Регуляторные и вспомогательные пептиды вич, антигены, вакцинные композиции, набор для иммуноанализа и способ обнаружения антител, индуцируемых вич

006210 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение касается новых пептидов на основе консервативных участков регуляторных и вспомогательных белков ВИЧ, антигенов в свободной или связанной с носителем форме, включающих по меньшей мере один из этих пептидов, вакцинных композиций, содержащих по меньшей мере один из этих антигенов, наборов для иммуноанализа и способа обнаружения антител, индуцируемых вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) или ВИЧ-специфичными пептидами, с помощью таких антигенов. Уровень техники Вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), являющийся возбудителем синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), продолжает представлять трудноразрешимую проблему для здравоохранения в развивающихся странах. В Западном мире терапевтические подходы, нацеленные на процессы репликации и созревания ВИЧ, оказали большое влияние на развитие болезни. Однако высокая стоимость данного лечения, высокая токсичность лекарств и отсутствие излечения означают, что разработка безопасных и эффективных вакцин остается первостепенной задачей для контроля за пандемией СПИД. ВИЧ-1 - это сложный ретровирус, кодирующий шесть регуляторных и вспомогательных генов, отсутствующих у простых ретровирусов, а именно tat, rev, nef, vif, vpr и vpu (табл. 1). В клетках эукариотов только полностью сплайсированные мРНК экспортируются в цитоплазму для трансляции. Несплайсированные или частично сплайсированные РНК остаются и затем подвергаются деградации в ядре. Таким образом, кодируемые генами tat, rev и nef белки (обозначаемые как Tat, Rev и Nef), образующиеся при множественном сплайсинге РНК, экспрессируются первыми и относятся к ранним генам при экспрессии ВИЧ-1. Для экспрессии однократно сплайсированных РНК, а также для транспортировки полного несплайсированного генома, состоящего из РНК, в цитоплазму для упаковки у ВИЧ-1 развились механизмы для преодоления ограничений на транспорт РНК. Регуляторные белки Tat и Rev необходимы для репликации ВИЧ-1, так как мутации в этих белках устраняют образование ВИЧ-1 (Dayton A.I. et al. (1986)Cell, 44: 941-947, и Fisher A.G. et al. (1986) Nature, 320: 367-371). Вспомогательные гены происходят из экзонов, находящихся всецело перед геном оболочки ВИЧ-1,к примеру, vif, или экзонов, находящихся либо впереди от, либо внутри гена env, но в других рамках считывания, например tat, rev. Эффективность сплайсинга частично регулирует уровень экспрессии генов различных вспомогательных белков. После интеграции провирусной ДНК ВИЧ-1 синтезируются преимущественно укороченные формы мРНК клеточной РНК-полимеразой II, которая взаимодействует с сайтами на длинном 5'-концевом повторе (LTR) провирусной ДНК. Одним из первых экспрессируется ген tat, который несет сигнал ядерной локализации. Он является сильным активатором транскрипции, усиливающим LTR-направляемую транскрипцию почти в 1000 раз. Непрерывная экспрессия Tat обеспечивает положительную обратную связь для продолжения генной экспрессии на высоком уровне. В отличие от обычных активаторов транскрипции, взаимодействующих с последовательностями ДНК, Tat непосредственно связывается с 5'концами всех РНК ВИЧ-1 на специфической вторичной структуре типа петли - TAR (элемент трансактивации реакции). Структура петли сильно консервативна и необходима для функционирования Tat. Структура взаимодействия Tat/TAR была проанализирована с помощью ядерного магнитного резонанса(ЯМР) (Puglisi et al. (1992) Science, 257: 76-80). Tat связывается с TAR вместе с клеточным белком, циклином Т, который, в свою очередь, связывает CDK9, фосфорилирующий С-концевой домен РНКполимеразы II, что стимулирует удлинение РНК-транскриптов. Эти клеточные кофакторы Tat имеются только в активированных клетках, а их отсутствие подавляет транскрипцию провирусной ДНК, приводя к "квазилатентности" в Т-лимфоцитах. Tat экспрессируется из двух экзонов, причем сигнал ядерной локализации и участок связывания TAR находятся в первом экзоне. Tat секретируется из инфицированных клеток и может оказывать гетерологические эффекты на соседние клетки. Они включают клеточную активацию (Hofman et al. (1993) Blood, 82: 2774-2780), индукцию клеточного апоптоза (Macho et al. (1999)Oncogene, 18: 7543-7551, 1999), функционирование в качестве секретируемых факторов роста (Trinh D.P.et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun., 256: 299-306) и модуляцию синтеза белка в клетках хозяина в пользу синтеза вирусных белков (Xiao et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun., 244: 384-389,1998). Таким образом, направленные на Tat терапевтические подходы будут иметь сильное влияние на инфекцию ВИЧ-1. Небольшие многократно сплайсированные мРНК, кодирующие Tat, Rev и Nef, преобладают во время ранней фазы после инфекции. После того как вырабатывается пороговый уровень Rev, несплайсированные и однократно сплайсированные РНК накапливаются в цитоплазме для трансляции, давая начало продуктивной инфекции. Неспособность выработки порогового уровня Rev может вносить вклад в квазилатентное состояние ВИЧ. Rev может связываться только с РНК, несущими особую структуру RRE(реагирующий на Rev элемент), которая находится в кодирующей env области генома. Rev взаимодействует с RRE в виде мультимера через богатый аргинином основный участок, находящийся в аминоконцевой половине белка. В результате этого взаимодействия происходит транспортировка частично сплайсированных РНК, что дает такие генные продукты, как Env, Vif, Vpu и Vpr, а также несплайсированных РНК, которые будут вводиться в качестве новых геномов при сборке частиц. Структурный анализ взаи-1 006210 модействия Rev/RRE также проводился методом ЯМР (Battiste et al. (1996) Science, 273: 1547-1551, 1996).Rev несет богатый лейцином сигнал экспорта, позволяющий ему мигрировать между ядром и цитоплазмой для непрерывной транспортировки новосинтезированных РНК (Kalland et al. (1994). J. Virol., 68: 1475-1485; MeyerMalim, (1994) Genes Dev., 8: 1538-1547). Именно таким образом Rev обеспечивает то,что структурные гены экспрессируются после регуляторных генов. Терапевтические подходы, направленные против Rev, приведут к прерыванию жизненного цикла вируса на ранней стадии инфекции. Хотя исходно Nef был описан как отрицательный фактор, позже было показано, что он оказывает положительное влияние на вирусную репликацию и экспрессируется в больших количествах, чем Tat иRev, как на ранней стадии, так и позже в процессе инфекции. Nef подвергается миристилированию на Nконце и связывается с внутренней стороной плазматической мембраны. Nef частично принимает участие в подавлении поверхностного CD4 и в его деградации путем эндоцитоза (Piguet et al. (1998) EMBO J., 17: 2472-2481). Удаление CD4 из поверхности клетки препятствует суперинфицированию другими штаммами ВИЧ-1 или повторному инфицированию выделяющимся вирусом. Nef также подавляет MHC-I, тем самым защищая инфицированные клетки от разрушения цитотоксическими Т-лимфоцитами (Le Gall etal. (1997). Res. ViroL, 148: 43-47). Nef не является обязательным вирусным белком, так как он не требуется для инфекции лимфоцитов периферической крови или Т-клеточных линий in vitro. Мутанты с делециейNef, однако, менее патогенны за длительные периоды времени. Nef также оказывает комплексное влияние на пути передачи сигналов в клетке и содержит богатый пролином участок, который может взаимодействовать с доменом SH3 киназ, участвующих в активации Т-клеток, что необходимо для эффективной репликации ВИЧ (Moarefi et al. (1997) Nature, 385: 650-653). Содержащие Nef вирусы способны синтезировать большее количество вирусной ДНК по сравнению с вирусами с делецией гена Nef, что означает прямое или непрямое участие Nef в активации обратной транскриптазы вируса. Низкое содержание Nef,связанного с вирионами, может объяснить такой феномен. Из инфицированных клеток также выделяется небольшое количество Nef, хотя его действие на соседние клетки неясно. Поскольку Nef экспрессируется на ранней стадии инфекции и оказывает значительное влияние на экспрессию CD4 и MHC-I, а также на течение болезни, он является важной мишенью для будущих терапевтических подходов.Tat и Nef секретируются и могут захватываться макрофагами и экспрессироваться вместе с молекулами MHC-II. Это улучшает их пригодность в качестве мишеней для подходов, основанных на пептидах,которые также могут экспрессироваться вместе с молекулами MHC-II. Ясно, что следует отдать приоритет подходам, направленным на продукты ранних генов, необходимых для репликации ВИЧ-1, таких какTat и Rev, наряду с Nef, который также экспрессируется на ранней стадии и влияет на течение болезни. Таблица 1 Регуляторные и вспомогательные белки ВИЧ-1 Ген Белок Название Экспрессия Локализация Функции Активирует вирусную транскрипцию; секретируется из инфицироТрансактиватор виванных клеток, при этом он может руснойTat Ранняя Ядро активировать Т-клетки, индуциротранскрипции вать апоптоз и функционировать в качестве фактора роста Ядерный фактор Ядрышко, нуклео- Регулирует сплайсинг/транспорт РНКRev Ранняя экспорта РНК плазма, цитоплазма в цитоплазму; челночный белок Запускает эндоцитоз CD4; подавляет Большое число эфЦитоплазма, связан экспрессию MHC-I; связывается с киnefNef фекторных Ранняя с мембраной; назами и может влиять на сигнальную функций вирионы систему Т-клеток и их активацию Запускает внутриклеточную деграЦитоплазма, связан дацию CD4, подавляет MHC-I, неvpuVpu Вирусный белок u Поздняя специфически стимулирует выдес мембраной ление ретровирусных частиц Усиливает инфекционность вирусных Фактор инфекционЦитоплазма, мем- частиц зависимым от клетки образом;Vif Поздняя браны; вирионы усиливает синтез вирусной ДНК во ности вируса время обратной транскрипции Способствует импорту в ядро преГлавным образом,интеграционного комплекса; остаvprVpr Вирусный белок r Поздняя ядро; навливает клетки на фазе G2/M вирионы клеточного цикла Природные последовательности ВИЧ в вакцинах-кандидатах неспособны стимулировать стабильный долговременный иммунный ответ вследствие присущей вирусу ВИЧ способности к маскировке пу-2 006210 тем изменения эпитопов, презентируемых иммунной системе. Для преодоления такой вариабельной презентации эпитопов определенные замены и комбинации аминокислот должны оказать содействие иммунной системе в презентации и распознавании этих чужеродных вирусных антигенов надежным образом и, следовательно, в большей степени. Основываясь на этих предпосылках, мы решили исследовать возможность разработки новых синтетических пептидов, способных имитировать эпитопы регуляторных и вспомогательных белков ВИЧ таким образом, чтобы они стали доступными как для гуморальной, так и для клеточной ветвей иммунной системы, и удовлетворить потребность в эффективной терапевтической и/или профилактической вакцине. Первоначальная работа основывалась на аминокислотных последовательностях нативных Tat, опубликованных Korber В. et al. in Human Retroviruses and AIDS 1997 Eds. Theoretical Biology and BiophysicsGroup, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. Первый эпитоп Tat находится между аминокислотами 1 и 24 белка tat. Таблица 2 Эпитоп Tat Однобуквенные и трехбуквенные обозначения аминокислот в последовательностях, приведенных в настоящем описании, соответствуют международным стандартам, изложенным в учебниках, напримерLehninger A.L., "Principles of Biochemistry", Worth Publishers Inc., New York, 1982. Аминокислоты, приведенные справа от левой колонки, представляют естественные варианты последовательности. Наш анализ привел к последовательности, содержащей следующий модифицированный эпитоп: где Nl означает 2-аминогексановую кислоту (норлейцин, сокращенно Nle и Nl в трехбуквенном и однобуквенном коде соответственно), а цистеиновый остаток находится в окисленной форме, то есть образует дисульфидный мостик. Поскольку остаток цистеина в С-концевой части (в положении 22) пептида входит в состав внутримолекулярной дисульфидной связи за пределами данного эпитопа, то подобная внутрипептидная дисульфидная связь образуется введением цистеина в N-концевую часть данного эпитопа.-3 006210 Альтернативный подход заключается в образовании межмолекулярной дисульфидной связи путем димеризации последовательностей Другой альтернативный способ состоит в димеризации с другим эпитопом, выбранным из Tat. Второй эпитоп Tat находится между аминокислотами 35 и 57 в направлении к С-концу и отделен от первого эпитопа 10 аминокислотами, содержащими 5 остатков Cys в дополнение к остатку Cys в каждом из эпитопов. Относительно высокое число остатков Cys позволяет осуществить целый ряд внутри- и межмолекулярных перекрестных сшивок. Вероятно, такой богатый цистеином домен будет доминировать при иммунологической презентации данного белка и вследствие этого будет "маскировать" два существенных эпитопа. Отбор и модификация двух соседних эпитопов могут способствовать презентации существенной части белка Tat более оптимальным образом. Для того чтобы уменьшить вероятность появления мутантов, избегающих узнавания, число эпитопов еще больше увеличили и выбрали две дополнительные пептидные последовательности. Эти последовательности локализуются в Rev (остатки 58-85) и Nef (остатки 65-85). Нативные последовательности были опубликованы в Human Retroviruses and AIDS 1999: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and-5 006210 Было синтезировано несколько модифицированных пептидов для того, чтобы определить уникальность последовательностей, их способность стимулировать иммунную систему, а также их специфичность и чувствительность в качестве антигенов ВИЧ-1. Раскрытие изобретения Пептиды по изобретению происходят из четырех различных консервативных участков белков ВИЧ-1Tat, Rev и Nef, описанных выше, которые обладают свойством сохранения уникальности (иммуногенности, чувствительности и специфичности) эпитопов ВИЧ-1. Кроме того, новые пептиды по изобретению не обладают заметным антагонистическим эффектом по отношению к цитотоксическим Т-лимфоцитам(CTL) и должны иметь по меньшей мере один потенциальный эпитоп CTL. Пептиды по настоящему изобретению, удовлетворяющие указанным выше критериям, выбирают из следующих групп:Xaa21 Хаа 22 Хаа 23 Хаа 24 (SEQ ID No. 1),где аминокислоты цепи могут иметь следующие значения: Хаа в положении 1 модифицированного пептида - Met, Ser, Cys или отсутствует,Хаа в положении 2 - Glu, Asp, Val, Ser или отсутствует,Хаа в положении 3 - Ser, Gln, Pro, Leu, Val, Ala, Trp, Туr или Phe,Хаа в положении 4 - Val или Ilе,Хаа в положении 5- Asp, Asn или Ilе,Хаа в положении 6 - Pro, His или Ala,Хаа в положении 7 - Arg, Asn, Ser, Lys, Glu или Asp,Хаа в положении 12 - Leu, Ile или Nle,Хаа в положении 15- Gly или Pro,Хаа в положении 16 - Ser, Asn или Ala,Хаа в положении 17 - Gln, Lys или Thr,Хаа в положении 18- Pro или His,Хаа в положении 19 - Lys, Thr, Ser, Ala, Arg, Pro, Glu, Leu, Ile или Nle,Хаа в положении 20 - Thr, Ala или Ilе,Хаа в положении 21 - Ala, Pro, Asp или Val,Хаа в положении 22 - Cys или Ser,Хаа в положении 23 - Thr, Asn или Ser,Хаа в положении 24 - Asn, Lys, Arg, Gln, Ala, Pro или Thr,причем пептид содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот из последовательности SEQ ID No. 1,кроме того, два или более остатков Cys могут образовывать внутрицепочечную или межцепочечную дисульфидную связь либо мостик -S-(CH2)p-S- или -(СН 2)р-, где р=1-8, необязательно с одним или более гетероатомами типа О, N или S между ними;Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Хаа 23 (SEQ ID No. 4),где аминокислоты цепи имеют следующие значения: Хаа в положении 1 - Pro, Ile, Leu, Thr, Туr или Val,Хаа в положении 2 - Val, Ala, Cys, Leu,Хаа в положении 3 - Cys, Ile, Leu, Val или Nle,Хаа в положении 5 - Ilе, Leu, Gln, Met или Thr,Хаа в положении 6 - Thr, Asn, Lys или Arg,Хаа в положении 7 - Lys, Arg или Gln,Хаа в положении 8 - Gly или Ala,Хаа в положении 9 - Leu или Ilе,Хаа в положении 10 - Gly, Ser или Ala,Хаа в положении 11 - Ilе или Gly,Хаа в положении 12 - Ser, Phe или Туr,Хааi, вставленный перед положением 14, - это Leu, Ile, Nle,Хаа в положении 15 - Arg, Lys, Ser или цитруллин (Cit),Хаа в положении 19 - Arg, Lys, Ser, Gly или Cit,Хаа в положении 20 - Gln, Arg или Pro,Хаа в положении 21 - Ilе или Leu,Хаа в положении 22 - Gly, Leu, Ile, Cys или отсутствует,Хаа в положении 23 - Gly или отсутствует,причем последовательность содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот изSEQ ID No. 4, а -Z- означает необязательный линкер, которым может быть PEG, модифицированныйPEG и/или [Gly]n, где n=1, 2 или 3,-6 006210 кроме того, два или более остатков Cys могут образовывать внутрицепочечную или межцепочечную дисульфидную связь либо мостик -S-(CH2)p-S- или -(СН 2)р-, где р=1-8, необязательно с одним или более гетероатомами типа О, N или S между ними;Xaa18 Xaa19 Leu Pro Pro Leu (SEQ ID No: 7),где Хаа в положении 1 - это Phe, Туr, Тrр или Arg,Хаа в положении 4 - Gly, Ser, Asn, Asp, Cys, Val, Thr, Ala или Arg,Хаа в положении 5 - Thr, Ala, Asp, Asn или Ser,Хаа в положении 6 - Туr, Cys, Phe, Arg, His, Ser, Val или Leu,Хаа в положении 10 - Ser, Pro, Phe, Leu или Ilе,Хаа в положении 11 - Ala, Thr, Glu, Gln, Val, Pro или Ser,Хаа в положении 12 - Glu, Lys, Gln, Asp, Asn, Туr, Тrр или Phe,Хааi, вставленный после положения 13, - это Ser, Pro, Phe, Leu или Ilе,Хааi, вставленный перед положением 14, - это Ala, Thr, Glu, Gln, Val, Pro или Ser,Хаа в положении 14 - Glu, Lys, Gln, Asp или Asn,Хаа в положении 15 - Pro, Ser, Ala или Asn,Хаа в положении 16 - Val, Asn, Gly или Pro,Хаа в положении 17 - Pro, Gln, His, Ser, Leu, Arg, Thr, Asp или Ilе,Хаа в положении 18 - Leu, Phe или Val,Хаа в положении 19 - Gln, Leu, Pro, His, Asp или Glu,причем последовательность содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот изSEQ ID No. 7, а -Z- означает необязательный линкер, которым может быть PEG, модифицированныйXaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 (SEQ ID No: 10),где Хаа в положении 1 - это Lys или Arg,Хаа в положении 5 - Phe или Leu,Хаа в положении 7 - Ilе или Val,Хаа в положении 8 - Thr, Arg, Lys, Ala или Met,Хаа в положении 10 - Gln или His,Хаа в положении 11 -Val, Leu или Ilе,Хааi, вставленный перед положением 13, - это Leu,Хаа в положении 13 - Leu, Val или Thr,Хаа в положении 14 - Arg или цитрулин (Cit),Хаа в положении 16 - Met, Val, Ile или Nle, Leu,Хаа в положении 17 - Thr или Asn,Хаа в положении 18 - Туr, Phe или Arg,Хаа в положении 19 - Lys или Arg,Хаа в положении 20 - Ala, Gly, Ser, Glu или Gln,Хаа в положении 21 - Ala, Ser или Val,причем последовательность содержит по меньшей мере шесть последовательных аминокислот изSEQ ID No. 10, a -Z- означает необязательный линкер, которым может быть PEG, модифицированныйPEG и/или [Gly]n, где n=1, 2 или 3 и, независимо от n, m в [Arg]m=0, 1, 2 или 3,терминальные концы последовательностей могут быть представлены свободными карбоксильными или аминогруппами, амидами, ацилами, ацетилами или их солями, и/или указанные пептидные последовательности иммобилизованы на твердой основе. Новые пептидные последовательности способны служить хорошими антигенами, причем такой антиген содержит по меньшей мере один пептид, выбранный из числа последовательностей SEQ ID No. 1,SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7 или SEQ ID No. 10. Антигенность можно адаптировать, подбирая соотношения или концентрации различных пептидов или размера пептидов путем, например, димеризации или полимеризации и/или иммобилизации на твердой фазе. Антиген включает две или несколько полипептидных последовательностей по изобретению, которые могут быть связаны через мостик, к примеру дисульфидный мостик между остатками Cys этих цепей или мостик типа алкиленов C1-C8, возможно, с одним или несколькими гетероатомами О, S или N между ними, но предпочтительно они не связаны. Цепи могут быть иммобилизованы на твердой фазе в мономерной, димерной или олигомерной форме. На концах могут быть добавлены дополнительные аминокислоты, чтобы получить "ножку" для лучшей иммобилизации. ПЭГ - это полиэтиленгликоль НО(СН 2 СН 2O)аН, который может входить в состав линкера -Z-, причем ПЭГ необязательно модифицирован дикарбоновой кислотой в виде НО(СН 2 СН 2O)аСО(СН 2)bСООН или терминальной карбоксильной группой в виде HO(CH2CH2O)a-1CH2COOH, где а=1-10 и b=2-6, перед присоединением линкера.-7 006210 Линкер -Z- может состоять из ПЭГ, модифицированного ПЭГ или их комбинации и/или в сочетании с одним или несколькими остатками Gly. Альтернативно, линкер -Z- может состоять из глицинового мостика [Gly]n, где n=1, 2 или 3. Все аминокислоты в пептидах изобретения могут находиться в виде D- или L-форм, хотя предпочтительна природная L-форма. С- и N-терминальные концы пептидных последовательностей могут отклоняться от природных последовательностей модификацией терминальной NH2-группы и/или СООН-группы, например они могут быть ацилированы, ацетилированы, амидированы или модифицированы с целью получения сайта связывания для носителя или другой молекулы. Пептиды по изобретению состоят из 6-50 аминокислот, предпочтительно от 10 до 30 аминокислот. Они охватывают все естественные вариации аминокислот в идентифицированных положениях. Полипептидный антиген согласно изобретению может быть как в свободной, так и в связанной с носителем форме. Носитель или твердую фазу, с которой пептид необязательно связан, можно выбирать из широкого круга известных носителей. Его следует выбирать с учетом намеченного применения иммобилизованного полипептида в качестве диагностического антигена или иммунизирующего компонента вакцины. Примеры носителей, которые могут применяться, к примеру, в диагностических целях, - это магнитные бусины или латекс из сополимеров типа стирендивинилбензол, гидроксилированный стирендивинилбензол, полистирен, карбоксилированный полистирен, бусины из технического углерода, неактивированного или активированного полистиреном или поливинилхлоридом стекла, эпоксиактивированного пористого магнитного стекла, частицы из желатина или полисахаридов либо белковые частицы, эритроциты, моно- или поликлональные антитела или fab-фрагменты таких антител. Согласно следующему воплощению настоящего изобретения антигены могут входить в состав вакцины, возможно, в сочетании с носителями, адъювантами или в комбинации с другими иммуностимулирующими элементами, такими как оспенный вирус канарейки, несущий ген env. Примерами носителей и/или адъювантов для вакцин служат и такие белки, как бычий или человеческий сывороточный альбумин, гемоцианин и жирные кислоты моллюска Fissurella. Иммуностимулирующие вещества можно подразделить на три группы: адьюванты, носители для антигенов и наполнители. Примеры адъювантов включают гидроксид алюминия, соли алюминия, сапонин,мурамиловые ди- и трипептиды, монофосфорилированный липид А, пальмитиновая кислота, В. pertussis и различные цитокины, включая цитокин IL-12 и IL-1 класса Тh1. Для переноса белков через клеточные мембраны в цитозоль может служить целый ряд белковых токсинов, которые полезны при разработке вакцин CTL. Носители включают бактериальные токсоиды, такие как инактивированные столбнячный и холерный токсины, генетически детоксифицированные бактериальные токсины, такие как термолабильный энтеротоксин из Е. соli, жирные кислоты, живые векторы типа химерного полиовируса, и гибридные белки, образующие частицы, например гибридные частицы TY и HBcAg с ретротранспозоном дрожжей. Часто применяемые наполнители в современных вакцинах состоят из эмульсии минерального масла,полного и неполного адъюванта Фрейнда, эмульсий растительных масел, неионных поверхностноактивных блоксополимеров, сквалена или сквалана, липопептидов, липосом и биодеградируемых микросфер. Два новых адъюванта, обладающиx значительным потенциалом для разработки новых вакцин, это микроэмульсия масло-в-воде MF59 и полимерные микрочастицы. Можно использовать любые вещества, усиливающие иммуногенность антигена, и в Фармакопее США и Европейской Фармакопее приведены еще несколько других альтернативных носителей или адъювантов. В состав композиции антигена для применения в качестве иммуностимулятора также могут входить интерфероны типа -INF, антивирусные хемокины или гемопоэтические факторы роста, такие как фактор роста гранулоцитов/макрофагов. Другой подход для усиления стимуляции и всасывания, к примеру, в кишечнике, состоит во введении пептидов изобретения вместе с небольшими пептидами, такими как ди-, три- или тетрапептиды. Эти пептиды можно вводить в дополнение к пептидам изобретения или в комбинации с ними. Предпочтительно пептиды вводят вместе с трипептидом YGG, состоящим из аминокислот в D- или L-форме, предпочтительно в D-форме. Последние подходы к непарентеральному введению вакцин, к примеру, через слизистую оболочку включают технологию слияния генов для создания нетоксичных производных мукозных адъювантов,генетическую инактивацию антигенов путем делеции в основном гене, коэкспрессию антигена и специфического цитокина, играющего важную роль в модуляции и контроле иммунного ответа в слизистой оболочке, и получение самого генетического материала, позволяющего захват ДНК или РНК и эндогенную экспрессию их в клетках хозяина. Один из подходов к получению продолжительных ответов, когда требуется клеточный иммунитет,заключается в вакцинации при помощи плазмидной ДНК, кодирующей один или несколько специфических антигенов. Для защиты от ВИЧ-инфекции вакцина должна индуцировать и мукозный, и системный иммунный ответ и может вводиться любым общепринятым способом, парентерально или непарентерально, напри-8 006210 мер подкожно, внутрикожно, внутривенно, внутримышечно, перорально, в слизистую оболочку или интраназально. В предпочтительном воплощении вакцина согласно настоящему изобретению включает антигены,содержащие пептиды, выбранные по меньшей мере из одной из групп SEQ ID No. 1, 4, 7 и 10, более предпочтительно различные пептиды находятся в равном количестве. В следующем предпочтительном воплощении вакцинная композиция содержит следующие антигены:R L V G F P V K P Q V P G L L R P L T Y K A A-NH2 (SEQ ID No. 15) Эти последовательности могут активировать клеточную иммунную систему и привносить CTLэпитопы. Аминокислотные изменения, проведенные в рамках CTL-эпитопов, предназначены для усиления связывания. Другие аминокислотные изменения проводились для облегчения синтеза пептида и/или увеличения растворимости пептида. Способ обнаружения антител, индуцируемых ВИЧ-1, или специфическими пептидами, или белками ВИЧ-1, в образце жидкой среды организма при помощи данных антигенов составляет следующее воплощение изобретения. Настоящее изобретение также охватывает набор для иммуноанализа, предназначенный для такого обнаружения, и антитела, способные избирательно реагировать с указанными антигенами. Получение пептидов Пептиды изобретения можно получить любым известным способом получения линейных аминокислотных последовательностей, таким как методы рекомбинантной ДНК. Нуклеотидная последовательность, кодирующая один или несколько пептидов изобретения или мультимер из таких пептидов, вводится в экспрессионный вектор. Подходящими экспрессионными векторами могут служить, к примеру,плазмиды, космиды, вирусы и YAC (искусственные хромосомы дрожжей), содержащие необходимые элементы для контроля репликации и экспрессии. Экспрессионный вектор может подвергаться стимуляции для экспрессии в клетках хозяина. Подходящими клетками хозяина являются, к примеру, бактерии,дрожжевые клетки и клетки млекопитающих. Такие методы хорошо известны в данной области и описаны, к примеру, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, 1989. Другие хорошо известные методы - это деградация или синтез путем присоединения одного аминокислотного остатка к следующему в жидкой фазе или предпочтительно на твердой фазе (смола), например, при помощи так называемого синтеза по Merrifield. См., к примеру, Barany and Merrifield in the Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2, E. Gross and Meinhofer, Ed. (Acad.Noble, Int. J. Peptide Protein Res., 35, p. 161-214 (1990). В случае, когда нужен связанный или циклический пептид, аминокислотная последовательность подвергается стадии химического окисления для циклизации или связывания двух остатков цистеина внутри одной или между двумя пептидными последовательностями, когда синтезируют соответствующие линейные аминокислотные последовательности, см. Akaji et al., Tetrahedron Letter, 33, 8, р. 10731076, 1992. Общее описание синтеза Все пептидные производные, полученные в описанных ниже примерах, были синтезированы в синтезаторе Milligen 9050 Peptide Synthesizer no стандартной программе. Использовали смолу Tenta Gel P RAM с теоретической нагрузкой 0,20 мэк/г (RAPP Polymere GmbH, Tubingen). Конечный продукт синтеза высушивали под вакуумом в течение ночи. Затем пептид отделяли от смолы путем обработки 90% трифторуксусной кислотой в присутствии этандитиола (5%) и воды (5%) в качестве перехватчиков (1,5 ч при комнатной температуре). Затем смолу фильтровали и промывали на фильтре дополнительным объемом трифторуксусной кислоты (100%) (2 х 20 мл). Фильтраты объединяли и упаривали под вакуумом (водяная баня при комнатной температуре), а остаток растирали в этиловом эфире (200 мл) и отфильтровывали осажденный продукт. Твердое вещество сразу растворяли на фильтре в ледяной уксусной кислоте (100 мл),вносили в 1,5 л 20% уксусной кислоты в метаноле и обрабатывали 0,1 М раствором йода в метаноле до получения легкого коричневого оттенка. Затем добавляли ионообменник Dowex 1 х 8 в ацетатной форме(15 г) (Bio-Rad, Richmond, CA) и смесь фильтровали. Фильтрат упаривали, а остаток лиофилизировали из уксусной кислоты. Затем продукт очищали методом обратнофазовой жидкостной хроматографии на колонке, заполненной Kromasil 100-5 С 8 (ЕКА Nobel, Surte, Sweden) в соответствующей системе, содержащей ацетонитрил в 0,1% водном растворе трифторуксусной кислоты. Образцы собирали с колонки и анализировали методом аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (BeckmanSystem Gold, USA), снабженной колонкой Kromasil 100-5 С 8 (ЕКА Nobel, Surte, Sweden). Фракции, содержащие чистое вещество, объединяли, растворитель выпаривали и продукт лиофилизировали из уксусной кислоты. Конечный продукт подвергали анализу HPLC и структуру пептида проверяли при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Для синтеза использовали только L-аминокислоты, которые были защищены фторенилметоксикарбонильной группой в положении -аминогруппы. Боковые цепи были защищены следующим образом:OtBu=трет-бутиловый эфир. Аминокислотные производные были получены у фирмы Bachem AG, Switzerland. Пример 1. Получение C S W V N P R L E P W Nl H P G S Q H NI T A C T N-NH2 (SEQ ID No. 2). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Затем пептид переводили в циклическую форму окислением с помощью I2. Пептид растворяли в смеси уксусной кислоты/метанола (1:4) и добавляли 0,1 М I2 в метаноле. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и массспектрометрии (LDI-MS). Чистота (HPLC): более 97% (отдельные примеси менее 1%). Молекулярный вес (свободное основание): 2746,2. Пример 2. Получение F V I P R L E P W Nl H P G S Q P NI T A C T N-NH2 (SEQ ID No. 3). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Чистота (HPLC): более 97% (отдельные примеси менее 1%). Молекулярный вес (свободное основание): 2538,0. Пример 3. Получение Y L L F L T K G L G I S G G G Y Nl G Cit K K R Cit Q IL G-NH2 (SEQ ID No. 5). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Пример 4. Получение Y L Nl F L T R G L G I S G G G Y Nl G Cit K K R Cit Q I C G-NH2 (SEQ ID No. 6). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Чистота (HPLC): более 97% (отдельные примеси менее 1%). Молекулярный вес (свободное основание): 3097,7. Пример 5. Получение R I L S T Y L G R I S G G G W L S A E P V P L Q L P P L-NH2 (SEQ ID No. 8). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Чистота (HPLC): более 97% (отдельные примеси менее 1%). Молекулярный вес (свободное основание): 2990,6. Пример 6. Получение R I L S T Y L G R I S G G G Y L S A E P V P L Q L P P L-NH2 (SEQ ID No. 9). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Пример 7. Получение К L V G F P V K P Q V P G G G R L L Cit P Nl T Y K A A-NH2 (SEQ ID No. 11). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Пример 8. Получение R L V G F P V K P Q V P G G G R L L R P L T Y K A A-NH2 (SEQ ID No. 12). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Чистота (HPLC): более 97% (отдельные примеси менее 1%). Молекулярный вес (свободное основание): 2790,4. Молекулярная формула: C130H217O39N29. Пример 9. Димеризация через дисульфидный мостик. Пептидные последовательности из примера 2 соединяли путем окисления с образованием дипептида, в котором цистеиновые остатки образуют дисульфидный мостик. Мостик формировали любым из следующих способов.- 10006210 Чистоту полученного димера определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Пример 10. Получение F V I H R L E P W L H P G S Q H Nl T A S T N-NH2 (SEQ ID No. 14). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Чистота (HPLC): более 98% (отдельные примеси менее 1%). Молекулярный вес (свободное основание): 2540,2. Пример 11. Получение R L V G F P V K P Q V P G L L R P L T Y К A A-NH2 (SEQ ID No. 15). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Чистота (HPLC): более 99% (отдельные примеси менее 1%). Молекулярный вес (свободное основание): 2520,3. Пример 12. Контрольный пример. Получение нативной последовательности Tat1: M E S V D P R L E P W K H P G S Q P K T A C T N-NH2(SEQ ID No. 16). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Чистота (HPLC): более 97% (отдельные примеси менее 1%). Молекулярный вес (свободное основание): 2708,1. Пример 13. Контрольный пример. Получение нативной последовательности Tat2: Q V C F I T K G L G I S Y G R К К R R Q R R R-NH2(SEQ ID No. 17). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Чистота (HPLC): более 94%. Молекулярный вес (свободное основание): 2806,4. Пример 14. Контрольный пример. Получение нативной Nef-последовательности: E E V G F P V R P Q V P L R P М Т Y К A A-NH2(SEQ ID No. 18). Пептид синтезировали в амидной форме из соответствующих исходных материалов согласно общему описанию синтеза. Чистоту определяли методом HPLC и проверяли структуру при помощи аминокислотного анализа и масс-спектрометрии (LDI-MS). Чистота (HPLC): более 95%. Молекулярный вес (свободное основание): 2384,8. Пример 15. Получение вакцины, содержащей пептиды SEQ ID No. 3 и 12. Лиофилизованные пептиды растворяли в стерильной воде до конечной концентрации 4 мг/мл. Также готовили препарат колониестимулирующего фактора гранулоцитов/макрофагов (GM-CSF) согласно инструкции производителя до конечной концентрации 0,3 мг/мл. Два раствора вводили внутрикожно. Обычная доза для инъекции составляла 100 мкл. Пример 16. Получение вакцины, содержащей пептиды SEQ ID No. 14 и 15. Лиофилизованные пептиды растворяли в стерильной воде до конечной концентрации 4 мг/мл. Также готовили препарат колониестимулирующего фактора гранулоцитов/макрофагов (GM-CSF) согласно инструкции производителя до конечной концентрации 0,3 мг/мл. Два раствора вводили внутрикожно. Обычная доза для инъекции составляла 100 мкл. Пример 17. Раствор или суспензию антигена смешивали с равным количеством адъюванта Фрейнда фирмы Behring, полного или неполного, а затем тщательно эмульгировали, набирая в шприц для инъекций и энергично выпуская из него, или при помощи гомогенизатора. Эмульсия должна оставаться стабильной не менее 30 мин. Эмульсии антиген-адъювант лучше всего вводить подкожно как депо. Пример 18. Иммуноанализ для обнаружения антител, индуцируемых ВИЧ-1. Реагенты для магнитных частиц следует готовить по методике, рекомендованной производителем. Использовали частицы Dynabeads фирмы Dynal AS. Покрытые лигандом магнитные частицы называютpеагентом 1. Пептид согласно изобретению ковалентно связывается с преактивированной поверхностью магнитных частиц. Также возможно физически абсорбировать пептид на поверхности магнитных частиц. Концентрация частиц в pеагенте 1 находится в пределах от 1 до 15 мг/мл. Размер частиц варьирует от 0,2 до 15 мкм. Концентрация пептидов находится в пределах от 0,01 до 1 мг/мл частиц.- 11006210 Реагент конъюгированного с щелочной фосфатазой антитела против Ig человека готовили по методике, рекомендованной фирмой Dako AS. Эта методика является стандартной в данной области. Данный реагент называется pеагент 2. Раствор субстрата - фенолфталеинмонофосфата - готовили согласно методике, рекомендованной фирмой Fluka AG. Эта методика является стандартной в данной области. Данный реагент называетсяpеагент 3. Используемый для отмывки и инкубации буфер представляет собой стандартный 0,05 М трисбуфер со следующими дополнительными компонентами: Твин 20 (от 0,01 до 0,1%), глицерин (от 0,1 до 10%) и хлористый натрий (от 0,2 до 0,1%). Процедура определения включает стадию инкубации, на которой 1 каплю реагента 1 смешивают с 2 каплями отмывочного буфера в каждой лунке. После перемешивания добавляют 30 мкл образца и раствор инкубируют 5 мин. Магнитные частицы удерживают магнитом и удаляют жидкость, а затем убирают магнит. Затем ячейки дважды отмывают 4 каплями отмывочного буфера перед инкубацией с реагентом 2. Вносят 1 каплю реагента 2 вместе с 2 каплями отмывочного буфера и раствор инкубируют 5 мин. Магнитные частицы удерживают магнитом и удаляют жидкость, а затем убирают магнит. Затем стадию отмывки повторяют перед инкубацией с реагентом 3. Вносят 2 капли реагента 3 в каждую ячейку и раствор инкубируют 3 мин. Результат определяют на белом фоне. Положительный результат - красный раствор (3+=интенсивно красный), тогда как отрицательный результат - бледный светло-желтый/коричневый раствор, как у отрицательного контроля. Набор для иммуноанализа может применяться для обнаружения антител, индуцируемых вирусом ВИЧ-1 или ВИЧ-специфичными пептидами или белками, например пептидами настоящего изобретения. Пример 19. Терапевтическая или профилактическая вакцина. По меньшей мере один из полипептидов изобретения, выбранный из группы последовательностейSEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 7 или SEQ ID No. 10, могут служить в качестве антигена и составлять действующее начало терапевтической или профилактической вакцины, предназначенной для защиты от вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1). Вакцина может включать соединения, обладающие благотворным эффектом защиты или стимуляции иммунной системы хозяина (человека или позвоночных животных), например интерлейкины, интерфероны, факторы роста гранулоцитов/макрофагов, гемопоэтические факторы роста и др. Предпочтительно вакцинная композиция дополнительно содержит адъювант или носитель, более предпочтительно адъювантом или носителем служит монофосфорилированный липид А (MPL), возможно, вместе с квасцами, адъювантом Фрейнда (полным или неполным) или гидроксидом алюминия. Оптимальное количество адъюванта/носителя зависит от выбранного типа. Пептиды изобретения могут быть модифицированы добавлением к С-концу одной жирной кислоты,например цепи пальмитоила, для получения липопептидной вакцины. Затем липопептиды могут быть введены в мембраны липосом методом замораживания-оттаивания, в результате чего образуются липосомы, несущие пептидные лиганды на своей поверхности. Пептидная или вакцинная композиция может быть лиофилизирована перед хранением. Лиофилизованные пептиды можно растворять в стерильной воде до конечной концентрации 0,1-100 мг/мл. Вакцину можно хранить предпочтительно при низкой температуре, в ампулах, содержащих одну или несколько дозовых единиц, готовых к употреблению. Обычная дозовая единица пептида согласно изобретению находится в пределах от 0,05 мкг до 1 мг на кг веса тела, предпочтительно в пределах от 0,15 мкг до 0,15 мг на кг веса тела. Специалисты в данной области знают, что доза подбирается в зависимости от веса тела пациента, типа заболевания, степени тяжести заболевания, способа введения и некоторых других факторов. При применении в качестве терапевтической вакцины ее можно вводить до 12 раз путем инъекций. Можно назначать дополнительные инъекции для иммунизации и в некоторых случаях продолжать их в течение всей жизни пациента. При приготовлении раствора для инъекции пептиды растворяют в стерильной воде до конечной концентрации пептида 1 мг/мл. Обычно объем раствора для инъекции составляет от 100 до 200 мкл (2x100 мкл). Пептид предпочтительно вводят вместе с подходящим адъювантом и/или фактором роста гранулоцитов/макрофагов, к примеру, Leucomax фирмы Shering Plough, приготовленном в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мг/мл, в соответствии с рекомендациями производителя. Особенно предпочтительно комбинированное лечение, когда данные пептиды вводятся вместе с пептидами, описанными в опубликованной международной патентной заявке PCT/NO00/00075 и/или находящейся на рассмотрении патентной заявке Норвегии 2000 4413. Эти пептиды можно вводить одновременно или последовательно. К подходящим способам введения относятся внутрикожный, подкожный, внутривенный, пероральный, внутримышечный, интраназальный, мукозальный и др. Для сохранения защитного эффекта могут потребоваться "бустерные" инъекции. Специалистам в данной области понятно, что вакцинные композиции по изобретению применимы не только для предупреждения инфекции, но также для лечения инфекции. Не наблюдалось токсических эффектов пептидов по изобретению при введении мышам в дозе 100 мкг на кг веса тела.- 12006210 Вышеприведенные примеры предназначаются только для иллюстрации. Предусматривается, что специалист в данной области может модифицировать описанные здесь пептиды, антигены и вакцины, не отклоняясь от замысла и области действия данного изобретения, как изложено в формуле изобретения. Перечень последовательностей