Трансформированные грибы-гифомицеты, способ их получения и способы экспрессии и получения белков при их использовании

006873 Краткое изложение существа изобретения В изобретении предлагается способ экспрессии и последующего скрининга библиотек ДНК, особенно синтетических, геномных библиотек и библиотек кДНК в гифомицетах в качестве хозяев. В системе применяются трансформированные или трансфецированные штаммы гифомицетов, которые генерируют переносимые элементы репродукции, например, путем эффективной споруляции в погруженной культуре. Грибы предпочтительно характеризуются морфологией, которая сводит к минимуму или препятствует образованию сплетенного мицелия. Особенно предпочтительные штаммы грибов также способны экспрессировать выделяемые количества экзогенных белков для оценки. Мутантные штаммы грибов согласно настоящему изобретению особенно хорошо подходят для методов высокопроизводительного скрининга за счет продуцирования ими переносимых элементов репродукции, высоких уровней экспрессии и очень низкой вязкости культуры. Известный уровень техники Существующие в природе популяции микроорганизмов проявляют широкий спектр биохимического и метаболического разнообразия. Частично из-за сложности в выделении и культивировании многих микроорганизмов большое число потенциально ценных белков и полипептидов, присутствующих в данных популяциях, ускользает от идентификации. Действительно, определено, что менее одного процента существующих в мире микроорганизмов культивируется в настоящее время. Таким образом, существует настоятельная необходимость применения новых подходов для характеристики белков, полипептидов и метаболитов из до сих пор некультивированных, неидентифицированных микроорганизмов, а также из известных микроорганизмов. (Применяемый здесь далее термин "белок" должен пониматься как охватывающий в одинаковой степени пептиды и полипептиды). Сохраняется также необходимость в новых подходах для идентификации и выделения генов, кодирующих данные белки, с тем, чтобы быть в состоянии модифицировать и/или продуцировать данные белки. Один из подходов к данной проблеме описан Short в патентах США 5958672; 6001574, 6030779 и 6057103 (содержание которых включено здесь в качестве ссылки). В данном подходе библиотеку геномной ДНК получают прямо из образца окружающей среды (например, из образца почвы), не предпринимая или предпринимая попытку выделить или культивировать какие-либо организмы, которые могут там присутствовать. Библиотеку ДНК экспрессируют в Е. coli и проводят скрининг экспрессируемых белков на интересующее свойство или активность. В данном способе кратко упоминается, но не описывается или адаптируется применение клеток гриба в качестве хозяина. Подход, как описано, страдает несколькими серьезными недостатками, одним из которых является то, что Е. coli неэффективно экспрессирует гены, имеющие интроны. Приблизительно 90% видов микроорганизмов почвы являются эукариотами (преимущественно грибы), которые обычно действительно имеют интроны в их геномной ДНК. Принимая во внимание, что известно уже около 100000 видов эумикотных грибов, при этом подсчитано, что 1000000 еще должно быть открыто (В.Kendrick, The Fifth Kingdom, Mycologue Publications 1999), потенциал разнообразия белков и метаболитов среди геномов грибов гораздо выше, но присутствие интронов создает препятствия для основного спектра белков и метаболитов грибов при использовании в бактериальных экспрессионных системах. Существует не только много классов ферментов (например, секретируемые пероксидазы лигнина грибов и магнийзависимые пероксидазы), уникальных для грибов, но существует много белков грибов, включая ферменты (например,пероксидазы лигнина, инвертазу A. niger), которые гликозилированы, а такие белки не будут гликозилированы при экспрессии в Е. coli. Намного большее число и больший размер, а также сложность геномов грибов, уникальность многих белков грибов и гликозилирование многих белков грибов - все это указывает на то, что фракция разнообразных микробных белков и метаболитов в данном образце окружающей среды, которая действительно может быть определена с помощью бактериальной экспрессии геномной ДНК, составляет значительно меньше 10%. Частично из-за распространения СПИДа и растущей популяции реципиентов для трансплантации органов существует растущая популяция индивидуумов с дефектной или подавленной иммунной системой, а число и разнообразие грибковых инфекций быстро растет (Infect. Med. 16:380-382, 385-386(1999. Существует необходимость в идентификации и характеристике белков патогенных грибов в текущем поиске новых мишеней для противогрибковых лекарств, который требует возможности скрининга библиотек ДНК, происходящих из геномов грибов. Опять же присутствие интронов в геномах грибов делает экспрессию библиотек геномных ДНК трудной в большинстве доступных в настоящее время бактериальных хозяев. Наблюдается также увеличение преобладания устойчивых к антибиотикам бактериальных инфекций, что создает необходимость в высокопроизводительном скрининге новых грибковых метаболитов, имеющих активность антибиотиков. Эукариотные геномы высших организмов являются также слишком сложными для всеобъемлющей экспрессии библиотек ДНК в бактериях. Когда рассматривают все эукариотные виды, бактерии составляют только приблизительно 0,3% от всех известных видов (E.G. Wilson, "The Current State of BiologicalDiversity", in Biodiversity, National Academy Press, Washington DC, 1988, Chapter 1); таким образом, часть всемирного генетического разнообразия, доступная для бактериальных экспрессионных систем, крайне ограничена.-1 006873 Чтобы избежать проблемы с интронами, можно получить библиотеку кДНК и экспрессировать ее в бактериях. Однако такой подход предполагает присутствие транскриптов РНК, и любые гены, которые активно не транскрибируются, не будут представлены в библиотеке. Много желаемых белков экспрессируются только при конкретных условиях (например, факторы вирулентности в патогенных грибах), и данные условия могут не иметь место во время получения РНК. Более того, для того, чтобы получить достаточно РНК для создания библиотеки кДНК, необходимо культивировать значительное количество организмов. Для организмов в образцах окружающей среды, которые плохо растут в культуре, или для новых микроорганизмов, для которых неизвестны подходящие условия культивирования, не может быть легко или надежно получено достаточное количество РНК. Напротив, достаточное количество геномной ДНК может быть получено из очень малого количества индивидуальных клеток при амплификации с помощью ПЦР, с применением случайных праймеров или праймеров, созданных для узнавания определенных классов генов. Наконец, гены, которые интенсивно экспрессируются в организме, будут иметь тенденцию к гиперэкспрессии их РНК и, таким образом, они представлены в библиотеке кДНК в повышенной степени за счет минимально экспрессирующихся генов. Для того чтобы иметь высокую степень охвата представленных видов мРНК, должен быть проведен скрининг намного большего количества клонов при применении библиотеки кДНК вместо геномной библиотеки, так как последняя будет иметь близкую к почти равномерной представленность множества присутствующих генов. Ясно, что более желательно проводить скрининг библиотеки геномной ДНК, если это в принципе возможно.E.coli также не способна секретировать многие белки и, таким образом, не желательна в качестве клетки-хозяина для целей скрининга, когда скрининг основывается на секреции продукта гена. Дополнительным недостатком в отношении Е. coli и бактериальных хозяев в целом является то, что прокариоты не могут обеспечить многие из посттрансляционных модификаций, требуемых для активности множества эукариотных белков. Примерами посттрансляционного процессинга, часто требуемого для получения активного белка, являются, кроме гликозилирования, расщепление субъединиц, образование дисульфидных связей и правильная укладка белков. Для обеспечения такого процессинга иногда можно использовать клетки млекопитающих, но клетки млекопитающих трудно поддерживать, они требуют дорогих сред и обычно не трансформируются с высокой эффективностью. Такие трансформационные системы являются, следовательно, непригодными для высокопроизводительного скрининга белков, хотя делались попытки применять клетки млекопитающих в качестве хозяев для скрининга библиотек кДНК (Schouten et al., заявка WO 99/64582). Описан подход, включающий слияние трансформированных протопластов с клетками млекопитающих до скрининга библиотеки (патент США 5989814), но экспрессия библиотеки белков происходит в бактериях или дрожжах до слияния клеток. Были попытки модифицировать характер гликозилирования ферментативно после экспрессии в клетках-хозяевах (Meynial-Salles and Combes, J. Biotechnol., 46:1-14 (1996, но такие способы должны быть специально приспособлены для специфических продуктов и не подходят для экспрессии белков из библиотек ДНК. Позднее Maras et al., Eur. J. Biochem., 249:701-707 (1997) (см. также патент США 5834251) описали штамм Trichoderma reesei, сконструированный для экспрессии GlcNAc трансферазы I человека. Фермент переносит N-ацетилглюкозамин к остаткам маннозы на других экспрессируемых экзогенных белках, что является первым этапом более полного приближения к природным продуктам млекопитающих. Применение дрожжей в качестве клеток-хозяев решает некоторые из упомянутых выше проблем, но создает новые. Дрожжи имеют тенденцию к повышенному гликозилированию экзогенных белков (Bretthauer and Castellino, 1999, Biotechnol. Appl. Biochem. 30:193-200) и измененный характер гликозилирования часто ведет к повышению антигенных свойств экспрессируемых белков млекопитающих (С. Ballou,in Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, J. Strathern et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY, 1982, 335-360). Хотя дрожжи способны копировать ограниченное число интронов, они обычно не способны обращаться со сложными генами высших видов, таких как позвоночные. Даже гены гифомицетов обычно слишком сложны для дрожжей в отношении эффективной транскрипции, и данная проблема сочетается с различиями в экспрессии и сплайсинговых последовательностях между дрожжами и гифомицетами (см., например, М. Innis et al., Science 1985 228:21-26). Несмотря на данные препятствия,трансформационные и экспрессионные системы для дрожжей интенсивно разрабатываются, особенно для применения с библиотеками кДНК. Разработаны экспрессионные системы дрожжей, которые применяют для скрининга мембранных и секретируемых белков млекопитающих (Klein, et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 1996 93:7108-7113; Treco, патент США 5783385), и для гетерологичных белков грибов (Dalbogeand Heldt-Hansen, Mol. Gen. Genet. 243:253:260 (1994, а также для белков млекопитающих (TekampOlson and Meryweather, патент США 6017731). Термин "дрожжи", применяемый в контексте экспрессионных систем дрожжей, обычно относится к организмам порядка Saccharomycetales, таким как S. cerevisiae и Pichia pastoris. В настоящем описании термины "грибы" и "грибковый" должны быть поняты как относящиеся к Basidiomycetes, Zygomycetes,Oomycetes и Chythridiomycetes, а также Ascomycetes класса Euascomycetes, которые не принадлежат к порядку Saccharomycetales. Гифомицеты можно отличить от дрожжей по удлинению их гиф в течение вегетативного роста и обязательному аэробному метаболизму углерода (вегетативный рост у дрожжей-2 006873 сопровождается почкованием одноклеточного таллома, и дрожжи могут использовать ферментативный катаболизм). Свойственный интронам сплайсинг и гликозилирование, укладка и другие посттрансляционные модификации генных продуктов грибов должны быть наиболее эффективно осуществлены грибковыми видами хозяев, что делает гифомицеты лучшими хозяевами для скрининга геномной ДНК из образцов почвы. Это делает их также прекрасными хозяевами для продукции ферментов грибов, представляющих коммерческий интерес, таких, как протеазы, целлюлазы и амилазы. Обнаружено, что гифомицеты способны транскрибировать, транслировать, осуществлять процессинг и секретировать продукты других эукариотных генов, включая гены млекопитающих. Последнее свойство делает гифомицеты привлекательными хозяевами для продукции белков биомедицинского назначения. Типы гликозилирования, осуществляемые гифомицетами, более близки к таковым белков млекопитающих, чем к типам, вводимым с помощью дрожжей. По данным причинам огромное количество усилий тратилось на разработку систем хозяев-грибов для экспрессии гетерологичных белков и разработан ряд грибковых экспрессионных систем. Для обзора работ в данной области см. Maras et al. Glycoconjugate J., 16:99-107 (1999); Peberdy, ActaCrit. Rev. Biotechnol. 17:273-306 (1997) и Jeenes et al. Biotech. Genet. Eng. Rev. 9:327-367 (1991). Высокопроизводительная экспрессия и тестирование библиотек ДНК, которые происходят из геномов грибов, также должны быть полезными для определения функций многих генов млекопитающих,которые в настоящее время имеют неизвестную функцию. Например, если идентифицирован белок гриба, обладающий интересующей активностью, последовательность кодирующего его гена может быть сравнена с последовательностью генома человека для поиска гомологичных генов.Yelton et al., патент США 4816405, описывает модификацию гифомицета Ascomycetes для продукции и секреции гетерологичных белков. Buxton et al. в патенте США 4885249 и в Buxton and Radford, Mol. Gen. Genet. 196:339-344 (1984) описывают трансформацию Aspergillus niger с помощью ДНКвектора, который содержит селективный маркер, способный включаться в клетки хозяина. McKnight etal., патент США 4935349 и Boel в патенте США 5536661 описывают способы экспрессии эукариотных генов в Aspergillus, включая промоторы, способные направлять экспрессию гетерологичных генов в Aspergillus и в других гифомицетах. Royer et al. в патенте США 5837847 и Berka et al. в заявке WO 00/56900 описывают экспрессионные системы для применения в Fusarium venenatum с применением промоторов природных и мутантных Fusarium spp. Conneely et al. в патенте США 5955316 описывают плазмидные конструкты, которые подходят для экспрессии и получения лактоферрина в Aspergillus. ГлюкозооксидазаCladosporium была экспрессирована в Aspergillus (патент США 5879921). Сходная технология применена для Neurospora. Lambowitz в патенте США 4486533 описывает автономно реплицирующийся ДНК-вектор для гифомицетов и его применение для введения и экспрессии гетерологичных генов в Neurospora. Stuart et al. описывают совместную трансформацию сферопластовNeurospora crassa с генами млекопитающих и эндогенными регуляторными элементами транскрипции в патенте США 5695965 и улучшенный штамм Neurospora, имеющий сниженный уровень внеклеточной протеазы, в патенте США 5776730. Векторы для трансформации Neurospora описаны в патенте США 5834191. Takagi et al. описывают систему трансформации для Rhizopus в патенте США 5436158. SisniegaBarroso et al. описывают систему трансформации для гифомицетов в заявке WO 99/51756, в которой применяют промоторы генов глутаматдегидрогеназы из Aspergillus awamori. Dantas-Barbosa et al., FEMSMicrobiol. Lett. 1998 169:185-190, описывают трансформацию Humicola grisea var. thermoidea для устойчивости к гигромицину В с применением способа либо с применением ацетата лития, либо путем электропорации. Среди более успешных грибковых экспрессионных систем находятся системы Aspergillus и Trichoderma, например, описанные Berka et al. в патенте США 5578463; см. также Devchand and Gwynne, J. Biothechnol. 17:3-9 (1991) и Gouka et al., Appl. Microbiol. Biothechnol. 47:1-11 (1997). Примеры трансформированных штаммов Myceliophthora thermophila, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris и Sporotrichumcellulophilum представлены в заявке WO 96/02563 и патентах США 5602004, 5604129 и 4695985, которые описывают определенные недостатки систем Aspergillus и Trichoderma и предполагают, что другие грибы могут быть более подходящими для продукции белков в большом масштабе. В данной области техники известны способы трансформации типов, отличных от Ascomycetes; см.,например, Munoz-Rivas et al., Mol. Gen. Genet. 1986 205:103-106 (Schizophyllum commune); van de Rhee et(Mucor circinelloides); Liou et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992 56:1503-1504 (Rhizopus niveus); Judelson et al., Mol. Plant Microbe Interact. 1991 4:602-607 (Phytophthora infestans); и de Groot et al., Nature Biothechnol. 1998 16:839-842 (Agaricus bisporus). В дополнение к обычным способам трансформации гифомицетов, таким как, например, слияние протопластов, Chakraborty and Kapoor, Nucleic Acids Res. 18:6737 (1990) описывают трансформацию гифомицетов путем электропорации. De Groot et аl. in Nature Biothechnol. 16: 839-842 (1998) описывают трансформацию нескольких видов гифомицетов, опосредуемую Agrobacterium tumefaciens. Выполнено баллистическое введение ДНК в грибы; см., например, Christiansen et al., Curr. Genet. 29:100-102 (1995);Durand et al., Curr. Genet. 31:158-161 (1997) и Barcellos et al., Can. J. Microbiol. 44:1137-1141 (1998). Применение магнитных частиц для "магнето-баллистической" трансфекции клеток описывается в патентах США 5516670 и 5753477 и как предполагается применимо к гифомицетам. Очевидно, что проделано много работы для разработки экспрессионных систем с применением грибов в качестве хозяев. Однако обычные грибковые хозяева все представляют собой гифомицеты, которые имеют тенденцию образовывать мицелиальные пленки в неперемешиваемых культурах и суспензионные (погруженные) культуры с высокой вязкостью в перемешиваемых резервуарах биореакторов. Данные свойства гифомицетов также создают ряд проблем для промышленного получения ферментов в грибковых клетках-хозяевах. Например, высокая вязкость и/или местное образование плотных агрегатов мицелия приводит к трудностям в перемешивании, аэрации и проникновении питательных веществ. В целом гифомицеты не поддаются микропипетированию в планшеты для микротитрования в виде суспензионных культур из-за вязкости культур. Более того, из-за перепутанных мицелиев культуру типичного гифомицета, экспрессирующего библиотеку ДНК, нелегко разделить на отдельные клоны в широком масштабе, что препятствует оценке индивидуальных генотипов, что должно требоваться в системе высокопроизводительного анализа. Типичные гифомицеты в отсутствие постоянного перемешивания имеют тенденцию к росту в форме пленки на поверхности жидкой культуральной среды, где они продуцируют воздушные споры. Они обычно не спорулируют в погруженной культуре. Оба данных свойства представляют существенную помеху для культивирования клонов гифомицетов в планшетах для микротитрования и для эффективных манипуляций и применения таких культур для высокопроизводительного скрининга. Суспендированные споры или другие компоненты репродуктивных элементов должны подходить для разделения и распределения в индивидуальные лунки для микротитрования, в то время, как продукция воздушных спор будет вести к перекрестному загрязнению лунок для микротитрования, если давать возможность образовываться поверхностным пленкам. Перемешивание среды в лунках для микротитрования до степени, необходимой для предотвращения образования пленки, не осуществимо. В дополнение к проблеме трудности контролирования формирования воздушных спор поверхностные пленки мешают проникновению света,делая многие тесты (в частности, методы спектрофотометрического поглощения) трудными или невыполнимыми. Поверхностные пленки мешают также таким процессам, как оксигенация, добавление реагентов и питательных веществ и пипетирование. Изучено влияние морфологии грибов на физические свойства культуры и идентифицированы существующие в природе штаммы, имеющие более благоприятную морфологию, как описано, например, Jensen and Boominathan в патенте США 5695985. Гомогенное распределение свободного мицелия с хорошо выраженным ветвлением описано как особенно желаемая морфология. Schuster and Royer в международной патентной заявке WO 97/26330 и в патенте США 6184026 предлагают сходный способ идентификации клеток грибов, имеющих более подходящую морфологию, для промышленного получения гетерологичных белков. Способ включает скрининг мутантов родительской линии грибов, отличных от штаммов дикого типа, для нахождения специфической измененной морфологии, трансформации мутанта и оценки того, будет ли культура трансформированного мутанта продуцировать больше гетерологичного белка,чем родительская клеточная линия. Особенно заявляются мутанты с по меньшей мере на 10% большим ветвлением гифы. Способ иллюстрируется для штаммов Trichoderma, Fusarium и Aspergillus и предполагается, что он применим для многих других видов. Влияние частоты ветвления на вязкость культуры мутантов Aspergillus oryzae исследована Bockinget al., Biotechnol. Bioeng. 65:638-648 (1999); более высоко разветвленные штаммы проявляли меньшую вязкость в данном исследовании. Van Wezel et аl. в заявке РСТ WO 00/00613 описывает способы снижения ветвления и/или увеличения фрагментации нитевидных микроорганизмов, в результате чего вязкость культуры снижается. Способ включает трансформацию микроорганизмов геном SsgA Streptomyces griseus. Способ продемонстрирован на нитевидных бактериях порядка Actinomycetales, но установлено, что он применим для гифомицетов. Dunn-Coleman et al. в заявке WO 00/56893 описывают HbrA2 мутант A.nidulans, который проявляет гиперразветвленный фенотип при росте при температуре выше 42 С и отмечают линейные взаимоотношения между степенью ветвления гифы и вязкостью культуры. Большинство предшествующих попыток в области экспрессионных систем гифомицетов было направлено на идентификацию штаммов, подходящих для промышленного получения ферментов и, следовательно, внимание было сфокусировано на вязкости культуры, стабильности трансформации, выходе гетерологичного белка на единицу объема и выходе в виде процента биомассы. Библиотеки ДНК экспрессировали в грибах; см., например, Gems and Clutterbuck, Curr. Genet. 1993 24:520-524, где библиотекуAspergillus nidulans экспрессировали в A. nidulans, и Gems et al., Mol. Gen. Genet. 1994 242:467-471, где геномную библиотеку Penicillium экспрессировали в Aspergillus. Ни одно из этих сообщений не раскрывало или предполагало скрининг экспрессируемых белков; только благодаря комплементарности мутантных аллелей у хозяина была продемонстрирована экспрессия генов из библиотеки ДНК. Метод комплементарности требует специфического мутантного хозяина для каждой активности экзогенного белка,которую хотят определить, и не дает инструмента для общего скрининга библиотеки.-4 006873 Клонирование гена инвертазы Aspergillus niger с помощью экспрессии в Trichoderma reesei описаноBerges et al., Curr. Genet. 1993 24:53-59. Применяя геномную библиотеку А. niger, созданную в космидном векторе, содержащем селективный маркер, и используя в качестве хозяина Т. reesei (который не способен утилизировать сахарозу), был клонирован ген инвертазы А. niger с помощью процедуры селекции сибсов. В этом случае опять требовались очень специфичные характеристики хозяина для определения присутствия единичного экспрессируемого экзогенного белка, и скрининг геномной библиотеки не был описан или представлен возможным. Характеристики клетки гриба-хозяина, подходящей для экспрессии библиотеки ДНК, отличны во многих отношениях от характеристик хозяев, подходящих для промышленного производства белка. В целом гриб-хозяин, подходящий для высокопроизводительного скрининга, должен отвечать многочисленным критериям, среди них представлены следующие: хозяин должен быть трансформирован с высокой эффективностью; хозяин должен осуществлять процессинг генов, содержащих интроны, и выполнять любой необходимый сплайсинг; хозяин должен осуществлять посттрансляционный процессинг экспрессируемого белка так, чтобы он продуцировался в активной форме; когда библиотеку исследуют для белка, хозяин должен продуцировать белок с высоким выходом,достаточным для его определения с помощью теста; хозяин должен акцептировать множество экспрессионных регуляторных элементов для облегчения и многосторонности применения; хозяин должен позволять применение легко отбираемых маркеров; культуры клеток хозяина должны быть с низкой вязкостью; хозяин должен характеризоваться недостаточностью протеаз и/или быть в состоянии подавлять экспрессию протеаз; хозяин должен давать возможность скринингу большого разнообразия активностей и свойств экзогенных белков; гифы в культуре гриба-хозяина не должны быть запутанными настолько, чтобы препятствовать выделению отдельных клонов, и не должны быть запутанными настолько, чтобы вызывать рост вязкости до точки предотвращения эффективного переноса и репликации при миниатюризированном формате высокопроизводительного скрининга (например, с помощью микропипетирования); хозяин не должен образовывать поверхностные пленки, но должен предпочтительно расти как погруженная культура; хозяин должен давать возможность эффективной продукции погруженных спор или артроспор в условиях роста, обеспечивающих высокопроизводительный скрининг. В случаях, когда скринингу подвергаются метаболиты, должно быть благоприятным, чтобы клетки хозяина секретировали метаболиты в среду, где они могли быть легко определены и/или испытаны. В идеале хозяин должен секретировать только экзогенный белок. В случаях, когда с белком проводят тесты, должно быть особенно выгодным, чтобы хозяин экспрессировал также достаточно гетерологичного белка для выделения и очистки белка. Клетка хозяина с такой характеристикой должна давать возможность для дополнительной характеристики всех интересующих гетерологичных белков только путем культивирования клеток хозяина без требующих времени молекулярно-биологических манипуляций, необходимых для переноса гена в другой организм. Предпочтительно хозяин должен быть способен секретировать белок, так как это должно позволять проводить более надежные и более разнообразные тесты. Должно быть также выгодным, чтобы из клетки хозяина можно было легко выделить гетерологичную ДНК так, чтобы могли быть выполнены дополнительные исследования и модификации гена. В дополнение к данным качествам хозяина система трансформации должна также проявлять определенные свойства. Частота трансформации должна быть достаточно высокой для получения числа трансформантов, требуемого для значимого скрининга. В идеале экспрессия экзогенного белка должна быть индуцирована с помощью единственного индуктора по единственному пути, действующему на единственный промотор. К настоящему времени не разработано ни сочетания клеток хозяина, ни системы трансформации,которые бы имели все или даже большинство данных критериев. Следовательно, остается потребность в клетке гриба-хозяина и в системах трансформации, которые способны эффективно экспрессировать продукты генов библиотеки ДНК, особенно геномной и/или эукариотной геномной библиотек ДНК. Краткое описание изобретения В настоящем изобретении применяют гифомицеты, которые продуцируют "переносимые элементы репродукции" при росте в погруженной культуре. Под "переносимым элементом репродукции" подразумевается спора, артроспора, фрагмент гифы, протопласт, микрочастица или другой элемент грибов, который (1) легко отделяется от других таких же элементов в культуральной среде и (2) способен воспроизводить себя в моноклональной культуре. Грибы предпочтительно также проявляют менее выраженный нитевидный фенотип и/или компактную морфологию роста и создают культуры с низкой вязкостью, ко-5 006873 торые подходят для физических манипуляций, применяемых для высокопроизводительного скрининга библиотеки ДНК. Особенно предпочтительны гифомицеты, которые даже в отсутствие перемешивания имеют тенденцию к росту в виде погруженных культур, отличающихся от поверхностных пленок. Настоящее изобретение характеризуется преимуществами системы трансформации, раскрытыми в международных патентных заявках PCT/NL 99/00618 и РСТ/ЕР 99/202516. Данные заявки описывают эффективную систему трансформации для хозяев-гифомицетов, таких как Chrysosporium lucknowense иAspergillus sojae. Данные заявки также показывают, что легко получить мутантные штаммы, которые сохраняют все преимущества клеток хозяина дикого типа, но которые частично потеряли свой нитевидный фенотип и таким образом обеспечивают культуры с низкой вязкостью. Предпочтительные для применения в изобретении грибы экспрессируют и секретируют большие количества экзогенного белка, давая высокое соотношение белок/биомасса по сравнению с ранее известными хозяевами-гифомицетами. В изобретении предлагается система трансформации, которая дает высокие выходы трансформантов. В изобретении также предлагаются библиотеки грибов-трансформантов,которые эффективно экспрессируют белковые продукты вставок гетерологичных кДНК и особенно вставок геномной ДНК. В другом варианте изобретения библиотеки трансформированных грибов могут быть использованы для скрининга активности и свойств гетерологичных белков или для скрининга метаболитов, продуцируемых трансформированными грибами в результате активности экзогенных белков, или для скрининга гетерологичных ДНК или образуемых с них транскриптов РНК. Следует принимать во внимание, что настоящее изобретение также делает возможным высокопроизводительный скрининг метаболитов нетрансформированных штаммов, имеющих фенотипические характеристики, описанные выше. Применяемый здесь термин "мутантный гифомицет" относится просто к грибам, не найденным в природе. "Мутации", которые ведут к желаемым фенотипическим характеристикам, таким как компактная форма роста, низкая вязкость, сниженные уровни протеаз, рост при погружении и т.п., могут быть введены случайным образом либо с помощью классических средств, таких как УФ-облучение и химический мутагенез, либо с помощью способов молекулярной биологии, таких как кластерный мутагенез, или они могут быть введены преднамеренно методами генной инженерии. Если обнаружится, что существующий в природе гриб обладает необходимыми свойствами, он будет, конечно, применим в способах изобретения. В еще одном варианте изобретения можно провести скрининг библиотек трансформированных грибов на полезные свойства самих грибов, таких как, например, высокие уровни продукции конкретного экспрессируемого белка или метаболита. Данный вариант изобретения иллюстрируется количественным анализом экспрессии интересующего белка, с помощью которого должен быть определен конкретный трансформант, имеющий наиболее благоприятное сочетание продукции белка, процессинга белка и секреции белка. В другом варианте изобретения можно провести скрининг библиотек трансформированных грибов на присутствие последовательностей ДНК, способных гибридизоваться с интересующим нуклеотидным зондом. Описание чертежей Фиг. 1 представляет собой иммуноблоттинг, как описано в примерах; фиг. 2 - карту pUT720; фиг. 3 - карту pUT970G; фиг. 4 - карту pUTl064; фиг. 5 - карту pUT1065; фиг. 6 - карту pF6g; фиг. 7 - карту pUT1150; фиг. 8 - карту pUT1152; фиг. 9 - карту pUT1155; фиг. 10 - карту pUT1160; фиг. 11 - карту pUT1162; фиг. 12 - схематическую структуру белка рсlA; фиг. 13 А - фотографию Aspergillus niger дикого типа; фиг. 13 В - фотографию мутанта рсlА Aspergillus niger; фиг. 14 А - фотографию Aspergillus sojae дикого типа; фиг. 14 В - фотографию мутанта рсlА Aspergillus sojae; фиг. 15 А-Е - результаты секвенирования гена pyrЕ. Подчеркивание показывает аминокислотную последовательность; она не непрерывна из-за некоторых неопределенностей последовательности. Указанные аминокислоты являются наиболее вероятными. Жирный шрифт показывает предполагаемые/вероятные интроны. Подробное описание изобретения В наиболее широком варианте изобретение направлено на трансформированные гифомицеты, которые генерируют переносимые элементы репродукции в суспензии, на библиотеки таких грибов и на спо-6 006873 собы скрининга таких библиотек на интересующие биологические свойства, такие как биохимическая или биологическая активность, связанная с экспрессируемыми экзогенными белками или с метаболитами, т.е. низкомолекулярными продуктами, получаемыми под действием эндогенных и/или экзогенных ферментов. Библиотека гифомицетов с низкой вязкостью включает грибы, содержащие последовательности нуклеиновой кислоты, причем каждая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует гетерологичный белок, причем указанные последовательности нуклеиновой кислоты функционально связаны с районом, регулирующим экспрессию, и необязательно с последовательностью, кодирующей секреторный сигнал и/или с последовательностью, кодирующей белок-носитель. Предпочтительно, чтобы трансформированный штамм в соответствии с изобретением секретировал гетерологичный белок. Экспрессия и способы скрининга настоящего изобретения и применяемые в нем грибы полезны для получения грибов, белков, метаболитов и молекул ДНК, использующихся для разнообразного применения. Способы настоящего изобретения также полезны для получения информации о нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности белка, и такая информация сама по себе рассматривается как ценный продукт заявленных способов. Предпочтительные гифомицеты настоящего изобретения характеризуются низкой вязкостью культуральной среды. В то время как типичный гифомицет промышленного качества дает культуры с вязкостью со степенью выше, чем 200 сантипуаз (сП) и обычно выше 1000 сП, и она может достигать 10000 сП, грибы настоящего изобретения характеризуются вязкостью в культуре менее 200 сП, предпочтительно менее 100 сП, более предпочтительно менее 60 сП и наиболее предпочтительно менее 10 сП после культивирования в течение 48 ч или более в присутствии адекватных питательных веществ при оптимальных или близких к оптимальным условиях роста. Гифомицеты настоящего изобретения обычно демонстрируют морфологию, характеризующуюся короткими, дискретными, несплетенными гифами или микрочастицами. Микрочастицы представляют собой слегка сплетенные или несплетенные скопления гиф, происходящих из одного клона, что отличает их от частиц, которые намного крупнее и происходят от множества сплетенных клонов. Например, мутантный штамм UV18-25 Chrysosporium lucknowense(вязкость 10 сП) и морфологически сходный мутантный штамм Х-252 Trichoderma longibrachiatum (вязкость 60 сП) характеризуются присутствием коротких, раздельных, несплетенных гиф длиной между 100 и 200 мкм, а генно-инженерный мутант рсlА Aspergillus sojae с низкой вязкостью характеризуется компактной формой с существенно разветвленными и короткими гифами (см. фиг. 14). В то время как грибы с низкой вязкостью описаны в заявке WО 97/26330 как имеющие "более сильное ветвление гифы",некоторые грибы настоящего изобретения имеют эквивалентное или даже слегка сниженное ветвление гифы по сравнению с немутантными штаммами. Очевидно, длина гифы играет доминантную роль в контролировании вязкости культуры. Особенно предпочтительные штаммы грибов характеризуются как имеющие высокое соотношение экзогенный секретируемый белок/биомасса. Данное соотношение составляет предпочтительно более 1:1,более предпочтительно более 2:1 и даже более предпочтительно более 6:1 или выше. Наиболее предпочтительно, чтобы соотношение составляло 8:1 или выше. Такие высокие соотношения являются выгодными для среды для высокопроизводительного скрининга, поскольку они ведут к более высокой концентрации экзогенного белка, позволяя осуществлять более чувствительные и/или более быстрые анализы скрининга. Это особенно выгодно, так как объем тестируемого раствора снижается, например, при переходе от 96-луночных планшетов к 384-луночным планшетам и оттуда к 1536-луночным планшетам. Способы настоящего изобретения подходят для любых форматов данных планшетов для микротитрования и для большинства других форматов HTS, применяющих жидкие образцы. Рассматривается, что любой гифомицет может быть превращен с помощью описанных здесь способов создания мутаций в мутантные штаммы, которые подходят для применения в настоящем изобретении. Среди предпочтительных родов гифомицетов находятся Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromyces, Cryplococcus, Acremonium, Tolypocladium, Scytalidium, Schizophyllum,Sporotrichum, Penicillium, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola и Trichoderma и их анаморфы и телиоморфы. Более предпочтительными являются Chrysosporium, Trichoderma,Arpergillus и Fusarium. Наиболее предпочтительным является Chrysosporium. Род и виды грибов могут быть определены по морфологии в соответствии с раскрытой Barnett and Hanter, Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 3rd Edition, 1972, Burgess Publishing Company. Источником, обеспечивающим подробностями, касающимися классификации грибов рода Chrysosporium, является Van Oorschot, C.A.N. (1980) "Arevision of Chrysosporium and allied genera" в Studies in Mycology No. 20, Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, The Netherlands, pp. 1-36. В соответствии с этими данными род Chrysosporium принадлежит к семейству Moniliaceae, которое принадлежит к порядку Hyphomycetales. Другим готовым источником, предлагающим информацию о номенклатуре грибов, являются коллекции Будапештского договора, особенно те, которые предлагают базы данных в открытом доступе(следующие адреса Интернета применяют протокол http). АТСС (США) предлагает информацию наgeneral. Другим источником является NT.ars-grin.gov/ fungaldatabases. Все данные институты могут обеспечить указаниями по отличительным характеристикам видов грибов. Альтернативная систематика As-7 006873comycota может быть найдена по адресу www.ncbi.nlm.nih.qov/htbin-post/Taxonomy/wgetorgmode= Undefid=4890. В соответствии с данной альтернативной систематикой род Chrysosporium принадлежит к семейству Onygenaceae, порядку Onygenales, типу Ascomycota. Определение Chrysosporium включает, но не ограничивается данными штаммами: С. botryoides, С.C. lucknowense представляет собой вид Chrysosporium, который представляет особый интерес, поскольку он предлагается как природный продуцент целлулазных белков (международные заявки WO 98/15633, PCT/NL 99/00618 и патенты США 5811381 и 6015707). Штаммы с инвентарными номерами международного хранилища АТСС 44006, CBS 251.72, CBS 143.77, CBS 272.77 и VKM F-3500D являются примерами штаммов Chrysosporium lucknowense. Включаемыми в определение Chrysosporium являются также штаммы, которые произошли от предков Chrysosporium, включая те из них, которые мутировали либо в природных условиях, либо под действием индуцируемого мутагенеза. В способах настоящего изобретения в одном осуществлении применяются мутанты Chrysosporium, полученные сочетанием облучения и химически индуцируемого мутагенеза, которые имеют тенденцию продуцировать переносимые элементы репродукции в суспензии и которые имеют морфологию, характеризуемую короткими,дискретными, несплетенными гифами ("компактный рост"), и фенотип, характеризуемый ростом в погруженном состоянии и пониженной вязкостью среды для ферментации при культивировании в суспензии. В другом осуществлении в изобретении применяются фенотипически сходные мутанты Trichoderma. В других осуществлениях в изобретении применяются фенотипически сходные мутанты Aspergillus sojae или Aspergillus niger. Например, мутацию VKM F-3500D (штамм "С 1") вызывали действием на него ультрафиолетового света для создания штамма UV13-6. Впоследствии получали дополнительную мутацию штамма UV13-6 под действием N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина для создания штамма NG7C-19. В свою очередь,получали мутацию последнего штамма действием на него ультрафиолетового света для создания штаммаUV18-25 (VKM F-3631D). В течение данного мутагенного процесса морфологические характеристики варьировались частично в культуре в жидкой среде или в планшетах, а также под микроскопом. С каждым последующим мутагенезом культуры проявляли меньшую "взбитость" и "ворсистость" на планшетах, что описывается как характерное свойство Chrysosporium, до тех пор, пока колонии не достигнут вида плоской пленки. Коричневый пигмент, наблюдаемый в штамме дикого типа в некоторых средах,был менее превалирующим в мутантных штаммах. В жидкой культуре мутант UV18-25 был заметно менее вязким, чем штамм С 1 дикого типа и мутанты UV13-6 и NG7C-19. В то время, как все штаммы сохраняли микроскопические характеристики роста Chrysosporium, мицелии становились более узкими с каждой последующей мутацией и в случае UV18-25 можно было наблюдать четкую фрагментацию мицелия. Данная фрагментация мицелия, по-видимому, является причиной более низкой вязкости, характерной для культур UV18-25. Способность штаммов к воздушной споруляции снижалась с каждым этапом мутагенеза. Данные результаты показывают, что штамм может генетически принадлежать к родуChrysosporium, в то же время проявляя отклонения от традиционных таксономических (морфологических) определений. В частности было найдено, что анаморфная форма Chrysosporium подходит для скрининга, применяемого в соответствии с настоящим изобретением. Метаболизм анаморфа делает его особенно подходящим для высокой степени экспрессии. Телеморф также должен подходить, так как генетическая основа анаморфов и телеморфов идентична. Различие между анаморфом и телеморфом состоит в том, что один представляет собой неполовую стадию, а другой - половую стадию; две стадии проявляют различную морфологию при определенных условиях. В другом примере охватываются штаммы Aspergillus sojae, созданные генно-инженерным способом. В одном из таких мутантов разрушен ген специфической эндопротеазы. Это ведет к фенотипу компактного роста, характеризуемому увеличенным ветвлением и короткой гифой, а также к образованию микрочастиц при культивировании в погруженном состоянии. Более того, Aspergillus sojae, на который ссылаются в данной заявке, может быть стимулирован для появления эффективной споруляции в специфических условиях культивирования в погруженном состоянии, что делает его особенно подходящим для применения в системе высокопродуктивного скрининга. В данном случае состояния, которые приводили к образованию переносимых элементов репродукции, просто представляли собой синтетическую среду, содержащую 0,6 г/мл ЭДТА. Приводящие к этому состояния будут варьироваться от одного хозяина к другому, но очевидно, что состояния уже должны быть известны, если хозяин найден подходящим.-8 006873 Предпочтительно применять нетоксичные и непатогенные штаммы грибов, ряд из которых известен специалистам в данной области, и это должно снизить риск для специалиста-практиканта и упростить общий скрининг. В предпочтительном осуществлении грибы должны также характеризоваться недостаточностью протеаз для того, чтобы свести к минимуму деградацию экзогенных белков, и/или способностью к подавлению продукции протеаз. Применение дефицитных по протеазам штаммов в качестве хозяев для экспрессии хорошо известно; см., например, заявку РСТ WO 96/29391. Дефицитные по протеазам штаммы могут быть получены путем скрининга мутантов, или ген(ы) протеаз(ы) могут быть "выбиты" или инактивированы другим образом с помощью способов, известных в данной области техники, как описано, например, Christensen and Hynes в патенте США 6025185 (Aspergillus oryzae с нефункционирующим геном areA). Обнаружено, что могут быть получены мутанты Chrysosporium, которые имеют сниженную экспрессию протеазы, что делает их даже более пригодными для получения белковых продуктов, особенно,если белковый продукт чувствителен к протеазной активности. Таким образом, в изобретении может применяться мутантный штамм Chrysosporium, который продуцирует меньше протеазы, чем немутантный штамм Chrysosporium, например, меньше, чем штамм С 1 С. lucknowense (VKM F-3500 D). В частности, протеазная активность (отличная от любой селективной протеазы, предназначенной для расщепления секретируемого гибридного белка) таких штаммов составляет менее половины от количества, более предпочтительно менее 30% от количества, наиболее предпочтительно менее приблизительно 10% от количества, продуцируемого штаммом С 1. Пониженная протеазная активность может быть измерена с помощью известных способов, таких как измерение ореолов, образованных на чашках со снятым молоком, или измерение деградации бычьего сывороточного альбумина (BSA). Может быть желательной инактивация других генов в гифомицете-хозяине, таких как, например,генов, кодирующих целлюлазы и другие усиленно секретируемые белки, для того, чтобы свести к минимуму вмешательство белков хозяина в тестирование. Гены, кодирующие секретируемые белки, могут быть удалены или мутированы, или в другом варианте гены, контролирующие систему индукции или другие пути, вовлеченные в экспрессию нежелательных белков, могут быть модифицированы таким образом, чтобы снизить их экспрессию. Когда в векторах настоящего изобретения применяют эндогенный промотор (см. ниже), может быть особенно желательной инактивация генов других белков, находящихся под контролем того же индуктора. Грибы, способные к подавлению секреции протеаз, представляют собой те, в которых экспрессия протеаз находится под контролем регуляторного элемента, который отвечает на состояние окружающей среды, так, что данными состояниями (например, концентрацией аминокислот) можно манипулировать для сведения к минимуму продукции протеаз. В трансформирующем векторе предпочтительно применяется гомологичный регулирующий экспрессию район, облегчающий высокую экспрессию в выбранном хозяине. Районы, регулирующие высокую экспрессию, которые происходят от гетерологичного хозяина, такого как Trichoderma или Aspergillus, хорошо известны в данной области техники и также могут быть использованы. Демонстративными,но не ограничивающими примерами белков, известных как экспрессируемые в больших количествах и в результате этого обеспечивающие регулирующие экспрессию последовательности, подходящие для применения в настоящем изобретении, являются гидрофобин, протеаза, амилаза, ксиланаза, пектиназа,эстераза, бета-галактозидаза, целлюлаза (например, эндоглюканаза, целлобиогидролаза) и полигалактуроназа. Область, регулирующая экспрессию, включает промоторную последовательность, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который должен экспрессироваться. Промотор присоединен таким образом, чтобы положение кодона инициации экспрессируемой последовательности делало возможным экспрессию. Последовательность промотора может быть конститутивной, но предпочтительно является индуцибельной. Применение индуцибельного промотора и подходящие среды для индукции благоприятствуют экспрессии генов, функционально связанных с промотором. Предусматривается любая последовательность, регулирующая экспрессию, гомологичных видов или гетерологичного штамма, способного разрешать экспрессию белка. Подходящей последовательностью, регулирующей экспрессию, является область, регулирующая экспрессию, у грибов, например регуляторная область аскомицетов. Подходит, если область, регулирующая экспрессию, аскомицетов представляет собой регуляторную область любого из следующих родов: Aspergillus, Trichoderma,Chrysosporium, Humicola, Neurospora, Tolypocladium, Fusarium, Penicillum, Talaromyces, или их альтернативных половых форм, таких как Emericela и Нуросrеа. Показательными примерами являются промотор целлобиогидролазы от Trichoderma; промоторы алкогольдегидрогеназы А, алкогольдегидрогеназы R,глутамат-дегидрогеназы, амилазы ТАКА, глюкоамилазы и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы от Aspergillus; промотор фосфоглицерата и контрольный промотор перекрестного пути от Neurospora; промоторы липазы и аспартатной протеиназы от Rhizomucor miehei; промотор бета-галактозидазы от Penicillium canescens и промоторы целлобиогидролазы, эндоглюканазы, ксиланазы, глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы А и протеазы от Chrysosporium. Предпочтительной является последовательность,регулирующая экспрессию, от того же самого рода, что и штамм хозяина, так как более вероятно, что она будет специфически адаптирована к хозяину.-9 006873 Особенно предпочтительны природные последовательности, регулирующие экспрессию, от штаммов Chrysosporium, которые экспрессируют белки в предельно высоких количествах. Образцы таких штаммов положены на хранение в соответствии с Будапештским договором во Всероссийскую коллекцию (VKM) института-депозитария в Москве. Штамм С 1 дикого типа имеет номер VKM F-3500 D, дата депонирования 29-08-1996, мутант C1 UV13-6 положен на хранение под номером VKM F-3632 D с датой депонирования 02-09-1998, мутант C1 NG7C-19 положен на хранение под номером VKM F-3633 D с датой депонирования 02-09-1998 и мутант C1 UV18-25 положен на хранение под номером VKM F-3631 D с датой депонирования 02-09-1998. Данные штаммы также предпочтительны как источники для создания мутантов с низкой вязкостью, действительно, штамм VKM F-3631 D уже проявляет фенотип необходимой низкой вязкости. Мутант штамма Trichoderma с низкой вязкостью, обозначенный X-252, был получен после двух циклов облучения Trichoderma longibrachiatum 18.2KK, который, в свою очередь, является полученным в результате мутации штамма QM 9414 Т. longibrachiatum (АТСС 26921). В других осуществлениях в настоящем изобретении применяются фенотипически сходные мутанты Aspergillus sojae иAspergillus niger. Предпочтительно, чтобы, когда хозяином является Chrysosporium, применялась последовательность промотора Chrysosporium для обеспечения ее хорошего узнавания хозяином. Определенные гетерологичные последовательности, регулирующие экспрессию, работают в Chrysosporium также эффективно,как природные последовательности Chrysosporium. Это позволяет использовать хорошо известные конструкты и векторы для трансформации Chrysosporium и дает множество других возможностей для создания векторов, дающих хорошую степень трансформации и экспрессии в данном хозяине. Например, может быть применена стандартная технология трансформации Aspergillus, как описано, например, Christiansen et al. в Bio/Technology 1988 6:1419-1422. Другие документы, предлагающие подробности векторов для трансформации Aspergillus, например патенты США 4816405, 5198345, 5503991, 5364770, 5705358,5728547 и 5578463, ЕР-В-215594 (также для Trichoderma) и их содержание, включены здесь в качестве ссылки. Так как в штаммах Chrysosporium наблюдалась предельно высокая степень экспрессии целлюлазы, области, регулирующие экспрессию генов целлюлазы, особенно предпочтительны. Векторы изобретения могут включать последовательность промотора, которая происходит от гена,кодирующего фермент, предпочтительно секретируемый фермент. Примерами подходящих ферментов,от которых могут быть взяты промоторные последовательности, являются ферменты деградации углеводов (например, целлюлазы, ксиланазы, маннаназы, маннозидазы, пектиназы, амилазы, например, глюкоамилазы, -амилазы, - и -галактозидазы, - и -глюкозидазы, -глюканазы, хитиназы, хитаназы),протеазы (эндопротеазы, аминопротеазы, амино- и карбоксипептидазы), другие гидролазы (липазы, эстеразы, фитазы), оксидоредуктазы (каталазы, глюкозооксидазы) и трансферазы (трансгликозилазы, трансглутаминазы, изомеразы и инвертазы). Некоторые примеры от Chrysosporium lucknowense представлены в табл. А. Конструкт нуклеиновой кислоты должен предпочтительно включать область, регулирующую экспрессию нуклеиновой кислоты, от Chrysosporium, более предпочтительно от Chrysosporium lucknowense или его производного, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который должен экспрессироваться. Особенно предпочтительные конструкты нуклеиновой кислоты должны включать область, регулирующую экспрессию от Chrysosporium, связанную с экспрессией целлюлазы или ксиланазы, предпочтительно с экспрессией целлобиогидролазы, наиболее предпочтительно с экспрессией целлобиогидролазы с М.м. 55 кДа (СВН 1), описанной в табл. А. В качестве дополнительных примеров рассматриваются также последовательности промоторов Chrysosporium для гидрофобина, протеазы, амилазы, ксиланазы, эстеразы, пектиназы, -галактозидазы, целлюлазы (например, эндоглюканазы, целлобиогидролазы) и полигалактуроназы, как попадающие в объем изобретения.- 10006873 Таблица А Характеристики выбранных ферментов Chrysosporium lucknowense- 11006873 Примечания:молекулярные массы по MALDI; все остальные по ЭФ в ПААГ с Na-ДДС хуl = ксиланазаPGU = полигалактуроназа Любой из промоторов или регуляторных областей экспрессии ферментов, раскрытых, например, в табл. А, может быть применен подходящим образом. Последовательности нуклеиновой кислоты данных промоторов и регуляторных областей могут быть легко получены из штамма Chrysosporium. Существует множество способов, с помощью которых могут быть определены последовательности промоторов, и они хорошо известны в данной области техники. Последовательности промоторов обычно находят непосредственно перед стартовым кодоном ATG перед началом интересующего гена. Например, последовательности промоторов могут быть идентифицированы с помощью делеций последовательностей выше интересующего гена с применением технологии рекомбинантной ДНК и проверки влияния данных делеций на экспрессию гена. Также, например, о последовательности промоторов можно часто судить при сравнении последовательности районов выше интересующего гена с консенсусной последовательностью промотора. Например, последовательности промоторов эндоглюканаз С 1 были идентифицированы данным способом (см. патент PCT/NL 99/00618) с помощью клонирования соответствующих генов. Предпочтительные промоторы в соответствии с изобретением представляют собой промоторы целлобиогидролазы с М.м. 55 кДа (СВН 1), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы А и ксиланазы с М.м. 30 кДа (XylF) отChrysosporium, так как данные ферменты экспрессируются на высоком уровне под своими собственными промоторами. Промоторы ферментов, деградирующих углеводы, в частности, от Chrysosporiumlucknowense, особенно GARG 27K С.lucknowense, могут быть удачно использованы для экспрессионных библиотек белков в других организмах грибов-хозяев. Конкретные осуществления последовательностей нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением известны для Chrysosporium, Aspergillus и Trichoderma. Промоторы для Chrysosporium описываются в заявке PCT/NL 99/00618. В предшествующем уровне техники предлагается ряд областей,регулирующих экспрессию, для применения в Aspergillus, например в патентах США 4935349; 5198345; 5252726; 5705358 и 5965384, а также в заявке РСТ WO 93/07277. Экспрессия в Trichoderma раскрыта в патенте США 6022725. Содержание данных патентов включено здесь полностью в качестве ссылки. Ген гидрофобина представляет собой ген гриба, который экспрессируется в высокой степени. Таким образом, предполагается, что последовательность промотора гена гидрофобина, предпочтительно отChrysosporium, может подходить для применения в качестве последовательности, регулирующей экспрессию, в подходящем осуществлении настоящего изобретения. Последовательности гена гидрофобинаTrichoderma reesei и Trichoderma harzianum раскрыты, например, на предшествующем уровне техники,также как последовательность гена для Aspergillus fumigatus и Aspergillus nidulans, и информация о соответствующих последовательностях включена здесь в качестве ссылки (Nakari-Setala et al., Eur. J. Biochem. 1996, 235:248-255; Parta et al., Infect. Immun. 1994 62:4389-4395; Munoz et al., Curr. Genet. 1997,32:225-230; и Stringer et al., Mol. Microbiol. 1995 16:33-44). При применении информации о данных последовательностях специалистом в данной области техники могут быть получены последовательности,регулирующие экспрессию генов гидрофобина Chrysosporium, без излишнего экспериментирования следуя стандартным способам, таким как предложенные выше. Рекомбинантный штамм Chrysosporium в соответствии с настоящим изобретением может включать регулирующую область гена гидрофобина,функционально связанную с последовательностью, кодирующей гетерологичный белок. Регулирующая экспрессию последовательность может также дополнительно включать энхансер или сайленсер. Из предшествующего уровня техники также хорошо известно, что они обычно расположены на некотором расстоянии от промотора. Последовательности, регулирующие экспрессию, могут также включать промоторы со связывающими сайтами для активатора и связывающими сайгами для репрессора. В некоторых случаях такие сайты могут также модифицироваться для уничтожения такого типа регуляции. Например, описаны промоторы гифомицетов, в которых присутствуют сайты creА. Сайты creА могут подвергаться мутации для обеспечения того, чтобы подавление глюкозой, обычно возникающее в результате присутствия creА, исчезало. Применение такого промотора позволяет получать библиотеку белков, кодируемых последовательностями нуклеиновой кислоты, регулируемыми промотором в присутствии глюкозы. Примеры способа представлены в заявках WO 94/13820 и WO 97/09438. Данные промоторы могут быть применены либо с, либо без их сайтов creА. Мутанты, в которых сайты creА подверглись мутации, могут быть использованы в качестве регулирующих экспрессию последовательностей в рекомбинантном штамме в соответствии с настоящим изобретением, и библиотека последовательностей нуклеиновой кислоты, которую они регулируют, может затем экспрессироваться в присутствии глюкозы. Такие промоторы Chrysosporium обеспечивают дерепрессию аналогичным способом, что и- 12006873 проиллюстрированный в заявке WO 97/09438. Идентичность сайтов creА известна из предшествующего уровня техники. В противоположном варианте можно применить промотор со связывающими сайтамиcreА, которые не подверглись мутации в штамме хозяина, с мутацией где-либо в другом месте системы репрессии, например, в самом гене creА, таким образом, что штамм может вопреки присутствию связывающих сайтов creА продуцировать библиотеку белков в присутствии глюкозы. Концевые последовательности также являются последовательностями, регулирующими экспрессию, и они функционально связаны с 3'-концами последовательностей, которые должны экспрессироваться. Множество различных терминаторов грибов, по-видимому, являются функционирующими в штаммах-хозяевах настоящего изобретения. Примерами являются терминатор trpC A. nidulans, терминатор альфа-глюкозидазы A. niger, терминатор глюкоамилазы А. niger, терминатор карбоксипротеазы Mucor miehei (см. патент США 5578463) и терминатор целлобиогидролазы Trichoderma reesei. Последовательности терминатора Chrysosporium, например, терминатора EG6, должны, конечно, хорошо функционировать в Chrysosporium. Подходящий вектор для трансформации для применения в соответствии с изобретением может необязательно содержать последовательности экзогенных нуклеиновых кислот, которые нужно экспрессировать, в функциональной связи с последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность. Сигнальная последовательность представляет собой аминокислотную последовательность, которая при функциональной связи с аминокислотной последовательностью экспрессируемого белка дает возможность белку секретироваться из организма хозяина. Такая сигнальная последовательность может быть или связана с гетерологичным белком, или может быть природной по отношению к хозяину. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальную последовательность, должна находиться в рамке для возможности трансляции сигнальной последовательности и гетерологичных белков. Сигнальные последовательности должны быть особенно предпочтительны, когда настоящее изобретение применяют в связи с направленной молекулярной перестройкой и единственным секретируемым экзогенным белком, который подвергся преобразованию. Должно быть понятно, что менее выгодно включать сигнальную последовательность в вектор, который используется для экспрессии библиотеки, так как это должно снижать вероятность экспрессии интересующего белка. В геномной библиотеке, полученной путем случайного расщепления ДНК и клонирования в вектор, мала вероятность того, что должно получиться слияние в рамке гена в библиотеке с сигнальной последовательностью. Также, если даже получено слияние в рамке, выбранная сигнальная последовательность может не работать со всеми генами. По данным причинам может быть предпочтительным не применять сигнальную последовательность, когда проводится скрининг библиотеки геномной ДНК, но скорее применять ее для скрининга активности или присутствия внутриклеточного экзогенного белка. Анализ активности или присутствия внутриклеточных белков может достигаться путем предварительной обработки библиотеки трансформантов ферментами, которые превращают клетки грибов в протопласты с последующим лизисом. Процедура описана Zeyl et al., J. Biotechnol. 59:221-224(1997). Данная процедура применена к Chrysosporium, чтобы позволить колониям PCR из трансформантов Chrysosporium расти в планшетах для микротитрования. Предусматривается любая сигнальная последовательность, способная обеспечивать секрецию белка из штамма Chrysosporium. Такая сигнальная последовательность является предпочтительно сигнальной последовательностью гриба, более предпочтительно сигнальной последовательностью Ascomycete. Подходящие сигнальные последовательности могут происходить в целом от эукариот, предпочтительно от дрожжей или от любого из следующих родов грибов: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Pichia,Neurospora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces или их альтернативные половые формы, такие как Emericella и Нуроcreа. Сигнальными последовательностями, которые особенно пригодны, являются те, которые природно связаны с целлобиогидролазой, эндоглюканазой, -галактозидазой, ксиланазой, пектиназой, эстеразой, гидрофобином,протеазой или амилазой. Примеры включают амилазу или глюкоамилазу Aspergillus или Humicola, амилазу ТАКА Aspergillus oryzae, -амилазу Aspergillus niger, карбоксипептидазу Mucor (патент США 5578463), липазу или протеиназу Rhizomucor miehei, целлобиогидролазу Trichoderma, -галактозидазуPenicillium canescens CBH1 из Chrysosporium и половой фактор альфа Saccharomyces. В противоположном варианте сигнальная последовательность может быть от гена амилазы или субтилизина штамма Bacillus. Сигнальная последовательность из того же самого рода, что и штамм хозяина,является чрезвычайно подходящей, так как она наиболее вероятно является специфически приспособленной к конкретному хозяину; таким образом, когда хозяином является Chrysosporium lucknowense,сигнальная последовательность предпочтительно является сигнальной последовательностью Chrysosporium. Штаммы Chrysosporium C1, UV13-6, NG7C-19 и UV18-25 секретируют белки в очень больших количествах и сигнальные последовательности от данных штаммов представляют собой особый интерес. Могут быть пригодны сигнальные последовательности от гифомицетов и дрожжей, так же как сигнальные последовательности негрибкового происхождения.- 13006873 Трансформированный рекомбинантный гриб-хозяин в соответствии с любыми осуществлениями настоящего изобретения может дополнительно включать маркер селекции. Такой маркер селекции позволяет отбирать трансформированные или трансфецированные клетки. Маркер селекции часто кодирует генный продукт, обеспечивающий специфический тип устойчивости, не встречающийся у нетрансформированного штамма. Это может быть устойчивость к тяжелым металлам, антибиотикам или биоцидам в целом. Прототрофия представляет собой также полезный маркер селекции из разнообразных неантибиотиковых маркеров. Ауксотрофные маркеры создают недостаточность питания клеток хозяина, и гены,корректирующие такую недостаточность, могут быть применены для селекции. Примерами обычно применяемых ауксотрофных маркеров селекции и маркеров устойчивости являются amdS (ацетамидаза), hph(гигромицинфосфотрансфераза), pyrG (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза) и руrЕ (оротат-Ррибозилтрансфераза), trpC (антранилатсинтаза), argВ (орнитин-карбамоилтрансфераза), sC (сульфатаденилтрансфераза), bar (фосфинотрицинацетилтрансфераза), niaD (нитратредуктаза), Sh-blе (устойчивость к блеомицину-флеомицину), мутантная ацетолактат-синтаза (устойчивость к сульфонилмочевине) и неомицин-фосфотрансфераза (устойчивость к аминогликозиду). Предпочтительным маркером селекции уChrysosporium является оротат-Р-рибозилтрансфераза. Селекция может быть осуществлена путем котрансформации, когда маркер селекции находится в отдельном векторе или когда маркер селекции находится в том же самом фрагменте нуклеиновой кислоты, что и кодирующая белок последовательность для гетерологичного белка. Дополнительное улучшение частоты трансформации может быть получено с помощью применения последовательности репликатора АМА 1, которую применяют, например, в Aspergillus niger (Verdoes etal., Gene 146:159-165 (1994. Данная последовательность вызывает от 10- до 100-кратное увеличение частоты трансформации в ряде различных гифомицетов. Более того, введенная ДНК остается автономной в клетках гриба в виде множественных копий без интеграции в геном гриба. Ожидается, что это должно быть выгодным для способа высокопроизводительного скрининга настоящего изобретения, так как неинтегративное состояние снижает вариации в уровне генной экспрессии между различными трансформантами. Более того, так как введенная ДНК не вступает в рекомбинацию с ДНК хозяина, не должны происходить нежелательные мутации в геноме хозяина. Сходные уровни экспрессии экзогенных генов могут быть получены с помощью применения автономно реплицирующихся векторов, таких как АМА 1, или наоборот автономная репликация в грибах может быть усилена с помощью теломерных последовательностей (см., например, А. Aleksenko and L. Ivanova, Mol. Gen. Genet. 1998 260:159-164). Применяемый здесь термин "гетерологичный белок" представляет собой белок или полипептид, не экспрессирующийся или не секретирующийся штаммом хозяина в обычных условиях, применяемый для экспрессии в соответствии с настоящим изобретением. Гетерологичный белок может иметь прокариотное происхождение или он может происходить от гриба, растения, насекомого или высшего животного,такого как млекопитающее. Для целей фармакологического скрининга, несомненно, часто предпочтение отдается белкам человека, таким образом, в предпочтительном осуществлении хозяином будет тот организм, в котором библиотека ДНК происходит от человека. Такие осуществления, следовательно, также рассматриваются как подходящие примеры настоящего изобретения. Экспрессия библиотеки генов человека, которая происходит от библиотеки геномной ДНК человека, в гифомицетах настоящего изобретения, как ожидается, будет эффективной по нескольким причинам. В настоящее время известно, что средний размер генов человека составляет 3000-5000 п.н., а интронов человека - в среднем от приблизительно 75 до приблизительно 150 п.н. (суммарный интервал 4050000). Гифомицеты имеют интроны размером 40-75 п.н., но они могут использовать интроны размером до 500 п.н. в длину. В среднем гены человека несут 3-5 интронов на ген (М. Deutsch, M. Long, Nucl.Acids Res. 1999 27:3219-3228; табл. В). Известно также, что сигнальные последовательности человека функционируют в гифомицетах. По данным причинам очевидно, что большое число генов человека может экспрессироваться и секретироваться на высоком уровне при применении способов настоящего изобретения. Таблица В- 14006873 Таким образом, ожидается, что способы настоящего изобретения пригодны для экспрессии библиотек ДНК, берущих начало как от прокариотных, так и от эукариотных геномов. Как описано выше, данные способы могут обеспечивать экспрессию и обнаружение как секретируемых, так и внутриклеточных белков, что дает легкий доступ к чрезвычайно большому количеству генов и белков. Другой аспект настоящего изобретения включает конструирование и скрининг мутантных библиотек грибов и мутантных библиотек грибов, полученных с помощью раскрытых здесь способов. Библиотеки могут быть получены трансформацией грибов-хозяев в соответствии с данным изобретением с помощью интегративной или неинтегративной трансформации с применением способов, известных специалистам. Данная библиотека грибов, основанная на предпочтительных штаммах хозяина, может обрабатываться или подвергаться скринингу на желаемые свойства или виды активности экзогенных белков с помощью способов скрининга в миниатюризированном или высокопроизводительном формате. Под интересующим свойством или активностью понимается любое физическое, физико-химическое, химическое, биологическое или каталитическое свойство или любое улучшение, повышение или снижение такого свойства, связанное с экзогенным белком члена библиотеки. Библиотека также может быть подвергнута скринингу на метаболиты или на свойство или активность, связанные с метаболитом, образуемым за счет присутствия экзогенных и/или эндогенных белков. Библиотека также может быть подвергнута скринингу на грибы, продуцирующие повышенное или пониженное количество такого белка или метаболита. В другом варианте настоящего изобретения библиотека трансформированных грибов может быть подвергнута скринингу на наличие метаболитов грибов, обладающих желаемыми свойствами. Примеры таких метаболитов включают поликетиды, алкалоиды и терпеноидные природные продукты. Ожидается,что многочисленные гены или кластеры генов (опероны) могут быть перенесены в клетки-хозяева настоящего изобретения и что небелковые продукты, образуемые за счет действия кодируемых ферментов,будут затем образовываться в клетках-хозяевах. Например, было показано, что ДНК, кодирующая белки,необходимые для образования ловастатина, может быть перенесена в Aspergillus oryzae (патент США 5362638; см. также патент США 5849541). В другом осуществлении изобретения библиотеку трансформированных грибов можно подвергнуть скринингу на наличие ДНК, которая гибридизуется с интересующим нуклеотидным зондом. В данном осуществлении экспрессия и/или секреция экзогенных белков несущественна, хотя часто все еще желаема. Следует понимать, что когда экспрессия белка не является необходимой, присутствие в векторе регуляторных последовательностей не требуется. В еще одном осуществлении настоящего изобретения библиотека трансформированных грибов может быть подвергнута скринингу на некое желаемое свойство самих грибов, такое как, например, устойчивость к физически или химически экстремальной среде или способность образовывать, модифицировать, разрушать или метаболизировать интересующее вещество. Такие желаемые свойства могут быть или могут не быть приписаны присутствию одиночного экзогенного белка. Данное осуществление должно быть особенно применимо при использовании в качестве части процесса направленного преобразования. Гетерологичная ДНК может быть геномной ДНК или кДНК, полученной из биологических образцов с помощью способов, хорошо известных в технике. Биологический образец может быть образцом окружающей среды (например, почвы, компоста, лесной подстилки, морской воды или пресной воды) или ее образцом, экстрагированным, отфильтрованным, отцентрифугированным или другим образом сконцентрированным. Могут быть также применены смешанные культуры микроорганизмов, берущие начало от образцов из окружающей среды. Биологический образец может также вести начало от единственного вида организма, такого как культивируемый микроорганизм, растение, насекомое или другое животное, такое как млекопитающее. Кроме того, гетерологичная ДНК может быть синтетической или полусинтетической, например, случайные последовательности ДНК или ДНК, включающая природные сегменты, которые были перемешаны, мутированы или изменены другим способом. Пример полусинтетической нуклеотидной библиотеки можно найти у Wagner et al., WO 00/0632. ДНК из образцов окружающей среды (или берущих от них начало смешанных культур) должна способствовать открытию новых белков, тогда как применение ДНК из единственного вида должно быть полезным в том, что (1) подходящий вектор может быть выбран более рационально и (2) в случае идентификации интересующего белка специалист-практик будет стремиться к дополнительному скринингу родственных или сходных видов. По сравнению с традиционными грибами-хозяевами, при применении штамма UV18-25 Chrysosporium с компактной морфологией мицелия уровни трансформации, экспрессии и секреции оказываются весьма высокими. Таким образом, рекомбинантный штамм в соответствии с настоящим изобретением должен предпочтительно проявлять такую морфологию. Настоящее изобретение, однако, также охватывает нерекомбинантные штаммы или иные созданные штаммы грибов, проявляющие данное свойство. В привлекательном осуществлении изобретения следовало бы использовать рекомбинантный штамм Chrysosporium, проявляющий вязкость ниже, чем вязкость штамма NG7C-19, предпочтительно ниже вязкостиUV18-25 при соответствующих или одинаковых условиях культивирования. Заявители определили, что- 15006873 вязкость культуры UV18-25 составляет менее 10 сП, что несопоставимо с ранее установленной вязкостью Trichoderma reesei, равной величине порядка 200-600 сП, и вязкостью традиционного Aspergillusniger, равной величине порядка 1500-2000 сП, при оптимальных условиях культивирования во время средней или поздней стадии ферментации. Соответственно, в данном изобретении может применяться любой созданный или мутантный гифомицет, проявляющий данное свойство низкой вязкости, такой как штамм UV18-25 (VKM F-3631D) Chrysosporium, штамм Х 252 Trichoderma или рсlА (ведущий начало от АТСС 11906) A. sojae или рсlА A. niger. Текучесть культур гифомицетов может варьировать в широком диапазоне от почти твердого состояния до свободно текущей жидкости. Вязкость может быть легко количественно определена с помощью ротационной вискозиметрии Brookfield, применения пробирок с кинематической вязкостью, вискозиметра с падающим шаром или вискозиметра чашечного типа. Бульоны ферментации являются неньютоновскими жидкостями, и кажущаяся вязкость будет зависеть в некоторой степени от скорости сдвига(Goudar et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999 51:310-315). Данный эффект, однако, значительно менее выражен для культур с низкой вязкостью, применяемых в данном изобретении. Применение таких культур с низкой вязкостью для скрининга экспрессионной библиотеки в соответствии со способом настоящего изобретения очень выгодно. Скрининг библиотек ДНК, экспрессированных в гифомицетах, прежде был ограничен относительно медленными и трудоемкими методами. В целом, после трансформации грибов (и необязательной для этого селекции трансформантов) необходимо было получить споры или конидии или механически разрушить мицелий для дисперсии библиотеки трансформированных грибов на отдельные организмы или репродуктивные элементы. Данное диспергирование необходимо для того, чтобы отдельные организмы могли быть прокультивированы в клональные колонии или культуры. После этого споры, конидии или фрагменты мицелия разводят и помещают в стандартные культуральные чашки, и отдельные колонии контролируют по цвету, изменениям на субстрате или другому выявляемому показателю наличия искомой активности или свойства белка. При другом подходе делают отпечатки секретируемых белков колоний на мембрану, и мембрану зондируют или исследуют на присутствие интересующей активности или свойства белка. Было доказано, что применение мембран является полезным, когда проблемой является протеолитическое разрушение экзогенного белка (Asgeirsdottir et al., Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65:2250-2252). Такие процедуры являются трудоемкими, и для них не было показано возможности автоматизации, в результате чего высокопроизводительный скрининг экспрессируемых в грибах белков пока не был осуществлен с традиционными гифомицетами. Для целей данного раскрытия понятие высокопроизводительный скрининг относится к любому частично или полностью автоматизированному способу скрининга, способного обеспечить оценку белков, экспрессируемых приблизительно 1000 или более трансформантами в день, и в особенности к тем способам, которые способны обеспечить оценку 5000 или более трансформантов в день, и в наибольшей степени применительно к способам, которые способны обеспечить оценку 10000 или более трансформантов в день. Соответственно, автоматизированный высокопроизводительный скрининг библиотеки трансформированных грибов согласно настоящему изобретению может быть произведен с помощью ряда известных подходов. Способы, для которых известна применимость к бактериям и дрожжам, в целом могут быть применены к грибам с низкой вязкостью настоящего изобретения. Это становится возможным благодаря наличию переносимых репродуктивных элементов в сочетании с фенотипом низкой вязкости,являющимся следствием относительно непереплетенной морфологии гиф применяемых мутантных грибов. По существу, мутантные грибы и/или их переносимые репродуктивные элементы ведут себя очень похоже на отдельные бактерии или дрожжи во время механических манипуляций, включаемых в автоматизированный высокопроизводительный скрининг. Это контрастирует с грибами дикого типа, а также большинством грибов, адаптированных для промышленности, которые образуют крайне переплетенные мицелии, не позволяющие легко разделить отдельные организмы друг от друга. Например, разбавленная суспензия трансформированных грибов согласно настоящему изобретению может быть перенесена в виде аликвот в лунки 96-луночного микропланшета с помощью механической микропипетки. Ожидается, что аппарат, оперирующий с жидкостями, способный осуществлять пипетирование в 384- или 1536-луночные микропланшеты, также может быть приспособлен к автоматизированному разнесению организмов в микропланшеты. Концентрация суспендированных организмов может быть изменена по желанию для контроля среднего количества организмов (или других переносимых репродуктивных элементов) в лунке. Следует понимать, что когда множество отдельных организмов вносится в лунки в виде аликвот, идентификация желаемой активности или свойства белка в данной лунке должна отслеживаться с помощью разведения содержимого лунки и культивирования присутствующих организмов в отдельные клональные колонии или культуры. Таким способом производительность системы может быть увеличена с затратами, требующимися для последующего установления содержимого каждой лунки, являющейся удачной. В другом осуществлении на пути жидкости может быть помещено устройство для сортировки клеток, способное направлять поток культуры в лунки микропланшета после выявления организма или другого переносимого репродуктивного элемента в детекторе клеток. Данное осуществление обеспечивает- 16006873 разнесение по одному организму на лунку с рациональной точностью. Применение оптически выявляемого маркера, такого как зеленый флуоресцентный белок, для идентификации трансформантов является особенно полезным в данном осуществлении, поскольку оно дает возможность автоматического отбора трансформантов с помощью активируемого флуоресценцией устройства для сортирования клеток. В еще одном осуществлении колонии, выращенные на твердых средах, могут отбираться автоматизированным сборщиком колоний и переноситься роботом в лунки планшета для микротитрования. Хорошо разделенные колонии должны давать одиночные клоны в каждой лунке. После этого диспергированным организмам дают расти в клональные культуры в лунках микропланшета. По желанию, с помощью автоматизированной системы разнесения жидкости могут быть добавлены индукторы, питательные вещества и т.д. Система может быть также применена для добавления любых реагентов, необходимых для обеспечения выявления интересующей активности или свойства белка. Например, для обеспечения спектроскопического или флуориметрического выявления ферментативной активности могут быть добавлены дающие окраску или флуоресценцию субстраты. Низкая вязкость и способность к росту культур в погруженном состоянии в лунках планшета для микротитрования обеспечивают быструю диффузию таких реагентов в культуру, что значительно повышает чувствительность и надежность анализа. Диффузия кислорода и питательных веществ также значительно возрастает,что способствует быстрому росту и максимальной экспрессии и секреции экзогенных пептидов. Некоторые виды анализа, такие как сцинтилляционный анализ близости, зависят от диффузии растворимых соединений для достижения состояния равновесия; и в этом случае низкая вязкость культур грибов настоящего изобретения делает возможным данный высокопроизводительный анализ. Наконец, в высокоавтоматизированной системе было бы желательно автоматически отбирать, отсасывать или пипетировать интересующие клональные культуры из их лунок в планшете для микротитрования, и низкая вязкость и способность культур к росту в погруженном состоянии должны делать это возможным. Все указанные выше операции были бы затруднены или невозможны при вязкости культур традиционных гифомицетов,в особенности культур, растущих в виде поверхностных пленок в неперемешиваемых, лишенных перемещения условиях лунки планшета для микротитрования. В другом осуществлении одиночные клетки пропускают через аппарат для микрообъемов жидкости, и интересующее свойство или активность определяют оптическим способом (Wada et al., WO 99/67639). Низкая вязкость существенна для работы приспособления для микрообъемов жидкости, и ожидается, что культуры с низкой вязкостью мутантных грибов настоящего изобретения могут быть подвержены манипуляции с микрообъемами жидкости. Short et al., в патенте США 6174673 описали, как можно применять флуорогенные субстраты для определения интересующей ферментативной активности и как клетки-хозяева, экспрессирующие такую активность, могут быть выделены с помощью активируемого флуоресценцией устройства для сортирования клеток. Способы настоящего изобретения совместимы с данным способом идентификации экспрессируемых белков. В одном осуществлении, где трансформанты несут флуоресцентный белок в качестве маркера,флуоресценцию можно количественно определять и применять в качестве показателя степени экспрессии гена и/или количества экспрессированного белка, находящегося в данной культуре. В данном осуществлении можно не только определять интересующий экзогенный белок, но и устанавливать удельную активность белка, как описано Blyna et а 1. в WO 00/78997. Данное осуществление должно быть особенно предпочтительным, когда способ скрининга изобретения применяют в качестве части процесса направленного преобразования. В тех случаях, когда приемлема более высокая вязкость, образующий гель матрикс может обеспечивать определенные преимущества при культивировании грибов и проведении биохимических анализов в микропланшетном формате, как описано Bochner в патенте США 6046021. Другой класс высокопроизводительного скрининга составляет фотометрический анализ, цифровая спектроскопия изображения больших количеств отдельных колоний, растущих на твердом субстрате. См., например, Youvan et al., 1994, Meth. Enzymol. 246:732-748. В данном способе изменения в суммарных спектрах поглощения или эмиссии специальных реактивов служат показателем присутствия интересующей активности или свойства гетерологичного белка. Легкость разделения отдельных организмов,свойственная применению мутантов с низкой вязкостью, также делает возможным применение гифомицетов в данном способе. Склонность колоний мутантных грибов настоящего изобретения проявлять меньший латеральный рост и образовывать гладкие, компактные и четко очерченные колонии на твердых средах также выгодна при такой системе скрининга. Более того, превосходные характеристики экспрессии и секреции грибов по сравнению с бактериями обеспечивает большие количества белка для спектрального анализа. Автоматизированный аппарат для работы с микроорганизмами описан в японской патентной заявке, номер публикация 11-304666. Данное приспособление способно переносить микрокапли, содержащие отдельные клетки, и ожидается, что штаммы грибов настоящего изобретения благодаря своей морфологии будут пригодны для микроманипулирования с отдельными колониями с помощью данного приспособления.- 17006873 Автоматизированная микробиологическая высокопроизводительная система скрининга описанаBeydon et al., J. Biomol. Screening 5:13-21 (2000). Роботизированная система способна переносить капельки объемом 400 нл на чашки агара и обрабатывать 10000 точек скрининга за час, и она была применена для проведения скрининга двойных гибридов у дрожжей. Ожидается, что хозяева-грибы настоящего изобретения, как и дрожжи, пригодны для высокопроизводительного скрининга с помощью систем данного типа. В качестве альтернативы планшетам для микротитрования, трансформанты можно выращивать на чашках и в форме микроколоний анализировать оптическим способом, как описано в WO 00/78997. Развитие высокопроизводительных способов скрининга в целом обсуждается Jayawickreme andKost, Curr. Opin. Biotechnol. 8:629-634(1997). Высокопроизводительный скрининг для редко транскрибируемых, дифференциально экспрессируемых генов описан von Stein et al., Nucleic Acid Res. 35:2598-2602(1997). Штамм UV18-25 Chrysosporium и штамм X 252 Trichoderma очень хорошо иллюстрируют различные аспекты настоящего изобретения. В изобретении, однако, могут применяться другие мутантные или другим образом созданные штаммы гифомицетов, которые продуцируют переносимые репродуктивные элементы в суспензии и проявляют низкую вязкость в культуре. Специфическая морфология грибов может не иметь решающего значения; заявители настоящего изобретения наблюдали короткие, непереплетенные мицелии двух данных штаммов, но с иной морфологией, такой как близкое и интенсивное ветвление гиф, что также может вести к сниженной вязкости. Штаммы грибов согласно настоящему изобретению являются предпочтительными, если они проявляют оптимальный рост при условиях нейтрального рН и температурах 25-43 С. Такие условия скрининга являются благоприятными для поддержания активности экзогенных белков, в особенности таких, которые подвержены деградации или инактивации при кислых значениях рН. Большинство белков млекопитающих, и, в частности, белков человека, эволюционировали для работы при физиологических рН и температуре, и скрининг на естественную активность фермента человека лучше всего проводить при таких условиях. Белки, предназначенные для терапевтического применения, должны функционировать при данных условиях, что делает данные условия предпочтительными для скрининга. Штаммы Chrysosporium в точности проявляют данное свойство, хорошо вырастая при нейтральных рН и 35-40 С, тогда как другие обычно применяемые виды грибовхозяев (например, Aspergillus и Trichoderma) лучше растут при кислых рН, и по этой причине могут быть менее пригодными. Другое применение способа настоящего изобретения состоит в процессе направленной перестройки, в котором создаются новые кодирующие белок последовательности ДНК, кодируемые белки экспрессируются в клетке-хозяине, и последовательности, кодирующие белки, проявляющие желаемые свойства, подвергают селекции, мутации и вновь экспрессируют. Процесс повторяют на протяжении нескольких циклов до получения белка с желаемыми свойствами. Примерами процесса, с помощью которого могут быть получены новые последовательности ДНК, кодирующие экзогенные белки, являются перемешивание генов, белковая инженерия, склонная к ошибкам ПЦР, сайт-направленный мутагенез и комбинаторный и случайный мутагенез. Патенты США 5223409, 5780279 и 5770356 описывают направленную перестройку. См. также Kuchner and Arnold, Trends in Biotechnology, 15:523-530 (1997); SchmidtDannert and Arnold, Trends in Biotech., 17:135-136 (1999); Arnold and Volkov, Curr. Opin. Chem. Biol., 3:5459 (1999); Zhao et al., Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2nd Ed., (Demain and Davies,eds.) pp. 597-604, ASM Press, Washington DC, 1999; Arnold and Wintrode, Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation (Flickinger and Drew, eds), pp. 971-987, John WileySons, New York, 1999 и Minshull and Stemmer, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284-290. Применение комбинаторного мутагенеза раскрыто Hu et al., Biochemistry, 1998 37:10006-10015. В патенте США 5763192 описан процесс получения новых кодирующих белок последовательностей ДНК путем создания случайных синтетических последовательностей, введения их хозяину и селекции клетокхозяев с желаемым свойством. Способы осуществления рекомбинации искусственных генов (перетасовки ДНК) включают рекомбинацию со случайным праймером (Z. Shao, et al., Nucleic Acids Res., 26:681683 (1998, процесс колеблющегося удлинения (Н. Zhao et al., Nature Biotech., 16:258-262 (1998 и гетеродуплексную рекомбинацию (А. Volkov et al., Nucleic Acids Res., 27:e18 (1999. Другим подходом служит склонная к ошибкам ПЦР (Song and Rhee, Appl. Environ. Microbiol. 66:890-894 (2000. Существует два широко применяемых способа проведения этапа селекции в процессе направленной перестройки. В одном способе интересующую активность белка каким-либо образом делают необходимой для выживания клеток-хозяев. Например, если желаемой активностью является целлюлаза, активная при рН 8, можно вызвать мутацию гена целлюлазы и ввести его в клетки-хозяева. Трансформанты выращивают с целлюлозой в качестве единственного источника углерода, и рН постепенно повышают до тех пор, пока не остается лишь несколько уцелевших организмов. Мутантный ген целлюлазы из уцелевших организмов, который предположительно кодирует целлюлазу, активную при относительно высоком рН,подвергают еще одному циклу мутации, и процесс повторяют до тех пор, пока не будут получены трансформанты, которые могут хорошо расти на целлюлозе при рН 8. Термостабильные варианты ферментов могут создаваться сходным образом, с помощью циклов мутации генов и культивирования клеток-хозяев- 18006873 при высокой температуре (Liao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986 83:576-580; Giver et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 1998 95:12809-12813. Для целей настоящей заявки мутация последовательностей ДНК,кодирующих экзогенные белки, может быть осуществлена любым из нескольких способов, применяемых для направленной перестройки, например, с помощью перетасовки генов, рекомбинации in vivo и кассетного мутагенеза. Главным достоинством данного способа служит природа с массовым параллелизмом стадии селекции выживания наиболее приспособленных. Миллионы или миллиарды неудачных мутаций одновременно снимаются с рассмотрения без необходимости их индивидуальной оценки. Однако не всегда возможно связать интересующую ферментативную активность с выживанием хозяина. Например, когда желаемым свойством белка является избирательное связывание с интересующей мишенью, по-видимому,трудно сделать способность к связыванию необходимой для выживания. Кроме того, выживание при экстремальных условиях, таких как высокая температура или предельные рН, вероятно, зависит от множества факторов, и желаемую мутацию не удастся отобрать, и она будет утрачена, если клетка-хозяин не способна к выживанию по причинам, не имеющим отношения к свойствам мутантного белка. Альтернативой подходу с массовым параллелизмом выживания наиболее приспособленных служит последовательный скрининг. В данном подходе отдельные трансформанты подвергают скринингу традиционными способами, такими как наблюдение осветленных или окрашенных зон вокруг колоний,растущих на индикаторных средах, колориметрические или флуориметрические ферментативные анализы, иммунологические анализы, анализы связывания и т.д. См., например, Joo et al., Nature 399:670-673(1999), где цитохром-Р 450-монооксигеназу, не нуждающуюся в NADH в качестве кофактора, перестраивали с помощью циклов мутаций и скрининга; May et al., Nature Biotech. 18:317-320 (2000), где гидантоиназу с обратной стереоспецифичностью перестраивали сходным образом; и Miyazaki et al., J. Mol.Biol. 297:1015-1026 (2000), где был создан термостабильный субтилизин. Скрининговый подход имеет явные преимущества по сравнению с простым скринингом на выживание, в особенности, если его можно проводить в высокопроизводительном варианте, достигающем производительности техники скрининга на выживание с массовым параллелизмом. Например, степень параллелизма была введена с помощью применения таких измерений, как цифровое изображение трансформированных организмов (Joo et al., ChemistryBiology, 6:699-706 (1999 или цифровая спектроскопическая оценка колоний (Youvan et al., 1994, Meth. Enzymol. 246:732-748). Серийные анализы могут быть автоматизированы путем применения устройства для сортирования клеток (Fu et al., Nature Biotech.,17:1109-1111 (1999. Хорошо обоснованный подход к высокопроизводительному скринингу включает автоматизированную оценку экспрессированных белков в планшетах для микротитрования с применением имеющихся в продаже планшетных ридеров, и способ настоящего изобретения хорошо приспособлен к применению данного типа высокопроизводительного скрининга желаемой перестройки. В данном осуществлении настоящего изобретения ген, кодирующий интересующий белок, подвергают мутации с помощью любого известного способа создания множества мутантов, мутантную кодирующую белок ДНК вводят с помощью подходящего экспрессионного вектора в гифомицетного хозяина с низкой вязкостью согласно настоящему изобретению, и трансформанты не обязательно подвергают селекции и культивируют. После этого клетки-хозяева вносят, как описано ранее, в лунки планшета для микротитрования или каким-либо другим способом пространственно разделяют с тем, чтобы получить моноклональные культуры (или поликлональные культуры, содержащие менее чем приблизительно 100 различных колоний). Клетки предпочтительно вносят в лунки планшета для микротитрования. Кодируемый мутантной ДНК белок предпочтительно секретируется в среду в лунках планшета для микротитрования. Каждую из высеянных культур подвергают скринингу на интересующую активность белка, и отбирают наиболее сильно проявляющие желаемое свойство. Ген, кодирующий желаемый белок в отобранных культурах, подвергают повторной мутации, и мутантную ДНК вновь вводят хозяину-грибу с низкой вязкостью, и трансформанты подвергают повторному скринингу. Процесс мутирования и повторного скрининга повторяют до тех пор, пока величина интересующего свойства не достигнет желаемого уровня. В другом осуществлении желаемую перестройку осуществляют за счет мутации и репродукции интересующего гена в другом организме, в таком как Е. coli, с последующим переносом мутантных генов в гифомицет согласно настоящему изобретению для скрининга. Специалисты в данной области техники должны хорошо понимать, что белок, который, повидимому, является интересным по результатам скрининга, необязательно должен обладать всеми другими свойствами, необходимыми для промышленного применения. Например, наличие ферментативной активности даже с высокой удельной активностью не является указанием на то, что мутантный фермент обладает необходимой стабильностью в отношении температуры или рН, или устойчивостью к детергенту или протеазе, или характеризуется отсутствием иммуногенности, или обладает другим свойством,которое могло бы быть желательным или необходимым для промышленной конкурентоспособности продукта. Существует потребность в способах простого определения того, обладает ли выявленный белок промышленно-полезными свойствами.- 19006873 Предшествующие подходы к скринингу не обеспечили решения данной проблемы, поскольку организмы-хозяева (бактерии и дрожжи) не были приспособлены для продукции выделяемых количеств белка. Ранее существовала необходимость переноса потенциально полезных генов из одного организма в другой, поскольку было необходимо пройти через получение библиотеки ДНК, экспрессию генов, скрининг, экспрессию аналитических количеств продуктов гена и гиперэкспрессию в пригодных для промышленности продуцирующих штаммах. Мутантные гифомицеты настоящего изобретения, с другой стороны, являются прекрасными гиперпродуцирующими и секретирующими экзогенные белки организмами, в особенности при их применении с описанными здесь векторами. Достаточное количество белка может быть выделено не только для целей характеристики, но и для оценки в тестах на применение. Действительно, штаммы, применяемые в способе скрининга настоящего изобретения, пригодны также для промышленного производства, поскольку они обладают желаемыми промышленными свойствами, такими как низкая вязкость, высокие скорости экспрессии и очень высокие соотношения белок/биомасса. Соответственно, в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения способ дополнительно включает культивирование клональной колонии или культуры, идентифицированных в соответствии со способом настоящего изобретения, при условиях, обеспечивающих экспрессию и секрецию библиотеки экзогенных белков (или их предшественников), и выявление продуцированного затем белка для получения интересующего белка. Экспрессия и секреция белка библиотеки может быть облегчена созданием слияния в рамке клонированного гена с геном гетерологичного белка (или его фрагмента) с его соответствующей сигнальной последовательностью или с сигнальной последовательностью от третьего белка,причем все они функционально связаны с последовательностью, регулирующей экспрессию. С помощью данного подхода создают гибридный белок, который содержит гетерологичные аминокислотные последовательности, расположенные перед белком библиотеки. Затем данный гибридный белокпредшественник может быть изолирован и выделен с применением способов очистки, известных в данной области техники. Способ может необязательно включать стадию расщепления секретируемого гибридного белкового предшественника для создания интересующего белка библиотеки. Стадию расщепления можно проводить с помощью Кех-2, Кех-2-подобной протеазы или другой избирательной протеазы,когда вектор конструируют таким образом, что сайт расщепления протеазой соединяет хорошо секретируемый носитель белка и интересующий белок. Легкая доступность мутантного белка непосредственно в результате скрининга организма-хозяина ранее была невозможна с применявшимися ранее хозяевами для скрининга. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается преимущество в том, что мутантные белки, считающиеся интересными на основании высокопроизводительного скрининга, могут быть выделены в значительных количествах (миллиграммах) для дальнейшей характеристики, и даже в больших количествах (от граммов до килограммов) для испытаний на применение. Данное конкретное осуществление изобретения, таким образом, позволяет исполнителю отобрать мутантные белки для следующего цикла направленной перестройки на основании любого количества желаемых свойств, а не только одного свойства, определенного при высокопроизводительном скрининге. Более жесткие критерии селекции, ставшие возможными благодаря настоящему изобретению, должны вести к более эффективным и оправданным по затратам процессам направленной перестройки. Способ получения рекомбинантного мутантного штамма гифомицета согласно настоящему изобретению включает введение библиотеки последовательностей ДНК, включающей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гетерологичные белки, в мутантный гифомицет с низкой вязкостью в соответствии с изобретением, причем последовательности нуклеиновой кислоты функционально связаны с областью регуляции экспрессии. Введение последовательностей ДНК может быть осуществлено любым известным самим по себе способом трансформации гифомицетов. Специалистам должно быть ясно,что существует несколько хорошо апробированных способов, таких как стимулированный СаСl2 полиэтиленгликолем захват ДНК протопластами грибов (Johnstone et al., EMBO J., 1985, 4:1307-1311). Способ трансформации протопластов описан в примерах. Альтернативные способы трансформации протопластовили сферопластов известны и могут быть применены, как это было описано на предшествующем уровне техники, для других гифомицетов. Векторы, пригодные для интеграции гетерологичной ДНК во множестве копий в геном гриба, хорошо известны; см., например, Giuseppin et al., заявка WO 91/00920. Применение автономно реплицируемых плазмид в течение длительного времени было известно в качестве эффективного инструмента для трансформации грибов (Gems et al Gene 1991 98:61-67;Aleksenko et al., Mol. Gen. Genet. 1996, 253:242-246). Подробности каждого способа можно найти во многих из цитированных ссылок, и они включены таким образом в качестве ссылки. Демонстрационные способы в соответствии с настоящим изобретением, включающие применение мутантного штамма Chrysosporium или A. sojae с низкой вязкостью в качестве исходного материала для введения векторов, несущих гетерологичную ДНК, представлены ниже.- 20006873 Примеры А. Создание мутантов с компактной морфологией роста. В различных патентных заявках показано, что морфологические мутанты могут быть выделены с помощью различных способов скрининга. В WO 96/02653 и WO 97/26330 описаны неопределенные мутанты, обладающие компактной морфологией. Было обнаружено, что осуществляющий процессинг пробелка мутант A. sojae обладает неожиданным, необычным ростовым фенотипом (сверхветвящимся), и при этом не наблюдалось нежелательного влияния на образование белка. Эксперименты с культивированием данного штамма показали фенотип очень компактного роста с микродебрисами. Данные особенности наблюдались не только в случае А. sojae, но и в случае других мутантных грибов, например, A. niger.(1). Создание осуществляющего процессинг пробелка мутанта А. niqer. Для клонирования гена А. niger, кодирующего конвертазу пробелка, применяли ПЦР. На основе сравнения генов различных конвертаз пробелков различных видов дрожжей и высших эукариот были созданы различные вырожденные в 4, 2, 2, 512, 1152, 4608, 2048 и 49152 раз, соответственно, праймеры для ПЦР. В результате амплификации с применением праймеров РЕ 4 и РЕ 6 были получены два отдельных клона, в которых в последовательности кодируемого белка не было обнаружено значительной гомологии с последовательностью КЕХ 2 S. cerevisiae. Данные клоны были применены в дальнейших экспериментах. На основании наблюдаемой гомологии клонированного ПЦР-фрагмента с другими генами конвертазы пробелка соответствующий ген А. niger был обозначен как рсlА (от подобного конвертазе пробелка). Анализ по Саузерну продуктов гидролиза геномной ДНК А. niger показал, что ген рсlА существует в виде гена в единичной копии, который не имеет близкородственных генов в геноме А. niger,поскольку даже в условиях гетерологичной гибридизации (50 С; отмывка 6xSSC) не наблюдалось дополнительных сигналов гибридизации. Первый скрининг геномной библиотеки в EMBL3 А. niger N401(van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 1987 206:71-75) оказался безрезультатным в получении позитивно гибридизуемых бляшек, хотя для скрининга было использовано приблизительно 10-20 геномных эквивалентов. При втором скрининге геномной библиотеки в EMBL4 A. niger N400 была выделена полноразмерная геномная копия гена рсlА (Goosen et al., Curr. Genet. 11:499-503 (1987. Из 8 гибридизуемых бляшек, которые были получены после скрининга 5-10 геномных эквивалентов, 6 оставались позитивными после первого повторного скрининга. Все эти 6 клонов, по-видимому,несли полную копию гена рсlА, поскольку во всех клонах (как это наблюдалось для геномной ДНК) с фрагментом ПЦР присутствовали два гибридизуемых EcoRV-фрагментов размером 3 и 4 т.п.н. (фрагмент ПЦР содержал сайт рестрикции для EcoRV). На основании сравнения с размером других конвертаз пробелка, совместно данные фрагменты должны были содержать полный ген рсlА с 5'- и 3'-примыкающими последовательностями. Два EcoRV-фрагмента и перекрывающий EcoRV-фрагмент размером 5 т.п.н. субклонировали для дальнейшей характеристики. На основании рестрикционной карты была определена полная последовательность ДНК гена рсlА по субклонам EcoRI и EcoRV. Анализ полученной последовательности выявил открытую рамку считывания со значительным сходством с таковой гена КЕХ 2 S. cerevisiae и других конвертаз пробелка. На основании последующего сравнения в кодирующей области были идентифицированы две потенциальные интронные последовательности. Последующий ПЦР-анализ библиотеки кДНК А. niger в pEMBLyex с праймерами, примыкающими к потенциальным интронам, показал, что лишь более близкая к 5'-концу из этих двух последовательностей представляет собой истинный интрон. Общая структура кодируемогоpclA-белка была явно похожа на таковую других конвертаз пробелка. Общее сходство белка pсlА с другими конвертазами пробелка составляло приблизительно 50%. Для того чтобы показать, что клонированный рсlА ген является функциональным геном, кодирующим функциональный белок, была предпринята попытка создания штаммов, лишенных гена рсlА. Для этого был создан делеционный вектор рсlА, pPCLlA, в котором большая часть кодирующей области рсlА была заменена маркером селекции pyrG A. oryzae. Затем вставочный EcoRI-фрагмент размером 5 т.п.н. из данного вектора использовали для трансформации различных штаммов A. niger. На основе данных трансформаций (основанных на pyrG селекции) было получено множество трансформантов. Интересно, что часть трансформантов (варьирующих от 1 до 50%) проявила очень четкий аберрантный фенотип (фиг. 13). Анализ по Саузерну нескольких штаммов дикого типа и аберрантных трансформантов показал, что те аберрантные трансформанты, которые проявляли жестко ограниченный (компактный) ростовой фенотип, утратили ген рсlА. Все штаммы, проявляющие рост дикого типа, как было показано, несли копию замещающего фрагмента, интегрированную рядом с геном рсlА дикого типа или в негомологичном положении.(2). Создание мутанта A. sojae по процессингу пробелка. Для создания соответствующего мутанта A. sojae была произведена функциональная комплементация мутанта А. niger с низкой вязкостью путем трансформации мутанта А. niger по рсlА космидной библиотекой АТСС 11906 А. sojae. Из полученных дополненных трансформантов А. niger были выделены клоны с геномными космидами, которые включали протеазу процессинга белка рсlА из А. sojae. Анализ частичной последовательности выделенных последовательностей подтвердил клонирование гена рсlА А.sojae. На основании клонированных последовательностей рсlА А. sojae был создан замещающий ген вектор в соответствии с подходом, сходным с описанным в других примерах заявителя, с применением маркера селекции pyrG многократного применения, описанного в заявке WO 01/09352. Кроме того, был сконструирован разрушающий ген вектор, несущий маркер селекции pyrG и укороченный по 5'- и 3'-концам фрагмент гена рсlА А. sojae. Для создания мутантов по рсlА в АТСС 11906 и производных АТСС 11906 применяли векторы и замены гена и разрушения гена. Эксперименты с культурами некоторых из полученных трансформантов выявили улучшенные морфологические характеристики, в частности, компактную ростовую морфологию и микродебрисы (фиг. 14 А и 14 В).(3). Выделение альтернативных мутантов A. sojae по компактному росту. Трансформация A. sojae ATCC 11906 и производных может быть произведена линейными фрагментами ДНК, несущими маркер грибковой селекции. Если не применяют специальных последовательностей репликации, то полученные с помощью данной процедуры трансформанты несут введенную ДНК,интегрированную в геном штамма-хозяина. Поскольку введенный маркер селекции имеет гетерологичное происхождение (A. niger), должна происходить только гетерологичная рекомбинация, ведущая к набору трансформантов, несущих маркерную ДНК в различных положениях генома. Данная интеграция склонна приводить к разрушению эндогенных для А. sojae последовательностей, что тем самым ведет к набору мутантных штаммов А. sojae. Это иллюстрируется анализом большой коллекции трансформантов, полученных из А. sojae ATCC 11906alpApyrG с применением фрагмента ДНК с маркером селекцииpyrG A. niger. Было проанализировано в общей сложности несколько тысяч трансформантов, из которых 5-10 проявили морфологически аберрантный фенотип. Среди них несколько имели фенотип, сопоставимый с мутантами рсlА. Сходно с описанным для клонирования гена рсlА А. sojae, из генной библиотеки А. sojae с помощью комплементации морфологического фенотипа мог быть выделен соответствующий мутации ген. На основе клонированного гена могут быть созданы мутанты с разрушением/делецией соответствующего гена.(4). Выделение мутантов Chrysosporium с компактным ростом. С помощью основанного на ПЦР подхода к клонированию, сходного с описанным для гена рсlА А.niger, из BLUESTAR (ТМ) генной библиотеки Chrysosporium был клонирован фрагмент гена Chrysosporium процессинга пробелка, названный pcl1. Фрагмент гена, несущий полную копию геномного гена,субклонировали из клона pBLUESTAR. На основе полученного субклона был создан разрушающий ген вектор, как описано для А. sojae. Вместо маркера pyrG, для Chrysosporium применяли фланкируемую повтором версию гена pyrЕ А. niger. (Разрушающая ген)-трансформация Chrysosporium давала штаммы с фенотипом компактного роста. В. Определение вязкости. Для грибковой ферментации с применением пяти различных грибковых организмов были определены следующие диапазоны рабочих параметров. Сравниваемыми пятью грибковыми организмами служили штаммы Aspergillus niger, Trichoderma longibrachiatum 18.2KK (исходно Т. reesei), Trichoderma longibrachiatum X 252, Chrysosporium lucknowense штамм UV18-25 и Aspergillus sojae pclA. Вязкость грибковой культуры меняется в ходе ферментации и зависит от концентрации питательных веществ. Для сообщаемых здесь измерений среду, содержащую от 20 до 100 г/л источника углеводного углерода (например, целлюлозы, лактозы, сахарозы, ксилозы, глюкозы и им подобного), инокулируют грибом и культуре дают пройти через фазу роста, во время которой источник углерода расходуется. Встряхиваемые культуры в бутылях встряхивают при 200 об/мин, а однолитровые сосуды для ферментации перемешивают с помощью мешалки при 500-1000 об./мин. Максимальная вязкость обычно имеет место в конце или незадолго до конца фазы роста. В это время тип питания культуры переключают на порционный,когда источник углерода подают в культуру с такой скоростью, что концентрация источника углерода не возрастает выше приблизительно 0,5 г/л. Типичной является скорость подачи между 1 и 3 г/л/ч. Вязкость определяли на вискозиметре Brookfield LVF с применением адаптера для малых образцов и шпинделя номер 31 при рабочей температуре 30 С. В шпиндель для малого образца помещали свежий образец бульона ферментации (10 мл). Скорость шпинделя доводили таким образом, чтобы получить показание в диапазоне 10-80. Через четыре минуты снимали показание со шкалы вискозиметра. Показание умножали на приводимый ниже коэффициент для получения вязкости в сантипуазах (сП). Конечную вязкость измеряли в конце ферментации. С. Трансформация Chrysosporium, Trichoderma и Tolypocladium. Применяли следующие среды для трансформации: Среды для селекции и культивирования: Для селекции трансформантов применяют среду для регенерации (MnR) с добавкой 50 мкг/мл флеомицина или 100-150 мкг/мл гигромицина. Для подтверждения устойчивости к антибиотику применяют среду GS с добавкой 5 мкг/мл флеомицина.PDA представляет собой полную среду для быстрого роста и хорошей споруляции. Жидкие среды инокулируют 1/20-й суспензии спор (все споры с одной 90 мм PDA-чашки в 5 мл 0,1% Твина). Такие культуры выращивают при 27 С во встряхиваемых бутылях (200 об./мин). Два нетрансформированных штамма Chrysosporium C1 и один штамм сравнения Trichoderma reesei тестировали в двух средах (GS с рН 6,8 и агаре Pridham, PA, с рН 6,8). Для тестирования степени устойчивости к антибиотику споры собирали с 7-дневных чашек PDA. Чашки для селекции инкубировали при 32 С, и показания снимали через 2, 4 и 5 дней. Штаммы С-1 NG7C-19 и UV18-25 четко показали низкий уровень базальной устойчивости как к флеомицину, так и к гигромицину, сопоставимый с таковым лабораторного штамма сравнения Т. reesei. Это служит четким указанием на то, что данные стандартные селектируемые маркеры грибов могут быть применены в штаммах Chrysosporium. He ожидается проблем с другими стандартными селектируемыми маркерами грибов. Селекция Sh-ble (резистентных к флеомицину) трансформированных штаммов Chrysosporium была успешно проведена при 50 мкг/мл. Эта величина была и уровнем селекции, примененной для Т. reesei,что таким образом показывает, что в случае Chrysosporium может быть легко достигнута дифференциальная селекция. Те же комментарии справедливы в отношении штаммов, трансформированных на устойчивость к гигромицину при уровне 150 мкг/мл. К Chrysosporium была применена техника протопластной трансформации, основанная на наиболее широко применяемой по отношению к грибам технике трансформации. Все споры с одной 90 мм чашкиPDA собирали в 8 мл IC1 и переносили во встряхиваемую бутыль с 50 мл среды IC1 для инкубации в течение 15 ч при 35 С и 200 об./мин. После этого культуру центрифугировали, осадок промывали МnР,вновь переносили в раствор 10 мл МnР с 10 мг/мл Caylase С 3 и инкубировали в течение 30 мин при 35 С при встряхивании (150 об./мин). Раствор фильтровали и фильтрат подвергали центрифугированию в течение 10 мин при 3500 об./мин. Осадок промывали 10 мл MnP Ca2+. Содержимое центрифугировали в течение 10 мин при 25 С. Затем добавляли 50 мкл холодной МРС. Смесь оставляли на льду в течение 30 мин, после чего добавляли 2,5 мл РМС. Через 15 мин при комнатной температуре смешивали 500 мкл обработанных протопластов с 3 мл MnR Soft и немедленно переносили на чашку с MnR, содержащей флеомицин или гигромицин в качестве агента селекции. После инкубации в течение пяти дней при 30 С трансформанты анализировали(клоны становились видимыми через 48 ч). Эффективность трансформации определяли с помощью 10 мкг плазмиды сравнения pAN8-l. Результаты представлены в следующей табл. С. Таблица С Эффективность трансформации (с применением 10 мкг плазмиды сравнения pAN8-l) Результаты показывают, что выживаемость трансформанта Chrysosporium превосходит таковуюTrichoderma. Способность штаммов к трансформации сопоставима, и, таким образом, количество трансформантов, полученных в одном эксперименте для Chrysosporium, в 4 раза превышает таковое для Т.reesei. Таким образом, система трансформации Chrysosporium не только не уступает общеприменимой системе Т. reesei, но даже превосходит ее. Данное улучшение может оказаться особенно полезным для векторов с меньшей чем у pAN8-l эффективностью трансформации. Ряд других трансформирующих и экспрессионных плазмид был сконструирован с применением гомологичных последовательностей, кодирующих белок Chrysosporium, а также гетерологичных кодирующих белок последовательностей для применения в экспериментах по трансформации Chrysosporium. Карты векторов представлены на фиг. 6-11. Подлежащий экспрессии гомологичный белок выбирали из группы продуцируемых Ghrysosporium целлюлаз, состоящей из эндорлюканазы 6, которая принадлежит к семейству 6 (мол. масса 43 кДа), а гетерологичным белком была эндоглюканаза 3, которая принадлежит к семейству 12 (мол. масса 25 кДа)pF6g включает промоторный фрагмент эндоглюканазы 6 Chrysosporium, присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы 6 в одной рамке с открытой рамкой считывания эндоглюканазы 6 и последующей терминаторной последовательности эндоглюканазы 6. Селекцию трансформантов производят с помощью котрансформации вектором селекции.pUT1150 включает промотор целлобиогидролазы Trichoderma reesei, присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы 6 в одной рамке с открытой рамкой считывания эндоглюканазы 6 и последующей терминаторной последовательности целлобиогидролазы Т. reesei. Кроме того, данный вектор несет вторую экспрессионную кассету с маркером селекции, т.е. геном устойчивости к флеомицинуpUT1152 включает промотор глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы A Aspergillus nidulans, присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы 6 в одной рамке с открытой рамкой считывания эндоглюканазы 6 и последующей терминаторной последовательности антранилатсинтазы (trpC)A. nidulans. Кроме того, данный вектор несет вторую экспрессионную кассету с маркером селекции, т.е. геном устойчивости к флеомицину (ген Sh-ble).pUT1155 включает промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы A A. nidulans, присоединенный к сигнальной последовательности целлобиогидролазы Trichoderma reesei в одной рамке с переносящим белком Sh-ble, который, в свою очередь, присоединен в одной рамке к открытой рамке считывания эндоглюканазы 6 и последующей терминаторной последовательности trpC A. nidulans. Данный вектор применяет технологию переносящего белка, слитого с интересующим белком, которая, как известно,очень значительно улучшает секрецию интересующего белка.pUT1160 включает промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы A Aspergillus nidulans, присоединенный к сигнальной последовательности целлобиогидролазы Trichoderma reesei в одной рамке сPenicillium с открытой рамкой считывания и последующей терминаторной последовательности trpC A.pUT1162 включает промотор целлобиогидролазы Trichoderma reesei, присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы 3 в одной рамке с открытой рамкой считывания эндоглюканазы 3Penicillium и последующей терминаторной последовательности целлобиогидролазы Т. reesei. Кроме того,данный вектор несет вторую экспрессионную кассету с геном устойчивости к флеомицину (ген Sh-ble) в качестве маркера селекции. Для специалистов должно быть ясно, что образец геномной или кДНК может быть легко разрезан или расщеплен до кодирующих белок фрагментов, и фрагменты лигируются в векторы, такие как иллюстрированы здесь, таким образом, чтобы получить библиотеку экспрессионных векторов. Кроме того,должно быть ясно, что применимы способы, использующие котрансфекцию, и что для трансфекции гифомицетов такими библиотеками векторов могут быть применены автономно реплицируемые векторы или интегрируемые векторы. Таблица D Сравниваемые трансформанты Табл. D показывает результаты трансформации Chrysosporium UV18-25 и Tolypocladium geodes. Примененный протокол трансформации описан ниже в разделе гетерологичной трансформации.D. Гетерологичная и гомологичная экспрессия в трансформантах Chrysosporium. Штаммы C1 (NG7C-19 и/или UV18-25) тестировали на их способность секретировать различные гетерологичные белки: бактериальный белок (белок устойчивости к флеомицину, Sh-ble, Streptoalloteichushindustanus), белок гриба (ксиланазу II, XYN2, Trichoderma reesei) и белок человека (лизоцим человека,HLZ). Подробности процесса описаны ниже.(1). Секреция C1 белка устойчивости к флеомицину (Sh-ble) Streptoalloteichus hindustanus. Штаммы C1 NG7C-19 и UV18-25 трансформировали с помощью плазмиды pUT720 (ссылка 1). Данный вектор представляет следующую экспрессионную кассету грибов: промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gpdA) Aspergillus nidulans (ссылка 2); синтетическая сигнальная последовательность целлобиогидролазы I (cbh1) Trichoderma reesei(ссылки 1,3); ген устойчивости к флеомицину Sh-ble Streptoalloteichus hindustanus (ссылка 4); терминатор триптофансинтазы (trpC) Aspergillus nidulans (ссылка 5). Вектор также несет ген бета-лактамазы (bla) и старт репликации Е. coli из плазмиды pUC18 (ссылка 6). Подробная карта плазмиды представлена на фиг. 2.C1 протопласты трансформировали по Durand et al. (ссылка 7) в адаптации для C1: все споры из одной 90-мм чашки PDA нетрансформированного штамма C1 собирали в 8 мл IC1 и переносили во встряхиваемую бутыль с 50 мл среды IC1 для инкубации в течение 15 ч при 35 С и 150 об./мин. После этого культуру центрифугировали, осадок промывали в МnР, вновь растворяли в 10 мл МnР + 10 мг/мл Caylase С 3 и инкубировали 30 мин при 35 С при встряхивании (150 об./мин). Раствор фильтровали и фильтрат центрифугировали 10 мин при 3500 об./мин. Осадок промывали 10 мл МnРСа 2+. Содержимое центрифугировали 10 мин при 3500 об./мин и осадок собирали в 1 мл МnРСа 2+. К 200 мкл раствора протопластов добавляли 10 мкг ДНК pUT720 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре (приблизительно 20 С). Затем добавляли 50 мкл холодной МРС. Смесь оставляли на льду в течение 30 мин, после чего добавляли 2,5 мл РМС. Через 15 мин при комнатной температуре 500 мкл обработанных протопластов смешивали с 3 мл MnR Soft и немедленно переносили на чашку с MnR, содержащей флеомицин 50 мкг/мл при рН 6,5) в качестве агента селекции. После 5-дневной инкубации при 30 С трансформанты анализировали (клоны становились видимыми через 48 ч).- 26006873 Образование Sh-ble трансформантами С 1 (устойчивыми к флеомицину клонами) анализировали следующим образом. Первичные трансформанты переносили на чашки с GS+флеомицин (5 мкг/мл) и выращивали в течение 5 дней при 32 С для подтверждения устойчивости. Каждый клон с подтвержденной устойчивостью субклонировали на чашках GS. Для получения спор для инициирования жидкой культуры применяли по два субклона на трансформант для инокуляции чашек PDA. Жидкие культуры вIC1 выращивали 5 дней при 27 С (встряхивание при 200 об./мин). После этого культуры центрифугировали (5000g, 10 мин) и отбирали 500 мкл супернатанта. Из этих образцов с помощью ТХУ осаждали белки, которые ресуспендировали в Western Sample Buffer до концентрации суммарного белка 4 мг/мл (способ Lowry, ссылка 8). 10 мкл (приблизительно 40 мкг суммарного белка) наносили на 12% акриламидный/Nа-ДДС гель и разделяли (система Mini Trans-Blot, BioRad Laboratories). Иммуноблоттинг проводили в соответствии с инструкциями BioRad (мембрана SchleicherSchull, 0,2 мкм) с применением антисыворотки кролика против Sh-ble (Societe Cayla, Tolouse FR, Catalog ANTI-0010) в качестве первичного антитела. Результаты показаны на фиг. 1 и в табл. Е. Таблица Е Выявленные уровни продукции Sh-blе в С 1Chrysosporium; 2) гетерологичная сигнальная последовательность pUT720 является функциональной в Chrysosporium; 3) Сhrysosporium может быть применен в качестве хозяина для секреции гетерологичных бактериальных белков.(2). Секреция С 1 лизоцима человека (HLZ). Штаммы C1 NG7C-19 и UV18-25 трансформировали плазмидой pUT970G (ссылка 9). Данный вектор представляет следующую экспрессионную кассету грибов: промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gpdA) Aspergillus nidulans (ссылка 2); синтетическая сигнальная последовательность целлобиогидролазы I (cbhl) Trichoderma reesei (ссылки 1,3); ген Sh-blе устойчивости к флеомицину Streptoalloteichus hindustanus, примененный в качестве белка-носителя (ссылка 10); шарнирный домен глюкоамилазы (glaA2) Aspergillus niger, клонированный из плазмиды pAN56-2(ссылки 11,12); линкерный пептид (LGERK), сходный с КЕХ 2-подобным сайтом расщепления протеазой (ссылка 1); синтетический ген лизоцима человека (hlz) (ссылка 10); терминатор триптофансинтазы (trpC) Aspergillus nidulans (ссылка 5). Вектор также несет ген бета-лактамазы (blа) и старт репликации Е. coli из плазмиды pUC18 (6). Подробная карта плазмиды представлена на фиг. 3. Протопласты С 1 трансформировали плазмидой pUT970G, следуя процедуре, уже описанной в примере 1. Гибридный белок (Sh-blешарнир GAMHLZ) является функциональным в отношении устойчивости к флеомицину, что тем самым обеспечивает легкую селекцию трансформантов С 1. Более того, степень устойчивости к флеомицину приблизительно коррелирует с уровнем экспрессии hlz. Образование HLZ трансформантами С 1 (устойчивыми к флеомицину клонами) анализировали с помощью теста на активность лизоцима следующим образом. Первичные трансформанты переносили на чашки с GS+флеомицин (5 мкг/мл) (подтверждение устойчивости), а также на чашки LYSO (определение- 27006873 активности HLZ визуализацией просветления зон (ссылки 1, 10. Чашки выращивали в течение 5 дней при 32 С. Каждый подтвержденный клон субклонировали на чашках LYSO. Для получения спор для инициирования жидкой культуры применяли по два субклона на трансформант для инокуляции чашекPDA. Жидкие культуры в IC1 выращивали 5 дней при 27 С (встряхивание при 180 об./мин). После этого культуры центрифугировали (5000g, 10 мин). В полученных образцах измеряли активность лизоцима согласно Morsky et al. (ссылка 13). Таблица F Уровни образования активного HLZ в С 1 Данные результаты показывают, что 1) пункты 1 и 2 примера 1 подтверждаются; 2) Sh-blе является функциональным в Chrysosporium в качестве маркера селекции; 3) Sh-blе является функциональным в Chrysosporium в качестве белка-носителя; 4) КЕХ 2-подобный сайт расщепления протеазой является функциональным в Chrysosporium (в противном случае HLZ не был бы активным); 5) Chrysosporium может быть применен в качестве хозяина для секреции гетерологичных белков млекопитающих.(3). Секреция С 1 ксиланазы II (XYN2) Trichoderma reesei. Штамм C1 UV18-25 трансформировали плазмидами pUT1064 и pUT1065. Плазмида pUT1064 представляет две следующие экспрессионные кассеты грибов. Первая кассета обеспечивает селекцию устойчивых к флеомицину трансформантов: промотор гена 1 контроля перекрестного пути (срс-1) Neurospora crassa (ссылка 14); ген Sh-blе устойчивости к флеомицину Streptoalloteichus hindustanus (ссылка 4); терминатор триптофансинтазы (trpC) Aspergillus nidulans (ссылка 5). Вторая кассета является кассетой образования ксиланазы: промотор cbh1 штамма TR2 Т. reesei (ссылка 15); ген хуn2 (включая ее сигнальную последовательность) штамма TR2 Т. reesei (ссылка 16); терминатор cbh1 штамма TR2 Т. reesei (ссылка 15). Вектор также несет старт репликации Е. coli из плазмиды pUC19 (ссылка 6). Подробная карта плазмиды представлена на фиг. 4.pUT1065 представляет следующую экспрессионную кассету грибов: промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gpdA) Aspergillus nidulans (ссылка 2); синтетическая сигнальная последовательность целлобиогидролазы I (cbh1) Trichoderma reesei(ссылки 1,3); ген Sh-ble устойчивости к флеомицину Streptoalloteichus hindustanus, примененный в качестве белка-носителя (ссылка 10); линкерный пептид (SGERK), сходный с КЕХ 2-подобным сайтом расщепления протеазой (ссылка 1); ген хуn2 (без сигнальной последовательности) штамма TR2 Т. reesei (ссылка 16); терминатор триптофансинтазы (trpC) Aspergillus nidulans (ссылка 5). Вектор также несет ген бета-лактамазы (blа) и старт репликации Е. coli из плазмиды pUC18 (ссылка 6). Подробная карта плазмиды представлена на фиг. 5. Протопласты С 1 трансформировали плазмидой pUT1064 или pUT1065, следуя процедуре, уже описанной в примере 1. Гибридный белок (Sh-bleXYN2) в плазмиде pUT1065 является функциональным в отношении устойчивости к флеомицину, что тем самым обеспечивает легкую селекцию трансформантов С 1. Более того, степень устойчивости к флеомицину приблизительно коррелирует с уровнем экспрессииxyn2. В pUT1064 хуn2 клонировали со своей собственной сигнальной последовательностью. Образование ксиланазы трансформантами С 1 (устойчивыми к флеомицину клонами) анализировали с помощью теста на активность ксиланазы следующим образом. Первичные трансформанты переносили- 28006873 на чашки с GS+флеомицин (5 мкг/мл) (подтверждение устойчивости), а также на чашки XYLAN (ссылка 17), на которых активность ксиланазы определяют посредством наблюдения просветления зон. Чашки выращивали в течение 5 дней при 32 С. Каждый подтвержденный клон субклонировали на чашкахXYLAN. Для получения спор для инокуляции жидкой культуры применяли по два субклона на трансформант для инокуляции чашек PDA. Жидкие культуры в IC1 + 5 г/л К+ фталат выращивали 5 дней при 27 С (встряхивание при 180 об./мин). После этого культуры центрифугировали (5000g, 10 мин). В полученных образцах измеряли активность ксиланазы с помощью метода DNS согласно Miller et al. (ссылка 18). Таблица G Уровни образования активной XYN2 в С 1 (лучшими продуцентами) Данные результаты показывают, что 1) пункты с 1 по 4 примера 2 подтверждаются; 2) С 1 может быть применен в качестве хозяина для секреции гетерологичных белков грибов.(4). Заключение. В табл. Н показаны результаты для плазмид, с помощью которых проводили трансформацию UV1825. Таблица показывает уровни экспрессии эндоглюканазы и целлобиогидролазы с применением гетерологичных регулирующих экспрессию последовательностей и сигнальных последовательностей, а также с применением гомологичных регулирующих экспрессию последовательностей и сигнальных последовательностей. Особенности различных плазмид можно найти в других частях описания, а также на фигурах. Образование происходит при щелочном рН при температуре 35 С. Таблица Н Данные по экспрессии трансформированным штаммом UV18-25(% относительно исходного штамма UV18-25)- 29006873 Условия культивирования (встряхиваемые бутыли): 88 ч, 35 С, 230 об./мин. Е. Конструирование генной библиотеки Asperqillus sojae.(1). Векторная библиотека. Геномную ДНК A. sojae выделяли из протопластов, полученных из АТСС 11906, с помощью ранее описанного протокола (Punt, van den Hondel, Methods Enzymol. 1992 216:447-457). После изолирования ДНК экстрагировали из протопластов с применением протокола, описанного Kolar et al., Gene 1988 62:127-34. После этого ДНК частично расщепляли с помощью MboI для получения фрагментов ДНК со средним размером 30-50 т.п.н. Вектор pAOpyrGcosarp1, который применяли для создания генной библиотеки, был сконструирован лигированием BamHI-HindII-фрагмента размером 3 т.п.н. из pANsCos1 (Osiewacz, Curr Genet. 1994,26:87-90) и Асс 65I-НindIII-фрагмента размером 3,2 т.п.н. из рАO4.2 (De Ruiter-Jacobs et al., Curr. Genet. 1989 16:159-63) в Асс 65I-ВаmНI-расщепленную pHELP1 (Gerns et al., Gene 1991 98:61-67). Космидный вектор несет маркер селекции pyrG A. oryzae и самореплицируется в гифомицетах. Расщепленную с помощью MboI геномную ДНК лигировали с BamHI-расщепленным pAOpyrGcosarp1, и смесь лигирования упаковывали в фаговые частицы с помощью векторного набора StratageneSupercos1 (Stratagene Inc., La Jolla CA). Это дало в общей сложности приблизительно 30000 индивидуальных клонов, обеспечивающих приблизительно 30-кратное представительство генома A. sojae. Запас (в 15% глицерине) пулов полученных клонов хранили при -80 С для последующего использования.(2). Высокочастотная трансформация. В качестве устойчивого к фтороротовой кислоте производного АТСС 11906 был выбран мутант A.sojae ATCC 11906pyrG, как описано в заявке WO 01/09352. Данный штамм, А. sojae АТСС 11906pyrG,трансформировали двумя векторами, несущими ген pyrG A. niger. Один вектор, рАВ 4-1 (Van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206:71-75 (1987, несет лишь ген pyrG, тогда как pAB4-arp1 (Verdoes et al.,Gene 146:159-165 (1994 несет ген pyrG и последовательность АМА 1 A. nidulans. Трансформация АТСС 11906pyrG дала 5-10 трансформантов на микрограмм ДНК из рАВ 4-1, тогда как частота с pAB4-arp1 была по меньшей мере в 10-100 раз выше. Фенотипический анализ трансформантов показал, что фенотипpyrG трансформантов pAB4-arp1 поддерживается лишь при постоянной селекции, тогда как трансформанты рАВ 4-1 были стабильными при наличии или в отсутствие селекции на фенотип pyrG. Данные результаты подтверждают автономную репликацию введенной плазмидной ДНК в трансформантах pAB4arp1. Сходные результаты были получены с другими векторами трансформации грибов, несущими последовательность АМА 1 или ее производные, например с pAOpyrGcosarp1.(3). Конструирование трансформантной библиотеки грибов. А. sojae АТСС 11906pyrG или родственные мутанты, в частности его мутанты с компактной морфологией, трансформировали генной библиотекой А. sojae, основанной на векторе трансформацииpAOpyrGcosarp1. Данный вектор ведет к высокой частоте трансформантов с легко реплицируемыми копиями вектора. Протопласты грибов обрабатывали, как описано в работе Punt и van den Hondel, MethodsEnzymol. 1992 216:447-457, ДНК из космидной библиотеки, несущей клоны геномной ДНК грибов из А.sojae или Chrysosporium, и последовательные разведения трансформированных протопластов помещали на селективные чашки агара для определения полученной частоты трансформаций. Оставшиеся протопласты восстанавливали в селективной среде в течение нескольких часов и хранили при 4 С. На основании результатов, полученных для частоты трансформаций (которая в зависимости от эксперимента может достигать нескольких тысяч трансформантов на микрограмм ДНК космидной библиотеки), предельные разведения восстановленных протопластов наносили на планшеты для микротитрования 96,248 или планшеты с другим форматом лунок, что давало один трансформированный протопласт на лунку. Планшеты инкубировали при 35 С до образования биомассы гриба. Полученную библиотеку трансформантов применяли в дальнейших экспериментах. Сходную стратегию применяли для конструирования набора трансформантов грибов, несущих мутантные аллели Chrysosporium СВН 1. Данная стратегия может быть также использована с библиотекой мутантов, полученных для любого интересующего гена, созданных с помощью подходов с применением мутагенеза, перетасовки генов или генной эволюции.F. Индукция споруляции при ферментации погруженной культуры. Многие грибы, такие как Aspergillus sojae, не проявляют споруляции при погруженной ферментации. Здесь заявители описывают ранее неизвестный подход к получению споруляции при данных условиях. А. sojae АТСС 11906, и, в частности, его мутанты с компактной морфологией роста выращивали в синтетической ростовой среде с добавкой дрожжевого экстракта. При данных условиях происходит быстрое накопление биомассы как в покоящихся, так и во встряхиваемых культурах. Однако в культуральной жидкости споруляция не происходит. Сходная ростовая среда с добавлением 0,6 г/кг ЭДТА дает значительный выход спор, достигающий 109 спор на мл культуральной жидкости после инкубации в течение 2-4 дней при 35 С.