Композиции и способы использования нитроксидов в сочетании с биологически совместимыми макромолекулами

Номер патента: 618

Опубликовано: 29.12.1999

Автор: Хсиа Дзен-Чанг

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ стимулирования превращений in vivo гидроксиламиновой формы нитроксида в парамагнитную форму, отличающийся тем, что включает проведение реакции нитроксида в гидроксиламиновой форме с макромолекулой полинитроксида с получением фермент-имитирующей активности в качестве гидроксиламиноксидазы, причем фермент-имитирующим соединением является нитроксидсодержащее соединение, имеющее нитроксильную группу, которая является менее стабильной, чем у первого нитроксида в его свободно-радикальной форме.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что макромолекулой полинитроксида является синтетический нитроксидный полимер.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что макромолекулу полинитроксида выбирают из группы, включающей декстран, гидроксиэтиловый крахмал, липосому, гемоглобин или альбумин.

4. Композиция, содержащая альбумин сыворотки человека, меченный нитроксидом, причем указанный нитроксид является нитроксидом, ковалентно меченным с альбумином со средним молярным отношением, равным приблизительно 17-95.

5. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что среднее молярное отношение нитроксида к альбумину сыворотки человека составляет приблизительно 30-95.

6. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что среднее молярное отношение нитроксида к альбумину сыворотки человека составляет приблизительно 52-95.

7. Композиция по п.4-6, отличающаяся тем, что нитроксид выбирают из группы, включающей TEMPOL, PROXYL и DOXYL.

8. Биологически совместимая композиция, отличающаяся тем, что включает первый нитроксид, проникающий через мембрану, и второй нитроксид, имеющий нитроксильную группу, способную принимать электрон от первого нитроксида.

9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что вторым нитроксидом является биологически совместимая макромолекула полинитроксида, в основном, не проникающая через мембрану.

10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что биологически совместимой макромолекулой полинитроксида является полинитроксид-альбумин.

11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что молярное отношение нитроксида к альбумину составляет приблизительно между 17-95.

12. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что первый нитроксид выбирают из группы, включающей TEMPOL, DOXYL или PROXYL.

13. Композиция по п.12, отличающаяся тем, что нитроксидом является его гидроксиламиновое производное.

14. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что биологически совместимая макромолекула полинитроксида представляет собой нативный гемоглобин, сшитый гемоглобин, полимеризованный гемоглобин, конъюгированный гемоглобин, гемоглобин, инкапсулированный в липосоме, гидроксил-крахмал, декстран или циклодекстран.

15. Способ усиления изображения электронного парамагнитного резонанса или ядерного магнитного резонанса биологической структуры, отличающийся тем, что включает введение первого нитроксида, проникающего через мембрану; введение второго нитроксида, имеющего нитроксильную группу, способную акцептировать электрон у первого нитроксида; и получение визуального изображения биологической структуры.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что нитроксид, проникающий через мембрану, выбирают из группы, включающей TEMPOL, PROXYL или DOXYL, а вторым нитроксидом является биологически совместимая макромолекула, выбранная из группы, включающей гемоглобин, альбумин, декстран, циклодекстран, гидроксиэтил-крахмал или липосому.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что полинитроксидной макромолекулой является альбумин, имеющий молярное отношение нитроксида к альбумину приблизительно 17-95.

18. Способ по п.15, отличающийся тем, что введение второй нитроксидной макромолекулы осуществляют для локализации усиления изображения в сайте вблизи взаимодействия первого нитроксида, проникающего через мембрану, и второго нитроксида.

19. Способ защиты организма от ионизирующего излучения, отличающийся тем, что включает введение первого нитроксида, проникающего через мембрану; и введение второго нитроксида, не проникающего через мембрану, и имеющего нитроксильную группу, способную акцептировать электрон у первого нитроксида.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что вторым нитроксидом является меченная нитроксидом макромолекула, выбранная из группы, включающей альбумин, гемоглобин, декстран, гидроксиэтил-крахмал, липосому или циклодекстран.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что полинитроксидной макромолекулой является меченный нитроксидом альбумин, выбранный из группы, включающей TEMPOL, DOXYL или PROXYL в молярном отношении приблизительно 7-95.

22. Способ лечения физиологического состояния организма с использованием терапевтической дозы ионизирующего излучения, отличающийся тем, что включает введение нитроксида, проникающего через мембрану; введение второго нитроксида, имеющего нитроксильную группу, способную принимать электрон у первого нитроксида; и обработку организма путем ионизирующего излучения.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что нитроксид, проникающий через мембрану, выбирают из группы, включающей TEMPOL, DOXYL или PROXYL, а вторым нитроксидом является меченная нитроксидом макромолекула, выбранная из группы, включающей гидроксиэтил-крахмал, альбумин, гемоглобин, липосому, декстран или циклодекстран.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что нитроксид-меченной макромолекулой является полинитроксид-альбумин, причем, молярное отношение нитроксида к альбумину составляет приблизительно 7-95.

25. Способ по п.22, отличающийся тем, что дозу ионизирующего излучения доставляют в определенный участок, соответствующий концентрации второго нитроксида.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что полинитроксид-альбумин находится в носителе, подходящем для местного применения, причем, указанный способ дополнительно включает местное применение полинитроксида в месте радиационного облучения.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что, по меньшей мере, либо нитроксид, проникающий через мембрану, либо полинитроксид-альбумин внутривенно вводят перед началом лучевой терапии.

Текст

Смотреть все

1 Область техники Настоящее изобретение относится к терапевтическому и диагностическому использованию нитроксидов, включая комбинированное использование проникающего через мембрану нитроксида с не проникающим через мембрану нитроксидом, включая меченные нитроксидом макромолекулы, например полипептиды, такие как гемоглобин, альбумин, иммуноглобулины, и полисахариды,такие как декстран, гидроксиэтилированный крахмал; а также искусственные мембраны,например жидкий бислой, гемоглобин - и альбумин содержащие микросферы. В настоящей заявке раскрываются нитроксидсодержащие композиции, которые способствуют снижению токсического действия ассоциированных с кислородом молекул, присутствующих в живом организме, и могут быть использованы для диагностики и лечения широкого ряда патологических состояний организма. Настоящее изобретение также относится к нитроксидам, синтетическим нитроксидсодержащим полимерам и сополимерам, и меченным нитроксидом макромолекулам, используемым в комбинации с низкомолекулярными и проникающими через мембрану нитроксидами для поддержания in vivo- эффекта нитроксидов. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым соединениям и к способам характеризации нитроксидов, используемых в комбинации с физиологически совместимыми бесклеточными и содержащими инкапсулированный гемоглобин растворами, предназначенными для применения в качестве заменителя эритроцитов. В настоящем изобретении также описаны способы и новые соединения, которые могут быть использованы для направленной доставки нитроксидов, не способных проникать через клеточную мембрану, в их мембранопроникающей форме, что будет приводить к внутриклеточной аккумуляции терапевтических концентраций указанных нитроксидов,применяемых для лечения старения кожи под действием света, а также в качестве средства от морщин. Кроме того, в настоящем изобретении раскрываются вышеуказанные нитроксиды, используемые в комбинации с другими физиологически активными соединениями, включая другие нитроксиды, для защиты от патологических повреждений и окислительных стрессов, вызываемых свободными радикалами, а также описывается их использование для диагностики и лечения заболеваний. Предпосылки создания изобретения Хотя физиологические механизмы кислородного метаболизма давно известны, однако, роль окислительного стресса в физиологии и медицине пока еще не совсем ясна. Влияние образующихся при участии кисло 000618 рода свободных радикалов на физиологию организма и его заболевания является важной темой, которой в настоящее время посвящается все возрастающее число медицинских и биологических исследований. Известно, что заболевания или повреждения организма могут приводить к образованию уровней свободных радикалов, значительно превышающих естественный противоокислительный потенциал организма, в результате чего может возникнуть окислительный стресс. Окислительный стресс представляет собой физиологическое проявление неконтролируемой токсичности свободных радикалов, а главным образом, токсичности, обусловленной образованием токсичных форм кислорода. Токсичные свободные радикалы являются этиологическим фактором многих патологических состояний, включая ишемическое реперфузионное повреждение в результате сердечного криза или приступа стенокардии; шок; аллопецию; сепсис; апоптоз; токсикоз, вызываемый некоторыми лекарственными средствами; токсикоз, вызванный кислородной терапией, применяемой при лечении легочных заболеваний; клиническое или случайное воздействие ионизирующего излучения; травмы; закрытые травмы головного мозга; ожоги; псориаз; патологические изменения в процессе старения; и многие другие состояния. Поэтому необходимо разработать такие композиции и методы, которые способствовали бы деинтоксикации свободных радикалов и родственных токсичных частиц, и которые были бы достаточно активными и стабильными in vivo, что позволило бы избежать их быстрого поглощения в случае увеличения концентрации свободных радикалов. Кроме того, были получены данные, которые показали, что присутствие свободных радикалов приводит к обострению ряда других заболеваний, включая рак, язвы и другие патологии желудочно-кишечного тракта, катаракту, закрытые травмы головного мозга,почечную недостаточность, поражение нервной системы, сердечно-сосудистые заболевания и т.п. Благодаря своей высокой реакционной способности, свободные радикалы могут окислять нуклеиновые кислоты, биологические мембраны, и другие клеточные компоненты, что приводит к серьезным повреждениям клеток или к их гибели, а также к мутагенезу или канцерогенезу. Противораковая радиотерапия и ряд противоопухолевых лекарственных средств действуют посредством генерации свободных радикалов, которые являются токсичными для опухолевых клеток, но которые являются также токсичными и для нормальных клеток, и, воздействуя на эти клетки во время их деления, вызывают при противораковой терапии нежелательные 3 побочные эффекты. Действительно, очевидно, что во многих патологических процессах,конечные реакции метаболизма приводят к образованию свободных радикалов, которые являются непосредственной причиной или существенным предрасполагающим фактором наблюдаемой патологии. Кроме того,резкое увеличение концентрации свободных радикалов может наблюдаться в ходе цепной реакции, инициированной прерыванием потока оксигенированной крови, например, при сердечном приступе или инсульте, часто сопровождаемых реперфузией оксигенированной крови к пораженному участку. Поскольку важная роль такого окислительного стрессавin vivo - системах является совершенно очевидной, то потребность в разработке соединений и методов, которые способствовали бы ингибированию окисления, и которые могли бы повлиять на образование свободных радикалов под действием активного кислорода в целях снижения их токсичности в биологических системах, особенно в организме человека, остается актуальной. В других вариантах,токсичные свободные радикалы могут быть образованы в качестве сопутствующего благоприятного фактора при соответствующей терапии, такой как облучение, являющееся частью противораковой радиотерапии. Так,например, поскольку механизмы, с помощью которых ионизирующее излучение вызывает физиологическое повреждение организма,включает в себя, по крайней мере, отчасти,взаимодействие свободных радикалов с клетками, то соединения, которые содержат свободные радикалы или взаимодействуют с ними, оказывают локальное действие на ткани,подвергаемые лучевой терапии, ограничивая,тем самым, дополнительные повреждения,вызываемые этим терапевтическим лечением. Кроме того, помимо своей клинически важной функции, свободнорадикальные реакции могут прослеживаться in vivo, поскольку неспаренные электроны, присутствующие в свободных радикалах, являются спектроскопически детектируемыми, и соединения,взаимодействующие со свободными радикалами, могут быть обнаружены с помощью спектроскопии. Для снижения патологических уровней свободных радикалов было предложено несколько терапевтических методов. В идеальном случае, безопасные и эффективные противоокислительные агенты могут способствовать повышению противоокислительной способности организма пациента, и ингибировать токсичность, вызываемую патологическими уровнями свободных радикалов, на стадии их генерирования. Однако, разработка методов и соединений для борьбы с окислительным стрессом или токсичностью, ассоциированной с соответствующими формами кислорода, не имела большого успеха. Использование многих антиоксидантов ограничено из-за непродолжительности срока их действия, токсичности их эффективных доз,их неспособности пересекать клеточные мембраны, и неспособности ингибировать действие высоких уровней свободных радикалов. Так, например, введение фермента супероксиддисмутазы (SOD) или каталазы может стимулировать превращение токсичных свободнорадикальных форм в нетоксичную форму. Однако, эти ферменты не являются эффективными во внутриклеточном пространстве. Процестеин в качестве предшественника GSH, а также витамины и другие химические антиоксиданты могут усиливать естественную противоокислительную способность организма, однако, они неспособны"справляться" с повышенными уровнями свободных радикалов, образующихся при повреждениях и заболеваниях, и быстро поглощаются организмом. Известно, что свободнорадикальные формы являются реакционноспособными и короткоживущими. Такая реактивность является особенно серьезным вредным фактором в биологических системах, поскольку неблагоприятные химические реакции между свободными радикалами и тканями организма происходят в непосредственной близости от места генерирования свободного радикала. Поэтому, соединения, способные снижать концентрации свободных радикалов, обладают определенным благоприятным действием,хотя такое действие может не давать клинически значимого эффекта, если только терапевтический эффект не будет сконцентрирован и локализован в конкретном участке организма, таком, как головной мозг, эпидермис, кишечник, сердечно-сосудистая система или отдельная ткань, например, участок, подвергаемый облучению. Проблемы, с которыми сталкиваются специалисты при создании кровезаменителей,подходящих для крупномасштабного внутривенного вливания, являются ярким примером тех трудностей, которые возникают на пути преодоления или уменьшения системной токсичности, вызываемой активными формами кислорода в полости сосудов. В течение последних десятилетий, ученые и врачи пытаются получить кровезаменитель, который с достаточной степенью безопасности мог бы быть использован для переливания крови человеку. Постоянная нехватка крови для переливания, а также проблемы, связанные с несовместимостью групп крови, необходимостью проведения тестов на совместимость крови донора и реципиента, и риском передачи какого-либо заболевания, вынуждают частные промышленные компании, университеты и правительство субсидировать или про 5 водить исследования по разработке препаратов кровезаменителей, позволяющих осуществлять крупномасштабную и безопасную трансфузию (переливание крови) без какихлибо значительных побочных физиологических эффектов. В настоящее время, несколько компаний проводят клинические испытания экспериментальных кровезаменителей. Однако, неблагоприятные физиологические реакции и сложность процесса исследований и разработки не позволяют довести эти исследования до стадии контрольных испытаний и затрудняют разработку клинически ценного кровезаменителя. В августе 1992 г. был выпущен отчет Консультативного совета по научным исследованиям при Военно-морском флоте США, в котором описываются попытки нескольких групп ученых продуцировать кровезаменитель; дается оценка этих попыток; и характеризуются проблемы, связанные с токсичностью. Указанный ответ Консультативного совета по научным исследованиям при Военно-морском флоте США отражает существующее общее мнение научной общественности, заключающееся в том, что хотя имеющиеся кровезамещающие продукты, часто именуемые "переносчиками кислорода на основе гемоглобина" (НВОС), демонстрируют эффективный транспорт кислорода, однако, определенные проблемы, связанные с токсичностью, остаются нерешенными. Так, например, неблагоприятными явлениями, возникающими при трансфузии и наблюдаемыми в клинических исследованиях имеющихся переносчиков кислорода на основе гемоглобина (НВОС), являются системная гипертензия и сужение кровеносных сосудов. Эти побочные явления вынуждают ряд фармацевтических компаний отказаться от своих клинических испытаний или продолжать их при более низких уровнях доз. Решению проблемы, связанной с токсичностью при использовании существующих кровезаменителей на основе гемоглобина, было уделено приоритетное внимание правительства США. Рекомендации Научноисследовательского комитета Военноморского флота США были реализованы Национальным институтом здравоохранения в форме "Заявки на предложения" (РА-93-23) по теме "Переносчики кислорода на основе гемоглобина: механизмы токсичности" ("Hemoglobin-Based Oxygen Carriers: Mechanism ofToxicity"). В соответствии с вышеуказанным очевидно, что медики и ученые ощущают острую и неотложную потребность в получении кровезаменителей, которые были бы пригодны для вливания и не давали бы побочных эффектов, наблюдаемых при использовании существующих переносчиков кислорода на основе гемоглобина. Эритроциты являются главным компонентом крови и содержат систему транспорта кислорода в организме. Уже давно известно,что наиболее важной характеристикой кровезаменителя является его способность к переносу кислорода. Эритроциты обладают способностью к переносу кислорода благодаря присутствию в них главного компонента гемоглобина, который функционирует как переносчик кислорода. Большинство продуктов,подвергаемых клиническим испытаниям на их способность служить в качестве кровезаменителей, содержат гемоглобин, который был выделен из мембран эритроцитов и остальных компонентов эритроцитов, и который был очищен для удаления, в основном,всех примесей. Однако гемоглобин, выделенный из эритроцитов и помещенный в раствор в его нативной форме, является нестабильным и быстро диссоциирует на составляющие его субъединицы. По этой причине, гемоглобин, используемый для получения НBОС (переносчика кислорода на основе гемоглобина),должен быть стабилизирован для предупреждения его диссоциации в растворе. Поэтому основные научные исследования и капиталовложения на эти исследования должны быть направлены на разработку гемоглобиновых продуктов, обладающих стабильностью в растворе, и стабилизированных таким образом, чтобы не была нарушена их основная функция транспорта кислорода. Способность существующих переносчиков кислорода на основе гемоглобина к транспорту кислорода была точно установлена (см. патенты США 3 925 344; 4 001 200; 4 001 401; 4 053 590; 4 061 736; 4 136 093; 4 301 144; 4336 248; 4 376 095; 4 377 512; 4 401 652; 4 473 494; 4 473 496; 4 600 531; 4 584 130; 4 826 811; 4 857 636; 4 911 929; и 5 061 688). В организме гемоглобин, присутствующий в эритроцитах, связывает молекулы кислорода, поступающего из воздуха в легкие, и переносит эти молекулы к тканям в соответствии с потребностью нормальной метаболической функции организма. Однако научный и медицинский парадокс заключается в том,что атмосферный кислород, который необходим большинству живых организмов для дыхания, может представлять опасность для жизни. С одной стороны, почти всем живым организмам для поддержания жизни требуется кислород. А с другой стороны, в процессе нормального кислородного обмена, в организме образуется ряд токсичных химических форм кислорода. Что касается окислительного стресса,возникающего в результате переноса кислорода гемоглобином, то известно, что в процессе транспорта кислорода, молекула гемоглобина (Hb) сама подвергается окислению переносимым ею молекулярным кислородом(О 2). Эта реакция самоокисления приводит к образованию двух нежелательных продуктов: мет-гемоглобина (met-Hb) и супероксиданиона (О 2-). Такая химическая реакция мо жет быть записана следующим образом: Супероксид-анион (О 2-) представляет собой молекулу кислорода, несущую дополнительный электрон и отрицательный заряд. Супероксид-анион является в высокой степени реакционноспособной и токсичной формой кислорода. Как подробно описано в настоящей заявке, свободнорадикальные формы кислорода, такие как супероксид-анион, участвуют в патологических процессах широкого ряда в качестве агентов, повреждающих клетки. В случае переноса кислорода гемоглобином,повреждающее действие окислительного стресса обычно проявляется в области сосудов и инициируется супероксид-анионом,который образуется в процессе самоокисления гемоглобина, а затем, под действием фермента супероксиддисмутазы (SOD), превращается в токсичный пероксид водорода в соответствии со следующей реакцией: В результате этой реакции, свободнорадикальная форма генерирует in vivo токсичное химическое соединение или вызывает повреждение клетки, которое многократно наблюдалось при патологических состояниях,где этиологическим фактором являлся окислительный стресс, в частности, при ишемическом реперфузионном повреждении в случаях сердечного приступа или инсульта. Присутствие супероксид-аниона и пероксида водорода в эритроцитах является, очевидно, главным источником окислительного стресса эритроцитов. Помимо транспорта кислорода гемоглобином эритроциты обладают другим менее известным свойством, которое заключается в том, что они содержат группу специальных ферментов, обладающих способностью к деинтоксикации связанных с кислородом химических молекул, продуцируемых в качестве побочных продуктов кислородного обмена. Без защиты, обеспечиваемой этими специфическими ферментными системами, самоокисление гемоглобина может приводить к повреждению и деструкции эритроцитов. Однако в живом организме, резервная способность ферментных систем, присутствующих в эритроцитах, защищает этот организм от токсичного кислорода путем превращения супероксид-аниона, продуцируемого в процессе нормального метаболизма, в нетоксичные формы, в результате чего осуществляется контроль за уровнем окислительного стресса. В случае если указанная ферментная система распадается, то целостность эритроцитов может быть нарушена. Повреждение гена, экспрессирующего один из ферментов, присутствующих в протективной системе эритроцитов, будет приводить к наблюдаемому патологическому состоянию. Так, например, гемолитическая анемия, индуцируемая пероксидом водорода, является следствием генетического нарушения в эритроцитах, а в частности, дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Это нарушение обусловлено неспособностью пораженных клеток поддерживать уровни НАД(Ф)Н, (NAD(P)H), достаточные для восстановления окисленного глутатиона,что приводит к неадекватной детоксикации пероксида водорода под действием глутатионпероксидазы (Р. Hochstein, Free Radical BiologyMedicine, 5: 387 (1988. Защитная ферментная система эритроцитов превращает токсичные молекулы супероксид-аниона в нетоксичные формы посредством двухстадийной химической реакции метаболизма. В первой стадии этой реакции метаболизма происходит превращение супероксид-аниона в пероксид водорода под действием фермента супероксиддисмутазы(SOD) (см. уравнение 2). Поскольку пероксид водорода также является токсичным для клеток, то эритроциты содержат другой фермент,каталазу, которая во второй стадии метаболизма превращает пероксид водорода в воду(см. уравнение 3): Эритроциты также обладают способностью к детоксикации пероксида водорода и других токсичных органических пероксидов посредством фермента глутатионпероксидазы, которая, реагируя с глутатионом, превращает пероксид водорода и органические пероксиды в воду. Кроме того, эритроциты содержат фермент, предотвращающий образование метгемоглобина, продуцируемого в результате самоокисления гемоглобина. Фермент метгемоглобин-редуктаза превращает метгемоглобин обратно в обычную форму гемоглобина. В соответствии с вышеизложенным очевидно, что в живом организме,токсические эффекты самоокисления гемоглобина предотвращаются в процессе реакций метаболизма под действием специфических ферментов, которые способствуют удалению нежелательных побочных продуктов кислородного обмена. В переносчиках кислорода на основе гемоглобина (НВОС), разработанных в настоящее время, отсутствуют ферментативные функции детоксикации кислорода, присущие ферментам супероксиддисмутазе, катализе и глутатионпероксидазе, которые служат для защиты эритроцитов от токсичного кислорода, продуцируемого в процессе нормального 9 транспорта кислорода. Если в НВОСрастворах отсутствует функция детоксикации кислорода, то из-за присутствия токсических молекул кислорода эти растворы будут небезопасными. Основной способ, с помощью которого изготавливаются существующие в настоящее время НВОС-растворы, заключается в том,что из эритроцитов удаляют гемоглобин, а затем его очищают от всех негемоглобиновых белков и других примесей, в результате чего полученный раствор может вызывать неблагоприятные реакции во время трансфузии(см., патенты США 4 780 210; 4 831 012; и 4 925 574). Значительное повреждение или удаление системы ферментов, способствующих детоксификации кислорода, является неизбежным результатом существующих способов выделения и очистки, которые позволяют выделить очищенный гемоглобин,используемый для очистки большинства НВОС. Альтернативно, вместо выделения гемоглобина из эритроцитов и его очистки,чистый гемоглобин может быть получен с использованием техники рекомбинантных ДНК. Однако рекомбинантный гемоглобин человека также является в высокой степени очищенным продуктом и не содержит систем детоксификации кислорода, обнаруживаемых в эритроцитах. Таким образом, разработка усовершенствованной техники получения раствора, содержащего в высокой степени очищенный гемоглобин, не является целесообразной во всех отношениях, поскольку процесс очистки гемоглобина приводит к удалению не только вредных примесей, но и полезных ферментов, присутствующих в эритроцитах и обеспечивающих детоксификацию кислорода, что, в конечном счете, приводит к кислородассоциированной токсичности. Одним из наблюдаемых токсичных побочных эффектов, обусловленных внутривенным введением имеющихся НВОС, является сужение кровеносных сосудов или гипертензия. Хорошо известно, что фермент супероксиддисмутаза (SOD) in vitro быстро утилизирует супероксид-анион и продлевает сосудорасширяющее действие окиси азота(NO). Биологическая активность молекулы окиси азота была обнаружена недавно, а до этого эта молекула была известна лишь как"эндотелиальный сосудорасширяющий фактор " (EDRF). Продление супероксиддисмутазой сосудорасширяющего действия окиси азота приписывали способности этого фермента предотвращать реакцию между супероксид-анионом и окисью азота. (М. Е. MurphyToxicol, 30: 535 (1990. Гипертензивное действие, наблюдаемое в преклинических исследованиях на животных существующих НВОС- растворов, дает основание предположить, что концентрация супероксид-анионов при крупномасштабных трансфузиях этих НВОС-растворов является причиной деструкции EDRF, и соответственно причиной наблюдаемого сужения сосудов и системной гипертензии. Поэтому важно подробно описать гипертенсивный эффект, индуцируемый реакцией супероксид-аниона с окисью азота (NO) в результате которой возникает экстравазация и связывание NO гемоглобином. После трансфузии НВОС, гемоглобин может также подавлять сосудорасширяющее действие окиси азота посредством реакции с этой окисью азота, в результате чего образуется соответствующий аддукт нитрозил-гем (NO-гем). В частности, известно, что дезокси-гемоглобин связывается с окисью азота со средством,которое на несколько порядков превышает сродство монокиси углерода. Эти взаимодействия гемоглобина с NO были использованы для анализа на окись азота и для исследования биологической активности окиси азота. Так, например, было выяснено, что антагонизм сосудорасширяющего действия окиси азота зависит от проницаемости клеточной мембраны для гемоглобина. В интактных тромбоцитах, гемоглобин не подавляет действие L -аргинина, который является предшественником окиси азота. В противоположность этому, в цитозоле лизированных тромбоцитов, гемоглобин оказывает наиболее эффективное ингибирующее действие на L-аргинин-индуцированное образование циклического GMP, опосредованное окисью азота. Эти эксперименты показали, что эффективного проникновения гемоглобина через мембрану тромбоцитов не происходит.(1990. Поэтому, одним из предпочтительных свойств HBOC является способность предотвращать взаимодействие окиси азота с гемоглобином. Кроме того, известно, что гемоглобин оказывает антагонистическое действие на эндотелий-зависимое расширение сосудов(Martin W, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 232: 708 (1985, а также на NO-зависимую релаксацию гладкой мышцы сосуда (Grueter G. A.et al., J. Cyclic. Nucleotide Res. 5: 211 (1979. Были предприняты попытки ограничить экстравазацию и гипертензивный эффект гемоглобина путем химической стабилизации,полимеризации,инкапсулирования,или нонъюгирования гемоглобина в НВОС в целях пролонгирования времени его присутствия в кровотоке. Исходя из вышеизложенного, очевидно, что хотя существующие в настоящее время НВОС, в основном, не проникают через мембрану и осуществляют транспорт кислорода, однако, НВОС-растворы неспособны предотвращать реакцию между супероксид-анионом и окисью азота при трансфузии. Вышеприведенные примеры показали, что несмотря на ясное понимание учеными механизмов транспорта кислорода и несмотря на их продолжающиеся десятилетиями попытки усовершенствовать способ продуцирования гемоглобина и получения его соответствующих препаратов, проблема регулирования токсичности кислорода/окислительного стресса остается актуальной. С точки зрения решения проблем, связанных с кислородной токсичностью существующих кровезаменителей, идеальным раствором является препарат на основе гемоглобина, обладающий функцией транспорта кислорода, присущей существующим в настоящее время НВОС, и функцией детоксификации кислорода, присущей эритроцитам. Однако, простое добавление фермента супероксиддисмутазы ( SOD) в имеющийся НВОСраствор не дает желаемого результата, поскольку при снижении концентрации супероксид-аниона происходит стимуляция реакции окисления гемоглобина до метгемоглобина, что приводит к нежелательному усилению продуцирования метгемоглобина (см. Уравнение (1. Нежелательной также является стимуляция превращения супероксиданиона в пероксид водорода в растворе гемоглобина, поскольку пероксид водорода является токсичным и реакционно-способным, и при хранении, он будет разлагаться до гидроксильного радикала или образовывать другие токсичные органические пероксиды. Поскольку, в идеальном случае, синтетические кровезаменители должны быть пригодны для инфузии в больших количествах,то соединения, которые взаимодействуют со свободными радикалами, должны обладать пролонгированным действием in vivo, а также должны быть стабильными и нетоксичными. В соответствии с настоящим изобретением,для уменьшения токсического действия свободных радикалов в живом организме используются нитроксиды и нитроксидмеченные макромолекулы. Другим примером физиологического повреждения в области сосудов, вызываемого каскадом свободнорадикальных реакций, могут служить отек мозга, некроз, и апоптоз,которые ассоциируются с рядом патологий,включая, цереброваскулярную окклюзию и нарушение мозгового кровообращения,обычно называемое "ударом" (или инсультом). Значительная часть повреждений головного мозга в результате инсульта также обусловлена реперфузией после окклюзии. Повреждение головного мозга в результате инсульта требует больших затрат на медперсонал и лечение, а поэтому уже в течение многих лет врачи и ученые пытаются найти способ предупреждения повреждений головного мозга при инсульте. Главный вклад в церебральные нарушения, сопутствующие ишемическому/реперфузионному повреждению головного мозга при инсульте, вносит образование свободных радикалов в полости сосуда, в результате чего происходит каскад реакций, приводящих к повреждению клеток. Так, например, было показано, что у трансгенных (Тg) SOD - 1 -мышей, кислородная токсичность, индуцированная свободными радикалами, ассоциируется с отеком и поражением нервной ткани (Chan P. H., C. J. Epstein, H. Kinouchi, Н. Kamii, S. Imaizumi, G.SOD-1-трансгенные мыши представляют модель для исследования и поиска путей защиты нервной ткани при нарушении мозгового кровообращения и черепно-мозговых травмах. Ann.N.Y. Acad. Sci.738: 93-103; Chan, P.Carlson, и S.R. Chen (1993). Роль супероксиддисмутазы при ишемическом поражении головного мозга после локальной церебральной ишемии у трансгенных мышей заключается в снижении уровня отека и инфаркта. См. Molecular Mechanisms of Ischemic Brain Damage,K. KogureB. K. Siesjo, eds. Amsterdam: Elsevier, pp. 96-104; Kinouchi, H., C. J. Epstein,T. Mizui, E. Carlson, S. F. Chen и P.H. Chan(1991). Уменьшение локальных ишемических поражений головного мозга у трансгенных мышей вызывает сверхпродуцированиеSci. USA 88:11158-11162. У SOD-1-трансгенных мышей, чел. трансгенная SOD продуцируется в головном мозге мышей на уровне, который может в три раза превышать нормальный уровень, и обеспечивает 30%-защиту мозга от поражения в результате инсульта, как было установлено по измерению зон инфаркта, отеков и поражений нервной ткани после локального ишемического инсульта. При инсульте повреждения, индуцированные свободными радикалами, локализируются во внутриклеточном пространстве и в полости сосудов, что свидетельствует (а) о повреждении клеточных мембран и органелл в тканях; и (в) о повреж 13 дении, специфическом для эндотелия сосудов. Imaizumi, S.,V. WooLworth, и R.A.Fishman (1990). Инкапсулированная в липосомы супероксиддисмутаза способствует снижению церебрального инфаркта при церебральной ишемии у крыс. Stroke 21: 1312-1317. Liu,Т. Н., J. S. Beckman, В. A. Freeman, E.L.Hogan, и C. Y. Hsi (1989). Супероксиддисмутаза и каталаза, конъюгированные с полиэтиленгликолем, снижают ишемические повреждения головного мозга. Am. J. Physiol. 256: Н 586-Н 593. Chan, P. H., S. Longar, и Р. A.Fishman (1987). Инкапсулированная липосомами супероксиддисмутаза оказывает протективное действие на посттравматический отек головного мозга. Ann. Neurol. 21: 540547. Однако пока еще не было получено абсолютно эффективного лекарственного средства, способного предотвращать нарушения головного мозга в результате церебральной ишемии. Было исследовано большое число экспериментальных нейропротективных агентов, тромболитических средств, и антикоагулянтов, однако, из-за побочных эффектов,продуцируемых этими агентами, они не могут быть использованы. Кроме того, ишемические/реперфузионные повреждения могут также возникать в процессе хирургической операции, например, по поводу эмболии пузырьками газа, эмболии эндогенными или экзогенными частицами, или в результате гипотензивного криза. Эти проблемы, очевидно, не могут быть решены с помощью антикоагулянтной терапии. Принимая во внимание противоокислительный защитный механизм действия нитроксидных соединений настоящего изобретения, можно утверждать,что настоящее изобретение способствует значительному уменьшению реперфузионных повреждений клеток посредством их защиты от повреждения во время реперфузии. Кроме того, поскольку соединения настоящего изобретения могут быть обнаружены методами спектроскопии, то они могут быть использованы в качестве терапевтических и диагностических агентов при инсульте, а также в качестве профилактических агентов для предупреждения шока во время операции, нарушения сердечной деятельности во время операции, и нарушения функции почек; при этом, указанные соединения могут быть использованы в сочетании с другими противоинсультными средствами, такими как тромболитические препараты, ингибиторы высвобождения глутамата, блокаторы входящего потока кальция, и антагонисты NMDA- рецепторов. Предупреждению окислительного стресса в сосудистой системе также препятствует образование окисленных липидов, которое может приводить к возникновению артери 000618 альных бляшек и артеросклероза на стенках сердечно-сосудистой системы, особенно, на стенках артерий, расположенных вблизи сердца. Механизм свободнорадикальной реакционной способности также предусматривает окисления липопротеинов низкой плотности (ЛНП) плазмы, и эти окисленные липиды, очевидно, также играют определенную роль в реперфузионных повреждениях головного мозга и центральной нервной системы, а также в некоторых заболеваниях и состояниях сердечно-сосудистой системы. Следует отметить, что в соответствии с несколькими вариантами осуществления настоящего изобретения, описанными в настоящей заявке, способность нитроксидов,используемых вместе с подходящими биологическими макромолекулами для предупреждения повреждений, вызываемых свободными радикалами in vivo, позволяет разработать терапевтические и диагностические нитроксидсодержащие препараты и способы их использования с широким диапазоном применения. С использованием соединений, описанных в настоящей заявке, можно лечить или диагностировать большое число физиологических состояний и процессов, которые обусловлены присутствием происходящих от кислорода свободных радикалов. Использование проникающих через мембрану низкомолекулярных нитроксидов в комбинации с биологически совместимыми макромолекулами, такими, как гемоглобин, альбумин, и др., позволяет исследователям изготовить нитроксидсодержащий препарат для применения в соответствующих условиях. Кроме того, многокомпонентная нитроксидсодержащая система действует как радиопротективный агент при ее использовании в противораковой терапии и для лечения от воздействия радиации. При применении этой системы в клинических условиях эффективность радиационной терапии может быть усилена путем повышения доз облучения,безопасность которых обеспечивается использованием вышеуказанной системы. Уже давно специалисты испытывают необходимость в получении средств, которые могут быть использованы для защиты от повреждающего действия ионизирующего излучения, которому подвергается пациент в процессе лучевой терапии, или от радиационного воздействия окружающей среды. Такие средства могут быть также использованы как средство для исследования механизмов радиационной цитотоксичности. Одним из самых ранних идентифицированных средств для защиты от радиации является цистамин,который представляет собой серусодержащее соединение. Открытие этого соединения побудило Министерство обороны США профинансировать синтез и систематический скри 15 нинг свыше 40000 соединений в попытке обнаружить еще более эффективные средства. Эти фундаментальные исследования привели к обнаружению нескольких противолучевых защитных агентов, таких как аминотиоловое соединение, известное как WR-2721. Позже было показано, что супероксиддисмутаза,интерлейкин-1, и гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор обладает противорадиационным протективным действием. По сравнению с этими средствами, WR-2721 показало наибольшую эффективность общей и селективной защиты нормальных тканей от радиационного облучения. Однако, при применении WR-2721 для лечения пациентов, подвергшихся противораковой лучевой терапии, это соединение обнаруживало токсичность и неселективное протективное действие на опухоли, что несколько умерило энтузиазм исследователей в отношении его использования в этих целях. Способность защищать ткани от действия"ионизирующего" излучения также предусматривает способность защищать и лечить кожные ткани, подвергшиеся действию УФизлучения. Таким образом, соединения, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы вместе с носителем, подходящим для введения, например, в виде лосьона или крема, который может быть нанесен на кожу. Было установлено, что некоторые стабильные нитроксиды обладают противоокислительным и противорадиационным защитным действием. Однако in vivo эти способные проникать через мембрану нитроксиды быстро превращаются в неактивную форму и могут быть токсичными в повышенных дозах. В соответствии с настоящим изобретением, эффективность введения этих способных проникать через мембрану нитроксидов может быть в значительной степени увеличена. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к стабильным нитроксидам, используемым вместе с другими биологически совместимыми макромолекулами, включая другие нитроксиды,путем введения в биологические системы в целях терапии и диагностики. В частности,настоящее изобретение относится к низкомолекулярным и способным проникать через мембрану нитроксидам, используемым в комбинации с нитроксидами, связанными в высоком молярном соотношении с биологически совместимыми макромолекулами, такими как альбумин и гемоглобин. В некоторых вариантах применения, взаимодействие между одной формой нитроксида и другой формой нитроксида с отличающимися стабильностями свободных радикалов облегчает перенос электронов или спина между молекулами. Разница в стабильностях этих сво 000618 бодных радикалов может быть обусловлена электрохимическим окружением молекулы или природой соединения. Настоящее изобретение также относится к использованию стабильных нитроксидных свободных радикалов, их предшественников и производных,называемых в целом "нитроксидами", для обеспечения функции детоксификации кислорода, свойственной эритроцитам, в кровезаменителях на основе гемоглобина, и для ослабления окислительного стресса в целях предотвращения биологических повреждений, ассоциируемых с токсичностью свободных радикалов, включая такие поражения,как воспаления, радиационные воздействия,черепно-мозговые травмы, шок, постишемические реперфузионные повреждения,почечная недостаточность, повреждение эндотелия, пероксидация липидов, серповидноклеточная анемия, активация и агрегация лейкоцитов, апоптоз, ионизирующее излучение, алопеция, катаракта, сепсис, псориаз,язвы, ускорение процесса старения, и другие. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, стабильные нитроксиды или их производные используются для создания нескольких кровезамещающих препаратов, которые обладают способностью к детоксификации кислорода, присущей эритроцитам. Эти препараты могут быть описаны в настоящей заявке как заместители эритроцитов на основе гемоглобина (HRC5), поскольку, в данном случае, эффективность переносчиков кислорода на основе гемоглобина (НВОС) увеличивается благодаря присущей эритроцитам функции детоксификации кислорода. Наличие такой функции позволяет создать вазонейтральные переносчики кислорода на основе гемоглобина, которые способствуют предупреждению гипертензии, наблюдаемой при использовании многих НВОС. Во избежание неблагоприятных эффектов, связанных с использованием лишь одних нитроксидов, в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, в целях достижения пролонгированной активности нитроксида in vivo меченные полинитроксидом макромолекулы, такие как Tempoмеченный альбумин сыворотки человека,вводят либо отдельно, либо вместе со свободным нитроксидом, способным проникать через мембрану. Одно из преимуществ такого препарата заключается в том, что он представляет собой улучшенный агент, который обладает противорадиационным протективным действием, и который может быть использован в диагностических и терапевтических целях, а также в целях защиты от действия любого источника радиации. При терапевтическом применении этого препарата может быть проведена лучевая терапия при 17 более высоких дозах облучения, что способствует повышению ее эффективности. Такая высокоэффективная терапия особенно важна при некоторых видах опухолей, например,опухолей мозга, и может быть использована в комбинации с визуализацией и доставкой кислорода, как описано в настоящей заявке,особенно, в случае опухолей, содержащих области гипоксии. Кроме того, нитроксиды могут быть обнаружены путем спектроскопии электронного парамагнитного резонанса и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Благодаря развитию современной техники визуализации, путем измерения и детекции стабильных свободных радикалов нитроксида могут быть получены изображения интактных биологических тканей и органов. В соответствии с настоящим изобретением, уровни активного нитроксида в организме могут поддерживаться в течение длительного периода времени,что позволяет улучшить контрастность изображения и увеличить продолжительность сигнала по сравнению с сигналом, наблюдаемым при использовании лишь одних низкомолекулярных и проникающих через мембрану нитроксидов. Кроме того, в отличие от некоторых существующих агентов, усиливающих изображение, композиции настоящего изобретения способны пересекать гемотоэнцефалический барьер. Кроме того, благодаря своей противоокислительной активности, композиции настоящего изобретения имеют как терапевтическую, так и диагностическую ценность, что позволит с успехом использовать новые композиции и способы настоящего изобретения в самых различных целях. Описаны также материалы и методы получения и введения стабильных нитроксидов в нескольких формах. В частности, описаны неактивные относительно нетоксичные предшественники или производные проникающих через мембраны нитроксидов, которые in vivo под действием других соединений, описанных в настоящей заявке, превращаются в биологически активные нитроксиды, или имитируют противоокислительные ферменты. В любом случае, химически восстановленный (неактивный) нитроксил может быть реактивирован под действием других нитроксидов с отличающейся стабильностью или под действием меченных нитроксидом макромолекул после того, как он был восстановлен в процессе детоксификации токсичных свободных радикалов. В результате такой регенерации, нитроксиды настоящего изобретения имеют более продолжительный период полужизни in vivo по сравнению с низкомолекулярными проникающими через мембрану нитроксидами, используемыми отдельно. Таким образом, настоящее изобре 000618 тение относится к композициям и способам повышения эффективности нитроксидов в любом случае их применения. При использовании многокомпонентной системы настоящего изобретения создается динамическое равновесие между низкомолекулярными проникающими через мембрану нитроксидами и проникающими через мембрану нитроксидсодержащими молекулами с отличающейся стабильностью. В частности,соединение на основе нитроксида, отличающееся тем, что оно имеет нитроксильную группу, способную акцептировать электрон от другого нитроксида, такого, как нитроксид, связанный с непроникающей через мембрану макромолекулой, и способный акцептировать электрон от гидроксиламинового производного, может действовать как имитатор фермента, который способствует регенерации активной функции проникающих через мембрану нитроксидов, или, наоборот, это соединение может действовать как акцептор электронов, который превращает гидроксиламиновую форму нитроксида в свободнорадикальную форму. В соответствии с настоящим изобретением, возможность поддерживать концентрацию активного нитроксида in vivo является главным преимуществом практически при любом применении нитроксида, когда его введение оказывает благоприятное действие,но ограничено в силу быстрого восстановления этого нитроксида in vivo, либо, когда оптимально эффективная доза вводимого проникающего через мембрану нитроксида является токсичной. Так, например, в соответствии с настоящим изобретением, увеличение активного периода полужизни нитроксида invivo обеспечивает защиту от облучения и улучшает визуализацию в клинических и других применениях, при которых эффективная доза низкомолекулярного и проникающего через мембрану нитроксида является токсичной или быстро выводится из организма. Нитроксиды, которые являются парамагнитными благодаря присутствию стабильного неспаренного электрона, функционируют как визуализирующие агенты в ядерном магнитном резонансе (ЯМР/МРВ) и в электронном парамагнитном резонансе(ЭПР/ЭРВ). Однако, вследствие быстрого восстановления нитроксида в его спектроскопически недетектируемую форму, чаще всего в гидроксиламиновую форму, использование таких агентов ограничено. Поскольку свободные радикалы ответственны за реперфузионные повреждения, и поскольку известно,что они участвуют в кислородном метаболизме, то с использованием композиций настоящего изобретения в качестве визуализирующих агентов можно наблюдать ишемические повреждения ткани и области гипоксии 19 тканей. Кроме того, противоокислительное и ферментимитирующее действие композиций настоящего изобретения дает дополнительное преимущество в отношении защиты от окислительного повреждения тканей. Важным преимуществом таких многокомпонентных нитроксидных систем является их способность осуществлять свое противоокислительное,антирадиационнопротективное, противоишемическое, визуализирующее, фермент-имитирующее и др. действие в нескольких участках живого организма,таких, как полость сосуда, интерстициальное пространство, и внутриклеточные области,либо в конкретном участке ткани в зависимости от способности к селективному проникновению через биологическую структуру, или в зависимости от использования известных методов введения, обеспечивающих направленный или локальный эффект. В соответствии с поставленной целью, врач или исследователь может самостоятельно изготовить многокомпонентную систему, описанную в настоящей заявке. Так, например, различные композиции, описанные в данной заявке,имеют различные степени сосудорасширяющего действия. Конкретный выбор нитроксидсодержащих молекул многокомпонентной системы настоящего изобретения будет определять возможности селективного лечения или диагностики конкретного заболевания или состояния, а также будет обеспечивать увеличение или уменьшение уровней свободнорадикальных форм нитроксида. Так,например, следует отметить, что настоящее изобретение может быть, в частности, направлено на лечение сердечно-сосудистой системы путем внутривенного введения одного или нескольких компонентов многокомпонентной системы, описанной в данной заявке. Аналогично, один нитроксид данной системы может быть локально введен в конкретно выбранный участок кожи путем местного применения, тогда как другие компоненты могут быть введены местно, перорально или внутривенно в зависимости от конкретных целей применения настоящего изобретения. В основном, в некоторых вариантах осуществления изобретения,нитроксид(включая предшественники и метаболические субстраты) выбирают так, чтобы он осуществлял нужную функцию, то есть, защиту от радиации, визуализацию, имитируемое ферментативное действие, и т.п., а другие нитроксидсодержащие молекулы выбирают так,чтобы они обеспечивали сохранение активности. В зависимости от переноса спина электрона, одна молекула может рассматриваться как нитроксид-"акцептор", а другая как нитроксид-"донор". В некоторых вариантах осуществления изобретения, "донор" и "акцеп 000618 тор" могут быть физически отделены друг от друга in vivo и иметь различную стабильность в отношении своих свободнорадикальных частей. В предпочтительном варианте, нитроксидом-акцептором является связанный с полинитроксидом альбумин, который присутствует, в основном, в полости сосудов и обеспечивает сохранение активности. Донорными молекулами являются обычно низкомолекулярные и проникающие через мембрану молекулы, такие, как TPL или ТРН. Альтернативно, донорные молекулы могут не обладать способностью проникать через мембрану, а акцепторные молекулы могут проникать через мембрану, и эти молекулы могут быть выбраны так, чтобы активность нитроксида ингибировалась. Следует отметить, что отдельные виды молекул, выбранные в качестве донора или акцептора, могут варьироваться при условии,что будет сохраняться их физическая обособленность и будет обеспечиваться их неодинаковая стабильность. Так, например, одни и те же нитроксиды могут действовать как акцепторы и как доноры. В качестве примера может служить ТРL, меченный у ряда аминогрупп макромолекул, таких как альбумин, где указанный ТРL является, в основном, не проникающим через мембрану нитроксидомакцептором. Неодинаковая стабильность связанного с макромолекулой TPL обеспечивается путем мечения в аминогруппах так, чтобы оставшиеся карбоксильные группы создавали кислотное микроокружение, приводящее к менее стабильному состоянию свободных радикалов в альбумин-связанном TPL. Альтернативно, могут быть получены различные несвязанные формы нитроксидов, которые,благодаря свойственной им химической и электрической природе, будут обеспечивать требуемое физическое разделение и неодинаковую стабильность. Соединения настоящего изобретения создают динамическое равновесие между восстановленной и окисленной формами нитроксида так, чтобы один из них был активным in vivo, а другой неактивным. Главный механизм такого явления заключается в отнятии электрона от первого нитроксида, а в частности, от его восстановленного гидроксиламинового производного, и присоединения этого электрона нитроксильной группой второго нитроксида. Второй нитроксид способен присоединять электрон в том случае, если он вступает в контакт с первым нитроксидом благодаря неодинаковой стабильности свободнорадикальной нитроксильной группы. В одном примере, свободный радикал или "оксидированная" форма, например, TPL быстро восстанавливается до ТРH до тех пор, пока она не будет регенерироваться в TPL с помощью полинитроксид-альбумина (РNА). Предпочтительные композиции, содержащие нитроксиды в сочетании с биологически совместимыми макромолекулами, могут варьироваться по своему составу; так, например, в случае использования физиологически приемлемого раствора для вливания, такого как переносчик кислорода на основе гемоглобина, эти композиции включают: 1) нитроксид-содержащие соединения, введенные в контейнер для хранения или содержащиеся внутри фильтра; причем, эти нитроксиды могут быть химически связаны с нерастворимой матрицей, используемой в фильтре, или содержаться в нем в нескольких формах, предпочтительных для хранения или введения; 2) нитроксид, ковалентно связанный с гемоглобином, стабилизированным посредством химического или рекомбинантного перекрестного сшивания; 3) нитроксид, ковалентно связанный с полимеризованным гемоглобином, с использованием, в частности, 2,4 или 8 молярных эквивалентов нитроксида; 4) нитроксид, инкапсулированный вместе с гемоглобином в липосомальную мембрану; 5) нитроксид, ковалентно связанный с конъюгированным гемоглобином; 6) нитроксил, ковалентно связанный с несколькими формами альбумина в высоком молярном соотношении, т.е., от 6 до 95; 7) нитроксид, ковалентно связанный с иммуноглобулинами; а также любая вышеуказанная комбинация в многокомпонентной системе. Как указывалось выше, эти композиции могут быть использованы отдельно или в сочетании с низкомолекулярными и проникающими через мембрану нитроксидами в зависимости от целей применения. Кроме того,для изменения реактивности или стабильности in vivo вышеуказанные композиции могут быть получены с использованием других соединений. В частности, для повышения стабильности гемоглобин-содержащих растворов могут быть использованы циклодекстран и другие известные стабилизирующие агенты. Кроме того, известно, что необходимый для организма микроэлемент селен генерирует супероксид, и может быть использован вместе с полинитроксидной макромолекулой для стимуляции ее окисления. Эти композиции могут быть также использованы с другими известными соединениями, обеспечивающими защиту от окислительного стресса,усиливащими визуализацию, и повышающими или понижающими чувствительность к радиационному излучению, а также с други 000618 ми известными соединениями, используемыми в клинической терапии или диагностике. Ниже представлены экспериментальные результаты, которые показали, что низкомолекулярные нитроксиды могут быть регенерированы из восстановленной неактивной формы в их активную форму посредством взаимодействия с нитроксидмеченными макромолекулами настоящего изобретения. Нижеприведенные экспериментальные результаты и методы показали, что нитроксиды могут быть связаны с биологически совместимыми макромолекулами, включая альбумин и стабилизированный,полимеризованный,конъюгированный и инкапсулированный гемоглобин, в целях их использования в терапии, диагностике, а также для оценки физиологических состояний, связанных с окислительным стрессом. Взаимодействие нитроксидмеченного гемоглобина и нитроксидмеченного альбумина, взятых отдельно или в сочетании с низкомолекулярным нитроксидом, со свободными радикалами позволяет предположить, что и другие биологически совместимые макромолекулы со значительным периодом полужизни в плазме могут быть помечены нитроксидом и использованы в соответствии с настоящим изобретением в целях предотвращения или защиты от окислительного стресса или токсичности, вызываемой свободнорадикальными формами химических соединений. Представленные экспериментальные результаты также показали, что композиции настоящего изобретения обладают антигипертензивным действием при введении их вместе с НВОС так, чтобы инфузия НВОСраствора имела вазонейтральную реакцию. Противолучевая защита была продемонстрирована на клеточных культурах и на мышах,подвергнутых летальным дозам радиации. Визуализация сердца крысы с помощью электронного парамагнитного резонанса показала,что посредством такой визуализации можно осуществлять непрерывное наблюдение за прогрессированием ишемических и реперфузионных повреждений, и кроме того, было продемонстрировано, что помимо усиления изображения, композиции настоящего изобретения обеспечивают защиту сердца от повреждения после ишемической реперфузии. Результаты экспериментов продемонстрировали защиту от ишемического реперфузионного повреждения в сердечно-сосудистой и церебро-васкулярной системах, а также показали, что протективный эффект композиций настоящего изобретения обусловлен ингибированием окисления липидов, активацией лейкоцитов, и терапевтическим и защитным действием на кожу. 23 Описание рисунков Фиг. 1 А и 1 В иллюстрируют спектры электронного спинового резонанса, полученные для 4-амино-ТЕМРО-меченных и полимеризованного с о-раффинозой гемоглобина,и зарегистрированные на (А) день 1 и (В) день 30(TEMPO: 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил); на фиг. 1 С - спектры образца фиг. 1 А, разведенного равным объемом немеченного гемоглобина, которые были зарегистрированы в день 1; на фиг. 1D спектр для образца фиг.1 С, зарегистрированный в день 30. Фиг. 2 А и 2 В - соответственно, спектры электронного спинового резонанса, демонстрирующие ковалентное связывание 4-(2 бромацетамидо)-TEMPO с N-аминогексилагарозой, и 4-амино-ТЕМРО с 1,4-бис(2:3 эпоксипропил)бутанактивированной агарозой. Фиг. 3 А и 3 В - соответственно, спектры электронного спинового резонанса, иллюстрирующие успешное ковалентное связывание 4-(2-бромацетамид)-TEMPO и 3-малеимидоРРОХУL с 3,5-бис-бромсилицил-бифумарат(DBBF)-сшитым или диаспирин-сшитым гемоглобином человека (НВОС). Фиг. 4 А - представляет ЭСР спектр 4-(2 бромацетамидо)-TEMPO; фиг. 4 В - ЭСРспектр 4-(2-бромацетамидо)-ТЕМРОмеченного НВОС; фиг.4 С - ЭСР-спектр 15ND17/ TEMPOL в лактатном растворе Рингера, который регистрировали при комнатной температуре. Фиг. 5 ЭСР-спектры 4-(2 бромацетамидо)-ТЕМРО-меченных НВОС с различными молярными отношениями нитроксидов к гемоглобину; на фиг. 5 А- 2:1; фиг. 5 В- 4:1; и фиг. 5 С- 8:1. Чувствительность прибора снижалась пропорционально от фиг.5 А до 5 С, при этом спектры регистрировали так, чтобы было видно, что центральный пик (Мо) имеет одинаковую высоту. Фиг. 6 - ЭСР-спектр смеси 4-(2-бромацетамидо)-ТЕМРО-меченного НВОС и 15ND17-TEMPOL, где центральный пик (см. стрелку, смотрящую вниз) первого компонента смеси и высокий боковой пик (см. стрелку,направленную вверх) второго компонента смеси были доведены до одинаковой интенсивности. Этот спектр является суперпозицией ЭСР-спектров Фиг.4 В и 4 С. Фиг. 7 представляет время полужизни 4(2-бромацетамидо)-ТЕМРО-меченного НВОС в плазме мыши; фиг. 7 А - ЭСР-спектр нитроксидного сигнала, зарегистрированный примерно через 10 мин после инфузии в хвостовую вену мыши 0,5 мл образца, показанного на фиг. 6; фиг. 7 В иллюстрирует уменьшение в зависимости от времени интенсивности сигнала центрального пика (Мо) фиг.7 А, зарегистрированное при 10-кратном увеличе 000618TEMPOL (0,5 мл, игла 32 калибра, мышь),зарегистрированное сразу после инфузии нитроксидов через канюлю в хвостовую вену мыши. ЭСР-спектр образца до инъекции показан на фиг.6; фиг. 8 А представляет серию 5 ЭСР-спектров, зарегистрированных с 0,5 минутными интервалами, при этом, для иллюстрации снижения интенсивности сигнала в зависимости от времени, напряженность магнитного поля после каждого сканирования повышали на 2 Гаусса; фиг.8 В является продолжением фиг. 8 А, т.е., представляет повторную регистрацию серии 6 ЭСР-спектров при том же самом временном интервале, за исключением того, что напряженность магнитного поля после каждого сканирования понижали на 2 Гаусса. Фиг. 9 А и 9 В - соответственно, спектры электронного спинового резонанса (ЭСР),полученные для 4-амино-ТЕМРО-меченно-го структурированного и полимеризованного с о-раффинозой гемоглобина человека, и для 3 малеимидо-РRОХУL-меченногоDBBFгемоглобина, полимеризованного с глутальдегидом. Фиг. 10 А и 10 В - соответственно, ЭСРспектры инкапсулированного в липосомы гемоглобина человека, содержащего (А) 3DOXYL-холестан, (В) 16-DOXYL-стеариновую кислоту; фиг. 10 С - ЭСР-спектр 3DOXYL -холестана и 16- DOXYL -стеарата. Фиг. 11 - ЭСР-спектр 4-амино-ТЕМРОмеченного гемоглобина, конъюгированного с декстраном. Фиг. 12 - вариант осуществления изобретения, в котором фильтровальный картридж содержит твердую матрицу, с которой связан нитроксид и через которую может быть пропущен раствор, содержащий гемоглобин. Фиг. 13 - среднее артериальное давление(MAP) как реакцию крысы на внутривенное вливание 7,8 г/дл 10% об./об. DBBF-Hb отдельно в лактатном растворе Рингера (пунктирная линия) и 7,89 г/дл 10% об./об. DBBFНb + 5 г/дл полинитроксид-альбумина (PNA)+ 100 мМ 10% об./об. TPL (сплошная линия) у крыс, находящихся в сознании. Затем, примерно за 7 дней до начала исследований,крыс оставляли для восстановления после хирургической операции и анестезии. Фиг. 14 - график концентраций TPL в плазме крыс в зависимости от времени после внутривенных инъекций. Образцы плазмы получали от крыс, описанных на фиг. 13. 25 Концентрации TPL определяли путем измерения спиновой плотности в ЭПР. Фиг. 15 А, 15 В и 15 С - соответственно,спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР): 15 А - TPL (2 мМ) в 50 мМ фосфатно-натриевом буфере, рН 7,6; 15 В - TPL (2 мМ) в том же самом буфере; 15 С - полинитроксид-альбумин (PNA). Спектрометрию проводили при следующих условиях: микроволновая мощность-8 мВ; коэффициент усиления - 1,00 е + 0,3; амплитуда модуляции 0,5; частота модуляции - 100 кГц; микроволновая частота - 9,43 ГГц; ширина развертки 200. Фиг. 16 - гистограмму, иллюстрирующую фракцию клеток китайского хомячкаV79, выживших после облучения дозой радиации 12 Грэй. Клетки V79 были предварительно обработаны за 10 мин до рентгеновского облучения. При введении лишь одного ТРН или PNA, какого-либо эффекта противорадиационной защиты не наблюдалось (как видно из гистограммы, в этом случае наблюдалось 2 % выживших клеток, как и в случае контроля без обработки). Как показано на гистограмме, усиление противорадиационной защиты давал образец, содержащий комбинацию ТРН и PNA (8% выживания). Фиг. 17 - превращение ТРН в TPL в присутствии PNA. Фиксированную концентрацию ТРН (25 мМ) смешивали с возрастающими концентрациями PNA в натрийфосфатном буфере (50 мМ, рН 7,6). Затем строили кривую зависимости ТР/ТРН от концентрации PNA. Это отношение определяет коэффициент превращения. КонцентрациюTPL измеряли путем инкубирования 25 мМ ТРН и семи различных концентраций PNA при комнатной температуре в течение 30 мин,с последующим разделением на 10 кДмембране Centroсоn в течение 1 ч при 5000 х г. Интенсивности высоких полевых ЭПРпиков для TPL в фильтрате калибровали с помощью стандартной кривой TPL и строили кривую, показанную на фиг. 17. Фиг. 18 А - непрерывную регистрацию пятнадцати ЭПР-спектров после инъекций в мышиную хвостовую вену; причем, после каждого сканирования, напряженность магнитного поля увеличивали вручную приблизительно на 1 Гаусс. Число сканирований отмечено на пике поля высокого напряжения(М-1/2) для 15N-TPL. Мыши предварительно инъецировали 0,5 мл 40 мМ 15N-ТРL, который восстанавливался до ТРН с периодом полужизни 2 мин (результаты не показаны). Вторая инъекция смеси PNA и 15N -TPL в хвостовую вену мыши показала аналогичную скорость исчезновения 15N- TPL (см. пики 1-5,зарегистрированные через 30- секундные интервалы с периодом полужизни 2 мин.) с последующим таким же быстрым восстановлением интенсивности пика (см. пики 5-7). Интенсивность пика TPL падает с полупериодом 13 мин (см. пики 7-15, зарегистрированные с интервалами 1 мин). Центральный(Мо) широкий резонансный пик (А) полинитроксид-альбумина (PSA), находящийся между двумя скоплениями (М + 1/2 и М -1/2) пиков 15N - TPL (TPL) также обнаруживает затухание с полупериодом 13 мин. Таким образом, использование 15N - TPL ясно проиллюстрировало спиновый перенос от ТРН к 14N нитроксидам на PSA in vivo. Фиг.18 В, 18 С и 18D представляют ЭСР-спектры, иллюстрирующие активацию TOPS тремя различными нитроксидмеченными белками человека. На фиг. 18 В и 18D проиллюстрирована активация TOPS альбумином, меченным различными видами нитроксида. Фиг.18 С представляет меченный нитроксидом переносчик кислорода на основе гемоглобина. Фиг. 18 В: (1) только 50 мМ TOPS; (2) только 43 мМ PNA; (3)TPL и ТРН в мышах 57 в присутствии или отсутствии PNA. Были построены кривые временной зависимости (мин) уровней TPL (в условных единицах) в плазме, определенных путем мониторинга интенсивности пика сильного поля:один ТР L (2 мМ), внутривенное введение;275 мг/кг TPL, внутрибрюшинное введение; иPNA, внутривенное введение, а затем 100 мг/кг ТРН,внутрибрюшинное введение. Фиг. 20 иллюстрирует 30-дневное исследование на выживание мышей С 57 (10 мышей на группу (N = 10, подвергнутых облучению дозой радиации 10 Грэй после обработки 0,5 мл/мышь PNA путем внутривенного введения, а затем, через 10 мин, PBS(x). Фиг. 21 иллюстрирует 30-дневное исследование на выживание мышей С 57, подвергнутых облучению дозой радиации 10 Грэй после обработки 0,5 мл/мышь PSA путем внутривенного введения, а затем, через 10 мин, буфером PBS (s); 0,5 мл PBS, а за 27 тем, через 10 мин, 200 мг/кг TPL, путем внутрибрюшинного введения (q); 0,5 мл/мышь полинитроксид-альбумина путем внутривенного введения, а затем, через 10 мин, 50 мг/кгTPL и полинитроксидальбумином. Изображение конструировали с использованием 144 проекций, полученных через 2,5 ч после ишемии. На Фиг. 22 В показано то же самое изображение в усеченном виде. Сбор данных проводили по следующим параметрам: спектральное окно прозрачности- 7,0 Г; пространственное окно - 25 мм; максимальный градиент - 49,3 Г/см. Фиг. 23 представляет ЭПР - изображение (25 х 25 мм 2) сердца крысы, нагруженного TPL и PNA, при этом, время указывается по мере продолжения ишемии (156 мин), а изображение является трехмерным. Сбор данных проводили по следующим параметрам: время сбора - 10 мин; спектральное окно Фиг. 24 иллюстрирует интенсивность ЭПР- сигнала 15N-Темро 1 в двух ишемических сердцах в зависимости от времени продолжения ишемии. Верхняя кривая относится к сердцу, обработанному 2 мМ TPL + PNA(q), а нижняя кривая относится к сердцу, обработанному одним TPL (2 мМ) (s). Сплошные линии представляют двойную экспоненциальную аппроксимацию полученных данных интенсивности. Полупериоды составляют 0,4 мин, 2,9 мин (s), и 3,3 мин, 30,1 мин(q), соответственно. Фиг. 25 представляет двухмерное ЭПРизображение (25 х 25 мм 2) в поперечном сечении для поперечных срезов сердца крысы,нагруженного TPL + PNA, в зависимости от продолжительности ишемии, при этом время указано в цифрах (мин : с) на каждой фотографии. Эти фотографии были получены, исходя из трехмерного пространственного изображения. Параметры по сбору данных были теми же, что и параметры, описанные на фиг. 23. Фиг. 26 иллюстрирует измерение восстановления коронарного кровотока в необработанном контрольном сердце (О), в сердце, обработанном 2 мМ TPL (q), и в сердце,обработанном PNA (4 г/дл) + 2 мМ TPL (v). Сердце подвергали 30-минутной глобальной ишемии с последующим 45-минутным восстановлением кровотока. Фиг. 27 иллюстрирует измерение восстановления продукта пульсового давления(РРР) в сердце необработанного контроля (О),в сердце, обработанном 2 мМ TPL (q), и в сердце, обработанном PNA (4 г/дл) + TPL (2 мМ) (v). Сердца подвергали 30-минутной глобальной ишемии с последующим 45 минутным восстановлением кровотока. Фиг. 28 представляет график, изображающий кривые зависимости интенсивности ЭПР-сигнала для TEMPOL от продолжительности ишемии в сердце, обработанном 15NTPL+PNA, где указанные интенсивности были получены, исходя из изображений, описанных на фиг. 25. Эти интенсивности были получены в конкретных положениях соответствующих трехмерных пространственных изображений, а именно: LAD (q), аорта (s),LV -апекс (w), и ткань (v). Фиг. 29 иллюстрирует среднее артериальное давление (MAP) как реакцию на внутреннее вливание 7,8 г/дл 10 % об./об. DBBF Нb + 7,5 г/дл PNA + 100 мМ 10 % об./об. TPL(n = 4) мышам, находящимся в активном состоянии. За семь дней до начала исследования, крыс оставляли для восстановления после хирургических операций и анестезии. Фиг. 30 иллюстрирует снижение неврологических расстройств у мышей, обработанных PNA. Животных подвергли 1-часовой локальной церебральной ишемии путем окклюзии средней мозговой артерии(МСА)/общей сонной артерии (ССА) с последующей реперфузией. Животных обрабатывали PNA (Рге PNA) или альбумином сыворотки человека (HSA) перед началом ишемии или непосредственно после реперфузии (PostPNA, Post HSA), и через 24 ч после реперфузии оценивали неврологический статус. ДозаPNA или альбумина сыворотки человека составляла 0,5 % по массе тела, об./мас. Фиг. 31 иллюстрирует снижение объема инфаркта у мышей, обработанных PNA. Животных подвергали 1-часовой локальной церебральной ишемии путем окклюзии МСА/ССА с последующей реперфузией. Животных обрабатывали PNA (Pre PNA) или альбумином сыворотки человека (Pre HSA) перед началом ишемии или непосредственно после реперфузии (Post PNA, Post HSA), а затем, через 24 ч после реперфузии животных умерщвляли для проведения гистологического анализа. Доза PNA или сывороточного альбумина составляла 0,5 % об./мас. по массе тела. Объем инфаркта вычисляли путем интегрирования площадей участков инфаркта в серийных коронарных срезах, взятых через 0,5 -миллиметровые интервалы от передней верхней части головного мозга. Результаты выражали как средние величиныср. кв. ош.,n = 7. Фиг. 32 иллюстрирует снижения % инфаркта у мышей, обработанных PNA. Животных подвергали 1-часовой локальной церебральной ишемии путем окклюзии МСА/ССА с последующей реперфузией. Животных об 29 рабатывали PNA (Pre PNA) или альбумином сыворотки человека (Pre HSA) перед началом ишемии или сразу после реперфузии (PostPNA, Post HSA), а затем, через 24 ч после реперфузии, животных умерщвляли для проведения гистологических анализов. Доза PNA или альбумина составляла 0,5 % по массе тела, v/2. Процент инфаркта вычисляли по формуле: (объем инфаркта/объем ипсилатерального (на той же стороне) полушария) х 100. Результаты выражали как средние величиныср. кв. ош., n = 7. Фиг. 32 А иллюстрирует количественную оценку апоплексических повреждений в серийных срезах головного мозга контрольных мышей по отношению к повреждениям головного мозга PNA -обработанных мышей. Серии коронарных гистологических срезов(толщиной 20 мкм) делали с интервалами 500 мкм от передней верхней части головного мозга, и церебральную ишемию оценивали как площадь инфарктной зоны (мм 2, среднее значениеср. кв. ош.,) на один срез. Разница в значениях площади инфаркта, полученных для PNA - обработанных мышей (q) и для контрольных мышей (s), равна площади между двумя кривыми (р 0,05 по т-критерию Стьюдента). Фиг. 33 иллюстрирует снижение гипертрофии полушария у мышей, обработанныхPNA. Животных подвергали 1-часовой локальной церебральной ишемии путем окклюзии МСА/ССА с последующей реперфузией. Животных обрабатывали PNA или альбумин сыворотки человека (HSA) перед началом ишемии (Рге PNA или Pre HSA) или сразу после реперфузии (Post PNA или Post HSA), а затем, через 24 ч после реперфузии, животных умерщвляли для проведения гистологических анализов. Доза PNA или альбумина составляла 0,5% по массе тела, об./мас. Процент гипертрофии полушария вычисляли по формуле: (объем ипсилатерального полушария - объем контралатерального полушария объем контралатерального объема) х 100. Результаты выражали как средние величиныср. кв. ош., n = 7. Фиг. 34 А и 34 В представляют характерные коронарные срезы, обнаруживающие уменьшение церебрального инфаркта у PNA обработанных мышей по сравнению с контрольными мышами, подвергнутыми локальной церебральной ишемии (1 ч) и реперфузии(24 ч). Срезы толщиной 20 мкм окрашивали крезиловым фиолетовым, который плохо поглощается ишемической тканью. На фиг. 34 А изображен срез, полученный из головного мозга необработанного животного, и обнаруживающий массивные ишемические повреждения (неокрашенные области), в основном,всего полушария. В этом полушарии, по сравнению с противоположным полушарием того же самого головного мозга, имеют место отеки, наблюдаемые в виде гипертрофии пораженного инфарктом полушария. На фиг. 34 В изображен срез, который был получен из головного мозга PNA - обработанного животного, и который обнаруживал нормальную гистологию и отсутствие отека. Это свидетельствует о том, что PNA обеспечивает защиту от повреждения головного мозга после апоплексии. На фиг. 34 С показаны характерные гистологические срезы, иллюстрирующие уменьшение повреждения после апоплексии у PNA-обработанных мышей по сравнению с контрольными мышами. Животные были подвергнуты локальной церебральной ишемии (1 ч), а затем реперфузии (24 ч). Обработанные мыши получали внутривенноPNA до начала ишемии и в начале реперфузии. Каждая доза составляла 1% по массе тела(об./мас.). Для иллюстрации степени ишемического поражения тканей делали коронарные срезы (толщиной 20 мкм) с интервалами в 500 мкм, начиная от передней части головного мозга, и окрашивали их крезиловым фиолетовым. Ишемические участки тканей не окрашивались. У необработанных животных(левая панель) наблюдались ишемические повреждения, в основном, всего полушария. Резкий контраст наблюдался в случае PNAобработанных животных (правая панель),которые обнаруживали нормальную гистологию всего головного мозга. Фиг. 35 представляет серию окрашенных коронарных срезов головного мозгаPNA-обработанной крысы, которые окрашивали после 2-часовой окклюзии МСА путем наложения хирургического шва. Фиг. 36 - серию окрашенных коронарных срезов головного мозга контрольного животного (обработанного физиологическим раствором), которые окрашивали после 2 часовой окклюзии МСА путем наложения хирургического шва. Фиг. 37 А и 37 В - гистологические анализы для определения объема инфаркта и процента инфаркта у крыс после кратковременной окклюзии МСА и введения физиологического раствора, альбумина сыворотки человека, и PNA. Фиг. 38 иллюстрирует спиновую плотность крови крыс, измеренную как функцию времени после трех инъекций PNA, вводимых с интервалами в 2 ч. Фиг. 39 иллюстрирует диффузионномассовое изображение магнитного резонанса головного мозга крысы во время окклюзии и реперфузии МСА. Фиг. 40 А, 40 В и 40 С представляют ЭПРспектры РNА и 15N-ТРL в коже спинки анестезированной мыши. 100 мкл PNA внутрикожно инъецировали в спинку анестезиро 31 ванной мыши и регистрировали спектр, показанный на фиг. 40 А. Затем инъецировали 15NТРL (1 % об/масс., 20 мг/мл) внутривенно, и через 1 мин регистрировали спектр, показанный на фиг. 40 В. После этого, через 30 мин снова регистрировали спектр, который показан на фиг. 40 С. Фиг. 41 иллюстрирует фармакокинетику внутривенного 15N-TPL (1% об./мас.), измеренную в бляшке на спинке мыши, куда был внутрикожно инъецирован РNА. Затем строили кривую зависимости интенсивности 15N-ТРL-пика слабого поля от времени. То есть, строили график зависимости 15N-TPLпика от времени. После инъекции 15N-ТРLсигнал возрастал, а затем через 5 мин резко падал, что свидетельствовало о биологическом восстановлении. Как видно из фиг. 41, в присутствии PNA, 15N-TPL-сигнал стабилизировался через 5 мин после инъекции PNA, и оставался стабильным в течение, по крайней мере, 30 мин, что свидетельствовало об окислительном действии PNA. Фиг. 42 А и 42 В иллюстрирует фармакокинетику внутривенного 15N-TPL (1 % об./мас.), измеренную в некротическом участке кожи брюшной полости мыши. (А) Интенсивность пика слабого поля возрастала, а затем в течение 5 мин после инъекции 15NTPL падала. (В) Возрастание интенсивности 15N-TPL как функции времени наблюдалось в течение, по крайней мере, 30 мин после внутрикожной инъекции 100 мкл PNA. Фиг. 43 иллюстрирует степень выживания в течение 10 дней экспериментальных животных, у которых был моделирован рабдомиолиз (острая патология скелетных мышц, сопровождающаяся их некрозом), вызванный инъекцией глицерина в мышцу, с последующей почечной недостаточностью,после введения полинитроксидальбумина сTEMPOL и альбумина в качестве контроля. Подробное описание изобретения Нитроксиды представляют собой стабильные свободные радикалы, которые, как было показано, обладают противоокислительной каталитической активностью, имитирующей активность супероксиддисмутазы(SOD), и которые, в случае их присутствия invivo, могут взаимодействовать с другими соединениями с активностью, имитирующей активность каталазы. Ранее, нитроксиды использовали в спектроскопии электронного спинового резонанса в качестве "спиновых меток" для изучения конформационных и кинематических характеристик биологических макромолекул. Нитроксиды были также использованы для обнаружения реакционноспособных промежуточных свободных радикалов, поскольку их химическая структура имеет стабильный неспаренный электрон с хорошо определенным сверхтонким взаимо 000618 действием. Кроме того, было выявлено, что нитроксиды действуют как имитаторы ферментов, а именно, некоторые низкомолекулярные нитроксиды были идентифицированы как имитаторы активности супероксиддисмутазы (SOD). (A. Saimuni et. al. J. Chem. Biol.,263: 17921 (1988 и каталазы (R. J. Mehlhornet al. Free Rad. Res. Comm., 17: 157 (1992. Многочисленные исследования также показали, что нитроксиды, которые проникают через клеточную мембрану, способны обеспечивать продолжительную защиту клеток млекопитающих от цитотоксичности супероксиданиона, генерируемого гипоксантин/ ксантиноксидазой, и от воздействия пероксида водорода. Используемый в настоящем описании термин "нитроксид" относится к стабильным нитроксидным свободным радикалам, включая соединения, содержащие нитроксильные группы, такие, как синтетические полимеры,их предшественники (такие, как N-Н-форма),и их производные, например, соответствующие гидроксиламиновые производные (NOH), в которых атомы кислорода заменены гидроксильной группой и которые присутствуют в галогенводородной форме. В целях настоящего изобретения обычно предпочтительной является хлоридная соль гидроксиламиновых производных. В нитроксидах, описанных в настоящей заявке, неспаренный электрон является стабильным отчасти оттого, что азотное ядро связано с двумя атомами углерода, которые замещены сильными донорами электронов. В случае, если кислород в N-О-связи имеет парциальный отрицательный заряд, то два смежных атома углерода вместе обеспечивают локализацию неспаренного электрона на азотном ядре. В основном, нитроксиды имеют либо гетероциклическую, либо линейную структуру. Фундаментальным критерием их структуры является стабильный свободный радикал. Структурно предпочтительными являются нитроксиды, имеющие нижеприведенную формулу, где R1- R4 являются донорами электронов, а А представляет остальные члены гетероциклического кольца. В этих гетероциклических структурах,"А" представляет остальные атомы углерода 5-членной (т.е., пирролидиниловой или РРОХУL с одной двойной связью,т.е., пирролиновой) или 6-членной (т.е., пиперидиниловой или TEMPO) гетероциклической структуры, в которой один атом углерода может быть замещен атомом кислорода (оксазолинил илиDOXYL), а некоторые атомы водорода могут быть замещены одним или двумя атомами брома. В таких гетероциклических структурах могут быть использованы стабильные изотопы (например, 15N, дейтерий). Замещение у -углеродов должно быть таким, чтобы,в основном, неспаренный электрон поддерживался в p-орбитальной конфигурации. R1R4 представляют алкильные группы (с прямой или разветвленной цепью) или арильные группы, однако, предпочтительными являются метильные или этильные группы. Для повышения стабильности, группы-заместители на -углеродах в любом нитроксиде должны быть сильными донорами электронов, и такими предпочтительными заместителями являются метильные группы (СН 3) или этильные группы (С 2 Н 5), хотя могут быть использованы и другие, более длинные углеродные цепи. См., например, патент США 5 462 946. Кроме того, специалистам известны и другие структуры, которые защищают от реактивности свободных радикалов, и которые необходимо в дальнейшем синтезировать. См. например, Bolton et al., "An EPR and NMR(16), 2345-2349 (1994). При связывании с биологически совместимыми макромолекулами настоящего изобретения, реакционная способность нитроксида, благодаря микроокружению, изменяется. Эта реакционная способность может быть заранее скорректирована в соответствии с применяемой схемой мечения и посредством реакции с другими соединениями, такими, как селен, который, как известно, способен влиять на стабильность или реактивность свободного радикала. Фактически, выбор нитроксидных соединений, которые являются эффективными с практической и экономической точки зрения, может быть ограничен изза стерических затруднений этих соединений. Предпочтительные нитроксиды, используемые в целях настоящего изобретения, имеют следующую структуру. Как показано выше, большинство подходящих нитроксидных соединений может быть, в основном, представлено структурной формулой где группу R выбирают из конфигураций,которые сохраняют стабильность свободного радикала. Как указывалось выше, структурная форма нитроксида может варьироваться, сохраняя при этом, свою основную функцию. Функциональные группы нитроксидов могут быть также введены в димеры, тримеры, такие как ВЗТ, описанные ниже, олигомеры,или полинитроксидные синтетические полимеры, имеющие множество повторяющихся субъединиц, каждая из которых содержит, по крайней мере, один нитроксид. Предпочтительный синтетический полимер содержит нитроксиды и карбоксильные группы в каждой из своих субъединиц. Так, например, нижеследующее соединение может быть синтезировано известными методами, описанными,например, в патенте США 5 407 657, из диаминового соединения и диангидрида: В целях настоящего изобретения, нитроксидную группу полимера, описанного в патенте США 5 407 657, предпочтительно заменяют бромо-ТЭМРО. Такие синтетические полимеры могут быть использованы для мечения гемоглобина, в частности, нативного гемоглобина, путем синтеза соединения с небольшим избытком диамина и получения свободной аминогруппы на конце полимера. Концевая аминогруппа реагирует с нейтрофильной группой, такой, как бромоацетабромид, в результате чего получают нитроксидное полимерное производное Бромо-ТЕМРО,которое может быть использовано для мечения аминогрупп белка, аналогичного белкам РNА и PNH. Был описан ряд методов ковалентного связывания нитроксида с биологическими макромолекулами, включая гемоглобин, альбумин, иммуноглобулины и липосомы. См.,например, МсСоnneil et al., Quart. Rev. Biophys. 3: p. 91 (1970); Hamilton et al., "StructuralSwarth, H. M. et al., eds., Wiley/Interscience,New York, p. 483 (1972). Для изучения механизмов кооперативного связывания кислорода гемоглобином, отобранные нитроксиды 35 были ковалентно связаны с молекулами гемоглобина. Что касается макромолекул, описанных в настоящей заявке, то для их связывания с нитроксидами могут быть использованы два способа, обычно называемые "стратегиями мечения". В специфическом мечении важную роль играет микроокружение, в котором нитроксид связывается с макромолекулой, в результате чего нитроксид приобретает каталитическую активность. Специфическое мечение в конкретном лигандсвязывающем сайте или сайтах приводит к получению гомогенного продукта, имеющего микроокружение с более подходящими сайтами связывании, а значит и более надежного соединения с точки зрения каталитической специфичности и активности нитроксида. Используемый в настоящей заявке термин "гемоглобин" включает окси-, карбокси-,карбомонокси - и дезоксигемоглобин, если только, это конкретно не оговаривается в контексте описания. Гемоглобин, используемый в настоящем изобретении, может быть нативным гемоглобином человека или животного, либо рекомбинантным гемоглобином, и может быть выделен или очищен известными способами. Гемоглобин может быть ковалентно связан с пиридоксальными группами пиридоксал-5-фосфата или аденозинтрифосфата (о-АТР) с разомкнутым кольцом посредством реакции с альдегидными группами и перекрестно сшитыми производными гемоглобина. Такими перекрестно сшитыми производными могут быть полифункциональные, гетеробифункциональные и гомобифункциональные перекрестносшивающие реагенты, такие как диальдегид, полиальдегид, диэпоксид, полиэпоксид, активированные поликарбоксильные и дикарбоксильные группы,например,3,5-бисбромосилицил-бифумарат,и ТЕМРОсукцинат или ТОРS (см. патент США 4 240 797) циклодекстраны, а также сшитый с ними анионный (например, сульфат) гемоглобин, и полимеризованный гемоглобин. Стабилизированный гемоглобин может быть получен в виде микросфер, имеющих перекрестно сшитый внешний слой, продуцированный путем перекрестного сшивания цистеиновых остатков, присутствующих в белке ( VivoRx Pharmaceuticals, Inc., Santa Monica, CA). Все растворы гемоглобина, описанные в настоящей заявке, и все другие нитроксидсодержащие растворы, например, растворы в других соединениях настоящего изобретения, описанные в настоящей заявке, вводят в физиологически приемлемой форме, например, в виде физиологически приемлемого внутривенного раствора или суспензии в подходящем носителе, растворителе или основании. Растворы гемоглобина являются бесклеточными, а по 000618 этому не содержат пирогенов, эндотоксинов и других примесей. Предпочтительные композиции с использованием нитроксида, связанного с альбумином, получают путем: 1) неспецифического мечения альбумина нитроксидом(например,4-(2 бромацетамидо)-TEMPO) с высоким отношением нитроксида к альбумину; 2) специфического мечения альбумина в лиганд-специфических сайтах связывания; и 3) интенсивного мечения альбумина путем восстановления и алкилирования) дисульфидных связей. Используемый в настоящем описании термин "альбумин" означает альбумин сыворотки человека, альбумин животного, рекомбинантный альбумин, и их фрагменты. Для повышения доступности сайтов мечения,альбумин может быть подвергнут термической или химической обработке. Кроме того,альбумин может присутствовать в форме мономера, димера и полимера, либо он может быть инкапсулирован в микросферы. Альбумин, описанный в данной заявке, может быть также обработан полиэтиленгликолем (ПЭГ) в соответствии с хорошо известной техникой в целях повышения его имунной совместимости. Предпочтительным способом ослабления окислительного стресса путем усиления противоокислительной реакции организма является использование многокомпонентной системы на основе нитроксида. Первым компонентом этой системы является нитроксид,способный проникать через мембрану, такой как TEMPOL. Благодаря своим зарядным характеристикам и небольшим размерам, низкомолекулярные несвязанные нитроксиды легко проникают через клеточную мембрану и попадают в межклеточное пространство. Вторым компонентом указанной системы является другая нитроксидсодержащая молекула, такая, как биологически совместимая макромолекула, меченная нитроксидом с высоким молярным отношением нитроксида(полинитроксида), например, альбумин сыворотки человека, меченный при молярном отношении TEMPOL, составляющим 30:1. Использование многокомпонентной нитроксидсодержащей системы настоящего изобретения способствует снижению токсичности,которая может быть вызвана большими, концентрированными или повторными дозами низкомолекулярного проникающего через мембрану нитроксида. Поскольку гидроксиламиновая форма нитроксида является неактивной в качестве антиксиданта, и поскольку токсичность нитроксида в высоких дозах,вероятно в первую очередь, обусловлена противоокислительной активностью, вызывающей нарушение окислительно-восстано 37 вительного потенциала клетки, то нитроксид в гидроксиламиновой форме является гораздо менее токсичным, чем соответствующий невосстановленный нитроксид. Таким образом,один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к использованию нетоксичной дозы проникающего через мембрану нитроксида в сочетании с макромолекулярным полинитроксидом в целях активации in vivo нитроксида, который был восстановлен до неактивной формы. Аналогичным образом, гидроксиламин может быть введен в качестве нетоксичного предшественника, который превращается in vivo в активный антиоксидант. В результате такого использования достигается безопасное и пролонгированное терапевтическое действие сильного антиоксиданта в организме. Что касается in vivo - безопасности, то уровни нитроксида, которые могут быть введены в соответствии с настоящим изобретением, хорошо переносятся животными, и очевидно будут хорошо переноситься человеком, поскольку известно, что нитроксиды являются относительно безопасными. Так,например, максимально допустимая дозаTEMPO для внутрибрюшинного введения мышам составляет 275 мг/кг, a ND50 составляет 341 мг/ кг. Кроме того, связанный с макромолекулой нитроксид является более безопасным, чем свободный нитроксид в его активной форме. Меченные нитроксидом макромолекулы настоящего изобретения, используемые в комбинации со свободным нитроксидом, будут способствовать снижению полного количества нитроксида, который,однако, необходимо вводить в организм для достижения противоокислительного эффекта. Еще одно преимущество меченных нитроксидом макромолекул, используемых в противоокислительных композициях настоящего изобретения, заключается в их способности обеспечивать высокие активные уровни нитроксидов в их активной антиоксидантной форме с повышенной безопасностью. Большинство нитроксидов, исследованных до настоящего времени в живых организмах, являются относительно низкомолекулярными соединениями, которые могут легко проникать через клеточные мембраны в ткани организма. Связанные с макромолекулами нитроксиды настоящего изобретения могут быть введены внутривенно и могут оставаться заключенными в васкулярном компартменте благодаря неспособности макромолекул проникать через мембраны. В этом варианте осуществления изобретения, нитроксид, ковалентно связанный с макромолекулой, будет способствовать снижению токсичности свободного радикала, ограничивая при этом локализацию нитроксида, т.е., областью сосуда, где действие нитроксида оптимизировано. После инъекции TEMPOL быстро диффундирует во внутриклеточное пространство,где он восстанавливается до гидроксиламимовои формы в процессе детоксификации(окисления) свободных радикалов. В процессе захвата неспаренного электрона из токсического свободного радикала, нитроксид восстанавливается до оксоаммониевого промежуточного соединения. После этого реакция оксоаммониевого промежуточного соединения может происходить двумя путями. Это промежуточное соединение может быть снова окислено до нитроксида благодаря спонтанной передаче электрона от свободных радикалов присутствующему в определенном количестве натуральному соединению; этот путь может квалифицироваться как ферментимитирующий процесс, поскольку, в конечном счете, нитроксид остается неизменным. Альтернативно, оксоаммониевое промежуточное соединение может быть подвергнуто дальнейшему восстановлению до гидроксиламина. Гидроксиламин не является парамагнетиком (то есть, он не дает сигнала при ЭПР-спектроскопии) и не обладает противоокислительной каталитической активностью,присущей активному нитроксиду. Реакционное равновесие in vivo в значительной степени благоприятствует восстановлению с образованием гидроксиламина. Благодаря своей высокой способности проникать через мембрану и инертнохимической структуре, гидроксиламин также свободно распределяется во внутриклеточном и внеклеточном пространстве, и сохраняется в организме в течение относительно продолжительного периода времени. Однако, после восстановления нитроксида в гидроксиламин, его противоокислительная активность теряется. В процессе детоксификации свободных радикалов, TEMPOL (4-гидроксил-2,2,6,6 тетра-метил-пиперидин-N-оксил) быстро утилизируется и восстанавливается до оксоаммониевого промежуточного соединения,которое затем может снова окисляться до нитроксида, либо подвергаться дальнейшему восстановлению до гидроксиламина. Таким образом, биологическая трансформация нитроксида (в процессе детоксификации свободных радикалов) приводит к образованию гидроксиламина. Гидроксиламин не является парамагнетиком (то есть, он не дает сигнала при ЭПР-спектроскопии) и не обладает противоокислительной каталитической активностью нитроксида. Использование одногоTEMPOL, не дает терапевтического эффекта,поскольку он быстро превращается в гидроксиламин и может быть токсичным в дозах,необходимых для достижения значимого противоокислительного эффекта. 39 Однако гидроксиламин является химически стабильным и относительно персистентным in vivo (структура молекулы нитроксида является относительно инертной), и как уже указывалось выше, он может снова превращаться в активную форму нитроксида. Такое in vivo-превращение обеспечивает безопасное клиническое использование нитроксидов для достижения пролонгированного противоокислительного эффекта. Кроме того,как указывалось выше, неспаренный электрон нитроксильной группы позволяет, помимо нитроксидов с противоокислительной активностью, получить нитроксиды с другими полезными свойствами. В частности, нитроксиды в форме свободных радикалов являются парамагнитными зондами, ЭПР-сигнал которых может отражать метаболическую информацию, например, давление кислорода и окислительно-восстановительный статус тканей, в биологических системах. Поскольку природные неспаренные электроны практически отсутствуют in vivo, то ЭПРвизуализация имеет еще и то преимущество,что полученные в данном случае изображения не имеют фонового шума. Нитроксиды также снижают время релаксации водородных ядер, а поэтому они могут быть использованы в качестве контрастных агентов при визуализации протонного или ядерного магнитного резонанса (МР 1). Кроме того, нитроксиды могут быть также использованы в качестве контрастных агентов для получения метаболических данных в дополнение к уже имеющейся информации, полученной методами МР 1. Так, например, путем замещения функциональных групп, присутствующих в нитроксиде, можно изменять его свойства,например, такие, как способность к релаксации, растворимость, биологическое распределение, стабильность in vivo, и толерантность. Усиление контрастности, достигаемое при использовании нитроксида, может повысить эффективность МР 1 путем дифференциации тканей, имеющих одинаковую интенсивность, но отличающихся гистологически, и благодаря облегчению локализации и характеризации нарушений, таких как нарушение гематоэнцефалического барьера, абсцессы и опухоли. Макромолекулярные полинитроксиды благодаря своей большой молекулярной массе и низкой мембранопроникающей способности, имеют тенденцию к распределению во внеклеточном пространстве, и не могут быть легко восстановлены под действием биохимической среды. Однако было установлено,что макромолекулярный нитроксид способен акцептировать электрон от гидроксиламина,что приводит снова к in vivo -превращению в нитроксид, обладающий противоокислительной активностью. Этот процесс обеспечивает эффективную передачу противоокислительной активности от малоподвижных макромолекул, присутствующих во внеклеточном пространстве, и обладающих высокой противоокислительной способностью к высокоподвижному и проникающему через мембрану нитроксиду, который способен пересекать клеточную мембрану и обеспечивать внутриклеточную противоокислительную активность. Как только нитроксид попадает вовнутрь клетки, он восстанавливается до гидроксиламина благодаря окислению токсичных свободных радикалов, после чего он выходит во внеклеточное пространство, где он снова активируется под действием макромолекулярного полинитроксида. Кроме того,реакционная способность макромолекулярного полинитроксида может быть усилена путем добавления других соединений, таких как селен. Поэтому, особенно предпочтительная нитроксидсодержащая композиция может быть получена путем связывания с высоким молярным отношением, нитроксида с макромолекулой (полинитроксидом) с последующим введением связанного нитроксида в контакт с терапевтически активным количеством несвязанного низкомолекулярного нитроксида in vivo, в результате чего получают каталитически активную полинитроксидную макромолекулу. Взаимодействие терапевтически активного нитроксида с каталитически активным нитроксидом обеспечивает пролонгированное противоокислительное действие,противолучевое действие, визуализирующее действие и т.п. в окружающих тканях. Фактически, макромолекулярная форма является"хранилищем" противоокислительной активности и может наделять активностью низкомолекулярную форму нитроксида, способную пересекать клеточную мембрану. Такой принцип "симбиоза", положенный в основу получения композиции, раскрываемой в настоящем описании, позволяет использовать преимущественные методы введения, такие как местное применение макромолекулярного нитроксида в сочетании с пероральным введением низкомолекулярного нитроксида, в результате чего достигается локальный пролонгированный противоокислительный эффект. Экспериментальные результаты и данные, полученные для различных композиций,представленных в настоящей заявке, показали, что нитроксидсодержащие соединения настоящего изобретения обнаруживают противоокислительную, противолучевую, антигипертензивную и спектроскопическую активность in vitro и in vivo. Исходя из этих результатов можно утверждать, что механизм, в соответствии с которым полинитроксидмеченные макромолекулы и свободные 41 нитроксиды участвуют в окислительновосстановительной реакции свободных радикалов, достаточно ясно продемонстрировал возможность получения новых НВОС и других нитроксидсодержащих макромолекул в целях детоксификации свободных радикалов,которые могут быть преимущественно использованы для диагностики и лечения широкого ряда физиологических состояний. Кроме того, в настоящей заявке описаны нитроксидсодержащие соединения, которые ассоциируются с контейнерами для хранения или введения фармацевтических средств, таких, как внутривенные растворы, препараты для местного применения, и другие. Нитроксидсодержащие соединения могут быть внесены в твердой или жидкой форме вовнутрь контейнера, либо они могут быть ковалентно связаны с внутренней поверхностью контейнера. Один из предпочтительных способов введения заключается в добавлении нитроксидсодержащих соединений (вместе или без свободного нитроксида) в проходной фильтр,используемый при введении жидкостей. Так,например, полинитроксид-альбумин может быть введен в фильтр вместе со свободным нитроксидом, либо он может быть связан с нерастворимой матрицей, находящейся в фильтре, используемом для введения внутривенных растворов, таких, как существующие НВОС, в целях поглощения ассоциированных с токсическим кислородом соединений перед инфузией пациенту.HRCS-композиции и нитроксидмеченные макромолекулы, описанные ниже, препятствуют образованию ассоциированных с токсическим кислородом соединений благодаря тому, что они "заставляют" нитроксид действовать как "супероксидоксидаза", т.е. в соответствии с ферментативно-подобной реакцией, которая, как известно, не происходит в эритроцитах. В этих HRCS -композициях,нитроксид предупреждает аккумуляцию нежелательного супероксиданиона, продуцируемого в результате самоокисления гемоглобина (см. Уравнение (1. Меченные нитроксидом макромолекулы, такие, как альбумин и иммуноглобулины обнаруживают аналогичное противоокислительное действие,имитирующее действие фермента; причем.,также, как и ферменты, они действуют в васкулярных и интерстициальных участках, и могут реагировать с проникающими через мембрану нитроксидами, обеспечивая, тем самым, внутриклеточную защиту. Предпочтительные композиции, полученные с использованием нитроксида, связанного с иммуноглобулинами, содержат нитроксид-меченный гаптен или антиген,связанный с иммуноглобулином, специфичным для гаптена или антигена. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, полезное терапевтическое действие нитроксидных соединений может регулироваться и продлеваться. Так, например,нитроксид ТОРS (2,2,6,6-тетраметил-1-оксил 4-пиперидилиден-янтарная кислота) может быть связан с сайтом связывания первичного билирубина сывороточного альбумина человека. In vivo, такое связывание продлевает время полужизни в плазме и замедляет диффузию нитроксида во внутриклеточное пространство, что позволяет уменьшить необходимую дозу (а значит и уменьшить потенциальную токсичность) и продлить биологическую активность. Таким образом, нитроксиды, такие как ТОР могут быть использованы даже отдельно, то есть, без макромолекулярного полинитроксида, в качестве антиоксидантов. В соответствии с настоящим изобретением, могут быть выбраны или сконструированы такие носители, которые могут обеспечить доставку нитроксидов к конкретным участкам организма, что будет способствовать локализации терапевтической противоокислительной активности на этих участках. Поскольку нитроксиды имеют стабильную химическую природу, то композиции,раскрытые в настоящей заявке, могут быть введены различными путями. Проникающие через мембрану нитроксиды могут быть введены парентерально или перорально. Восстановленная форма нитроксида, т.е., гидроксиламин, может оказывать локальное действие в желудочно-кишечной (GI) системе, либо он может быть поглощен кровотоком. Таким образом, пролонгированная противоокислительная активность может быть обеспечена во всех участках организма. Макромолекулярный полинитроксид может быть введен парентерально, после чего, он останется локализованным во внеклеточном пространстве,где он будет реактивировать восстановленный свободный нитроксид; либо он может быть введен перорально или местно/чрезкожно, и в этом случае, он будет активировать циркулирующий восстановленный нитроксид, обеспечивая, тем самым локальный противоокислительный эффект. Очевидно, что отдельная реактивность макромолекулярного полинитроксида на основе белка и проникающего через мембрану нитроксида может быть усилена путем нагревания макромолекулы и ее мечения в первичных аминогруппах в полипептидной цепи. Известно, что нагревание изменяет конформацию макромолекулы, удлиняя водородные связи между аминогруппами и карбоксильными группами, и образуя измененную макромолекулярную четвертичную структуру. Последующее ковалентное мечение нитроксидами у аминогрупп может происходить в относительно внутренних сайтах на белке, 43 которые становятся более доступными в результате нагревания. В полученной таким образом меченной нитроксидом макромолекуле, нитроксидные части становятся более защищенными от реакции с растворителем. Кроме того, если нитроксиды связываются с большим количеством аминогрупп на белке,то преобладание оставшихся карбоксильных групп создает кислое микроокружение вокруг связанного нитроксида. Кислое окружение повышает реакционную способность нитроксида путем втягивания неспаренного электрона в N-О к атому кислорода. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, который относится к заменителю эритроцитов, необходимым свойством нитроксидов является их способность влиять на ход каскада реакций супероксиданиона с HRCS (HRCS = заменитель эритроцитов человека) путем имитации активностей супероксидоксидазы, супероксиддисмутазы, и каталазы; при этом, поглощения нитроксидов в процессе реакций почти не происходит. В "супероксидоксидазной" реакции, супероксиданион снова окисляется до молекулярного кислорода без предшествующего образования пероксида водорода. Это осуществляется частично путем создания условий хранения, при которых концентрация нитроксида значительно превышает концентрацию кислорода. В соответствии с используемым в настоящем изобретении способом, нитроксид предупреждает каскад нежелательных окислительных реакций, которые начинаются с образования супероксид-аниона. Кроме того,физиологически совместимые HRCS - растворы, описанные в настоящей заявке, имеют преимущество перед уже существующими НВОС-растворами, которое заключается в том,что нитроксид имитирует ферментативную активность супероксиддисмутазы и каталазы после введения пациенту композиции,описанной в настоящей заявке. В настоящем изобретении могут быть использованы нитроксиды широкого ряда,однако, выбранный нитроксид должен быть физиологически приемлемым в минимальной концентрации, требуемой для снижения токсичности кислорода. При этом следует отметить, что оценка имеющихся видов нитроксидов показала, что относительно низкая токсичность нитроксидов стимулировала их использование в качестве контрастирующих агентов при ЯМР-визуализации (см., патенты США 4 834 964; 4863717; 5 104 641). Существует ряд методов выделения и очистки растворов гемоглобина, которые являются в результате такой очистки физиологически приемлемыми, и эти способы хорошо известны специалистам. Обычно, очищенные гемоглобиновые композиции содержат, по крайней мере, 99% гемоглобина по массе всего белка; примерно менее 3 мкг/мл всех фосфолипидов; менее 1 мкг/мл фосфатидилсерина или фосфатидилэтаноламина; и менее 6% неактивного пигмента гема. Очищенный раствор гемоглобина, используемый в настоящем изобретении, может быть получен различными известными способами, включая способы, но не ограничиваясь ими, описанные в работах: Cheung et al., Anal Biochem 137: 481-484 (1984), De Venuto et al., J.(1993). Очищенные растворы гемоглобина, используемые в настоящем изобретении, в основном, не должны содержать кислород. В этом растворе, гемоглобин может быть дезоксигенирован путем добавления химического восстановителя, который освобождает гемоглобин от кислорода и поддерживает его, в основном, в дезоксигенированном состоянии. Предпочтительный способ дезоксигенирования гемоглобинового раствора предусматривает обработку этого раствора инертным, в основном, не содержащим кислорода газом,таким, как азот или монокись углерода, в результате чего связанный кислород отщепляется от гемоглобина, а гемоглобин, присутствующий в растворе, превращается в форму дезокси-гемоглобина или карбоксигемоглобина, в которой отсутствует кислород. Альтернативно, гемоглобин может быть обработан вакуумом или газом с использованием мембраны, которая является проницаемой для кислорода и непроницаемой для гемоглобина. Так, например, раствор гемоглобина может быть пропущен через диффузионную ячейку,имеющую мембранную перегородку, вдоль которой движется раствор гемоглобина, и через которую кислород может проходить, а гемоглобин не может. Инертный газ, циркулирующий с противоположной стороны мембранной перегородки, способствует удалению кислорода и превращению гемоглобина, присутствующего в растворе, в дезоксигенированную форму. При этом, предпочтительно,чтобы дезокси-гемоглобин, во время его мечения нит-роксидом, перекрестного сшивания, полимеризации или коньюгации, находился, в основном, в бескислородном окружении. После удаления любого связанного кислорода, нитроксид ковалентно связывают с гемоглобином. В основном, с одной молекулой гемоглобина ковалентно связывают один,а предпочтительно более одного нитроксида. Нитроксид может быть ковалентно связан с гемоглобином в любом из нескольких сайтов,присутствующих на молекуле гемоглобина,например, 45(а) в одной или нескольких свободных сульфгидро (-SH)-группах, например, в -93 сайте;(в) в любых реакционноспособных амино (-N Н 2)-группах, например, в DPG -сайте в(с) в любой неспецифической поверхностной амино (-NH2)-или карбоксильной(-СООН)-группе. Нитроксид может быть также связан с любыми остаточными альдегидными, эпоксидными, или активированными карбоксильными группами двухвалентного или многовалентного перекрестно сшивающего агента,участвующего в перекрестном сшивании и полимеризации гемоглобина, или с любыми остаточными реакционноспособными группами такого агента, как декстран (Dx), гидроксиэтилированный крахмал (НЕ S) или полиоксиэтилен (РОЕ), используемого для конъюгирования гемоглобина. Как видно из уравнения (1) (см.выше),во время хранения, гемоглобин, присутствующий в НВОС-растворе, подвергается медленному самоокислению кислородом с образованием метгемоглобина и супероксиданиона. Однако во время хранения HRCS,который является объектом настоящего изобретения, образованный таким образом супероксид-анион будет способствовать восстановлению нитроксида до гидроксиламинового производного, а сам супероксид-анион будет, в последующей реакции, окисляться с образованием молекулярного кислорода. Превращение супероксид-аниона в молекулярный кислород, описанное вышеприведенным уравнением (4), предупреждает аккумуляцию супероксид-аниона и последующее образование пероксида водорода. Такая активность, описанная в данной заявке как "супероксидазная" активность, будет наиболее эффективной в случае, когда исходное содержание кислорода в композиции будет сведено к минимуму; а также, когда эта композиция будет храниться, в основном, в бескислородной среде, и концентрация нитроксида будет достаточной для предупреждения образования супероксид-аниона и пероксида водорода. Поэтому, хранение НРСS должно предпочтительно осуществляться в основном,в бескислородном контейнере. Система контейнеров, позволяющая хранить раствор в бескислородной среде, хорошо известна специалистам, поскольку многие внутривенные растворы, не содержащие гемоглобина, являются чувствительными к воздействию кислорода. Так, например, может быть использован стеклянный контейнер,который очищает от кислорода в процессе заполнения и герметизации. Кроме того, могут быть использованы пластиковые контейнеры, обернутые полиэтиленовой пленкой для защиты от кислорода. В основном, может быть использован любой контейнер, предохраняющий гемоглобин, присутствующий в растворе, от взаимодействия с кислородом. Для иллюстрации "супероксидоксидазной" активности нитроксида, образцы нитроксид-меченного гемоглобина в растворе помещали на хранение в условиях ускоренного окисления, и в течение всего времени хранения проводили исследования окислительновосстановительного состояния нитроксида с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса. Так, например, раствор полимеризованного с о-раффинозой гемоглобина, который был помечен 4-аминоТЕМРО, хранили в его оксигенированном состоянии в герметично закрытом стеклянном контейнере (фиг. 1 А). В этом состоянии,скорость образования супероксид-аниона и метгемоглобина в растворе является достаточно высокой, что позволяет с успехом проследить превращение нитроксида в его гидроксиламиновые производные (см. уравнение(4) и ср. фиг.1 А и 1 В). Как видно из уравнения 4, превращение нитроксида в его диамагнитное гидроксильное производное происходит наряду с превращением супероксиданиона обратно в молекулярный кислород. Экспериментальное подтверждение такого превращения проиллюстрировано на фиг. 1 А и 1 В. С помощью спектроскопии методом электронного спинового резонанса было показано, что TEMPO, ковалентно связанный с гемоглобином (фиг. 1 А) превратился в свое диамагнитное производное о чем свидетельствовало полное исчезновение резонансного пика после хранения образца в течение 30 дней при 4 С (фиг. 1 В). При этом можно считать, что нитроксид обладает "супероксидоксидазной" активностью в том случае, когда он превращается в свое гидроксиламиновое производное в присутствии гемоглобина. О "супероксиддисмутазной" активности нитроксида в НВОС-растворе свидетельствует обратное превращение гидроксиламинового производного в нитроксид (см. уравнение(5) и уравнение (4. Принимая во внимание,что в условиях эксперимента, проиллюстрированного на фиг.1 А и 1 В, нитроксид полностью превращается в гидроксиламин (см. уравнение (4, этот нитроксид может быть регенерирован путем простого увеличения количества супероксид-аниона, как показано в уравнении 5. Для иллюстрации механизма этой реакции, относительную концентрацию гемоглобина (и тем самым супероксиданиона) по отношению к нитроксиду увеличивали путем разведения образца (фиг. 3-А) равным объемом немеченного гемоглобина. 47 Сравнение фиг.1 А и фиг. 1 С показало приблизительно 50%-ное снижение интенсивности нитроксидного сигнала, обусловленное эффектом разбавления. С другой стороны,после 30 дней хранения при 4 С , нитроксид частично регенерируется (см., фиг.1), как видно из уравнения (5). Это наблюдение подтверждает обратное превращение гидроксиламинового производного в нитроксид, происходящее вместе с образованием пероксида водорода из супероксид-аниона.(5) Суммируя уравнения (4) и (5), получим уравнение которое показывает, что в "НВОС"-растворе,нитроксид действует как низкомолекулярный и не содержащий атомов металла имитатор супероксиддисмутазы (SOD). Данные, полученные по спектру электронного спинового резонанса для нитроксида (фиг.1), подтверждают реакцию супероксид-аниона с гидроксиламином которая приводит к образованию нитроксида и пероксида водорода (Н 2 О 2). Недавно было высказано предположение, что оксоаммониевый катион может участвовать в качестве одного из промежуточных соединений в катализируемой нитроксидом реакции дисмутации супероксида.HRCS- композиции настоящего изобретения способствуют ослаблению окислительного стресса, вызываемого в результате образования супероксид-аниона в стандартных НВОС-растворах, а после трансфузии, они уменьшают деструкцию окиси азота, которая является эндотелиальным фактором релаксации (EDRF). Предупреждение деструкцииEDRF позволит до некоторой степени решить проблему сужения сосудов и системной гипертензии, которые наблюдаются при инфузии пациенту стандартных НВОС-растворов. Число молекул нитроксида на молекулу гемоглобина может составлять в пределах приблизительно 1-40, либо быть равным любому целому числу или варьироваться в диапазоне между этими целыми числами, а наиболее предпочтительно, если число молекул нитроксида для специфического мечения составляет около 2. При использовании многокомпонентной системы, молярное отношение нитроксида к гемоглобину может приблизительно составлять от 3 до 60, либо любое це 000618 лое число или диапазон между этими числами. Например, нитроксид, такой, как 3 малеимидо-PROXYL, ковалентно связывают с гемоглобином в растворе, предварительно приготовив 100 мМ раствор нитроксида в этаноле, используемом в качестве носителя растворителя. Затем два (2) молярных эквивалента нитроксида по отношению к гемоглобину добавляют, размешивая при этом, кDCl-Hb (8 г/дл) в лактатсодержащем растворе Рингера. Реакционную смесь оставляют, размешивая, при 22 С до тех пор, пока более 90% нитроксида не свяжется ковалентно сDCl-Hb, обычно в пределах 1 ч. Затем непрореагировавший нитроксид удаляют, используя систему проточной мембранной фильтрации, имеющую отсечку молекулярной массы в 30 000 Дальтон, для этого три раза промывают 10 объемами лактатного раствора Рингера. Концентрацию удерживаемого гемоглобина доводили до уровня 7-14 г/дл, подвергали стерильной фильтрации, и хранили при 4 С. После трансфузии, в случае, если НRСS является полностью оксигенированным, то нитроксид, как ожидается, будет обладатьSOD-имитирующей активностью, и кроме того, активностью, имитирующей каталазную активность. Под действием нитроксида в качестве SOD-имитатора, супероксид-анион подвергается реакции дисмутации с образованием пероксида водорода (см. уравнение(2, что способствует защите присутствующей в эндотелии окиси азота от деструкции, и предупреждает сужение сосудов. Имитируя каталазную активность, нитроксид обеспечивает защиту от токсичности пероксида водорода путем его превращения в безвредную воду (см., уравнение (3. Как указывалось выше, нитроксиды были ковалентно связаны с гемоглобином в целях изучения способности самой молекулы гемоглобина к кооперативному связыванию кислорода. Однако, в этих исследованиях,нитроксиды не были использованы с раствором стабилизированного, т.е., перекрестно сшитого или полимеризованного, инкапсулированного или конъюгированного гемоглобина, где эти нитроксиды являются физиологически совместимыми. Не были также использованы синтетические нитроксидсодержащие полимеры для мечения нативного гемоглобина. Известная структура гемоглобина и нитроксидов дает основание предположить, что химически структурированный или перекрестно сшитый посредством техники рекомбинантных ДНК гемоглобин может быть помечен нитроксидом путем отбора соответствующего сайта на молекуле этого гемоглобина так, чтобы он не блокировался конкретным соединением, используемым для стабилизации, полимеризации или конъюгации моле 49 кулы гемоглобина. Поскольку некоторые из стабилизированных и полимеризованных форм гемоглобина, описанных ниже, используются в клинических испытаниях, то связывание нитроксидов с этими переносчиками кислорода на основе стабилизированного и полимеризованного гемоглобина, описанными ниже, в целях иллюстрации их способности к детоксификации кислорода в соответствии с настоящим изобретением, может быть применено и к уже существующим растворам гемоглобина. Технология мечения нитроксидом, проиллюстрированная в настоящем описании на примере с нитроксид-НВОС, может быть с успехом применена для продуцирования других меченных нитроксидом макромолекул,обладающих нужной противоокислительной и фермент-имитирующей активностью, например, таких, как меченный нитроксидом сывороточный альбумин и меченный нитроксидом иммуноглобулин. Подходящими формами сывороточного альбумина, который может быть легко помечен нитроксидом с использованием указанной технологии, являются мономерный (нормальный) альбумин,гомодимерный альбумин, олигомерный альбумин, а также их агрегаты (микросферы и микропузырьки) и полипептидные фрагменты. Используемый в настоящем описании термин "белок" или "макромолекула" включает также его (ее) фрагмент, т.е. может означать полипептидные фрагменты белка. Из-за различия в применении, композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы как отдельно, так и в сочетании друг с другом. Так, например, при лечении и диагностике повреждений сердца при реперфузии или ишемических повреждений сердечно-сосудистой системы, может оказаться полезным использовать несколько аспектов настоящего изобретения, например,доставку кислорода, системную защиту от окислительного стресса, локальную защиту от реперфузионного повреждения, и улучшенную визуализацию. В этих случаях может быть использована комбинация описанных в данной заявке композиций, таких, как уже существующий НВОС, меченный нитроксидом альбумин, и низкомолекулярный нитроксид; причем, все указанные композиции могут быть введены одновременно или последовательно в зависимости от терапевтических или диагностических целей. Что касается выбора конкретной композиции и способа ее введения в соответствии с настоящим изобретением, то такой выбор зависит от конкретной цели применения. Выбор нитроксидных соединений, способных акцептировать электрон от низкомолекулярного и проникающего через мембрану соединения, может быть сделан в соответствии с имеющимися несколькими способами введения, а предпочтительные композиции могут быть выбраны исходя из конкретного участка, нуждающегося в защите в данном конкретном случае. Предупреждение возникновения окислительного стресса после инфузии переносчика кислорода на основе гемоглобина, описанного выше, является примером необходимости выбора композиций и методов введения в соответствии с настоящим изобретением для обеспечения специфической защиты от токсичности свободных радикалов и предотвращения возникновения токсических побочных эффектов после инфузии НВОС. В случае, если необходима активность или защита кожи или дермального слоя, то предпочтительным соединением является TOPS,поскольку это соединение является относительно небольшим и способным проникать через мембрану. Если специфическая защита или активность необходима для желудочнокишечного тракта, то предпочтительным является полинитроксид-декстран, поскольку это соединение менее восприимчиво к ферментативному расщеплению в желудочнокишечном тракте. В этих целях, предпочтительным является пероральное или ректальное введение. Если специфическая защита или активность направлена на внутривенные или внутрисосудистые участки, такие, как цереброваскулярная или сердечно-сосудистая система, то предпочтительным является полинитроксид-альбумин, поскольку альбумин является главным белком плазмы, хорошо переносится организмом, легко вводится, и обладает продолжительным временем полужизни в плазме. Такие применения могут также предусматривать использование переносчика на основе гемоглобина, или его полинитроксидного производного. Тем же самым принципом можно руководствоваться и при внутрибрюшинном или внутрикожном введении. Как показано в нескольких примерах,введение соединений настоящего изобретения в организм может быть локальным, или может быть направлено на определенную группу клеток или орган. В частности, сохранение органа для трансплантации может быть достигнуто путем инфузии полинитроксидальбумина либо до, либо после удаления органа из организма. Так, например, при трансплантации сердца, PNA используют для селективной перфузии сердца, т.е., путем концентрированного внутривенного введения после удаления органа из организма. Этот орган может быть также трансплантирован и сохранен в PNA- бане для предотвращения повреждения органа в процессе пероксидации липидов, окислительного стресса, и т.п. Кроме того, после хирургической трансплантации, в случае, если орган подвергается ре 51 перфузии оксигенированной кровью, то этот орган может быть защищен тем же способом,который был проиллюстрирован в настоящем описании для ишемического реперфузионного повреждения сердца и головного мозга. В случае, если необходима специфическая защита легких, то предпочтительно использовать аэрозольную форму полинитроксидальбумина, которая обеспечивает защитное покрытие легочных дыхательных путей. Как очевидно для каждого специалиста, указанные предпочтительные композиции могут быть модифицированы в зависимости от конкретных применений. Как уже указывалось, вышеописанные композиции являются предпочтительными вариантами электронакцептирующего соединения. Что касается проникающих через мембрану соединений-доноров электрона, то выбор предпочтительного соединения также зависит от целей применения и метода введения. Композиция и способ введения должны обеспечивать системное или тканеспецифическое распределение этой композиции в соответствии с уровнем генерируемых свободных радикалов, либо в соответствии с физиологическим состоянием, представляющим интерес, или участком, который нуждается в отображении или обработке. Так, например,при сепсисе наблюдается обширный сосудистый коллапс, который сопровождается увеличением продуцирования свободных радикалов в организме. Аналогично, тотальное облучение организма приводит к генерированию свободных радикалов во всех тканях организма. В таких случаях, низкомолекулярный, проникающий через мембрану нитроксид, являющийся донором электронов, может быть введен перорально или внутривенно в количестве, обеспечивающим системное распределение. В соответствии с этим, такое введение должно сопровождаться введением акцептора электрона, который также широко распространяется по всему организму, например, внутривенным введением полинитроксид-альбуминй. Если продуцирование свободных радикалов является более локализованным, то в этом случае, локальная защита или активность обеспечивается предпочтительно путем селективного применения акцептора электрона, поскольку проникающие через мембрану соединения имеют тенденцию к системному распределению после введения, хотя местное введение в кожу проникающих через мембрану соединений может дать более локальный эффект. На основании вышеприведенного описания, каждый специалист может самостоятельно выбрать композиции и методы введения для наиболее эффективного достижения конкретных целей, которые могут быть осуществлены с помощью настоящего изобрете 000618 ния. Так, например, для усиления изображения желудочно-кишечной системы, может быть осуществлено пероральное введение полинитроксид-декстрана в качестве акцептора электрона и пероральное и/или внутривенное введение проникающего через мембрану препарата ТЕМPOL. В качестве еще одного примера может служить лечение псориаза, локального заболевания кожи, при котором наблюдается продуцирование свободных радикалов, и для лечения которого может быть применено местное введение TOPS в качестве акцептора электронов и местное введение проникающего через мембрану препарата TEMPOL. Аналогичным образом, защита конкретного участка или активность в этом участке может быть обеспечена путем использования композиции настоящего изобретения, применяемой для лечения других заболеваний, или для диагностики или лечения состояний, при которых наблюдается присутствие свободных радикалов. Поэтому в нижеследующих примерах приводится подробное описание нескольких препаратов, которые могут быть использованы в любой комбинации в зависимости от целей применения, осуществляемых в соответствии с настоящим изобретением. Пример 1. Контейнеры и фильтры, содержащие нитроксиды и соединения, меченные нитроксидом. В соответствии с настоящим изобретением детоксификация кислорода при применении существующих растворов для внутривенного введения, таких как растворы НВОС,может быть осуществлена без химического модифицирования существующих композиций. Неблагоприятные физиологические эффекты, вызванные токсичностью кислорода,наблюдаемой при применении существующих композиций, могут быть уменьшены посредством использования полинитроксидных макромолекул в сочетании со свободным нитроксидом, или посредством ковалентного связывания нитроксидов с внутренней поверхностью стенок сосуда, в котором содержится НВОС. Контейнер для гемоглобинсодержащих растворов настоящего изобретения должен быть физиологически совместимым, и иметь характеристики, аналогичные характеристикам любого контейнера, используемого для жидкостей для внутривенного введения. Для этих целей, подходящим является, в основном, стеклянный или биологически совместимый пластиковый контейнер. В целях осуществления настоящего изобретения, где раствор для внутривенного введения помещают в контейнер на любой промежуток времени,этот контейнер не должен содержать кислород и должен быть герметично закрытым во избежание проникания кислорода. В случае 53 применения стеклянного контейнера достаточно использовать стандартную пробку и прокладку. Однако в настоящее время некоторые контейнеры из эластичного пластика способны пропускать кислород. В таком случае обертывающая фольга или другое герметизирующее средство может быть использовано для предохранения от контакта кислорода с раствором. Для нанесения нитроксида на внутреннюю поверхность контейнера, эту внутреннюю поверхность покрывают невыщелачивающим слоем нитроксидного полимера или сополимера, содержащего нитроксид. Нитроксидсодержащие полимеры могут быть получены рядом методов, основанных на общеизвестных реакциях полимеризации, при условии, что в процессе этой реакции полимеризации, стабильность свободных радикалов будет сохраняться. Также, внутренняя поверхность контейнера с НВОС может быть модифицирована так, чтобы она содержала покрывающий слой вещества, которое может связываться с нитроксидом, например, гидрофильные гидразидные группы, которые могут вступать в реакцию с кетоновой или альдегидной группой нитроксида с образованием стабильных гидразоновых производных. После этого, непосредственно протекает реакция образования покрывающего слоя. Например, нитроксид (100 мМ) в ацетатном буфере при рН=5,0 добавляют в пластиковый контейнер,активизированный гидразидом, для облегчения образования гидразоновой связи. После подготовки контейнера добавляют физиологически совместимый раствор. Этот раствор может быть стабилизирован и очищен НВОС или НРСS, как описано ранее,и может также включать любой внутривенный коллоидный или кристаллический раствор, который является подходящим для совместного введения с гемоглобином. Затем,раствор выдерживают, в основном, в бескислородной среде. Помимо этого, для обработки поверхности внутри контейнера, фильтрующий патрон с входным и выходным отверстием Люэровского наконечника, содержащий гелевую или твердую матрицу, на которой иммобилизован нитроксид, может быть использован для удаления реакционноспособных кислородных молекул, в то время как раствор гемоглобина проходит через раствор. Для каждого способа введения, полинитроксидная макромолекула может быть добавлена вовнутрь фильтра, через который раствор непосредственно вводят пациенту для прохождения реакции с раствором перед инфузией. Может быть также включен низкомолекулярный нитроксид. В этих способах применения, нитроксид может быть также связан с мягкой или твердой геле 000618 вой матрицей, при этом, все процессы происходят, в основном, в стерильном проходном фильтре перед инфузией. Различные методы связывания небольших лигандов, таких как нитроксид, с твердой матрицей, хорошо известны специалистам по аффинной хроматографии как методы химической модификации стеклянных и пластиковых поверхностей. Известны несколько видов матриц, которые совместимы со стерильными растворами, включая агарозный гель, продукты на основе полисульфона, латекс, и другие. В методе с использованием фильтрующего патрона, твердая матрица является ковалентно связанной с нитроксидом, и находится внутри фильтра и другого подобного устройства, так, чтобы раствор, такой как раствор гемоглобина, мог проходить через устройство, и вступать в контакт с нитроксидом при его вливании пациенту. Практический метод предусматривает использование общедоступного активированного агарозного геля в качестве матрицы и помещение этого геля в стерильный патрон с Люэровским наконечником. Затем, патрон просто вставляют в трубку для введения жидкости во время трансфузии раствора, содержащего гемоглобин. На практике, структура, содержащая корпус фильтра, в котором находится нитроксид, и через который пропускают гемоглобин, может быть получена с помощью различных известных соединений. См. например, патент США 5149425. Как показано на фиг.12, корпус 1 содержит агарозный гель,меченный нитроксидом. Например, -аминогексилагарозу (см. фиг.2 А) метили 4 бромацетамидо-ТЕМРО, а 1,4- бис(2,3 эпоксипропокси)бутанагарозу подвергали реакции связывания с 4-амино-ТЕМРО (см. фиг. 2 В). В корпус фильтра могут быть введены и другие соединения (не показаны). Во время трансфузии, трубка для внутривенной трансфузии, содержащая раствор,может быть соединена с входным отверстием 2, обеспечивая проход в корпус 1, где раствор гемоглобина может взаимодействовать с нитроксидсодержащими соединениями внутри корпуса или связываться с матрицей 4, причем, в этом способе, нитроксидсодержащие композиции вводятся для осуществления реакции с удалением из раствора молекул, ассоциированных с токсичным кислородом. Затем, раствор гемоглобина выводят из патрона через выходное устройство Люэровского наконечника 3, и непосредственно вводят пациенту. Спектр электронного резонанса 4 амино -TEMPO-меченной эпоксиагарозы показан на фиг. 2 А. Альтернативно, аминогексил-агароза может реагировать с 4(2-бромацетамидо)-TEMPO с образованиемTEMPO-меченной агарозы. Спектр электрон 55 ного спинового резонанса показан на фиг.2. Альтернативно, 4-карбоксил-ТЕМРО может быть связан с аминоагарозой с помощью карбодиимида посредством карбоамидной связи. В противоположность этому, 4-аминоТЕМРО может быть связан с карбоксильной группой на агарозном геле с использованием карбодиимида,например,1-этил-3-(3 диметиламинопропил) карбодиимида. Патрон, меченный 4-амино-ТЕМРО,приготавливали путем пропускания 100 мМ 4-амино-ТЕМРО (Sigma Chem.Co.) в лактатном растворе Рингера через альдегид AvidChrom Cartidge (Unisyn Tech.Inc.) при комнатной температуре в течение одного часа, а затем подвергали реакции восстановления цианоборогидридом натрия в течение 6 ч. Внутреннюю поверхность корпуса патрона тщательно промывали лактатным раствором Рингера. Аналогично, патрон, меченный 3-аминоРRОХУL, может быть получен путем замены 4-амино-ТЕМРО на 3-амино-PROXYL, методом, описанным выше. Пример 2. Стабилизированный гемоглобин, меченный нитроксидом. Для предупреждения диссоциации гемоглобина на составляющие его субъединицы,гемоглобин подвергали внутримолекулярной стабилизации путем химического или рекомбинантного перекрестного сшивания его субъединиц. Понятие "стабилизированный гемоглобин" относится к мономерам гемоглобина, стабилизированным путем химического или рекомбинантного перекрестного сшивания, а также к димерам, тримерам, и высшим олигомерам, составляющим молекулы гемоглобина, стабилизированного путем сшивания циклодекстранами и их сульфатными производными. Предпочтительной техникой присоединения нитроксида к стабилизированному гемоглобину является ковалентное связывание нитроксида с сульфгрильными группами -93 двух -цепей стабилизированного гемоглобина. Хотя специфическое мечение на участке-93 было проведено на нативном гемоглобине человека для изучения конформации (См.(1970, такое специфическое мечение перекрестно-сшитого гемоглобина не приводится. Как указано выше, было разработано несколько типов переносчиков кислорода на основе гемоглобина, которые стабилизированы путем химического сшивания, с получением, например, DBBF-сшитого гемоглобина,и гемоглобина, который стабилизировали и олигомеризировали о-раффинозой. Сахара с незамкнутым кольцом, описанные в патенте США 4 857 636, приводят к образованию поливалентных альдегидов, 000618 происходящих от дисахаридов, олигосахаридов, или, предпочтительно, от трисахаридов,таких как о-раффиноза. Действие этих соединений обеспечивает внутримолекулярную стабилизацию (перекрестное сшивание) и внутримолекулярную полимеризацию. В соответствии с реакцией, описанной в нашем раннем патенте, поливалентные альдегиды могут быть использованы для продуцирования "стабилизированного" гемоглобина, как описано ранее, без полимеризации. В другом случае нитроксид может быть ковалентно связан со стабилизированным гемоглобином или полимеризованным гемоглобином. Таким образом, растворы на основе гемоглобина,стабилизированные с использованием поливалентных альдегидов, рассматриваются в настоящем варианте изобретения как "стабилизированный гемоглобин", а в последующем варианте изобретения как "полимеризованный гемоглобин". Для иллюстрации того, что участок -93 химически модифицированного гемоглобина не может рассматриваться как стерически недоступным для связывания нитроксида,были представлены результаты, подтверждающие, что нитроксид может быть ковалентно связан с участком -93 DBBF-сшитого гемоглобина. В этом варианте, DBBF-Hb подвергали реакции с двумя типами нитроксидов(TEMPO и PROXYL), которые содержат 2 типа сульфгидро-групп, специфичных к функциональным группам, и имеют следующие структурные формулыDBB F-Hb получали путем перекрестного сшивания очищенного и дезоксигенированного гемоглобина в растворе с бис-(3,5 57 дибромсалицил)фумаратом с помощью хорошо известной техники, и полученный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии. Ковалентное связывание 3 малеимидо-(2,2,5,5-тетраметилпирролидинN-оксил)[3-малеимидо-РRОХУL] осуществляли путем добавления 2 молярных эквивалентов этого нитроксида, используя в качестве растворителя метанол, при концентрации приблизительно 100 мМ 3-малеимидоPROXYL, к 1 мл DBBF-Нb при концентрации приблизительно 8 г/дл в Lactate Ringers.DBBF-Нb оставляли для реакции при температуре 22-23 С приблизительно на 30 мин при размешивании. Степень сшивания оценивали исходя из процента исчезновения интенсивности сигнала электронного парамагнитного резонанса непрореагировавшего нитроксида. Для удаления непрореагировавшего нитроксида реакционную смесь три раза промывали 10 объемами избыточного количестваFiltron с полиэтиленсульфоновыми (PES) мембранами с ограничениями номинальной молекулярной массы в 30 килодальтон(NMWL) (Filton Technology, Co.). Измерения электронного парамагнитного резонанса меченного нитроксидом гемоглобина проводили на спектрометре ESR Bruker. На фиг. 3 А показаны спектры электронного парамагнитного резонанса DBBF - Нb, меченного 4-(2 бромацетамидо)-TEMPO. Спектр электронного парамагнитного резонанса DBB F-Hb, который аналогичен спектру DBBF-Нb, меченного 3-малеимидо-РRОХУL, показан на фиг. 3 В. В этом эксперименте, нитроксид является ковалентно связанным с одиночной сульфгидрогруппой на двух -глобиновых цепях гемоглобина. Таким образом, отношение нитроксида к кислороду, связанному с гемоглобином, составляет приблизительно 200:1 при 99,00% дезоксигемоглобина, поскольку эти два нитроксида присоединены к двум глобиновым цепям гемоглобина. Однако, после трансфузии, дезоксигенированный HRCS подает кислород в легкое, и отношение: "нитроксид - кислород, связанный с гемоглобином" становится равным приблизительно 1/2 при 100% окислении, поскольку эти четыре молекулы кислорода связаны с четырьмя глобиновыми цепями гемоглобина посредством двух нитроксидов, находящихся на глобиновых цепях. С использованием отношения гемоглобин: нитроксид (1:2), более чем 90% нитроксида является ковалентно связанным с DBBF-Hb, DBBF - Нb может быть также ковалентно меченным спейсерной группой (например, внешней метильной группой) между малеимидо- и PROXYL- группами (т.е., 3 000618 малеимидометил-РRОХУL), которые имеют спектр резонанса, аналогичный спектру, показанному на фиг. 3 В. Примечательно, что другие нитроксиды могут быть ковалентно связаны со специфическими аминогруппами в PG-связывающем сайте (например, -Val-I,-Lys-82, и -Lys-99) или могут быть присоединены к оставшимся 40 аминогруппам + поверхностный линин -аминогруппы на гемоглобине. Изотиоцианатные производные нитроксидов TEMPO и PROXYL также могут реагировать с аминогруппой. Например, 4 изотиоцианат-ТЕМРО может быть добавлен к гемоглобину при молярном отношении приблизительно 10:1. Спектр резонанса (не показан) гемоглобина, меченного этим нитроксидом на других участках, является аналогичным спектру, показанному на фиг. 3 А. Способность DBBF-Hb связываться с нитроксидами в нескольких сайтах дает основание предположить, что рекомбинантный гемоглобин, который стабилизирован димерами альфа-глобина (D. Looker и др., NATURE 356:258 (1992, может быть аналогичным образом помечен нитроксидом. Может быть также получен DBBF-Hb-аналог нитроксидмеченного сшивающего агента, а именно, такого агента, как ТЕМРО-меченный сукцинат (патент США 4 270 797). На фиг. 4 показаны ЭСР-спектры (А) 2(бромацетамидо)-TEMPO, (В) 2-(бромацетамидо)-ТЕМРО-меченного НВОС и (С) 15ND17TEMPOL (TEMPOL:4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил) в растворе Рингера при комнатной температуре. Различие на фиг. 4 А и 4 В иллюстрирует различие в мобильности низкомолекулярного нитроксида по сравнению с нитроксидом, ковалентно связанных с макромолекулой, такой как гемоглобин. На фиг. 4 С показано, что стабильный изотоп азота 15N с ядерным спином 1/2 дает два резонансных пика, а природный изотоп 14N с ядерным спином 1 дает три резонансных пика(сравнение 4 А с 4 С). В серии экспериментов,описанных в этом изобретении, разделение указанных резонансных пиков используется для демонстрации фер-ментимитирующих реакций и in vivo и in vitro -реакций окисления/восстановления низкомолекулярных и макромолекулярных нитроксидов. НВОС, меченный нитроксидом, с различными молярными отношениями нитроксида к гемоглобину, были получены следующим образом. 2-, 4-, и 8-молярные эквиваленты 4-(2-бромацетамидо)-TEMPO были добавлены в качестве твердого порошка непосредственно в три отдельные 15 миллилитровые вакуумные сосуды Vacutainer в чистом вытяжном шкафу. После установки резиновой прокладки, 4-(2-бромацетамидо)TEMPO растворяли в 200 микролитрах хло 59 роформа. Затем, в сосуды Vacutainer подавали высокий вакуум (5 мм рт.ст.) посредством иглы калибром 27 через резиновую прокладку, и хлороформ удаляли, оставляя тонкую пленку 4-(2-бромацетамидо)-TEMPO, покрывающую нижнюю половину Vacutainer. После введения соответствующего количества НВОС путем стерильного переноса через резиновую прокладку, растворы оставляли для реакции при комнатной температуре с периодическим вихревым размешиванием приблизительно в течение 5 мин с интервалами в 1/2 ч (при этом, не все твердые вещества были растворены в нитроксиде/гемоглобине с молярным отношением 4:8), сосуды Vacutainers оставляли при температуре 4 С на ночь в холодильнике. Вихревое размешивание при комнатной температуре продолжали на следующее утро в течение получаса до тех пор,пока все твердые вещества 4-(2 бромацетамидо)-TEMPO не исчезнут (по визуальной оценке) с поверхности сосудаVacutainer. Затем, реакционные смеси и контрольную смесь переносили в стерильную трубку для диализа, и диализовали против LactatedRinger до тех пор, пока не были обнаружены сигналы электронного парамагнитного резонанса (ESR) немеченного свободного 4-(2 бромацетамидо)-TEMPO. Спектры ESR 4-(2 бромацетамидо)-TEMPO-меченного НВОС при 2,4, и 8 молярных эквивалентах 4-(2 бромацетамидо)-TEMPOL-гемоглобин показаны на фиг. 5 А-5 С, соответственно. При 2 молярных эквивалентах 4-(2-бромацетамидо)TEMPO с гемоглобином, спектры ЭПР являются, в основном, такими же при диализе или без диализа, и указывают на то, что ковалентное мечение является количественным. Две группы SH- на бета-глобулиновых цепях являются очевидно участком ковалентного связывания в случае с НВОС (это может быть подтверждено путем выборочного блокирования 4-(2-бромацетамидо)-TEMPO, меченного N-этил-малеимидом, или путем анализа глобулиновой цепи с помощью обращеннофазовой ВЗЖХ). Следует отметить, что отношения интенсивности сигнала ЭПР (пик Мо) 2:4:8 являются приблизительно теми же отношениями, что и для спектров, которые регистрировали при пропорциональном снижении чувствительности прибора. Кроме того, ожидается, что 4-(2 бромацетамидо)-TEMPO может быть связан с гемоглобином даже при более высоких молярных отношениях, например, в качестве агентов, защищающих от радиационного облучения in vivo. Полинитроксид-гемоглобин (PNH), полученный как описано ниже, предпочтительно имеет молярное отношение в кровезаменяющих композициях 8:1, а особенно пред 000618 почтительное молярное отношение составляет приблизительно 18. Предпочтительный композицией PNH является карбомоноксиловое производное, СО-PNH. СО связывается с группами гема PNH, стабилизированнымиPNH: при этом было показано, что CO-PNH является стабильной при нагревании до 60 С. Из этого следует, что композиция CO-PNH не требует замораживания, и может быть сохранена при комнатной температуре в течение продолжительного периода времени. Кроме того, при введении композиции пациенту,присутствие СО усиливает сосудорасширяющую активность PNH, а также известно, что СО действует в качестве сосудорасширяющего фактора in vivo . После вывода СО из PNH,PNH продолжает действовать как терапевтическое средство, обеспечивая доставку кислорода в ткань и действуя посредством их нитроксидопосредованного сосудорасширяющего фактора. На фиг. 6 показан спектр ЭПР смеси 4(2-бромацетамид)-ТЕМРО-меченного НВОС и 15ND17- TEMPOL, где центральный пик 4(2-бромацетамидо)-TEMPO (указанный нижней стрелкой) и область высокого пика 15ND17-TEMPOL (указанный верхней стрелкой) были доведены до аналогичной интенсивности. Разделение пиков резонанса позволяет проводить одновременный мониторинг активностей свободных радикалов или имитаторов фермента, включая низкомолекулярный нитроксид (TEMPOL) и их макромолекулярный конъюгат в обеих (мышиных) реакцияхin vitro и in vivo. Например, in vivo -период полужизни двух нитроксидов в плазме сравнивали по уникальным спектральным характеристикам различных нитроксидов. В частности, in vivo-ЭПР-исследования растворов на основе гемоглобина на мышах осуществляли с использованием нитроксида с гемоглобином в отношении 8:1 (См. фиг.50 с учетом их высокой интенсивности сигнала ЭПР. Сначала, приблизительный период полужизни низкомолекулярного нитроксида в плазме(15ND17-TEMPOL, см. фиг. 4 С) и высокомолекулярного 4-(2-бромацетамидо)-TEMPO меченного НВОС с высокой молекулярной массой (см. фиг. 4 В) определяли путем получения смеси двух нитроксидов и доведения интенсивности сигнала ЭПР приблизительно до той же интенсивности (см. фиг. 6). 0,5 миллилитров смеси вводили под анестезией в расширенную хвостовую вену мыши под нагревательной лампой. Хвост мыши вставляли в ЭПР-камеру, и через десять минут после инъекции спектр регистрировали (см. фиг.7 А). Как показано на фиг. 7 А, 7 В и 7 С, сигнал 15ND17-TEMPOL может быть не обнаружен, однако, НВОС, меченный 4-(2-бромаце

МПК / Метки

МПК: A61K 31/40

Метки: способы, сочетании, макромолекулами, нитроксидов, совместимыми, биологически, использования, композиции

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/30-618-kompozicii-i-sposoby-ispolzovaniya-nitroksidov-v-sochetanii-s-biologicheski-sovmestimymi-makromolekulami.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Композиции и способы использования нитроксидов в сочетании с биологически совместимыми макромолекулами</a>

Похожие патенты