Белок, имеющий в своей структуре цистиновые узлы

007611 Настоящее изобретение относится к новому белку INSP002, идентифицированному в настоящей заявке как секретируемый белок, т.е. как член семейства DAN, относящегося к суперсемейству цитокинов,имеющих в своей структуре цистиновые узлы, и к применению этого белка и последовательностей нуклеиновой кислоты кодирующего гена для диагностики, профилактики и лечения заболеваний. Все цитируемые публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте введены в настоящее описание посредством ссылки. Предшествующий уровень техники В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин "функциональная геномика" применяется к способам использования средств биоинформатики для определения функций исследуемых последовательностей белков. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научно-исследовательских лабораторий, занимающихся определением функций этих последовательностей белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных для этих последовательностей. Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастает, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков настоящего изобретения, могут давать окончательные результаты с достаточно высокой степенью достоверности. Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, для их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств, все еще остается актуальной. Общее описание секретируемых белков Способность клеток продуцировать и секретировать внеклеточные белки, является главным фактором во многих биологических процессах. Ферменты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса и молекулы, передающие сигналы, секретируются клетками посредством слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной. В большинстве случаев, но не всегда, белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум и в секреторные везикулы посредством сигнального пептида. Сигнальные пептиды представляют собой цис-активные последовательности, которые влияют на транспорт полипептидных цепей из цитоплазмы в мембрано-ассоциированный компартмент, такой как секреторная везикула. Полипептиды, которые нацелены на секреторные везикулы, либо секретируются во внеклеточный матрикс, либо удерживаются в плазматической мембране. Полипептиды, которые удерживаются в плазматической мембране, имеют один или более трансмембранных доменов. Примерами секретируемых белков, которые играют главную роль в функционировании клеток, являются цитокины, гормоны, белки внеклеточного матрикса (адгезивные молекулы), протеазы и факторы роста и дифференцировки. Факторы роста представляют собой относительно большую группу полипептидов, которые обладают общей способностью индуцировать размножение клеток как in vivo, так и in vitro. Факторы роста отличаются от классических эндокринных гормонов, таких как инсулин или гормон роста, по двум своим важным механизмами действия. Во-первых, эндокринные гормоны обычно синтезируются в конкретных железах (таких как поджелудочная железа, в случае инсулина), тогда как факторы роста часто синтезируются в клетках и тканях различных типов. Во-вторых, классические эндокринные гормоны высвобождаются в физиологические жидкости в области их синтеза и переносятся в кровотоке в их ткань-мишень. Важные отличительные свойства факторов роста заключаются в том, что в большинстве случаев они действуют только в тех тканях, в которых они синтезируются (см. Health. J.K. (1993) Growth Factors, Oxford University Press, Oxford, UK, pp.15-33). Хотя уровень сходства последовательностей факторов роста невысок, однако, по своему структурному и функциональному сходству, они могут быть подразделены на суперсемейства. Примерами таких суперсемейств являются:(a) гемопоэтические факторы роста, такие как гормон роста, IL-2, IL-4, G-CSF и CNTF, каждый из которых имеет структурный мотив в виде пучка из четырех спиралей;(c) EGF-подобные факторы роста, такие как EGF и TGF-альфа, каждый из которых имеет иммуноглобулин-подобный домен; и(d) факторы роста, имеющие в своей структуре цистиновые узлы, такие как NGF, TGF-бета, PDGF и гликопротеиновые гормоны. Факторы роста являются внеклеточными молекулами, и для осуществления своего биологического действия, они взаимодействуют со специфическими высокоаффинными рецепторами, локализованными на плазматических мембранах клеток-мишеней. Характеризация молекул ряда различных рецепторов факторов роста показала, что они могут быть разделены на определенные семейства: тирозинкиназные рецепторы, ассоциированные с G-белком рецепторы, состоящие из семи трансмембранных доменов, и-1 007611 серин/треонинкиназные рецепторы. Тирозинкиназные рецепторы отличаются тем, что они имеют внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, обладающий тирозинкиназной активностью. Серин/треонинкиназные рецепторы факторов роста имеют сходство с тирозинкиназными рецепторами, содержащими внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен. Внутриклеточный домен обладает присущей ему серин/треонинкиназной активностью. Нарушение регуляции факторов роста приводит к ряду патологических состояний, включая, но, не ограничиваясь ими, онкологические заболевания (Bartucci M. et al. (2001) Cancer Res. Sep. 15; 61(18):6747-54, Dias S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Sep.11;98(19):10857-62, Djavan B. et al.Sep. 199(Pt 3):231-40), неврологические заболевания (Cooper J.D. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(18):10439-44, Fahnestock M. et al. (2001) Mol. Cell. Neurosci 18(2):210-20) и метаболические заболевания (Vickers M.H. et al. (2001) Endocrinology 142(9):3964-73). Суперсемейство, имеющее в структуре цистиновые узлы Типичная структура, наблюдаемая у суперсемейства с цистиновыми узлами, основана на присутствии 6 цистиновых остатков, образующих 3 дисульфидных связи. Две из этих дисульфидных связей образуют "кольцеобразную" структуру, которая пронизана третьей дисульфидной связью (Sun et al. 1995). Домены "цистиновый узел" часто обнаруживают более чем 6 цистиновых остатков. Дополнительные цистиновые остатки обычно используются для образования других дисульфидных связей в домене "цистиновый узел" или межцепьевых дисульфидных связей во время димеризации. Это суперсемейство с "цистиновыми узлами" подразделяется на подсемейство, которое включает гликопротеиновые гормоны (например, фолликолустимулирующий гормон), белки трансформирующего фактора роста-бета (TGF-бета) (например, белок морфогенеза кости 4), белки, подобные тромбоцитарному фактору роста (PDGF-подобные белки) (например, тромбоцитарный фактор роста А), факторы роста нервных клеток (NGF) (например, нейротропный фактор головного мозга) и семейство отобранных методом дифференциального скрининга аберрантных генов в нейробластоме (DAN) (например, cerberus). Суперсемейство DAN включает Cerl, Cerberus, Caronte, Drm/Gremlin, PRDC, DAN Dante и CeCanl (Massague et al., Genes Dev. 2000 Mar. 15;14(6):627-44; MassagueWotton, EMBO J. 2000 Apr. 17;19(8):174554). Предполагается, что члены подсемейства DAN способны модулировать действие членов подсемейства белков TGF-бета (Pearce et al., Dev.Biol. 1999 May 1;209(1):98-110). Более конкретно, возможно, что члены подсемейства DAN способны модулировать действие белков морфогенеза кости (BMP) в процессе ее развития. Было обнаружено, что члены подсемейства DAN действуют как антагонисты белков морфогенеза кости (BMP), которые являются членами подсемейства TGF-бета, входящего в суперсемейство, имеющее домены "цистиновый узел" (Stanley et al., Mech.Dev. 1998 Oct, 77(2):173-84; Massague et al. 2000 (supra);Massague J.Wotton D, 2002 (supra. Мономеры BMP подвергаются гомо- или гетеродимеризации посредством связывания своих доменов "цистиновый узел", после чего они взаимодействуют с рецепторами клеточной поверхности. Считается, что члены подсемейства DAN способны связываться с BMP посредством их собственных доменов "цистиновый узел". Это приводит к предотвращению связыванияBMP с его природным партнером по димеризации, в результате чего, BMP теряет свою способность взаимодействовать со своим сигнальным рецептором, присутствующим на поверхности клетки. Эксперименты, конкретно направленные на DAN, Cerl и DRM, показали, что они ингибируют действие ВМР 4(Pearce et al., 1999 (см. выше. Более ясное понимание функции cerberus было достигнуто в результате исследования на связывание (Piccolo S. et al. Nature 1999 Feb. 25;397(6721):707-10). В первых функциональных исследованиях,проводимых на cerberus, использовали белок cerberus Xenopus laevis (cer). Микроинжекция мРНК cerberus Xenopus в эмбрионах Xenopus показала, что белок cer индуцирует образование эктопических головок в передней эндодерме организатора Спэманна (Bouwmeester et al. Nature 1996 Aug. 15;382(6592):595601; Bouwmeester T. Int., J. Dev. Biol. 200, 145(1 Spec No):251-8). Исследования на связывание, проведенные Piccolo и сотрудниками; показали, что белок cerberus Xenopus связывается с белками Nodal, BMP иWnt через независимые сайты и ингибирует их действие. Более конкретно, эти исследователи обнаружили, что белок cerberus обладает высокоспецифичной аффинностью и ингибирующим действием по отношению к Xnr-1 (члену семейства Nodal), ВМР 4 (члену семейства BMP) и Xwmt-8 (члену семейства Wnt). В этой работе была установлена взаимосвязь cerberus, а, следовательно, и других членов семейства DAN с путями эволюции и дифференцировки тканей. Склерозтин, кодируемый геном SOST, также является членом подсемейства DAN (Brumkow et al.,2001, Am. J. Hum. Genet. 68:577-589). Ген SOST ассоциируется со склеростеозом, т.е. склерозирующей дисплазии кости, наследуемой по аутосомно-рецессивному типу. Фенотип, ассоциируемый со склеростеозом, представляет собой прогрессирующее разрастание склетных костей, которое приводит к гигантизму, деформации лица и к ущемлению седьмого и восьмого черепных нервов (Brumkow et al. 2001 (см. выше. Взаимосвязь между склеростеозом и SOST была установлена посредством картирования по го-2 007611 мозиготности семей, подверженных указанному заболеванию. Brumkow и сотрудники идентифицировали сходство между фенотипом, ассоциированным со склеростеозом, и эффектами, ассоциированными с другими членами подсемейства DAN. Аргумент в пользу такой взаимосвязи является еще более убедительным, если предположить, что склеростеоз может быть обусловлен потерей негативного регулятора для члена подсемейства TGF-бета, а более конкретно, BMP. Поэтому, идентификация секретируемых белков и, в частности, факторов роста, таких как члены суперсемейства, имеющие в своей структуре цистиновые узлы, в частности, члены подсемейства DAN,является крайне необходимой для лучшего понимания основных путей, которые приводят к развитию приведенных выше патологических состояний и ассоциированных с ними заболеваний, приведенных выше, и для разработки более эффективных методов генотерапии или лекарственной терапии указанных заболеваний. Описание изобретения Настоящее изобретение основано на обнаружении функций белка INSP002, действующего как секретируемый белок, в частности, как секретируемый белок подсемейства DAN, входящего в суперсемейство, имеющего "цистиновые узлы" в своей структуре. В первом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, который(ii) представляет собой ее фрагмент, который обладает функцией секретируемого белка, предпочтительно, функцией члена суперсемейства цитокинов с цистиновыми узлами, более предпочтительно, члена подсемейств DAN, или который имеет общую с полипептидом (i) антигенную детерминанту; или(iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii). Предпочтительно, полипептид первого аспекта настоящего изобретения:(ii) представляет собой его фрагмент, который обладает функцией секретируемого белка, предпочтительно, функцией члена суперсемейства цитокинов с цистиновыми узлами, более предпочтительно,члена подсемейств DAN, либо который имеет общую с полипептидами (i) антигенную детерминанту; или(iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii). В соответствии с другим вариантом своего первого аспекта, настоящее изобретение относится к полипептиду, которыйi) состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8;(ii) представляет собой его фрагмент, который обладает функцией секретируемого белка, предпочтительно, функцией члена суперсемейства цитокинов с цистиновыми узлами, более предпочтительно,члена подсемейств DAN, или который имеет общую с полипептидом (i) антигенную детерминанту; или(iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii). Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, будет далее называться "полипептид экзона 1 INSP002". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ IDNO:4, будет далее называться "полипептид экзона 2 INSP002". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:6, будет далее называться "полипептидом INSP002". Первые 22 аминокислоты полипептида экзона 1 INSP002 представляют собой сигнальный пептид, а последовательности полипептида INSP002 без сигнальной последовательности представлены в SEQ ID NO:7 и SEQ IDNO:8. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, будет далее называться "полипептид экзона 1 INSP002 без сигнального пептида". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:8, будет далее называться "полипептидом INSP002 без сигнального пептида". В соответствии с другим вариантом своего первого аспекта, настоящее изобретение относится к полипептиду, которыйi) содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:14;(ii) представляет собой его фрагмент, который обладает функцией секретируемого белка, предпочтительно, функцией члена суперсемейства цитокинов с цистиновыми узлами, более предпочтительно,члена подсемейств DAN, или который имеет общую с полипептидом (i) антигенную детерминанту; или(iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii). Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, представляет собой вариант полипептида INSP002. Он идентичен полипептиду INSP002, за исключением того, что по сравнению с полипептидом INSP002, содержит две аминокислотные делеции в положениях 107 и 108 и одну аминокислотную замену в положении 110. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, далее будет называться "вариантом полипептида INSP002". Предпочтительно полипептид первого аспекта настоящего изобретения функционирует как член суперсемейства цитокинов, имеющих в своей структуре цистиновые узлы, предпочтительно как член-3 007611 подсемейства DAN. Термин "цитокин с цистиновыми узлами" хорошо известен, и специалист с помощью одного из известных анализов, может легко установить, функционирует ли данный полипептид как член суперсемейства цитокинов, имеющих цистиновые узлы в своей структуре. В частности, специалист с помощью одного из известных анализов может легко установить, функционирует ли данный полипептид как член подсемейства DAN, и является ли он антагонистом членов суперсемейства TGF-бета, в частности, антагонистом BMP. Для того чтобы определить, функционирует ли полипептид как антагонист BMP, в качестве системы для анализа может быть использован эмбрионThomsen. 1995, Dev. Genet. 17:78-89, Jones CM. et al., 1992, 10 Development 115:639-647). Сверхэкспрессия сигналов ВМР-2/4-класса или ВМР-7-класса в ранней мезодерме индуцирует вентральные пути, в то время как ингибиторы этих сигналов (такие как Noggin, Xnr3, Chordin или Follistatin) индуцируют дорсальные пути. Поэтому действие полипептида на эмбриональное развитие может быть использовано для того, чтобы определить является ли данный полипептид антагонистом BMP. Используемый термин "полипептид INSP002" включает полипептиды, содержащие полипептид экзона 1 INSP002, полипептид экзона 1 INSP002 без сигнального пептида, полипептид экзона 2 INSP002,полипептид INSP002 или полипептид INSP002 без сигнального пептида, а также полипептиды, состоящие из полипептида экзона 1 INSP002, полипептида экзона 1 INSP002 без сигнального пептида, полипептида экзона 2 INSP002, полипептида INSP002, полипептида INSP002 без сигнального пептида или варианта полипептида INSP002. Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид первого аспекта настоящего изобретения. При этом предпочтительно, чтобы указанная очищенная молекула нуклеиновой кислоты содержала последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NО:1 (кодирующую полипептид экзона 1 INSP002), в SEQ ID NО:3 (кодирующую полипептид экзона 2 INSP002), в SEQ ID NО:5 (кодирующую полипептид INSP002) или в SEQ ID NО:13 (кодирующую вариант полипептида INSP002), или представляла собой избыточный эквивалент или фрагмент любой из этих последовательностей. Настоящее изобретение также относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NО:1 (кодирующей полипептид экзона 1 INSP002), в SEQ ID NО:3 (кодирующей полипептид экзона 2 INSP002), в SEQ ID NО:5 (кодирующей полипептид INSP002) или в SEQ ID NО:13 (кодирующей вариант полипептида INSP002), или представляющей собой избыточный эквивалент или фрагмент любой из этих последовательностей. В соответствии с одним из вариантов этого аспекта настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты не содержит 5'-нетранслируемую область, расположенную выше последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид экзона 1 INSP002 и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид INSP002 (нуклеотиды 1-151 SEQ ID NО:1 и SEQ ID NО:5). В соответствии с этим вариантом настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно, содержит нуклеотиды 152-475 SEQ ID NО:1 или нуклеотиды 152-721 SEQ ID NО:5. Настоящее изобретение, кроме того, относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидов 152-475 SEQ ID NО:1 или нуклеотидов 152-721 SEQ ID NО:5. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид INSP002 без 5'-нетранслируемой области (нуклеотиды 152-721 SEQID NО:5), представлена в SEQ ID NО:11, а нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид экзона 1 INSP002 без 5'-нетранслируемой области (нуклеотиды 152-475 SEQ ID NО:1), представлена вSEQ ID NО:12. В соответствии с другим вариантом этого аспекта настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты не кодирует сигнальный пептид, расположенный в начале полипептида экзона 1INSP002 и полипептида INSP002 (нуклеотиды 152-217 SEQ ID NО:1 и SEQ ID NО:5). В соответствии с этим вариантом настоящего изобретения, очищенная молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно,содержит нуклеотиды 218-475 SEQ ID NО:1 (кодирующие полипептид экзона 1 INSP002 без сигнального пептида) или нуклеотиды 218-721 SEQ ID NО:5 (кодирующие полипептид INSP002 без сигнального пептида). Настоящее изобретение, кроме того, относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидов 218-475 SEQ ID NО:1 (кодирующих полипептид INSP002 без сигнального пептида) или нуклеотидов 218-721 SEQ ID NО:5 кодирующих полипептид INSP002 без сигнального пептида). Нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый полипептид INSP002 (SEQ ID NО:7), представлена в SEQ ID NО:9, а нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый полипептид экзона 1INSP002, представлена в SEQ ID NО:10. В соответствии с другим вариантом этого аспекта настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты не содержит 5'-нетранслируемую область, расположенную выше последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида INSP002 (нуклеотиды 1-68 SEQ ID NО:13). В соответствии с этим вариантом настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты,предпочтительно, содержит нуклеотиды или состоит из нуклеотидов 69-719 SEQ ID NО:13. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант полипептида INSP002 без 5'-нетранслируемой области(нуклеотиды 69-719 SEQ ID NО:13) представлена в SEQ ID NО:15. В третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты,которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты второго аспекта настоящего изобретения. В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения. В пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному вектором четвертого аспекта настоящего изобретения. В шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с полипептидом первого аспекта настоящего изобретения, обладающим активностью цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, и который, предпочтительно, ингибирует такую активность. При этом предпочтительно, чтобы лиганд ингибировал функцию полипептида первого аспекта настоящего изобретения, который является членом подсемейства DAN цитокинов, имеющих цистиновые узлы в своей структуре. Лиганды для полипептида настоящего изобретения могут образовывать различные формы,включая природные или модифицированные субстраты, ферменты, рецепторы, небольшие органические молекулы, такие как небольшие природные или синтетические органические молекулы, имеющие молекулярную массу до 2000 Да, предпочтительно, 800 Да или менее, пептидомиметики, неорганические молекулы, пептиды, полипептиды, антитела, структурные или функциональные миметики приведенных выше соединений. В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое эффективно модифицирует экспрессию природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или регулирует активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения. Соединение седьмого аспекта настоящего изобретения может либо повышать (служить агонистом),либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида. Важно отметить, что идентификация функции полипептида INSP002 дает возможность разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний. В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду первого аспекта настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или к вектору четвертого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду пятого аспекта настоящего изобретения, или к соединению шестого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики. Эти молекулы могут быть также использованы для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения клеточно-пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний. В девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у человека, включающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или уровня активности полипептида первого аспекта настоящего изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют in vitro. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем рецидива заболевания. В соответствии с девятым и десятым аспектами настоящего изобретения расстройством или заболеванием, предпочтительно, является расстройство или заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, предпочтительно, члена подсемейства DAN. Заболеванием или расстройством может быть заболевание или расстройство, которое ассоциируется с аберрантными уровнями лиганда для цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, предпочтительно, для члена подсемейства DAN. Так, например, таким заболеванием или расстройством может быть расстройство или заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями члена суперсемейства TGF-бета. В частности, указанным заболеванием или расстройством может быть заболевание или расстройство, которое ассоциируется с BMP, такое как невропатия, нефропатия, такая как диабетическая нефропатия, рак, заживление ран, фиброз, остеопения, остеопороз, переломы и склеростеоз. Предпочтительный способ детекции полипептидов первого аспекта настоящего изобретения включает стадии;(a) контактирования лиганда шестого аспекта настоящего изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и-5 007611 Что касается девятого аспекта настоящего изобретения, то каждому специалисту известно, что для детекции аномальных уровней белка существуют различные методы, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точечную мутацию, метод амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы, в которых используются антитела. Аналогичные методы могут быть использованы в течение коротких или продолжительных промежутков времени, что позволяет наблюдать за терапевтическим лечением заболевания пациента. Настоящее изобретение также относится к набору, который может быть использован в указанных методах диагностики заболевания. В десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида первого аспекта настоящего изобретения в качестве секретируемого белка. Предпочтительно, настоящее изобретение относится к применению полипептида первого аспекта настоящего изобретения в качестве цитокина,более предпочтительно, в качестве цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, в частности, в качестве члена подсемейства DAN цитокинов, имеющих цистиновые узлы в своей структуре. В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид первого аспекта настоящего изобретения или молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или вектор четвертого аспекта настоящего изобретения, или клетку-хозяина пятого аспекта настоящего изобретения, или лиганд шестого аспекта настоящего изобретения, или соединения седьмого аспекта настоящего изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. В двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду первого аспекта настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или к вектору четвертого аспекта настоящего изобретения, или к клетке-хозяину пятого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду шестого аспекта настоящего изобретения, или к соединению седьмого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы для производства лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний. В тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида первого аспекта настоящего изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения,или вектора четвертого аспекта настоящего изобретения, или лиганда шестого аспекта настоящего изобретения, или соединения седьмого аспекта настоящего изобретения. В соответствии с двенадцатым и тринадцатым аспектами настоящего изобретения заболеванием является, предпочтительно, заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями цитокина,имеющего цистиновые узлы в своей структуре, а предпочтительно, члена подсемейства DAN. Таким заболеванием может быть заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями лиганда для цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, а предпочтительно, лиганда для члена подсемейства DAN. Так, например, таким заболеванием может быть заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями члена суперсемейства TGF-бета. В частности, указанным заболеванием или расстройством может быть заболевание или расстройство, которое ассоциируется с BMP, такое как невропатия, нефропатия, такая как диабетическая нефропатия, рак, заживление ран, фиброз, остеопения, остеопороз, переломы и склеростеоз. Для заболеваний, при которых у пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или при которых активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента,полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту,должны обладать агонистическими свойствами. И, наоборот, для заболеваний, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или при которых активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения выше,чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты,рибозимы и лиганды, такие как антитела. В четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным или к дефицитным по данному полипептиду животным, которые не являются человеком и которые были трансформированы так, чтобы они экспрессировали более высокие или более низкие уровни или вообще не экспрессировали полипептида первого аспекта настоящего изобретения. Такие трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний, и могут быть также использованы в способах скрининга для идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики такого заболевания. Краткое описание стандартных способов и методик, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения, приводится ниже. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно описанными способами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология приводится лишь в целях опи-6 007611 сания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения. В данном описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот. Если не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы,стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области. Более полное описание таких методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящие описания, которые могут быть использованы для консультации, приводятся в следующих работах:Blackwell eds. 1986). Используемый термин "полипептид" включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами. Этот термин относится к коротким цепям (пептидам или полипептидам) и к более длинным цепям (белкам). Полипептид настоящего изобретения может присутствовать в форме зрелого белка, либо он может присутствовать в виде пре-, про- или препро-белка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препро-части этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах пре-, про- или препро-последовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность, либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности. Полипептид первого аспекта настоящего изобретения может образовывать часть гибридного белка. Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или более дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, про-последовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, например, к соединению, увеличивающему время полужизни полипептида (например, к полиэтиленгликолю). Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации,хорошо известных специалистам в данной области. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах настоящего изобретения, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ADP-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образованиеGPI-якоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг,фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование и убихитинизация. Модификации могут присутствовать в любом участке полипептида, включая пептидный остов,аминокислотные боковые цепи и амино- или карбокси-концы. Действительно, блокирование амино- или карбокси-конца в полипептиде, либо того и другого, посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения. Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев, будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептида, которые получены рекомбинантным методом, природа и степень модификации, по большей части, будет определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в амино-7 007611 кислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, картины гликозилирования могут варьироваться у различных типов клеток-хозяина. Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов. Функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептидам INSP002. Два полипептида могут быть определены термином "гомологичные", если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин "идентичность означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин "сходство" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко определена. (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York,1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993;Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например,аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых они происходят), и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептидов INSP002. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или более аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно, консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между Ala, Val, Leu и Ile; между Ser и Thr; между кислотными остатками Asp и Glu; между Asn и Gln; межу основными остатками Lys и Arg; или между ароматическими остатками Phe и Tyr. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, т.е. от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот или только одна аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно предпочтительными являются"молчащие" замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Также предпочтительными являются консервативные замены. Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или более аминокислотных остатков включают группу-заместитель. Обычно считается, что два полипептида, имеющие более чем 30% идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения имели степень идентичности последовательности полипептидаINSP002 или его активных фрагментов, составляющую более 35%. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие степень идентичности более чем 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99% или более соответственно. Функционально эквивалентными полипептидами первого аспекта настоящего изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или более методов сопоставления структур. Так, например, для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности полипептидам INSP002, делается предположение, что они обладают активностью секретированной молекулы, где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с последовательностями полипептида INSP002,может быть использована технология информационной обработки потока данных для генома (Inpharmatica Genome Threader), которая составляет один из аспектов методов поиска, используемых для генерирования базы данных поиска Biopendium (см. совместно рассматриваемую заявку на патент Великобритании, PCT/GB01/01105). Термин "значительная структурная гомология" означает, что технологияInpharmatica Genome Threader позволяет предсказать, с достоверностью 10% и выше, что два белка имеют структурную гомологию. Полипептиды первого аспекта настоящего изобретения также включают фрагменты полипептидовINSP002 и фрагменты функциональных эквивалентов полипептидов INSP002, при условии, что эти фрагменты сохраняют активность цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, а предпочтительно, активность члена подсемейства DAN, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, либо они имеют антигенную детерминанту, общую для полипептидов INSP002. Используемый здесь термин "фрагмент" означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая идентична части, но не всей, аминокислотной последовательности полипептидовINSP002, либо одному из их функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать, по крайней мере n смежных аминокислот последовательности, и в зависимости от конкретной последова-8 007611 тельности, n, предпочтительно, равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту. Указанные фрагменты могут присутствовать в "свободной форме", т.е. не являться частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам, либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют. Если фрагмент настоящего изобретения входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно,чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Так, например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фрагменту, имеющему пре- и/или про-полипептидную область, присоединенную к амино-концу указанного фрагмента, и/или дополнительную область,присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. При этом в состав одного более крупного полипептида могут входить несколько фрагментов. Полипептиды настоящего изобретения или их иммуногенные фрагменты (содержащие, по крайней мере одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов,экспрессирующих полипептиды настоящего изобретения, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для специалиста, такие антитела, помимо других применений, могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств. Термин "иммуноспецифический" означает, что антитела имеют, в основном, более высокую аффинность к полипептидам настоящего изобретения, чем к другим родственным полипептидам известного уровня. Используемый здесь термин "антитело" означает интактные молекулы, а также их фрагменты,такие как Fab, F(ab')2 и Fv, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Такие антитела связываются с полипептидами первого аспекта настоящего изобретения. Под понятием "значительно более высокая аффинность" подразумевается заметно повышенная аффинность к полипептиду настоящего изобретения по сравнению с аффиностью известных секретируемых белков. При этом, предпочтительно, чтобы аффинность к полипептиду настоящего изобретения, по крайней мере, в 1,5, 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105 или 106 раз превышала аффинность к известным секретируемым белкам, таким как цитокины, имеющие цистиновые узлы в своей структуре, в частности, таким как члены подсемейства DAN. Если желательно использовать поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизовано полипептидом первого аспекта настоящего изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Затем связанный полипептид может быть использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например, иммуноаффинной хроматографией. Моноклональные антитела против полипептидов первого аспекта настоящего изобретения могут быть легко продуцированы любым специалистом. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной техники хорошо известна в данной области (см. например, Kohler G.Milstein, С. Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al. Immunology Today 4:72(1983); Cole et al., 77-96,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985. Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов первого аспекта настоящего изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, т.е. на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными в данной области, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах. Могут быть также использованы химерные антитела, в которых не-человеческие вариабельные области соединены или лигированы с человеческими константными областями (см. например, Liu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987. Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например, путем их "гуманизации", см. Jones et al. Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al. Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al. J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al. Proc. Nati Acad. Sci. USA, 86,10029 (1989); Gorman et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 88, 34181 (1991); and Hodgson et al, Bio/Technology,9, 421 (1991. Используемый термин "гуманизованное антитело" означает молекулы антитела, в которых аминокислоты CDR и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но, при этом, оно обладает способностью связываться с донорным антителом.-9 007611 В другом альтернативном варианте изобретения, таким антителом может быть "биспецифическое" антитело, т.е. антитело, имеющее два различных антиген-связывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам. Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами настоящего изобретения, либо из набора ПЦР-амплифицированных V-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки "необученных" лимфоцитов, может быть использована техника фагового представления (McCafferty J. et al. (1990),Nature 348, 552-554; Marks J. et al. (1992), Biotechnology 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также увеличена путем перестановки цепей (Clackson Т. et al. (1991), Nature 352, 624-628) . Антитела, генерированные описанными выше методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, т.е. они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ELISA). Для этих целей антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент. Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения являются молекулы, которые кодируют полипептидные последовательности, представленные в SEQ ID NО:2, SEQ ID NО:4, SEQ ID NО:7, SEQ ID NО:6, SEQ ID NО:8 и SEQ ID NО:14, и функционально эквивалентные полипептиды. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в способах и для целей, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, предпочтительно, содержат, по крайней мере n смежных нуклеотидов в описываемых последовательностях, и в зависимости от конкретной последовательности, n предпочтительно, равно 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более). Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также включают последовательности,комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов). Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, таким как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, выделение из геномных или кДНК-библиотек или выделение из микроорганизма. РНК-молекулы могут быть, в основном, генерированы путем in vitro- или in vivo-транскрипции ДНК-последовательностей. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" также охватывает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги,содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (PNA). Используемый термин "PNA" означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий, по крайней мере, из пяти нуклеотидов, и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые, предпочтительно, заканчиваются лизином. Концевой лизин предает данной композиции растворимость. PNA могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они предпочтительно, связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК и приостанавливают элонгацию транскрипта (Nielsen Р.Е. et al. (1993), Anticancer Drug Des. 8:53-63). Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид SEQ ID NО:2, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NО:1 (нуклеотиды 152-475), и представлена в SEQ ID NО:12. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:7, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NО:1 (нуклеотиды 218-475), и представлена в SEQ ID NО:10. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид SEQ ID NО:4, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NО:3. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид SEQ ID NО:6, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NО:5 (нуклеотиды 152-721),и представлена в SEQ ID NО:11. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид SEQ IDNО:8, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NО:5 (нуклеотиды 218-721), и представлена в SEQ ID NО:9. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид SEQ ID NО:14, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NО:13 (нуклеотиды 69-719), и представлена в SEQ ID NО:15. Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые, вследствие вырожденности генетического кода, кодируют полипептид SEQ ID NО:2, SEQ ID NО:4, SEQ ID NО:7, SEQ IDNО:6, SEQ ID NО:8 или SEQ ID NО:14. Такими молекулами нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид SEQ ID NО:2, SEQ ID NО:4, SEQ ID NО:7, SEQ ID NО:6, SEQ ID NО:8 или SEQ ID NО:14,- 10007611 могут быть, но не ограничиваются ими, кодирующая последовательность для отдельного зрелого полипептида; кодирующая последовательность для зрелого полипептида вместе с другими кодирующими последовательностями, такими как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препро-полипептидную последовательность; кодирующая последовательность зрелого полипептида с приведенными выше дополнительными кодирующими последовательностями или без них, либо вместе с дополнительными некодирующими последовательностями,включая некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибированные нетранслированные последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации) и в связывании с рибосомой и обеспечивают стабильность мРНК. Молекулами нуклеиновой кислоты могут также включать вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами. Молекулы нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов первого аспекта настоящего изобретения. Такая молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо указанной молекулой может быть вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты,к клеткам или к целым организмам. Из рассматриваемых вариантов можно отметить варианты, которые отличаются от приведенных выше молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Замены, делеции или инсерции могут быть осуществлены по отношению к одному или более нуклеотидам. Варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой области. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям. Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также сконструированы методами, в основном, известными в данной области, включая, в зависимости от различных целей, модификацию клонирования, процессинга и/или экспрессии генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки с помощью ПЦР генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т.п. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид первого аспекта настоящего изобретения, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят во второй или третий аспект настоящего изобретения. Так, например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным экспрессировать гибридный белок, который будет распознаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок может быть также сконструирован таким образом, чтобы он содержал сайт расщепления, расположенный между последовательностью полипептида настоящего изобретения и последовательностью гетерологичного белка, и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из указанного гетерологичного белка. Молекулами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также антисмысловые молекулы, которые являются частично комплементарными молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды настоящего изобретения, и поэтому, они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (в результате гибридизации). Антисмысловые молекулы, такие как олигонуклеотиды,могут быть сконструированы так, чтобы они распознавали нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид настоящего изобретения, специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и предупреждали ее транскрипцию, в соответствии с методами, хорошо известными специалистам (см. например, Cohen J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J.Dervan et al. Science 251, 1360 (1991. Используемый термин "гибридизация" означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем эти две молекулы могут контактировать друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются: тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или BLOTTO); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (сульфата декстрана или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации (Sambrook et al.[см. выше]). Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного в данной области (Sambrooket al. [см. выше]). В основном, гомологичная молекула будет затем конкурировать с полностью гомологичной молекулой за связывание с молекулой-мишенью и ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у Wahl G.M. и S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) и KimmelA.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511). Термин "жесткость" означает условия реакции гибридизации, которые способствуют ассоциации наиболее сходных молекул, но не ассоциации молекул, не обладающих таким сходством. Условия гибридизации высокой жесткости определены как условия инкубирования в течение ночи при 42 С в растворе, содержащем 50% формамид, 5X SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия(рН 7,6), 5 х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1X SSC приблизительно при 65 С. Условия низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35 С (Sambrook et al. [см.выше]). Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости. В предпочтительных вариантах этого аспекта, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по крайней мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды INSP002 (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ IDNO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:14), и к молекулам нуклеиновой кислоты, которые, в основном, комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения, предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая, по всей своей длине, по крайней мере, на 80% идентична кодирующим последовательностям для SEQ IDNO:2 и SEQ ID NO:7, представленным в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:12; кодирующей последовательности для SEQ ID NO:4, представленной в SEQ ID NO:3; кодирующим последовательностям для SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:8, представленным в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:11; или кодирующим последовательностям для SEQ ID NO:14, представленным в SEQ ID NO:13 и SEQ IDNO:15; либо, чтобы она представляла собой комплементарную им молекулу нуклеиновой кислоты. При этом особенно предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине были по крайней мере на 90%, более предпочтительно по крайней мере на 95%, особенно предпочтительно по крайней мере на 98% или 99% идентичны указанным последовательностям. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают, в основном, такой же биологической функцией или активностью, что и полипептиды INSP002. Настоящее изобретение относится к способу детекции молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, включающему стадии:(а) контактирования нуклеинового зонда настоящего изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов; и(b) детекции любого такого образованного дуплекса. Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептиды INSP002, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных и ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими этот полипептид. В этой связи, наряду с другими известными методами, могут быть использованы описанные и обсуждаемые методы, которые приводятся ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны и, в основном, доступны в данной области, и могут быть реально использованы для осуществления многих вариантов настоящего изобретения, обсуждаемых в настоящей заявке. В указанных методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, секвеназа (US Biochemical Corp., Cleveland, ОН), полимераза Taq (Perkin Elmer), термостабильная полимераза Т 7 (Amersham, Chicago, IL) или комбинация таких полимераз и корректирующие экзонуклеазы, такие как экзонуклеазы, присутствующие в ELONGASE Amplification System, и поставляемые Gibco/BRL(Gaithersburg, MD) . Способ секвенирования может быть, предпочтительно, автоматизирован с использованием устройств, таких как аппарат Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), термоячейка PeltierDNA Sequencers (Perkin Elmer). Одним из методов выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с функцией, эквивалентной функции полипептида INSP002, является зондирование библиотеки геномных ДНК или кДНК природным или искусственно сконструированным зондом с использованием стандартных методик, известных в данной области (см. например, "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al.(eds). Greene Publisching Associates and Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Особенно подходящими являются зонды, содержащие 15, предпочтительно по крайней мере 30, более предпочтительно по край- 12007611 ней мере 50 непрерывно следующих друг за другом оснований, которые соответствуют или комплементарны последовательностям нуклеиновой кислоты, происходящей от соответствующего кодирующего гена (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ IDNO:12, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:15). Для облегчения идентификации такие зонды могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом. Подходящими реагентами являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемого продукта. С использованием этих зондов специалист может самостоятельно выделить комплементарные копии полинуклеотидов геномной ДНК, кДНК или РНК, кодирующих представляющие интерес белки, происходящие от различных источников, например человека, млекопитающего или других животных, и скринировать эти источники на присутствие родственных последовательностей,например отдельных членов семейства, типа и/или подтипа. Во многих случаях выделенные кДНК-последовательности будут неполными, т.е. в этих последовательностях область, кодирующая полипептид, будет обрезана обычно у 5'-конца. Для получения полноразмерных кДНК или для удлинения коротких кДНК существует несколько методов. Такие последовательности можно удлинить с использованием неполной нуклеотидной последовательности и с применением различных известных в данной области методов детекции расположенных выше последовательностей, таких как промоторы и регуляторные элементы. Так, например, одним из методов, который может быть использован в данном случае, является метод быстрой амплификации кДНК-концов (RACE; см.,например, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1998). Недавно разработанные модификации этой технологии, проиллюстрированные Marathon TM (Clontech Laboratories Inc.), значительно упростили поиск более длинных кДНК. Для поиска неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, которая является смежной с известным локусом, может быть использован слегка модифицированный метод, который называется "сайт-рестрикционной" ПЦР и предусматривает использование универсальных праймеров (Sarkar G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). Для амплификации или для удлинения последовательностей с использованием различных праймеров, полученных на основе известной области, может быть также использована обратная ПЦР (Triglia T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186). Другим методом, который может быть использован в данном случае, является ПЦР "с захватом", которая представляет собой ПЦР-амплификацию ДНК-фрагментов, смежных с известной последовательностью в искусственной хромосомной ДНК человека и дрожжей (Lagerstrom M. et al. (1991) PCR Methods Applic. 1, 111119). Другим методом, который может быть использован для поиска неизвестных последовательностей,является метод Parker J.D. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060). Кроме того, можно использовать ПЦР, "гнездовые" праймеры и библиотеки PromoterFinderTM для "прогулки" по геномной ДНК(Clontech, Palo Alto, CA). Этот способ позволяет избежать необходимости скрининга библиотек и может быть использован для обнаружения участков стыка интрон/экзон. При скрининге на полноразмерные ДНК предпочтительно использовать библиотеки, которые были отобраны по размерам и содержат более крупные кДНК. Предпочтительными также являются библиотеки рандомизированных праймеров, которые могут включать дополнительные последовательности, содержащие 5'-области генов. Использование библиотеки рандомизированных праймеров может оказаться особенно предпочтительным в том случае, если библиотека oligo-d(T) не дает полноразмерной кДНК. Геномные библиотеки могут быть использованы для удлинения последовательности с получением 5'нетранскрибированных регуляторных областей. В одном из вариантов осуществления изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть использованы для определения локализации в хромосоме. В этом методе молекула нуклеиновой кислоты может быть нацелена на конкретный участок, либо она может быть гибридизована с конкретным участком на отдельной хромосоме человека. В соответствии с настоящим изобретением, картирование релевантных последовательностей в хромосомах является важным звеном в подтверждении корреляции этих последовательностей с геноассоциированным заболеванием. После картирования последовательности с определением ее точной локализации, физическое положение последовательности на хромосоме может быть сопоставлено с данными генетической карты. Эти данные можно найти, например, в работе V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (имеющейся в настоящее время вJohn Hopkins University Welch Medical Library). Взаимосвязь между генами, которые могут быть картированы на одной и той же области хромосомы, и заболеваниями, ассоциированными с ними, затем идентифицируют с помощью анализа на сцепление генов (совместное наследование физически смежных генов). Это позволяет исследователям получить ценную информацию, которая может быть использована для поиска генов, ассоциированных с данным заболеванием, с применением метода позиционного клонирования или других методов обнаружения генов. После предварительного определения локализации генов, ассоциированных с данным заболеванием или синдромом, путем анализа на сцепление генов с конкретной областью генома, любое картирование последовательностей на данном участке может дать информацию об ассоциированных или регуляторных генах, которая может быть использована для последующих исследований. Молекула нуклеиновой кислоты может быть также использована для детекции различий в хромосомной локализации, обусловленных транслокацией, инверсией и т.п., у нормальных индивидуумов, индивидуумов-носителей и у индивидуумов с заболеванием.- 13007611 Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также являются ценным материалом для определения локализации в тканях. Такие методы позволяют определять характер экспрессии полипептида в тканях путем детекции мРНК, которая их кодирует. Такими методами являются методы гибридизации in situ и методы амплификации нуклеотидов, такие как ПЦР. Результаты этих исследований позволили получить определенные сведения относительно нормальных функций данного полипептида в организме. Кроме того, в этих исследованиях сравнение нормального характера экспрессии мРНК с экспрессией мРНК, кодируемой мутантным геном, позволяет получить важную информацию о роли мутантных полипептидов в заболевании. Такая аномальная экспрессия может иметь кратковременную, пространственную или количественную природу. Для ингибирования эндогенной экспрессии гена, кодирующего полипептид настоящего изобретения, могут быть также использованы методы "отключения" гена. Одним из методов, который может быть использован для "отключения" последовательность-специфического посттрансляционного гена, является интерференция РНК (RNAi) (Elbashir S.M. et al. Nature 2001, 411, 494-498). Короткие дцРНК-олигонуклеотиды синтезируют in vitro и вводят в клетку. Последовательность-специфическое связывание этих дцРНК-олигонуклеотидов запускает процесс деградации мРНК-мишени, приводит к снижению уровня или к отмене экспрессии целевого белка. Эффективность методов "отключения" гена, описанных выше, может быть оценена путем определения уровня экспрессии полипептидов (например, с помощью Вестерн-блоттинга), и на РНК-уровне - с помощью методики, основанной на TaqMan. Векторы настоящего изобретения содержат молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы. Клетки-хозяева настоящего изобретения, которые могут быть трансформированы, трансфецированы или трансдуцированы векторами настоящего изобретения, могут представлять собой прокариотические или эукариотические клетки-хозяева. Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти полипептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам, и многие из них подробно описаны у Sambrook et al. (см. выше) и FernandezHoeffler (1998, eds. "Gene expression systems. Usingnature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto). Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы, в основном, любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспрессионную систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у Sambrook et al. (см. выше). В общих чертах, кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания с рибосомой (для экспрессии в бактериях) и необязательно оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине. Примерами подходящих систем экспрессии являются, например, хромосомная, эписомная и вирусные системы, включая, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофага,транспозонов, дрожжевых эписом, инсерционных элементов, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирус, паповавирусы, такие как SV40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы домашней птицы, псевдорабивирусы и ретровирусы, или их комбинации, а также векторы, происходящие от плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включая космиды и фагмиды. Для доставки более крупных фрагментов ДНК, чем те, которые могут содержаться и экспрессироваться в плазмиде, могут быть также использованы искусственные человеческие хромосомы (НАС). Особенно подходящими экспрессионными системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНКэкспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными зкспрессирующими векторами (например,бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом мозаики табака, TMV) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Ti или pBR322); или клеточные системы животных. Для продуцирования полипептидов настоящего изобретения могут быть также использованы бесклеточные системы трансляции. Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид настоящего изобретения, в клетки-хозяева может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах, таких как руководство Davis et al. I Basic Methods in Molecular Biology (1986) и Sambrook et al.[см. выше]. Особенно подходящими методами являются трансфекция с использованием фосфата кальция; трансфекция, опосредованная DEAE-декстраном; трасвекция; микроинжекция; трансфекция, опосредованная катионным липидом; электропорация; трансдукция; загрузка путем соскоба; введение методом биобаллистики или инфицирование (см. Sambrook et al., 1989, [см. выше], Ausubel et al. [см. выше],- 14007611Spector, GoldmanLeinwald, 1998). В эукариотических клетках экспрессионные системы, в зависимости от целей их использования, могут быть либо временными (например, эписомными), либо перманентными (хромосомная интеграция). Кодирующая молекула нуклеиновой кислоты может включать, а может и не включать последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид, или лидерную последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого полипептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду, либо они могут быть гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при посттрансляционном процессинге. Помимо регуляторных последовательностей может оказаться желательным введение регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии полипептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и 3'-нетранслируемые области. Эти последовательности взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Такие регуляторные последовательности могут варьироваться по своей длине и специфичности. В зависимости от выбранной векторной системы и выбранного хозяина могут быть использованы любые подходящие транскрипционные и трансляционные элементы, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Так, например, для клонирования в бактериальных системах могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор lacZ фагмиды BlueScript (Stratagene,LaJolla, CA) или плазмиды pSportlTM (Gibco BRL) и т.п. В клетках насекомых может использоваться бакуловирусный промотор полиэдрина. Промоторы или энхансеры, происходящие от геномов растительных клеток (например, гена белка теплового шока, RUBISCO и гена запасных белков) или от вирусов растений (например, вирусных промоторов или лидерных последовательностей), могут быть клонированы в указанный вектор. В клеточных системах млекопитающих предпочтительными являются промоторы, происходящие от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих. Если необходимо генерировать клеточную линию, содержащую множество копий данной последовательности, то могут быть использованы векторы на основе SV40 или EBV с соответствующим селективным маркером. Экспрессирующий вектор конструируют так, чтобы конкретная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты присутствовала в векторе вместе с соответствующими регуляторными последовательностями, и чтобы положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к регуляторным последовательностям позволяли такой кодирующей последовательности транскрибироваться под "контролем" регуляторных последовательностей, т.е. так, чтобы РНК-полимераза, которая связывается с ДНК-молекулой у регуляторных последовательностей, осуществляла транскрипцию кодирующей последовательности. В некоторых случаях может оказаться необходимым модифицировать последовательность так, чтобы она могла присоединяться к регуляторным последовательностям в соответствующей ориентации, т.е. с сохранением рамки считывания. Регуляторные последовательности и другие контрольные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты перед встраиванием в вектор. Альтернативно, такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт. Для длительного высокоэффективного продуцирования рекомбинантного полипептида, предпочтительной является стабильная экспрессия. Так, например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют нужный полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные экспрессионные элементы и выбранный маркерный ген, присутствующий на том же самом или на отдельном векторе. После введения этого вектора, клетки можно оставить на 1-2 дня для роста в обогащенной среде, которую затем заменяют селективной средой. Селективный маркер необходим для сообщения резистентности, используемой в целях отбора, и его присутствие позволяет культивировать и выделять клетки,успешно экспрессирующие введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации методами культивирования ткани, подходящими для клеток такого типа. Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области, и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почек детнышей хомячка (ВНК),клетки почек обезьяны (COS), клетки С 127, клетки 3 Т 3, клетки ВНК, клетки НЕК 293, клетки меланомы Боуэса, клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2) и ряд других клеточных- 15007611 линий. В бакуловирусной системе материалы для получения экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными и поставляются в наборах, inter alia, от Invitrogen, SanDiego CA (набор "MaxBac"). В общих чертах, эти методы известны специалистам и подробно описаны уSummersSmith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых, такие как клеткиDrosophila S2 и клетки Spodoptera Sf9. В данной области известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются системы, описанные в US 5693506, US 5659122 и US 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991). В частности, можно использовать любые растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты с последующим генерированием из них целых регенерированных растений, которые содержали бы перенесенный ген. В частности, из культивируемых клеток или тканей могут быть регенерированы все растения, включая, но, не ограничиваясь ими, все основные виды сахарного тростника,сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых и овощных растений. Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются клетки стрептококков, стафилококков, E.coli, Streptomyces и Bacillus subtilis. Примерами особенно подходящих клеток-хозяев для экспрессии в грибах являются дрожжевые клетки (например, S. cerevisiae) и клетки Aspergillus. Любые системы отбора, которые могут быть использованы для выделения трансформированных клеточных линий, известны в данной области. Примерами являются гены тимидинкиназы (Wigler M. etal. (1977) Cell 11:223-32) и аденин-фосфорибозилтрансферазы вируса простого герпеса (Lowy I. et al.(1980) Cell 22:817-23), которые могут быть использованы в tk- или aprt-клетках соответственно. Кроме того, в качестве основы для отбора могут быть использованы гены резистентности к антиметаболиту, антибиотику или к гербициду, например, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), который придает резистентность к метотрексату (Wigler M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); ген npt, который придает резистентность к аминогликозидам, неомицину и к G-418 (Colbere-Garapin F. et al. (1981) J.Mol. Biol. 150:1-14), и гены als или pat, которые придают резистентность к хлорсульфурон- и фосфинотрицинацетилтрансферазе соответственно. Были описаны и другие селективные гены, примеры которых хорошо известны специалистам. Хотя присутствие или отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что присутствует также и нужный ген, однако его присутствие и экспрессия еще нуждаются в подтверждении. Так, например, если соответствующая последовательность была встроена в последовательность маркерного гена, то трансформированные клетки, содержащие соответствующие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может находиться в тандема с последовательностью, кодирующей полипептид настоящего изобретения,находящийся под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индуцирование или отбор обычно указывает также на экспрессию тандемного гена. Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид настоящего изобретения, и которые экспрессируют указанный полипептид, могут быть идентифицированы различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, ДНК-ДНК или ДНК-РНК-гибридизация и биоанализы на присутствие белка, например, сортировка клеток по интенсивности флуоресценции (FACS) или иммуноанализы (таких как твердофазный иммуноферментный анализ [ELISA] и радиоиммуноанализ [РИА]), которые предусматривают использование мембран, растворов или чипов для детекции и/или количественной оценки нуклеиновой кислоты или белка (см. Hampton R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual,APS Press, St. Paul, M.N. и Maddox D.E. et al., (1983) J. Exp. Med. 158, 1211-1216). Существует широкий ряд методов мечения и конъюгирования, известных специалистам, и эти методы могут быть использованы в различных анализах на присутствие нуклеиновых кислот и аминокислот. Методами, используемыми в целях продуцирования меченых зондов для гибридизации или ПЦРзондов для детекции последовательностей, родственных молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды настоящего изобретения, являются мечение олигонуклеотидами, ник-трансляция, мечение по концам или ПЦР-амплификация с использованием меченного полинуклеотида. Альтернативно, последовательности, кодирующие полипептид настоящего изобретения, могут быть клонированы в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны в данной области, являются коммерчески доступными и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов in vitro путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т 7, Т 3 или SP6, и меченых нуклеотидов. Эти методики могут быть осуществлены с использованием различных коммерчески доступных наборов (PharmaciaUpjoin(Kalamazoo, MI); Promega (Madison WI) и U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH). Подходящими репортерными молекулами или метками, которые могут быть использованы для облегчения детекции, являются радионуклиды, ферменты и флуоресцентные, хемилюминисцентные или- 16007611 хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также использованы для генерирования трансгенных животных, в частности, грызунов. Такие трансгенные животные входят в дополнительный аспект настоящего изобретения. Такое генерирование может быть осуществлено путем локальной модификации соматических клеток или манипуляций с зародышевыми линиями: для введения наследуемых модификаций. Такие трансгенные животные могут быть, в частности, использованы для генерирования животных-моделей в целях поиска молекул лекарственных средств, которые являются эффективными в качестве модуляторов полипептидов настоящего изобретения. Полипептид может быть выделен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатитах и хроматографию на лектине. Для очистки наиболее подходящей является высокоэффективная жидкостная хроматография. В случае если данный полипептид был денатурирован в процессе выделения или очистки, то для восстановления активной конформации может быть использована хорошо известная техника рефолдинга белков. Если необходимо, то для облегчения очистки белков могут быть также использованы специальные векторные конструкции, полученные путем присоединения последовательностей, кодирующих полипептиды настоящего изобретения, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен,который облегчает очистку растворимых белков. Примерами таких доменов, облегчающих очистку белков, являются пептиды, образующие хелатные комплексы с металлами, такие как: гистидин-триптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах; домены белка А,которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине; и домен, используемый в системе FLAGS удлинение/аффинная очистка (Immunex Corp., Seattle, WA). Для облегчения очистки,между доменом для очистки и полипептидом настоящего изобретения могут быть включены расщепляемые линкерные последовательности, такие как последовательности, специфичные к фактору ХА или энтерокиназе (Invitrogen, San Diego, CA). Один из таких экспрессирующих векторов обеспечивает экспрессию гибридного белка, содержащего полипептид настоящего изобретения, присоединенный к нескольким гистидиновым остаткам, за которыми следуют тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают проведение очистки с помощью IMAC (аффинной хроматографии на иммобилизованном ионе металла, описанной Porath J. et al. (1992), Prot. Exp. Purif. 3:263-281), тогда как тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы позволяют выделять полипептид из гибридного белка. Обсуждение векторов, содержащих гибридные белки, можно найти у Kroll D.J. et al. (1993; DNACell Biol. 12:441-453). Если экспрессируемый полипептид используется в аналитическом скрининге, то обычно предпочтительно, чтобы он был продуцирован на поверхности клетки-хозяина, в которой он экспрессируется. В этом случае, клетки-хозяева могут быть собраны до их использования в скрининг-анализе, например,таким методом, как сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) или иммуноаффинным методом. Если полипептид секретируется в среду, то такая среда может быть восстановлена для выделения и очистки экспрессированного полипептида. Если полипептид продуцируется внутри клетки, то перед выделением полипептида клетки должны быть сначала подвергнуты лизису. Полипептид настоящего изобретения может быть использован для скрининга библиотек соединений в любом из известных методов, применяемых для скрининга лекарственных средств. Такие соединения могут стимулировать (служить агонистами) или ингибировать (служить антагонистами) уровень экспрессии гена или активность полипептида настоящего изобретения, и поэтому они составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. Предпочтительными соединениями являются соединения, способные влиять на экспрессию природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или регулировать активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения. Соединения-агонисты или соединения-анатагонисты могут быть выделены, например, из клеток,бесклеточных препаратов, химических библиотек или смесей природных продуктов. Такими агонистами или антагонистами могут быть природные или модифицированные субстраты, лиганды, ферменты, рецепторы, либо структурные или функциональные миметики. Подходящее описание таких методов скрининга можно найти в работе Coligan et al., Current Protocols in Immunology I(2):Chapter 5 (1991). Соединения, которые могут рассматриваться как наиболее вероятные кандидаты на хорошие антагонисты, представляют собой молекулы, которые связываются с полипептидом настоящего изобретения,но не индуцируют каких-либо биологических эффектов полипептида после связывания с ним. Потенциальными антагонистами являются небольшие органические молекулы, пептиды, полипептиды и антитела, которые связываются с полипептидом настоящего изобретения и, тем самым, ингибируют или подавляют его активность. Таким образом, связывание полипептида с нормальными связывающимися клеточными молекулами может ингибироваться так, чтобы подавлялась нормальная биологическая активность полипептида. Полипептид настоящего изобретения, который используется в таком методе скрининга, может на- 17007611 ходиться в растворе в свободном состоянии, может быть иммобилизован на твердом носителе, может присутствовать на клеточной поверхности, либо он может быть локализован внутри клетки. В основном такие методы скрининга предусматривают использование соответствующих клеток или клеточных мембран, экспрессирующих полипептид, который контактирует с тестируемым соединением, что приводит к связыванию, либо к стимуляции или ингибированию функционального ответа. Функциональный ответ клеток, контактируемых с тестируемым соединением, сравнивают с контрольными клетками, которые не контактировали с тестируемым соединением. С помощью подходящей системы детекции, такой анализ позволяет определить, может ли тестируемое соединение давать сигнал, генерируемый активацией указанного полипептида. Ингибиторы активации обычно анализируют в присутствии известного агониста, и оценивают влияние этого агониста на активацию в присутствии тестируемого соединения. Предпочтительный способ идентификации соединения-агониста или соединения-антагониста по отношению к полипептиду настоящего изобретения включает:(a) контактирование клетки, экспрессирующей на клеточной поверхности полипептид первого аспекта настоящего изобретения, который ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, и при этом соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с полипептидом; и(b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом, либо его активации или ингибирования путем измерения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом. Еще более предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста по отношению к полипептиду настоящего изобретения включает:(a) контактирование клетки, экспрессирующей на клеточной поверхности полипептид, который ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с полипептидом, и при этом соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с полипептидом; и(b) определение события связывания соединения с полипептидом, либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия соединения с полипептидом, с уровнем сигнала, полученного в отсутствии указанного соединения. В других предпочтительных вариантах изобретения общие методы, описанные выше, могут дополнительно включать осуществление идентификации агониста или антагониста в присутствии меченного или немеченного лиганда для полипептида. В другом варианте изобретения способ идентификации агониста или антагониста полипептида настоящего изобретения включает: определение факта ингибирования связывания лиганда с клетками, которые содержат полипептид настоящего изобретения на своей поверхности, или с клеточными мембранами, содержащими такой полипептид, в присутствии соединения-кандидата в условиях, стимулирующих связывание с полипептидом, и определение количества лиганда, связанного с полипептидом. Считается, что соединение, способное приводить к снижению уровня связывания с лигандом, является агонистом или антагонистом. При этом предпочтительно, чтобы указанный лиганд был меченным. Более конкретно, способ скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом к полипептиду, включает стадии:(a) инкубирования меченного лиганда с целой клеткой, экспрессирующей полипептид настоящего изобретения на клеточной поверхности, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид настоящего изобретения;(b) измерения количества меченного лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной;(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченого лиганда и целой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведение этой смеси до состояния равновесия;(d) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и(e) сравнения различия в количествах связанного меченного лиганда стадий (b) и (d), где соединение, вызывающее снижение уровня связывания в стадии (d), считается агонистом или антагонистом. В вышеописанных анализах может быть установлено, что указанные полипептиды модулируют различные физиологические и патологические процессы дозозависимым способом. Так, например,"функциональными эквивалентами" полипептидов настоящего изобретения являются полипептиды, которые в приведенных выше анализах обладают той же самой дозозависимой модулирующей активностью. Хотя уровень дозозависимой активности необязательно является идентичным уровню полипептидов настоящего изобретения, однако, предпочтительно, чтобы в данном анализе на активность "функциональные эквиваленты" обнаруживали в основном такую же аналогичную зависимость от дозы, как и полипептиды настоящего изобретения. В некоторых описанных выше вариантах изобретения могут быть использованы простые анализы на связывание, в которых адгезию тестируемого соединения к поверхности, несущей данный полипептид, детектируют с помощью метки, непосредственно или опосредованно ассоциированной с тестируемым соединением, или с помощью анализа на конкуренцию с меченым со- 18007611 единением-конкурентом. В другом варианте осуществления изобретения могут быть использованы конкурентные анализы на скрининг лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные связываться с данным полипептидом, специфически конкурируют за связывание с тестируемым соединением. Таким образом, указанные антитела могут быть использованы для детекции на присутствие любого тестируемого соединения, обладающего специфической аффинностью связывания с указанным полипептидом. Могут быть также разработаны анализы для детекции влияния добавленных тестируемых соединений на продуцирование мРНК, кодирующей указанный полипептид, в клетках. Так, например, анализELISA может быть разработан так, чтобы можно было измерить секретируемые или клеточноассоциированные уровни полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител стандартными методами, известными в данной области, и этот анализ может быть использован для поиска соединений, которые могут ингибировать или усиливать продуцирование полипептида из соответствующим образом модифицированных клеток или тканей. Затем может быть определен уровень образования связывающих комплексов между полипептидом и тестируемым соединением. Аналитическими способами, которые также входят в объем настоящего изобретения, являются способы, предусматривающие использование генов и полипептидов настоящего изобретения в анализах на сверхэкспрессию или в анализах на исключение. Такие анализы предусматривают манипуляцию с уровнями указанных генов/полипептидов в клетках и оценку влияния этой манипуляции на физиологию клеток, подвергнутых манипуляции. Так, например, такие эксперименты позволяют точно выявить пути передачи сигнала и метаболические пути, в которых участвуют конкретные гены/полипептиды, а также получить информацию относительно идентичности полипептидов, с которыми взаимодействуют исследуемые полипептиды, и найти ключ к разгадке механизмов, с помощью которых регулируются родственные гены и белки. Другой метод, который может быть использован для скрининга на лекарственные средства, дает возможность осуществлять высокоэффективный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания с нужным полипептидом (см., Международную патентную заявку WO 84/03564). В этом методе, большое число различных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате, который затем может быть подвергнут реакции с полипептидом настоящего изобретения и промывке. Одним из способов иммобилизации полипептида является использование не-нейтрализующих антител. Связанный полипептид может быть затем детектирован методами, хорошо известными в данной области. Очищенный полипептид также может быть непосредственно нанесен на планшеты для последующего использования в приведенных выше способах скрининга на лекарственные средства. Полипептид настоящего изобретения может быть использован для идентификации мембраноассоциированных или растворимых рецепторов с помощью стандартной техники связывания с рецептором, известной в данной области, такой как анализы на связывание и перекрестное сшивание с лигандом,в которых полипептид метят радиоактивным изотопом, химически модифицируют или присоединяют к пептидной последовательности, которая облегчает его детекцию или очистку, и инкубируют с источником предполагаемого рецептора (например, с композицией клеток, клеточными мембранами, клеточными супернатантами, тканевыми экстрактами или с физиологическими жидкостями). Эффективность связывания может быть определена биофизическими методами, такими как поверхностный плазменный резонанс и спектроскопия. Анализы на связывание могут быть использованы для очистки и клонирования рецептора, но они могут быть также использованы для идентификации агонистов и антагонистов указанного полипептида, которые конкурируют с указанным полипептидом за связывание с рецептором. Стандартные методы проведения скрининг-анализов хорошо известны в данной области. Настоящее изобретение также относится к набору для скрининга, используемому в методах идентификации агонистов, антагонистов, лигандов, рецепторов, субстратов и ферментов, описанных выше. Настоящее изобретение также относится к агонистам, антагонистам, лигандам, рецепторам, субстратам, ферментам и к другим соединениям, модулирующим активность или антигенность полипептида настоящего изобретения в соответствии с описанными выше механизмами. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение настоящего изобретения в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем. Эти композиции могут быть использованы в качестве терапевтических или диагностических реагентов, вакцин или в качестве других иммуногенных композиций, подробно описанных ниже. В соответствии с используемой здесь терминологией, композиция, содержащая полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение [X], считается "в основном не содержащей" примесей [здесь,Y], если по крайней мере 85 мас.% от всего количества X+Y в данной композиции составляет X. Предпочтительно X составляет по крайней мере примерно 90% по общей массе X+Y в данной композиции,более предпочтительно по крайней мере примерно 95, 98 или даже 99 мас.%. Фармацевтические композиции предпочтительно должны содержать терапевтически эффективное количество полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, лиганда или соединения настоящего изобретения. Используемый здесь термин "терапевтически эффективное количество" означает количество тера- 19007611 певтического агента, необходимого для лечения, ослабления или профилактики рассматриваемого заболевания или состояния, или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Для каждого соединения терапевтически эффективная доза может быть сначала оценена либо в анализе клеточной культуры, например, опухолевых клеток, либо на животных-моделях, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. Животное-модель может быть также использовано для определения соответствующего интервала концентраций и способа введения. Такая информация может быть затем использована для определения подходящих доз и способов их введения человеку. Точное эффективное количество соединения для введения индивидууму будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего состояния здоровья индивидуума, возраста, массы и пола индивидуума, его режима питания и частоты введения лекарственного средства, а также от комбинации(й) лекарственных средств, чувствительности данного индивидуума на реакцию и его переносимость/восприимчивость к данной терапии. Такое количество может быть определено путем рутинного экспериментирования и может быть установлено врачом-клиницистом. В общих чертах, эффективная доза может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,05 до 10 мг/кг. Композиции могут быть введены пациенту либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами. Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель,подходящий для введения терапевтического агента. Такими носителями являются антитела и другие полипептиды, гены и другие терапевтические агенты, такие как липосомы, при условии, что этот носитель сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию, и что данный вводимый носитель не является чрезмерно токсичным. Подходящими носителями могут быть крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Используемыми фармацевтически приемлемыми солями могут быть, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот,такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991). Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут, кроме того, содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в указанных композициях могут присутствовать и вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества и т.п. С помощью таких носителей могут быть получены фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п., для перорального введения пациенту. Композиции настоящего изобретения, после их приготовления, могут быть непосредственно введены индивидууму. Индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть животные, в частности человек. Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть введены различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, внутривенное, внутримышечное,внутриартериальное, интрамедулярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное или чрескожное введение (см. например, WO 98/10734), а также подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, кишечное, местное, подъязычное, интравагинальное или ректальное введение. Для введения фармацевтических композиций настоящего изобретения могут быть также использованы генные ружья или безигольные шприцы. В основном, терапевтические композиции могут быть приготовлены в виде растворов для инъекций, либо в виде жидких растворов или суспензий, либо они могут быть получены в виде твердых форм, подходящих для получения растворов или суспензий в жидких носителях перед их введением путем инъекции. Указанные композиции могут быть непосредственно доставлены, в основном, путем подкожной,внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции, либо они могут быть доставлены в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут быть также введены в пораженный участок. При этом лечение может быть проведено по схеме введения разовой дозы или дробных доз. Если активность полипептида настоящего изобретения превышает активность, требуемую для лечения конкретного патологического состояния, то в данном случае может быть рассмотрено несколько подходов. Один из таких подходов включает введение индивидууму вышеописанного соединенияингибитора (антагониста) вместе с фармацевтически приемлемым носителем, где указанный ингибитор вводят в количестве, эффективном для ингибирования функции полипептида, например, блокирования связывания с лигандами, субстратами, ферментами или рецепторами, либо ингибирования вторичного сигнала, и, тем самым, эффективном для ослабления симптомов аномального состояния. Такими антагонистами, предпочтительно, являются антитела. Для минимизации иммуногенности антител, описанных выше, наиболее предпочтительно, чтобы такие антитела были химерными и/или гуманизованными. В соответствии с другим подходом могут быть введены растворимые формы полипептидов, которые сохраняют аффинность связывания с рассматриваемым лигандом, субстратом, ферментом или рецептором. В основном, такой полипептид может быть введен в виде фрагментов, в которых сохраняются- 20007611 соответствующие части. В альтернативном подходе, экспрессия гена, кодирующего полипептид, может быть ингибирована методами блокирования экспрессии, такими как использование молекул антисмысловой нуклеиновой кислоты (описанных выше), которые могут быть либо эндогенно генерированы, либо введены отдельно. Модификации экспрессии генов могут быть получены путем конструирования комплементарных последовательностей или антисмысловых молекул (ДНК, РНК или PNA) для контролирующих элементов, 5'последовательностей или регуляторных последовательностей (сигнальной последовательности, промоторов, энхансеров и интронов) гена, кодирующего полипептид. Аналогичным образом, ингибирование может быть осуществлено с использованием методики спаривания оснований с образованием "тройной спирали". Спаривание с образованием тройной спирали используется потому, что оно приводит к нарушению способности двойной спирали раскрываться так, чтобы это оказалось достаточным для связывания с полимеразой, факторами транскрипции или регуляторными молекулами. Успехи в клинической терапии, достигнутые за последнее время благодаря использованию ДНК-триплекса, были описаны в литературе (Gee J.E. et al. (1994): Huber B.E.B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, FuturaPublishing Co., Mt. Kisco, NY). Комплементарная последовательность или антисмысловая молекула могут быть также сконструированы в целях блокирования трансляции мРНК посредством предотвращения связывания транскрипта с рибосомами. Такие олигонуклеотиды могут быть введены или генерированы insitu в результате экспрессии in vivo. Кроме того, экспрессия полипептида настоящего изобретения может быть предотвращена с использованием рибозимов, специфичных к мРНК-последовательности, кодирующей этот полипептид. Рибозимы представляют собой каталитически активные РНК, которые могут быть природными или синтетическими (см. например, Usman N. et al., Curr. Opin. Struct. Biol. (1996) 6(4), 527-33). Синтетические рибозимы могут быть сконструированы так, чтобы они специфически расщепляли мРНК в выбранных положениях и, тем самым, предотвращали трансляцию мРНК в функциональный полипептид. Рибозимы могут быть синтезированы с использованием природного рибозофосфатного остова и природных оснований,обычно присутствующих в РНК-молекулах. Альтернативно, рибозимы могут быть синтезированы с использованием неприродных остовов, например, 2'-О-метил-РНК, в целях защиты от расщепления рибонуклеазой, и эти рибозимы могут содержать модифицированные основания. РНК-молекулы могут быть модифицированы в целях увеличения внутриклеточной стабильности и времени полужизни. Возможными модификациями являются, но не ограничиваются ими, присоединение фланкирующих последовательностей у 5'- и/или у 3'-концов молекулы или использование в указанном остове молекулы фосфортиоата или 2'-O-метила вместо фосфодиэстеразных связей. Эта концепция может рассматриваться и при продуцировании PNA и может быть применена ко всем указанным молекулам посредством включения нетрадиционных оснований, таких как инозин, квеозин и бутозин, а также ацетил-, метил-, тио- и аналогичные модифицированные формы аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина, которые не могут легко распознаваться эндогенными эндонуклеазами. Для лечения аномальных состояний, ассоциированных с недостаточной экспрессией полипептида настоящего изобретения и его активностью, имеется несколько способов. Один из таких способов предусматривает введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения, которое активирует полипептид, т.е. соединение-агонист, описанное выше, в целях ослабления симптомов патологического состояния. Альтернативно, терапевтическое количество указанного полипептида в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем может быть введено в целях сохранения соответствующего физиологического равновесия данного полипептида. Для осуществления эндогенного продуцирования у индивидуума данного полипептида соответствующими клетками может быть применена генотерапия. Генотерапию используют для перманентного лечения заболеваний, связанных с аномальным продуцированием полипептида, путем замены дефектного гена "правильным" терапевтическим геном. Генотерапия настоящего изобретения может быть осуществлена in vivo или ex vivo. Для генотерапии ex vivo требуется выделение и очистка клеток, взятых у пациента, введение терапевтического гена и введение генетически модифицированных клеток обратно пациенту. В противоположность этому, генотерапия in vivo не требует выделения и очистки клеток пациента. Для введения пациенту, терапевтический ген обычно является "упакованным". Носители для доставки генов могут быть невирусными, такими как липосомы, либо они могут представлять собой дефектные по репликации вирусы, такие как аденовирус, описанный Berkner K.L., Curr. Top. Microbiol.Immunol., 158, 39-66 (1992) или векторы на основе адено-ассоциированного вируса (AAV), описанныеMuzyczka N. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992) и в патенте США 5252479. Так, например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид настоящего изобретения, может быть сконструирована для экспрессии в дефектном по репликации ретровирусном векторе. Затем эта экспрессионная конструкция может быть выделена и введена в упаковывающую клетку, трансдуцированную ретровирусным плазмидным вектором, содержащим РНК, кодирующую указанный полипептид, так,чтобы указанная упаковывающая клетка продуцировала инфекционные вирусные частицы, содержащие нужный ген. Эти клетки-продуценты могут быть введены индивидууму для конструирования клеток inA.P.Read, BIOS Scientific Publishers Ltd). Другим способом является введение "оголенной ДНК", где терапевтический ген непосредственно инъецируют в кровоток или в мышечную ткань. В случае, когда полипептидами или молекулами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения являются агенты, вызывающие заболевание, настоящее изобретение относится к их возможному применению в вакцинах для вырабатывания антител против указанного агента, вызывающего заболевания. Если приведенный выше полипептид или молекула нуклеиновой кислоты должны быть активированы, то разрабатываемая вакцина должна вырабатывать антитела или Т-клетки против указанных агентов (как описано в WO 00/29428). Вакцины настоящего изобретения могут быть либо профилактическими (т.е. предназначенными для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (т.е. предназначенными для лечения заболеваний после инфицирования). Такие вакцины содержат иммунизирующий(е) антиген(ы), иммуноген(ы), полипептид(ы), белок(ки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с описанными выше фармацевтически приемлемыми носителями, которыми может быть любой носитель, который сам по себе не индуцируют вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию. Кроме того, эти носители могут действовать как иммуностимуляторы("адъюванты"). Кроме того, антиген или иммуноген может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид дифтерии, столбняка, холеры, Н. pylori и другие патогены. Поскольку полипептиды могут разрушаться в желудке, то вакцины, содержащие полипептиды,предпочтительно, вводят парентерально (например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или чрескожной инъекции). Композициями, подходящими для парентерального введения, являются водные и безводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы,бактериостаты и растворенные вещества, сообщающие данной композиции изотоничность с кровью реципиента, а также водные и безводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты или загустители. Вакцинные композиции настоящего изобретения могут быть помещены в упаковки для разовых лекарственных форм или для дробных лекарственных форм. Так, например, эти лекарственные формы могут быть помещены в запаянные ампулы и сосуды и могут храниться в замороженном виде, в которые,непосредственно перед их использованием, необходимо лишь добавить стерильный жидкий носитель. Конкретная доза будет зависеть от удельной активности данной вакцины и может быть легко определена путем рутинного экспериментирования. Доставка антител, связывающихся с полипептидами настоящего изобретения, методами генотерапии может быть осуществлена, например, как описано в Международной патентной заявке WO 98/55607. Для получения вакцинных композиций может быть также использована технология безигольного впрыскивания (см., например, www.powderject.com). Ряд подходящих методов вакцинации и систем для доставки вакцин описаны в Международной патентной заявке WO 00/29428. Настоящее изобретение также относится к применению молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в качестве диагностических реагентов. Детекция мутированной формы гена, характеризующейся существованием молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, которые ассоциируются с дисфункцией, используется в качестве диагностического средства, которое может облегчать установление диагноза заболевания или установления восприимчивости к заболеванию, возникающему в результате пониженной экспрессии, сверхэкспрессии или измененной пространственной или временной экспрессии данного гена. Индивидуумы, несущие мутации в данном гене, могут быть идентифицированы на уровне ДНК рядом методов. Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для диагностики, могут быть получены из клеток данного индивидуума, таких как клетки крови, мочи, слюны, биоптата ткани или материала, полученного после аутопсии. Геномные ДНК могут быть использованы непосредственно для детекции либо перед проведением анализа они могут быть амплифицированы ферментативно с использованием ПЦР, лигазной цепной реакции (ЛЦР), амплификации с замещением цепи (SDA) или другими методами амплификации (см. Saiki et al., Nature, 324, 163-166 (1986); Bej et al. Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334(1990. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания у пациента, включающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид настоящего изобретения, и сравнение полученного уровня экспрессии с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия данного заболевания. Этот способ может включать следующие стадии:a) контактирование образца ткани, взятой у пациента, с нуклеиновокислотным зондом в жестких условиях, в результате чего образуется гибридный комплекс между молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения и указанным зондом;b) контактирование контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); иc) детекцию присутствия гибридных комплексов в указанных образцах, где детекция уровней гибридного комплекса в образце данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, является признаком наличия данного заболевания. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, включающему следующие стадии:a) получения образцов тканей от пациента, исследуемого на наличие заболевания;b) выделения молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения из указанного образца ткани; иc) установления диагноза заболевания у данного пациента путем обнаружения присутствия мутации молекулы нуклеиновой кислоты, которая ассоциируется с данным заболеванием. Для облегчения детекции молекулы нуклеиновой кислоты в описанных выше способах, может быть проведена стадия амплификации, например, с помощью ПЦР. Делеции и инсерции могут быть детектированы по изменению размера амплифицированного продукта по сравнению с нормальным генотипом. Точечная мутация может быть идентифицирована путем гибридизации амплифицированной ДНК с меченой РНК настоящего изобретения, или альтернативно, с меченой антисмысловой ДНК-последовательностью настоящего изобретения. Полностью соответствующие последовательности могут быть дифференцированы от дуплексов с ошибочным спариванием путем гидролиза РНКазой или путем оценки различий в температурах плавления. Присутствие или отсутствие мутации у пациента может быть определено посредством контактирования ДНК с нуклеиновокислотным зондом, который гибридизуется с ДНК в жестких условиях, в результате чего образуется гибридная двухцепочечная молекула, которая имеет негибридизованную часть цепи нуклеиновокислотного зонда в любой области, соответствующей мутации, ассоциированной с заболеванием; и установления присутствия или отсутствия негибридизованной части цепи нуклеиновокислотного зонда как показателя наличия или отсутствия ассоциированной с заболеванием мутации в соответствующей области ДНКцепи. Такие способы диагностики являются особенно ценными для проведения пренатальных и даже неонатальных тестов. Точечные мутации и другие отличия между последовательностями эталонного гена и "мутантных" генов могут быть идентифицированы другими хорошо известными методами, такими как прямое секвенирование ДНК или определение конформационного полиформизма одноцепочечных последовательностей (см. Orita et al., Genomics, 5, 874-879 (1989. Так, например, секвенирующий праймер может быть использован вместе двухцепочечным ПЦР-продуктом или с одноцепочечной матричной молекулой, генерированной с помощью модифицированной ПЦР. Определение последовательности осуществляют в соответствии со стандартными методиками с использованием радиоактивно меченых нуклеотидов или в соответствии с методами автоматического секвенирования с использованием флуоресцентных меток. Клонированные ДНК-сегменты могут быть также использованы в качестве зондов для детекции специфических ДНК-сегментов. Чувствительность этого метода значительно повышается при использовании в комбинации с ПЦР. Кроме того, точечные мутации и другие модификации последовательностей, такие как полиморфизм, могут быть детектированы, как описано выше, например, с использованием аллельспецифических олигонуклеотидов для ПЦР-амплификации последовательностей, отличающихся одним нуклеотидом. Различия в ДНК-последовательностях могут быть также детектированы по изменениям электрофоретической подвижности ДНК-фрагментов в гелях, в присутствии или в отсутствии денатурирующих агентов, либо путем прямого секвенирования ДНК (например, Myers et al. Science (1985) 230:1242). Изменения в конкретных положениях данных последовательностей могут быть также выявлены либо путем проведения анализов на защиту от нуклеазы, таких как анализ на защиту от РНКазы или S1, либо путем химического расщепления (см. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401). Помимо стандартного гель-электрофореза и секвенирования ДНК, мутации, такие как микроделеции, анеуплоидии, транслокации и инверсии, могут быть также детектированы путем проведения анализа in situ (см. например, Keller et al. DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, New York, N.Y., USA (1993, т.е. ДНК или РНК-последовательности в клетках могут быть проанализированы на мутации, не прибегая к их выделению и/или иммобилизации на мембране. Гибридизация in situ с флуоресценцией (FISH) является в настоящее время наиболее широко используемым методом, и множество его описаний уже появилось в литературе (см. например, Trachuck et al. Science 250, 559-562 (1990) и Trask et al. Trends, Genet., 7,149-154 (1991. В другом варианте осуществления изобретения для проведения эффективного скрининга генетических вариантов, мутаций и полиморфизма может быть создан массив олигонуклеотидных зондов, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Технология создания массивов хорошо известна в данной области, находит широкое применение и может быть использована для решения ряда проблем молекулярной генетики, касающихся экспрессии генов, сцепления генов и генетической измен- 23007611 чивости (см. например, М. Chee et al., Science (1996). Vol. 274, pp.610-613). В одном из вариантов осуществления изобретения, такой массив может быть получен и использован в соответствии с методами, описанными в заявке РСТ WO 95/11995 (Chee et al.); Lockhart D.J. et al.,(1996). Nat. Biotech. 14:1675-1680; и Schema M. et al. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619. Олигонуклеотидные пары могут быть использованы в количестве от двух пар до одного миллиона пар. Олигомеры синтезируют в соответствующих участках на субстрате с использованием оптически направленного химического синтеза. Таким субстратом может быть бумага, нейлон или мембрана другого типа,фильтр, чип, покровное стекло или любой другой твердый носитель. В другом аспекте настоящего изобретения олигонуклеотид может быть синтезирован на поверхности субстрата с использованием процедуры химического связывания и струйного аппарата для нанесения путем разбрызгивания, как описано в заявке РСТ WO 95/251116 (Baldeschweiler et al.). В другом своем аспекте, для определения порядка расположения кДНК-фрагментов или олигонуклеотидов на поверхности субстрата и связывания этих фрагментов или олигонуклеотидов с поверхностью субстрата могут быть использованы "сетчатые" массивы,аналогичные массивам для дот (или слот)-блотов, с использованием вакуумной системы и методов термического, УФ-, механического или химического связывания. Массив, такой как массивы, описанные выше, может быть создан вручную или с использованием подходящих устройств (слот-блот или дотблот-аппарата), материалов (любого твердого носителя) и оборудования (включая роботизированную аппаратуру), и этот массив может содержать 8, 24, 96, 384, 1536 или 6144 олигонуклеотидов или любое другое число от двух и выше одного миллиона, которое является подходящим для эффективного использования коммерчески доступного оборудования. Помимо методов, описанных выше, заболевания могут быть диагностированы методами, включающими определение в образце, взятом у индивидуума, аномально низкого или аномально высокого уровня полипептида или мРНК. Для количественной оценки полипептидов, пониженный или повышенный уровень экспрессии может быть измерен на РНК-уровне любыми методами, хорошо известными в данной области, например, путем амплификации нуклеиновых кислот, а именно, с помощью ПЦР или ОТ-ПЦР, путем проведения анализов на защиту от РНКазы, с помощью Нозерн-блот-анализов и другими методами гибридизации. Аналитические методы, которые могут быть использованы для определения уровней полипептида настоящего изобретения в образце, взятом у хозяина, хорошо известны специалистам, и подробно обсуждаются выше (включая радиоиммуноанализы, анализы на конкурентное связывание, Вестерн-блотанализ и ELISA-анализы). В этом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, который включает стадии:(a) контактирования лиганда, описанного выше, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и(b) детекции указанного комплекса. Протоколы, такие как ELISA, РИА и FACS, разработанные для измерения уровней полипептидов,могут быть, кроме того, взяты за основу при определении измененных или аномальных уровней экспрессии полипептида. Нормальные или стандартные значения для экспрессии полипептида получают путем объединения физиологических жидкостей или клеточных экстрактов, взятых у нормальных млекопитающих, предпочтительно, у человека, с антителом против полипептида в условиях, подходящих для образования комплекса. Количество образованного стандартного комплекса может быть оценено различными методами, такими как фотометрические методы. Антитела, которые специфически связываются с полипептидом настоящего изобретения, могут быть использованы для диагностики состояний или заболеваний, характеризующихся экспрессией полипептида, или в анализах для наблюдения за пациентами, которым было проведено лечение полипептидами, молекулами нуклеиновой кислоты, лигандами и другими соединениями настоящего изобретения. Антитела, подходящие для использования в диагностических целях, могут быть получены способом,аналогичным способу, описанному выше для терапии. Диагностические анализы на присутствие полипептида осуществляют методами, в которых используют антитело и метку для детекции полипептида в физиологических жидкостях или экстрактах клеток или тканей человека. При этом могут быть использованы модифицированные или немодифицированные антитела, и эти антитела могут быть помечены путем их ковалентного или нековалентного связывания с репортерной молекулой. При этом могут быть использованы репортерные молекулы широкого ряда, известные в данной области, и некоторые из них описаны выше. Количества полипептида, экспрессируемого у индивидуума, в контрольном и зараженном образцах и образце ткани, взятой при биопсии, сравнивают со стандартными величинами. Отклонение величин,полученных для данного индивидуума, от стандартных величин позволяет определить параметры для диагностики заболевания. Диагностический анализ может быть использован для выявления отсутствия,присутствия и избыточной экспрессии полипептида и для мониторинга регуляции уровней полипептида во время терапевтического лечения. Такие анализы могут быть также использованы для оценки эффективности конкретного курса терапевтического лечения при исследовании животных в клинических испытаниях или для наблюдения за лечением отдельного пациента.- 24007611 Диагностический набор настоящего изобретения может содержать:(a) молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения;(c) лиганд настоящего изобретения. В одном из аспектов настоящего изобретения, диагностический набор может включать первый контейнер, содержащий нуклеиновокислотный зонд, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию зонда и праймеров для облегчения диагностики заболевания. Этот набор может, кроме того, включать третий контейнер, содержащий агент для расщепления негибридизованной РНК. В альтернативном аспекте настоящего изобретения, диагностический набор может содержать массив молекул нуклеиновой кислоты, по крайней мере, одной из которых является молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Для детекции полипептида настоящего изобретения диагностический набор может содержать одно или более антител, связывающихся с полипептидом настоящего изобретения, и реагент, используемый для детекции реакции связывания между антителом и полипептидом. Такие наборы могут быть использованы для диагностики заболевания или восприимчивости к заболеванию, в частности, для диагностики пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития,метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний. Такими заболеванием или расстройством являются, предпочтительно, заболевание или расстройство, ассоциированное с аберрантными уровнями цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, предпочтительно, члена подсемейства DAN. Таким заболеванием или расстройством может быть также расстройство или заболевание, которое ассоциируется с аберрантными уровнями лиганда для цитокина, имеющего цистиновые узлы в своей структуре, предпочтительно, для члена подсемейства DAN. Так, например, таким заболеванием или расстройством может быть заболевание или расстройство, которое ассоциируется с аберрантными уровнями члена суперсемейства TGF-бета. В частности, указанным заболеванием или расстройством может быть заболевание или расстройство, которое ассоциируется с BMP, такое как невропатия, нефропатия, такая как диабетическая нефропатия, рак, заживление ран, фиброз, остеопения, остеопороз, переломы и склеростеоз. Различные аспекты и варианты настоящего изобретения будут более подробно проиллюстрированы на примерах, в частности, для полипептидов INSP002. При этом следует отметить, что в настоящее изобретение могут быть внесены конкретные модификации, не выходящие за объем изобретения. Краткое описание графического материала Фиг. 1 - результаты, полученные с помощью BLAST в неизбыточной базе данных NCBI с использованием объединенной полипептидой последовательности SEQ ID NО:2 и SEQ ID NО:4; фиг. 2 - сопоставление, осуществляемое с помощью программы BLAST, объединенной полипептидой последовательности SEQ ID NО:2 и SEQ ID NО:4 с близкородственной последовательностью cerberus-родственного белка 1 Homo sapiens; фиг. 3 - четыре наилучших соответствия в базах данных NCBI-nr и NCBI-nt BLAST, полученных для INSP002 26 ноября 2002; фиг. 4 - сопоставление INSP002 с АК 095926.1; фиг. 5 - сопоставление INSP002 с IMAGE: 4558384; фиг. 6 - нуклеотидная последовательность INSP002 с трансляцией; фиг. 7 - неполная клонированная последовательность INSP002 с трансляцией; фиг. 8 - карта для неполного PCRII-TOPO-INSP002; фиг. 9 - сопоставление предсказанной последовательности INSP002 (верхняя строка) с неполной клонированной последовательностью (нижняя строка); фиг. 10 - нуклеотидная последовательность и трансляция кДНК-вставки в Image: 4558384; фиг. 11 - сопоставление последовательностей предсказанного INSP002 (верхняя строка) с IMAGE: 4558384 (ВС 025333.1)(нижняя строка); фиг. 12 - нуклеотидная последовательность и трансляция INSP002V, генерированного с помощью ПЦР, в Image: 4558384; фиг. 13 - карта pCR4blunt-TOPO-INSP002V; фиг. 14 - сравнение предсказанного INSP002 (верхняя строка) с вариантом последовательностиINSP002V (нижняя строка); фиг. 15 - карта экспрессирующего вектора pEAK12d; фиг. 16 - карта вектора pDONR201 Gateway; фиг. 17 - карта pEAK12d-INSP002-V-6HIS; фиг. 18 - последовательность полноразмерного INSP002, клонированного из сердца: фиг. 19 - карта плазмиды pCR4blunt-TOPO-INSP002FL, кодирующей полноразмерный INSP002,клонированного из сердца.- 25007611 Примеры Пример 1. Сравнение белка INSP002 с белками в базе данных последовательностей. Полипептидную последовательность, происходящую от объединенных последовательностей SEQID NO:2 и SEQ ID NO:4, которая представляет собой транслированную последовательность следующих друг за другом экзонов INSP002, использовали в качестве запрашиваемой последовательности в программе BLAST для поиска в базе данных неизбыточных последовательностей NCBI. Наилучшие десять соответствий дают последовательности, аннотированные как белки cerberus или cerberus-родственные белки, которые являются членами семейства цитокинов с цистиновыми узлами, и которые сопоставляли с запрашиваемой последовательностью с высокозначимыми величинами Е (2 Е-10-2 Е-06) (фиг. 1). На фиг. 2 показано сопоставление запрашиваемой последовательности INSP002 с последовательностью cerberusродственного белка 1 Homo sapiens (Feng et al. 2001). Полипептидную последовательность, происходящую от объединенных последовательностей SEQID NO:2 и SEQ ID NO:4, которая представляет собой транслированную последовательность следующих друг за другом экзонов INSP002, вводили в программу SignalP V2.0.b2 (Nielsen et al. 1997 Protein Eng. 1:1-6). С помощью этой программы было предсказано, что указанная полипептидная последовательность имеет сигнальный пептид. Наиболее вероятно, что сайт отщепления сигнального пептида находится между остатками 22 и 23 указанной полипептидной последовательности INSP002, происходящей от объединенных последовательностей SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:1, кодирующая экзон 1 полипептида SEQ ID NO:2,содержит 5'-нетранслируемую область (5'UTR) и белок-кодирующую последовательность (CDS). CDS начинается с нуклеотида 152. Пример 2. Повторение BLAST-поиска.BLAST-поиск в базах данных NCBI-nr и NCBI-nt проводили 26 ноября 2002 с использованием полипептидной последовательности SEQ ID NO:6, происходящей от объединенных последовательностейSEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4. Наилучшие четыре соответствия, идентифицированные в результате проведенного поиска, показаны на фиг. 3. Этот поиск выявил, что полипептид INSP002 идентичен гипотетическому белку FLJ38067 на аминокислотном уровне и соответствующей нуклеотидной последовательности АK095926, клонированной из сердца и депонированной 16 июля 2002 г. На фиг. 4 показано сопоставление запрашиваемой последовательности INSP002 с белком, происходящем от кДНК-клона АK095926. Граница сплайсинга экзона 1 и экзона 2, предсказанная для INSP002, была экспериментально подтверждена присутствием AK095926. Исследования также показали, что части INSP002 идентичны IMAGE-клону 4558384 (ВС 025333.1),депонированному 8 марта 2002 г. На фиг. 5 показано сопоставление частей запрашиваемой последовательности INSP002 с IMAGE-клоном 4558384. Пример 3. Частичное клонирование кДНК INSP002.(i) Библиотеки кДНК. Библиотеки человеческих кДНК (в векторах бактериофага лямбда ( закупали у Stratagene илиClontech или получали в Научно-исследовательском институте фармакологии Сероно в векторахZAP илиGT10 в соответствии с протоколом производителей (Stratagene). ДНК бактериофагаполучали из лабораторных культур инфицированного штамма-хозяина E.coli с использованием системы очистки ДНКWizard Lambda Preps в соответствии с инструкциями производителей (Promega Corporation, Madison WI). Список используемых библиотек и штаммов-хозяев приведен в табл. 1.(ii) ПЦР предполагаемых кДНК, полученных из фаговой библиотеки ДНК. Неполную кДНК, кодирующую INSP002 (фиг. 6), получали в виде продукта ПЦР-амплификации,состоящего из 159 п.н. (фиг. 7), с использованием геноспецифических клонирующих праймеров(INSP002-CP1 и INSP002-CP2, фиг. 6 и табл. II). ПЦР осуществляли в конечном объеме 50 мкл, содержащем IX буфер AmpliTaq, 200 мкМ dNTP, 50 пмоль каждого клонирующего праймера, 2,5 единицAmpliTaq (Perkin-Elmer) и 100 нг каждой фаговой библиотеки ДНК с использованием аппарата MJ Research DNA Engine с установленной программой, работающей в следующем режиме; 94 С, 1 мин; 40- 26007611 циклов - 94 С, 1 мин, х С и у мин и 72 С (где х означает наименьшую температуру Тm=5 С, и у=1 мин на т.п.н. продукта); затем 1 цикл - 72 С, 7 мин и цикл выдерживания при 4 С. Продукты амплификации визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1X буфере ТАЕ (Life Technologies) и ПЦР-продукты, мигрирующие в предполагаемой молекулярной массе, выделяли из геля с использованием системы очистки ДНК Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega). ПЦРпродукты, элюированые в 50 мкл стерильной воды, либо непосредственно субклонировали, либо хранили при -20 С.(iii) Геноспецифические клонирующие праймеры для ПЦР. Пары ПЦР-праймеров, имеющих длину от 18 до 25 нуклеотидов, конструировали для амплификации полноразмерной последовательности предполагаемой кДНК с использованием программы PrimerDesigner Software (ScientificEducational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA). ПЦРпраймеры оптимизировали так, чтобы Tm была близка к 5510 С, и содержание GC составляло 40-60%. Отбирали праймеры, которые обнаруживали высокую селективность для последовательности-мишениINSP002 (низкий уровень или отсутствие неспецифического праймирования с другими матрицами).(pCRII-TOPO) с использованием набора для клонирования ТОРО ТА, закупленного у Invitrogen Corporation (cat.K4600-01 и K3575-01 соответственно), и с использованием условий, указанных производителем. Вкратце, 4 мкл выделенного из геля ПЦР-продукта, полученного в результате амплификации библиотеки последовательностей почки плода человека (библиотека номер 12), инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре с 1 мкл вектора ТОРО и 1 мкл солевого раствора. Затем реакционную смесь трансформировали в штамм ТОР 10 Etcoli (Invitrogen) следующим образом: 50 мкл-аликвоту клетокOne Shot TOP10 оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси ТОРО. Смесь инкубировали в течение 15 ч на льду и затем подвергали тепловому шоку путем инкубирования при 42 С в течение точно 30 с. Затем образцы снова помещали на лед и добавляли 250 мкл теплой среды SOC (при комнатной температуре). Образцы инкубировали со встряхиванием (220 об/мин) в течение 1 ч при 37 С. Затем смесь для трансформации высевали на чашки с L-бульоном (LB), содержащие ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37 С. Резистентные к ампициллину колонии, содержащие кДНК-вставки,идентифицировали с помощью ПЦР колоний.(v) ПЦР колоний. Колонии инокулировали в 50 мкл стерильной воды с использованием стерильной зубочистки. Затем 10 мкл-аликвоту инокулята подвергали ПЦР в общем реакционном объеме 20 мкл, как описано выше, за исключением того, что в качестве пар праймеров использовали SP6 и Т 7. Циклы проводили в следующих условиях: 94 С, 2 мин, 30 циклов при 94 С, 30 с.; 47 С, 30 с. и 72 С, 1 мин; 1 цикл, 72 С, 7 мин. Затем перед проведением анализа образцы выдерживали при 4 С (цикл выдерживания). Продукты ПЦР-реакции анализировали на 1% агарозных гелях в буфере 1 X ТАЕ. Колонии, которые давали ПЦР-продукт предполагаемого размера (159 п.н. -кДНК + 187 п.н., что обусловлено присутствием сайта множественного клонирования или MCS), культивировали в течение ночи при 37 С в 5 млL-бульона (LB), содержащего ампициллин (100 мкг/мл), со встряхиванием при 220 об/мин при 37 С.(vi) Получение и секвенирование плазмидной ДНК. Минипрепарат плазмидной ДНК получали из 5 мл культур с использованием роботизированной системы Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen) или набора Wizard Plus SV Miniprep (Promega cat.1460) в соответствии с инструкциями производителей. Плазмидную ДНК элюировали в 100 мкл стерильной воды. Концентрацию ДНК измеряли с использованием фотометра Эппендорфа ВО. Затем плазмидную ДНК(200-500 нг) подвергали ДНК-секвенированию с использованием праймера 17 и праймера SP6 и с использованием системы BigDye Terminator (Apllied Biosystems cat.4390246) в соответствии с инструкциями производителей. Реакционные смеси для секвенирования очищали на колонках с Dye-Ex (Qiagen) или на планшетах для очистки Montage SEQ 96 (Millipore cat.LSKS09624) и затем анализировали на секвенаторе Applied Biosystems 3700."правильном" размере (159 п.н.), идентифицировали в библиотеках кДНК коры головного мозга, толстой кишки, легких плода и почек плода (библиотеки 8, 9, 11 и 12). Последовательность ПЦР-продукта, клонированного в вектор pCRII-TOPO, показана на фиг. 7 и карта плазмиды (плазмида ID 13422) - на фиг. 8. Неполная клонированная кДНК представляла собой часть экзона 2 INSP002, как было показано путем сопоставления предсказанной нуклеотидной последовательности INSP002 и клонированной неполной нуклеотидной последовательности на фиг. 9 а, и сопоставления предсказанной последовательности белкаINSP002 и клонированной неполной последовательности белка на фиг. 9b. Пример 4. Генерирование ORF INSP002 из Image: 4558384.Image-клон 4558384 (в плазмиде рОТВ 7), выделенный из ретинобластомы, закупали у Resgen (Invitrogen Corp.). Уколочную культуру E.coli 4558384 засевали путем разбрасывания на LB-чашки, содержащие ампициллин (100 мкг/мл) и культивировали в течение ночи при 37 С. Отдельные резистентные к- 27007611 ампициллину моноколонии инокулировали в 5 мл среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали со встряхиванием при 220 об/мин в течение ночи при 37 С. Получали минипрепарат плазмидной ДНК, который секвенировали с использованием праймеров SP6, Т 7, M13F, INSP002-CP1 иINSP002-CP2, как описано в примере 3(vi). Последовательность вставки показана на фиг. 10. Сопоставление нуклеотидной последовательности и предполагаемой аминокислотной последовательности, предсказанной, исходя из кДНК Image 4558384,с INSP002, показано на фиг. 11. Очевидно, что кДНК Image 4558384 представляет собой вариант сплайсинга INSP002. Этот вариант, по сравнению с предсказанной последовательностью INSP002, содержит 87 п.н.-вставку, которая вводит сдвиг рамки считывания и ранний стоп-кодон. Помимо 3'нетранслируемой последовательности, он также содержит Alu-повтор, что указывает на контаминирующее включение геномной ДНК в кДНК. Экзоны 2 и 4 Image 4558384 эквивалентны экзонам 1 и 2 предсказанного INSP002. Однако Image 4558384 вводит дополнительный экзон между экзонами 1 и 2 предсказанного INSP002. Дополнительный экзон кодирует ранний стоп-кодон, что предотвращает трансляцию домена "цистиновый узел". Границы сплайсинга в Image 4558384 показаны ниже: Для удаления геномной ДНК в целях генерирования полноразмерной кДНК, кодирующей ORFINSP002, рекомендуется использовать ПЦР-стратегию. ПЦР-праймеры были сконструированы для амплификации 5'-конца (выше) и 3'-конца (ниже) последовательности INSP002, которая фланкирует 87 п.н.вставку в клоне Image. Обратный праймер для расположенной выше последовательности и прямой праймер для расположенной ниже последовательности содержали комплементарные последовательности у своих 3'- и 5'-концов соответственно для создания перекрывающихся концов так, чтобы ПЦР-продукты от каждой реакции могли смешиваться и подвергаться отжигу, что обеспечивало бы амплификацию полноразмерной кДНК в третьей ПЦР-реакции, проводимой с использованием присоединяемого выше"гнездового" прямого праймера и присоединяемого ниже "гнездового" обратного праймера. Первая ПЦР-реакционная смесь, используемая для амплификации 5'-конца INSP002 (выше от 87 п.н.-вставки), содержала, в конечном объеме 50 мкл, 5 мкл 10 Х буфера Pfx Platinum, 1,5 мкл dNTP (10 мМ), 1 мкл MgSO4 (50 мМ), 1,5 мкл INSP002V-5'-F (10 мкМ), 1,5 мкл INSP002V-5'-R (10 мкМ), 0,75 мклPfx Platinum и 135 нг плазмидной кДНК IMAGE:4558384. Амплификацию осуществляли в следующих условиях: 1 цикл при 94 С, 2 мин, 30 циклов при 94 С, 15 с и 68 С, 1 мин. и 1 цикл при 68 С, 7 мин. Вторую ПЦР-реакцию амплификации 3'-конца INSP002 (ниже от 87 п.н.-вставки) осуществляли в тех же самых условиях, за исключением того, что в качестве праймеров использовали INSP002V-3'-F и INSP002V3'-R. Продукты амплификации визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1X буфере ТАЕ (Invitrogen). ПЦР-продукты, мигрирующие в предполагаемой молекулярной массе (520 п.н. и 448 п.н, для ПЦР 1 и 2 соответственно) выделяли из геля с использованием системы очистки ДНК Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega). ПЦР-продукты элюировали в 50 мкл стерильной воды, и концентрацию ДНК измеряли с использованием фотометра Эппендорфа ВО. Затем 50 нг каждого очищенного ПЦР-продукта использовали в качестве матрицы для "гнездовой" ПЦР в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл 10 Х буфера Pfx Platinum, 1,5 мкл dNTP (10 мМ), 1 мкл MgSO4 (50 мМ), 1,5 мкл INSP002V-5'nest-F (10 мкМ), 1,5 мкл INSP002V-3' nest-R (10 мкМ). Реакционную смесь нагревали при 95 С в течение 3 мин и добавляли 0,75 мкл полимеразы Pfx Platinum. Амплификацию осуществляли в следующих условиях: 1 цикл при 94 С, 2 мин, 30 циклов при 94 С, 15 с, 61 С, 30 с и 68 С 1 мин и 1 цикл 68 С, 7 мин. ПЦРпродукты, мигрирующие в предполагаемой молекулярной массе 719 п.н., выделяли из геля с использованием системы очистки ДНК Wizard PCR Preps DNA Purification System и элюировали в 50 мкл стерильной воды. Затем 4 мкл очищенного ПЦР-продукта лигировали в вектор pCR4blunt-TOPO, как описано в- 28007611 разделе 1.4. Резистентные к ампициллину колонии тестировали на вставки с помощью ПЦР колоний с использованием праймеров Т 3 и Т 7, как описано в разделе 1.5. Колонии, которые давали ПЦР-продукт ожидаемого размера (719 п.н.+106 п.н., что обусловлено присутствием сайта множественного клонирования или MCS), культивировали в 5 мл LB-бульона, содержащего ампициллин (100 мкг/мл), со встряхиванием при 220 об/мин при 37 С. Минипрепарат плазмидной ДНК получали из 5 мл культур и секвенирвоали с использованием праймеров Т 3 и Т 7, как описано в разделе 1.6. Последовательность одного из полученных клонов и соответствующая плазмидная карта (pCR4blunt-TOPO-INSP002V) показаны на фиг. 12 и 13 соответственно. Трансляция клонированной последовательности показала, что INSP002V содержит 2 аминокислотных делеции (V107 и Q108) и одну аминокислотную замену (F110L) по сравнению с предсказанной последовательностью INSP002. Сопоставление нуклеотидной и аминокислотной последовательностей предсказанного INSP002 и INSP002V проиллюстрировано на фиг. 14. При сравнении с предсказанным INSP002 было выявлено, что на границе сплайсинга между экзонами 1 и 2 используется расположенный выше донорный сайт длиной 6 п.н. Это приводит к делеции двух аминокислот (ValGlu). Используемый акцептор сплайсинга аналогичен акцептору, используемому в предсказанном INSP002, однако за этим акцептором имеются две ошибки, обнаруженные при секвенировании. Это приводит к аминокислотной замене (PheLeu). Пример 5. Конструирование плазмиды для экспрессии INSP002V в клетках HEK293/EBNA. Клон pCR4blunt-TOPO, содержащий полноразмерную кодирующую последовательность (ORF)INSP002V, идентифицированную путем секвенирования ДНК (фиг. 13), затем использовали для субклонирования вставки в вектор для экспрессии pEAK12d в клетках млекопитающего (фиг. 15) с использованием методики клонирования Gateway (Invitrogen).(i) Генерирование Gateway-совместимой ORF INSP002, присоединенной к последовательностиметке 6HIS, с сохранением рамки считывания. Первая стадия способа клонирования Gateway включает двухстадийную ПЦР-реакцию, которая генерирует ORF INSP002V, фланкированную у 5'-конца сайтом рекомбинации attB1 и последовательностью Козака, и у 3'-конца - последовательностью, кодирующей, с сохранением рамки считывания, 6 гистидиновую (6HIS) метку стоп-кодоном и сайтом рекомбинации attB2 (Gateway-совместимой кДНК). Первая ПЦР-реакционная смесь (в конечном объеме 50 мкл) содержала: 25 нг pCR4blunt-TOPOINSP002V (плазмида 13075 и фиг. 13), 1,5 мкл dNTP (10 мМ), 5 мкл 10 Х полимеразного буфера Pfx, 1 мкл MgSO4 (50 мМ), 0,5 мкл каждого геноспецифического праймера (100 мкМ) (INSP002V ЕХ 1 иINSP002V-ЕХ 2) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Pfx Platinum (Invitrogen). ПЦР-реакцию осуществляли с использованием начальной стадии денатурации при 95 С, 2 мин, с последующим проведением 12 циклов при 94 С, 15 с, и 68 С, 30 с. ПЦР-продукты очищали непосредственно из реакционной смеси с использованием системы очистки ДНК Wizard PCR Prep (Promega) в соответствии с инструкциями производителей. Вторая ПЦР-реакционная смесь (в конечном объеме 50 мкл) содержала: 10 мкл очищенного ПЦРпродукта, 1,5 мкл dNTP (5 мМ), 1 мкл MgSO4 (50 мМ), 5 мкл 10X полимеразного буфера Pfx Platinum, 0,5 мкл каждого праймера для конверсии Gateway (100 мкМ) (прямого праймера GCP и обратного праймераGCP) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Pfx Platinum. Вторую ПЦР-реакцию осуществляли при следующих условиях: 95 С, 1 мин., 4 цикла при 94 С, 15 с; 45 С, 30 с и 68 С, 3,5 мин; 25 циклов при 94 С, 15 с; 55 С,30 с и 68 С, 3,5 мин. ПЦР-продукты очищали, как описано выше.(ii) Субклонирование Gateway-совместимой ORF INSP002V во встраивающий вектор pDONR201Gateway и экспрессирующий вектор pEAK12d. Вторая стадия способа клонирования Gateway включает субклонирование Gateway-модифицированного ПЦР-продукта во встраивающий вектор pDONR201 Gateway (Invitrogen, фиг. 16), которое осуществляли следующим образом: 5 мкл очищенного ПЦР-продукта инкубировали с 1,5 мкл вектора pDONR201 (0,1 мкг/мкл) , 2 мкл буфера ВР и 1,5 мкл клоназной ферментной смеси ВР (Invitrogen) при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакцию прекращали добавлением протеиназы K (2 мкг) и инкубировали при 37 С еще 10 мин. Аликвоту реакционной смеси (2 мкл) трансформировали в клетки DH10BE.coli путем электропорации с использованием импульсного устройства Biorad Gene Pulser. Трансформанты высевали на LB-планшеты с канамицином. Плазмидный минипрепарат ДНК (Mini-prep) приготавливали из 1-4 полученных колоний с использованием набора Wizard Plus SV Minipreps (Promega), и затем 1,5 мкл плазмидного элюата использовали в реакционной смеси для рекомбинации, содержащей 1,5 мкл вектора pEAK12d (фиг. 9) (0,1 мкг/мл), 2 мкл буфера LR и 1,5 мкл клоназы LR (Invitrogen) в конечном объеме 10 мкл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем реакцию прекращали добавлением протеиназы K (2 мкг) и смесь инкубировали при 37 С в течение еще 10 мин. Аликвоту этой реакционной смеси (1 мкл) использовали для трансформации клеток DH10B E.coli путем электропорации. Клоны, содержащие "правильную" вставку, идентифицировали путем проведения ПЦР колоний,как описано выше, за исключением того, что для ПЦР использовали праймеры pEAK12d (pEAK12d F иpEAK12d R). Плазмидный минипрепарат ДНК выделяли из клонов, содержащих "правильную" вставку, с использованием роботизированной системы Qiaprep Turbo 9600 (Quigen) или вручную с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep (Promega), и последовательность подтверждали с использованием прай- 29007611 меров pEAK12d F и pEAK12d R. Очищенный в градиенте CsCl максипрепарат ДНК плазмиды pEAK12d-INSP002V-6HIS (плазмидаID номер 13227, фиг. 17) получали из 500 мл культуры клонов с подтвержденной последовательностью(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), ресуспендировали при концентрации 1 мкг/мл в стерильной воде и хранили при -20 С.(iii) Конструирование экспрессирующего вектора pEAK12d. Вектор pEAK12d представляет собой совместимый с системой клонирования Gateway вариант вектора рЕАK12 для экспрессии в клетках млекопитающих (закупленного у Edge Biosystems), в котором нужная кДНК экспрессируется под контролем человеческого промотора EF1. Вектор pEAK12d генерировали, как описано ниже. рЕАK12 расщепляли рестриктирующими ферментами HindIII и NotI, затупляли по концам фрагментом Кленова (New England Biolabs) и дефосфорилировали с использованием щелочной фосфатазы кишечника теленка (Roche). После дефосфорилирования вектор лигировали с сохранением рамки считывания с затупленным по концам кластером С Gateway (система конверсии вектора Gateway, Invitrogen,cat11828-019), который содержит сайты рекомбинации AttR, фланкирующие ген ccdB и ген резистентности к хлорамфениколу и трансформировали в клетки DB3.1 E.coli (которые обеспечивают размножение векторов, содержащих ген ccdB). Минипрепарат ДНК выделяли из нескольких полученных колоний с использованием набора Wizard Plus SV Miniprep (Promega) и расщепляли ферментамиAseI/EcoRI для идентификации клонов с получением фрагмента длиной 670 п.н., что указывало на то,что этот кластер был встроен в "правильной" ориентации. Полученная плазмида была обозначенаpEAK12d (фиг. 15). Пример 6. Экспрессия INSP002-SV-6HIS-V1 в клетках млекопитающих (плазмида 13227) и очистка. Клетки почек эмбриона человека 293, экспрессирующие ядерный антиген вируса Эпштейна Барра(HEK293-EBNA, Invitrogen), поддерживали в суспензии бессывороточной среды Ех-клеток VPRO (посевной материал, поддерживающая среда, JRH). За 16-20 ч до трансфецирования (день 1), клетки высевали во флаконы с 2 х Т 225 (50 мл на флакон в среде DMEM/F12 (1:1, содержащие посевную среду с 2%FBS (JRH) при плотности 2 х 105 клеток/мл. На следующий день (день трансфекции 0) осуществляли трансфекцию с использованием реагента JetPEI (2 мкл/мкг плазмидной ДНК, PolyPlus-трансфекция). Для каждого флакона, 113 мкг ДНК ( 13227) ко-трансфецировали 2,3 мкг GFP (флуоресцентного репортерного гена). Затем смесь для трансфекции добавляли во флаконы с 2 х Т 225 и инкубировали при 37 С (5% СО 2) в течение 6 дней. Для повышения шансов получить большее количество материала, эту процедуру повторяли в еще в двух колбах, в результате чего получали всего 200 мл продукта. Подтверждение позитивной трансфекции проводили путем качественной оценки флуоресценции на день 1 и на день 6 (Axiovert 10 Zeiss). На 6-й день (день сбора), супернатанты (200 мл) из четырех флаконов объединяли и центрифугировали (4 С, 400 г), затем помещали в сосуд, содержащий уникальный идентификатор. Одну аликвоту (500 мкл) оставляли для проведения количественной оценки (QC) 6 хНis-меченного белка (QC внутреннего биопроцессинга). Способ очистки 200 мл образца культуральной среды, содержащего рекомбинантный белок с С-концевой меткой 6His, разводили холодным буфером А (50 мМ NaH2PO4; 600 мм NaCl; 8,7 % (мас/об) глицерина, рН 7,5) до конечного объема 400 мл. Образец фильтровали через стерильный фильтр 0,22 мкм (Millipore, 500 млфильтровальное устройство) и выдерживали при 4 С в стерильном квадратном 500 мл-сосуде со средой(Nalgene). Очистку осуществляли при 4 С на рабочей станции VISION (Applied Biosystems), подсоединенной к автоматическому устройству для загрузки образцов (Labomatic). Процедура очистки состояла из двух последовательных стадий, т.е., сначала проводили металлоаффинную хроматографию на колонке с Poros 20 МС (Applied Biosystems), загруженной ионами Ni (4,6 х 50 мм, 0,83 мл), затем проводили гельфильтрацию на колонке (1,0 х 10 см) со средой, содержащей сефадекс G-25 (Amersham Pharmacia). Для проведения первой стадии хроматографии, металлоаффинную колонку регенерировали 30 колоночными объемами раствора EDTA (100 мМ EDTA; 1M NaCl; pH 8,0), снова загружали ионы металла путем промывки 15 колоночными объемами 100 мМ раствора NiSO4, после чего промывали 10 колоночными объемами буфера А, затем промывали 7 колоночными объемами буфера В (50 мМ NaH2PO4; 600 мМ NaCl; 8,7 % (мас/об) глицерин, 400 мМ имидазол; рН 7,5) и, наконец, уравновешивали 15 колоночными объемами буфера А, содержащего 15 мМ имидазола. Образец загружали на аффинную колонку с металлическим Ni партиями по 200 мл. 200 мл образца переносили с помощью устройства для загрузки образцов Labomatic в 200 мл-петлю для образца и затем загружали на аффинную колонку с металлическим Ni при скорости потока 10 мл/мин. Для загрузки 400 мл образца на колонку процедуру переноса и загрузки повторяли еще раз. По окончании процедуры загрузки колонку промывали 12 колоночными объемами буфера А, затем 28 колоночными объемами буфера А, содержащего 20 мМ имидазола. Во время промывки 20 мМ имидазолом, высвобождаемые примесные белки элюировались с колонки. И нако- 30