Конструкция катетера и области ее применения

007594 Предпосылки изобретения Область изобретения Данное изобретение относится к области медицинских устройств для долгосрочного введения, в частности, катетеров, а также к области способов и конструкций для промывки, закрепления, заправки и нанесения покрытия на эти медицинские устройства. Изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, применяемым для увеличения потока в катетере и предотвращения возникновения инфекции в катетерах, подверженных фибриновым отложениям или содержащих сгустки на основе фибрина. Описание связанных документов Системы доставки широко используются в медицине в качестве устройств для введения жидких веществ, которые могут включать лекарственные или питательные вещества, или другие активные вещества, в определенный участок организма пациента. Такие системы часто включают использование катетеров, которые во многих случаях вводят хирургическим путем или внутривенно и вшивают для длительного применения желаемого вещества. Типичные системы включают центральные катетеры, которые могут быть использованы для общего парентерального питания (TPN), используемого, например,при синдроме укороченной толстой кишки (для продления жизни), с риском сепсиса или эндокардита. Такие системы также включают катетеры и дренажи, используемые в перитонеальном диализе у пациентов с терминальной почечной недостаточностью, которая в случае инфицирования может привести к перитониту с серьезными последствиями. Интраваскулярные катетеры относятся к наиболее распространенным медицинским устройствам. Такие катетеры при помощи стандартных операций помещают в васкулярную систему пациента для различных процедур и часто оставляют на месте в течение длительного времени. Один из типов систем доставки, используемых в течение нескольких лет при лечении различных расстройств у людей, включает резервуар или камеру малого объема, имплантируемую подкожно под фасцию с прямым доступом через катетер к кардиоваскулярной системе. Такие системы известны как системы портов. Поскольку порт и интраваскулярный катетер являются прямыми путями из окружающей среды в кровообращение пациента, присутствие катетера или порта создает значительный и постоянный потенциал для попадания микроорганизмов в кровообращение пациента. В настоящее время общепризнано, что такая постоянная катетеризация у терапевтических, хирургических, гинекологических, урологических и других пациентов может привести к серьезному инфицированию мочеполовых путей. Практикующие врачи разработали множество методик, касающихся введения, использования, прикрепления и извлечения устройств жидкостного регулирования и других операций, производимых с катетерами. Почти все эти операции имеют целью предотвращение проникновения микроорганизмов в кровообращение пациента. Разработан ряд методик для снижения риска инфицирования, которые используют в медицинских устройствах антибактериальные средства, но ни одна из них не показала полностью удовлетворительных результатов в клинических испытаниях. Эти устройства предпочтительно обеспечивают эффективные уровни антибактериального средства в течение всего периода использования устройства. Такое замедленное высвобождение может быть труднодостижимо, так как может потребоваться специальный механизм распределения антибактериального средства в течение длительного периода времени, и введение достаточных количеств антибактериального средства может негативно повлиять на поверхностные характеристики устройства. Трудности, возникающие при обеспечении эффективной антибактериальной защиты, усугубляются развитием патогенов, обладающих устойчивостью к лекарствам. В настоящее время стандартный уход за васкулярными катетерами включает промывку полости катетера антикоагулянтом, таким как гепарин, для предотвращения коагуляции крови внутри и вокруг наконечника катетера и создания помех потоку жидкостей через катетер. Кроме того, гепарин не обладает антибактериальным действием и, к тому же, при недостаточном контроле, он может завести антикоагуляционный процесс слишком далеко, создав опасность кровотечения. Гепарин также может привести к образованию антител, вызывающих серьезное расстройство, называемое гепарин-индуцированной тромбоцитопенией (HIT), которое истощает тромбоциты и дополнительно увеличивает опасность кровотечения. Таким образом, инфекции и тромбозная закупорка по-прежнему составляют распространенную проблему, несмотря на профилактическое использование гепариновых промывок. Необходимо пристальное изучение патогенеза и микробиологии инфекций, обусловленных центральными венозными катетерами,для эффективного устранения этой проблемы.Staphylococcus epidermidis и S. aureus вызывают 75% инфекций, обусловленных центральными венозными катетерами (CVC). Виды Candida насчитывают еще 10-15% таких инфекций. Было обнаружено,что использование антистафилококковых антибиотиков для предотвращения этих инфекций снижаетCVC-обусловленные бактериальные инфекции, но только за счет увеличения степени грибковых (кандидозных) инфекций. Наблюдается также корреляция между тромбообразованием и инфицированием. По существу, фибриновая оболочка, постепенно покрывающая внутреннюю и внешнюю поверхности катетера, поглощает постоянные васкулярные катетеры. Эта фибриновая оболочка развивает такие организмы, как Staphylococci и Candida с повышенной способностью адгезии к поверхности катетера. В отличие от этих микроб-1 007594 ных видов, грамотрицательные бациллы не показывают существенного сцепления с фибрином и фибронектином. Таким образом, состав, останавливающий образование фибрина, был бы особенно полезен для предотвращения колонизации Staphylococci, Candida и т.п. на участках постоянных катетеров. После введения лекарственного препарата в организм пациента через катетер врач обычно осуществляет введение промывочного раствора, который может включать антикоагулянт, такой как гепарин. Промывочный раствор должен вытеснить лекарственный препарат из катетера таким образом, чтобы обеспечить доставку всей дозы, и остаться в некотором количестве в катетере, чтобы кровь пациента не проходила в катетер и не образовывала сгусток, который может засорить отверстие катетера. Таким образом, когда катетер понадобится в следующий раз, хорошо промытый катетер будет полностью свободным и готовым для очередного использования.Root et al., Antimicrob. Agents Chemother. 32: 1627-1631 (1988) опубликовали исследование действия в катетерах динатрий-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), соединения, хорошо известного своими хелатирующими свойствами in vivo и широко используемого в качестве антикоагулянта in vitro. В патенте США 5363754 описано применение фармацевтических композиций смеси миноциклина и ЭДТА для поддержания свободным порта катетера. В патенте США 5091442 описаны трубчатые изделия, такие как презервативы и катетеры с противомикробными свойствами, обусловленными введением в них неионного слаборастворимого противомикробного препарата, такого как триклозан. Этот противомикробный препарат может быть распределен во всем изделии или в его покрытии. В патенте США 5362754 описан фармацевтический препарат, включающий миноциклин и ЭДТА для поддержания катетера свободным. В патенте США 5362754 описано использование смеси миноциклина и ЭДТА(М-ЭДТА) для поддержания порта катетера свободным. В работе Purchase et al., Nephron. 58: 119-20 (1991) описано использование для этой цели кальциевых комплексонов, включая цитрат. В работе Butuovic et al., Artif. Organs. 22: 945-7 (1998) показано, что цитрат и полигелин, являющийся заменителем плазмы, получаемым из костей крупного рогатого скота,имеют одинаковую эффективность с гепарином в поддержании катетера свободным. В лекции на 30-м ежегодном заседании Американского Нефрологического общества, состоявшемся 2-5 ноября 1997 г. в Сан-Антонио, Техас, Sodemann et al. сообщили, что удаления катетеров из-за инфекции можно избежать благодаря постоянному применению концентрированной смеси гентамицина/цитрата. Однако один из цитратных кальциевых комплексонов для диализных катетеров марки TRICITRASOL имеет определенные недостатки. Некоторые пациенты жалуются на кратковременную потерю вкусовых ощущений сразу после инъекции цитрата. Имеется недавнее сообщение FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, США) о случае смерти пациента вскоре после инъекции цитрата для блокировки катетера (Stas et al., Nephrol Dial Transplant. 16: 15211522 (2001); FDA выпустило предупреждение по применению антикоагулянта triCitrasol (торговая марка) для диализных катетеров. FDA Talk Paper T00-16, 14 April 2000. В патенте США 5019096 описаны устойчивые к инфекции медицинские устройства, включающие синергическую комбинацию соли серебра (например, сульфадиазина серебра) и хлоргексидина. В патенте США 5772640 описаны полимерные медицинские изделия, включающие антибактериальные средства, хлоргексидин и триклозан. В патенте США 5362754 описано предотвращение образования гликокаликса на катетере за счет нанесения покрытия из ЭДТА и/или миноциклина, предотвращающего бактериальные и грибковые инфекции. В патенте США 6258797 описан способ предотвращения инфекции или сепсиса в системах катетеров и портов путем использования противомикробного блокирующего раствора тауролидина или таурултама. В патенте США 6166007 описаны противомикробные блокирующие вещества, включающие производные тауринамида и карбоновые кислоты и/или их соли для предотвращения инфекции и коагуляции крови внутри или вблизи медицинского протезного устройства после введения этого устройства в тело пациента. В ЕР 1040841 описано предотвращение тромбоза и/или бактериального роста на контактирующей с жидкостью поверхности системы доставки путем контактирования этой поверхности с жидкостью, предотвращающей тромбоз, которая содержит антикоагулянт - тауролидин и/или таурултам. В ЕР 882461 описано медицинское устройство, обладающее как физиологической, так и противомикробной активностью, которое включает основной материал и пленочное покрытие из сшитого полимера, образованное на поверхности основного материала, при этом и физиологически активное вещество, и противомикробное вещество связаны с пленкой покрытия. В публикации Boorgu et al., ASAIO J., 46. (6): 767-770 (Nov. 2000) описана дополнительная антибиотическая/антикоагулянтная блокирующая терапия при лечении бактериемии, связанной с использованием имплантируемых подкожно устройств доступа для гемодиализа. К устройству прикрепляют два катетера, которые имплантируют в верхнюю полую вену или правое предсердие. Антибиотическая/антикоагулянтная блокирующая терапия включает вливание антибиотика и антикоагулянта в устройство. См. также Schwartz et al., Journal of Clinical Oncology, 8(9): 1591-1597 (1990) и Kamal et al.,JAMA. 265(18):2364-2368 (1991).Wiernikowski et al., Am J. Pediatr Hematol Oncol. 13(2): 137-140 (1991) показывают, что бактериостатические промывочные солевые растворы эффективнее предотвращают инфекцию катетера, чем обыч-2 007594 ный солевой раствор. Vercaigne et al., Pharmacotherapy. 20: 394-9 (2000) оценивали гепарин в сочетании с антибиотиками в качестве блокирующего раствора для предотвращения инфекции. В работе Patel et al.,Thromb Hemost. 82: 1205-6 (1999) описано успешное использование слабодозированного r-гирудина для рецидивного тромбоза диализного катетера у пациента с гепарин-индуцированной тромбоцитопенией.Darouiche et al., Nutrition. 13(4) (suppl): 26S-29S (1997) сообщают, что предотвращение васкулярной катетер-обусловленной инфекции может быть обеспечено путем использования противомикробных средств,включающих применение местных дезинфектантов, таких как хлоргексидин, использование пропитанных серебром подкожных манжет (для CVC кратковременного использования), промывку катетеров комбинацией противомикробных и противотромбозных средств и нанесение на катетеры покрытия из антисептических (хлоргексидин и сульфадиазин серебра) или противомикробных средств (миноциклин и рифампин). Антибактериальные блокирующие растворы используются для очистки катетеров. Например, в патенте США 6174537 описан промывочный раствор для катетеров. См. также Sodermann et al. Blood(Wyeth-Ayerst); и Henrickson et al., J. Clin Oncol., 18: 1269-1278 (2000) о предотвращении CVCобусловленных инфекций и тромботических явлений с использованием ванкомицин/ ципрофлоксацин/гепаринового промывочного раствора. Имплантируемые CVC с мягкой манжетой, такие как QUINTON PERMCATH CVC (Quinton Instrument Co., Seattle, WA), все чаще используются у пациентов с почечной недостаточностью в терминальной стадии в качестве средства постоянного доступа. Главными ограничениями их применения,кроме инфекций, являются тромбоз и неадекватный кровоток. Для предотвращения этих осложнений обычно используют гепарин для заправки центральных венозных катетеров QUINTON PERMCATH между сеансами диализа. Schenk et al., Amer. J. Kidney Diseases. 35: 130-136 (Jan. 2000) показали, что рекомбинантный тканевой активатор плазминогена (rt-PA) оказался лучше гепарина для заправки QUINTON PERMCATH между сеансами диализа. Однако Schenk et al. использовали 2 мг альтеплазы в сочетании с SWFT (стерильная вода для инъекций, фармакопея США), что не предотвращало рост бактерий. Закупорка или блокировка центральных венозных устройств доступа (CVAD) вследствие образования кровяного сгустка (тромба) внутри или у наконечника катетера CVAD представляют собой распространенную проблему, которая может препятствовать применению такого вида терапии у пациентов. Оценки показывают, что закупориваются 25% CVAD, при этом наиболее распространенная этиология включает тромбоз (Haire et al., Thromb. Haemost. 72: 543-547 (1994); Rubin, J. Clin. Oncol., 1: 572-573(1983); Lokich et al., J. Clin. Oncol.,3: 710-717 (1985. В 1994 г. Haire et al., выше, провели дважды слепое,перспективное, рандомизированное испытание урокиназы в сравнении с альтеплазой (t-PA) в дисфункциональных катетерах, которые по данным рентгенографии оказались закупоренными тромбом. Катетеры обрабатывали 2 мг альтеплазы или 10000 ед. урокиназы, которые оставляли в устройстве на 2 ч. После 1-2 обработок альтеплаза восстанавливала функцию большего количества катетеров, чем урокиназа(89% против 59% (р=0,013. 4 сентября 2001 г. Управление США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило тромболитическое средство CATHFLO ACTIVASE (альтеплаза) t-PA для восстановления функции CVAD, оцениваемой по способности отбирать кровь. CATHFLO ACTIVASE t-PA выпускается в 2-мг одноразовых ампулах, является единственным серийно выпускаемым тромболитическим препаратом, применяемым для этой цели, и предлагает медицинским работникам разумный способ обработки при осложнениях CVAD, которые могут затруднять уход за пациентом. Одна ампула CATHFLO t-PA содержит 2,2 мг альтеплазы, 77 мг L-аргинина, 0,2 мг эмульгатора POLYSORBATE 80 и фосфорную кислоту для создания рН 7,3.t-РА связывали с другими материалами, отличными от васкулярных катетеров. См., например, Zhoual., Biomaterials. 17: 75-77 (1996). В патенте США 5688516 описано использование выбранных комбинаций хелатирующего средства, антикоагулянта или антитромботического средства, с негликопептидным противомикробным средством, таким как тетрациклиновые антибиотики, для образования покрытия медицинского устройства и ингибирования инфекции катетера. Предпочтительные комбинации включают миноциклин или другой негликопептидный противомикробный препарат вместе с ЭДТА, ЭГТА, ДТПА, ТТГ, гепарином и/или гирудином в фармацевтически приемлемом разбавителе. В патенте США 6187768 также описано использование противомикробного средства и антикоагулянта, антитромботического средства или хелатирующего средства для поддержания свободными постоянных медицинских устройств, таких как катетеры, и для предотвращения инфекций, вызванных ростом бактерий в катетерах. Несмотря на вышеописанные достижения, существует необходимость в нетоксичном способе удаления фибринсвязанных кровяных сгустков из катетеров, в частности, постоянных медицинских устройств. Также существует необходимость в предотвращении образования и удалении фибрина из таких устройств, так как определенные бактерии содержат участки связывания, в частности, склонные к сцеплению с фибрином.-3 007594 Краткое изложение изобретения Данное изобретение относится к растворам, уникальным по своей способности удовлетворять вышеописанные требования, не основанным на антикоагуляционном, противотромботическом или хелатирующем действии и без использования антибиотиков, к которым млекопитающие могут развивать устойчивость. Данное изобретение решает проблемы, изложенные выше, путем использования активатора плазминогена в сочетании с дезинфектантом, используемым в качестве антисептика (консерванта), в основном, органическим спиртом, обладающим этой способностью. Полученная композиция не только обладает фибринолитической активностью, но и предотвращает рост патогенов, в частности, в закупоренных катетерах, и соответствует стандартам USP (фармакопея США). Область изобретения изложена в формуле изобретения. В частности, в первом аспекте данное изобретение относится к композиции, применяемой для удаления фибринсвязанных сгустков крови из катетера, содержащей воду, фибринолитически эффективное количество активатора плазминогена и антисептически эффективное количество бактериостатического органического спирта, при этом композиция не включает хелатирующее средство. В следующем аспекте изобретение относится к комплекту, состоящему из нескольких отсеков,включая отсек, содержащий фибринолитически эффективное количество активатора плазминогена, отсек, содержащий воду, включающую антисептически эффективное количество бактериостатического органического спирта, при этом ни один отсек не содержит хелатирующего средства, и инструкции по смешиванию содержимого обоих отсеков и по использованию полученной смеси для удаления фибринсвязанных сгустков крови из катетера, который содержит такие сгустки крови. В следующем аспекте изобретение относится к комплекту, состоящему из нескольких отсеков,включая отсек, содержащий от 0,1 до 10 мг/мл t-PA нативной последовательности или тенектеплазы и отсек, содержащий воду, включающую от 0,5 до 1,2% (об./об.) бензилового спирта, изопропанола или этанола, при этом ни один отсек не содержит хелатирующего средства, и инструкции по смешиванию содержимого обоих отсеков и по использованию полученной смеси для удаления фибринсвязанных сгустков крови из катетера, который содержит такие сгустки крови. Предпочтительное количество бензилового спирта, являющегося здесь предпочтительным спиртом,составляет около 0,8-1,1%. Этот диапазон и более широкий диапазон 0,5-1,2% достаточен для ингибирования роста микробов, но сохраняет стабильность и функцию активатора плазминогена. Преимущество этих спиртов состоит в том, что они не приводят к развитию устойчивости к антибиотикам. В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу удаления фибринсвязанных сгустков крови из катетера, который содержит такие сгустки крови, включающему контактирование катетера с вышеописанной композицией по меньшей мере в течение 5 дней. В следующем варианте осуществления изобретение относится к катетеру, покрытому вышеописанной композицией. Краткое описание чертежа Обрезанные хроматограммы SEC для разведенных образцов rt-PA (1 мг/мл в BWFI, BNS и SWFI) после 14 дней хранения при 37 С в стеклянных пробирках показаны на чертеже. Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления Определения. В данном описании выражение "катетер" относится к медицинскому устройству, обычно изготавливаемому из конструкционных полимеров, таких как полиуретан, силикон или другие подобные полимеры медицинского назначения для доставки лекарств и отбора крови. Такие катетеры включают широкое разнообразие постоянных медицинских устройств, таких как мочевой катетер, васкулярный катетер,в частности, CVC или периферический внутривенный катетер, артериальный катетер, трахеальный катетер, катетер Свана-Ганза, гемодиализный катетер, пупочный катетер, подкожный нетуннелированный силиконовый катетер, туннелированный центральный венозный катетер с манжетой, подкожный центральный венозный порт и т.п. Выражение "васкулярный катетер" относится к катетеру, вводимому в васкулярную систему, и включает периферические катетеры и CVC, устройства с манжетами для длительного применения и краткосрочного применения, устройства без манжет и имплантируемые порты. CVC, или центральные венозные устройства доступа (CVAD), включают центральные катетеры, вводимые периферически (линии PICC), наружные устройства с манжетами, катетеры без манжет, нетуннелированные и подкожно туннелированные катетеры, гемодиализные (HD) катетеры и порты. Предпочтительными катетерами в данном изобретении являются постоянные катетеры, такие какCVC, предпочтительно туннелированный CVC с манжетой, периферический внутривенный катетер, артериальный катетер, катетер Свана-Ганза, гемодиализный катетер, пупочный катетер, подкожный нетуннелированный силиконовый катетер или подкожный центральный венозный порт. Также предпочтительным является мочевой катетер или перитонеальный катетер. Кроме того, предпочтительными являются внутривенный катетер, в частности, изготовленный из биомедицинского полиуретана или силикона, или васкулярный катетер. Выражение "препарат" или "композиция" здесь относится к композиции, раствору, составу и т.п.,-4 007594 представляющему собой смесь ингредиентов, описанных выше. Выражения "контакт", "контактирование" и т.п. означают воздействие реагента любым способом,например путем покрытия, инкубирования и т.д. Выражения "покрытие", "покрытый" и т.д. здесь относятся к маканию, пропитке и/или импрегнированию катетера композицией, описанной здесь. Выражение "бактериостатический органический спирт" означает органический спирт, являющийся дезинфектантом, используемым в качестве антисептика, и не классифицируется как антибиотик или относящийся к классу антибиотиков. Дезинфектанты, являющиеся химическими препаратами, ингибирующими или убивающими микроорганизмы, определены в Basic and Clinical Pharmacology. 8th edition(2001), Section VII. Chemotherapeutic Drugs. Chapter 50. Miscellaneous Antimicrobial Agents - Disinfectants,Antiseptics, and Sterilants. Консерванты, представляют собой химические препараты, используемые для предотвращения порчи препаратов микробами. Дезинфектанты используются в качестве антисептиков для предотвращения чрезмерного роста бактерий и грибков в фармацевтических препаратах. Они должны быть эффективными в предотвращении роста микроорганизмов, которые могут в них содержаться, и должны иметь достаточную растворимость и стабильность, чтобы оставаться активными, как описано вEllenhorn's Medical Toxicology 2nd Ed. (1997), Section IV. Chemicals. Chapter 57. Antiseptics and Disinfectants. Примеры таких органических спиртов-антисептиков включают этанол, изопропанол и бензиловый спирт, являющиеся здесь предпочтительными, при этом бензиловый спирт наиболее предпочтителен. Бензиловый спирт, являющийся гидрофобным, может разрушать стенки клеток и мембраны микроорганизмов, денатурировать белки и инактивировать ферменты. Выражение "бактериостатическая вода для инъекций" или "BWFI" относится к смеси воды и переменных количеств бензилового спирта, а также к воде, не содержащей других ингредиентов, по определению фармакопеи США (USP). Выражение "стерильная вода для инъекций" или "SWFI" здесь означает только стерильную воду без других ингредиентов. Выражение "нормальный солевой раствор" или "NS" здесь означает смесь воды с соответствующим количеством (например, 0,9% (вес/об. хлорида натрия, без других ингредиентов. Выражение "бактериостатический нормальный солевой раствор" или "BNS" здесь относится к стерильной воде с соответствующим количеством (например, 0,9% (вес./об. хлорида натрия и с соответствующим количеством (т.е. антисептически эффективным) бактериостатического органического спирта,такого как бензиловый спирт, без других ингредиентов. Выражение "активатор плазминогена" здесь означает фибринолитический одно- или двухцепной активатор плазминогена, включая активатор мочевого плазминогена в нативной или вариантной форме,тканевой активатор плазминогена в нативной форме, такой как альтеплаза t-PA ACTIVASE, или в вариантной форме, такой как r-РА (ретеплаза; RETAVASE; Centocor, Inc.) и тенектеплаза (инвариант tPA, обозначаемый T103N, N117Q, K296 А, Н 297 А, R298A, R299A, выпускаемый под маркой TNKASE компанией Genentech, Inc. и описанный, например, в патенте США 5612029), а также урокиназа (например, ABBOKINASE; Abbott), которая может представлять собой существующую в природе нативную молекулу или вариант урокиназы, имеющий фибринолитическую функцию для растворения сгустков в крови и предотвращения накопления и удаления фибрина. Предпочтительно активатор плазминогена представляет собой t-PA нативной последовательности, фибринолитический вариант t-PA, урокиназу нативной последовательности или фибринолитический вариант урокиназы. Более предпочтительно активатор плазминогена представляет собой t-PA нативной последовательности, фибринолитический вариант t-PA или урокиназу нативной последовательности. Еще более предпочтительно активатор плазминогена представляет собой t-PA нативной последовательности или фибринолитический вариант t-PA. Еще более предпочтительно вариант t-PA представляет собой тенектеплазу или ретеплазу. Наиболее предпочтительно активатор плазминогена представляет собой t-PA нативной последовательности или тенектеплазу. Выражение "хелатирующее средство" здесь означает средство, используемое для хелатирования,такое как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), DMSA (димеркаптосукциновая кислота), дефероксамин, димеркапрол, цитрат цинка, TRICITRASOL (цитратный кальциевый комплексон), комбинации висмута и цитрата, пеницилламин, сукцимер или этидронат. Другие хелатирующие средства включают этиленгликоль-бис-(бета-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (EGTA) и диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPА) и ее соли, а также динатрия кальция эдетат, триэтилентетрамина дигидрохлорид и вещества, хелатирующие двухвалентные катионы металлов, таких как Са, Mg,Mn, Fe и Zn. Модели осуществления изобретения Данное изобретение относится к композициям, используемым для удаления фибринсвязанных сгустков крови из катетера, содержащего воду, фибринолитически эффективное количество активатора плазминогена и антисептически эффективное количество бактериостатического органического спирта. Композиция не содержит хелатирующего средства. Вода предпочтительно содержит, во-первых, бактериостатический органический спирт. Существует-5 007594 четыре основных типа разбавителей, используемых для разбавления или разведения лекарственных препаратов: BWFI, SWFI, BNS и NS. Данное изобретение включает только бактериостатические разбавители, т.е. BWFI и BNS. Предпочтительно вода, содержащая спирт, представляет собой бактериостатическую воду для инъекций или бактериостатический нормальный солевой раствор. рН композиции, описываемой здесь, должна быть пригодной для биологического использования. Обычно композиция или раствор по данному изобретению имеет рН в диапазоне от 3 до 7, предпочтительно от 3,5 до 6,5 и наиболее предпочтительно от 4,5 до 6,5. Композиция обычно имеет физиологический уровень рН. Если необходимо, рН может быть отрегулирована добавлением кислоты или основания, например, минеральной кислоты, такой как соляная кислота, или предпочтительно кислоты, не вызывающей ацидоз, такой как уксусная, яблочная или молочная кислота. Другие способы регулирования рН, известные специалистам, также могут быть использованы. Тест для выяснения, является ли количество активатора плазминогена в композиции фибринолитически эффективным, может быть проведен, например, путем in vitro анализа растворения сгустка, например, как описано ниже в примерах. Антисептически эффективное количество спирта может быть определено, например, путем теста на противомикробную эффективность, изложенного ниже в примерах. Предпочтительно количество активатора плазминогена составляет около 0,1-10 мг/мл, а антисептически эффективное количество органического спирта предпочтительно составляет около 0,5-1,2% (об./об.). Более предпочтительно фибринолитически эффективное количество активатора плазминогена составляет около 0,3-5 мг/мл, еще более предпочтительно около 0,5-4 мг/мл и наиболее предпочтительно около 1-3 мг/мл. Наиболее предпочтительное количество органического спирта составляет около 0,8-1,1% (об./об.). Композицию по изобретению предпочтительно подвергают условиям, в которых любые содержащиеся в ней микроорганизмы становятся по существу нежизнеспособными, и заполняют ею герметизируемую емкость, такую как шприц, пробирку с закрытой мембраной или ампулу, по существу устойчивую к проникновению микроорганизмов. Предпочтительно герметизируемая емкость содержит аликвоту промывочного раствора, достаточную для выполнения одной процедуры промывки катетера. Для специальных целей может быть предпочтительна общая емкость, содержащая достаточное количество раствора для дозирования нескольких аликвот, предназначенных для отдельных процедур промывки катетера. Способ промывки внутривенного катетера включает приготовление смешанного раствора, описанного выше, и контактирование катетера с таким раствором по меньшей мере в течение 2 ч. Способ включает заполнение манипуляционного жидкостного устройства, предпочтительно шприца, аликвотой раствора, достаточной для выполнения процедуры промывки катетера. Предпочтительное количество для промывочной процедуры обычно составляет от 1 до 3 мл. Затем исполнитель фиксирует шприц в целевом интраваскулярном катетере, требующем промывки, и вводит раствор в катетер, таким образом выполняя процедуру промывки. Описанный способ может быть использован для удаления имеющихся сгустков крови практически из любого туннелированного или нетуннелированного катетера. Как часть режима обслуживания катетера, промывка катетера наиболее предпочтительно должна выполняться с использованием композиции,описанной здесь, например, раз в неделю, один раз в 4 дня, один раз каждые 2 дня, раз в день (примерно каждые 24 ч), два раза в день, каждые 4 ч или по необходимости, в соответствии с нуждами пациента,известными опытному практикующему врачу. Режим промывки катетера может просто состоять в одной промывке при каждой смене катетера. В предпочтительном варианте осуществления способа катетер должен промываться чаще, с 4-часовыми интервалами, композицией, описанной здесь. Хотя способ по изобретению относится к введению композиции в катетеры, уже установленные на целевом участке, опытным специалистам будет понятно, что контактирование или покрытие катетера композицией вне тела пациента может предотвратить отложение фибрина на такой поверхности после имплантации катетера и сократить участки бактериального роста. Таким образом, поверхности катетеров, например, гемодиализных катетеров, могут быть предварительно обработаны композицией, описываемой здесь. Катетер может быть обработан композицией предварительно, а после введения может подвергаться периодическим промывкам. Частные примеры катетеров, которые могут быть изготовлены и покрыты композицией по изобретению, перечислены выше. В способе покрытия активатор плазминогена, вода и спирт используются в таких количествах, чтобы их комбинация в обработанном изделии обладала существенной фибринолитической и антисептической активностью. В одном из вариантов осуществления катетер представляет собой полиуретановый или силиконовый катетер (или изготовленный из подобных полимеров), обработанный (т.е. путем макания или пропитки) пропиточным раствором, описанным выше. Затем поверхность катетера, представляющую интерес, подвергают воздействию композиции в течение периода времени, достаточного для образования композицией пленки или покрытия на контактирующей с ней поверхности устройства. Поскольку композиция представляет собой жидкость, она должна высохнуть на поверхности устройства в течение достаточного времени для образования пленки. Количество описанной здесь композиции, вводимое в катетер, должно быть достаточным для его заполнения. Такие устройства, если они являются гемодиализными катетерами, обычно имеют внутрен-6 007594 ний объем в диапазоне от 0,1 до 10 мл. Эти цифры, безусловно, будут варьироваться в зависимости от длины и диаметра трубки устройства, которые, среди прочего, могут зависеть от размера тела пациента. Если из катетера нужно удалить фибринсвязанные сгустки крови, катетер может контактировать с раствором, описанным здесь, в течение по меньшей мере 5 дней, предпочтительно около 6-15 дней. В следующем варианте осуществления изобретение относится к комплекту или пакету. В одном из вариантов комплект или пакет включает контейнерное устройство, такое как шприц с отсеками, включающее по меньшей мере два отдельных отсека. Один отсек или контейнер содержит фибринолитически эффективное количество активатора плазминогена, такого как t-PA, а второй отсек или контейнер содержит воду, включающую антисептически эффективное количество бактериостатического органического спирта. Как и композиция, ни один отсек не содержит хелатирующего средства. Пакет также включает инструкции по смешиванию содержимого обоих отсеков и по использованию полученной смеси для удаления фибринсвязанных сгустков крови из катетера, который содержит такие сгустки крови. t-PA может иметь форму сухого лиофилизованного порошка, который потом разводят водой для получения раствора, удобного для использования. Комплект может включать дополнительный контейнер, адаптированный для принятия содержимого двух отсеков. Пакет, описанный здесь, может представлять собой комплект, в котором каждый отсек является отдельным контейнером, таким как пробирка или ампула, или пакет может представлять собой шприц с несколькими отсеками. Различные особенности и аспекты изобретения дополнительно представлены в примерах, описанных ниже. Поскольку эти примеры приведены лишь для иллюстрации использования изобретения в пределах его области, они не должны рассматриваться как ограничивающие область изобретения. Все приведенные здесь литературные источники включены в данную заявку в виде ссылок. Пример 1 (сравнительный). Краткое изложение. Тест, описанный ниже, проводили для оценки противомикробных свойств 2 мг/мл t-PAACTIVASE, разведенного в SWFI. Этот образец показал несоответствие требованиям теста на противомикробную эффективность USP. Тест на противомикробную эффективность USP. Этот тест используют для оценки эффективности антисептика в препарате или для оценки собственной противомикробной способности активного ингредиента. Этот тест описан в USP 24, "Microbiological Tests/(51) Antimicrobial Effectiveness Testing, стр. 1809-1811. А. Материалы и основное оборудование. 1. Пробные микроорганизмы включали Escherichia coli, ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa, ATCC 9027, Staphylococcus aureus, ATCC 6538, Candida albicans, ATCC 10231 и Aspergillus niger, ATCC 16404. 2. Среды, добавки и основное оборудование включали Соево-триптиказный агар (TSA) Декстрозный агар Сабуро (SDA) Солевой раствор, буферизованный фосфатом (PBS), стерильный, рН 7,20,2 Стерильные 50-мл конические пробирки Стерильные тампоны и серологические пипетки Спектрофотометр Счетчик колоний микроорганизмов, Quebec или эквивалентный Термостаты при 2-8 С, 22,52,5 С и 32,52,5 С В. Методика. 1. Получение инокулята. Готовили суспензию каждого микроорганизма для получения приблизительной концентрации 1108 колониеобразующих единиц (CFU)/мл. Каждую из пяти конических пробирок, содержащих 10 мл образца, инокулировали 0,05 мл одного из пробных микроорганизмов с получением исходной концентрации от 1105 CFU/мл до 1106 CFU/мл тестового препарата. Исходную популяцию жизнеспособных организмов в каждом тестовом препарате рассчитывали на основе концентрации микроорганизмов в каждом стандартизованном инокуляте методом Pour Plate (глубинного посева). Этот метод представляет собой стандартную микробиологическую методику определения количества микроорганизмов в тестовом образце. Тестовый образец разбавляют стерильным солевым раствором и отмеривают пипеткой в стерильную чашку Петри. Затем в чашку Петри наливают расплавленный агар (питательную среду), смешивают с образцом и инкубируют при стандартизованной температуре и времени. Этот метод обеспечивает получение колоний, которые формируются во всем агаре, не только на поверхности. Около 10 мл образца оставили неинокулированным в одной конической пробирке в качестве отрицательного контрольного опыта. При Т=7 дней, 14 дней и 28 дней популяцию каждого микроорганизма в инокулированных образцах и в отрицательном контрольном опыте определяли методом глубинного посева, подтвержденным методом чашечного подсчта микроорганизмов. Условия инкубации для метода глубинного посева представлены в табл. 1.-7 007594 2. Проверка достоверности метода глубинного посева. Провели серию разведений образца 1:10 и 1:100 с получением разбавленных концентраций. 1-мл порцию каждой разбавленной концентрации образца ввели в каждую из 5 чашек Петри. Для каждой разбавленной концентрации образца в соответствующую чашку Петри добавили 0,1-мл аликвоту, содержащую около 1103 CFU/мл каждого пробного микроорганизма. Параллельно тот же объем инокулята каждого микроорганизма ввели в каждую из двух пластин без разбавленных концентраций образца для подтверждения количества микроорганизмов. 15-20-мл порцию расплавленного агара, поддерживаемого при 45 С, добавили в каждую чашку и осторожно перемешали содержимое круговыми движениями. Чашки оставили для отвердевания и инкубировали, как показано в табл. 1. 3. Приготовление образца. 10 мл образца ввели в каждую из пяти пробирок. Каждую пробирку пометили "ЕС", "PA", "SA","СА" или "AN" так, чтобы для каждого пробного микроорганизма была предназначена одна пробирка. 10 мл образца ввели в одну пробирку, помеченную как отрицательный контрольный опыт. В альтернативном варианте на этапах введения и маркирования в каждую пробирку вводили 20 мл образца. 4. Определение бионагрузки. С использованием отрицательного контрольного опыта определяли бионагрузку образца методом глубинного посева. Использовали условия среды и инкубации, представленные в табл. 1. 5. Инокуляция образца. 0,05 мл каждой суспензии микроорганизма инокулировали при 1108 CFU/мл в соответствующую пробирку, содержащую 10 мл образца. Объем суспензионного инокулята составил 0,5% объема образца. Смесь тщательно перемешали путем вращения. Конечная концентрация тестового препарата составила около 5,0105 CFU/мл. В альтернативном варианте, если в каждой пробирке был использован объем 20 мл образца, на этапе инокуляции вводили 0,1 мл каждой пробной суспензии. 6. Подтверждение исходной концентрации. Чашечный подсчет для каждого стандартизованного инокулята (1,0 х 108 CFU/мл) выполняли методом глубинного посева. Использовали условия среды и инкубации, представленные в табл. 1. Чашечный подсчт выполняли в двух экземплярах с получением среднего значения для каждого стандартизованного инокулята. Исходную концентрацию каждого пробного микроорганизма в тестовом препарате рассчитывали с использованием следующего уравнения: где S - средняя концентрация микроорганизма в стандартизованной суспензии (1,0108 CFU/мл),I - объем инокулята (0,05 мл),Р - объем тестового препарата (10 мл). 7. Хранение образцов и тестовые интервалы. Инокулированные контейнеры и отрицательный контрольный опыт инкубировали при 22,52,5 С с защитой от света. Из каждого контейнера отбирали образцы через промежутки времени, указанные в табл. 2. Чашечный подсчт инокулированных образцов и отрицательного контрольного опыта проводили методом глубинного посева. Чашечный подсчт выполняли в двух экземплярах. Использовали условия среды и инкубации, представленные в табл. 1. Таблица 1 Условия инкубации для метода глубинного посева-8 007594 Таблица 2 Время отбора образцов для парентеральных препаратов С. Критерии соответствия. 1. Для достоверности испытания пробными микроорганизмами концентрация пробных микроорганизмов в каждом тестовом препарате составляла от 1105 CFU/мл до 1106 CFU/мл. В образцах, испытанных проверенным методом чашечного подсчта микроорганизмов, обнаружимой бионагрузки не было. 2. Для достоверности метода чашечного подсчта микроорганизмов среднее подсчитанное значение извлеченного инокулята при каждом уровне разведения должно быть больше или равно 50% среднего значения для соответствующего контрольного опыта. Если среднее подсчитанное значение извлеченного инокулята при разведении составляет менее 50%, все подсчитанные значения при этом разведении считаются недостоверными.l. По USP. Для бактерий должно наблюдаться снижение по шкале десятичного логарифма не менее 1,0 относительно исходного подсчитанного количества через 7 дней, не менее 3,0 относительно исходного количества через 14 дней, а через 28 дней не должно быть увеличения относительно количества, определенного через 14 дней. Для дрожжевых и плесневых грибов не должно быть увеличения относительно исходного подсчитанного количества через 7, 14 и 28 дней. "Отсутствие увеличения" означает не более 0,5 логарифмических единиц выше предыдущей измеренной величины. 2. По ЕР. Критерии оценки противомикробной активности для парентеральных препаратов представлены в табл. 3 в виде логарифмического снижения количества жизнеспособных микроорганизмов относительно величины, полученной для инокулята. Таблица 3 Критерии ЕР для оценки противомикробной активности для парентеральных препаратовN1 - Отсутствие увеличения. "Отсутствие увеличения" означает не более 0,3 логарифмических единиц выше предыдущей измеренной величины.Критерий А выражает рекомендуемую эффективность, которая должна быть достигнута. В оправданных случаях, когда критерий А не может быть достигнут, например, из-за повышенного риска отрицательных реакций,должен быть удовлетворен критерий В. Тест с t-PA ACTIVASE и SWFI. А. Материалы, оборудование и методика. Образец представлял собой 2 мг/мл t-PA альтеплазы ACTIVASE в пробирке с SWFI, не содержащей бензилового спирта. Пробные микроорганизмы и все среды, добавки и основное оборудование соответствовали перечисленным для предыдущего теста. Методика соответствовала методике, описанной для предыдущего теста, а условия инкубации - приведенным в табл. 1. Критерии соответствия и интерпретация соответствовали описанным для предыдущего теста. Результаты. Рассчитанные исходные концентрации пробных микроорганизмов в каждом тестовом препарате составляли от 1105 CFU/мл до 1106 CFU/мл (табл. 4).-9 007594 В образцах, испытанных методом глубинного посева, обнаружимой бионагрузки не было (табл. 5). Метод чашечного подсчта был подтвержден с использованием метода глубинного посева. Среднее значение извлеченного инокулята при разведении образца 1:10 было больше или равно 50% среднего значения соответствующего контрольного опыта (табл. 6). Для P. aeruginosa и S. aureus логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было больше или равно величине 1,3 через 7 дней, меньше 3,0 через 14 дней и больше или равно 3,6 через 28 дней (табл. 7 и 8). Для Е. coli логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было меньше 1,0 через 7 дней и меньше 3,0 через 14 дней и 28 дней (табл. 7 и 8). Для дрожжевых и плесневых грибов логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было больше или равно 0,6 через 7 дней, больше или равно 1,0 через 14 дней и больше или равно 1,6 через 28 дней (табл. 7 и 8). Таблица 4 Расчетные исходные концентрации пробных микроорганизмов- 10007594 Таблица 6 Среднее количество извлеченного инокулята в методе глубинного посева Таблица 7 Микробная популяция за 28 дней- 11007594 Таблица 8 Логарифмическое снижение микробной популяции за 28 дней Заключение. В бактериальном тесте на противомикробную эффективность данный образец показал несоответствие требованиям USP. Образец показал логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации 1,0 через 7 дней для Е. coli. Через 14 дней логарифмическое снижение микроорганизмов во всех трех бактериальных тестах составило 3,0. Для дрожжевых и плесневых грибов через 7,14, и 28 дней не было увеличения относительно рассчитанного исходного значения. Пример 2. Краткое изложение. Тестирование проводили, как описано выше для противомикробной эффективности, для оценки эффективности 0,8% бензилового спирта в качестве антисептика в 2 мг/мл t-PA ACTIVASE в соответствии с требованиями USP. Этот образец показал соответствие требованиям теста USP на противомикробную эффективность. Материалы, оборудование и методика. Образец представлял собой t-PA ACTIVASE (2 мг/мл) в пробирке с 0,8% бензилового спирта. В частности, разбавителем служила стерильная вода с добавлением соответствующего количества бензилового спирта до конечной концентрации 0,8%. Пробные микроорганизмы соответствовали описанным в примере 1. Среды, добавки и основное оборудование соответствовали перечисленным в примере 1. Используемая методика соответствовала описанной в примере 1, а условия инкубации соответствовали указанным в табл. 1. Критерии соответствия и интерпретация соответствовали описанным в примере 1. Результаты. Результаты были идентичными представленным в табл. 4 и 5 для рассчитанной исходной концентрации пробных микроорганизмов в каждом тестовом препарате (от 1105 до 1106 CFU/мл) и для бионагрузки в образце в методе глубинного посева (отсутствие обнаружимой бионагрузки). Метод чашечного подсчта микроорганизмов подтверждали с использованием метода глубинного посева. Среднее количество извлеченного инокулята при разведении образца 1:10 было больше или равно 50% среднего значения соответствующего контрольного опыта (табл. 9). Для бактерий логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было больше 3,3 через 7 дней и больше 4,3 через 14 и через 28 дней (табл. 10 и 11). Для дрожжевых и плесневых грибов логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было больше или равно 3,1 через 7 дней и больше 4,6 через 14 и через 28 дней (табл. 10 и 11).- 12007594 Таблица 9 Среднее количество извлеченного инокулята в методе глубинного посева Таблица 10 Микробная популяция за 28 дней- 13007594 Таблица 11 Логарифмическое снижение микробной популяции за 28 дней Заключение. Этот образец показал соответствие требованиям теста USP на противомикробную эффективность. Пример 3. Краткое изложение. Тестирование проводили, как описано выше для теста на противомикробную эффективность, для оценки эффективности 0,9% бензилового спирта в качестве антисептика в 2 мг/мл t-PA ACTIVASE в соответствии с требованиями USP. Этот образец показал соответствие требованиям теста USP на противомикробную эффективность. Материалы, оборудование и методика. Образец представлял собой t-PA ACTIVASE (2 мг/мл) в пробирке с 0,9% бензилового спирта. В частности, разбавителем была стерильная вода с добавлением соответствующего количества бензилового спирта до конечной концентрации 0,9%. Пробные микроорганизмы соответствовали описанным в примере 1. Среды, добавки и основное оборудование соответствовали перечисленным в примере 1. Используемая методика соответствовала описанной в примере 1, а условия инкубации соответствовали указанным в табл. 1. Критерии соответствия и интерпретация соответствовали описанным в примере 1. Результаты. Результаты были идентичными представленным в табл. 4 и 5 для рассчитанной исходной концентрации пробных микроорганизмов в каждом тестовом препарате (от 1105 до 1106 CFU/мл) и для бионагрузки в образце в методе глубинного посева (отсутствие обнаружимой бионагрузки). Метод чашечного подсчта микроорганизмов подтверждали с использованием метода глубинного посева. Среднее количество извлеченного инокулята при разведении образца 1:10 было больше или равно 50% среднего значения соответствующего контрольного опыта (табл. 12). Для бактерий логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было больше 3,3 через 7 дней и больше 4,3 через 14 и через 28 дней (табл. 10 и 11). Для дрожжевых и плесневых грибов логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было больше или равно 3,6 через 7 дней и больше 4,6 через 14 и через 28 дней (табл. 13 и 14).- 14007594 Таблица 12 Среднее количество извлеченного инокулята в методе глубинного посева Таблица 13 Микробная популяция за 28 дней- 15007594 Таблица 14 Логарифмическое снижение микробной популяции за 28 дней Заключение. Данный образец показал соответствие требованиям теста USP на противомикробную эффективность. В одном из предлагаемых способов заправки раствор CATHFLO ACTIVASE (альтеплазы), полученный путем разведения 2,2 мг лиофилизованного порошка 2,2 мл 0,9% бензилового спирта в стерильной бактериостатической воде для инъекций (концентрация 1 мг/мл) может быть введен внутрь васкулярного катетера в объеме, равном заправочному объему полости катетера. Затем раствор может быть аспирирован из катетера перед использованием катетера в медицинских целях. Пример 4. Краткое изложение. Тестирование проводили, как описано выше для теста на противомикробную эффективность, для оценки эффективности 1,0% бензилового спирта в качестве антисептика в 2 мг/мл t-PA ACTIVASE в соответствии с требованиями USP. Этот образец показал соответствие требованиям теста USP на противомикробную эффективность. Материалы, оборудование и методика. Образец представлял собой ACTIVASE t-PA (2 мг/мл) в пробирке с 1,0% бензилового спирта. В частности, разбавителем была стерильная вода с добавлением соответствующего количества бензилового спирта до конечной концентрации 1,0%. Пробные микроорганизмы соответствовали описанным в примере 1. Среды, добавки и основное оборудование соответствовали перечисленным в примере 1. Используемая методика соответствовала описанной в примере 1, а условия инкубации соответствовали указанным в табл. 1. Критерии соответствия и интерпретация соответствовали описанным в примере 1. Результаты. Результаты были идентичными представленным в табл. 4 и 5 для рассчитанной исходной концентрации пробных микроорганизмов в каждом тестовом препарате (от 1105 до 1106 CFU/мл) и для бионагрузки в образце методом глубинного посева (отсутствие обнаружимой бионагрузки). Метод чашечного подсчта микроорганизмов подтверждали с использованием метода глубинного посева. Среднее количество извлеченного инокулята при разведении образца 1:10 было больше или равно 50% среднего значения соответствующего контрольного опыта (табл. 15). Для бактерий логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было больше 3,3 через 7 дней и больше 4,3 через 14 и через 28 дней (табл. 16 и 17). Для дрожжевых и плесневых грибов логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было больше или равно 4,1 через 7 дней и больше 4,6 через 14 дней (табл. 16 и 17).- 16007594 Таблица 15 Среднее количество извлеченного инокулята в соответствии с методом глубинного посева Таблица 16 Микробная популяция за 28 дней- 17007594 Таблица 17 Логарифмическое снижение микробной популяции за 28 дней Заключение. Данный образец показал соответствие требованиям теста USP на противомикробную эффективность. Пример 5. Краткое изложение. Тестирование проводили, как описано выше для теста на противомикробную эффективность, для оценки эффективности 1,1% бензилового спирта в качестве антисептика в 2 мг/мл t-PA ACTIVASE в соответствии с требованиями USP. Этот образец показал соответствие требованиям теста USP на противомикробную эффективность. Материалы, оборудование и методика. Образец представлял собой ACTIVASE t-PA (2 мг/мл) в пробирке с 1,1% бензилового спирта. В частности, разбавителем была стерильная вода с добавлением соответствующего количества бензилового спирта до конечной концентрации 1,1%. Пробные микроорганизмы соответствовали описанным в примере 1. Среды, добавки и основное оборудование соответствовали перечисленным в примере 1. Используемая методика соответствовала описанной в примере 1, а условия инкубации соответствовали указанным в табл. 1. Критерии соответствия и интерпретация соответствовали описанным в примере 1. Результаты. Результаты были идентичными представленным в табл. 4 и 5 для рассчитанной исходной концентрации пробных микроорганизмов в каждом тестовом препарате (от 1105 до 1106 CFU/мл) и для бионагрузки в образце в методе глубинного посева (отсутствие обнаружимой бионагрузки). Метод чашечного подсчта микроорганизмов подтверждали с использованием метода глубинного посева. Среднее количество извлеченного инокулята при разведении образца 1:10 было больше или равно 50% среднего значения соответствующего контрольного опыта (табл. 18). Для бактерий логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было больше 3,3 через 7 дней и больше 4,3 через 14 и через 28 дней (табл. 16 и 17). Для дрожжевых и плесневых грибов логарифмическое снижение относительно рассчитанной исходной концентрации было больше или равно 3,6 через 7 дней и больше 4,6 через 14 и через 28 дней (табл. 19 и 20).- 18007594 Таблица 18 Среднее количество извлеченного инокулята в методе глубинного посева Таблица 19 Микробная популяция за 28 дней- 19007594 Таблица 20 Логарифмическое снижение микробной популяции за 28 дней Заключение. Данный образец показал соответствие требованиям теста USP на противомикробную эффективность. Пример 6. Краткое изложение. Альтеплазу (2 мг/пробирку rt-PA) разводили до 1 мг/мл BWFI, BNS и SWFI. Стабильность протеина после разведения в стеклянных пробирках наблюдали при 37 С в течение 2 недель. После 14 дней хранения при 37 С все разведенные растворы внешне оставались прозрачными и бесцветными. Концентрации протеина (1,10,02 мг/мл) и рН (7,20,03) не изменились. Содержание мономера по данным нативной гельпроникающей хроматографии показало постепенное снижение 1-3% и 4-5% через одну и две недели соответственно при 37 С. Снижение процента одиночных цепей и фибринолитической активности (invitro) наблюдалось через 1 неделю при 37 С. Однако процент одиночных цепей и фибринолитическая активность (in vitro) резко снизились через 14 дней при 37 С. Для протеинового раствора, разведенногоSWFI, наблюдалось большее количество протеолитических обрезков молекулы, чем при разведенииBWFI или BNS. Таким образом, альтеплаза (2 мг/пробирку rt-РА), разведенная BWFI, BNS или SWFI до 1 мг/мл была относительно стабильной при 37 С в течение 1 недели. Материалы и методика.B. Методика. Альтеплазу (2 мг/пробирку rt-PA) разводили до 1 мг/мл BWFI, BNS или SWFI (в двух экземплярах). Разведенные протеиновые растворы хранили при 37 С. Стабильность разведенных протеиновых растворов после хранения в течение 3 ч, 7 дней и 14 дней при 37 С оценивали путем анализов, описанных ниже. Для определения количества частиц при помощи анализатора HIAC/ROYCO проводили отдельный эксперимент. Альтеплазу (2-мг rt-PA) разводили BWFI, BNS или SWFI (в двух экземплярах) до 1 мг/мл. Четыре пробирки на группу для каждой временной точки объединили вместе в одной пробирке (5-мл стеклянная пробирка прибора). Определение количества частиц (отбор образцов 31 мл, первый прогон не учитывается) проводили при Т = 0 ч, 3 ч, 7 дней и 14 дней после хранения при 37 С. С. Аналитические показатели.(1) Цвет и прозрачность. Каждый образец в стеклянной пробирке исследовали в световом боксе, оснащенном черным и белым фоном. Соответственно записывали цвет и прозрачность образцов.(2) HIAC/ROYCO. Для измерения объединяли четыре пробирки с разведенным протеиновым раствором. Процедуру анализа твердых частиц для каждого из парентеральных препаратов малого объема проводили с той модификацией, что объем образца 1 мл тестировали с использованием 1-мл шприца вместо 5-мл объема при использовании 10-мл шприца. Записывали количество частиц, определенное в диапазоне размеров 10 и 25 мкм.(3) рН. Определяли рН выборочных аликвот с использованием рН-метра RADIOMETER PHM 93,- 20007594 оснащенного комбинированным рН-электродом (Microelectrodes, Inc.). рН-метр стандартизовали стандартными буферами с рН 4,01 и 7,00 (Mallinckrodt, Inc.). Аликвоты 20 мкл переносили для измерения в 0,5-мл пробирку Эппендорфа.(4) Концентрации, определяемые методом УФ-поглощения. Концентрации протеина определяли путем УФ-поглощения при 280 нм. Использовали спектрофотометр (НР 8253 А) на основе диодной матрицы UV/VTS с кварцевой кюветой (длина оптического пути 1 см) для измерения. Образцы разбавляли в 10-12,5 раз составным буфером. Измерение проводили в сравнении с соответствующим эталоном и при УФ-сканировании от 240 до 400 нм. Концентрации протеина рассчитывали следующим образом: Конц., мг/мл = (А 280-А 320)/1,9,где 1,9 - оптическая плотность (мл/мг-см) rt-PA при 280 нм.(5) % мономера, определяемый нативной SEC. Колонку TSK 3000SWXL (ToSoHaas, 3007,5 мм внутр. диам., 5-мкм) использовали для жидкостной хроматографии HP 1090 (ЖХ), в сочетании с детектором на основе диодной матрицы. Подвижная фаза включала 0,2 М аргинина, 0,12 М сульфата аммония, 10% изопропанола, рН 7,3. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Образцы (50 мкг rt-PAэквивалента) вводили в одном экземпляре и собирали хроматограммы с обнаружением при 280 нм. Процент мономера рассчитывали следующим образом:(6) % одиночных цепей, определяемый сокращенной SEC. Использовали колонку TSK 3000SWXL (ToSoHaas, 3007,5-мм внутр. диам., 5-мкм) для ЖХ HP 1090, в сочетании с детектором на основе диодной матрицы. Подвижная фаза включала 0,2 М фосфат натрия, 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), рН 6,8. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Образцы (12,5 мкг rt-PA-эквивалента) инкубировали с 20 мМ DTT (конечная концентрация) при 37 С в течение 3-5 мин и инжектировали в одном экземпляре. Хроматограммы наблюдали с обнаружением при 214 нм. Процент одиночных цепей (SC) рассчитывали следующим образом:(7) Активность растворения очищенного сгустка (фибринолитическая активность) для rt-PA. Эффективность протеина оценивали путем анализа растворения очищенного сгустка (тромба), описанного ниже в примере 7. Образцы разбавляли в аналитическом диапазоне (200-1000 нг/мл) с получением двух концентраций в разбавителе. Разбавление выполняли за день до анализа, и разбавленные образцы хранили при 2-8 С до проведения анализа на следующий день. Эталонный материал rt-PA разбавляли подобным образом в качестве внутреннего эталона. Результаты. Результаты исследования показаны в табл. 21 и 22. Через 14 дней хранения при 37 С все разведенные растворы выглядели прозрачными и бесцветными. Концентрации протеина (1,10,02 мг/мл) и рНHIAC/ROYCO, в альтеплазе (2 мг/пробирку rt-PA, n=l) при разведении BWFI, BNS и SWFI до 1 мг/мл,после хранения при 37 С. В таблице показано увеличение числа частиц (с размером 10 и 25 мкм) для всех протеиновых растворов после разведения, в сравнении с одним разбавителем. Однако все результаты находятся в пределах норм, допустимых по USP для инъекций малого объема (SVI, см. табл. 23). Наблюдалось некоторое снижение числа частиц для разведенного лекарственного средства после хранения при 37 С. Кроме того, полученное число частиц оказалось более низким для протеиновых растворов,разведенных BWFI и BNS, чем для протеиновых растворов, разведенных SWFI. Все разведенные растворы содержали 94-95% мономера через 14 дней при 37 С (табл. 22). Тесты на% одиночных цепей и фибринолитическую активность (in vitro) показали снижение через одну неделю при 37 С. % одиночных цепей оказался выше для протеиновых растворов, разведенных BWFI или BNS,чем для протеиновых растворов, разведенных SWFI. He вдаваясь в теорию, это можно объяснить присутствием антисептика, ингибирующего протеолитическую активность. Через две недели при 37 С процент одиночных цепей для протеиновых растворов, разведенных SWFI, упал до 50%, что ниже показателя стабильности ( 55%) для одиночных цепей в rt-PA. Кроме превращения одной цепи в две, хроматограммы сокращенной SEC для разведенных протеиновых растворов через 2 недели при 37 С показали присутствие обрезков/фрагментов молекул, что предполагает увеличение протеолитического расщепления при повышенной температуре с течением времени(см. фиг. 1). Фиг. 1 ясно показывает, что кроме наличия обрезков или фрагментов превращение одноцепных rt-PA в двухцепные происходило более интенсивно для rt-PA, разведенных SWFI, чем для разведенных BWFI или BNS, после хранения при 37 С в течение 14 дней. Анализ фибринолитической активности (in vitro) показал, что все разведенные растворы альтеплазы(1 мг/мл) сохраняли эффективность 100% через 3 ч при 37 С (табл. 23). Все образцы были бесцветными или прозрачными. Активность начала падать через неделю хранения при 37 С, но оставалась на уровне 90% (в сравнении с исходной, Т=0). Резкое снижение активности произошло через две недели при 37 С,с сохранением всего 44-65% активности.- 21007594 Таблица 21 Число частиц, определяемое методом HIAC/ROYCO, в разведенной альтеплазе (1 мг/мл, 2 мг/пробирку rtPA) после хранения при 37 С в течение 3 ч, 7 дней и 14 дней- 22007594 Таблица 22 Стабильность альтеплазы (2 мг/пробирку rt-PA), разведенной до 1 мг/мл BWFI, BNS, и SWFI,в стеклянных пробирках при 37 С- 23007594 Таблица 23 Пределы содержания твердых частиц в растворах для инъекций Заключение. Альтеплаза (2 мг/пробирку rt-PA), разведенная BWFI, BNS или SWFI до 1 мг/мл, была относительно стабильной при 37 С в течение недели в стеклянной пробирке. Предположительно, раствор BNS должен быть противомикробным, так как бензиловый спирт является в нем активным ингредиентом. Тестирование стабильности с использованием BNS было положительным, т.е. альтеплаза была стабильной и функциональной. Пример 7. Краткое изложение.t-РА, разведенный до 0,01 мг/мл в нормальном солевом растворе, оказался литически активным в тесте на эффективность растворения сгустка. В таком тесте тромбин и фибриноген смешивают друг с другом с получением фибрина; плазминоген и rt-PA смешивают друг с другом с получением плазмина; фибрин и плазмин вместе растворяют сгусток. В данном тесте измеряют способность t-РА взаимодействовать с плазминогеном с образованием плазмина и, таким образом, растворять сгусток. Материалы и методика. А. Материалы. Альтеплазу (2 мг/пробирку rt-PA) разбавляли до конечной концентрации протеина 0,01, 0,025, 0,05 и 0,1 мг/мл в баллонах для внутривенного вливания (IV-баллонах), содержащих 0,9% NaCl (нормальный солевой раствор, NS) (Baxter и/или Abbott, 250 мл). В частности, rt-PA, протеин в массе разбавляли до 1 мг/мл (эквивалент состава 50-мг пробирки, 0,004% поверхностно-активного вещества TWEEN 80) фильтрованной водой MILLI-Q или же пробирочный rt-PA (100-миллиграммовая пробирка) разводили до 1 мг/мл (0,008-0,011% TWEEN 80) стерильной водой для инъекций, USP (SWFI) с использованием 60-см 3 BD шприца и иглы 18G, непосредственно вставленной в резиновую мембрану пробирки у центра комка. Содержимое пробирки осторожно перемешивали круговыми движениями до полного растворения комка. Удаляли часть внутривенного разбавителя (0,9% NaCl, NS) и заменяли тем же количеством разведенного или разбавленного 1 мг/мл rt-PA следующим образом. Конечная конц., мг/мл Объем, мл, удаленный из 250-мл lV баллона(Замененный тем же объемом 1 мг/мл rt PA) 0,05 12,5 (30-см 3 шприц BD и игла 18G) 0,024 6 (10-см 3 шприц BD и игла 22G) 0,01 2,5 (3- или 5-см 3 шприц BD и игла 22G) Переполнение баллона не учитывали. После разбавления в IV-баллонах (n=2 для каждой концентрации) баллоны осторожно перемешивали путем переворачивания (20-24 раз). 10-мл аликвоту отбирали из впускного порта IV-баллона с использованием 10-см 3 шприца BD и иглы 22G. Аликвоту (t=0) вносили непосредственно в 20-см 3 прозрачную стеклянную пробирку типа I для визуального исследования. Подобному физическому исследованию также подвергали плацебо-эквиваленты при 0,025 и 0,05 мг/мл. В. Анализы. 1. Визуальное исследование. Каждую аликвоту исследовали в световом боксе, оснащенном черным и белым фоном. Аликвоты сравнивали с равным объемом SWFI или фильтрованной воды MILLI-Q в стеклянной пробирке такого же объема, служившей в качестве контрольного опыта. Соответственно записывали цвет и прозрачность аликвот. 2. Тест на растворение очищенного сгустка (микроцентрифужный анализатор (тест 1) и спектрофотометр для считывания планшетов (тест 2. Эффективность протеина альтеплазы t-PA оценивали при помощи теста на растворение очищенного сгустка, описанного ниже. Образцы разбавляли в аналитическом диапазоне (200-1000 нг/мл) с получением трех или двух концентраций в разбавителе. Разбавление проводили за день до анализа и разбавленные образцы хранили при 2-8 С до анализа на следующий день. Эталонный материал Rt-PA разбавляли подобным образом в качестве внутреннего эталона.a. Оборудование. Использовали микроцентрифужный анализатор IL MONARCH, модель 761, состоящий из узла анализатора с устройствами флуоресцентного и светорассеивающего анализа и встроенным компьюте- 24007594 ром и загрузочного узла.(вес/об.) NaN3 и 0,01% (об./об.) эмульгатора POLYSORBATE 80, рН 7,40,1. Человеческий тромбин (30-40 ед./мл) (Calbiochem), хранимый в закрытой пробирке замороженным при -60 С или ниже до использования. Плазминоген, хранимый замороженным при -60 С или ниже до использования. Биоклеточный фибриноген, приготовленный следующим образом. Фибриноген и буфер для растворения сгустка довели до комнатной температуры. Общий объем 7 мл буфера для растворения сгустка ввели в пробирку. Пробирку закрыли и обернули парафильмом. Пробирку положили на бок в чашку или закрепили в орбитальном шейкере. Скорость установили между 4 и 5. Пробирку встряхивали около часа,проверяя, насколько хорошо растворяется комок. Когда комок полностью растворился, раствор перенесли в 50-мл пробирку Фалькона. Прежнюю пробирку промыли минимум три раза буфером для растворения сгустка и промывочные жидкости перенесли в пробирку Фалькона, чтобы сохранить все остаточные глобулы или частицы. Раствор довели до конечного объема 30 мл с использованием меток на пробирке. Пробирку обернули парафильмом и поместили в шейкер на 15-30 мин. Весь протеин солюбилизировали после встряхивания. Раствор поместили на водный лед минимум на 2-3 ч и периодически осторожно встряхивали. С использованием бумаги WHATMAN1 раствор профильтровали путем сцеживания раствора с осадка. Профильтрованный раствор держали на льду. Эталонный материал (стандартный t-PA ACTIVASER). Все растворы, содержащие t-PA, держали в полистирольных или полипропиленовых контейнерах. с. Приготовление стандартных растворов. Из эталонного материала приготовили 10-мкг/мл общий стандартный раствор. Разведение записывали в таблицы анализа. Остальные стандарты готовили в соответствии с приведенной ниже схемой разведения. Все стандарты держали на льду, и срок годности для калибровочной кривой составлял 12 ч со времени их изготовления. Приготовление общего стандартного раствора и остальных стандартов повторили для получения двух калибровочных кривых.i. Исходный препарат. Если образец представлял собой пробирку с лиофилизованным материалом, ее содержимое разводили по объему до 1 мг/мл водой для инъекций (WFI). Если образец представлял собой стерильный материал в массе, его разводили до 1 мг/мл WFI.ii. Приготовление основного раствора образца. При помощи микропипетки 100 мкл 1,0-мг/мл образца rt-PA ввели в 15-мл полистирольную пробирку. 9,90 мл аналитического буфера добавили в пробирку с использованием 10-мл градуированной полистирольной пипетки или мерной пипетки с микропипеткой. Этот раствор обозначили как основной раствор образца.iii. Приготовление рабочего раствора образца. При помощи микропипетки 600 мкл основного раствора образца ввели в 15-мл полистирольную пробирку. 9,40 мл аналитического буфера добавили в пробирку с использованием 10-мл градуированной полистирольной пипетки или мерной пипетки с микропипеткой. Получили раствор образца для введения в чашки образцов. Разведенные образцы держали на льду.iv. Этапы приготовления основного и рабочего растворов образцов повторили для получения двух разведений образцов.v. Приготовление положительного контрольного опыта. Контрольный опыт приготовили путем разведения образца rt-PA до 1 мг/мл, пипетирования 0,5-мл- 25007594 аликвот в пробирки Эппендорфа и замораживания при -60 С. Для проведения анализа размораживали по одной пробирке каждый день. Контрольный опыт разбавляли с использованием 100 мкл образца тем же способом, что и образец. Разбавленные контрольные образцы держали на льду. е. Методика проведения анализа в анализаторе MONARCH 2000 (анализ 1). Данный анализ проводят следующим образом: реагентами являются вещества, добавляемые в раствор другого вещества для осуществления химической реакции. В данном случае содержимое лодочки 1 должно реагировать с содержимым лодочки 2 с образованием стандартизованного сгустка. Тромбин (лодочка 2) при смешивании с плазминогеном и фибриногеном (лодочка 1) вызывает превращение фибриногена в фибрин и образует стандартизованный in vitro сгусток, состоящий из плазминогена и фибрина. Затем на сгусток воздействуют тестовым образцом t-PA. T-PA вызывает превращение плазминогена в плазмин, и плазмин разрушает нити фибрина. По мере распада сгустка происходят изменения в оптической плотности. Оптическую плотность наносят на график зависимости от времени. Кончики пипеток анализатора проверили на правильность расположения, а водяной резервуар проверили на заполнение. Удалили пузырьки воздуха из шприцов, если необходимо, и выполнили промывочный цикл. Параметры анализатора приведены в табл. 24. Таблица 24 Параметры анализатора Эти пункты должны регулироваться соответствующим образом, для того чтобы обеспечить полный сбор данных. Лодочку с реагентом 1 приготовили путем добавления 200 мкл разведенного плазминогена к 10,0 мл фильтрованного фибриногена. Смесь осторожно перемешали и внесли в лодочку для реагента 1. Лодочку с реагентом 1 установили в первое положение стола анализатора для реагентов. Лодочку с реагентом 2 приготовили путем добавления 33 ед./мл раствора тромбина, описанного выше, в лодочку с реагентом 2. Лодочку с реагентом 2 установили в положение 2 анализатора. 0,25-мл чашки для образцов установили в кольца для образцов. С использованием одноразовых переносящих пипеток или пипетки PIPETMAN, чашки для образцов заполнили стандартом, контрольным раствором и образцами, как показано в табл. 25 Примерная схема загрузки. Если испытывали менее двух образцов, загрузку проводили, как указано в таблице, а в любые промежуточные пустые чашки вводили пипеткой аналитический буфер или воду. Нажимали кнопку "Special request" ("Специальный запрос") на анализаторе MONARCH. Вводили информацию чашек с образцами. Дважды нажимали кнопку "Accept" (Прием). По окончании пипетирования анализатором MONARCH, лодочки с реагентами снимали и помещали на лед. Кольцо для образцов снимали и помещали в холодильник при 2-8 С.i. Определение конечной точки. Конечная точка (время растворения) может быть определена при помощи компьютерной программы или вручную. Для автоматического компьютерного расчета конечной точкой является время, требуемое для растворения сгустка, которое определяется автоматически. При определении вручную конечной точкой считают первую временную точку ниже 0,03 единиц оптической плотности, в которой изменение составляет менее 0,003 абс. ед. В частности, при определении вручную, конечную точку определяли на основе временных данных оптической плотности. Определяли первую точку оптической плотности менее 0,0300. Конечную точку определяли как время достижения первой величины оптической плотности менее 0,0300, при которой изменение в оптической плотности между текущим значением оптической плотности и следующим значением оптической плотности составляло менее 0,0030. Если изменение оптической плотности было больше 0,0030, переходили к следующему показанию оптической плотности и определяли изменение оптической плотности. Конечной точкой считали первое значение оптической плотности для указанной пары (исходной и следующей величины оптической плотности), при которой изменение оптической плотности составляло менее 0,0030.ii. Расчеты. Рассчитывали среднее время растворения для каждой точки калибровочной кривой. Стандартные концентрации (нг/мл) и средние значения конечных точек времени (в секундах) преобразовывали в логарифмические величины. Получали калибровочную кривую зависимости логарифма концентрации (ось х) и логарифма времени (ось у).- 27007594 С использованием величин угловых коэффициентов, полученных методом линейной регрессии,рассчитывали логарифмическую концентрацию для каждого образца из логарифма времени растворения(конечных точек). Антилогарифм полученной логарифмической концентрации умножали на коэффициент разбавления (например, 1667) для получения ед./мл: Системную пригодность калибровочной кривой оценивали с использованием теста на системную пригодность. В соответствии с этим тестом, для того чтобы данные были достоверными, коэффициент корреляции для стандартов должен находиться в пределах от -0,997 до -1,000, а контрольного опыта в пределах 10% от принятого значения. Если системная пригодность не соответствовала этим условиям,калибровочную кривую можно было переопределить путем выполнения анализа линейной регрессии с использованием не менее четырех смежных точек (т.е. без учета первого или последнего стандарта). Результаты были представлены в виде ед./пробирку, ед./мг, ед./мл, IU (международных единиц)/пробирку, IU/мг или IU/мл, в зависимости от того, что требовалось в таблицах анализа. Для контрольного опыта было получено среднее значение из всех пяти параллельных опытов. Системную пригодность оценивали, как описано выше. Для пробирочных образцов рассчитывали среднее из всех пяти параллельных опытов на одно разведение образца. Средний результат выводили из двух разведений образца. Его представляли в виде ед./пробирку, где ед./пробирку = ср. ед./мл х мл/пробирку. Для образцов в массе рассчитывали среднее из пяти параллельных опытов на одно разведение образца. Средний результат выводили из двух разведений образца. Его представляли в виде ед./мг, где Ед./мл или ед./мг могут быть преобразованы в международные единицы (IU)/мл или IU/мг путем умножения на соответствующий коэффициент преобразования в международные единицы. При тестировании СОА и стабильности тестирование образца повторяли с использованием одного цикла каждый день в течение 3 дней. Выводили среднее значение из результатов трех дней. Анализ может быть проведен повторно на основе результатов собственного контрольного опыта и/или на основе систематической или неопределимой ошибки. Конечные результаты могут быть представлены в виде среднего значения множества тестов.f. Методика анализа с использованием спектрофотометра для считывания планшетов 2. Включили спектрофотометр для считывания планшетов и установили температуру термостата на 25 С. Дали прогреться лампе в течение минимум получаса. Ввели тромбин в количестве 20 мкл в каждую лунку. Тромбин может быть введен из резервуара реагента или из промежуточного планшета с использованием многоканальной пипетки. 20 мкл на лунку разбавленных стандартов (в двух экземплярах) добавили в лунки В 2-В 6 и С 2-С 6. 20 мкл на лунку контрольного раствора добавили в лунки D2-G2 и 20 мкл образцов добавили в остальные лунки в четырех экземплярах в вертикальном формате до максимального количества 9 образцов на планшет. Лунки в рядах B-G, не содержащие стандартов, контрольных растворов или образцов, должны содержать 20 мкл аналитического разбавителя. Образцы rt-PA могут быть добавлены по отдельности одноканальной пипеткой или из промежуточного планшета с использованием многоканальной пипетки. Примерная карта планшета- 28007594 Раствору фибриногена дали нагреться до комнатной температуры перед добавлением плазминогена. 200 мкл на лунку фибриногена-плазминогена вносили в планшет настолько быстро, насколько возможно. После добавления фибриногена-плазминогена планшет сразу поместили в считывающее устройство и начали сбор данных. Первое считывание было сделано с учетом двух минут добавления фибриногенаплазминогена в планшет, для регистрации максимальной оптической плотности сгустка. Собрали данные оптической плотности планшета при 340 нм и проводили считывание через соответствующие промежутки времени (обычно 30 с), пока не была достигнута базовая оптическая плотность для всех лунок (обычно 1 ч).i. Расчет. Определение конечной точки (времени полурастворения) осуществляли следующим образом: время растворения рассчитывали как время достижения полумаксимума оптической плотности. Максимальная оптическая плотность соответствовала максимальной непрозрачности сгустка, зарегистрированной для данной лунки. Оптическая плотность фона соответствовала минимальной оптической плотности полностью растворенного сгустка. Точки необработанных данных (время растворения в секундах) усреднили для каждого стандарта, контрольного опыта и всех экземпляров образцов. Рассчитали логарифм усредненной величины. Калибровочную кривую строили путем ввода данных времени растворения (логарифмическая шкала секунд на оси у) в зависимости от концентрации протеина по калибровочной кривой rt-PA (логарифмическая шкала нг/мл на оси х). С использованием величин угловых коэффициентов, полученных методом линейной регрессии,рассчитывали логарифмическую концентрацию для каждого образца из логарифма времени растворения. Антилогарифм полученной логарифмической концентрации умножали на коэффициент разбавления (например, 1667) для получения ед./мл Для пробирочных образцов единицей измерения служили ед./пробирку, где ед./пробирку = ср. ед./млмл/пробирку. Если удельную активность определяли для образцов в стерильной массе, то рассчитывали среднее из всех пяти параллельных опытов в ед./мг, где Ед./мл или ед./мг могут быть преобразованы в IU/мл или IU/мг путем умножения на соответствующий коэффициент преобразования в международные единицы. Оценивали системную пригодность калибровочной кривой. Для того чтобы данные оценки были достоверными, коэффициент корреляции для стандартов должен находиться в пределах от -0,995 до-1,000, а контрольного опыта в пределах 10% от принятого значения. Если системная пригодность не соответствовала этим условиям, калибровочную кривую можно было переопределить путем повторного запуска программы расчета с использованием не менее четырех смежных точек (т.е. без учета первого или последнего стандарта). Активность rt-PA представляли в виде ед./пробирку, ед./мг, ед./мл, IU/пробирку, IU/мг или IU/мл, в зависимости от того, что требовалось в таблицах анализа. Анализ может быть проведен повторно на основе результатов собственного контрольного опыта и/или на основе систематической или неопределимой ошибки. Конечные результаты могут быть представлены в виде среднего значения множества тестов. Результаты. При визуальном исследовании растворы альтеплазы t-PA при разведении до 0,01, 0,025 и 0,05 мг/млNS выглядели бесцветными, прозрачными или слегка опалесцирующими в начале исследования и через 24 ч инфузии (без фильтра) при комнатной температуре. При 0,1 мг/мл в NS раствор альтеплазы t-PA выглядел слегка мутным сразу после разведения и оставался таким же в течение периода инфузии. В большинстве случаев все фракции, собранные за 24 ч для всех концентраций, показали значения удельной активности более 90%, исходя из оценки методом растворения сгустка. Заключение. Восстановленный t-PA (5 мг/мл), разведенный до 0,01, 0,02 и 0,05% мг/мл в IV-баллонах с 0,9%NaCl (500 мл) был литически активным после 24 ч хранения при окружающих условиях.- 29007594 Пример 8. Краткое изложение. Тенектеплаза, разведенная до 0,01 мг/мл в нормальном солевом растворе, показала литическую активность в тесте на эффективность растворения сгустка. В таком тесте тромбин и фибриноген смешивают друг с другом для получения фибрина; плазминоген и тенектеплазу смешивают друг с другом для получения плазмина; фибрин и плазмин вместе растворяют сгусток. В этом тесте измеряют эффективность взаимодействия тенектеплазы с плазминогеном для образования плазмина и, таким образом, растворения сгустка. Материалы и методика.A. Материалы и реактивы. Тенектеплаза, TNKASE, 50-мг ампула 0,9% NaCl для инъекций, USP, 500 мл (Baxter) 10 мл SWFI, USP (Abbott) 3-см 3, 5-см 3, и 10-см 3 шприцы BD Иглы 22G 1,5 Чистые стеклянные 5-см 3 пробирки WHEATON типа I 20-мм пробки для жидкостей из серого бутилкаучукаB. Методика. Тенектеплазу (TNKASE, вариант t-PA), приобретенную в Genentech, Inc. (например, патент США 5612029) (50 мг/пробирку) развели до 5 мг/мл 10 миллилитрами SWFI. С использованием 3- и 5-см шприцов и иглы 22G извлекли 1, 2 и 5 мл нормального солевого раствора (NS) из отдельных IV-баллонов(500 мл NS, Baxter), в двух экземплярах. Тот же объем заменили разведенным лекарственным средством с получением конечной концентрации тенектеплазы в баллонах 0,01, 0,02 и 0,05 мг/мл. Содержимое баллонов осторожно перемешали путем переворачивания. 10-мл аликвоту разбавленного раствора тенектеплазы взяли через IV-порт 10-см 3 шприцом и ввели в две 5-см 3 чистые стеклянные пробирки (6 мл в одну и остальное в другую). IV-баллоны, содержащие разбавленную тенектеплазу, поместили на рабочую поверхность стола под перпендикулярным флуоресцентным светом при окружающих условиях на 24 ч. Дополнительные аликвоты (10 мл каждая) из этих IV-баллонов отбирали через 8 и 24 ч хранения. С. Анализ. Определение рН выполняли с использованием рН-метра RADIOMETER PHM 93 и микроэлектрода (MI-410, Microelectrode, Inc.). Перед измерением при окружающих условиях рН-метр стандартизовали стандартными буферами с рН 4,01 и 7,00. Все аликвоты тенектеплазы подвергли анализу растворения сгустка, описанному выше, для определения in vitro биоактивности тенектеплазы в этих аликвотах. Образцы развели разбавителем до двух или трех различных концентраций в аналитическом диапазоне (200-500 нг/мл). Тенектеплазу использовали в качестве внутреннего эталона. Все полученные величины нормализовали по отношению к эталонной тенектеплазе. Биоактивность анализировали методом растворения сгустка до и после центрифугирования. Результаты. Сводка результатов приведена в табл. 26. Наблюдаемая рН (7,1-7,2) для более высокой концентрации тенектеплазы (0,05 мг/мл в NS) была чуть выше, чем для более низких концентраций (рН 6,7-6,8 и рН 6,8-6,9 при 0,01 и 0,02 мг/мл соответственно). Это обусловлено большим количеством буферизованной тенектеплазы (5 мг/мл, рН 7,3), добавляемой непосредственно в IV-баллон для первоначального разбавления. Но все величины рН остались неизменными после 24 ч хранения при окружающих условиях. Активность растворения сгустка и концентрации протеина (определяемые RP-HPLC, обращеннофазовой жидкостной хроматографией высокого разрешения) определяли до и после центрифугирования аликвоты каждого образца. Это обеспечивало удаление любого осадка, невидимого невооруженным глазом, перед анализом для более точной интерпретации результатов. Во всех случаях результаты после центрифугирования как для активности, так и для концентрации были чуть ниже, чем перед центрифугированием, что означало присутствие небольшого количества осадка. В табл. 26 представлено процентное изменение концентрации до и после центрифугирования, показывающее более высокую потерю протеина при 0,01 и 0,02 мг/мл вскоре после разбавления, чем при более высокой концентрации (0,5 мг/мл). Это процентное изменение при более низкой концентрации (0,01 мг/мл) также увеличивается при увеличении времени хранения. При 0,01 мг/мл процентное изменение концентрации составило 57% сразу после разбавления и увеличилось до 71% через 24 ч. При 0,02 и 0,05 мг/мл значительных изменений не наблюдалось. Не вдаваясь в теорию, это явление можно объяснить более выраженным поглощением протеина при низкой концентрации, которое обычно происходит сразу и со временем достигает предела насыщения. В табл. 27 показано, что процент восстановленного протеина относительно целевых концентраций при 0,01, 0,02 и 0,05 мг/мл составлял 40-50, 65 и 86-92% соответственно. Этот процент восстановленного протеина был заниженным, поскольку не учитывался объем переполнения внутри IV-баллона, и количе- 30