В качестве иллюстрации, при использовании вектора, содержащего трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид,такой как, например, FGF-5, FGF-4, aFGF, bFGF и/или VEGF, причем этот вектор доставляется к сердцу,где этот белок или пептид продуцируется до терапевтически значимой степени в миокарде непрерывно в течение продолжительных периодов времени, ангиогенез может быть стимулирован в пораженном участке (районе) миокарда. Другие трансгены, такие как трансгены, кодирующие белки бетаадренергической передачи сигнала или другие усиливающие сердце или сердечную мышцу белки, могут быть также использованы, как описано ниже, в сочетании с использованием ангиогенного трансгена. Векторами, используемыми в данном изобретении, могут быть плазмида или предпочтительно вирусный вектор, например, дефектный по репликации аденовирус или аденоассоциированный вирус (AAV). Инъекцией исходного раствора вирусного вектора, например, раствора, который содержит относительно небольшое количество вируса дикого типа или вообще не содержит вирус дикого типа, глубоко в просвет одной или обеих коронарных артерий (или трансплантатов), предпочтительно как в правую, так и в левую коронарные аретрии (или трансплантаты), и предпочтительно в количестве 107-1013 вирусных частиц, как определено оптической денситометрией, (более предпочтительно 109-1011 вирусных частиц),можно локально трансфицировать желаемое число клеток в пораженном миокарде кодирующими ангиогенный белок или пептид генами, максимизируя тем самым терапевтическую эффективность переноса гена и минимизируя нежелательный ангиогенез в экстракардиальных районах (районах вне сердца) и возможность воспалительной реакции на вирусные белки. В другом предпочтительном аспекте, данное изобретение может быть также использовано для лечения пациента, страдающего от застойной сердечной недостаточности, доставкой вектора с встроенным трансгеном к сердцу указанного пациента, причем этот вектор содержит трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, посредством чего этот трансген экспрессируется в миокарде, приводя к увеличенному кровотоку и увеличенной функции в сердце. Среди таких пациентов, страдающих от застойной сердечной недостаточности, находятся пациенты, обнаруживающие дилатированную кардиомиопатию, и пациенты, которые проявляют тяжелые инфаркты миокарда, обычно связанные с тяжелым или окклюзионным заболеванием коронарных артерий. Вектор предпочтительно вводят в кровеносный сосуд, подающий кровь к миокарду сердца, так чтобы доставить вектор к миокарду. Предпочтительно вектор вводят в просвет коронарной артерии, трансплантат подкожной вены или трансплантат внутренней артерии молочной железы; наиболее предпочтительно вектор вводят в просвет как левой, так и правой коронарной артерии. Интракоронарную инъекцию предпочтительно производят в виде единственной инъекции,относительно глубоко в каждую выбранную артерию (артерии), (например, предпочтительно по меньшей мере на 1 см в просвет этого сосуда (сосудов. Способы данного изобретения применимы также для предупреждения или ослабления вредного желудочкового ремоделирования в пациенте, который страдает (или может страдать) от инфаркта мио- 11008538 карда. Опять вектор, содержащий трансген, кодирующий ангиогенный белок или пептид, предпочтительно функционально связанный с промотором для экспрессии этого гена, доставляют к сердцу пациента, где этот трансген экспрессируется и вредное желудочковое ремоделирование ослабляется. Трансгены, кодирующие ангиогенные белки и пептиды В данном изобретении могут использоваться один или несколько трансгенов, кодирующих ангиогенный белковый или пептидный фактор, который может усиливать кровоток и/или контрактильную функцию. Любой белок или пептид, проявляющий ангиогенную активность, измеримую способами, описанными здесь и в данной области, может потенциально использоваться в связи с данным изобретением. Ряд таких ангиогенных белков являются известными в данной области и новые формы идентифицируются рутинно. Примерами подходящих ангиогенных белков или пептидов являются члены семейства фибробластных факторов роста (FGF), васкулярные эндотелиальные факторы роста (VEGF), тромбоцитарные факторы роста (PDGF), инсулиноподобные факторы роста (IGF) и другие. Члены семейства FGF включают в себя, но не ограничиваются ими, aFGF (FGF-1), bFGF (FGF-2), FGF-4 (также известный как"hst/KS3"), FGF-5, FGF-6. Было показано, что VEGF экспрессируется миоцитами сердца в ответ на ишемию in vitro и in vivo; он является регулятором ангиогенеза при физиологических условиях, а также во время адаптивной реакции к патологическим состояниям (Banai et al. Circulation 89:2183-2189, 1994). Семейство VEGF включает в себя, но не ограничивается ими, члены подсемейства VEGF-A (например,VEGF-121, VEGF-145, VEGF-165, VEGF-189 и VEGF-206), а также члены подсемейства VEGF-B (например, VEGF-167 и VEGF-186) и подсемейства VEGF-C. PDGF включает в себя, например, PDGF А иPDGF В, a IGF включает в себя, например, IGF-1. Другие ангиогенные белки и пептиды известны в данной области и регулярно идентифицируются новые. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих эти и другие белки, и соответствующие аминокислотные последовательности также известны в данной области (см., например, базу данных последовательностей GenBank). Ангиогенные белки и пептиды включают в себя предшественники пептидов, которые посттрансляционно процессируются в активные пептиды, и "производные" и "функциональные эквиваленты" ангиогенных белков и пептидов. Производные ангиогенного белка или пептида являются пептидами, имеющими сходную аминокислотную последовательность и сохраняющими, до некоторой степени, одну или несколько активностей родственного ангиогенного белка или пептида. Как хорошо известно специалистам с квалификацией в данной области, применимые производные обычно имеют значительное сходство последовательностей (на уровне аминокислот) в районах или доменах белка, связанных с ангиогенной активностью. Подобным образом, специалистам в данной области будет вполне понятно, что под "функциональным эквивалентом" подразумевается белок или пептид, который имеет активность, которая может заменять одну или несколько активностей конкретного ангиогенного белка или пептида. Предпочтительные функциональные эквиваленты сохраняют все активности конкретного ангиогенного белка или пептида; однако функциональный эквивалент может иметь активность, которая, при количественном измерении, является более сильной или более слабой, чем активность пептида или белка дикого типа. В отношении подробностей, касающихся семейства FGF, см., например, Burgess, Ann. N.Y. Acad.Ther. 6: 1457-1465, 1995; Zhan et al., Mol. Cell. Biol., 8: 3487, 1988; Seddon et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 638: 98-108, 1991. В отношении hst/KS3 человека (т.е. FGF-4), см. Taira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2980-2984, 1087. В отношении белка VEGF-A человека, см., например, Tischer et al. J. Biol. Chem. 206: 11947-11954, 1991, и ссылки в ней; Muhlhauser et al., Circ. Res. 77: 1077-1086, 1995; и Neufeld et al., WO 98/10071 (12 March 1998). Другие варианты известных ангиогенных белков также были описаны; например, варианты белков VEGF и белков, родственных VEGF, см., например, Baird et al., WO 99/40197, (12August 1999); и Bohlen et al., WO 98/493300, (5 November 1998). Комбинации ангиогенных белков и векторы доставки генов, кодирующие такие комбинации, описаны в Gao et al. USSN 09/607766, filed 30 June 2000, озаглавленном "Dual Recombinant Gene Therapy Compositions and Methods of Use", включенном тем самым ссылкой в полном виде. Как также понятно специалистам в данной области, ангиогенные белки могут стимулировать ангиогенез усилением экспрессии, стабильности или функциональности других ангиогенных белков. Примеры таких ангиогенных белков и пептидов включают в себя, например, регуляторные факторы, которые индуцируют реакцию на гипоксию (например, индуцируемые гипоксией факторы, такие как Hif-1, Hif-2 и т.п.; см., например, Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(9): 4304-8,1993; Forsythe et al., Mol. Cell. Biol. 16(9): 4604-13, 1996; Semenza et al., Kidney Int., 51(2): 553-5, 1997; иO'Rourke et al., Oncol. Res., 9(6-7): 327-32, 1997; a также другие регуляторные факторы, такие как, например, факторы, которые индуцируются физиологическими состояниями, связанными с сердечнососудистым заболеванием, такими как воспаление (например, индуцируемая синтаза оксида азота(iNOS), a также ее конститутивная копия, cNOS; см., например, Yoshizumi et al., Circ. Res., 73(1): 205-9,1993; Chartrain et al., J. Biol. Chem., 269(9): 6765-72, 1994; Papapetropoulos et al., Am. J. Pathol., 150(5): 1835-44, 1997; и Palmer, et al., Am. J. Physiol., 274(2 Pt 1): L212-9, 1998). Дополнительные примеры таких ангиогенных белков включают в себя некоторые инсулиноподобные факторы роста (например, IGF-1) и ангиопоэтины (Ang), которые, как сообщалось, промотируют и/или стимулируют экспрессию и/или активность других ангиогенных белков, таких как VEGF (см., например, Goad, et al., Endocrinology, 137(6):- 12008538 2262-68 (1996); Warren, et al., J. Biol. Chem., 271(46):29483-88 (1996); Pungia, et al., Diabetes 46(10): 161926 (1997); и Asahara, et al., Circ. Res., 83(3):233-40 (1998) и Bermont et al., Int. J. Cancer 85: 117-123, 2000). Подобным образом фактор роста гепатоцитов (также называемый фактором Скеттера), который, как сообщалось, индуцировал образование кровеносных сосудов in vivo (см., например, Grant et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90: 1937-1941, 1993), увеличивал, как сообщалось, экспрессию VEGF (см., например, Wojta et al., Lab. Invest. 79:427-438, 1999). Дополнительные примеры ангиогенных полипептидов включают в себя природные и синтетические регуляторные пептиды (ангиогенные полипептидные регуляторы), которые действуют в качестве промоторов эндогенных ангиогенных генов. Нативные ангиогенные полипептидные регуляторы могут быть получены из индукторов эндогенных ангиогенных генов. Hif, описанный выше, является одним из иллюстративных примеров такого ангиогенного гена, который, как сообщалось, промотировал ангиогенез индукцией экспрессии других ангиогенных генов. Синтетические ангиогенные полипептидные регуляторы могут быть сконструированы, например, получением белков, связывающих множественные белки цинковые пальцы, которые специфически связываются с последовательностями, находящимися слева от кодирующих районов эндогенных ангиогенных генов, и которые могут быть использованы для индукции экспрессии таких эндогенных генов. Исследования многочисленных генов привело к разработке "правил" для конструирования таких связывающихся с ДНК белков,содержащих "цинковые пальцы" (см., например, Rhodes and Klug, Scientific American, February 1993, pp 56-65; Choo and Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(23): 11163-7, 1994; Rebar and Pabo, Science,263(5147): 671-3, 1994; Choo et al., J. Mol. Biol., 273(3): 525-32, 1997; Pomeranz et al., Science 267: 93-96,1995; и Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 5525-5530, 1997. Как будет понятно специалисту с квалификацией в данной области, многочисленные дополнительные гены, кодирующие белки и пептиды, обладающие способностью прямо или косвенно промотировать ангиогенез, регулярно идентифицируются,и новые гены будут идентифицированы на основании сходства с известными кодирующими ангиогенный белок или пептид генами или с обнаруживаемой способностью таких генов кодировать белки или пептиды, которые промотируют ангиогенез. Информацию о последовательности для таких генов и кодируемых полипептидов легко получить из баз данных последовательностей, таких как GenBank илиEMBL. Полинуклеотиды, кодирующие такие белки, могут быть также получены из библиотек генов, например, с использованием способов ПЦР или гибридизации, являющихся рутинными в данной области. Предпочтительно, кодирующий ангиогенный белок трансген функционально связан с промотором,который регулирует транскрипцию и экспрессию этого гена в клетке млекопитающего, такой как клетка в сердце или в скелетной мышце. Одним предпочтительным в настоящее время промотором является промотор CMV. В другом предпочтительном варианте, обсуждаемом дополнительно ниже, этим промотором является тканеспецифический промотор, такой как специфический для сердца промотор (например, специфический для кардиомиоцитов промотор). Предпочтительно ген, кодирующий ангиогенный фактор, также функционально связан с сигналом полиаденилирования. Успех подхода с использованием переноса генов требует как синтеза продукта гена, так и секреции из трансфицированной клетки. Таким образом, ангиогенные белки и пептиды включают в себя белки и пептиды, которые природно секретируются или были модифицированы таким образом, чтобы сделать возможной секрецию, например, посредством функционального связывания с сигнальным пептидом. С этой точки зрения, ген, кодирующий секретируемый ангиогенный белок, например, FGF-4, FGF-5 илиFGF-6, является предпочтительным, так как эти белки содержат функциональные секреторные сигнальные последовательности и легко секретируются из клеток. Многие, если не все, белки VEGF человека (в том числе, но не только, VEGF-121 и VEGF-165) также легко секретируются и являются диффундируемыми после секреции. Таким образом, при экспрессии эти ангиогенные белки легко достигают сердечного интерстиция и индуцируют ангиогенез. Кровеносные сосуды, которые развиваются в ангиогенезе,включают в себя капилляры, которые являются кровеносными сосудами самого малого калибра, имеющими диаметр около 8 мкм, и кровеносные сосуды более крупного калибра, которые имеют диаметр по меньшей мере около 10 мкм. Ангиогенная активность может быть определена измерением кровотока,увеличения функции обработанной ткани или присутствием кровеносных сосудов, с использованием процедур, известных в данной области или описанных здесь. Например, число или плотность капилляров могут быть определены количественно в животном визуально или микроскопическим анализом участка ткани (см. пример 5). В случае других ангиогенных белков, таких как aFGF (FGF-1) и bFGF (FGF-2), которые не имеют природной секреторной сигнальной последовательности, слитые белки, имеющие секреторные сигнальные последовательности, могут быть рекомбинантно получены с использованием стандартной методологии рекомбинантных ДНК, известной специалисту в данной области. Считается, что как aFGF, так иbFGF секретируются природно до некоторой степени; однако включение дополнительной сигнальной последовательности секреции может быть использовано для усиления секреции этого белка. Секреторная сигнальная последовательность обычно расположена при N-конце желаемого белка, но может быть помещена в любом положении, подходящем для обеспечения секреции ангиогенного фактора. Например,полинуклеотид, содержащий подходящую сигнальную последовательность, может быть слит 5' (слева) относительно первого кодона выбранного гена ангиогенного белка. Подходящие секреторные сигналь- 13008538 ные последовательности включают в себя сигнальные последовательности генов FGF-4, FGF-5, FGF-6 или сигнальную последовательность отличающегося секретируемого белка, например, IL-1-бета. Пример 7 ниже приводит пример одного типа модификации ангиогенного белка для присоединения сигнальной последовательности из другого белка, модификации, достигаемой заменой остатков в ангиогенном белке остатками, которые управляют секрецией этого секретируемого второго белка. Можно использовать сигнальную последовательность, полученную из белка, который обычно секретируется из сердечных миоцитов. Ангиогенные гены могут также обеспечивать дополнительные функции, которые могут улучшать,например, функцию клеток сердца. Например, FGF может обеспечивать усиливающие сердце и/или "защищающие от ишемии действия", которые могут быть независимыми от их способности стимулировать ангиогенез. Таким образом, ангиогенные гены могут быть использованы для усиления функции сердца посредством механизмов, которые являются дополнительными или заменяют стимуляцию ангиогенезаper se. В качестве дополнительного примера, IGF, который может промотировать ангиогенез, может также усиливать функцию мышечных клеток (см., например, Musaro et al., Nature 400: 581-585, 1999); а также проявлять антиапоптотические эффекты (см., например, Lee et al. Endocrinology 140: 4831-4840, 1999). Другие белки, которые усиливают функцию клеток мышц, могут также применяться в соответствии со способами данного изобретения. Как отмечалось выше, гены, кодирующие один или несколько ангиогенных белков или пептидов,могут быть использованы в сочетании с данным изобретением. Таким образом, ген или гены, кодирующие комбинацию ангиогенных белков или пептидов, могут доставляться с использованием одного или нескольких векторов в соответствии со способами, описанными здесь. Семейства ангиогенных генов,описанных здесь и в литературе в данной области, содержат многочисленные примеры таких генов. Предпочтительно, при использовании такой комбинации, гены могут быть получены из различных семейств ангиогенных факторов (например, комбинации, выбранной из двух или нескольких различных членов группы, состоящей из FGF, VEGF, PDGF и IGF). Для отдельной иллюстрации такой комбинации можно использовать вектор, содержащий ген FGF и ген VEGF. В качестве иллюстративного примера,авторы использовали комбинацию гена FGF (FGF-4-фрагмента 140) (см., например, ген FGF-4 и его варианты, описанные Basilico et al., в патенте США с номером 5459250, выданном 17 октября 1995 г., и родственные случаи), и вариант гена VEGF (мутеина 2 VEGF-145) (см., например, ген VEGF-145 и его варианты, описанные Neufeld et al., WO 98/10071, опубликованный 12 марта 1998 г., и родственные случаи). Такие комбинации могут проявлять аддитивные и/или синергические действия. Многочисленные другие комбинации будут очевидными для специалистов с квалификацией в данной области, на основании этих описаний. Векторы, содержащие ангиогенные гены или комбинации ангиогенных генов, в соответствии с данным изобретением, могут также включать в себя один или несколько других генов, которые могут быть использованы для дополнительного усиления кровотока ткани и/или контрактильной функции. В сердце, например, гены, кодирующие бета-ASP (описанные Hammond et al., в ожидающих одновременного рассмотрения заявках WO 98/10085, опубликованных 12 марта 1998 г.), могут использоваться в комбинации с одним или несколькими генами, кодирующими ангиогенные белки или пептиды. Другие усиливающие сердечные или мышечные клетки белки могут быть подобным образом включены в композиции и способы данного изобретения. Комбинации генов, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, могут быть обеспечены в едином векторе (например, в виде отдельных генов, каждый из которых находится под контролем промотора, или в виде единого транскрипционно или трансляционно слитого гена). Комбинации генов могут быть также обеспечены в виде комбинации векторов (которые могут быть произведены из одного и того же или различных векторов, такой как комбинация аденовирусных векторов или комбинация аденовирусного вектора и аденоассоциированного (AAV) вектора); которые могут вводиться пациенту одновременно или последовательно. В случае аденовируса (Ad) и аденоассоциированного вируса (AAV), присутствие Ad, который обычно является хелперным вирусом для AAV, может усиливать способность AAV опосредовать перенос гена. Таким образом, Ad-вектор может быть введен одновременно с введением AAV-вектора или перед введением AAV-вектора, в соответствии с данным изобретением. Кроме эффективности трансфекции на выбор вектора влияет также желаемая продолжительность экспрессии трансгена. В качестве иллюстрации, поскольку многие ангиогенные гены могут вызывать долгосрочные эффекты без необходимости долгосрочной экспрессии (например, инициированием или облегчением процесса ангиогенеза, который приводит к увеличению васкуляризации ткани),ангиогенные гены могут вводиться с использованием аденовируса (или иного вектора, который обычно не интегрируется в ДНК хозяина), который может использоваться перед введением AAV-вектора, или в комбинации с введением AAV-вектора, несущего трансген, для которого желательной является более долгосрочная экспрессия (например, трансген бета-ASP). Другие комбинации трансгенов и/или векторов будут очевидными специалистам в данной области на основании объяснений и иллюстраций данного изобретения. Для лечения людей гены, кодирующие ангиогенные белки человеческого происхождения, являются предпочтительными, хотя могут также использоваться ангиогенные белки, происходящие из других млекопитающих, которые проявляет перекрестную межвидовую активность, т.е. имеют ангиогенную актив- 14008538 ность в людях. Векторы для доставки генов in vivo Обычно представляющий интерес ген переносят к сердцу или к периферической сосудистой сети invivo и он управляет продуцированием кодируемого белка. Предпочтительно такое продуцирование является конститутивным (хотя могут использоваться также индуцируемые системы экспрессии). Векторы, применимые в данном изобретении, включают в себя вирусные векторы, векторы на основе липидов (например, липосомы) и другие векторы, которые способны доставлять ДНК к неделящимся клеткам in vivo. Предпочтительными в настоящее время являются вирусные векторы, в частности,дефектные по репликации вирусные векторы, в том числе, например, дефектные по репликации аденовирусные векторы и аденоассоциированные вирусные векторы. В отношении легкости получения и применения в данном изобретении, дефектные по репликации аденовирусные векторы являются в настоящее время наиболее предпочтительными. Аденовирус эффективно инфицирует неделящиеся клетки и, следовательно, применим для экспрессии рекомбинантных генов в миокарде, вследствие нерепликативной природы сердечных миоцитов. Различные другие векторы, пригодные для генотерапии in vivo, могут легко применяться для доставки трансгенов ангиогенных белков для использования в данном изобретении. Такие другие векторы включают в себя другие вирусные векторы (такие как AAV), невирусные платформы доставки, а также векторы на основе липидов (такие как липосомы, мицеллы, липидсодержащие эмульсии и другие, которые были описаны в данной области). Что касается AAV-векторов, как известно в данной области, они являются предпочтительно дефектными по репликации в людях, такие как, например, AAV-векторы,имеющие удаленные гены rep и cap (последовательность которых должна, следовательно, поставлятьсяin trans для репликации и упаковки AAV-векторов, обычно в пакующей клеточной линии), и инсертированный трансген (включающий в себя, например, промотор, функционально связанный с ним) предпочтительно фланкирован инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV. Рекомбинантные вирусные векторы содержат один или несколько генов или последовательностей. Поскольку многие вирусные векторы проявляют связанные с размерами ограничения в связи с упаковкой и поскольку дефектные по репликации вирусные векторы являются обычно предпочтительными для доставки in vivo, гетерологичные гены или последовательности обычно вводят путем замены одной или нескольких частей вирусного генома. Такие вирусы могут становиться дефектными по репликации вследствие делеций, что требует того, чтобы делетированная функция (функции) обеспечивались in trans во время репликации вируса и инкапсидации (с использованием, например, хелперного вируса или пакующей клеточной линии, несущей гены, необходимые для репликации и/или инкапсидации) (см., например,ссылки и иллюстрации ниже). Как утверждалось выше, модифицированные AAV-векторы, в которых трансгены вставляют вместо вирусных генов rep и cap, также хорошо известны в данной области. Подобным образом, модифицированные вирусные векторы, в которых доставляемый полинуклеотид расположен снаружи вирусной частицы, также были описаны (см., например, Curiel, DT, et al. PNAS 88:88508854, 1991). Ссылки, описывающие эти и другие векторы доставки генов, известны в данной области, и ряд из них цитируются здесь. Как описано выше и в цитируемых ссылках, векторы могут также содержать другие компоненты или функциональные группы, которые дополнительно модулируют доставку гена и/или экспрессию гена,или которые иным образом обеспечивают выгодные свойства клеткам-мишеням. Такие другие компоненты включают в себя, например, компоненты, которые влияют на связывание или на нацеливание на клетки (в том числе компоненты, которые опосредуют тип клеток или тканеспецифическое связывание); компоненты, которые влияют на поглощение вектора клеткой; компоненты, которые влияют на процессинг и/или локализацию вектора и его нуклеиновой кислоты в клетке после поглощения (такие как агенты, опосредующие внутриклеточный процессинг и/или ядерную локализацию); и компоненты, которые влияют на экспрессию полинуклеотида. Такие компоненты могут также включать в себя маркеры, например, детектируемые и/или селектируемые маркеры, которые могут быть использованы для детектирования или отбора клеток, которые поглотили и экспрессируют нуклеиновую кислоту, доставляемую данным вектором. Такие компоненты могут быть обеспечены в виде природного признака вектора (например, путем применения определенных вирусных векторов, которые имеют компоненты или функциональности, опосредующие связывание и поглощение), или векторы могут быть модифицированы для обеспечения таких функциональностей. Детектируемый маркерный ген позволяет специфически детектировать клетки, несущие ген, подлежащий специфическому детектированию (например, делает возможным отличение от клеток, которые не несут маркерный ген). Одним примером такого детектируемого маркерного гена является ген lacZ, кодирующий бета-галактозидазу, который позволяет детектировать клетки, трансдуцированные вектором, несущим ген lacZ, с использованием окрашивания, как описано ниже. Селектируемые маркеры могут быть позитивными, негативными или бифункциональными. Позитивные селектируемые маркеры делают возможным отбор на клетки, несущие маркер, тогда как негативные селектируемые маркеры позволяют селективно элиминировать клетки, несущие маркер. Было описано большое разнообразие таких маркерных генов, в том числе бифункциональные маркеры (т.е. позитивные/негативные) (см., например, Lupton, S., WO 92/08796, published 29 May 1992; и Lupton, S.,- 15008538WO 94/28143, published 8 December 1994). Такие маркерные гены могут обеспечивать дополнительную меру контроля, которая может быть выгодной в контекстах генотерапии. Большое разнообразие таких векторов известно в данной области, и они обычно являются доступными (см., например, различные цитированные выше ссылки). Работы, описывающие аденовирусные векторы и другие вирусные векторы, которые могут быть использованы в способах данного изобретения, включают в себя следующие ссылки: Hurwitz, M.S., Adenoviridae and Their Replication, in Fields, В., et al., (eds.) Virology, Vol. 2, Raven Press New York, pp. 16791721, 1990); Graham, F., et al., pp. 109-128 in Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (ed.), Humana Press, Clifton, N.J. (1991); Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995; Schreier, H, Pharmaceutica Acta Helvetiae 68: 145-159, 1994; Schneider and French, Circulation 88:1937-1942, 1993; Curiel D.T., et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992; Graham, F.L., et al., WO 95/00655 (5 January 1995); Falck-Pedersen, E.S., WO 95/16772 (22 June 1995); Denefle, P. et al., WO 95/23867 (8 September 1995); Haddada, H. et al., WO 94/26914 (24 November 1994); Perricaudet, M. et al.,WO 95/02697 (26 January 1995); Zhang, W., et al., WO 95/25071 (12 October 1995). Различные аденовирусные плазмиды также доступны из коммерческих источников, в том числе, например, Microbix Biosystemsof Toronto, Ontario (см., например, Microbix Product Information Sheet: Plasmids for Adenovirus Vector Construction, 1996). Различные дополнительные аденовирусные векторы и способы для их получения и очистки регулярно идентифицируются. Дополнительные ссылки, описывающие AAV-векторы, которые могли бы использоваться в способах данного изобретения, включают в себя следующие: Carter, В., Handbook of Parvoviruses, vol. 1, pp. 169-228, 1990; Berns, Virology, pp. 1743-1764 (Raven Press 1990); Carter, В., Curr. Opin. Biotechnol., 3: 533539, 1992; Muzyczka, N., Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 92-129; Flotte, T.R., et al.,Am. JH. Respir. Cell Mol. Biol. 7: 349-356, 1992; Chatterjee et al., Ann. NY Acad. Sci., 770: 79-90, 1995;June 1996); и Du et al., Gene Therapie 3: 254261, 1996. Различные дополнительные AAV-векторы и способы для их получения и очистки регулярно идентифицируются. Как описано выше и в научной литературе, ряд произведенных из ретровируса систем также были разработаны для применения в доставке генов in vivo. В качестве иллюстрации род лентивирус ретровирусов (например, вирус иммунодефицита человека, вирус иммунодефицита кошачьих и т.п.) может быть модифицирован таким образом, что эти вирусы способны трансдуцировать клетки, которые обычно являются неделящимися (см., например, Poeschla et al., PNAS 96:11395-11399, 1996; Naldini et al., PNAS 96:11382-11388, 1996; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996; Srinivasakumar et al., J. Virol. 71:5841-5848,1997; Zufferey et al., Nat. Biotechnol. 15: 871-875, 1997; Kim et al., J. Virol. 72: 811-816, 1998; Miyoshi et al.,J. Virol. 72:8150-8157, 1998; см. также Buchschacher et al., Blood 15:2499-2504, 2000; см. также The SalkInstitute, WO97/12622 (10 April 1997. Хотя лентивирусные векторные системы на основе ВИЧ заставили в некоторой степени сфокусировать внимание в этом отношении, недавно были разработаны другие лентивирусные системы, такие как лентивирусные векторные системы на основе вируса иммунодефицита кошачьих, которые предоставляют потенциальные преимущества над системами на основе ВИЧ (см.,например, Poeschla et al., Nat. Med. 4:354-357, 1998; Johnston et al., J. Virol. 73: 2491-2498, 1999; и Johnstonet al., J. Virol. 73: 4991-5000, 1999; см. также обзор Romano et al., Stem Cells 18:19-39, 2000 и рассматриваемые в нем ссылки). Кроме вирусных векторов, известны также и продолжают разрабатываться невирусные векторы,которые могут быть использованы в качестве средств доставки генов. Например, в данной области были описаны не-вирусные носители (платформы) доставки на основе белка, например, макромолекулярные комплексы, содержащие ДНК-связывающий белок и носитель или часть молекулы, способные опосредовать доставку генов, а также векторы на основе липидов (например, липосомы, мицеллы, липидсодержащие эмульсии и другие). Ссылки, описывающие не-вирусные векторы, которые могли бы быть использованы в способах данного изобретения, включают в себя следующие: Ledley, FD, Human Gene(29 June 1995); Lin et al., WO 96/01840 (25 January 1996). Были идентифицированы многочисленные дополнительные опосредованные липидами векторы доставки генов in vivo и кофакторы векторной доставки (см., например, Kollen et al., Hum. Gene Ther. 10:615-22, 1999; Roy et al., Nat. Med. 5:387-391; Fajac etal., Hum. Gene Ther. 10:395-406, 1999; Ochiya et al., Nat. Med. 5:707-710, 1999). Дополнительно была опи- 16008538 сана разработка систем, которые комбинируют компоненты вирусных и невирусных систем доставки генов и могут быть использованы здесь (см., например, Philip et al., Mol. Cell Biol., 14: 2411-2418, 1994; см. также Di Nicola et al., Hum. Gene Ther. 10:1875-1884, 1999). Различные дополнительные не-вирусные векторы доставки генов и способы для их получения и очистки регулярно идентифицируются. Как описано выше, эффективность доставки генов с использованием вектора, такого как вирусный вектор, может увеличиваться доставкой этого вектора в кровеносный сосуд, такой как артерия, или в ткань, которую пре-инфузируют и/или ко-инфузируют вазоактивным агентом, например, гистамином или агонистом гистамина, или белком васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), как описано здесь и дополнительно иллюстрируется в находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявке РСТ WO 99/40945, опубликованной 19 августа 1999 г. Другим примером вазоактивного агента, который может быть использован для увеличения эффективности доставки гена, является донор оксида азота, такой как нитропруссид натрия. Наиболее предпочтительно, вазоактивный агент инфузируют в кровеносный сосуд или ткань одновременно с введением вектора и/или за несколько минут перед введением вектора. Вазоактивный агент, в применении здесь, обозначает природное или синтетическое вещество, которое индуцирует увеличенную проницаемость сосудов и/или усиливает перенос макромолекул, таких как векторы доставки генов, из кровеносных сосудов, например, через эндотелий капилляров. Посредством увеличения проницаемости для макромолекул или иным образом облегчения переноса макромолекул в капиллярное ложе, перфузируемое артерией, вазоактивные агенты могут усиливать доставку этих векторов к районам-мишеням и, следовательно, усиливать общую экспрессию трансгена в тканимишени. Авторы данного изобретения использовали гистамин в качестве вазоактивного агента, и было обнаружено, что он существенно усиливает доставку вектора к инфузируемому району, такому как миокард. Производные и агонисты гистамина, такие, которые взаимодействуют с рецепторами гистамина Н,которые могут быть использованы, включают в себя, например, 2-метилгистамин, 2-пиридилэтиламин,бетагистин и 2-тиазолилэтиламин. Эти и другие агонисты гистамина описаны, например, в Garrison JC,Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (8th Ed: Gilman A.G., Rail T.W., Nies A.S.,Taylor P., eds) Pergamon Press, 1990, pp 575-582 и других фармакологических научных трудах. Кроме гистамина и агонистов гистамина, которые могут быть использованы в качестве вазоактивных агентов, васкулярные эндотелиальные факторы роста (VEGF) и агонисты VEGF (как описано здесь и в цитируемых ссылках) могут также индуцировать увеличенную проницаемость сосудов и, следовательно, могут быть использованы в качестве вазоактивного агента для усиления доставки генов в контексте описанных здесь композиций и способов. Как и в случае гистамина, VEGF предпочтительно инфузируют в кровеносный сосуд, снабжающий кровью участок-мишень, на протяжении нескольких минут перед инфузией вектора. Доноры оксида азота, такие как нитропруссид натрия (SNP), могут также использоваться в качестве вазоактивных агентов. Предпочтительно, донор оксида азота (например, SNP) преинфузируют в участокмишень (или в кровеносный сосуд, снабжающий ткань-мишень) за несколько минут перед моментом инфузии векторной композиции и продолжают инфузировать до момента инфузии векторной композици. Введение может также продолжаться во время инфузии векторной композиции. Приводимый в качестве примера аденовирусный вектор, который является независимым от хелпера и дефектным по репликации в человеке Обычно представляющий интерес ген переносится в сердце или в периферическую сосудистую сеть, in vivo, и регулирует продуцирование кодируемого белка. Возможны несколько различных подходов к переносу генов. В настоящее время предпочтительной является хелпер-независимая репликационно-дефектная система на основе аденовируса 5 человека (Ad5). С использованием единственной интракоронарной инъекции (инъекции в коронарные сосуды) такой системы на основе рекомбинантного Ad5 авторы данного изобретения показали значительную трансфекцию миокардиальных клеток in vivo(Giordano and Hammond, Clin. Res., 42:123A, 1994). Нерепликативные рекомбинантные аденовирусные векторы являются особенно применимыми в трансфекции коронарного эндотелия и сердечных миоцитов, приводя к высокоэффективной трансфекции после интракоронарной инъекции. Аденовирусные векторы могут быть также использованы для трансфекции ткани, снабжаемой периферической сосудистой сетью, например, с использованием интраартериальной или прямой инъекции. Как показано здесь, хелпер-независимая репликационно-дефектная система аденовируса 5 человека может быть использована для эффективной трансфекции большого процента миокардиальных клеток invivo посредством единственной интракоронарной инъекции. Авторы также показали, что такой способ доставки может быть использован для эффективного нацеливания векторов на миокард крупного сердца млекопитающих. Дополнительные способы нацеливания векторов на конкретные клетки или типы тканей описаны ниже и в литературе в данной области. В различных описанных ниже иллюстрациях используемые рекомбинантные аденовирусные векторы основаны на аденовирусе 5 человека (описанном McGrory W.J. et al., Virology 163:614-617, 1988), который лишен необходимых ранних генов из генома аденовируса (обычно Е 1 А/Е 1 В) и, следовательно,неспособен реплицироваться, если он не растет в пермиссивных клеточных линиях, которые обеспечивают продукты отсутствующих генов in trans. Вместо отсутствующих аденовирусных геномных последовательностей, представляющий интерес трансген может быть клонирован и экспрессирован в тка- 17008538 ни/клетках, инфицированных репликационно-дефектным аденовирусом. Обычно, перенос генов на основе аденовируса не приводит к стабильной интеграции в геном клетки-мишени. Однако, аденовирусные векторы могут размножаться с высоким титром и трансфицировать нереплицирующиеся клетки; и, хотя трансген не передается дочерним клеткам, это является пригодным для переноса гена в дифференцированные (зрелые) сердечные миоциты, которые не делятся активно. Ретровирусные векторы обеспечивают стабильный перенос генов, и в настоящее время получены высокие титры посредством псевдотипирования ретровирусов (Bums, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8033-8037, 1993), но применяемые в настоящее время ретровирусные векторы обычно неспособны к эффективной трансдукции нереплицирующихся клеток (например, сердечных миоцитов). Кроме того, потенциальные опасности включения трансгена в ДНК хозяина являются неоправданными, если достаточным является кратковременный перенос гена. Действительно, авторы изобретения показали, что ограниченная продолжительность в экспрессии ангиогенного белка является достаточной для существенного улучшения кровотока и функции ишемической ткани (см. примере 5). Таким образом, временный перенос гена является терапевтически достаточным для лечения таких сердечно-сосудистых заболеваниий. В пределах 14 дней после переноса генаFGF-5 в миокард кровоток к ишемическому ложу увеличивался в два раза и этот эффект сохранялся в течение по меньшей мере 12 недель (пример 5 и фиг. 8). Увеличенный кровоток коррелировал с увеличением числа капилляров в сердце (см. пример 5). Утолщение стенки также увеличивалось в пределах двух недель после переноса гена и сохранялось в течение по меньшей мере 12 недель. Таким образом, ген ангиогенного фактора не должен присутствовать в инфицированной клетке в течение более, чем нескольких недель, для получения терапевтического действия. Как только развивались кровеносные сосуды,продолжающаяся экспрессия экзогенного ангиогенного белка могла не требоваться для поддержания новой сосудистой структуры и увеличенного кровотока. Преимущество, связанное с неделящимися клетками, такими как моноциты, заключается в том, что вирусный вектор не "разбавляется" легко делением клеток хозяина. Однако, если это необходимо или желательно для дополнительного увеличения продолжительности экспрессии трансгена в сердце, можно использовать различные аденовирусные векторы второй генерации, которые имеют делеции как Е 1, так и Е 4, которые могут быть использованы вместе с введением циклофосфамида (см., например, Dai et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1401-1405, 1995). Клетки 293 человека (Accession No. ATCC CRL1573; Rockville, MD), которые являются клетками почек эмбриона человека, трансформированными генами Е 1 А/Е 1 В аденовируса, являются примером применимых пермиссивных клеточных линий для получения таких репликационно-дефектных векторов. Однако могут быть также использованы другие клеточные линии, которые позволяют репликационнодефектным аденовирусным векторам размножаться в них, например, клетки HeLa. Конструирование рекомбинантного аденовирусного вектора Аденовирусные векторы, используемые в данном изобретении, могут быть сконструированы по способу рекомбинации спасения, описанному в Graham, Virology 163:614-617, 1988. Вкратце, представляющий интерес трансген клонируют в челночный вектор, который содержит промотор, полилинкер и частичные фланкирующие последовательности аденовируса, из которого были делетированы гены Е 1 А/Е 1 В. В качестве примера челночного вектора может быть приведена плазмида рАС 1 (Virology 163:614-617, 1988) (или ее аналог), которая кодирует части левой стороны генома аденовируса 5 человека (Virology 163:614-617, 1988), минус последовательности Е 1 А и Е 1 В, кодирующие ранний белок, которые являются необходимыми для репликации вируса, и плазмида ACCMVPLPA (Gomez-Foix et al., J.Biol. Chem. 267: 25129-25134, 1992), которая содержит полилинкер, промотор CMV и сигнал полиаденилирования SV40, фланкированные частичными аденовирусными последовательностями, из которых были делетированы гены Е 1 А/Е 1 В. Применение плазмиды рАСl или ACCMVPLA облегчает процесс клонирования. Затем этот челночный вектор котрансфицируют плазмидой, которая содержит полный геном аденовируса 5 человека с длиной, слишком большой для инкапсулирования, в клетки 293. Котрансфекция может проводиться осаждением фосфатом кальция или липофекцией (Zhang et al., Biotechniques 15:868-872, 1993). Плазмида JM17 кодирует полный геном аденовируса 5 человека плюс части вектораpBR322, включающие в себя ген устойчивости к ампициллину (4,3 т.п.н.). Хотя JM17 кодирует все аденовирусные белки, необходимые для получения зрелых вирусных частиц, она является слишком большой для инкасуляции (40 т.п.н. против 36 т.п.н. для дикого типа). В небольшой субпопуляции котрансфицированных клеток рекомбинация спасения между содержащим трансген челночным вектором, например, плазмидой рАСl, и плазмидой, имеющей полный геном аденовируса 5, например, плазмидойpJM17, обеспечивает рекомбинантный геном, который не имеет последовательностей Е 1 А/Е 1 В и который содержит представляющий интерес трансген, но вторично теряет дополнительную последовательность, например, последовательности pBR322, во время рекомбинации, становясь тем самым достаточно малым для инкапсуляции (см. фиг. 1). Что касается описанного выше способа, авторы сообщили успешные результаты (Giordano et al., Circulation 88:1-139, 1993 и Giordano and Hammond, Clin. Res. 42:123A,1994). Запускаемый CMV кодирующий -галактозидазу аденовирус HCMVSP1lacZ (Clin Res 42:123A,1994) может быть использован для оценки эффективности переноса гена с использованием обработки X- 18008538gal. Нацеленные векторные конструкции Ограниченная экспрессия ангиогенного трансгена только в сердце или конкретных типах клеток в сердце (например, сердечных миоцитах) или в других тканях-мишенях, таких как периферическая сосудистая сеть, может обеспечивать определенные преимущества, обсуждаемые ниже. Данное изобретение рассматривает применение нацеливания не только доставкой трансгена, например, в коронарную артерию или другой тканеспецифический канал, но также с использованием нацеленных векторных конструкций, имеющих признаки, которые имеют тенденцию нацеленной доставки генов и/или экспрессии генов в конкретных клетках-хозяина или типах клеток-хозяина (например, сердечных или иных миоцитах). Таким образом, такие нацеленные векторные конструкции могли бы включать в себя векторы нацеленной доставки и/или нацеленные векторы, описанные более подробно ниже и в публикациях в данной области. Ограничение доставки и/или экспрессии может быть выгодным в качестве средства дополнительного фокусирования потенциальных эффектов генотерапии. Потенциальная применимость дополнительной рестрикции доставки/экспрессии зависит в большой мере от типа используемого вектора и способа и места введения такого вектора. Как описано здесь, наблюдали, что доставка вирусных векторов посредством интракоронарной инъекции к миокарду обеспечивает сама по себе высоконацеленную доставку генов (см. примеры ниже). Кроме того, при использовании векторов, которые обычно не приводят к интеграции трансгена в репликон клетки-хозяина (таких как аденовирусные и многочисленные другие векторы), ожидается, что сердечные миоциты будут проявлять относительно продолжительную экспрессию трансгена, так как эти клетки обычно не реплицируются. В противоположность этому экспрессия быстро делящихся клеток, таких как эндотелиальные клетки, склонна к уменьшению вследствие деления и обновления клеток. Однако, могут использоваться также другие средства ограничения доставки и/или экспрессии, в дополнение или вместо иллюстрированных способов доставки, как описано здесь. Векторы нацеленной доставки включают в себя, например, векторы (такие как вирусы, невирусные векторы на основе белков и векторы на основе липидов), имеющие поверхностные компоненты (такие как член пары лиганд-рецептор, другая половина которой обнаруживается на клетке-хозяина для нацеливания) или другие признаки, которые опосредуют преимущественное связывание и/или преимущественную доставку гена к конкретным клеткам-хозяина или типам клеток-хозяина. Как известно в данной области, ряд векторов как вирусного, так и невирусного происхождения имеют присущие им свойства облегчения такого преимущественного связывания и/или были модифицированы для выполнения преимущественного нацеливания (см., например, Douglas et al., Nat. Biotech. 14:1574-1578, 1996; Kasahara, N. etOpin. in Biotech. 6: 698-708, 1995; Schofield, JP, et al., British Med. Bull. 51: 56-71, 1995; Schreier, H, Pharmaceutica Acta Helvetiae 68: 145-159, 1994; Ledley, F.D., Hum. Gene Ther. 6: 1129-1144, 1995; Conary, J.T.,et al., WO 95/34647 (21 December 1995); Overell, R.W., et al., WO 95/28494 (26 October 1995); и Truong,V.L. et al., WO 96/00295 (4 January 1996. Нацеленные векторы включают в себя векторы (такие как вирусы, невирусные векторы на основе белков и векторы на основе липидов), в случае которых доставка приводит к экспрессии трансгена, которая является относительно ограниченной конкретными клетками-хозяина или типами клеток-хозяина. В качестве иллюстрации, ангиогенные трансгены, доставляемые в соответствии с данным изобретением,могут быть функционально связаны с гетерологичными тканеспецифическими промоторами, с ограничением таким образом экспрессии только клетками в данной конкретной ткани. Например, тканеспецифические последовательности регуляции транскрипции, полученные из гена,кодирующего специфический для кардиомиоцитов промотор легкой цепи миозина (MLC) или тяжелой цепи миозина, могут быть слиты с трансгеном, например, геном FGF, в векторе, таком как аденовирусные конструкции, описанные выше. Таким образом, экспрессия этого трансгена может быть относительно ограничена сердечными миоцитами (т.е. будет происходить только в сердечных миоцитах). Определяли эффективность экспрессии гена и степень специфичности, обеспечиваемые специфическими для кардиомиоцитов промоторами MLC и МНС с lacZ (с использованием рекомбинантной аденовирусной системы, такой как приведенная в качестве примера здесь); и сообщалась специфическая для сердца экспрессия (см., например, Lee et al., J. Biol. Chem. 267:15875-15885, 1992). Поскольку промотор MLC может содержать всего лишь около 250 п.н., он легко подходит даже для векторов с ограниченным размером, таких как пакующая система аденовируса-5, приведенная в качестве примера здесь. Промотор тяжелой цепи миозина, который, как известно, является сильным промотором транскрипции, обеспечивает другой альтернативный специфический для сердца промотор, содержащий менее, чем приблизительно 300 п.н. Хотя другие промоторы, такие как промотор тропонина-С, не обеспечивают тканеспецифичности, они являются небольшими и высокоэффективными. Нацеленная экспрессия генов Неожиданным открытием данного изобретения является то, что рекомбинантный аденовирус очень эффективно поглощается в первом сосудистом ложе, с которым он встречается. Действительно, в модели животного примера 4 эффективность поглощения этого вируса в сердце после интракоронарной инъек- 19008538 ции составляла 98%, т.е. 98% этого вируса удалялась в первом прохождении вируса через миокардиальное сосудистое ложе. Кроме того, сыворотка, взятая из этих животных во время инъекции, была неспособна выращивать вирусные бляшки (Graham, Virology, 163:614-617, 1988) до разведения в 200 раз, что предполагает присутствие сывороточного фактора (или связывающего белка) который ингибирует размножение вируса. Эти два фактора (эффективное прикрепление вируса первого прохождения и возможность присутствия сывороточного связывающего белка) могут действовать вместе, ограничивая экспрессию первым сосудистым ложем, встреченным вирусом. Для дальнейшей оценки степени, до которой перенос гена лимитирован сердцем после интракоронарного переноса гена, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) использовали, чтобы наблюдать, было ли доказательство внекардиалыюго присутствия вирусной ДНК спустя две недели после переноса гена, в двух обработанных животных (пример 4 ниже). Животные показали присутствие вирусной ДНК в их сердцах, но не в их сетчатках, скелетных мышцах или печенях. Чувствительность ПЦР является такой,что может детектироваться одна последовательность ДНК на 5000000 клеток. Таким образом, эти данные показали, что вирусная ДНК не присутствовала во внекардиальных тканях спустя две недели после доставки гена. Эти результаты дополнительно подтверждали с использованием других ангиогенных белков и производных, как описано ниже. Эти открытия являются чрезвычайно важными, так как они подтверждают концепцию нацеливания трансгена на сердце (т.е. обеспечения экспрессии трансгена в сердце, а не где-либо в другом месте). Локализованная доставка и экспрессия трансгена обеспечивают преимущество безопасности, дополнительно повышая полезность применения данных способов в лечении пациентов. Размножение и очистка аденовирусных векторов Рекомбинантные вирусные векторы, такие как аденовирусные векторы, могут быть очищены из бляшек в соответствии со стандартными способами. В качестве иллюстрации, полученные рекомбинантные аденовирусные векторы могут быть размножены в клетках 293 человека (которые обеспечивают функции Е 1 А и Е 1 В in trans) до титров в предпочтительном диапазоне около 1010-1012 вирусных частиц/мл. Способы размножения и очистки были описаны для различных вирусных векторов, и они могут быть использованы вместе с данным изобретением. Здесь в качестве примеров описаны аденовирусные векторы, но могут также применяться другие вирусные векторы, такие как AAV. Для аденовируса клетки могут быть инфицированы при 80% конфлюентности и собраны спустя 48 ч. После 3 циклов замораживания-оттаивания инфицированных клеток, остатки клеток (дебрис) осаждают центрифугированием и вирус очищают ультрацентрифугированием в градиенте CsCl (предпочтительным является двукратное центрифугирование в градиенте CsCl). Перед инъекцией in vivo, исходные растворы вирусов могут быть обессолены (например, гель-фильтрацией через колонки Сефарозы, такие как Сефадекс G-25). Обессоленный исходный раствор вируса может быть также отфильтрован через фильтр 0,3 мкм, если желательно. Авторы обычно концентрируют и очищают исходный раствор вируса двукратным ультрацентрифугированием в градиенте CsCl с последующей хроматографией на Сефадексе G25, с уравновешиванием колонок забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР). Полученный исходный раствор вируса обычно имеет конечный титр вируса, равный по меньшей мере приблизительно 1010-1012 вирусных частиц/мл. Предпочтительно рекомбинантный вирус является высокоочищенным и по существу не содержащим вируса дикого типа (потенциально репликативного). По этим причинам размножение и очистку можно проводить для исключения примесей и вируса дикого типа, например идентификацией успешного рекомбинантного вируса при помощи ПЦР с использованием подходящих праймеров, проведением двух раундов очистки из бляшек и двукратного ультрацентрифугирования в градиенте CsCl. Доставка векторов, несущих ангиогенный трансген Средства и композиции, которые используют для доставки векторов, несущих трансгены ангиогенных белков, зависят от конкретного используемого вектора, как хорошо известно в данной области. Однако обычно вектор может быть в форме инъекционного препарата, содержащего фармацевтически приемлемый носитель/разбавитель, такой как, например, забуференный фосфатом солевой раствор. Другие фармацевтические носители, препараты и дозы описаны ниже. Предпочтительным в настоящее время способом доставки in vivo для заболевания сердца (особенно для векторных конструкций, которые иным образом не нацелены для доставки и/или экспрессии, которая ограничивается миокардом или иной тканью-мишенью), является доставка инъекцией вектора в кровеносный сосуд или другой канал, непосредственно снабжающий кровью миокард или ткань, предпочтительно инъекцией в одну или обе коронарные артерии или другие тканеспецифические артерии (или болюсной инъекцией в периферическую ткань). В качестве примера для доставки к миокарду, такая инъекция достигается предпочтительно катетером, введенным до значительной степени (обычно на по меньшей мере приблизительно 1 см) в просвете одной или обеих коронарных артерий или одного или нескольких трансплантатов подкожных вен или внутренних артерий молочной железы или других каналов,доставляющих кровь к миокарду. Предпочтительно инъекцию выполняют как в левую, так и в правую коронарные артерии для обеспечения общего распределения ко всем районам сердца (например, левую переднюю нисходящую артерию (LAD), левую коронарную артерию (LCx) и правые). Инъекцией препа- 20008538 рата аденовирусного вектора в соответствии с этим, необязательно в комбинации с вазоактивным агентом для усиления доставки гена, как описано здесь, можно выполнять эффективный опосредованный аденовирусом перенос ангиогенного гена для лечения сердечно-сосудистого заболевания, например клинической миокардиальной ишемии или заболевания периферических сосудов, без каких-либо нежелательных эффектов. Векторы доставляются в количестве, достаточном для того, чтобы данный трансген экспрессировался и обеспечивал терапевтическую пользу. Для вирусных векторов (таких как аденовирус), конечный титр вируса в инъекционном препарате находится предпочтительно в диапазоне около 107-1013 вирусных частиц, что делает возможным эффективный перенос гена. Исходный раствор аденовируса, предпочтительно не содержащий вируса дикого типа, может инъецироваться глубоко в просвет одной или обеих коронарных артерий (или трансплантатов), предпочтительно как в правую, так и в левую коронарные артерии (или трансплантаты), и предпочтительно в количестве 109-1011 вирусных частиц, как определено оптической денситометрией. Предпочтительно вектор доставляется в виде единственной инъекции в каждый канал (например, в каждую коронарную артерию). Для дополнительного увеличения локализованной доставки вектора генотерапии и для повышения эффективности доставки гена, в соответствии с данным изобретением, можно инфузировать вазоактивный агент, предпочтительно гистамин или агонист гистамина или белок васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF) или донор оксида азота (например, нитропруссид натрия), в подлежащую лечению ткань, либо одновременно с введением ангиогенного вектора генотерапии, либо за несколько минут до введения этого вектора. Посредством инъекции векторной композиции непосредственно в просвет коронарной артерии при помощи коронарных катетеров, можно нацелить на ген довольно эффективно и минимизировать потерю рекомбинантных векторов в проксимальную аорту во время инъекции. Этот тип инъекции делает возможной локальную трансфекцию желаемого числа клеток, в частности, сердечных миоцитов, в пораженном миокарде кодирующими ангиогенный белок или пептид генами, максимизируя тем самым терапевтическую эффективность переноса генов и минимизируя нежелательный ангиогенез во внекардиальных районах. Для доставки к заболевшим тканям, снабжаемых кровью периферической сосудистой сетью,вектор может вводиться в одну или несколько артерий, снабжающих кровью такую ткань, или в виде болюсной инъекции в эту ткань. Векторные конструкции, которые специфически нацелены на миокард, такие как векторы, включающие в себя компоненты миокард-специфического связывания или поглощения, и/или которые включают в себя трансгены ангиогенных белков, которые находятся под контролем миокард-специфических регуляторных последовательностей транскрипции (например, кардимиоцит-специфических промоторов),могут быть использованы вместо таких способов направленной инъекции или, предпочтительно, вместе с такими способами направленной инъекции, в качестве способа дополнительного ограничения экспрессии миокардом (например, желудочковыми миоцитами). Для векторов, которые могут вызывать иммунную реакцию, предпочтительно инъецировать вектор непосредственно в кровеносный сосуд, снабжающий кровью миокард, как описано выше, хотя могут быть использованы дополнительные способы для ограничения внекардиальной доставки или иным образом уменьшения потенциальной возможности иммунной реакции. Могут быть также использованы векторы, нацеленные на ткани, снабжаемые кровью периферической сосудистой сетью, такие как векторы, нацеленные на скелетную мышцу, или могут использоваться также промоторы, специфически экспрессируемые в скелетной мышце. Как описано подробно ниже, было продемонстрировано, что с использованием способов данного изобретения для доставки in vivo вирусного вектора, содержащего ангиогенный трансген, экспрессия этого трансгена не происходила в гепатоцитах, и вирусная РНК не могла быть обнаружена в моче в любое время после интракоронарной инъекции. Кроме того, не могло быть обнаружено доказательство внекардиальной экспрессии в глазу, печени или скелетной мышце при помощи ПЦР спустя две недели после интракоронарной доставки трансгенов таким образом. Различные катетеры и пути доставки могут быть использованы для достижения интракоронарной доставки, как известно в данной области (см., например, цитированные выше ссылки, в том числе: Topol,E.J. (ed.), The Textbook of Interventional Cardiology, 2nd Ed. (W.B. Saunders Co. 1994); Rutherford, R.B.,Vascular Surgery, 3rd Ed. (W.B. Saunders Co. 1989); The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed. (W.B. 1992); иSabiston, D., The Textbook of Surgery, 14th Ed. (W.B. 1991. Прямая интракоронарная (или в трансплантированный сосуд) инъекция может быть выполнена с использованием стандартного подкожного катетера на основе способов, проводимых при флуороскопическом контроле направления катетера. Любое разнообразие коронарных катетеров или перфузионный катетер Стека, например, могут быть использованы в данном изобретении. Например, различные катетеры общего назначения, а также модифицированные катетеры, пригодные для применения в данном изобретении, доступны из коммерческих фирмпоставщиков, таких как Advanced Cardiovascular Systems (ACS), Target Therapeutics, Boston Scientific иCordis. В том случае, когда доставка в миокард достигается инъекцией непосредственно в коронарную артерию (что является в настоящее время наиболее предпочтительным), может быть также использован ряд подходов для введения катетера в коронарную артерию, как известно в данной области. В качестве- 21008538 примера, катетер может быть удобным образом введен в бедренную артерию и пройдет ретроградно (назад) через подвздошную артерию и брюшную аорту и в коронарную артерию. Альтернативно, катетер может быть сначала введен в плечевую артерию или сонную артерию и пройдет ретроградно в коронарную артерию. Капиллярное ложе миокарда может быть также достигнуто ретроградной перфузией, например, из катетера, помещенного в коронарный синус. Такой катетер может также использовать проксимальный баллон для предупреждения или уменьшения направленного вперед потока в качестве средства облегчения направленной назад перфузии. Для доставки к тканям, снабжаемым кровью периферической сосудистой сетью, катетеры могут вводиться в артерии, снабжающие кровью такие ткани (например, бедренные артерии в случае ноги), или могут вводиться, например, болюсной инъекцией или инфузией в пораженную ткань. Различные комбинации векторов, содержащих ангиогенные гены, и катетеров или других приспособлений для доставки in vivo (например, других приспособлений, способных вводить фармацевтическую композицию, обычно в забуференном растворе, в кровеносный сосуд или в мышцу) могут быть включены в наборы для применения в соответствии с данным изобретением. Такие наборы могут также содержать один или несколько вазоактивных агентов для усиления доставки генов и могут дополнительно включать в себя инструкции, описывающие их применение в соответствии с любым из способов, описанных здесь. Модели животных Важными предпосылками для успешных исследований сердечно-сосудистой генотерапии являются(1) генетическая конституция модели животного, которое применимо для клинического сердечнососудистого заболевания, которая может обеспечить полезные данные в отношении механизмов для увеличенного кровотока и/или контрактильной функции, и (2) точная оценка эффектов переноса генов. С этой точки зрения, ни один из более ранних способов не является удовлетворительным. Таким образом,авторы изобретения использовали свиные модели, которые удовлетворяют этим предпосылкам. Свинья является особенно подходящей моделью для исследования заболеваний сердца человека вследствие ее близости (релевантности) относительно физиологии человека. Сердце свиньи похоже на сердце человека по следующим признакам. Свинья имеет природное коронарное кровоснабжение, очень сходное с коронарным кровоснабжением человека, в том числе имеет относительное отсутствие коронарных коллатеральных сосудов. Во-вторых, размер сердца свиньи, в процентах от общего веса тела, является сходным с размером сердца человека. Кроме того, свинья является крупной моделью животного, что позволяет,следовательно, более точную экстраполяцию различных параметров, таких как эффективные дозы векторов, токсичность и т.д. В противоположность этому, сердца таких животных, как собаки и члены семейства мышиных, имеют большое количество эндогенных коллатеральных сосудов. Кроме того, относительно общего веса тела, размер сердца собаки в два раза больше сердца человека. Модель животного, описанная здесь в примере 5, является примером миокардиальной ишемии.(Поскольку миокардиальная ишемия может также приводить к застойной сердечной недостаточности и/или встречается в связи с ней, эта конкретная модель дополнительно уместна для этой ситуации). С использованием этой модели, было продемонстрировано, что опосредованная вектором доставка гена,кодирующего ангиогенный белок, ослабляла миокардиальную ишемию и увеличивала кровоток в ишемическом районе. Развитие коллатеральных сосудов также увеличивалось. В качестве иллюстрации, авторы изобретения успешно продемонстрировали способы переноса гена с несколькими различными ангиогенными белками, в том числе как с природными формами, так и с мутеинами (как описано в примерах ниже). В этой модели, которая имитирует клиническое заболевание коронарных артерий, помещение амероидного жгута вокруг левой огибающей артерии (LCx) приводит к постепенному полному закрытию (в пределах 7 дней положения) с минимальным повреждением (1% левого желудочка, 41% ложа LCx)(Roth, et al., Circulation 82:1778, 1990; Roth, et al., Am. J. Physiol, 235:1-11279, 1987; White, et al., Circ. Res.,71:1490, 1992; Hammond, et al., Cardiol., 23:475, 1994; и Hammond, et al., J. Clin. Invest., 92:2644, 1993). Миокардиальные функция и кровоток были нормальными в состоянии покоя в районе, предварительно перфузированном с помощью закупоренной артерии (называемом ишемическим районом), но резерв кровотока является недостаточным для предотвращения ишемии, когда потребности в миокардиальном кислороде увеличиваются, вследствие ограниченного развития эндогенных коллатеральных сосудов. Таким образом, ложе LCx является предметом эпизодической ишемии, аналогично клинической грудной жабе (стенокардии). Взаимоотношения развития коллатеральных сосудов и функции кровотока являются стабильными в пределах 21 дня наложения амероидного жгута и остаются стабильными в течение четырех месяцев (Roth, et al., Circulation, 82:1778, 1990; Roth, et al., Am. J. Physiol, 235:H1279, 1987; White, etal., Circ. Res., 71:1490, 1992). Было показано телеметрией, что животные имеют периодическую ишемическую дисфункцию в подвергающемся опасности ложе, в течение дня, связанную с резкими увеличениями частоты сердечных сокращений, во время кормления, при помехах, доставляемых персоналом, и т.д. Таким образом, эта модель имела ложе со стабильными, но недостаточными коллатеральными сосудами, и является предметом для периодической ишемии. Другим явным преимуществом этой модели является то, что имеется нормально перфузируемый и функционирующий район (ложе LAD), смежный с- 22008538 ненормально перфузируемым и имеющим дисфункцию районом (ложем LCx), что предоставляет контрольное ложе в каждом животном. Миокардиальную контрастную эхокардиографию использовали для приближенной оценки регионарной миокардиальной перфузии. Контрастное вещество состоит из микроагрегатов галактозы и увеличивает эхогенность (белизну) изображения. Микроагрегаты распределяются в коронарные артерии и миокардиальную стенку таким образом, что они пропорциональны кровотоку (Skyba, et al., Circulation,90:1513-1521, 1994). Было показано, что максимальная интенсивность контраста близко коррелировала с миокардиальным кровотоком, как измерено при помощи микросфер (Skyba, et al., Circulation, 90:15131521, 1994). Для документирования, что эхографические изображения, применяемые в данном изобретении, точно идентифицировали ложе LCx и что миокардиальная контрастная эхокардиография может использоваться для оценки миокардиального кровотока, гидравлический манжетный блокатор помещали вокруг проксимальной LCx, смежной с амероидным жгутом. В некоторых аспектах данного изобретения, при умерщвлении животных сердца перфузионно фиксировали (глутаровым альдегидом, физиологическими давлениями, in situ) для количественного определения роста капилляров при помощи микроскопии. ПЦР использовали для детектирования ДНК ангиогенного белка и мРНК в миокарде из животных, которым производили перенос гена. Как описано ниже,спустя две недели после переноса генов пробы миокарда из трансдуцированных lacZ животных обнаружили значительную бета-галактозидазную активность при гистологическом обследовании. Наконец, с использованием поликлональных антител к ангиогенному белку была продемонстрирована экспрессия ангиогенного белка в клетках и миокарде из животных, которые получали перенос гена. Что касается демонстрации улучшенного кровотока, специалистам в данной области известны различные способы. Например, миокардиальный кровоток может быть определен способом с применением радиоактивных микросфер, как описано в Roth, et al., Am. J. Physiol, 235:1-H1279, 1987 или в Roth, et al.,Circulation, 82:1778-1789, 1990. Миокардиальный кровоток может быть также количественно определен,например, получением изображений с использованием таллия, которое предусматривает перфузию сердца радиоактивным таллием, как описано Braunwald in Heart Disease, 4th ed., pp. 276-311 (Saunders, Philadelphia, 1992). Клетки в сердце обладают авидностью в отношении таллия. Поглощение таллия позитивно коррелирует с кровотоком. Таким образом, пониженное поглощение является признаком пониженного кровотока, который происходит в ишемических условиях, в которых имеется дефицит перфузии. В находящемся в сознании индивидууме ангиогенную активность можно легко оценить контрастной эхокардиографией, как описано в примерах 1 и 5 и в Sahn, D.J., et al., Circulation 58:1072-1083, 1978. Улучшенная миокардиальная функция может быть определена измерением утолщения стенки, например,трансторакальной эхокардиографией. Стратегия для терапевтических исследований включала в себя тайминг доставки трансгена, способ и путь введения трансгена и выбор ангиогенного гена. В амероидной модели миокардиальной ишемии перенос гена выполняли после стабильного, но недостаточного развития коллатеральных сосудов. Более ранние исследования с использованием амероидной модели включали в себя доставку ангиогенных пептидов во время замыкания амероида, перед развитием ишемии и коллатеральных сосудов. Однако, этот подход не был использован по нескольким причинам. Во-первых, такие исследования не пригодны для близко дублирующихся состояний, которые могли бы присутствовать в лечении клинической миокардиальной ишемии, в котором перенос гена осуществляли бы в условиях имеющейся миокардиальной ишемии; предыдущие исследования аналогичны обеспечению пептида в рецидивировании ишемии и, следовательно, они менее уместны. Во-вторых, предполагалось, на основании предыдущих исследований в культуре клеток, что ишемический стимул вместе с ангиогенным пептидом был бы оптимальной средой для стимуляции ангиогенеза. Это могло бы оптимально достигаться доставкой трансгена в тот момент,когда заболевание сердца уже присутствует. Выбор способа для достижения доставки трансгена был связан с этими определениями. Ограничение, что этот способ должен был применимым для последующего лечения пациентов с заболеванием коронарных сосудов, делало некоторые подходы непригодными (непрерывную инфузию пептида в коронарную артерию, прямую инъекцию плазмиды в сердце, покрытие сердца смолой, содержащей пептид для обеспечения медленного долгосрочного высвобождения). Наконец, свиная модель обеспечивала превосходный способ для прослеживания регионарного кровотока и функции перед доставкой гена и после доставки гена. Применение контрольных животных, которые получали тот же самый вектор (например, рекомбинантный аденовирус), но с репортерным геном, обеспечивает контроль для этих исследований. Свинья имеет природную коронарную циркуляцию, очень сходную с коронарной циркуляцией людей, в том числе относительное отсутствие природных коронарных коллатеральных сосудов. Свиная модель обеспечивала также превосходное средство для прослеживания регионарного кровотока и функции перед доставкой гена и после доставки гена. Применение контрольных животных, которые получали ту же самую рекомбинантную аденовирусную конструкцию, но с репортерным геном, обеспечивало контроль для этих исследований. На основании вышесказанного и на основании предыдущих опубликованных исследований, специалистам в данной области будет понятно,что ожидается, что результаты, описанные ниже, полученные на свиньях, являются предсказательными для результатов, которые будут получены для человека.- 23008538 Что касается заболевания периферических сосудов, доставка ангиогенных генов в периферическую сосудистую сеть с использованием векторов генотерапии данного изобретения может быть испытана с использованием, например, модели периферической ишемии с лигированием кровеносных сосудов задних конечностей. См., например, модель лигирования бедренной артерии, описанную R.L. Terjung et al.(см., например, Yang, et al., Circ. Res., 79(l):62-9, 1996). Как и в случае доставки ангиогенных генов к ишемическому миокарду, доставка ангиогенных генов, согласно данному изобретению, к периферической сосудистой сети и/или связанной с ней мышце может быть использована для преодоления эффектов заболевания периферических сосудов. Другая модель животного, описанная здесь в примере 1, индуцирует дилатированную кардиомиопатию, такую какая наблюдается в клинической застойной сердечной недостаточности. В этой модели,непрерывная быстрая электрическая стимуляция желудочка на протяжении периода 3-4 недель индуцирует сердечную недостаточность, которая обнаруживает сходные признаки со многими признаками клинической сердечной недостаточности, в том числе дилатацию (расширение) левого желудочка с нарушенной систолической функцией, аналогичную регионарным функциональным отклонениям от нормы,наблюдаемым при сердечной недостаточности (в том числе отклонениях, связанных с тяжелым заболеванием коронарных артерий и с не-ИБС (не-CAD)-DCM (дилатированной кардиомиопатией), такой какIDCM (идиопатическая дилатированная кардиомиопатия. Другие модели застойной сердечной недостаточности животных включают в себя индукцию хронической желудочковой дисфункции посредством интракоронарной доставки микросфер (см., например, Lavine et al., J. Am. Coll. Cardiol. 18: 1794-1803(1991. В качестве дополнительного примера желудочковой дисфункции, окклюзия левой коронарной аретрии в крысиной модели может индуцировать инфаркты, и затем эти животные могут исследоваться и лечиться на протяжении последующих дней или недель (см., например, Pfeffer et al., Circ. Res. 44: 503512, 1979; Pfeffer et al., Am. J. Physiol. 260: H1406-1414, 1991). Таким образом, эти модели могут быть использованы для определения, эффективна ли доставка векторной конструкции, кодирующей ангиогенный пептид или белок, для ослабления сердечных дисфункций, связанных с этими состояниями. Эти модели особенно применимы в обеспечении некоторых из параметров, при помощи которых можно оценивать эффективность генотерапии in vivo для лечения сердечной застойной недостаточности и вентрикулярного ремоделирования. Терапевтические применения Векторы данного изобретения (например, репликативно-дефектный аденовирус) делают возможным высокоэффективный перенос генов in vivo без значительного некроза или воспаления. На основании этих результатов, некоторые из которых описаны подробно в примерах ниже, видно, что достигается достаточная степень переноса генов in vivo для осуществления функциональных изменений in vivo. Перенос гена ангиогенного белка, одного или в комбинации с другим усиливающим мышцу белком или пептидом, будет улучшать кровоток и усиливать мышечную функцию в обработанной мышце. Кроме того, если желательно, вазоактивный агент может быть использован вместе с этими способами и композициями, как описано здесь, для дополнительного усиления доставки гена к району-мишени. Поскольку вазоактивный агент (такой как гистамин, агонист гистамина, донор оксида азота или белок VEGF) может быть использован для увеличения эффективности переноса гена при векторной дозе гена, включение такого агента может быть использовано для ограничения количества вектора, необходимого для введения для достижения конкретного терапевтического эффекта. В одном аспекте векторы и способы данного изобретения могут быть использованы для лечения дилатированной кардиомиопатии (DCM), типа сердечной недостаточности, который обычно диагностируется обнаружением дилатированного, гипоконтрактильного левого и/или правого желудочка. Как обсуждалось выше, DCM может встречаться в отсутствие других характерных форм заболевания сердца,таких как коронарная окклюзия или инфаркт миокарда, в истории заболевания. Дилатированная кардиомиопатия (DCM) связана со слабой функцией желудочка и симптомами сердечной недостаточности. У этих пациентов расширение полостей сердца и утончение стенки обычно приводит к высокому напряжению стенки левого желудочка. Многие пациенты обнаруживают симптомы даже при слабом физическом усилии или при отдыхе и, следовательно, характеризуются как проявляющие тяжелую типа-III или типа-IV сердечную недостаточность, соответственно (см., например, классификацию сердечной недостаточности Нью-Йоркской ассоциации кардиологов (NYHA. Как отмечалось выше, многие пациенты с заболеванием коронарных артерий могут прогрессировать до проявления дилатированной кардиомиопатии, часто как результата одного или нескольких сердечных приступов (инфарктов миокарда). Дополнительным применением данного изобретения является предупреждение или по меньшей мере ослабление разрушительного ремоделирования желудочков (также известного, как разрушительное ремоделирование, для краткости), которое означает расширение полостей после инфаркта миокарда, которое может прогрессировать до тяжелой сердечной недостаточности. Даже если ремоделирование желудочков уже началось, все еще желательно стимулировать увеличение в кровотоке, так как это может все еще быть эффективным для устранения желудочковой дисфункции. Подобным образом, стимуляция ангиогенеза может быть полезной, так как развитие микрососудистого (капиллярного) ложа может быть- 24008538 также эффективным для устранения желудочковой дисфункции. Далее, такие ангиогенные белки или пептиды могут также иметь другие усиливающие действия. В пациенте, который имел инфаркт миокарда, разрушительное ремоделирование желудочков предотвращается, если пациент не имеет расширения полостей сердца и если симптомы сердечной недостаточности не развиваются. Разрушительное ремоделирование желудочков ослабляется, если имеется какое-либо наблюдаемое или измеримое уменьшение в существующем симптоме сердечной недостаточности. Например, пациент может обнаруживать меньшую одышку и улучшенную переносимость физической нагрузки. Способы оценки улучшения функции сердца и уменьшения симптомов являются по существу аналогичными способам оценки, описанным выше для DCM. Ожидается, что предупреждение или ослабление разрушительного ремоделирования желудочков в результате улучшенных коллатерального кровотока и желудочковой функции и/или других механизмов будет достигаться в пределах недель после переноса ангиогенного гена в пациенте с использованием описанных здесь способов. В одном примере данный способ переноса in vivo трансгена, кодирующего ангиогенный белок, используется для демонстрации, что перенос гена рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ангиогенный белок или пептид, является эффективным в значительном уменьшении миокардиальной ишемии. В другом примере данный способ переноса in vivo трансгена, кодирующего ангиогенный белок,используют для лечения состояния, связанного с застойной сердечной недостаточностью. Как показывают приведенные ниже данные, экспрессия экзогенно обеспеченного ангиогенного трансгена приводит к увеличенному кровотоку и/или улучшенной функции в сердце (или другой тканимишени). Этот увеличенный кровоток и/или улучшенная функция будут ослаблять один или несколько симптомов сердечно-сосудистого заболевания, поражающего ткани-мишени. Как описано здесь, ряд различных векторов могут использоваться для доставки трансгенов ангиогенных белков in vivo в соответствии со способами данного изобретения. В качестве иллюстрации, репликативно-дефектные рекомбинантные аденовирусные векторы, приведенные в качестве примера здесь,достигали высокоэффективного переноса генов in vivo без цитопатического действия или воспаления в районах экспрессии генов. В лечении стенокардии, которая может быть связана с ИБС (CAD), перенос кодирующего ангиогенный белок трансгена может проводиться в любое время, но предпочтительно его проводят относительно скоро после появления тяжелой стенокардии. В лечении наиболее застойной сердечной недостаточности перенос кодирующего ангиогенный белок гена может проводиться, например, когда развитие сердечной недостаточности является вероятным или была диагностирована сердечная недостаточность. Для лечения желудочкового ремоделирования перенос гена может выполняться в любое время после перенесения пациентом инфаркта, предпочтительно в пределах 30 дней и даже более предпочтительно в пределах 7-20 дней после инфаркта. Как отмечалось выше, белки бета-адренергической передачи сигнала (бета-ASP) (в том числе бетаадренергические рецепторы (бета-AR), ингибиторы рецепторной киназы G-белка (GRK-ингибиторы) и аденилилциклазы (АС могут также использоваться для усиления сердечной функции, как описано и иллюстрировано подробно в патентной заявке Соединенных Штатов с номером 08/924757, поданной 5 сентября 1997 г. (на основе заявки US 60/048 933, поданной 16 июня 1997 г. и заявки US 08/708 661, поданной 5 сентября 1996 г.), а также заявке PCT/US97/15610, поданной 5 сентября 1997 г. и продолжении дела заявки US с регистрационным номером 09/008 097, поданной 16 января 1998 г., и продолжении дела заявки US с регистрационным номером 09/472667, поданной 27 декабря 1999 г., каждая из которых включена здесь в качестве ссылки. Композиции или продукты данного изобретения могут быть легко обеспечены в форме композиций, пригодных для введения пациенту, в кровоток (например, внутриартериальной инъекцией или в виде болюсной инфузии в ткань, такую как скелетная мышца). Подходящая форма введения может быть наилучшим образом определена врачом-практиком. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и их приготовление описаны в стандартных справочниках по приготовлению лекарственных средств,например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin. См. также Wang, Y.J. and Hanson, M.A.,"Parental Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journals of Parental Sciences andTechnology, Technicsl Report No. 10, Suppl. 42:2S (1988). Векторы данного изобретения должны быть предпочтительно приготовлены в растворе при нейтральном рН, например, около рН 6,5-8,5, более предпочтительно приблизительно от рН 7 до рН 8, с наполнителем для доведения раствора почти до изотоничности, например, 4,5% маннитом или 0,9% хлоридом натрия, рН, забуференным известными в данной области буферными растворами, такими как фосфат натрия, которые обычно считаются безопасными,вместе с общепринятым консервантом, таким как метакрезол (0,1-0,75%), более предпочтительно с 0,150,4% метакрезолом. Желательная изотоничность может достигаться с использованием хлорида натрия или других фармацевтически приемлемых агентов, таких как декстроза, борная кислота, тартрат натрия,пропиленгликоль, полиолы (такие как маннит или сорбит), или других неорганических или органических растворенных веществ. Хлорид натрия является предпочтительным, в частности, для буферов, содержащих ионы натрия. Если желательно, растворы вышеописанных композиций могут быть также приготовлены для увеличения срока годности и стабильности. Терапевтически полезные композиции данного- 25008538 изобретения готовят смешиванием ингредиентов согласно обычно принятым процедурам. Например,выбранные компоненты могут смешиваться для получения концентрированной смеси, которая может быть затем доведена до конечной концентрации и вязкости добавлением воды и/или буфера для контроля рН или дополнительного растворенного вещества для регуляции тоничности. Для применения врачом композиции должны быть обеспечены в дозированной форме, содержащей количество вектора данного изобретения, которое будет эффективным, в виде одной дозы или множественных доз для обеспечения терапевтического действия. Как будет понятно специалистам в данной области, эффективное количество терапевтического агента будет варьировать в зависимости от многих факторов, в том числе от возраста и веса пациента, физического состояния пациента и уровня ангиогенеза и/или другого действия, которые должны быть получены, и других факторов. Эффективная доза вирусных векторов данного изобретения будет обычно в диапазоне приблизительно 107-1013 вирусных частиц. Как отмечалось, точная подлежащая введению доза определяется лечащим врачом, но предпочтительно она находится в 5 мл или меньшем количестве физиологически забуференного раствора (такого как забуференный фосфатом солевой раствор), более предпочтительно в 13 мл. Предпочтительным вариантом введения является введение инъекцией в один или несколько локализованных районов (например, в одну или обе коронарные артерии, в случае заболеваний сердца) с использованием подходящего катетера или другого приспособления для доставки in vivo. Следующие примеры обеспечены для дополнительной помощи специалистам с обычной квалификацией в данной области. Эти примеры предназначены для иллюстрации и, следовательно, не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение. Ряд примерных модификаций и вариаций описаны в данной заявке, и другие модификации и вариации будут очевидными специалистам в данной области. Считается, что такие вариации находятся в рамках данного изобретения, описанного и заявленного здесь. Примеры Пример 1. Свиная модель застойной сердечной недостаточности и связанной с ней миокардиальной ишемии 1-А. Животные и хирургическая процедура Девять Йоркширских свиней (Sus scrofa) весом 406 кг анестезировали кетамином (50 мг/кг внутримышечно IM) и сульфатом атропина (0,1 мг/кг внутримышечно IM) с последующим введением натрий-амитала (100 мг/кг внутривенно IV). После эндотрахеальной интубации галотан доставляли нагнетающим вентилятором на протяжении всей процедуры. При левой торакотомии катетеры помещали в аорту, легочную артерию и левое предсердие. Микроманометр Конигсберга помещали в верхушку левого желудочка и эпикардиальное монополярное отведение помещали на 1,0 см ниже атриовентрикулярной бороздки в латеральной стенке левого желудочка. Генератор мощности (Spectrax 5985; Meditronic, Inc.) вставляли в подкожный карман в брюшной полости. Четырех животных оборудовали проточным зондом (Transonic, Inc.) около главной легочной артерии. Перикард рыхло сближали и грудную клетку закрывали. Спустя 7-10 дней после торакотомии производили измерения фона гемодинамики, функции левого желудочка и миокардиального кровотока. Затем инициировали вентрикулярную электростимуляцию (2209 bpm (ударов в минуту) на протяжении 264 дней). Амплитуда стимула была 2,5 В, продолжительность импульса 0,5 мс. Девять дополнительных свиней (407 кг) использовали в качестве контролей; пять свиней подвергали торакотомии и оборудовали инструментарием без стимуляции и убивали спустя 307 дней после начальной торакотомии. Данные, касающиеся правой и левой вентрикулярной массы были сходными в контрольных животных, подвергались ли они торакотомии или нет,так что их результаты объединяли в единую контрольную группу. 1-В. Гемодинамические исследования Гемодинамические результаты получали из находящихся в сознании неусыпленных животных после инактивации стимулятора в течение по меньшей мере 1 ч и животные были в фоновом состоянии. Все данные получали для каждого животного с интервалами 7 дней. Давления получали из левого предсердия, легочной артерии и аорты. Левое вентрикулярное dP/dt получали из левого вентрикулярного кровяного давления высокой точности. Регистрировали легочный артериальный кровоток. Брали пробы крови из аорты и легких получали для расчета содержания артериовенозного кислорода. 1-С. Эхокардиографические исследования Эхокардиогоафия является способом измерения регионарного миокардиального кровотока, предусматривающим инъекцию контрастного вещества в индивидуума или животного. Контрастное вещество(микроагрегаты галактозы) увеличивают эхогенность (белизну) изображения после левой предсердной инъекции. Эти микроагрегаты распределяются в коронарные артерии и миокардиальные стенки пропорционально кровотоку (Skyba, et al., Circulation, 90:1513-1521, 1994). Максимальная интенсивность контрастного усиления коррелирует с миокардиальным кровотоком, как измерено с использованием микросфер (Skyba, et al., Circulation, 90:1513-1521, 1994). Двумерные и М-модальные изображения получали системой визуализации Hewlett Packard Sonos- 26008538 1500. Изображения получали из окологрудинного приближения на уровне средней сосочковой мышцы и регистрировали на имеющей очень высокую чувствительность VHS-ленте. Измерения производили в соответствии с критериями Американского общества эхокардиографии (Sahn D.J., et al., Circulation,58:1072-1083, 1978). Вследствие ориентации по средней линии межжелудочковой перегородки (IVS) свиньи и использования правого окологрудинного вида, М-модальные измерения короткой оси производили через IVS и анатомическую латеральную стенку. Все параметры, в том числе концевую диастолическую величину (EDD), концевую систолическую величину (ESD) и толщину стенки измеряли на по меньшей мере пяти случайных концевых экспираторных ударах и определяли среднее. Концевую диастолическую величину получали при появлении комплекса QRS. Концевая систолическая величина берется в момент максимально латерального положения IVS или в конце Т-волны. Левую вентрикулярную систолическую функцию оценивали с использованием фракционного укорочения, FS-[(EDDESD)/EDD]100. Процентное утолщение стенки (% WTh) рассчитывали в виде %WTh=[(ESWThEDWTh)/EDWTh]100. Для демонстрации воспроизводимости эхокардиограцических измерений, животных визуализировали в 2 последовательных дня перед началом протокола электрической кардиостимуляции. Данные из отдельных демонстраций были высоковоспроизводимыми (фракционное укорочение, R2=0,94, P=0,006; утолщение латеральной стенки, R2=0,90, P= 0,005). Все эти измерения получали с инактивированными электростимуляторами. 1-D. Миокардиальный кровоток Миокардиальный кровоток определяли способом с радиоактивными микросферами, как описано подробно ранее (Roth, D.M., et al., Am. J, Physiol. 253:H1279-H1288, 1987; Roth, D.M., et al., Circulation 82:1778-1789, 1990). Трансмуральные пробы из левой вентрикулярной латеральной стенки и межжелудочковой перегородки делили на эндокардиальную, среднестеночную и эпикардиальную трети, и кровоток к каждой трети трансмурального потока определяли. Трансмуральные срезы производили из районов, в которых делались эхокардиографические измерения, так что кровоток и функциональные измерения соответствовали в каждом ложе. Микросферы инъецировали в контрольном состоянии (не электростимулированном), при инициировании вентрикулярной электрической стимуляции (225 bpm (ударов в минуту, а затем при 7-дневных интервалах во время вентрикулярной электрической стимуляции при 225 ударах в минуту; микросферы также инъецировали с инактивированными электростимуляторами при 14 днях (n=4) и 21-28 днях (n=3). Миокардиальный кровоток на один удар рассчитывали делением миокардиального кровотока на частоту сердечных сокращений (регистрируемую во время инъекции микросфер) (Indolfi, С., et al., Circulation 80:933-993, 1989). Среднее левое предсердное и среднее артериальное давления регистрировали во время инъекции микросфер, так что можно было рассчитать приближенную величину сопротивления коронарных сосудов; индекс сопротивления коронарных сосудов равен среднему артериальному давлению минус среднее левое предсердное давление, деленному на трансмуральный коронарный кровоток. 1-Е. Систолическое напряжение стенки Периферическое систолическое напряжение стенки не могло быть определено, так как авторы не смогли получить подходящий вид для оценки длинной оси левого желудочка. Таким образом, авторы рассчитали меридиональное концевое систолическое напряжение стенки (Riechek, N., et al., Circulation 65:99-108, 1982) с использованием уравнения: меридиональное концевое систолическое напряжение стенки (дины) = (0,344PD)-[h(I-h/D)], где Р обозначает левое вентрикулярное концевое систолическое давление в динах, D обозначает левый вентрикулярный концевой систолический диаметр в см, a h обозначает концевую систолическую толщину стенки. Меридиональное концевое систолическое напряжение стенки рассчитывали как для боковой стенки, так и для IVS перед инициацией электрической стимуляции и затем последовательно при недельных интервалах (с инактивированным электростимулятором). 1-F. Терминальная хирургия После 262 дней непрерывной электрической кардиостимуляции животных анестезировали и интубировали и проводили стернотомию по средней линии грудины. Все еще сокращающиеся сердца погружали в солевой раствор (4 С), коронарные артерии быстро перфузировали солевым раствором (4 С),правый желудочек и левый желудочек (в том числе межжелудочковую перегородку) взвешивали и трансмуральные пробы из каждого района быстро замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70 С. 1-G. Адениннуклеотиды АТФ и АДФ измеряли в трансмуральных пробах IVS и латеральной стенке в четырех животных с сердечной недостаточностью (электрически кардиостимулированных 28 дней) и четырех контрольных животных. Пробы из животных с сердечной недостаточностью получали с инактивированными электростимуляторами (60 мин) в день убивания животных. Пробы получали идентично во всех животных. АТФ и АДФ измеряли в жидкостном хроматографе Waters высокого разрешения, как описано ранее (Pilz, R.B.,J. Biol. Chem. 259:2927-2935, 1984). 1-Н. Статистический анализ Данные выражали в виде среднегостандартное отклонение (SD). Конкретные измерения, полу- 27008538 ченные в контрольном (перед стимуляцией) состоянии и при 1-недельных интервалах во время электрической кардиостимуляции, сравнивали с повторяемыми измерениями с использованием ANOVA(Crunch4, Crunch Software Corp.). В некоторых сравнениях (латеральной стенки против IVS, например,использовали двухфакторный ANOVA. Post hoc сравнения выполняли с использованием способа Тьюки, как описано в данной области. Девять животных выживали 21 день электрической кардиостимуляции; шесть из них выживали 28 дней электрической кардиостимуляции. Результаты, полученные для животных, выживших 28 дней, были статистически неотличимыми от результатов животных, выживших только 21 день. ANOVA проводили, следовательно, на девяти животных в четырех временных точках: контроль (перед стимуляцией), 7 дней, 14 дней и 21-28 дней. Нулевая гипотеза отклонялась, когда получали Р 0,05 (двусторонний критерий). Результаты 1-I. Гемодинамические исследования Быстрая вентрикулярная электростимуляция приводила к изменениям в гемодинамике, которые были значимыми после 7-14 дней электрической стимуляции. При 7 днях животные имели увеличенные левое предсердное и легочное артериальное давление. Это давление возрастало по отношению к норме при увеличении длительности электрической стимуляции (табл. 1). Признаки циркуляторного застоя (тахипноэ, асциты и тахикардия) были очевидными 14-21 день. Легочный артериальный кровоток (минутный сердечный выброс) уменьшался на 21 день стимуляции (контроль, 330,1 л/мин; 21 день, 1,90,4 л/мин; Р 0,05). Таблица 1. Гемодинамика и левая вентрикулярная функция Дисперсионный анализ (повторяемые измерения) использовали для определения, влияла ли продолжительность электрической стимуляции на конкретную переменную; р-величины из ANOVA перечислены в правом столбце. Post hoc испытание выполняли по способу Тьюки: ар 0,05; bр 0,01; ср 0,001(против контрольной величины для той же самой переменной); dp0,05; ep0,01; fp00,001 (в сравнении с предыдущей неделей); gp0,05; hp0,01; ip0,001 (в сравнении с величиной 7 д); post hoc испытание по способу Тьюки. Измерения производили с инактивированными электростимуляторами (пейсмекерами), и измерения представляют среднееSD. 7 д: 7 дней стимуляции; 14 д: 14 дней стимуляции; 21-28 д: 21-28 дней стимуляции. 1-J. Глобальная функция левого желудочка Левую вентрикулярную функцию оценивали при помощи эхокардиографии и гемодинамических переменных, после того как электрокардиостимуляторы были выключены. Фракционное укорочение (FS) прогрессивно уменьшалось по мере увеличения продолжительности кардиостимуляции (Р=0,0001; табл. 1), достигая его самой низкой величины на 21-28 день (контроль, 393%; 21-28 дней 134%; Р 0,0001; табл. 1). Величина левого вентрикулярного концевого диастолического давления (EDD) прогрессивно увеличивалась во время электрической кардиостимуляции Р 0,0001; табл. 1), достигая ее максимальной величины на 21-28 день (контроль, 3,94 см; 21-28 дней, 5,80,6 см; Р=0,0002). Левое вентрикулярное максимальное положительное LV dP/dt также уменьшалось на протяжении исследования (Р=0,0001; табл. 1). Прогрессирующее падение максимального dP/dt сопровождалось увеличением левого вентрикулярного концевого диастолического давления, подтверждая уменьшенную контрак-тильность левого желудочка, так как увеличенная предварительная нагрузка обычно увеличивает левое вентрикулярное максимальное dP/dt (Mahler, F., et al., Am. J. Cardiol. 35:626-634,1975). 1-K. Левая вентрикулярная регионарная функция- 28008538 С инактивированным кардиостимулятором, регионарную левую вентрикулярную функцию оценивали измерением процентного утолщения стенки, а именно левой вентрикулярной латеральной стенки и межжелудочковой перегородки (IVS). Электрическая кардиостимуляция от латеральной стенки вызывала значительное ухудшение функции латеральной стенки в сравнении с IVS (Р=0,001; фиг. 1 и табл. 2). Это различие было значимым на 7 день и увеличивалось дополнительно на 21-28 день, так как функция латеральной стенки ухудшалась. IVS показала незначимое уменьшение в утолщении стенки на протяжении хода этого исследования. Концевая диастолическая толщина стенки обнаружила прогрессирующее утончение во время исследования, которое было более тяжелым в латеральной стенке (табл. 2). Таблица 2. Последовательное утолщение стенки левого желудочка Двухфакторный дисперсионный анализ (повторяемые измерения) использовали для определения,влияет ли на концевое диастолическое утолщение стенки (EDTh) или % утолщения стенки (WTh) продолжительность кардиостимуляции (время) или район (латеральная стенка, LAT; или межжелудочковая перегородка, IVS), или является ли изменение в EDTh или WTh% различным между этими двумя районами (меж.). Средние величины для EDTh или WTh% в каждой временной точке испытывали на различия между этими двумя районами post hoc с использованием анализов Тьюки. Величины представляют среднееSD (стандартное отклонение). 7 д: 7 дней стимуляции; 14 д: 14 дней стимуляции; 21-28 д: 21-28 дней стимуляции. n=9. 1-L. Левый вентрикулярный регионарный кровоток Субэндокардиальный кровоток в минуту увеличивался больше в IVS, чем в латеральной стенке, в начале электрической кардиостимуляции (фиг. 2 и табл. 3). Это различие в регионарном кровотоке во время стимуляции сохранялось в течение продолжительности данного исследования, и картина изменения в кровотоке была различной между этими двумя районами (Р=0,006). Картина изменения в кровотоке в минуту между этими двумя районами во время стимуляции согласовалась при измерении в эндокардиальном (Р=0,006), среднестеночном (Р=0,002), эпикардиальном (Р=0,016) или траснсмуральном(пристеночном) (Р=0,003) отделах (табл. 3). В противоположность этому, когда электрокардиостимулятор был инактивирован, субэндокардиальный кровоток не обнаруживал регионарных различий при измерении в контрольном состоянии, на 14 день или на 21-28 день (фиг. 2 и табл. 3). Двухфакторный дисперсионный анализ (повторяемые измерения) использовали для определения,влияет ли на субэндокардиальный (ENDO) или трансмуральный (TRANS) кровоток продолжительность кардиостимуляции (время) или район (латеральная стенка, LAT; или межжелудочковая перегородка,IVS), или является ли картина изменений в кровотоке различной между этими двумя районами (между). Средние величины для кровотока в каждой временной точке испытывали на различия между этими двумя районами post hoc с использованием анализов Тьюки. Величины представляют среднееSD (стандартное отклонение) из 5 животных. Вкл.: микросферы инъецировали во время электрической стимуляции желудочка (225 ударов в минуту). Выкл.: электический стимулятор выключен. День 0=Контроль; День 14: 14 дней стимуляции; День 21-28: 21-28 дней стимуляции. Отношения эндокардиальный кровоток:эпикардиальный кровоток не изменялись значимо по мере прогрессирования сердечной недостаточности (Р=0,058). Однако с началом стимуляции сердца отношение эндокардиальный кровоток:эпикардиальный кровоток было существенно более низким в латераль- 30