Способы и композиции для ингибирования пролиферации клеток млекопитающих

1 Область и предпосылки изобретения Данное изобретение относится к применению рибонуклеазы семейства Т 2 или кодирующего ее полинуклеотида для предупреждения,ингибирования и/или обращения пролиферации,колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих клеток у субъекта. Далее, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного ингредиента рибонуклеазу семейства Т 2 или кодирующий ее полинуклеотид, для лечения пролиферативных заболеваний или нарушений вообще и злокачественных опухолей в частности. Существует растущий интерес, как в медицинской среде, так и среди всего населения, в разработке новых лекарственных средств для лечения клеточно-пролиферативных заболеваний и нарушений, таких как злокачественные опухоли. Средства, которые проявляют антипролиферативные свойства, свойства против колонизации, против дифференцировки и/или против развития в отношении клеток млекопитающих,потенциально могут быть использованы в качестве противораковых средств. Идет широкий поиск таких агентов как таковых как природного, так и синтетического происхождения. РИБАЗЫ являются рибонуклеазами(РНКазами), которые проявляют биологическую активность, которая отличается от их способности разрушать РНК. Известно, что РИБАЗЫ и их структурные гомологи осуществляют большое число клеточных реакций (Rybak, M. et al. ,1991, J. Biol. Chem. 266:21202-21207; Schein,C.H. 1997 Nature Biotechnol. 15:529-536). Считается, что EDN и ЕСР, два основных белка, обнаруженных в секреторных гранулах цитотоксических эозинофилов (члены семейства РНКаз А), участвуют в иммунной реакции. В самонесовместимых растениях S-РНКазы столбика(члены семейства Т 2 РНКаз) останавливают рост пыльцевых трубок и, следовательно, предотвращают оплодотворение. RC-РНКаза, получаемая из яйцеклеток лягушки-быка, ингибирует in vitro рост опухолевых клеток, таких как Р 388, и клеточных линий лейкоза L1210, и является эффективной для лизиса клеток саркомы 180, клеток Эрлиха и асцитных клеток Мер II invivo (Chang, C-F. et al., 1988, J. Mol. Biol. 283:231-244). Некоторые РНКазы проявляют ограниченную рибонуклеазную активность,примером которых являются ангиогенины, которые стимулируют образование кровеносных сосудов (Fett, J. W. 1985, Biochemistry 24:54805486). Живые организмы используют внеклеточные РНКазы для защиты от патогенов и опухолевых клеток. Например, ЕСР секретируется в ответ на атаку паразитов (Newton, DL. 1992, J. 2 активность проявляется также цинк-2-гликопротеидом (Zn2gp), РНКазой, присутствующей в большинстве жидкостей тела человека, в том числе крови, семенной плазме, грудном молоке,синовиальной жидкости, слюне, моче и поте(Lei G, et al., 1998, Arch. Biochem. Biophys. Jul 15; 355 (2): 160-4). Конкретный механизм, посредством которого действуют внеклеточные РНК-азы в клеточных реакциях, остается неизвестным. Основным барьером цитотоксической активности некоторых РНКаз является клеточная мембрана. Было обнаружено, что ЕСР образует каналы как в искусственных, так и в клеточных мембранах. Предположительно ЕСР, высвобождаемая из гранулярной мембраны вместе с EDN(РНКазой эозинофилов, которая является ответственной за разрушение клеток Пуркинье мозжечка) переносит EDN в межклеточное пространство. Доступ грибкового токсина сарцина (члена семейства РНКаз А) в клеткимишени зависит от вирусной инфекции, которая делает проницаемой клеточную мембрану (Rybak, M. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:2120221207). Возможно, что РНКазы входят в клетку посредством эндоцитоза. При использовании разрушающих аппарат Гольджи лекарственных средств ретиноевой кислоты или моненсина для искусственной доставки БС-РНКазы в клетки,цитотоксичность резко возрастала (Wu U, et al.,1995, J. Biol. Chem. 21; 270(29):17476-81). Цитотоксичность РНКаз может быть использована для терапевтических целей. РНКазаL человека активируется интерфероном и ингибирует вирусный рост. Экспрессия гена для РНКазы L человека вместе с геном 2'5'-Асинтетазы в растениях табака является достаточной для защиты растений от вируса мозаики огурца и для предотвращения репликации вируса Y картофеля. Вирус иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) индуцирует блокаду в антивирусных путях РНКазы L (Schein, C.H. 1997 Nature Biotechnol. 15:529-536). РНКазы могут быть слиты со специфическими антителами против мембранного белка для создания иммунотоксинов. Например, слияние РНКазы А с антителами к рецептору трансферрина или с антигеном CD5 Т-клеток приводит к ингибированию белкового синтеза в опухолевых клетках, несущих специфический рецептор для каждого из указанных выше токсинов (Rybak, M. et al., 1991, J. Biol.Chem. 266:21202-21207; Newton, DL. 1998, Biochemistry 14; 37 (15): 5173-83). Поскольку РНКазы являются менее токсичными для животных, они могут иметь меньше нежелательных побочных эффектов, чем используемые в настоящее время иммунотоксины. Цитотоксичность цитотоксических рибонуклеаз является, по-видимому, обратно пропорциональной силе взаимодействия между ингибитором РНКаз (RI) и РНКазой. Ингибитор 3 РНКаз (RI) является природной молекулой, обнаруженной в клетках позвоночных, которая служит для защиты этих клеток от потенциально летальных действий рибонуклеаз. Ингибитор РНКаз является цитозольным белком массой 50 кДа, который связывается с РНКазами с варьирующейся аффинностью. Например, RI связывается с членами надсемейства рибонуклеаз бычьей панкреатической рибонуклеазы А(РНКазы А) с константами ингибирования, изменяющимися в диапазоне десяти порядков величин, причем K1 находится в диапазоне от 10-6 до 10-16 М. А-РНКазы ОHKОHAЗA, подобная РНКазе А и BSРНКазе, является челном надсемейства РНКаз А. Члены надсемейства РНКаз А имеют приблизительно 30%-ную идентичность аминокислотных последовательностей. Большая часть неконсервативных остатков расположены в поверхностных петлях и, по-видимому, играют существенную роль в расшифрованной биологической активности каждой РНКазы. ОHKОHAЗA была выделена из яйцеклеток и ранних эмбрионов северной леопардовой лягушки (Rana pipiens). Она обладает противоопухолевым действием на различные солидные опухоли как in situ, так и in vivo (Mikulski S.M.,et al., 1990 J. Natl. Cancer 17; 82 (2) :151-3). Было также обнаружено, что ОНКОНАЗА специфически ингибирует репликацию ВИЧ-1 в инфицированных лейкозных клетках Н 9 в нетоксической концентрации (Youle R.J., et al., 1994, Proc.Natl. Acad. Sci. 21; 91(13):6012-6). Хотя РНКазная активность ОНКОНАЗЫ является относительно низкой, считается, что ее ферментативная и цитотоксическая активности связаны до некоторой степени. Считается, что третичная структура А-РНКаз различается между цитотоксическими и нецитотоксическими типами. Например, считается, что различия между третичной структурой ОНКОНАЗЫ и РНКазы А являются ответственными за увеличенную цитотоксичность, наблюдаемую для ОНКОНАЗЫ. ОHKОHAЗA, в противоположность РНКазе А, содержит блокированный Nконцевой остаток Glul (пироглутамат), который является существенным как для ферментативной, так и для цитотоксической активностей. Эта уникальная структура позволяет ОHKОHAЗE проникать в клетки-мишени (Boix E.,et al., 1996, J. Mol. Biol. 19:257(5):992-1007). Кроме того, в ОHKОHAЗE остаток Lys9 заменяет остаток РНКазы А, что, как считают, влияет на структуру активного сайта. Кроме того, различия в аминокислотной последовательности первичной структуры между ОНКОНАЗОЙ и РНКазой А обусловливают топологические изменения на периферии активного сайта, которые влияют на его специфичность (Mosimann 4 Различия в токсичности между АРНКазами приписывают также их способности связывать RI. Бычья семенная рибонуклеаза(БС-РНКаза) является на 80% идентичной в ее аминокислотной последовательности РНКазе А,но, в противоположность другим членам надсемейства РНКазы А, БС-РНКаза существует в димерной форме. Было показано, что четвертичная структура БС-РНКазы предотвращает связывание с RI, позволяя этому ферменту сохранять его рибонуклеолитическую активность в присутствии RI (Kim et al., 1995, J. Biol. Chem. 270 No. 52:31097-31102). ОHKОHAЗA, которая имеет высокую степень гомологии с РНКазой А,является устойчивой к связыванию RI. Комплекс RI-ОHKОHAЗA имеет Kа по меньшей мере в сто миллионов раз меньше, чем Kа комплекса RI-РНКаза А. Более низкая аффинность связывания ОНКОНАЗЫ в отношении RI предотвращает эффективное ингибирование рибонуклеолитической активности и могло бы объяснять, почему ОHKОHA3A является цитотоксичной при низких концентрациях, а РНКаза А не является цитотоксичной. Предполагается, что связывание с рецептором клеточной поверхности является первой стадией в цитотоксичности ОНКОНАЗЫ. Ничего неизвестно о характере рецепторов ОНКОНАЗЫ на поверхности клеток млекопитающих. ОHKОHAЗA может сзязываться с углеводами клеточной поверхности, как в случае рицина,или может связываться с рецепторами, первоначально развившимися для физиологически импортируемых молекул, подобных полипептидным гормонам (Wu Y, et al., 1993, J. Biol. Chem. 15; 268(14): 10686-93). У мышей, ОНКОНАЗА удалялась из почек при скорости в 50-100 раз более медленной, чем РНКаза А. Более низкая скорость удаления ОНКОНАЗЫ объясняется как результат ее более высокой способности связываться с клетками канальцев и/или ее устойчивости к протеолитическому разрушению. Сильная задержка ОНКОНАЗЫ в почках может приводить к клиническим осложнениям (Vasandani V.M., et al., 1996, Cancer Res. 15; 56(18):180-6). ОНКОНАЗА может также связываться с рецепторами EDN клеток Пуркинье(4) :540-52). Специфичность ОНКОНАЗЫ выражается также в ее тРНК-предпочтительности. В лизате ретикулоцитов кролика и в яйцеклетках Xenopus было обнаружено, что ОHKОHAЗA ингибирует белковый синтез посредством разрушения тРНК, а не посредством разрушения рРНК или мРНК. Напротив, РНКаза А деградирует в основном рРНК и мРНК (Lin J.J., et al.,1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 14; 204(1):156-62). Обработка восприимчивых культур ткани ОНКОНАЗОЙ приводит к накоплению клеток,задержанных в фазе G1 клеточного цикла,имеющих очень низкий уровень содержания 5 РНК (Mosimann S.C., et al., 1992, Proteins 14 (3): 392-400). В клетках глиомы ОНКОНАЗА ингибировала белковый синтез без значимого уменьшения плотности клеток, что указывало на то, что ОНКОНАЗА является также цитотоксичной для клеток, кроме того, что она является цитостатической (Wu Y, et al., 1993, J. Biol.Chem. 15; 268(14): 10686-93). ОНКОНАЗА,комбинированная с химиотерапевтическими агентами, может преодолевать устойчивость к множественным лекарственным средствам. Лечение винкристином и ОНКОНАЗОЙ увеличивало среднее время выживания (MST) мышей,несущих устойчивые к винкристину опухоли, до 66 дней, в сравнении с 44 днями в случае мышей, получавших только винкристин (Schein,C.H., et al., 1997, Nature Biotechnоl. 15:529-536). Кроме того, некоторые химиотерапевтические агенты могут действовать синергически с ОНКОНА 3 ОЙ. В линиях опухолевых клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека и рака легкого человека, обработанных комбинацией ОНКОНАЗЫ и тамоксифена (антиэстрогена), трифторперазина (стелазина, ингибитора кальмодулина) или ловастатина (3-гидроксил-3 метилглутатил-кофермент(HMG-CoA)редуктазы), наблюдали более сильное ингибирование роста, чем в случае клеток, обработанных только ОНКОНАЗОЙ (Mikulski S.M., et al.,1990, Cell Tissue Kinet. 23 (3) :237-46). Таким образом, возможность развития схем комбинированной терапии с более высокой эффективностью и/или меньшей токсичностью является очевидной. Бычья семенная РНКаза является уникальным членом семейства РНКазы А, так как она является единственной РНКазой, содержащей димер РНКаза А-подобных субъединиц, связанных двумя дисульфидными мостиками. Кроме того, она сохраняет аллостерическую регуляцию как продуктами субстрата, так и продуктами реакции. Эта регуляция происходит в фазе циклического гидролиза нуклеотидов. Она способна расщеплять как одноцепочечную, так и двухцепочечную РНК. БС-РНКаза является высоко цитотоксичной. Она проявляет противоопухолевое действие in vitro на мышиных лейкозных клетках, клетках HeLa и клетках легких зародыша человека, клетках нейробластомы мышей и фибробластах человека и клеточных линиях плазмацитомы мышей. При введении in vivo крысам, имеющим солидные карциномы (фолликулярную карциному щитовидной железы и ее метастазы в легких), БС-РНКаза индуцирует резкое уменьшение веса опухоли без определяемых токсических действий на подвергнутых обработке животных (Laccetti, P. et al., 1992,Cancer Research 52:4582-4586). Искусственно мономеризованная БС-РНКаза имеет более высокую рибонуклеазную активность, но более низкую цитотоксичность, чем нативная БСРНКаза (D'Allessio G., et al., 1991, TIBS:104 004929 6 106). Это, опять же, указывает на важность молекулярной структуры для биологической активности. Кажется, что, подобно ОНКОНАЗЕ,БС-РНКаза связывается с сайтом (сайтами) узнавания на поверхности клеток-мишеней, перед вхождением в клетки-мишени. Кроме того, что БС-РНКаза является цитотоксичной, она является также иммунорепрессивной. БС-РНКаза может блокировать пролиферацию активированных Т-клеток и пролонгировать выживание кожных трансплантатов,трансплантированных в аллохтонных мышей. Иммунорепрессивная активность БС-РНКазы объясняется необходимостью защиты клеток спермы от женской иммунной системы. Т 2-РНКазы В растениях самонесовместимость является частой и эффективной в предотвращении самооплодотворения. Пыльца, несущая конкретный аллель в локусе S, который контролирует самонесовместимость, неспособна оплодотворять растения, несущие тот же самый S-аллель. Во многих самонесовместимых растениях, особенно членах семейств Solanaceae и Rosaceae, SРНКаза, член семейства Т 2-РНКаз, секретируется женскими органами. S-РНКаза специфически узнает собственную пыльцу и останавливает ее рост в рыльце или столбике перед наступлением оплодотворения (Clarke, A.E. and Newbigin, E.,1993, Ann. Rev. Genet. 27:257-279), считают, что остановка роста пыльцевой трубки является прямым следствием разрушения РНК, однако,механизм вхождения S-РНКазы в клетку пыльцевой трубки все еще является неясным. Члены семейства РНКаз Т 2 были первоначально идентифицированы в грибах (Egami, F,and Nakamura, К. 1969, Microbial ribonucleases.Springer-Verlag, Berlin). С тех пор они были обнаружены в большом разнообразии организмов,в диапазоне от вирусов до млекопитающих. В частности, Т 2-РНКазы обнаруживают гораздо более широкое распространение, чем подробно описанное семейство РНКазы А. Однако роль Т 2-РНКаз in vivo в клетках млекопитающих все еще является неизвестной. В общем, признанным является то, что в микроорганизмах внеклеточные Т 2-РНКазы способствуют расщеплению полирибонуклеотидов, присутствующих в среде для выращивания, что приводит к возникновению диффундируемых питательных веществ. Они могут также служить в качестве защитных агентов (Egami, F,and Nakamura, К. 1969, Microbial ribonucleases.Springer-Verlag, Berlin). В растениях Т 2-РНКазы играют роль в процессе опыления, селективно ограничивая удлинение пыльцевых трубок, растущих в направлении семяпочек (Roiz, L. and Shoseyov, O.,1995, Int. J. Plant Sci. 156:37-41, Roiz L. et al.,1995, Physiol. Plant. 94:585-590). До настоящего времени механизм, при помощи которого эти 7 РНКазы влияют на пыльцевые трубки, является неясным. Таким образом, существуют несколько примеров цитотоксических рибонуклеаз, которые могут эффективно использоваться в качестве агентов лечения злокачественных опухолей. Новые рибонуклеазы с активностями, направленными против пролиферации, против колонизации, против дифференцировки и/или против развития в отношении клеток млекопитающих,должны увеличить спектр лекарственных средств, доступных для лечения злокачественных опухолей человека для открывания посредством этого новых горизонтов в области лечения злокачественной опухоли. Таким образом, существует широко признаваемая потребность в новых рибонуклеазах,и было бы чрезвычайно выгодно иметь новую РНКазу, которая имеет потенциал применимости в лечении пролиферативного заболевания человека, такого как злокачественная опухоль. Сущность изобретения Один аспект данного изобретения относится к способу предупреждения, ингибирования и/или обращения пролиферации, колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих клеток у субъекта,причем этот способ предусматривает стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2. Другой аспект данного изобретения относится к способу предупреждения, ингибирования и/или обращения пролиферации, колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих клеток у субъекта,причем этот способ предусматривает стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2. Еще один аспект данного изобретения относится к способу (i) лечения опухоли у субъекта; (ii) предупреждения, ингибирования и/или обращения развития опухоли у субъекта; (iii) предупреждения, ингибирования и/или обращения трансформации доброкачественной опухоли в злокачественную опухоль у субъекта; (iv) предупреждения, ингибирования и/или обращения ангиогенеза опухоли у субъекта; (v) уменьшения числа отдельных опухолей у субъекта; (vi) уменьшения размера опухоли у субъекта; (vii) уменьшения числа злокачественных опухолей у субъекта и (viii) предупреждения, ингибирования и/или обращения трансформации ткани в опухоль у субъекта, причем каждый из этих способов выполняют введением субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2 или терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2. 8 Еще один аспект данного изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей рибонуклеазу семейства Т 2 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель. Дополнительный аспект данного изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента полинуклеотид, кодирующий и способный экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2, и фармацевтически приемлемый носитель. Еще один дополнительный аспект данного изобретения относится к способу приготовления лекарственного средства, применимого в предупреждении, ингибировании и/или обращении пролиферации, колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих клеток у субъекта, предусматривающему стадию комбинирования рибонуклеазы семейства Т 2 с фармацевтически приемлемым носителем. Еще один дополнительный аспект данного изобретения относится к способу приготовления лекарственного средства, применимого в предупреждении, ингибировании и/или обращении пролиферации, колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих клеток у субъекта, предусматривающему стадию комбинирования полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2, с фармацевтически приемлемым носителем. Согласно дополнительным признакам предпочтительных осуществлений данного изобретения, описанных ниже, рибонуклеаза семейства Т 2 по существу не имеет рибонуклеолитической активности. Применяемая здесь фраза "по существу не имеет рибонуклеолитической активности" относится к (i) инактивированной рибонуклеазе (природной или рекомбинантной) семейства Т 2, которая имеет 0-10%ную рибонуклеолитическую активность в сравнении с подобной неинактивированной рибонуклеазой; и/или (ii) рекомбинантной мутантной (природной или индуцированной человеком) рибонуклеазе семейства Т 2, которая имеет 0-10%-ную рибонуклеолитическую активность в сравнении с подобной немутантной рибонуклеазой. Инактивация рибонуклеазной активности рибонуклеазы семейства Т 2 может быть осуществлена способом, выбранным из группы, состоящей из кипячения, автоклавирования и химической денатурации. Согласно дополнительным признакам описанных предпочтительных осуществлений, ненормально пролиферирующими клетками являются раковые клетки. Согласно другим дополнительным признакам описанных предпочтительных осуществлений, стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества РНКазы семейства Т 2 выполняют способом введения, выбранным из 9 группы, состоящей из перорального введения,местного введения, чресслизистого введения,парентерального введения, ректального введения и введения посредством ингаляции. Согласно дополнительным признакам описанных предпочтительных осуществлений, рибонуклеазой семейства Т 2 является РНКаза В 1. Согласно другим дополнительным признакам описанных предпочтительных осуществлений, рибонуклеаза семейства рибонуклеаз Т 2 выбрана из группы, состоящей из РНКазы Т 2,РНКазы Rh, РНКазы М, РНКазы Trv, РНКазыIrp, РНКазы Le2, РНКазы Phyb, РНКазы LE,РНКазы МС, РНКазы CL1, РНКазы Bspl, РНКазы RCL2, РНКазы Dm, РНКазы Оу и РНКазы Тр. Согласно другим дополнительным признакам описанных предпочтительных осуществлений идентифицировано лекарственное средство,которое обеспечивает лечение указанного пролиферативного нарушения или заболевания,такого как указанная злокачественная опухоль. Согласно другим дополнительным признакам описанных предпочтительных осуществлений ненормально пролиферирующие клетки являются клетками, ассоциированными с пролиферативным нарушением или заболеванием,выбранным из группы, состоящей из папилломы, бластоглиомы, саркомы Капоши, меланомы,рака легкого, рака яичника, рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы, астроцитомы, злокачественной опухоли головы, злокачественной опухоли шеи, рака мочевого пузыря,рака молочной железы, колоректального рака,рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, гепатоцитомерной карциномы, лейкоза, лимфомы, болезни Ходжкина,болезни Беркитта, артрита, ревматоидного артрита, диабетической ретинопатии, ангиогенеза,рестеноза, рестеноза в стентах для расширения сосудов и рестеноза в сосудистых трансплантатах. Данное изобретение успешно устраняет недостатки известных в настоящее время форм посредством раскрытия новых активностей рибонуклеаз семейства Т 2, применимых для профилактики, ингибирования и обращения пролиферативных заболеваний или нарушений, таких как злокачественная опухоль. Краткое описание чертежей Данное изобретение описано здесь только посредством примеров со ссылкой на сопутствующие рисунки. Теперь с конкретной подробной ссылкой на рисунки подчеркивается, что эти приведенные конкретные подробности даются в качестве примера и только для цели иллюстративного обсуждения предпочтительных вариантов данного изобретения и представлены для обеспечения, как считают авторы, наиболее полезного и легко понимаемого описания принципов и концептуальных аспектов данного изобретения. В этой связи не делаются попытки 10 показать структурные подробности данного изобретения в еще больших деталях, чем это необходимо для фундаментального понимания данного изобретения, причем описание, взятое вместе с этими рисунками, делает очевидным для специалистов в данной области, каким образом некоторые формы данного изобретения могут быть осуществлены на практике. На чертежах фиг. 1 является графическим представлением поглощения и РНКазной активности РНКазы Bl Aspergillus nider, выделенной согласно описаниям Roiz, L. and Shoseyov, 0., 19 95, Int. Plant Sci. 156:37-41. График А представляет фракции, полученные при помощи EMDTMAE-колоночной хроматографии неочищенного фильтрата, тогда как график 3 представляет фракцию, полученную из MONO-Qколоночной хроматографии активных фракций,полученных из EMD-TMAE-хроматографии неочищенного фильтрата. Сплошная линия представляет поглощение при 280 нм, а пунктирная линия представляет РНКазную активность. Фиг. 2 является ДСН-ПААГ-зимограммой,иллюстрирующей увеличение концентрации белка РНКазы В 1 в ходе использованных стадий очистки. Дорожка 1 представляет неочищенный фильтрат; дорожка 2 представляет элюат изEMD-TMAE-колонки; дорожка 3 представляет элюат из MONO-Q-колонки; дорожка 4 представляет элюат дорожки 3, анализированный insitu на РНКазную активность и окрашенный толуидином синим; дорожка 5 представляет очищенную РНКазу после дегликозилирования ПНГазой F. Дорожки 1-3 и 5 окрашены кумасси синим. Фиг. 3 является графиком, иллюстрирующим действие in vitro различных концентраций РНКазы В 1 на прорастание пыльцы персика(сплошная линия с черными квадратами) и длину пыльцевой трубки (пунктирная линия с белыми блоками). Фиг. 4 а и 4b иллюстрируют действие РНКазы В 1 на рост пыльцевых трубок в рыльце и верхней части столбика. Фиг. 4 а представляет контрольный цветок, тогда как фиг. 4b представляет цветок, обработанный РНКазой В 1 перед опылением. Черта = 0,2 мм. Фиг. 5 а и 5b иллюстрируют действие РНКазы В 1 на рост пыльцевых трубок в столбике цветка мандарина (тангерина). Фиг. 5 а представляет контрольный цветок, который был экспонирован перекрестному опылению в течение 48 ч. Фиг. 5b представляет цветок, который обрабатывали РНКазой В 1 перед опылением. Черта =0,1 мм. Фиг. 6 а и 6b иллюстрируют тест жизнеспособности, проводимый на семенах нектарина 11 семя, продуцируемое обработанным РНКазой В 1 цветком. Черта = 0,3 мм. Фиг. 7 иллюстрирует действие РНКазы В 1,необработанной, прокипяченной или автоклавированной, на длину пыльцевых трубок лилии сорта Osnat. Фиг. 8 а и 8b иллюстрируют действие РНКазы В 1 на пыльцевые трубки лилии, выращиваемые in vitro и окрашенные IKI. Фиг. 9 а и 9b иллюстрируют неподвижные фотоснимки, сделанные из интегрированных видеоизображений, показывающие движение и локализацию органелл в необработанных РНКазой В 1 (фиг. 9 а) и обработанных РНКазой В 1(фиг. 9b) пыльцевых трубках. Фиг. 10 а и 10b иллюстрируют действие РНКазы B1 на филаменты актина в растущей пыльцевой трубке лилии. Фиг. 10 а представляет контрольную пыльцевую трубку, тогда как фиг. 10b представляет обработанную РНКазой В 1 пыльцевую трубку. Обе пыльцевые трубки отрезали и окрашивали TRITC-фаллоидином для визуализации после экспериментирования. Фиг. 11 является графиком Скетчарда,представляющим связывание РНКазы В 1 с актином. А - концентрация актина (мкМ), Rf концентрация свободной РНКазы В 1 (мкМ), Rbконцентрация связанной РНКазы В 1 (мкМ). Фиг. 12 а-с иллюстрируют окрашенные иммунозолотом-серебром пыльцевые трубки лилии, росшие в течение 1 ч. Фиг. 12 а представляет контроль, тогда как фиг. 12b и 12 с, обе,представляют обработанные РНКазой B1 пыльцевые трубки. Пыльцевую трубку фиг. 12b инкубировали с кроличьей неиммунной сывороткой, тогда как пыльцевую трубку фиг. 12 с инкубировали с кроличьим поликлональным антителом против РНКазы В 1. Фиг. 13 а и 13b иллюстрируют действие различных концентраций РНКазы В 1 на жизнеспособность раковых клеток ободочной кишки НТ 29. Повторные пробы этих клеток выращивали в течение 48 ч или в течение 72 ч при 37 С,визуализировали с использованием дифференциального окрашивания трипановым синим и считали. Фиг. 13 а представляет общие числа клеток, тогда как фиг. 13b представляет число мертвых клеток. Фиг. 14 иллюстрирует действие РНКазы В 1 на клоногенность клеток НТ 29. Повторные пробы клеток предынкубировали со средой для выращивания в отсутствие или в присутствии 10-6 М РНКазы В 1 в течение 48 ч, трипсинизировали, промывали, ресуспендировали в не содержащей РНКазу В 1 среде для выращивания в серийных разведениях и высевали в 96 луночные микротитрационные планшеты для колонизации в течение 14 дней. Колонки считали после фиксации и окрашивания метиленовым синим. Фиг.15 иллюстрирует действие периода экспонирования РНКазе В 1 на клоногенность 12 клеток НТ 29. Повторные пробы клеток предынкубировали со средой для выращивания, содержащей 10-6 М РНКазу В 1, в течение 48 ч и затем давали образовывать колонии в среде для выращивания, содержащей ту же самую концентрацию РНКазы В 1, или в не содержащей РНКазы В 1 среде. Колонизацию выполняли в 96-луночных микротитрационных планшетах в течение 7 дней. Каждый вариант обработки содержал различные исходные числа клеток на лунку. Колонии считали после фиксации и визуализации в метиленовом синем. Клетки, предынкубированные и колонизированные в не содержащей РНКазу В 1 среде для выращивания,служили в качестве контроля. Фиг. 16 а-с иллюстрируют действие РНКазы В 1 на способность колонизации клеток НТ 29. Контрольные клетки (фиг. 16 а) предынкубировали 48 ч в не содержащей РНКазы В 2 среде для выращивания и затем трипсинизировали и инкубировали в той же самой среде для выращивания в 96-луночных микротитрационных планшетах для колонизации. Фиг. 16b представляет клетки, которые предынкубировали в течение 48 ч в среде для выращивания, содержащей 10-6 М РНКазу В 1, а затем им давали образовывать колонии в не содержащей РНКазу В 1 среде для выращивания. Фиг. 16 с представляет клетки, которые предынкубировали и затем колонизировали в среде для выращивания содержащей 10-6 М РНКазу В 1. Колонии клеток визуализировали окрашиванием метиленовым синим. Фиг. 17 является схемой экспериментов invivo, проводимых на крысах, описывающей обработку для каждой группы крыс. Фиг. 18 демонстрирует действие двух различных рН на скорость высвобождения РНКазы В 1 из микрокапсул САР. Микрокапсулы, содержащие 10 мг РНКазы В 1, суспендировали в 10 мл 0,1 М НСl (рН 1) или 0,1 М Трис-буфере(рН 8) и инкубировали при 37 С при перемешивании. Пробы верхнего раствора брали каждые 30 мин для определений активности РНКазы. Фиг. 19 а-d демонстрируют действие РНКазы В 1 и/или DMH на скорость роста крыс, как показано весом тела в конце каждого эксперимента. Исходный вес крысы был приблизительно 200 г. n = 6. 19 а - ЗФР, РНКазу В 1 или IРНКазу В 1 вводили через осмотические насосы при неделях 1-9 после первой инъекции DMH(превентивная обработка). В качестве контроля использовали крыс, обработанных, как описано выше, но в отсутствие DMH. 19b - ЗФР, РНКазу В 1 или I-РНКазу В 1 вводили через осмотические насосы при неделях 12-17 после первой инъекции DMH (терапевтические обработки). 19 с - Крыс кормили микрокапсулами, содержащими РНКазу В 1 или глюкозу в качестве превентивной обработки. В качестве контроля использовали крыс, обработанных, как описано выше, но в отсутствие DMH. 19d - Крыс корми 13 ли микрокапсулами, содержащими РНКазу В 1 или глюкозу. Фиг. 20 а-с демонстрируют РНКазную активность в фекалиях крыс, имплантированных осмотическими насосами, содержащими РНКазу В 1 (20 а), I-РНКазу В 1 (20b) или ЗФР (20 с), в качестве превентивной обработки. В качестве контроля крыс обрабатывали РНКазой В 1 или ЗФР в отсутствие DMH. РНКазную активность определяли, как описано в разделе примеры ниже. Фиг. 21 демонстрирует РНКазную активность в фекалиях крыс, которых кормили микрокапсулами, содержащими РНКазу В 1 или глюкозу в превентивной обработке. В качестве контроля крыс кормили РНКазой В 1 или глюкозой в отсутствие DMH. РНКазную активность определяли, как описано в разделе примеры ниже. Фиг. 22 показывает число аберрантных очагов крипт (ACF) в дистальной ободочной кишке (5 см) крыс, имплантированных осмотическими насосами в качестве превентивной обработки (n = 6). Фиг. 23 а-с демонстрируют действие РНКазы В 1 на различные параметры, определяемые в дистальной (5 см) ободочной кишке крыс, получавших с кормом микроинкапсулированную РНКазу В 1 или глюкозу, в качестве превентивной обработки (n = 6); 23 а - число опухолей на ободочную кишку; 23b - размер опухоли; 23 с ACF на ободочную кишку. Фиг. 24 а-d демонстрируют различные типы опухолей, сфотографированных при нижней слизистой поверхности через 1 ч после вырезания. 24 а - красные опухоли; 24b - белые опухоли. 24 с - розовая опухоль и красная опухоль; 24d распределение трех типов опухолей в крысах, получавших микрокапсулы, содержащие глюкозу или РНКазу В 1, в качестве превентивной обработки. Фиг. 25 а-d показывают гистопатологическое исследование опухолей, окрашенных красителями гематоксилином Майера и martiusжелтым. 25 а - аденома или аденопапиллома доброкачественная опухоль; 25b - аденокарцинома, в которой клетки слизистой оболочки проникли под субмукозу; 25 с - хорошо развитая аденокарцинома, в которой расположение ткани является полностью нарушенным; 25d - характер распределения типов аденомы и аденокарциномы опухолей в ободочных кишках крыс,обработанных инкапсулированной глюкозой или РНКазой В 1, в качестве превентивной обработки. Фиг. 26 а-с демонстрируют действие РНКазы В 1 на различные параметры, исследованные в дистальной ободочной кишке (5 см) крыс, обработанных осмотическими насосами, содержащими ЗФР, РНКазу В 1 или I-РНКазу В 1, в качестве терапевтической обработки. 26 а - число опухолей на ободочную кишку; 26b004929 14 распределение опухолей по размеру; 26 с - распределение опухолей по цвету, указывающему на ангиогенез. Фиг. 27 а-с демонстрируют действие РНКазы В 1 на различные параметры, исследованные в дистальной ободочной кишке (5 см) крыс, получавших в виде корма микроинкапсулированные РНКазу B1 или глюкозу в качестве терапевтических обработок. 27 а - число опухолей на ободочную кишку; 27b - распределение опухолей по размеру; 27 с - распределение опухолей по цвету, указывающему на ангиогенез. Фиг. 28 а-b показывают культивируемые клетки карциномы ободочной кишки человека НТ-29 4-d, окрашенные TRITC на актин. 28 а контрольные клетки; 28b - клетки, которые росли в присутствии 10-6 М РНКазы В 1. Фиг. 29 а-b показывают культивируемые клетки карциномы ободочной кишки человека НТ-29 4-d, иммуноокрашенные на мембранный актин. 28 а - контрольные клетки; 28b - клетки,которые росли в присутствии 10-6 М РНКазы В 1. Фиг. 30 а-с показывают культивируемые клетки карциномы ободочной кишки человека НТ-29 4-d, иммуноокрашенные FITC. Антитела против РНКазы В 1 использовали в качестве первого антитела. 30 а - контрольные клетки; 30b- клетки, которые росли в присутствии РНКазы В 1, обнаруживающие РНКазу В 1, связанную с клеточной поверхностью; 30 с - неиммунную сыворотку (PIS) использовали в качестве первого антитела. Фиг. 31 демонстрирует действие различных белковых обработок на длину пыльцевых трубок лилии. Пыльцевые трубки выращивалиin vitro в течение 1 ч при 25 С, как описано в разделе "Примеры", который следует далее. Описание предпочтительных вариантов Данное изобретение описывает применение рибонуклеазы семейства Т 2 или кодирующего ее полинуклеотида для предупреждения,ингибирования и/или обращения пролиферации,колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферующих клеток у субъекта. Далее данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим, в качестве активного ингредиента, рибонуклеазу семейства Т 2 или кодирующий ее полинуклеотид, для лечения пролиферативных заболеваний или нарушений, в общем, и злокачественной опухоли, в частности. Применение рибонуклеаз с цитотоксической активностью для ингибирования пролиферации опухолевых клеток не является новым и было продемонстрировано ранее в данной области. Было показано, что рибонуклеаза семейства А, которая коммерчески известна как ОHKОHAЗA, ингибирует клеточную пролиферацию в опухолевой ткани в клинических испытаниях. Было показано, что несколько других РНКаз надсемейства А РНКаз имеют цитоток 15 сическую активность, кроме их рибонуклеолитической активности. Хотя цитотоксичность некоторых рибонуклеаз зависит в некоторой степени от их рибонуклеолитической активности, уровень рибонуклеолитической активности не всегда коррелирует с уровнем цитотоксичности, наблюдаемой для рибонуклеаз. Кроме того, существуют несколько примеров рибонуклеаз, которые совершенно не проявляют цитотоксической активности, но хорошо функционируют в качестве рибонуклеаз. Наиболее известным примером является РНКаза А. В других случаях, скорость этой реакции ослабляется для более специфического связывания или улучшенной функции в некоторой другой компетенции. Например, активный сайт ангигенина блокируется боковыми цепями, которые не присутствуют в РНКазе А,делая его в 10000 раз менее активным на общих субстратах, но более специфическим в расщеплении рибосомной РНК. БС-РНКаза является более быстрой нуклеазой, когда она является мономерной. Однако ее цитотоксичность является более высокой, и ингибирование ингибитором рибонуклеазы значительно снижается в димерной форме. Гликозилированная РНКаза В является менее активной, чем БС-РНКаза, на большинстве субстратов, хотя часто наблюдаемое деамидирование в БС-РНКазе (аспарагин 67 изоаспартат) уменьшает активность мутантов РНКазы А расщеплением всей цепи структур с Н-связями в этом белке (обзор в Shein, C.H. 1997. Nature Biotechnol. 15:529-536). Рибонуклеазы семейства Т 2 отличаются их уникальными молекулярными признаками. Сравнение между РНКазными членами семейств А и Т 2 суммировано ниже в табл. 1 (положение аминокислот после РНКазы А и РНКазы Т 2 в семействах А и Т 2, соответственно). Таблица 1 16 Рибонуклеазы семейства Т 2 были идентифицированы в многочисленных микроорганизмах, а также в растениях, в которых они играют активную роль в процессе опыления, посредством селективного ограничения удлинения пыльцевых трубок, направляющихся к семяпочкам. Как обнаружено авторами данного изобретения и как дополнительно объяснено подробно ниже в примерах 1, 2 и 6, РНКаза В 1, Т 2 рибонуклеаза, либо рибонуклеолитически активная, либо рибонуклеолитически неактивная,специфически связывается с актином в удлинении пыльцевых трубок для ингибирования посредством этого удлинение пыльцевых трубок и также с актином клеток млекопитающих. Известно, что актин образует филаменты,которые являются существенными цитоскелетными компонентами клеток, активными как в поддержании клеточной структуры, так и в поддержании внутриклеточного транспорта органелл. В результате, филаменты актина участвуют во многих клеточных процессах во время всего жизненного цикла нормальных и отклоняющихся от нормы клеток, в том числе пролиферации,колонизации,дифференцировке,трансформации и других аспектах развития,включающих в себя образование ткани. Многочисленные исследования показали, что актин участвует в различных клеточных процессах,регулирующих образование раковых клетокBiol. 10:123-130; Jammy, P.A.Chaponnier, C. 1995. Curr. Opin. Cell Biol. 7:111-117; Sigmond,S.H. 1996. Curr. Opin. Cell Biol. 8:66-73; Tapon,N. et al., 1997. Curr. Opin. Cell Biol. 9:86-92). Так,например, филаменты актина участвует в аномальной пролиферации клеток (Assoian, R.K.and Zhu, X. 1997. Curr. Opin. Cell Biol. 9:93-89). Было обнаружено, что злокачественные клетки являются более чувствительными к цитохалазину В, чем нормальные клетки (Hemstreet G.P. etal., 1996. J. Cell Biochem. 25S:197-204). Поскольку актин является высококонсервативным белком, сохраняющим высокий уровень гомологии между эволюционно отдаленными организмами, была высказана гипотеза,что актинсвязывающая активность РНКазы В 1,которая ингибирует удлинение пыльцевых трубок, может быть использована, без ограничения данной теорией, для специфического связывания актина клеток млекопитающих для ингибирования посредством этого пролиферации, колонизации, дифференцировки и/или развития. Если свести данное изобретение к практике, и, как описано дополнительно в примерах 2 и 5 в разделе "Примеры", экзогенная РНКаза В 1 связывается с актином мембран и вызывает нарушение клеточной актиновой сетки. Как показано в примерах 3-5, действие РНКазы В 1 на раковые клетки млекопитающих исследовали дополнительно in vitro и in vivo. Как ясно пока 17 зано здесь, РНКаза Bl (i) существенно уменьшает пролиферацию и/или колонизацию клеток аденокарциномы, выращиваемых в культуре; и(ii) уменьшает число аберрантных очагов крипт(ACF), снижает число и уменьшает размер опухолей, препятствует ангиогенезу опухолей,снижает злокачественность опухолей и переход от аденомы к аденокарциноме в модели карциномы ободочной кишки крысы, превентивным и/или терапевтическим образом, не обнаруживая явных побочных действий на здоровую ткань в ободочной кишке или в ином месте. Перед подробным объяснением по меньшей мере одного варианта данного изобретения должно быть понятно, что данное изобретение не ограничивается в его применении лишь деталями, изложенными в следующем описании или иллюстрированными примерами. Данное изобретение может иметь другие варианты или практиковаться или выполняться разнообразными путями. Должно быть также понятно, что фразеология и терминология, используемая здесь, применяется для цели описания и не должна рассматриваться как ограничительная. Должно быть также понятно, что данное изобретение не связано или не ограничивается никакой теорией или гипотезой, которые указаны здесь. Одна или несколько рибонуклеаз семейства Т 2 называются здесь собирательно Т 2 РНКазой. Подобным образом один или несколько полинуклеотидов, кодирующих одну или несколько рибонуклеаз семейства Т 2, собирательно называются здесь полинуклеотидом, кодирующим Т 2-РНКазу. Таким образом, согласно одному аспекту данного изобретения, обеспечен способ предупреждения, ингибирования и/или обращения пролиферации, колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферующих клеток у субъекта. Способ этого аспекта данного изобретения осуществляют введением этому субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2 или полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2, либо per se, либо в виде активного ингредиента фармацевтической композиции. Таким образом, в соответствии с другим аспектом данного изобретения обеспечена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента рибонуклеазу семейства Т 2 или полинуклеотид, кодирующий и способный экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2, и фармацевтически приемлемый носитель. Еще один дополнительный аспект данного изобретения относится к способу приготовления лекарственного средства, применимого в предупреждении, ингибировании и/или обращении пролиферации, колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих 18 клеток у субъекта, предусматривающий стадию комбинирования рибонуклеазы семейства Т 2 или полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2, с фармацевтически приемлемым носителем. Это лекарственное средство предпочтительно идентифицируют как обеспечивающее лечение для указанного пролиферативного нарушения или заболевания, такого как указанная злокачественная опухоль. Такая идентификация может быть напечатана, например, на контейнере, содержащем данное лекарственное средство,или на листочке, как хорошо известно в данной области. Способ и фармацевтическая композиция данного изобретения могут быть использованы,например, для (i) лечения опухоли у субъекта;(ii) предупреждения, ингибирования и/или обращения развития опухоли у субъекта; (iii) предупреждения, ингибирования и/или обращения трансформации доброкачественной опухоли в злокачественную опухоль у субъекта; (iv) предупреждения, ингибирования и/или обращения ангиогенеза опухоли у субъекта; (v) уменьшения числа отдельных опухолей у субъекта; (vi) уменьшения размера опухоли у субъекта; (vii) уменьшения числа злокачественных опухолей у субъекта и (viii) предупреждения, ингибирования и/или обращения трансформации ткани в опухоль у субъекта. Т 2-РНКаза может быть получена из нативного источника, как описано в примере 1, который следует далее, или альтернативно, она может быть получена в виде рекомбинантного белка с использованием подходящего полинуклеотида (см. табл. 2 ниже к следующие описания) и системы экспрессии. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков хорошо известны в данной области и могут быть выполнены любым из множества альтернативных способов,описанных подробно в любом из ряда справочников и книг с лабораторными протоколами, в том числе, например, "Molecular Cloning. A Для некоторых применений может быть полезным применение рибонуклеазы, которая по существу не имеет рибонуклеолитической активности, которая может иметь или вызывать нежелательные побочные действия. В применении здесь, фраза по существу не имеет рибонуклеолитической активности относится к (i) инактивированной рибонуклеазе (природной или рекомбинантной) семейства Т 2, которая имеет 0-10%-ную рибонуклеолитическую активность в сравнении с подобной, неактивированной, рибонуклеазой; и/или к (ii) рекомбинантной мутантной (природному изоляту или индуцированной человеком) рибонуклеазе семейства Т 2, которая имеет 0-10%-ную рибонуклеолитическую активность в сравнении с подобной, немутантной, рибонуклеазой. Инактивация рибонуклеолитической активности рибонуклеазы семейства Т 2 может быть осуществле 004929 20 на способом, выбранным из группы, состоящей из кипячения, автоклавирования и химической денатурации или инактивации. Как дополнительно описано подробно в примерах 2 и 6 ниже, авторами изобретения было показано, что активности РНКазы В 1 против пролиферации, против колонизации, против дифференцировки и/или против развития не зависят от ее рибонуклеолитической активности, так как прокипяченная, автоклавированная и химически инактивированная (ацетилированная) РНКаза В 1, которая имеет малую (10%) рибонуклеолитическую активность или, по существу, не имеет (0-10%) рибонуклеолитической активности, сохраняет, по существу, все ее активности против пролиферации, против колонизации, против дифференцировки и/или против развития. Таким образом, белок Т 2-РНКазы согласно данному изобретению может быть использован в нативной, рибонуклеолитически активной форме или, альтернативно, в молчащей или репрессированной рибонуклеолитической форме,не имеющей (0%) или имеющей небольшую (до 10%) рибонуклеолитическую активность, которая все еще сохраняет его другие активности. Как таковой, термин Т 2-РНКазы охватывает все формы этого белка, имеющие активности против пролиферации, против колонизации,против дифференцировки и/или против развития, независимо от его других активностей. Должно быть понятно, что применение Т 2 РНКазы, либо непосредственно, либо экспрессируемой из полинуклеотида, которая проявляет желательную активность, и все еще лишена, или репрессирована по рибонуклеолитической активности, является особенно выгодным, так как рибонуклеолитическая активность может продуцировать нежелательные побочные действия у субъекта. Полипептид, представляющий аминокислотную последовательность Т 2-РНКазы, как определено здесь, может быть получен любым из нескольких способов, хорошо известных в данной области. Например, этот полипептид может быть получен синтетически стандартными способами синтеза пептидов, например, с использованием стандартного химического способа с 9-флуоренилметоксикарбонилом (F-Moc)(см., например, Atherton, Е. and Sheppard, R.C. 1985, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 165) или стандартного химического способа с бутилоксикарбонатом (Т-Вос), хотя следует отметить, что,более недавно, нашла все увеличивающееся применение система с флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc)/трет-бутилом, разработаннаяLKB Journal 33,9). Альтернативно, белок Т 2-РНКаза может быть также выделен и очищен способами, хорошо известными в данной области, из организмов, которые, как известно, экспрессируют 21 этот белок. Такие организмы включают в себя,например, Aeromonas hydrophila, HaemophilusPhysarum polycephlum, Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum, Nicotiana alata, Malus domestica, Pyrus pyrifolia, Momordica charantia,Gallus gallus, Rana catesbeiana, Drosophyla melanogaster, Crassostera gigus, Todarodes pasificus и Нomo sapiens. Однако понятно, что другие организмы, о которых еще неизвестно, продуцируют Т 2-РНКазу, если они будут обнаружены в качестве таковых, могли бы также использоваться в качестве источника для Т 2-РНКазы в соответствии с данным изобретением. Альтернативно и предпочтительно, белок Т 2-РНКазы может быть получен рекомбинантно экспрессией полинуклеотида, кодирующего его,с использованием подходящей экспрессионной векторной системы. Предпочтительно, выбирают экспрессионную систему, которая обеспечивает подходящие посттрансляционные модификации. Подходящие экспрессионные векторные системы включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки млекопитающих, инфицированные вирусом (например, аденовирусом, ретровирусом, вирусом простого герпеса, вирусом птичьей оспы (дифтерита; клетки насекомых,инфицированные вирусом (например, бакуловирусом); генетически модифицированные растения или клетки растений, трансформированные плазмидой, вирусом растений или Agrobacterium; трансформированные микроорганизмы, такие как дрожжи, содержащие дрожжевые векторы, или бактерии, трансформированные ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Регуляторные элементы экспрессии векторов варьируются по их силе и спецификациям в зависимости от используемой системы хозяин-вектор, может быть использован любой из ряда подходящих элементов транскрипции и трансляции. Рекомбинантно полученная Т 2-РНКаза может быть очищена из клеток-хозяев аффинной хроматографией, электрофорезом, высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ), иммунопреципитацией,осаждением или любым другим способом, известным в данной области. Очищенная Т 2-РНКаза может быть использована для приготовления лекарственного средства в соответствии с данным изобретением посредством общепринятых способов смешивания, растворения, гранулирования, приготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, захватывания или лиофилизации с добавлением подходящих фармацевтически приемлемых носителей и/или наполнителей или альтернативно она может быть связана с подходящими доставляющими носителями, как описано выше. 22 Полинуклеотид в соответствии с данным изобретением может кодировать нативный белок Т 2-РНКазу, причем этот термин в данном контексте описывает Т 2-РНКазу, имеющую как антипролиферативную, так и рибонуклеолитическую активности, или, альтернативно, полинуклеотид в соответствии с данным изобретением может кодировать молчащий или репрессированный мутант Т 2-РНКазы, не имеющий рибонуклеолитической активности или имеющий невысокую рибонуклеолитическую активность,для экспрессии (например, транскрипции и трансляции) in vivo в белок, который, по существу, не содержит рибонуклеолитической активности. Как таковой, термин "полинуклеотид", в применении в контексте Т 2-РНКаз в общем, или в контексте любой конкретной Т 2-РНКазы, относится к любой полинуклеотидной последовательности, которая кодирует Т 2-РНКазу, активную в предупреждении, ингибировании и/или обращении пролиферации, колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих клеток, либо имеющую рибонуклеолитическую активность, либо лишенную рибонуклеолитической активности. Полинуклеотиды, кодирующие Т 2-РНКазу, лишенную рибонуклеолитической активности, могут быть получены с использованием известных молекулярно-биологических способов, таких как случайный мутагенез, сайт-направленный мутагенез и способы ускоренной эволюции. Сайт-направленный мутагенез может быть легко использован, так как аминокислотные остатки, существенные для рибонуклеолитической активности Т 2-РНКаз, были выяснены (см.Kusano et al., 1998. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:87-94, которая включена таким образом в качестве ссылки, и табл. 2 выше). Таким образом, данное изобретение может быть использовано для лечения состояний, синдромов или заболеваний, характеризующихся аномально пролиферирующими клетками, такими как раковые или иные клетки, такие как,но не только, клетки папилломы, бластоглиомы,саркомы Капоши, меланомы, рака легкого, рака яичника, рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы, астроцитомы, злокачественной опухоли головы, злокачественной опухоли шеи, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, гепатоцитомерной карциномы, лейкоза, лимфомы, болезни Ходжкина, болезни Беркитта, артрита, ревматоидного артрита, диабетической ретинопатии, ангиогенеза, рестеноза,рестеноза в стентах для расширения сосудов и рестеноза в сосудистых трансплантатах. В применении здесь, термины рак или опухоль являются клиническими описательными терминами, которые включают в себя мириады заболеваний, характеризующихся клет 23 ками, которые проявляют отклоняющуюся от нормы клеточную пролиферацию. Термин опухоль, при применении к ткани, обычно относится к любому отклоняющемуся от нормы росту ткани, характеризующемуся избыточной и аномальной клеточной пролиферацией. Опухоль может быть доброкачественной и неспособной распространяться из ее исходного очага,или злокачественной или метастатической и способной распространяться за пределы ее анатомического места в другие зоны по всему телу хозяина. Термин рак является старым термином, который обычно используют для описания злокачественной опухоли или патологического состояния, возникающего из нее. Альтернативно, в данной области отклоняющийся от нормы рост называют неоплазмой, а злокачественный отклоняющийся от нормы рост называют злокачественной неоплазмой. Любая рибонуклеаза семейства Т 2, которая имеет активности, направленные против пролиферации, против колонизации, против дифференцировки и/или против развития, описанные здесь и приведенные в разделе Примеры, которые следуют далее, может быть использована в качестве лекарственного средства в соответствии с описаниями данного изобретения. Подобным образом, любой полинуклеотид, кодирующий рибонуклеазу семейства Т 2, которая имеет активности, направленные против пролиферации, против колонизации, против дифференцировки и/или против развития, описанные здесь,может быть использован в качестве лекарственного средства в соответствии с описаниями данного изобретения. Неисчерпывающий список рибонуклеаз семейства Т 2 обеспечен в табл. 2 выше. Как дополнительно иллюстрируется нижеследующими примерами, РНКаза В 1, которая является членом семейства Т 2, имеет активности, направленные против пролиферации, против колонизации, против дифференцировки и/или против развития, как определено в анализах in vivo и in vitro. Кроме того, показано, что РНКаза В 1 связывается с актином, даже при обработке ее таким образом, что она не содержит рибонуклеазной активности. Таким образом, данное изобретение обеспечивает три различных анализа при помощи которых специалист с обычной квалификацией в данной области мог бы тестировать конкретную рибонуклеазу на ее активности, направленные против пролиферации, против колонизации, против дифференцировки и/или против развития, которые представляют собой in vitro тест для определения действия тестируемой рибонуклеазы на раковые клетки, in vivo тест для определения действия тестируемой рибонуклеазы на развитие опухоли и другой in vitro тест для определения способности тестируемой рибонуклеазы связываться с клеточным и/или свободным актином. Без ограничения данного изобретения какойлибо теорией, авторы изобретения считают, что 24 способность рибонуклеазы связываться с актином является признаком того, что такая рибонуклеаза имеет активности, направленные против пролиферации, против колонизации, против дифференцировки и/или против развития. Рибонуклеаза в соответствии с данным изобретением может быть введена в организм,такой как человек или любое другое млекопитающее, per se или в фармацевтической композиции, где ее смешивают с подходящими носителями или наполнителями. В применении здесь, "фармацевтическая композиция" или "лекарственное средство" относятся к препарату одной или нескольких рибонуклеаз или полинуклеотидов, кодирующих их, как описано здесь, с другими химическими компонентами, такими как физиологически подходящие носители или наполнители. Целью фармацевтической композиции является облегчение введения соединения организму. Здесь термин "наполнитель" обозначает инертное вещество, добавляемое к фармацевтической композиции для дополнительного облегчения введения соединения. Примеры, без ограничения, наполнителей включают в себя карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли. Фармацевтические композиции могут также включать в себя один или несколько дополнительных активных ингредиентов, таких как,но не только, противовоспалительные агенты,антимикробные агенты, анестетики и т.п., кроме основного активного ингредиента. Фармацевтические композиции данного изобретения могут быть приготовлены способами, хорошо известными в данной области, например, посредством способов общепринятого смешивания, растворения, грануляции, приготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, захвата или лиофилизации. Таким образом, фармацевтические композиции для применения в соответствии с данным изобретением могут быть приготовлены общепринятыми способами с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, содержащих наполнители и вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных соединений в препараты, которые могут использоваться фармацевтически. Правильное приготовление зависит от выбранного пути введения. Таким образом, для выполнения введения фармацевтической композиции данного изобретения, которая включает в себя подходящий фармацевтический носитель и эффективное количество Т 2-РНКазы или кодирующего ее полинуклеотида, эту композицию вводят, например, местно, интраокулярно, парентерально,перорально, интраназально, внутривенно, внут 25 римышечно, подкожно или любым другим эффективным образом с использованием способов,известных в данной области. Для внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции Т 2-РНКаза или кодирующий ее полинуклеотид могут быть приготовлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенка, раствор Рингера или физиологический солевой раствор. Например, физиологически подходящий раствор, содержащий эффективное количество Т 2-РНКазы или кодирующего ее полинуклеотида, может быть введен системно в кровоток для лечения рака или опухоли,которая не может быть непосредственно достигнута или анатомически изолирована. Физиологически приемлемый раствор, содержащий эффективное количество Т 2-РНКазы или кодирующего ее полинуклеотида, может быть непосредственно инъецирован в ткань-мишень рака или опухоли иглой в количествах, эффективных для лечения опухолевых клеток ткани-мишени. Для введения через слизистую оболочку, в композиции используют смачивающие реагенты(пенетранты), пригодные для барьера, через который они должны проникать. Такие пенетранты обычно известны в данной области. Для перорального введения, фармацевтическая композиция данного изобретения может быть легко приготовлена объединением Т 2 РНКазы или кодирующего ее полинуклеотида с фармацевтически приемлемыми носителями,хорошо известными в данной области. Такие носители позволяют приготовить Т 2-РНКазу или кодирующий ее полинуклеотид в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей,сиропов, суспензий и т.п. для перорального приема пациентом. Фармакологические препараты для перорального применения могут быть приготовлены с использованием твердого наполнителя, с необязательным измельчением полученной смеси и обработкой смеси гранул после добавления подходящих вспомогательных веществ, если желательно, с получением центральных частей таблеток или драже. Подходящими наполнителями являются, в частности,такие наполнители, как сахара, в том числе лактоза, сахароза, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза,натрий-карбометилцеллюлоза; и/или физиологически приемлемые полимеры, такие как поливинилпирролидон(ПВП). Если желательно, могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Центральные части драже обеспечивают подходящим покрытием. Для этой цели могут быть использованы концентрированные раство 004929 26 ры сахаров, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, гель из карбопола, полиэтиленгликоль, диоксид титана, растворы лака и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут добавляться к покрытиям таблеток или драже для идентификации или для характеристики различных комбинаций доз активного ингредиента. Дополнительные фармацевтические композиции, которые могут быть использованы перорально, включают в себя капсулы из двух плотно подогнанных одна к другой половинок,сделанных из желатина, а также мягкие, заделанные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Капсулы из подогнанных половинок могут содержать Т 2-РНКазу или кодирующий ее полинуклеотид в смеси с наполнителем, например,лактозой, связывающими веществами, такими как крахмалы, смазывающими веществами, например, тальком или стеаратом магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах, Т 2-РНКаза или кодирующий ее полинуклеотид могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные (нелетучие) масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все композиции для перорального применения должны быть в дозах, подходящих для выбранного пути введения. Пероральная доставка фармацевтической композиции данного изобретения может быть неуспешной из-за рН и разрушения ферментами в желудочно-кишечном тракте. Таким образом,такие фармацевтические композиции должны приготовляться таким образом, чтобы избежать нежелательных обстоятельств. Например, на пероральную твердую композицию может быть нанесено энтеросолюбильное покрытие. Вещества с кислотоустойчивыми свойствами, такие как ацетат-фталат целлюлозы (САР), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР) и акриловые смолы наиболее часто применяют для покрытия таблеток или гранул с целью микроинкапсулирования. Предпочтительно используют мокрую грануляцию для получения гранул с энтеросолюбильным покрытием во избежание реакций между активным ингредиентом и покрытием (Lin, S.Y. and Kawashima, Y. 1987,Pharmaceutical Res. 4:70-74). Может быть также использован способ выпаривания растворителя. Способ выпаривания растворителя использовали для инкапсулирования инсулина, вводимого диабетическим крысам, для поддержания концентрации глюкозы в крови (Lin. S.Y. et al.,1986, Biomater, Medicine Device, Artificial organ 13:187-201 и Lin, S.Y. et al., 1988, BiochemicalArtificial Cells Artificial Organ 16:815-828). Этот способ использовали также для инкапсулирова 27 ния биологических материалов высокого молекулярного веса, таких как вирусный антиген и конканавалин A (Maharaj, I. et al. 1984, J. Pharmac. Sci. 73:39-42). Для буккального (щечного) введения фармацевтическая композиция данного изобретения может иметь форму таблеток или лепешек, приготовленных общепринятым способом. Для ректального введения могут применяться суппозитории, хорошо известные в данной области. Для введения ингаляцией, Т 2-РНКазу или кодирующий ее полинуклеотид для применения в соответствии с данным изобретением удобно доставлять в форме предоставления аэрозольным спреем из находящейся под давлением упаковки или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана или диоксида углерода. В случае находящегося под давлением аэрозоля единица дозы может определяться обеспечением клапана для доставки отмеренного количества. Капсулы и патроны, например, из желатина, для применения в ингаляторе или инсуффляторе (порошковдувателе) могут быть приготовлены таким образом, что они содержат порошкообразную смесь из Т 2-РНКазы или кодирующего ее полинуклеотида и подходящей порошкообразной основы, например, лактозы или крахмала. Фармацевтическая композиция данного изобретения может быть также приготовлена для парентерального введения, например, посредством болюсной инъекции или непрерывного вливания. Композиция для инъекции может предоставляться в унифицированной дозированной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах, необязательно с добавленным консервантом. Этими композициями могут быть суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях или они могут содержать способствующие приготовлению агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Фармацевтические композиции для парентерального введения включают в себя водные растворы активного препарата в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии Т 2-РНКазы или кодирующего ее полинуклеотида могут быть приготовлены в виде подходящих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно, суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты,которые увеличивают растворимость Т 2 004929 28 РНКазы или кодирующего ее полинуклеотида,для возможности приготовления высококонцентрированных растворов. Альтернативно, Т 2-РНКаза или кодирующий ее полинуклеотид могут быть приготовлены в порошкообразной форме для смешивания с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед применением. Фармацевтическая композиция данного изобретения может быть также приготовлена в виде ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, с использованием, например, обычных основ для суппозиториев, таких как какао-масло или другие глицериды. Кроме того, злокачественная опухоль или опухоль, присутствующие в полости тела, например в глазу, желудочно-кишечном тракте,мочеполовых путях (например, мочевом пузыре), легочной или бронхиальной системе и т.п.,могут получать физиологически приемлемую композицию (например, раствор, такой как солевой раствор или фосфатный буфер, суспензию или эмульсию, которые являются стерильными),содержащую эффективное количество Т 2 РНКазы или кодирующего ее полинуклеотида,посредством прямой инъекции с иглой или через катетер или иную трубку для доставки, помещенную в пораженный раком или опухолью полый орган. Любое эффективное для визуализации устройство, такое как рентген, сонограмма или волоконно-оптическая система визуализации, может быть использовано для определения местоположения ткани-мишени и направления иглы или катетера в участок в непосредственной близости от нее. Фармацевтическая композиция данного изобретения может также доставляться осмотическими микронасосами. Осмотические микронасосы имплантируют в одну из полостей тела,и лекарственное средство постоянно высвобождается на ткань, подлежащую лечению. Этот способ особенно выгоден при возникновении иммунной реакции на фармацевтическую композицию. Этот способ использовали для ОНКОНАЗЫ (Vasandani V.M., et al., 1996, CancerRes. 15; 56 (18) :4180-6). Альтернативно и в соответствии с другим предпочтительным вариантом данного изобретения, фармацевтически приемлемый носитель включает в себя доставляющий носитель, способный доставлять Т 2-РНКазу или кодирующий ее полинуклеотид в клетку млекопитающего субъекта. Многочисленные доставляющие носители и способы известны в данной области для нацеливания белков или нуклеиновых кислот в или на клетки опухолей или раков. Например, липосомы являются искусственными мембранными везикулами, которые способны доставлять белки или нуклеиновые кислоты в клетки-мишениCeccoll, J. et al., Journal of Investigative Dermatology, 1989, 93:190-1941). Таким образом, Т 2 РНКаза или кодирующий ее полинуклеотид могут быть инкапсулированы с высокой эффективностью липосомными везикулами и доставлены в клетки млекопитающего. Кроме того,белок или нуклеиновая кислота Т 2-РНКазы могут быть также доставлены в клетки-мишени опухоли или рака с использованием мицелл, как описано, например, в патенте США 5 925 628, выданном Lee, который включен в качестве ссылки. Инкапсулированные в лилосоме или мицелле Т 2-РНКаза или кодирующий ее полинуклеотид могут вводиться местно, интраокулярно,парентерально, интраназально, внутритрахеально, внутрибронхиально, внутримышечно, подкожно или любым другим эффективным способом в дозе, эффективной для лечения аномально пролиферирующих клеток ткани-мишени. Липосомы могут вводиться в любой физиологически приемлемой композиции, содержащей эффективное количество инкапсулированных Т 2 РНКазы или кодирующего ее полинуклеотида. Альтернативно и в соответствии с другим предпочтительным вариантом данного изобретения, доставляющим носителем могут быть, но не только, антитело или лиганд, способные связывать специфический рецептор или маркер клеточной поверхности. Антитело или лиганд могут быть непосредственно связаны с белком или нуклеиновой кислотой Т 2-РНКазы через подходящий линкер, или альтернативно такие антитело или лиганд могут быть обеспечены на поверхности липосомы, инкапсулирующей Т 2 РНКазу или кодирующий ее полинуклеотид. Например, Т 2-РНКаза или кодирующий ее полинуклеотид могут быть слиты со специфическими антителами или лигандами к мембранному белку для нацеливания на специфические ткани или клетки, как описано ранее в данной области. Должно быть понятно в этой связи, что слияние РНКазы А семейства рибонуклеаз А с антителами к рецептору трансферрина или с антигеном CD5 Т-клеток приводит к ингибированию белкового синтеза в опухолевых клетках,несущих специфический рецептор для каждого из вышеуказанных токсинов (Rybak, M. et al.,1991, J. Biol. Chem. 266:21202-21207 и NewtonDL, et al., 1997, Protein Eng. 10 (4): 463-70) . Фармацевтические композиции, пригодные для применения в связи с данным изобретением, включают в себя композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения предполагаемой цели. Более конкретно, терапевтически эффективное количество означает количество активных ингредиентов, эффективное для предупреждения, ослабления или смягчения симпто 004929 30 мов заболевания или продления выживания подлежащего лечению субъекта. Определение терапевтически эффективного количества находится вполне в рамках компетенции специалистов в данной области, особенно в свете обеспеченного здесь подробного описания. Токсичность и терапевтическая эффективность активных ингредиентов, описанных здесь,могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами в культурах клеток или на экспериментальных животных, например, определением IС 50 и LD50 (летальной дозы,вызывающей смерть у 50% испытуемых животных) для рассматриваемого активного ингредиента. Данные, полученные из этих тестов на культурах клеток и в исследованиях на животных, могут быть использованы в приготовлении диапазона доз для применения в случае человека. Доза может варьироваться в зависимости от используемой дозированной формы и от используемого пути введения. Точный состав,путь введения и доза могут быть выбраны врачом в связи с состоянием пациента (см., например, Fingl, et al., 1975, m "The PharmacologicalBasis of Therapeutics", Ch. 1 p.l). В зависимости от тяжести и восприимчивости состояния, подлежащего лечению, предоставление дозы может быть единственным введением композиции медленного высвобождения, с ходом терапии, длящимся от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор,пока не будет достигнуто излечивание или уменьшение патологического состояния. Как уже упоминалось выше, согласно аспекту данного изобретения, активным ингредиентом фармацевтической композиции является полинуклеотид, кодирующий Т 2-РНКазу. Согласно этому аспекту данного изобретения, полинуклеотид вводят в клетку млекопитающего вместе с фармацевтически приемлемым носителем, причем введение приводит к генетической модификации этой клетки, делая возможной экспрессию в ней Т 2-РНКазы. В применении в данном описании и в разделе формулы изобретения ниже, термин "генетическая модификация" относится к способу введения нуклеиновых кислот в клетки. Введение может, например, выполняться инфекцией вирусом, инъекцией, трансфекцией, бомбардировкой частицами или любыми другими способами, эффективными во введении нуклеиновых кислот в клетки, некоторые из этих способов дополнительно описаны более подробно ниже. После генетической модификации нуклеиновая кислота либо интегрируется в весь клеточный геном (ДНК) или в часть генома, либо остается вне клеточного генома, обеспечивая стабильно модифицированные или временно модифицированные клетки. 31 Как таковая, фармацевтическая композиция этого аспекта данного изобретения является применимой для генной терапии. В применении здесь, выражения "генная терапия" или "генетическая терапия" используются взаимозаменяемо и относятся к способу терапии, в котором стабильная или временная генетическая модификация пролиферативных клеток, таких как раковые клетки, приводит к ингибированию пролиферации этих клеток. Любой из полинуклеотидов, идентифицированных в табл. 2 номером доступа в банке генов (GenBank), может быть использован в соответствии с данным изобретением в качестве полинуклеотида, кодирующего Т 2-РНКазу. Кроме того, полинуклеотиды, гомологичные на 40 или более % и/или гибридизующиеся при слабых и/или строгих условиях гибридизации с перечисленными полинуклеотидами, могут быть также использованы в качестве полинуклеотида, кодирующего Т 2-РНКазу, при условии,что белок, кодируемый им, характеризуется как Т 2-РНКаза и проявляет желаемые активности. Кроме того, должно быть понятно, что части,мутанты, химеры или аллели таких полинуклеотидов могут также использоваться в качестве полинуклеотида, кодирующего Т 2-РНКазу, в соответствии с данным изобретением, опять при условии, что такие части, мутанты, химеры или аллели таких полинуклеотидов кодируют Т 2 РНКазу, которая проявляет желаемые активности. Выделение новых полинуклеотидов, кодирующих Т 2-РНКазы, также рассматривается. Такое выделение может быть выполнено с использованием методологий, хорошо известных в данной области, таких как, но не только, скрининг библиотек, гибридизация, ПЦР-амплификация, меченые праймеры, меченые вырожденные праймеры. Таким образом, могут быть использованы как геномные полинуклеотиды,так и кДНК-полинуклеотиды. Полинуклеотид в соответствии с данным изобретением может быть слитым, в рамке считывания, с любым кодирующим другой полипептид полинуклеотидом, для кодирования слитого белка с использованием способов, хорошо известных в данной области. Например, полипептид может быть слит с лидерной последовательностью или сигнальным пептидом для секреции. Подобным образом, белок Т 2-РНКазы может быть слит (конъюгирован) с другими белками с использованием способов, хорошо известных в данной области. Многие способы известны в данной области для конъюгации или слияния (связывания) молекул разных типов, в том числе белков. Эти способы могут быть использованы в соответствии с данным изобретением для связывания Т 2-РНКазы с другими молекулами, такими как лиганды или антитела,для содействия посредством этого нацеливанию и связыванию Т 2-РНКазы со специфическими 32 типами клеток. Любая пара белков может быть конъюгирована или слита вместе с использованием любого способа конъюгации, известного специалисту в данной области. Белки могут конъюгироваться с использованиемN-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионатом) ("SDPD") (Sigma, Cat. No. P-3415), процедуры конъюгации с глутаровым альдегидом или процедуры конъюгации с карбодиимидом. Согласно предпочтительному варианту данного изобретения, полинуклеотид включает в себя один или несколько сегментов, содержащих регуляторные последовательности транскрипции, функционально связанные с кодирующей Т 2-РНКазу последовательностью. Такие регуляторные последовательности транскрипции могут включать в себя, но не ограничиваются ими, промоторы и энхансеры, как подробно описано дополнительно ниже. Эти регуляторные последовательности транскрипции обычно функционально связаны слева от кодирующего района и функционируют в регуляции его транскрипции и/или трансляции. Согласно другому предпочтительному варианту данного изобретения, полинуклеотид,кодирующий Т 2-РНКазу, включен в эукариотический экспрессирующий вектор. Выражение экспрессирующий вектор относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая включает в себя последовательность, кодирующую Т 2-РНКазу, и регуляторные последовательности транскрипции и которая способна экспрессировать Т 2-РНКазу в клетке млекопитающего. Многочисленные способы для введения ДНК-фрагментов в вектор для целей экспрессии гена млекопитающего известны в данной области и могут быть использованы для конструирования содержащего кодирующий Т 2-РНКазу ген экспрессирующего вектора, включающего в себя подходящие регуляторные последовательности транскрипции/трансляции и желаемые последовательности полинуклеотида Т 2 РНКазы. Эти способы могут включать в себя способы рекомбинантных и синтетических ДНКin vitro и генетическую рекомбинацию in vivo. Экспрессия кодирующего Т 2-РНКазу полинуклеотида может регулироваться регуляторными последовательностями транскрипции, так что Т 2-РНКаза экспрессируется в клетке-хозяине,инфицированной или трансфицированной молекулой рекомбинантной ДНК. Например, экспрессия Т 2-РНКазы может регулироваться любым элементом промотор/энхансер, известным в данной области. Промоторная активация может быть тканеспецифической или индуцируемой метаболическим продуктом или введенным веществом. Промоторы/энхансеры, которые могут быть использованы для регуляции экспрессии 33 Т 2-РНКазы в тканях или клетках-мишенях,включают в себя, но не ограничиваются ими,нативный промотор RB, промотор/энхансер цитомегаловируса (CMV) (Karasuyama, H., et al.,1989, J. Exp. Med., 169:13), промотор -актина человека (Gunning, P., et al., 1987, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 84:4 831-4835), индуцируемый глюкокортикоидом промотор, присутствующий в длинном концевом повторе вируса опухоли молочной железы мыши (HHTV LTR) (Klessig,D. F., et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:1354-1362),последовательности длинного концевого повтора вируса мышиного лейкоза Молони (MULVLTR) (Weiss, R., et al., 1985, RNA Tumor Viruses,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), промотор раннего района SV40(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304310), промотор, содержащийся в 3'-длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (RSV)(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), промотор/энхансер тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV) (Wagner et al., 1981, Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A 78:1441-1445), регуляторные последовательности гена металлотионеинаLAT вируса простого герпеса (Wolfe, J.H., et al.,1992, Nature Genetics, 1:379-384). Экспрессирующие векторы, совместимые с клетками-хозяевами млекопитающих для применения в генетической терапии опухолевых или раковых клеток, включают в себя, но не ограничиваются ими, плазмиды, ретровирусные векторы, аденовирусные векторы, герпесвирусные векторы и нерепликативные вирусы оспы(дифтерита) птиц, описанные, например, в патенте США с номером 5 174 993, который включен таким образом в качестве ссылки. Несколько способов могут быть использованы для доставки экспрессирующих векторов в соответствии с этим аспектом данного изобретения в клетки-мишени млекопитающих. Например, подходящий фармацевтически приемлемый носитель, такой как физиологически приемлемый раствор, который содержит эффективное количество экспрессирующего вектора, может быть введен местно, интраокулярно, парентерально, перорально, интраназально, внутривенно, внутримышечно, подкожно или любым другим эффективным способом. Физиологически приемлемый раствор, содержащий эффективное количество экспрессирующего вектора, может быть введен системно в кровоток для лечения рака или опухоли, которые не могут быть непосредственно достигнуты или анатомически выделены. Для лечения опухолевых масс физиологически приемлемый раствор, содержащий эффективное количество экспрессирующего вектора,может быть непосредственно инъецирован, через иглу, в опухолевую массу-мишень в количе 004929 34 ствах, эффективных для лечения опухолевых клеток опухолевой массы-мишени. Альтернативно, злокачественная опухоль или опухоль, присутствующие в полости тела,например, в глазу, желудочно-кишечном тракте,мочеполовых путях (например, в мочевом пузыре), легочной и бронхиальной системе и т.п.,может получать физиологически приемлемую композицию (например, раствор, такой как солевой раствор или фосфатный буфер, который является стерильным, за исключением экспрессирующего вектора), содержащую эффективное количество экспрессирующего вектора, посредством инъекции иглой или катетером или другой доставляющей трубкой, помещенными в пораженный раком или опухолью полый орган. Любое эффективное для визуализации устройство, такое как рентген, сонограмма или волоконно-оптическая система визуализации, может быть использовано для определения местоположения ткани-мишени и направления иглы или катетера. Должно быть понятно, что, поскольку "голый" экспрессирующий вектор может активно поглощаться клеткой млекопитающего, поглощение и нацеленная доставка усиливаются, если экспрессирующий вектор подходящим образом упакован или инкапсулирован. Таким образом, согласно другому предпочтительному варианту данного изобретения,фармацевтически приемлемый носитель включает в себя доставляющий носитель, пригодный для доставки экспрессирующего вектора в клетки млекопитающих нацеленным образом. Вирусный экспрессирующий вектор может вводиться доставляющим носителем в клеткумишень в экспрессируемой форме посредством инфекции или трансдукции. Такой доставляющий носитель включает в себя, но не ограничивается ими, ретровирус, аденовирус, герпесвирус и вирус оспы (дифтерита) птиц. Доставляющий носитель, способный вводить векторную конструкцию в клетку-мишень и способный экспрессировать Т 2-РНКазу в ней в ингибирующих клеточную пролиферацию количествах, может вводиться любым эффективным способом, описанным выше. Альтернативно, такой доставляющий носитель может включать в себя, но не ограничивается ими, липосому, мицеллу, антитело или лиганд, как описано выше. Должно быть понятно, что описанные здесь полинуклеотиды могут быть использованы в приготовлении лекарственного средства,применимого в ингибировании пролиферации клетки млекопитающего в млекопитающем, посредством смешивания полинуклеотида с подходящим фармацевтически приемлемым носителем. Как уже упоминалось выше, полинуклеотиды, кодирующие Т 2-РНКазу, могут быть получены разнообразными способами, в том чис 35 ле, амплификацией с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) библиотек геномной ДНК или кДНК и скринингом с использованием Т 2-РНКаза-специфических праймеров, с использованием ПЦР с обратной транскрипцией вместе с Т 2-РНКаза-специфическими праймерами для амплификации мРНК, выделенной из организмов, о которых известно, что они экспрессируют Т 2-РНКазы, или прямым выделением ДНК-последовательностей, кодирующих Т 2 РНКазу, из соответствующих организмов. В этом случае должно быть понятно, что указанные выше способы могут быть также использованы для выделения или генерирования активных форм Т 2-РНКазы, описанных выше. Затем очищенный полинуклеотид может быть встроен в подходящие экспрессирующие векторы или обеспечен подходящими регуляторными последовательностями транскрипции и приготовлен, как описано выше. Как описано дополнительно в разделе"Примеры", который следует далее, и как указывалось выше, тест для определения действий специфической Т 2-РНКазы или кодирующего ее полинуклеотида обеспечен также в соответствии с описаниями данного изобретения. Такой тест выполняют, например, подверганием пролиферирующих клеток действию Т 2-РНКазы и прослеживанием их пролиферативного поведения во времени в сравнении с контрольными,необработанными клетками. Этот тест может быть использован не только для отбора наиболее сильной Т 2-РНКазы для любого конкретного применения, но также для установления зависимости ответной реакции от дозы, которая может быть переведена в дозу первоначальной обработки в экспериментах in vivo или во время лечения субъекта, как это все приведено в примерах здесь для РНКазы В 1 семейства Т 2. Должно быть понятно, что этот тест может быть также использован для определения антипролиферативного активного сайта или части Т 2 РНКазы или для определения активности генерируемых или изолируемых мутантов, которые не обнаруживают рибонуклеолитической активности. Дополнительные цели, преимущества и новые признаки данного изобретения станут очевидными специалисту с обычной квалификацией в данной области при изучении следующих примеров, которые не предназначены для ограничения данного изобретения. Кроме того,каждый из многочисленных вариантов и аспектов данного изобретения, очерченный выше и заявленный в разделе Формула изобретения ниже, найдет экспериментальное подтверждение в нижеследующих примерах. Примеры Здесь делается ссылка на следующие примеры, которые вместе с приведенными выше описаниями иллюстрируют данное изобретение неограничивающим образом. 36 В общем, используемая здесь номенклатура и лабораторные процедуры, используемые в данном изобретении, включают в себя молекулярные, биохимические, микробиологические способы и способы рекомбинантных ДНК. Такие способы подробно объясняются в литературе. См., например, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" Sambrook et al.,(1989); "CurrentCellular Immunology", W.H. Freeman and Co.,New York (1980); доступные иммуноанализы подробно описаны в патентной и научной литературе, см., например, патенты США с номерами 3 791 932; 3 839 153; 3 850 752; 3 850 578; 3 853 987; 3 867 517; 3 879 262; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; 4 098 876; 4 879 219; 5 011 771 и 5 281 521; "OligonucleotideLaboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все они включены в качестве ссылок, как если бы были полностью представлены здесь. Другие общие ссылки даются во всем этом документе. Авторы считают, что приведенные в них процедуры хорошо известны в данной области, и ссылки обеспечены для удобства читателя. Вся информация, содержащаяся в них, включена таким образом в качестве ссылки. Пример 1. Характеристика РНКазы Aspergillus niger В 1 и ее ингибирующее действие на рост пыльцевых трубок в плодовых деревьях. 37 Материалы и способы Получение и очистка внеклеточной РНКазы A. niger: Aspergillus niger Bl (CMI CC 324626) выращивали в жидкой культуре, содержащей 1% (мас./об.) пшеничной муки и 0,05%(мас./об.) сульфата аммония. Смесь доводили до рН 3,5 хлористо-водородной кислотой и автоклавировали. Инокулят приблизительно 106 спор суспендировали в 100 мл среды и инкубировали при 30 С в ротационном шейкере при 200 об/мин в течение 100 ч. Среду для выращивания пропускали через мембрану 2 мкм и диализовали три раза против 10 объемов 2 мМ ацетата натрия рН 6. Два литра диализованного раствора наносили на колонку Fractogel EMDTMAE 650 (М) 26/10 (Merck), уравновешенную 20 мМ ацетатом натрия рН 6. Связанные белки элюировали 500 мл линейного градиента 0-1,0 М хлорида натрия в том же самом буфере с использованием системы жидкостной экспрессхроматографии белков (FPLC) (Pharmacia) со скоростью тока 5 мл/мин. Фракции, обнаруживающие наивысшую РНКазную активность,объединяли и диализовали против 2 мМ ацетата натрия рН 6 и аликвоту 50 мл наносили на колонку MONO-Q 5/5 HR (Pharmacia), уравновешенную 20 мМ ацетатом натрия рН 6. Элюцию выполняли, как в случае колонки EMD/TMAE,за исключением того, что использовали только 10 мл солевого градиента 0-1,0 М, при скорости тока 1 мл/мин. Белки подвергали мониторингу при 280 нм и измеряли по Бредфорду (Bradford, M.M. 1976,Anal. Biochem. 72:248-245), с использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве стандарта. Различные фракции анализировали при помощи электрофореза в 12,5% содержащем додецилсульфат натрия полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) (Laemmeli, U.K. 1970. Nature 227:680-685). РНКазную активность определяли, как описано ранее (Roiz andShoseyov, 1995, Int. J. Plant Sci. 156:37-41). Очищенную РНКазу Bl ферментативно дегликозилировали согласно процедуре, описанной Broothaerts et al. (Broothaerts, W.P. et al. 1991. Sex. Plant Reprod. 4:258-266). Фермент смешивали с 0,5% (мас./об.) ДСН и 5%(мас./об.) -меркаптоэтанолом и нагревали при 100 С в течение 5 мин. После охлаждения реакционную смесь разбавляли в 2,5 раза буфером,содержащим 50 мМ фосфат натрия рН 7,5, 25 мМ ЭДТА, 1% (мас./об.) Тритон Х-100 и 0,02%(мас./об.) азид натрия. Добавляли пептид-Nгликозидазу F (ПКГазу F, Boehringer-Mannheim) до конечной концентрации 20 единиц/мл и инкубирование выполняли в течение ночи при 37 С. Затем эту пробу смешивали с буфером для нанесения проб, нагревали при 100 С в течение 5 мин и анализировали электрофорезом в ДСНПААГ с использованием 12,5% геля. Анализ РНКазы Оптимальные условия для РНКазной активности определяли в соответствии с процедурой, модифицированной из процедуры BrownPhysiol. 82:801-806), с использованием диапазона температур 20-100 С при приращениях 10 С,и в диапазоне рН 2,5-7 при приращениях 0,5 единиц рН, устанавливаемых с использованием 50 и 12 мМ фосфатного-цитратного буферов. Каждую из проб 10 мкл добавляли к 490 мкл охлажденного на льду буфера, содержащего 4 мг/мл дрожжевой РНК (Sigma). Половину каждой пробы использовали в качестве слепого опыта посредством немедленного добавления стоп-раствора, содержащего 50 мкл 0,75%(мас./об.) уранилсульфата в 25% (мас./об.) перхлорной кислоте. Оставшуюся половину инкубировали в течение 10 мин, после чего к каждой из них добавляли 50 мкл стоп-раствора. После центрифугирования при 15000 х g в течение 5 мин супернатант разбавляли в 20 раз дистиллированной водой и определяли поглощение при 260 нм. Одну единицу РНКазной активности определяли как количество фермента, высвобождающего растворимые нуклеотиды при скорости одна А.U.260 нм в минуту. РНКазу В 1 визуализировали по активности геля, как описано ранее (Roiz and Shoseyov,1995, Int. J. Plant Sci. 156:37-41). ДСН-гель, содержащий РНКазу В 1, ренатурировали промыванием два раза в течение 15 мин каждый раз 20 мМ ацетатным буфером при рН 3,5, содержащим 25% (об./об.) изопропанол, и затем два раза в течение 15 мин каждый раз только буфером. Ренатурированный гель, содержащий РНКазу В 1, наносили на пластинку, содержащую 0,1% РНК и 0,8% агарозу в 20 мМ ацетатном буфере,и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. Затем гель удаляли и агарозную пластинку окрашивали 0,02% (мас./об.) толуидиновым синим в воде для визуализации РНКазной активности. Действие РНКазы В 1 на рост пыльцевых трубок Пыльцу персика сорта Almog проращивали(Roiz and Shoseyov, 1995, Int. Plant Sci 156:3741). Пыльцевые зерна суспендировали в виде аликвот, содержащих 100 мкл 15% (мас./об.) сахарозы, 100 мкг/мл борной кислоты, 200 мкг/мл сульфата магния, 200 мкг/мл нитрата кальция и различные концентрации РНКазы В 1. После инкубирования в течение ночи при 25 С в темной камере регистрировали процент прорастания. Длину пыльцевых трубок определяли окуляром-микрометром. Действие обработки РНКазой В 1 на рост пыльцевых трубок также исследовали in vivo. Интактные цветки персика и тангерина (Citrusreticulata, Blanco cv. Murcott) опрыскивали на ранних стадиях цветения 100 единиц/мл РНКазы В 1 в 20 мм цитратном буфере при рН 3,5. В 39 каждом виде дополнительные цветки на той же самой стадии, на других ветвях, опрыскивали только буфером или оставляли необработанными в качестве контролем. После экспонирования перекрестному опылению в течение 48 ч столбики фиксировали в смеси 3:1 уксусная кислота:этанол (по объему) в течение 24 ч, промывали дистиллированной водой и погружали на ночь в 8 М гидроксид натрия. После тщательного промывания в дистиллированной воде столбики разрезали в продольном направлении, погружали каждый в каплю 0,1% (мас./об.) анилинового синего в 0,1 М фосфате калия на предметном стекле и осторожно придавливали покровным стеклом. Пыльцевые трубки наблюдали с использованием эпифлуоресцентной микроскопии (Olympus ВХ 40 equipped with WIBcube). Действие РНКазы Bl на завязывание плодов Полевые эксперименты проводили на персике обыкновенном (Prunus persica var. NectarinaFantasia). Ветви длиной 3-40 см, несущие приблизительно 10% открытых цветков, опрыскизали разными концентрациями РНКазы 31 в 20 м.М цитратном буфере рН 3,5 и 0,025% Тритоне Х-100. Необработанные ветви и ветви, опрысканные только буфером и Тритоном Х-100,служили в качестве контролей. Ветви опрыскивали с интервалами 2-3 дня во время периода цветения (14 дней). Спустя месяц, определяли число плодов на ветвь. Для теста жизнеспособности семена разрезали продольно через зародыш и погружали в 1% раствор 2,3,5 трифенилтетразолийхлорида в воде на 4 ч при 20 С в темном помещении. Красное окрашивание указывало на жизнеспособные ткани. Экспериментальные результаты Очистка и характеристика РНКазы В 1A. niger, выращиваемый в жидкой культуре, продуцировал значительные количества внеклеточной РНКазы В 1. Было обнаружено, что температура 60 С и рН 3,5 были оптимальными для РНКазной активности и были взяты в качестве стандартных условий для последующих анализов РНКазы. Очистка РНКазы В 1 включала в себя три стадии (табл. 3). В первой стадии получали неочищенный фильтрат, содержащий 1000 единиц/мл и 0,05 мг/мл белка. Неочищенный фильтрат пропускали через колонку EMDTMAE и объединенные активные фракции (фиг. 1, график А) содержали 0,1 мг/мл белка с РНКазной активностью 40000 единиц/мл. В конечной стадии объединенные фракции пропускали через колонку MONO-Q и элюировали активную фракцию РНКазы (фиг. 1, график В). Эта фракция содержала концентрацию белка 1,05 мкг/мл и имела активность РНКазы 543000 единиц/мл. Две основные полосы белка, 40 и 32 кДа, наблюдали после электрофореза в ДСНПААГ очищенной фракции РНКазы В 1 (фиг. 2). Гель с РНКазной активностью обнаруживал 40 активные полосы, соответствующие белкам 32 и 40 кДа. При подвергании действию ПНГазы F появилась единственная полоса белка при 29 кДа. РНКазная активность сохранялась после расщепления ПНГ-азой (не показано). Таблица 3 Действие РНКазы В 1 на пыльцевые трубки и завязывание плодов В экспериментах in vitro 75% контрольных пыльцевых зерен прорастали и пыльцевые трубки достигали длины приблизительно 0,5 мм. Добавление РНКазы В 1 к среде для выращивания уменьшало процент прорастания и длину пыльцевых трубок зависимым от дозы образом(фиг. 3). РНКаза В 1 имела ярко выраженное ингибируюшее действие, 50 единиц/мл, представляющие 0,1 мкг/мл белка, были летальными, тогда как 125 мкг/мл БСА уменьшали только наполовину прорастаемость пыльцы и рост пыльцевых трубок.In vivo, наблюдали, что пыльцевые трубки персика, прорастая через ткань рыльца, направлялись в столбик через 48 ч после опыления(фиг. 4 а). Сходное действие наблюдали в столбиках, обработанных только буфером. В противоположность этому, пыльцевые зерна, прораставшие на рыльцах, обработанных РНКазой В 1,продуцировали короткие пыльцевые трубки,которые, по-видимому, не имели какой-либо ориентации роста и не могли проникать в ткань столбика (фиг. 4b). В случае тангерина (мангдарина) только малая часть ткани рыльца, диаметр которой был 2-3 мм, была уловлена полем зрения микроскопа. Таким образом, наблюдали только несколько пыльцевых трубок, как показано на фиг. 5. Однако различие между нормальным ростом контрольных пыльцевых трубок (фиг. 5 а) и неправильном ростом обработанных РНКазой пыльцевых трубок (фиг. 5b) было вполне очевидным. В персике сорта Фантазия РНКаза В 1 вызывала уменьшение в завязывании плодов (табл. 4). В ветвях, которые оставались необработанными или опрыскивались буфером с Тритоном Х-100, завязывание плодов было 48,3% и 36,3%,соответственно. По-видимому, буфер с низким рН оказывал некоторое ингибирующее действие на завязывание плодов, однако, ветви, обработанные 500 и 1000 единиц/мл РНКазы В 1, завязывали 23,3% и 18,4% плодов, соответственно,что указывало на значимый эффект прореживания завязей РНКазы, являющийся зависимым от дозы. В обработанных РНКазой В 1 ветвях наблюдали много неразвившихся маленьких плодиков. Тесты на жизнеспособность показали,что в контрольных цветках (либо необработанных, либо опрысканных только буфером) ткани зародышей окрашивались в красный цвет (фиг. 6 а), тогда как ткани зародышей, развившихся в обработанных РНКазой цветках, окрашивались в коричневый цвет, что указывало на некроз(РНКазу Bl) очищали до гомогенности. Было обнаружено, что она содержит две изоформы гликопротеидов 32 и 40 кДа, имеющие общую центральную часть (кор) 29 кДа. Оптимальную РНКазную активность наблюдали при температуре 60 С и рН 3,5. В персике (Prunus persica cv.Murcott) этот фермент ингибировал прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок in vitro, а также in vivo. В полевых экспериментах РНКаза вызывала уменьшение в персике (Prunus persicavar. nectarina Fantasia) завязывания плодов и ингибировала нормальное развитие зародышей. Пример 2. Ингибирование прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок Т 2-РНКазой опосредовано взаимодействием с актином. Ингибирование прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок РНКазой является общепризнанным, однако, механизм, при помощи которого этот фермент взаимодействует с процессом удлинения трубок, является все еще неясным. Как таковое, данное исследование ставило задачу выяснения роли РККазы В 1 в препятствовании процессу роста в длину пыльцевых трубок. Материалы и экспериментальные способы Действие РНКазы В 1 на рост пыльцевых трубок Пыльникам лилии (Lilium grandiflorum L.cv. Osnat) давали раскрываться в течение 24 ч при комнатной температуре и затем либо использовали в свежем виде, либо хранили при-20 С. РНКазу В 1 получали и очищали из фильтрата среды для выращивания Aspergillusniger, как описано в примере 1. Пыльцу проращивали in vitro в водных культурах по 100 мкл каждая, содержащих 7% сахарозу, 1,27 мМ Са(NO3)2, 0,16 мМ Н 3 ВО 3, 1 мМ KNO3 и 3 мМ КН 2 РО 4 в воде (Yokota and Shimmen 1994). Некоторые культуры дополняли РНКазой В 1,имеющей 100 единиц/мл РНКазной активности,до конечной концентрации белка 16 мкг/мл. Дополнительные культуры дополняли РНКазой, 004929 42 которую предварительно кипятили в течение 30 мин, что приводило к 50% потере активности,или автоклавированной РНКазой, не имеющей никакой каталитической активности. После 2 ч инкубирования при 25 С в темноте длину пыльцевых трубок измеряли под микроскопом с использованием окуляра-микрометра. Пыльцевые трубки окрашивали IKI (0,3% 12 и 1,5% KI в воде) для детектирования крахмальных зерен. Активно удлиняющиеся одночасовые пыльцевые трубки переносили в стеклянные ячейки на столике микроскопа. Характер роста пыльцевых трубок и движение органелл регистрировали согласно модификации способаPlant Reprod. 3:187-194) с использованием видеопредставляющего устройства Applitec MSV800. Изображения улавливали при 0,8 кадр/с в течение 8 с при помощи схемы воспроизведения стоп-кадра и затем преобразовывали в цифровую форму и интегрировали при помощи программного обеспечения NIH image. Фотографии обрабатывали с использованием программных обеспечений Adobe Photoshop (Adobe SystemsInc., Mountain View, CA) и Power-Point (Microsoft Co.). Действие РНКазы на актиновые филаменты пыльцевых трубок: Пыльцу проращивали in vitro в водных культурах с РНКазой или без РНКазы. После периода инкубирования в течение ночи, пыльцевые трубки осторожно осаждали и среду для выращивания заменяли 10-6 М фаллоидином,меченым изоцианатом тетраметилродамина В(TRITC) (Sigma) в буфере ЗФРТ (150 мМ NaCl 3 мМ КСl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ К 2 НРО 4 и 0,02% Твин-20). Для наблюдений in vivo, цветки лилии сорта Stargazer кастрировали при начале цветения и 0,5 мл среды для выращивания, содержащей 100 единиц/мл РНКазы, инъецировали через рыльце в канал столбика. Цветки, в которые инъецировали среду для выращивания без РНКазы, использовали в качестве контроля. Жидкости абсорбировались в ткань столбика в течение 5 ч при 25 С, после чего рыльца опыляли вручную пыльцой лилии сорта Osnat. После 48 ч инкубирования при 25 С каждый пестик разрезали продольно и пыльцевые трубки осторожно удаляли в раствор TRITC-TBST и инкубировали в течение 1 ч. Разрез на рыльце не влиял на пыльцевые трубки, так как их жизнеспособные протопласты были локализованы на дистальной части, защищенной каллозными пробками. Как в экспериментах in vitro, так и в экспериментах in vivo окрашенные пыльцевые трубки промывали в TBS (TBST без Твина-20),помещали на предметное стекло и наблюдали с использованием эпифлуоресцентного светового микроскопа (Olympus ВХ 40, снабженного меркуриевой лампой USH-102D). Связывание актина с РНКазой В 1 Взаимодействие между РНКазой В 1 и актином измеряли количественно согласно модификации способа Simm (Simm, F.C. et al., 1987.(Sigma Co.) из мышц кролика полимеризовали до волокнистого (F-)актина в буфере F (10 мМ Трис рН 8, 0,1 мМ АТФ, 0,2 мМ СаСl2, 0,1 М КСl и 2 мМ МgСl2) в течение 30 мин при комнатной температуре. Пробы 50 мкл, содержащие, каждая, 30 мкМ F-актин, инкубировали в течение ночи при 4 С с 1-33 мкМ РНКазой В 1. В качестве контроля, каждую концентрацию РНКазы инкубировали только с буфером F. Пробы центрифугировали при 15000 g в течение 40 мин и определяли РНКазную активность супернатанта (Roiz, L., Goren, R. and Shoseyov, О. 1995, Physiol. Plant. 94:585-590). Окрашивание иммунозолотом-серебром РНКазы Bl на пыльцевых трубках Краситель иммунозолото-серебро (IGSS) использовали для обнаружения присоединения РНКазы к пыльцевым трубкам лилии. Поликлональные антитела индукцировали против РНКазы В 1 в кролике (Aminolab). Пыльцевые трубки лилии in vitro фиксировали в течение ночи в 2,5% глутаровом альдегиде в ЗФРТ при 4 С. Пыльцевые трубки промывали 6 течение 1 ч в ЗФРТ, блокировали в течение 1 ч в ЗФРТ, содержащем 1% БСА и 2% обезжиренное молоко,и инкубировали в течение 1 ч в антителе против РНКазы В 1, разведенном 1:500 в ЗФРТ. Неиммунную сыворотку кролика (PIS) использовали в качестве контроля. Пыльцевые трубки промывали три раза, каждый раз по 10 мин, в ЗФРТ и затем инкубировали в течение 1 ч в козьих антителах против кроличьего IgG, конъюгированных с 5 нм частицами золота, разведенных 1:100 в ЗФРТ. После двух 10 мин промывок в ЗФРТ и одной 10-минутной промывки в воде использовали набор с содержащим серебро красителем(BioCell Research Laboratories) для конечного проявления реакции. Пыльцевые трубки намачивали в объединенных растворах набора в течение 10-15 мин, промывали избытком дистиллированной воды и наблюдали под световым микроскопом (Olympus BX40). Экспериментальные результаты Контрольная проба пыльцевых трубок лилии, проращиваемых in vitro в среде для выращивания без РНКазы, достигала приблизительно 300 мкм в длину (фиг. 7). Культуры, которые обрабатывали РНКазой при тех же самых условиях, достигали только 160 мкм в длину. Кипячение или автоклавирование РНКазы давало пыльцевые трубки длиной 130 и 170 мкм, соответственно. Различия между тремя обработанными РНКазой группами пыльцевых трубок считали незначимыми. Окрашивание на крахмал показало, что амилопласты контрольной пробы были распре 004929 44 деленными вдоль пыльцевой трубки, за исключением зоны кончика (фиг. 8 а). С другой стороны, в обработанных РНКазой пыльцевых трубках в зоне кончика накапливались IKIокрашенные тела (фиг. 8b). Интегрированные видеоизображения активно удлиняющихся пыльцевых трубок обнаружили цитоплазматические линии тока (фиг. 9 а и 9b). В контрольной пробе непрерывное продольное движение было наиболее обычным,так как был акропетальный ток на периферии трубки и базипетальный ток в центре, что образовывало картину обращенного фонтана ниже зоны кончика (фиг. 9 а). Сама зона кончика была занята гораздо более мелкими телами, в основном Р-частицами, картина движения которых была едва заметной. В ингибированных РНКазой пыльцевых трубках кончик казался распухшим, с хорошо видимым крахмалом и липидными частицами, достигающими зоны кончика(фиг. 9b). Не было обнаружено непрерывное движение, но, вместо этого, удлиненные неправильные изображения обнаружили случайным образом вращающиеся цитоплазматические частицы. Действие РНКазы на распределение филаментов актина исследовали в 1-часовых in vitro и 48-часовых in vivo пыльцевых трубках. Пыльцевые трубки in vivo достигали длины приблизительно 3-4 см, и их окрашивание TRITCфаллоидином было более интенсивным, чем в пыльцевых трубках in vitro. Однако тип действия РНКазы был сходным в обоих экспериментах. В контроле, микрофиламенты актина собирались продольно вдоль оси трубки, образуя тонкую сетку в зоне кончика (фиг. 10 а). С другой стороны, в обработанных РНКазой пыльцевых трубках массы актина накапливались при клеточной стенке кончика (фиг. 10b). Взаимодействие между РНКазой В 1 и актином определяли количественно с использованием анализа Скетчарда. В эксперименте с комплексом актин-РНКаза В 1 линия регрессии, пересекающаяся с абсциссой при 0,45 (фиг. 11),показывает, что молярное отношение РНКазагактин было 0,45, что подразумевает, что с каждой молекулой РНКазы связываются две молекулы актина. Пыльцу, прораставшую в присутствии РНКаз В 1, готовили в виде препаратов для световой микроскопии и локализацию РНКазы определяли при помощи IGSS, с использованием антител против РНКазы (фиг. 12 а-с). В пыльцевых трубках, росших без РНКазы (фиг. 12 а) или с РНКазой, но обработанных PIS (фиг. 12b), наружная поверхность клеточной стенки не окрашивалась серебром. С другой стороны, в пыльцевых трубках, обработанных РНКазой В 1, появлялось явное окрашивание иммунозолотомсеребром, причем краситель накапливался при зоне кончика (фиг. 12 с). 45 В этом исследовании прорастание пыльцы и рост в длину пыльцевых трубок лилии (Liliumgrandiflorum) специфически ингибировались РНКазой Bl A. niger. Прокипяченная или автоклавированная РНКаза, не имеющая большей части исходной каталитической активности,обнаруживала такое же ингибирующее действие. Эти результаты демонстрируют, что РНКаза A. niger является актинсвязывающим белком,обладающим ингибирующим действием на рост в длину пыльцевых трубок. Это связывание,которое не связано с каталитической активностью РНКазы В 1, деформирует актиновые филаменты пыльцевых трубок, нарушая посредством этого ток цитоплазмы. Пример 3. Действие РНКазы В 1 на клетки рака ободочной кишки человека. Поскольку актинсвязывающая активность,обнаруженная для РНКазы В 1 в пыльцевых трубках, указывала на возможную цитотоксическую активность, авторы решили исследовать цитотоксическое действие РНКазы В 1 на клетках рака ободочной кишки человека. Материалы и экспериментальные способы и результаты Культура клеток Все эксперименты выполняли in vitro. Клетки аденокарциномы ободочной кишки человека (НТ 2 9) выращивали в среде DMEM(Biological Industries, Bet Haemek), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, 1% глутамином и 10% антибиотическим противогрибковым раствором (Biolab). Клетки инкубировали при 37 С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО 2. Растворы РНКазы В 1 готовили в буфере ЗФР, рН 6,8. Предварительный анализ жизнеспособности клеток Клетки инкубировали в колбах на 50 мл. Каждая колба содержала 2 х 105 клеток в 7 мл среды, в отсутствие или в присутствии различных концентраций (10-8-10-6 М) РНКазы В 1. Клетки выращивали в течение 48 или 72 ч и затем жизнеспособные и нежизнеспособные клетки дифференциально считали с использованием окрашивания трипановым синим. Во всех обработках общее число клеток,росших в течение 72 ч (55-60 х 105) , превышало приблизительно в 2 раза число клеток, полученных после 48 ч культивирования (25-30 х 105)(фиг. 13 а). Присутствие РНКазы В 1 в среде для выращивания не оказывало значимого действия на рост клеток. Однако, небольшое, но значимое действие РНКазы В 1 на число мертвых клеток было обнаружено как при 48 ч, так и при 72 ч инкубации (фиг. 13b). Анализ I клоногенности Долгосрочное выживание опухолевых клеток характеризуется их способностью делиться и образовывать клоны. Клетки предынкубировали в течение 48 ч в среде для выращивания,содержащей 10-6 М РНКазу В 1, затем трипсини 004929 46 зировали, промывали и ресуспендировали в среде для выращивания без РНКазы B1. Перед высевом в 96-луночные микротитрационные планшеты эти клетки разводили до серийных 5 кратных разведений в диапазоне между 50-105 клеток в каждой лунке (200 мл). Планшеты инкубировали в течение 14 дней в описанных выше условиях, без добавления свежей среды для выращивания, после чего колонии фиксировали и окрашивали метиленовым синим. Клоногенные клетки в каждой лунке считали после визуализации клонов. Контрольные клетки обрабатывали, как описано выше, но предынкубировали во время первых 48 ч в среде, не содержащей РНКазы В 1. В обоих вариантах обработки сходное число колоний наблюдали в лунках, в которые высевали 100 клеток (фиг. 14). Цитотоксическое действие РНКазы В 1 появлялось в лунках, содержащих высокие плотности клеток. В лунках,засеянных 500 клетками, каждая, контрольные и обработанные РНКазой В 1 клетки образовывали 180 и 100 колоний на лунку, соответственно. Кроме того, в лунках, засеянных 1000 клетками,каждая, обработанные РНКазой В 1 клетки образовали около 250 колоний на лунку, тогда как контрольные клетки образовали многочисленные колонии, которые, слитые в непрерывный слой, не могли быть, следовательно, подсчитаны и иллюстрируются на фиг. 14. Клетки, засеянные при более высоких плотностях, не выживали в культуре без замены среды. Анализ II клоногенности Способность опухолевых клеток пролиферировать и образовывать колонии исследовали в коротком подвергании действию в сравнении с непрерывным подверганием действию РНКазы В 1. Этот эксперимент выполняли, как описано в анализе I клоногенности, с использованием (i) контрольных клеток, (ii) клеток, предынкубированных со средой, содержащей 10-6 М РНКазе В 1, и затем оставленных для образования колоний в несодержащей РНКазу В 1 среде для выращивания, и (iii) клеток предынкубированных,как в (ii), и затем инкубированных во время анализа колонизации в среде для выращивания,содержащей 10-6 М РНКазу В 1. В этих экспериментах исходные плотности были в диапазоне между 250 и 1000 клеток на лунку, а период образования колоний был 7 дней. Более короткий период инкубирования,использованный в этом эксперименте (7 дней) в сравнении с 14-дневной предынкубацией приводил к слитым колониям, которые не могли быть различены, даже в лунках, содержащих высокие плотности клеток. При всех плотностях, 48 ч предынкубации в РНКазе В 1 приводили к уменьшению способности клеток на 2030% образовывать колонии, в сравнении с контролем (фиг. 15). Однако при каждой плотности непрерывное подвергание действию РНКазы В 1 приводило к резкому уменьшению 90% в клоно 47 генности. Фиг. 16 а-с показывают, что непрерывно обрабатываемые РНКазой В 1 клетки(фиг. 16 с) были более мелкими и менее окрашиваемыми, чем клетки, которые предынкубировали в течение 48 ч в РНКазе В 1 (фиг. 16b) или контрольные клетки (фиг. 16 а). Этот результат показывает, что РНКаза В 1 влияет на скорость роста колоний. Таким образом, ясно показано результатами, представленными здесь, что РНКаза Bl A.niger имеет явное цитотоксическое действие на раковые клетки НТ 29 аденокарциномы человека. Цитотоксическое действие РНКазы В 1 выражалось скорее уменьшением клеточной клоногенности, чем уменьшением жизнеспособности клеток. Возможно, что РНКаза В 1 оказывает долгосрочное действие на опухолевые клетки. РНКаза В 1 вызывает уменьшение скорости роста колоний в сравнении с контролем, что свидетельствует о том, что она может влиять на способность клеток пролиферировать. Пример 4. Действие in vivo РНКазы В 1 на развитие опухоли в крысиной модели. Для дальнейшего исследования противоракового действия РНКазы В 1 выполняли эксперимент in vivo на крысах. Материалы и экспериментальные способы Полученные из Charles-River 4-недельные самцы крыс были разделены на группы из 6 животных. В некоторых группах крыс индуцировали для развития рака ободочной кишки пятью инъекциями один раз в неделю диметилгидразина (DMH). В этом эксперименте исследовали два типа введения РНКазы В 1. РНКазу В 1 вносили непосредственно в ободочную кишку с использованием осмотических микронасосов или предоставляли перорально с использованием покрытых энтеросолюбильным покрытием микрокапсул. Полный набор обработок каждой группы крыс описан в схеме фиг. 17. Во время этого эксперимента крыс взвешивали один раз в неделю для мониторинга действия DМH и/или РНКазы B1 на скорость их роста. В группах,обработанных РНКазой В 1, фекалии собирали один раз в неделю из каждой клетки и сушили при 60 С. Пробу 250 мг сухих фекалий растирали и перерастворяли в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР). После центрифугирования РНКазную активность в верхнем растворе определяли, как описано в Roiz et al. (Roiz, L. etai., J. Amer. Soc. Hort. Sci. 125(1) :9-14, 2000). Введение РНКазы В 1 в ободочную кишку через осмотические микронасосы РНКазу В 1 загружали в осмотические микронасосы (ALZET). Насосы имплантировали подкожно в живот крыс. Осмотическим насосам давали непрерывно высвобождать РНКазу В 1 непосредственно в ободочную кишку через катетер, при рассчитанной концентрации 10-6 М в ободочной кишке в течение по меньшей мере 6 недель, при предположении, что объем ободочной кишки крысы равен приблизительно 4 мл. 48 Крыс обрабатывали следующим образом: крысам одной группы имплантировали насосы, содержащие живую РНКазу В 1 (РНКаза В 1),имеющую полную РНКазную активность. Крысам второй группы имплантировали насосы,содержащие автоклавированную РНКазу B1 (IРНКаза B1), не имеющую никакой РНКазной активности. А крысам третьей группы имплантировали насосы, содержащие ЗФР, который использовали в качестве носителя РНКазы В 1 в первых двух группах, и эти крысы служили в качестве контролей. Для испытания возможного превентивного действия РНКазы В 1 выбранные обработанныеDMH крысы получали РНКазу В 1 1-9 недель после первой инъекции DMH. Затем этих крыс умерщвляли и их ободочные кишки вырезали и промывали ЗФР и затем ЗФР, содержащим 0,1 М дитиотреитол (ДТТ). После этого ободочные кишки вскрывали продольно и фиксировали в течение по меньшей мере 1 ч в 4% формальдегиде в ЗФР на фильтровальной бумаге. После окрашивания 0,025% метиленовым синим в ЗФР слизистую оболочку ободочной кишки обследовали под микроскопом при низком увеличении на аберрантные очаги крипт (ACF). ACF считали в дистальной (5 см) ободочной кишке. Для исследования терапевтического действия РНКазы В 1 остальные крысы получали РНКазу В 1 от 12 до 18 недель после первой инъекции DMН. Ободочные кишки вырезали и фиксировали, как описано выше, и опухоли считали и измеряли. Для гистопатологических исследований каждую опухоль заливали в парафин. Тонкие (10 мкм) срезы окрашивали и оценивали степень злокачественности. Пероральное введение РНКазы В 1 Приготовление микрокапсул Микрокапсулы готовили с использованием модифицированной процедуры, описанной LinCommun. 14; 204(1):156-62). Смесь 0,6 г лиофилизированной РНКазы В 1 и 2,4 г глюкозы хорошо измельчали в порошок в ступке с пестиком. Тонкоизмельченный порошок высыпали в химический стакан на 1 л, содержащий 200 мл жидкого парафина и 2 мл Span-80, и перемешивали при 600 об/мин в течение 20 мин. Раствор ацетата-фталата целлюлозы в смеси ацетонэтанол (САР) осторожно добавляли к перемешиваемой смеси (3,2 г САР в 40 мл смеси 9:1 ацетон: 95% этанол) и давали перемешиваться еще в течение 2 ч в ламинарном боксе для удаления следов ацетона. Микрокапсулы отверждали добавлением 30 мл эфира и сушили на фильтровальной бумаге с использованием воронки Бюхнера и следы жидкого парафина удаляли двумя дополнительными промывками по 30 мл эфира. Затем микрокапсулы оставляли высыхать в течение ночи и пропускали через сито с малыми отверстиями. Большинство микрокапсул имели размеры 200 и 500 мкм. 49 В предварительном эксперименте (фиг. 18) было обнаружено, что микрокапсулы САР являются нерастворимыми при кислом рН, соответствующем среде желудка. Однако после 1 ч в щелочном рН достигалась максимальная РНКазная активность, что указывает на то, что микрокапсулы могли легко высвобождать их содержимое в кишечнике. Пероральное введение микрокапсул РНКазы В 1 Микрокапсулы, содержащие РНКазу В 1 или глюкозу в качестве плацебо, смешивали со смесями Purina. Каждая обработанная РНКазой В 1 крыса получала суточную дозу 1,6 мг РНКазы В 1 для получения конечной концентрации 10-5 М в ободочной кишке. Экспериментальные подробности для перорального введения были аналогичны описанным выше для введения микронасосов, за исключением отсроченного окончания (11 недель) при оценке превентивного действия РНКазы В 1 (фиг. 17). Экспериментальные результаты Действие различных обработок на скорость роста крыс Исходный вес крыс был около 200 г. Эксперимент заканчивался в разное время для каждой обработки, как описано выше. Обычно,крысы достигали конечного веса тела около 400-500 г, без значимых различий между различными обработками (фиг. 19a-d). Однако обработанные DMH группы показали небольшое уменьшение веса тела в сравнении с обработанными РНКазой В 1 группами, в присутствии или в отсутствие DMH. РНКазная активность в фекалиях крыс Фиг. 20 а-с показывают изменения в РНКазной активности в фекалиях крыс, имплантированных осмотическим насосом, содержащим РНКазу В 1, I-РНКазу В 1 или ЗФР, в превентивном режиме (фиг. 1) во время 8 недель. В крысах, обработанных РНКазой В 1 (фиг. 20 а),РНКазная активность в фекалиях была в 5 раз выше, чем в крысах, обработанных I-РНКазой В 1 (фиг. 20b) или ЗФР (фиг. 20 с). Эта активность сохранялась высокой в течение 5 недель и затем постепенно снижалась по мере истощения резервуара РНКазы В 1 в насосах. Фоновую эндогенную РНКазную активность обнаруживали в фекалиях двух последних групп. Сходную картину наблюдали в крысах,получавших с кормом микроинкапсулированную РНКазу В 1, но в 8 раз более высокую РНКазную активность детектировали в сравнении с крысами, получавшими микрокапсулы,содержащие только глюкозу (фиг. 21). В этом эксперименте постепенное уменьшение РНКазной активности может объясняться как результат увеличения веса тела крыс и, вследствие этого, объема ободочной кишки. Действие РНКазы В 1 в качестве превентивного агента Имплантированных насосом крыс умерщвляли после 8 недель, так как наблюдали ин 004929 50 фекцию в местах насосов. Только на этой стадии были видны ACF. ACF являются суррогатными биомаркерами канцерогенных изменений в ободочной кишке крысы во время начальной фазы канцерогенеза. Бокаловидные клетки в криптах становятся более крупными и интенсивно окрашивались в сравнении с нормальными клетками слизистой оболочки. Число ACF резко уменьшалось вследствие обработок РНКазой В 1 или I-РНКазой В 1 (фиг. 22). Не наблюдали разрушающего действия на слизистую оболочку ободочной кишки в крысах, обработанных РНКазой В 1 или I-РНКазой В 1, в отсутствие DMH. В крысах, получавших перорально микроинкапсулированную РНКазу В 1, эксперимент продолжали в течение 11 недель после первого введения DMH. В это время присутствовали как опухоли, так и ACF. РНКаза В 1 вызывала уменьшение числа опухолей на ободочную кишку (фиг. 23 а), размера опухолей (фиг. 23b), a также числа ACF (фиг. 23 с) , в сравнении с контролем. Кроме того, наблюдали цветовое разнообразие опухолей ободочной кишки; красные опухоли, которые имели интенсивное кровоснабжение (фиг. 24 а), белые опухоли, почти лишенные кровеносных сосудов (фиг. 24b) и розовые опухоли с небольшим количеством кровеносных сосудов (фиг. 24 с). В обработанных глюкозой крысах все опухоли были красными. С другой стороны, в обработанных РНКазой B1 крысах наблюдали значимое уменьшение числа красноватых опухолей (фиг. 24d); 10% и 50% опухолей были розовыми и белыми, соответственно. Эти результаты ясно указывают на антиангиогенное действие РHКазы В 1. Опухоли могли также различаться гистопатологическими параметрами, как доброкачественные или злокачественные. Доброкачественная опухоль, называемая аденомой (фиг. 25 а), может быть определена по размноженному слою слизистой оболочки, а иногда по развитию аденопапилломы, однако, слой ткани под слизистой оболочки (субмукоза) является интактным и хорошо отличаемым от других слоев ободочной кишки. В злокачественной опухоли, называемой аденокарциномой, клетки слизистой оболочки проникают под нижележащий слой(субмукозу) и в конечном счете приводят к потере правильного распределения ткани (фиг. 25b и 25 с). Исследования распределения различных типов опухолей в крысах, обработанных превентивно глюкозой или РНКазой В 1, показали,что РНКаза В 1 явно уменьшала степень злокачественности (фиг. 25d). Действие РНКазы В 1 в качестве лекарственного средства В обоих способах применения, либо непосредственно с использованием осмотических насосов, либо перорально, хорошо развитые опухоли подвергали действию РНКазы В 1 в 51 течение 12-17 недель эксперимента. В крысах,обработанных осмотическими насосами, РНКаза В 1 вызывала уменьшение числа опухолей на ободочную кишку (фиг. 26 а). Ингибирующее действие, около 50% относительно контроля,было наиболее значительным в крысах, обработанных I-РНКазой В 1. РНКаза В 1 действовала также на рост опухолей, как показано распределением размеров(фиг. 26b). Как правило, большинство опухолей имели диаметр 3-5 мм, однако, в обработанных ЗФР крысах видны исключительно большие опухоли, с диаметрами более 9-12 мм. Этот результат подразумевает, что РНКаза В 1 ингибирует или останавливает развитие предсуществующих опухолей. Тем не менее, не наблюдали значимых различий между действиями РНКазы В 1 и I-РККазы B1. Как и в эксперименте по превентивному действию РНКазы В 1, на картину ангиогенеза также влияла РНКаза В 1, вносимая через осмотические насосы (фиг. 26 с). В обработанных ЗФР крысах большинство опухолей, около 80%,были красными по цвету. В противоположность этому, в обработанных как РНКазой В 1, так и IРНКазой В 1 крысах только 30% опухолей были красными, тогда как остальные были розовыми или белыми. По-видимому, РНКаза В 1 уменьшает ангиогенез также и в предсуществующих опухолях. В крысах, получающих с кормом инкапсулированную РНКазу В 1, действие этой обработки было менее значительным, чем действие РНКазы В 1, получаемой через осмотические насосы (фиг. 27 а-с). Этот результат объясняется предположением, что очень небольшая доля белка достигает ободочной кишки. Как упоминалось выше, микрокапсулы действительно проходят через желудок, но они все еще имеют длительный путь через тонкую кишку и слепую кишку. Эксперимент по испытанию этой гипотезы проводили, следовательно, с использованием микрокапсул САР, загруженных флуоресцентным белком и предоставляемых крысам. Крыс умерщвляли спустя 6 ч и содержимое их желудочно-кишечного тракта наблюдали под флуоресцентным микроскопом. Было обнаружено, что в двенадцатиперстной кишке микрокапсулы начинали растворяться. Растворение продолжалось далее в подвздошной кишке и тощей кишке. Когда микрокапсулы поступали в слепую кишку, большая часть флуоресценции диффундировала в содержимое слепой кишки. Поскольку микрокапсулы повреждались, действие РНКазы В 1 могло уменьшаться вследствие наличия протеаз в кишечнике и слепой кишке. Несмотря на тот факт, что перорально вводимая РНКаза В 1 не уменьшала число и размер предсуществующих опухолей, она влияла в некоторой степени на распределение цвета среди типов опухолей (фиг. 27 с). Обработанные глюкозой и РНКазой В 1 крысы имели около 60% и 52 40% красных опухолей, соответственно. Повидимому, перорально вводимая РНКаза В 1 в данной композиции также влияла на ангиогенез,но более умеренно. Пример 5. Действие РНКазы В 1 на раковые клетки ободочной кишки НТ 29 человека invitro. Материал и экспериментальные способы Условия роста клеток Все эксперименты выполняли на клетках аденокарциномы ободочной кишки человека(Biolab). Клетки трипсинизировали и 2 мл среды, содержащей 5 х 104 клеток, высевали в каждую лунку 6-луночной чашки. Некоторые чашки дополняли РНКазой В 1 до конечной концентрации 10-6 М. Клетки инкубировали при 37 С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО 2. Спустя 48 ч среду в присутствии или в отсутствие РНКазы В 1 заменяли в каждой лунке, соответственно, для поддержания постоянного снабжения ингредиентами и РНКазой В 1. Спустя 4 дня эту среду удаляли и культуры клеток фиксировали в 4% формальдегиде в ЗФР (150 мМ NaCl, 3 мМ КСl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМNaH2PO4) pH 7,2 в течение 15 мин на льду. Клетки окрашивали в зависимости от различных целей следующим образом. Прямое окрашивание на внутриклеточный актин Клетки промывали в ЗФР и увеличивали их проницаемость в ЗФР, содержащем 0,02% Твин-20 (ЗФРТ), в течение 1 ч при комнатной температуре. После 3 промывок ЗФР клетки окрашивали на актин 10-6 М фаллоидином, меченым изоцианатом тетраметилродамина В(TRITC) (Sigma), в течение 1 ч и давали стоять в ЗФР в течение ночи при 4 С для удаления любого избытка окрашивающего материала. Клетки распределяли в воде на предметном стекле и визуализировали с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа(LSM) 510 (Zeiss). Иммуноокрашивание на мембранный актин Клетки фиксировали формальдегидом и промывали ЗФР, как описано выше, и затем инкубировали с кроличьими антителами против актина (Sigma), разведенными 1:500 в ЗФР, в течение 1 ч при комнатной температуре и промывали три раза ЗФР. Затем клетки инкубировали с козьими антителами против кроличьегоIgG, конъюгированными с изотиоцианатом флуоресцеина (FITC), разведенными 1:100 в ЗФР, в течение 1 ч при тех же условиях, промызали снова и визуализировали, как описано выше. 53 Иммуноокрашивание РНКазы В 1 на клеточной поверхности Поликлональные антитела (Aminolab, Israel) индуцировали в кроликах против очищенной РНКазы В 1. Антитело против РНКазы В 1 использовали в качестве первого антитела в иммуноокрашивании НТ 29 в соответствии с процедурой, описанной выше. Экспериментальные результаты Прямое окрашивание на внутриклеточный актин В контрольных клетках, растущих без РНКазы В 1, наблюдали тонкую сеть актина,окрашенную TRITC, заполняющую цитоплазму клетки. Легкое окрашивание наблюдали на поверхности мембраны (фиг. 28 а). В противоположность этому, в обработанных РНКазой В 1 клетках мембрана и периферическая зона цитоплазмы в каждой клетке была интенсивно окрашенной (фиг. 28b), что указывало на перегруппировку сетки актина в ответ на внешнее добавление РНКазы В 1. Иммуноокрашивание на мембранный актинFITC-иммуноокрашивание показало мелкие флуоресцентные пятна актина в мембранной зоне в контрольных клетках (фиг. 29 а). Этот результат согласуется с окрашиванием TRITC,показанным на фиг. 28 а. В этом эксперименте не использовали детергент, поэтому антитело едва ли проникало в цитоплазму клеток. Таким образом, кажется, что в этих клетках мембранный актин взаимодействует с наружной средой. В обработанных РНКазой В 1 клетках наблюдали гораздо более слабое окрашивание (фиг. 29b), что подразумевает, что РНКаза В 1, ранее связанная с мембранным актином, мешает связыванию антител против актина. Дополнительные клетки, не обработанные РНКазой В 1, инкубировали с предварительно смешанными кроличьими антителами против актина и 1 мкМ актином. Наблюдали такую же слабую флуоресценцию, что и на фиг. 29b (не показано). Для исключения возможности спонтанной флуоресценции FITC клетки обрабатывали, как описано, за исключением того, что отсутствовали антитела против актина. Не обнаруживали флуоресцентного окрашивания. Иммуноокрашивание РНКазы В 1 на клеточной поверхности Очень слабая FITC-флуоресценция появлялась в контрольных клетках, инкубированных с антителом против РНКазы В 1 (фиг. 30 а). Однако обработанные РНКазой В 1 клетки обнаруживали интенсивную флуоресцентную реакцию(фиг. 30b). Этот результат показывает значимое присутствие РНКазы В 1 на клеточной поверхности, особенно на краях и удлинениях клеток. Обработка кроличьей неиммунной сывороткой(PIS) вместо антител против РНКазы В 1 приводила к очень слабой флуоресценции (фиг. 30 с). Пример 6. Действие IAc-РНКазы В 1 на рост пыльцевых трубок лилии. 54 Материалы и экспериментальные способы Йодацетилирование РНКазы В 1 Йодацетилирование РНКазы В 1 выполняли согласно Irie et al. (Irie M, et al. 1986 J. Biochem. 99 (3): 627-33). РНКазу Bl растворяли в 2,5 мл 0,1 M ацетатного буфера, содержащего 0,1 М йодацетат, до конечной концентрации 10 нМ. После инкубирования в течение ночи при 37 С белок высаливали на колонке СефадексаG-15. Фракции, содержащие белок, собирали и интенсивно диализовали против воды. После лиофилизации получали 10 мг белка. РНКазную активность йодацетилированной (IАс-) РНКазы В 1 сравнивали с немодифицированной РНКазой В 1. Действие IAc-РНКазы В 1 на пыльцевые трубки лилии Лиофилизированную IAc-РНКазу B1 растворяли до конечной концентрации 1 или 5 мкМ в среде для выращивания пыльцевых трубок лилии, содержащей 7% сахарозу, 1,27 мМ Са(NO3)20,16 мМ Н 3 ВО 3, 1 мМ KNO3 и 3 мМProtoplasma 177:153-162). Пыльцевые трубки лилии (Lilium longiflorum) проращивали in vitro в пробирках, содержащих 100 мкл среды для выращивания, в присутствии или в отсутствие 10-6 М IAc-РНКазы В 1. В качестве дополнительных контролей, пыльцу лилии проращивали при тех же самых концентрациях РНКазы В 1 или БСА в среде для выращивания. После 1,5 часовой инкубации при 25 С в темноте длину пыльцевых трубок измеряли в каждом варианте обработки под световым микроскопом. Экспериментальные результаты Йодацетилирование РНКазы В 1 Йодацетат приводит к ингибированию РНКазной активности через связывание остатков гистидина в активном сайте РНКазы. РНКазная активность IAc-РНКазы В 1 была на 90% меньше, в сравнении с необработанной РНКазой В 1. Действие IAc-РНКазы В 1 на пыльцевые трубки лилии Контрольные пыльцевые трубки лилии достигают длины 0,26 мм (фиг. 31). В этом эксперименте БСА использовали в качестве контроля, так как он не оказывает цитотоксического действия на пыльцевые трубки. Действительно, при концентрации 10-6 М БСА не оказывал значимого действия на рост пыльцевых трубок. Ингибирующее действие 5x10-6 М БСА может быть объяснено как результат того факта, что пыльцевые трубки являются чувствительными к изменениям осмотического потенциала в среде для выращивания. Как РНКаза В 1, так и IAcРНКаза В 1 проявляли явное ингибирующее действие на рост пыльцевых трубок. В обеих концентрациях IAc-РНКаза В 1 была более эффективной, чем РНКаза В 1, однако, эти различия не были значимыми. Таким образом, в пыльцевых трубках лилии IAc-РНКаза В 1 ингибирует рост пыльцевых трубок аналогично не 55 модифицированной РНКазе В 1, показывая, что потеря РНКазной активности не снижает ее ингибирующего действия. Хотя данное изобретение было описано в связи с его характерными вариантами, очевидно, что многие альтернативы, модификации и вариации будут очевидными специалистам с квалификацией в данной области. Поэтому,предполагается, что оно включает в себя все такие альтернативы, модификации и вариации,которые охватываются идеей и широким объемом прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки и последовательности, идентифицированные номером доступа, упомянутые в этом описании,включены таким образом в качестве ссылки в их полном объеме в это описание, в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация,патент, патентная заявка или последовательность были специально и отдельно указаны как включенные здесь в качестве ссылки. Кроме того, цитирование или идентификация любой ссылки в этой заявке не должно рассматриваться как признание того, что такая ссылка является доступной в качестве прототипа данного изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ предупреждения, ингибирования и/или обращения пролиферации, колонизации,дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих клеток у субъекта, причем этот способ предусматривает стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2. 2. Способ по п.1, где указанная рибонуклеаза семейства Т 2, по существу, не имеет рибонуклеолитической активности. 3. Способ по п.1, где ненормально пролиферирующими клетками являются раковые клетки. 4. Способ по п.1, где ненормально пролиферирующие клетки являются клетками, ассоциированными с пролиферативным нарушением или заболеванием, выбранным из группы, состоящей из папилломы, бластоглиомы, саркомы Капоши, меланомы, рака легкого, рака яичника,рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы, астроцитомы, злокачественной опухоли головы, злокачественной опухоли шеи,рака мочевого пузыря, рака молочной железы,колоректального рака, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка,гепатоцитомерной карциномы, лейкоза, лимфомы, болезни Ходжкина, болезни Беркитта, артрита, ревматоидного артрита, диабетической ретинопатии, ангиогенеза, рестеноза, рестеноза в стентах для расширения сосудов и рестеноза в сосудистых трансплантатах. 5. Способ по п.1, где указанную стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества указанной РНКазы семейства Т 2 56 выполняют посредством способа введения, выбранного из группы, состоящей из перорального введения, местного введения, чресслизистого введения, парентерального введения, ректального введения и введения ингаляцией. 6. Способ по п.1, где указанной рибонуклеазой семейства Т 2 является РНКаза В 1. 7. Способ по п.1, где указанная рибонуклеаза семейства рибонуклеаз Т 2 выбрана из группы, состоящей из РНКазы Т 2, РНКазы Rh,РНКазы М, РНКазы Trv, РНКазы Irp, РНКазыLe2, РНКазы Phyb, РНКазы LE, РНКазы МС,РНКазы CL1, РНКазы Bsp1, РНКазы RCL2,РНКазы Dm, РНКазы Оу и РНКазы Тр. 8. Способ предупреждения, ингибирования и/или обращения пролиферации, колонизации,дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих клеток у субъекта, причем этот способ предусматривает стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2. 9. Способ по п.8, где указанная рибонуклеаза семейства Т 2, по существу, не имеет рибонуклеолитической активности. 10. Способ по п.8, где ненормально пролиферирующими клетками являются раковые клетки. 11. Способ по п.8, где ненормально пролиферирующие клетки являются клетками, ассоциированными с пролиферативным нарушением или заболеванием, выбранным из группы,состоящей из папилломы, бластоглиомы, саркомы Капоши, меланомы, рака легкого, рака яичника, рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы, астроцитомы, злокачественной опухоли головы, злокачественной опухоли шеи, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, гепатоцитомерной карциномы, лейкоза, лимфомы, болезни Ходжкина, болезни Беркитта, артрита, ревматоидного артрита, диабетической ретинопатии, ангиогенеза, рестеноза,рестеноза в стентах для расширения сосудов и рестеноза в сосудистых трансплантатах. 12. Способ по п.8, где указанную стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo указанную РНКазу семейства Т 2, выполняют посредством способа введения, выбранного из группы, состоящей из перорального введения, местного введения, чресслизистого введения, парентерального введения, ректального введения и введения ингаляцией. 13. Способ по п.8, где указанной рибонуклеазой семейства Т 2 является РНКаза В 1. 14. Способ по п.8, где указанная рибонуклеаза семейства Т 2 выбрана из группы, состоящей из РНКазы Т 2, РНКазы Rh, РНКазы М, 57 РНКазы Trv, РНКазы Irp, РНКазы Le2, РНКазыPhyb, РНКазы LE, РНКазы МС, РНКазы CL1,РНКазы Bsp1, РНКазы RCL2, РНКазы Dm,РНКазы Оу и РНКазы Тр. 15. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента рибонуклеазу семейства Т 2 и фармацевтически приемлемый носитель. 16. Фармацевтическая композиция по п.15,где указанная рибонуклеаза семейства Т 2, по существу, не имеет рибонуклеолитической активности. 17. Фармацевтическая композиция по п.15,где указанной рибонуклеазой семейства Т 2 является РНКаза В 1. 18. Фармацевтическая композиция по п.15,где указанная рибонуклеаза семейства Т 2 выбрана из группы, состоящей из РНКазы Т 2,РНКазы Rh, РНКазы М, РНКазы Trv, РНКазыRCL2, РНКазы Dm, РНКазы Оу и РНКазы Тр. 19. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента полинуклеотид, кодирующий и способный экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2, и фармацевтически приемлемый носитель. 20. Фармацевтическая композиция по п.19,где указанная рибонуклеаза семейства Т 2, по существу, не имеет рибонуклеолитической активности. 21. Фармацевтическая композиция по п.19,где указанной рибонуклеазой семейства Т 2 является РНКаза В 1. 22. Фармацевтическая композиция по п.19,где указанная рибонуклеаза семейства Т 2 выбрана из группы, состоящей из РНКазы Т 2,РНКазы Rh, РНКазы М, РНКазы Trv, РНКазыRCL2, РНКазы Dm, РНКазы Оу и РНКазы Тр. 23. Способ приготовления лекарственного средства, применимого в предупреждении, ингибировании и/или обращении пролиферации,колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих клеток у субъекта, предусматривающий комбинирование рибонуклеазы семейства Т 2 с фармацевтически приемлемым носителем. 24. Способ по п.23, где указанная рибонуклеаза семейства Т 2, по существу, не имеет рибонуклеолитической активности. 25. Способ по п.23, дополнительно предусматривающий стадию инактивации рибонуклеолитической активности указанной рибонуклеазы семейства Т 2. 26. Способ по п.25, где указанную стадию инактивации рибонуклеолитической активности указанной рибонуклеазы семейства Т 2 выполняют способом, выбранным из группы, состоя 004929 58 щей из кипячения, автоклавирования и химической денатурации. 27. Способ по п.23, дополнительно предусматривающий стадию идентификации лекарственного средства как средства лечения для указанного рака. 28. Способ по п.23, дополнительно предусматривающий стадию идентификации лекарственного средства как средства лечения для указанного пролиферативного нарушения или заболевания. 29. Способ по п.28, где указанное пролиферативное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из папилломы, бластоглиомы, саркомы Капоши, меланомы, рака легкого, рака яичника, рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы, астроцитомы, злокачественной опухоли головы, злокачественной опухоли шеи, рака мочевого пузыря,рака молочной железы, колоректального рака,рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, гепатоцитомерной карциномы, лейкоза, лимфомы, болезни Ходжкина,болезни Беркитта, артрита, ревматоидного артрита, диабетической ретинопатии, ангиогенеза,рестеноза, рестеноза в стентах для расширения сосудов и рестеноза в сосудистых трансплантатах. 30. Способ по п.23, где указанной рибонуклеазой семейства Т 2 является РНКаза В 1. 31. Способ по п.23, где указанная рибонуклеаза семейства Т 2 выбрана из группы, состоящей из РНКазы Т 2, РНКазы Rh, РНКазы М,РНКазы Trv, РНКазы Irp, РНКазы Le2, РНКазыPhyb, РНКазы LE, РНКазы МС, РНКазы CL1,РНКазы Bsp1, РНКазы RCL2, РНКазы Dm,РНКазы Оу и РНКазы Тр. 32. Способ приготовления лекарственного средства, применимого в предупреждении, ингибировании и/или обращении пролиферации,колонизации, дифференцировки и/или развития ненормально пролиферирующих клеток, предусматривающий стадию комбинирования полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2, с фармацевтически приемлемым носителем. 33. Способ по п.32, где указанная рибонуклеаза семейства Т 2, по существу, не имеет рибонуклеолитической активности. 34. Способ по п.32, дополнительно предусматривающий стадию инактивации рибонуклеолитической активности указанной рибонуклеазы семейства Т 2. 35. Способ по п.34, где указанную стадию инактивации рибонуклеолитической активности указанной рибонуклеазы семейства Т 2 выполняют способом, выбранным из группы, состоящей из кипячения, автоклавирования и химической денатурации. 36. Способ по п.32, дополнительно предусматривающий стадию идентификации лекарст 59 венного средства как средства лечения для указанной злокачественной опухоли. 37. Способ по п.32, дополнительно предусматривающий стадию идентификации лекарственного средства как средства лечения для указанного пролиферативного нарушения или заболевания. 38. Способ по п.37, где указанное пролиферативное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из папилломы, бластоглиомы, саркомы Капоши, меланомы, рака легкого, рака яичника, рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы, астроцитомы, злокачественной опухоли головы, злокачественной опухоли шеи, рака мочевого пузыря,рака молочной железы, колоректального рака,рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, гепатоцитомерной карциномы, лейкоза, лимфомы, болезни Ходжкина,болезни Беркитта, артрита, ревматоидного артрита, диабетической ретинопатии, ангиогенеза,рестеноза, рестеноза в стентах для расширения сосудов и рестеноза в сосудистых трансплантатах. 39. Способ по п.32, где указанной рибонуклеазой семейства Т 2 является РНКаза В 1. 40. Способ по п.32, где указанная рибонуклеаза семейства Т 2 выбрана из группы, состоящей из РНКазы Т 2, РНКазы Rh, РНКазы М,РНКазы Trv, РНКазы Irp, РНКазы Le2, РНКазыPhyb, РНКазы LE, РНКазы МС, РНКазы CL1,РНКазы Bsp1, РНКазы RCL2, РНКазы Dm,РНКазы Оу и РНКазы Тр. 41. Способ лечения опухоли у субъекта,предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2. 42. Способ предупреждения, ингибирования и/или обращения развития опухоли у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2. 43. Способ предупреждения, ингибирования и/или обращения трансформации доброкачественной опухоли в злокачественную опухоль у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2. 44. Способ предупреждения, ингибирования и/или обращения ангиогенеза опухоли у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2. 45. Способ уменьшения числа отдельных опухолей у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2. 46. Способ уменьшения размера опухоли у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2. 47. Способ уменьшения числа злокачественных опухолей у субъекта, предусматривающий ста 004929 60 дию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2. 48. Способ предупреждения, ингибирования и/или обращения трансформации ткани в опухоль у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества рибонуклеазы семейства Т 2. 49. Способ лечения опухоли у субъекта,предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2. 50. Способ предупреждения, ингибирования и/или обращения развития опухоли у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2. 51. Способ предупреждения, ингибирования и/или обращения трансформации доброкачественной опухоли в злокачественную опухоль у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2. 52. Способ предупреждения, ингибирования и/или обращения ангиогенеза опухоли у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2. 53. Способ уменьшения числа отдельных опухолей у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2. 54. Способ уменьшения размера опухоли у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2. 55. Способ уменьшения числа злокачественных опухолей у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2. 56. Способ предупреждения, ингибирования и/или обращения трансформации ткани в опухоль у субъекта, предусматривающий стадию введения этому субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, кодирующего и способного экспрессировать in vivo рекомбинантную рибонуклеазу семейства Т 2.