Соединения и способы для лечения и диагностики рака легкого

1 Область техники Настоящее изобретение в целом касается лечения и диагностики ракового заболевания,такого как рак легкого. Изобретение более конкретно касается полипептидов, включающих по крайней мере сегмент белка легочной опухоли,а также полинуклеотидов, кодирующих такие полипептиды. Указанные полипептиды и полинуклеотиды могут быть использованы в вакцинах и фармацевтических композициях для профилактики и лечения рака легкого и для диагностики и контроля таких форм рака. Предпосылки изобретения Рак легкого является основной причиной онкологической смертности и у мужчин, и у женщин в США при оценке в 172 тысячи новых случаев в 1994 году. Выживаемость в течение 5 лет у всех больных с диагнозом рака легкого,независимо от стадии болезни в момент диагностирования, составляет только 13%. Это контрастирует с 46%-ным уровнем 5-летней выживаемости в тех случаях, когда заболевание все еще локализовано. Однако только в 16% случаев рак легкого диагностируют до того момента, как болезнь распространяется. Раннее выявление затруднительно, поскольку клинические симптомы часто не выявляются до того, как заболевание достигает прогрессирующей стадии. В настоящее время диагноз осуществляется с использованием рентгенографии грудной клетки, анализа типа клеток,содержащихся в мокротах, и фиброскопического анализа бронхиальных путей. Режимы лечения определяют исходя из типа и стадии раковой опухоли: они включают хирургическое вмешательство, радиотерапию и/или химиотерапию. Несмотря на существенные исследования в области лечения данного заболевания, рак легкого остается трудным для лечения. Следовательно, в данной области техники сохраняется необходимость в улучшенных вакцинах, способах лечения и способах диагностики рака легкого. Краткое содержание изобретения В кратком изложении настоящее изобретении представляет композиции и способы для диагностики и лечения такого ракового заболевания, как рак легкого. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает полипептиды, включающие по крайней мере участок белка легочной опухоли или его варианта. Некоторые участки и другие варианты являются иммуногенными в такой степени, что способность варианта взаимодействовать с антигенспецифичными антисыворотками в существенной степени не уменьшается. В некоторых вариантах полипептид включает последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы,которая включает (а) последовательности, приведенные в любом из SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 1013, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 005140(а) или (b). В конкретных вариантах полипептиды по настоящему изобретению включают по крайней мере участок опухолевого белка, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая включает последовательности, приведенные в любом изSEQ ID NO: 152, 155, 156, 165, 166, 169, 170,172, 174, 176, 226-252, 338-344 и 346, и их варианты. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает полинуклеотиды, которые кодируют полипептид в соответствии с описанным выше, или их участок (такой как участок,кодирующий по крайней мере 15 аминокислотных остатков белка легочной опухоли), экспрессирующие векторы, включающие такие полинуклеотиды, и клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные указанными экспрессирующими векторами. В других аспектах настоящее изобретение представляет фармацевтические композиции,содержащие полипептид или полинуклеотид в соответствии с описанным выше и физиологически приемлемый носитель. В близком аспекте настоящего изобретения предусматриваются вакцины для профилактического или терапевтического применения. Такие вакцины содержат полипептид или полинуклеотид, описанные выше, и иммуностимулирующее средство. Далее настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции, которые содержат: (а) антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком легочной опухоли; и (b) физиологически приемлемый носитель. В других аспектах настоящее изобретение представляет фармацевтические композиции,содержащие: (а) антиген-презентирующую клетку, которая экспрессирует описанный выше полипептид; и (b) фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Антигенпрезентирующими клетками являются дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и В-лимфоциты. В близких аспектах предусматриваются вакцины, которые содержат: (а) антиген 3 презентирующую клетку, которая экспрессирует описанный выше полипептид; и (b) иммуностимулирующее средство. Далее в других аспектах настоящее изобретение представляет химерные белки, которые включают по крайней мере один полипептид в соответствии с описанным выше, а также полинуклеотиды, кодирующие такие химерные белки. В близких аспектах представляются фармацевтические композиции, содержащие химерный белок или полинуклеотид, кодирующий химерный белок, в сочетании с физиологически приемлемым носителем. Далее в следующих аспектах предусматриваются вакцины, которые содержат химерный белок или полинуклеотид, кодирующий химерный белок, в сочетании с иммуностимулирующим средством. В следующих аспектах настоящее изобретение охватывает способы подавления развития рака у пациента, включающие введение пациенту фармацевтической композиции или вакцины,отмеченных выше. Кроме того, в других аспектах настоящее изобретение представляет способы удаления опухолевых клеток из биологического образца,включающие контактирование биологического образца с Т-клетками, специфически взаимодействующими с белком легочной опухоли,причем стадию контактирования проводят в условиях и в течение времени, достаточных для удаления из образца клеток, экспрессирующих данный белок. В близких аспектах предусматриваются способы подавления развития рака у пациента,включающие введение пациенту биологического образца, обработанного в соответствии с описанным выше. Далее в следующих аспектах предусматриваются способы стимуляции и/или воспроизведения Т-клеток, специфичных для белка легочной опухоли, включающие контактирование Тклеток с одним или несколькими из: (i) описанным выше полипептидом;(ii) полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид; и/или (iii) с антиген-презентирующей клеткой,которая экспрессирует такой полипептид; в условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения стимуляции и/или воспроизведения Т-клеток. Также представляются детерминированные Т-клеточные популяции, включающие Т-клетки, полученные в соответствии с описанным выше. В последующих аспектах настоящее изобретение представляет способы подавления развития рака у пациента, включающие введение пациенту эффективного количества Т-клеточной популяции, описанной выше. Далее настоящее изобретение представляет способы подавления развития рака у пациента, включающие следующие стадии: (а) инкуба 005140 4 цию СD4-позитивных и/или CD8-позитивных Тклеток, взятых от пациента, с одним или несколькими из: (i) полипептидом, включающим по крайней мере иммуногенный участок белка легочной опухоли; (ii) полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид; и (iii) антигенпрезентирующей клеткой, которая экспрессирует такой полипептид; и (b) введение пациенту эффективного количества пролиферировавших Т-клеток, что тем самым подавляет развитие рака у пациента. Пролиферировавшие клетки могут, что не является обязательным, быть клонированы до введения пациенту. В других аспектах настоящее изобретение предусматривает способы определения наличия или отсутствия рака у пациента, включающие(а) контактирование биологического образца,взятого от пациента, со связывающим агентом,который связывается с приведенным выше полипептидом; (b) определение в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; и (с) сравнение количества полипептида с заранее установленной величиной отсечки, что тем самым определяет наличие или отсутствие рака у пациента. В предпочтительных вариантах связывающим агентом является антитело, более предпочтительно - моноклональное антитело. Рак может быть раком легкого. Также настоящее изобретение в других своих аспектах охватывает способы контроля за развитием рака у пациента. Такие способы включают стадии: (а) контактирование биологического образца, взятого от пациента в первый момент времени, со связывающим агентом,который связывается с полипептидом, описанным выше; (b) определение в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; (с) повторение стадий (а) и (b) с использованием биологического образца, взятого от пациента в последующий момент времени; и (а) сравнение количества полипептида,выявленного на стадии (с), с количеством, выявленным на стадии (b), что тем самым позволяет контролировать развитие рака у пациента. Далее настоящее изобретение в других аспектах представляет способы определения наличия или отсутствия ракового заболевания у пациента, включающие стадии: (а) контактирование биологического образца, взятого от пациента, с олигонуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим белок легочной опухоли; (b) определение в образце уровня полинуклеотида,предпочтительно мРНК, который гибридизуется с олигонуклеотидом; и (с) сравнение уровня полинуклеотида,который гибридизуется с олигонуклеотидом, с заранее установленной величиной отсечки, тем самым определяя наличие или отсутствие у пациента ракового заболевания. В некоторых вариантах количество мРНК определяют с помощью полимеразной цепной реакции с использо 5 ванием, например, по крайней мере одного олигонуклеотидного праймера, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, описанный выше, или с комплементом такого полинуклеотида. В других вариантах количество мРНК определяют с использованием метода гибридизации, используя олигонуклеотидный зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, описанный выше, или с комплементом такого полинуклеотида. В близких аспектах представляются способы контроля за развитием рака у пациента,включающие стадии: (а) контактирование биологического образца, взятого от пациента, с олигонуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим белок легочной опухоли; (b) определение в образце количества полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом; (с) повторение стадий (а) и (b) с использованием биологического образца, взятого от пациента в последующий момент времени; и (а) сравнение количества полинуклеотида,выявленного на стадии (с), с количеством, выявленным на стадии (b), что тем самым позволяет контролировать развитие ракового заболевания у пациента. В следующих аспектах настоящее изобретение предусматривает антитела, такие как моноклональные антитела, которые связываются с полипептидом в соответствии с описанным выше, а также диагностические наборы, содержащие такие антитела. Также представляются диагностические наборы, содержащие один или несколько олигонуклеотидных зондов или праймеров в соответствии с описанным выше. Указанные и другие аспекты настоящего изобретения станут ясны в результате ознакомления с нижеследующим подробным описанием и прилагающимися чертежами. Все приведенные в данном тексте библиографические ссылки включены здесь для сведения в полном своем объеме в той же степени, в какой они включены здесь по отдельности. Идентификаторы последовательностейSEQ ID NO 1 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-2.SEQ ID NO 2 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-28.SEQ ID NO 3 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-90.SEQ ID NO 4 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-144.SEQ ID NO 5 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-133.SEQ ID NO 6 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-169.SEQ ID NO 7 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-6.SEQ ID NO 8 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-11.SEQ ID NO 9 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-17.SEQ ID NO 10 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-25.SEQ ID NO 11 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-39.SEQ ID NO 12 представляет первую установленную последовательность кДНК для LSTS2-43.SEQ ID NO 13 представляет вторую установленную последовательность кДНК для LSTS2-43.SEQ ID NO 14 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-65.SEQ ID NO 15 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-68.SEQ ID NO 16 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-72.SEQ ID NO 17 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-74.SEQ ID NO 18 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-103.SEQ ID NO 19 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N11F.SEQ ID NO 20 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N12A.SEQ ID NO 21 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N14H.SEQ ID NO 22 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N15A.SEQ ID NO 23 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N16B.SEQ ID NO 24 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N17B.SEQ ID NO 25 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N17H.SEQ ID NO 26 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N18A.SEQ ID NO 27 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N18D.SEQ ID NO 28 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N19A.SEQ ID NO 29 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N19E.SEQ ID NO 30 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N110A.SEQ ID NO 31 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N110G.SEQ ID NO 32 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N111A.SEQ ID NO 33 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N112C.SEQ ID NO 34 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-N112E.SEQ ID NO 35 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B13D.SEQ ID NO 36 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B16C.SEQ ID NO 37 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B15D.SEQ ID NO 38 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B15F.SEQ ID NO 39 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B16G.SEQ ID NO 40 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B18A.SEQ ID NO 41 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B18D.SEQ ID NO 42 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B110A.SEQ ID NO 43 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B19B.SEQ ID NO 44 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B19F.SEQ ID NO 45 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-B112D.SEQ ID NO 46 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-I22B.SEQ ID NO 47 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-I25F.SEQ ID NO 48 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-I26B.SEQ ID NO 49 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-I27F.SEQ ID NO 50 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-I28G.SEQ ID NO 51 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-I29E.SEQ ID NO 52 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-I212B.SEQ ID NO 53 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-H22C.SEQ ID NO 54 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-H21G.SEQ ID NO 55 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-H24G.SEQ ID NO 56 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-H23H.SEQ ID NO 57 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-H25G.SEQ ID NO 58 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-H29B.SEQ ID NO 59 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-H210H.SEQ ID NO 60 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S2-H212D.SEQ ID NO 61 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S3-2.SEQ ID NO 62 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S3-4.SEQ ID NO 63 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S3-7.SEQ ID NO 64 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S3-8.SEQ ID NO 65 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S3-12.SEQ ID NO 66 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S3-13.SEQ ID NO 67 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S3-14.SEQ ID NO 68 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S3-16.SEQ ID NO 69 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S3-21.SEQ ID NO 70 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S3-22.SEQ ID NO 71 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-7.SEQ ID NO 72 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A1E.SEQ ID NO 73 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A1G.SEQ ID NO 74 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A3E.SEQ ID NO 75 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A4E.SEQ ID NO 76 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A6D.SEQ ID NO 77 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A8D.SEQ ID NO 78 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A10A.SEQ ID NO 79 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A10C.SEQ ID NO 80 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A9D.SEQ ID NO 81 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A10D.SEQ ID NO 82 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A9H.SEQ ID NO 83 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A11D.SEQ ID NO 84 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A12D.SEQ ID NO 85 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A11E.SEQ ID NO 86 представляет установленную последовательность кДНК для LST-S1-A12E.SEQ ID NO 87 представляет установленную последовательность кДНК для L513S(T3).SEQ ID NO 88 представляет установленную последовательность кДНК для L513S, контиг 1.SEQ ID NO 89 представляет первую установленную последовательность кДНК дляSEQ ID NO 90 представляет вторую установленную последовательность кДНК дляSEQ ID NO 91 представляет первую установленную последовательность кДНК дляSEQ ID NO 92 представляет вторую установленную последовательность кДНК дляSEQ ID NO 93 представляет установленную последовательность кДНК для L517S.SEQ ID NO 94 представляет достроенную последовательность кДНК LST-S1-169 (также известной как L519S).SEQ ID NO 95 представляет первую установленную последовательность кДНК дляSEQ ID NO 96 представляет вторую установленную последовательность кДНК дляSEQ ID NO 97 представляет первую установленную последовательность кДНК дляSEQ ID NO 98 представляет вторую установленную последовательность кДНК дляSEQ ID NO 99 представляет установленную последовательность кДНК для L522S.SEQ ID NO 100 представляет установленную последовательность кДНК для L523S.SEQ ID NO 101 представляет установленную последовательность кДНК для L524S.SEQ ID NO 102 представляет установленную последовательность кДНК для L525S.SEQ ID NO 103 представляет установленную последовательность кДНК для L526S.SEQ ID NO 104 представляет установленную последовательность кДНК для L527S.SEQ ID NO 105 представляет установленную последовательность кДНК для L528S.SEQ ID NO 106 представляет установленную последовательность кДНК для L529S.SEQ ID NO 107 представляет первую установленную последовательность кДНК дляSEQ ID NO 108 представляет вторую установленную последовательность кДНК дляSEQ ID NO 109 представляет установленную полноразмерную последовательность кДНК для короткой формы L531S.SEQ ID NO 110 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность,кодируемую SEQ ID NO 109.SEQ ID NO 111 представляет установленную полноразмерную последовательность кДНК для длинной формы L531S.SEQ ID NO 112 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность,кодируемую SEQ ID NO 111.SEQ ID NO 113 представляет установленную полноразмерную последовательность кДНК для L520S.SEQ ID NO 114 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность,кодируемую SEQ ID NO 113.SEQ ID NO 115 представляет установленную последовательность кДНК для контига 1.SEQ ID NO 116 представляет установленную последовательность кДНК для контига 3.SEQ ID NO 117 представляет установленную последовательность кДНК для контига 4.SEQ ID NO 118 представляет установленную последовательность кДНК для контига 5.SEQ ID NO 119 представляет установленную последовательность кДНК для контига 7.SEQ ID NO 120 представляет установленную последовательность кДНК для контига 8.SEQ ID NO 121 представляет установленную последовательность кДНК для контига 9.SEQ ID NO 122 представляет установленную последовательность кДНК для контига 10.SEQ ID NO 123 представляет установленную последовательность кДНК для контига 12.SEQ ID NO 124 представляет установленную последовательность кДНК для контига 11.SEQ ID NO 125 представляет установленную последовательность кДНК для контига 13.SEQ ID NO 126 представляет установленную последовательность кДНК для контига 15.SEQ ID NO 127 представляет установленную последовательность кДНК для контига 16.SEQ ID NO 128 представляет установленную последовательность кДНК для контига 17.SEQ ID NO 129 представляет установленную последовательность кДНК для контига 19.SEQ ID NO 130 представляет установленную последовательность кДНК для контига 20.SEQ ID NO 131 представляет установленную последовательность кДНК для контига 22.SEQ ID NO 132 представляет установленную последовательность кДНК для контига 24.SEQ ID NO 133 представляет установленную последовательность кДНК для контига 29.SEQ ID NO 134 представляет установленную последовательность кДНК для контига 31.SEQ ID NO 135 представляет установленную последовательность кДНК для контига 33.SEQ ID NO 136 представляет установленную последовательность кДНК для контига 38.SEQ ID NO 137 представляет установленную последовательность кДНК для контига 39.SEQ ID NO 138 представляет установленную последовательность кДНК для контига 41.SEQ ID NO 139 представляет установленную последовательность кДНК для контига 43.SEQ ID NO 140 представляет установленную последовательность кДНК для контига 44.SEQ ID NO 141 представляет установленную последовательность кДНК для контига 45.SEQ ID NO 142 представляет установленную последовательность кДНК для контига 47.SEQ ID NO 143 представляет установленную последовательность кДНК для контига 48.SEQ ID NO 144 представляет установленную последовательность кДНК для контига 49.SEQ ID NO 145 представляет установленную последовательность кДНК для контига 50.SEQ ID NO 146 представляет установленную последовательность кДНК для контига 53.SEQ ID NO 147 представляет установленную последовательность кДНК для контига 54.SEQ ID NO 148 представляет установленную последовательность кДНК для контига 56.SEQ ID NO 149 представляет установленную последовательность кДНК для контига 57.SEQ ID NO 150 представляет установленную последовательность кДНК для контига 58.SEQ ID NO 151 представляет полноразмерную последовательность кДНК для L530S.SEQ ID NO 153 представляет полноразмерную последовательность кДНК первого варианта L514S.SEQ ID NO 154 представляет полноразмерную последовательность кДНК второго варианта L514S.SEQ ID NO 157 представляет установленную последовательность кДНК для контига 59.SEQ ID NO 158 представляет полноразмерную последовательность кДНК для L763P(также обозначаемой как контиг 22).SEQ ID NO 160 представляет полноразмерную последовательность кДНК для L762P(также обозначаемой как контиг 17).SEQ ID NO 162 представляет установленную последовательность кДНК для L515S.SEQ ID NO 163 представляет полноразмерную последовательность кДНК первого варианта L524S.SEQ ID NO 164 представляет полноразмерную последовательность кДНК второго варианта L524S.SEQ ID NO 167 представляет полноразмерную последовательность кДНК первого варианта L762P.SEQ ID NO 168 представляет полноразмерную последовательность кДНК второго варианта L762P.SEQ ID NO 171 представляет полноразмерную последовательность кДНК L773P (также обозначаемой как контиг 56).SEQ ID NO 173 представляет достроенную последовательность кДНК для L519S.SEQ ID NO 174 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность,кодируемую SEQ ID NO 173.SEQ ID NO 175 представляет полноразмерную последовательность кДНК для L523S.SEQ ID NO 176 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность,кодируемую SEQ ID NO 175.SEQ ID NO 177 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub57A.SEQ ID NO 178 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub58G.SEQ ID NO 179 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub58H.SEQ ID NO 180 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub510B.SEQ ID NO 181 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub510H.SEQ ID NO 182 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub512B.SEQ ID NO 183 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub511C.SEQ ID NO 184 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-1c.SEQ ID NO 185 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-2f.SEQ ID NO 186 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub62G.SEQ ID NO 187 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub64d.SEQ ID NO 188 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-4e.SEQ ID NO 189 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-4f.SEQ ID NO 190 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub63h.SEQ ID NO 191 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub65d.SEQ ID NO 192 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub65h.SEQ ID NO 193 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub66h.SEQ ID NO 194 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-7a.SEQ ID NO 195 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-8a.SEQ ID NO 196 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-7a.SEQ ID NO 197 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-7e.SEQ ID NO 198 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-8e.SEQ ID NO 199 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub67g.SEQ ID NO 200 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-9f.SEQ ID NO 201 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub69h.SEQ ID NO 202 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub611b.SEQ ID NO 203 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub611c.SEQ ID NO 204 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub612c.SEQ ID NO 205 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub612e.SEQ ID NO 206 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub612f.SEQ ID NO 207 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub611g.SEQ ID NO 208 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub612g.SEQ ID NO 209 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub612h.SEQ ID NO 210 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II1a.SEQ ID NO 211 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II2b.SEQ ID NO 212 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II2g.SEQ ID NO 213 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II1h.SEQ ID NO 214 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II4a.SEQ ID NO 215 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II4b.SEQ ID NO 216 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II3e.SEQ ID NO 217 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II4f.SEQ ID NO 218 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II4g.SEQ ID NO 219 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II4h.SEQ ID NO 220 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II5c.SEQ ID NO 221 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II5e.SEQ ID NO 222 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II6f.SEQ ID NO 223 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II5g.SEQ ID NO 224 представляет установленную последовательность кДНК для LST-sub6-II6g.SEQ ID NO 225 представляет аминокислотную последовательность для L528S.SEQ ID NO 252 представляет экспрессированную аминокислотную последовательностьSEQ ID NO 254 представляет последовательность ДНК экспрессионной конструкцииSEQ ID NO 255 представляет установленную последовательность для клона 23785.SEQ ID NO 256 представляет установленную последовательность для клона 23786.SEQ ID NO 257 представляет установленную последовательность для клона 23788.SEQ ID NO 258 представляет установленную последовательность для клона 23790.SEQ ID NO 259 представляет установленную последовательность для клона 23793.SEQ ID NO 260 представляет установленную последовательность для клона 23794.SEQ ID NO 261 представляет установленную последовательность для клона 23795.SEQ ID NO 262 представляет установленную последовательность для клона 23796.SEQ ID NO 263 представляет установленную последовательность для клона 23797.SEQ ID NO 264 представляет установленную последовательность для клона 23798.SEQ ID NO 265 представляет установленную последовательность для клона 23799.SEQ ID NO 266 представляет установленную последовательность для клона 23800.SEQ ID NO 267 представляет установленную последовательность для клона 23802.SEQ ID NO 268 представляет установленную последовательность для клона 23803.SEQ ID NO 269 представляет установленную последовательность для клона 23804.SEQ ID NO 270 представляет установленную последовательность для клона 23805.SEQ ID NO 271 представляет установленную последовательность для клона 23806.SEQ ID NO 272 представляет установленную последовательность для клона 23807.SEQ ID NO 273 представляет установленную последовательность для клона 23808.SEQ ID NO 274 представляет установленную последовательность для клона 23809.SEQ ID NO 275 представляет установленную последовательность для клона 23810.SEQ ID NO 276 представляет установленную последовательность для клона 23811.SEQ ID NO 277 представляет установленную последовательность для клона 23812.SEQ ID NO 278 представляет установленную последовательность для клона 23813.SEQ ID NO 279 представляет установленную последовательность для клона 23815.SEQ ID NO 280 представляет установленную последовательность для клона 25298.SEQ ID NO 281 представляет установленную последовательность для клона 25299.SEQ ID NO 282 представляет установленную последовательность для клона 25300.SEQ ID NO 283 представляет установленную последовательность для клона 25301.SEQ ID NO 284 представляет установленную последовательность для клона 25304.SEQ ID NO 285 представляет установленную последовательность для клона 25309.SEQ ID NO 286 представляет установленную последовательность для клона 25312.SEQ ID NO 287 представляет установленную последовательность для клона 25317.SEQ ID NO 288 представляет установленную последовательность для клона 25321.SEQ ID NO 289 представляет установленную последовательность для клона 25323.SEQ ID NO 290 представляет установленную последовательность для клона 25327.SEQ ID NO 291 представляет установленную последовательность для клона 25328.SEQ ID NO 292 представляет установленную последовательность для клона 25332.SEQ ID NO 293 представляет установленную последовательность для клона 25333.SEQ ID NO 294 представляет установленную последовательность для клона 25336.SEQ ID NO 295 представляет установленную последовательность для клона 25340.SEQ ID NO 296 представляет установленную последовательность для клона 25342.SEQ ID NO 297 представляет установленную последовательность для клона 25356.SEQ ID NO 298 представляет установленную последовательность для клона 25357.SEQ ID NO 299 представляет установленную последовательность для клона 25361.SEQ ID NO 300 представляет установленную последовательность для клона 25363.SEQ ID NO 301 представляет установленную последовательность для клона 25397.SEQ ID NO 302 представляет установленную последовательность для клона 25402.SEQ ID NO 303 представляет установленную последовательность для клона 25403.SEQ ID NO 304 представляет установленную последовательность для клона 25405.SEQ ID NO 305 представляет установленную последовательность для клона 25407.SEQ ID NO 306 представляет установленную последовательность для клона 25409.SEQ ID NO 307 представляет установленную последовательность для клона 25396.SEQ ID NO 308 представляет установленную последовательность для клона 25414.SEQ ID NO 309 представляет установленную последовательность для клона 25410.SEQ ID NO 310 представляет установленную последовательность для клона 25406.SEQ ID NO 311 представляет установленную последовательность для клона 25306.SEQ ID NO 312 представляет установленную последовательность для клона 25362.SEQ ID NO 313 представляет установленную последовательность для клона 25360.SEQ ID NO 314 представляет установленную последовательность для клона 25398.SEQ ID NO 315 представляет установленную последовательность для клона 25355.SEQ ID NO 316 представляет установленную последовательность для клона 25351.SEQ ID NO 317 представляет установленную последовательность для клона 25331.SEQ ID NO 318 представляет установленную последовательность для клона 25338.SEQ ID NO 319 представляет установленную последовательность для клона 25335.SEQ ID NO 320 представляет установленную последовательность для клона 25329.SEQ ID NO 321 представляет установленную последовательность для клона 25324.SEQ ID NO 322 представляет установленную последовательность для клона 25322.SEQ ID NO 323 представляет установленную последовательность для клона 25319.SEQ ID NO 324 представляет установленную последовательность для клона 25316.SEQ ID NO 325 представляет установленную последовательность для клона 25311.SEQ ID NO 326 представляет установленную последовательность для клона 25310.SEQ ID NO 327 представляет установленную последовательность для клона 25302.SEQ ID NO 328 представляет установленную последовательность для клона 25315.SEQ ID NO 329 представляет установленную последовательность для клона 25308.SEQ ID NO 330 представляет установленную последовательность для клона 25303.SEQ ID NO 331-337 представляют последовательности кДНК изоформ гомолога опухоль-супрессорного белка р 53 - р 63 (также обозначаемого как L530S).SEQ ID NO 345 представляет вторую последовательность кДНК антигена L763P.SEQ ID NO 347 представляет установленную полноразмерную последовательность кДНК для L523S.SEQ ID NO 348 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность,кодируемую SEQ ID NO 347.SEQ ID NO 350 представляет аминокислотную последовательность N-концевой частиL773P. Подробное описание изобретения Как отмечалось выше, настоящее изобретение в целом направлено на композиции и способы для лечения и диагностики рака, такого как рак легкого. Описанные в данном тексте композиции могут содержать полипептиды легочной опухоли, полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды, связывающие агенты, такие как антитела, антиген-презентирующие клетки(АПК) и/или клетки иммунной системы (например, Т-клетки). Полипептиды по настоящему изобретению в принципе включают по крайней мере участок (такой как иммуногенный сегмент) белка легочной опухоли или его варианта. Белок легочной опухоли - это белок, который экспрессируется в клетках легочной опухоли на уровне по крайней мере в два раза и предпочтительно по крайней мере в пять раз выше уровня экспрессии в нормальной ткани, что определено с использованием репрезентативного анализа,описанного в данном тексте. Некоторые белки легочной опухоли являются опухолевыми белками, которые на выявляемом уровне (при использовании иммунологического анализа, такого как ТИФА или Вестерн-блоттинг) взаимодействуют с антисыворотками больного с диагнозом рака легкого. В целом, полинуклеотиды по настоящему изобретению включают последовательность ДНК или РНК, которая кодирует полностью или частично такой полипептид или которая комплементарна указанной последовательности. В целом, антитела являются белками иммунной системы или их антигенсвязывающими фрагментами, которые способны связываться с полипептидом в соответствии с описанным выше. Антиген-презентирующими клетками являются дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и В-лимфоциты, 19 которые экспрессируют описанный выше полипептид. Т-клетки, которые могут быть использованы в составе указанных композиций, в целом, являются Т-клетками, которые специфичны для полипептида, описанного выше. Настоящее изобретение основывается на открытии белков легочной опухоли человека. Последовательности полинуклеотидов, кодирующие конкретные опухолевые белки, представлены в SEQ ID NO 1-109, 111, 113, 115-151,153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171,173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 и 349. Полинуклеотиды белков легочной опухоли Любой полинуклеотид, который кодирует белок легочной опухоли или его участок, или другой его вариант в соответствии с описанным в данном тексте, охватывается настоящим изобретением. Предпочтительные полинуклеотиды включают по крайней мере 15 расположенных подряд нуклеотидов, предпочтительно по крайней мере 30 расположенных подряд нуклеотидов и более предпочтительно по крайней мере 45 расположенных подряд нуклеотидов, которые кодируют участок белка легочной опухоли. Более предпочтительно полинуклеотид кодирует иммуногенный сегмент белка легочной опухоли. Полинуклеотиды, комплементарные любой такой последовательности, также охватываются настоящим изобретением. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными, а также могут быть молекулами ДНК(геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК охватывают молекулы гяРНК,которые включают интроны и соответствуют молекуле ДНК по типу один к одному, а также молекулы мРНК, в которых интроны отсутствуют. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, что необязательно, присутствовать в составе полинуклеотида по настоящему изобретению, а полинуклеотид может быть, а может не быть связан с другими молекулами и/или материалами подложки. Полинуклеотиды могут включать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует белок легочной опухоли или его часть) или могут включать вариант такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут включать одну или большее число замен, добавлений, делеций и/или вставок таким образом, что иммуногенность кодируемого полипептида не снижается по отношению к нативному опухолевому белку. Уровень иммуногенности кодируемого полипептида в принципе можно оценить в соответствии с описанным в данном тексте. Предпочтительно варианты проявляют по крайней мере примерно 70% идентичности, более предпочтительно по крайней мере примерно 80% идентичности и наиболее предпочтительно по крайней мере примерно 90% идентичности по отно 005140 20 шению к полинуклеотидной последовательности, которая кодирует нативный белок легочной опухоли или его часть. Термин варианты также охватывает гомологичные гены ксеногенного происхождения. Две полинуклеотидные или полипептидные последовательности называют идентичными, если последовательность нуклеотидов или аминокислот в двух последовательностях одинакова при сопоставлении их в соответствии с описанным далее по принципу максимального соответствия. Сравнения между двумя последовательностями обычно проводят путем сравнения последовательностей в окне сравнения с целью идентификации и сравнения локальных мотивов по сходству последовательности. По использованию в данном тексте термин окно сравнения обозначает участок по крайней мере из примерно 20 расположенных подряд положений, обычно от 30 до примерно 75, от 40 до примерно 50, внутри которого последовательность можно сравнивать с референсной последовательностью с тем же числом непрерывных положений после того, как две последовательности сопоставлены оптимальным образом. Оптимальное сопоставление последовательностей для сравнения может быть осуществлено с использованием программы Megalign из набора Lasergene биоинформационного компьютерного пакета (DNASTAR Inc., Madison, WI) с использованием установок по умолчанию. Данная программа включает ряд схем сопоставления, описанных в следующих источниках:Sci. USA, 80, 726-730. Предпочтительно процент идентичности последовательностей определяют путем сравнения двух оптимально сопоставленных последовательностей в окне сравнения по крайней мере 20 положений, причем часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может включать вставки или делеции (т.е. пробелы) на уровне 20% или меньше, обычно 5-15% или 10-12%, по сравнению с референсными последовательностями(которые не содержат вставок или делеций), для 21 оптимального сопоставления двух последовательностей. Процент подсчитывают путем определения числа позиций, по которым имеются идентичные основания нуклеиновой кислоты или остатки аминокислот в обеих последовательностях, устанавливая число совпадающих положений, после чего делят число совпавших положений на общее число положений в референсной последовательности (т.е. на размер окна) и умножают полученный результат на 100,получая процент идентичности последовательностей. Также или в качестве альтернативы варианты могут быть по существу гомологичными нативному гену или его части, или его комплементу. Такие варианты полинуклеотидов способны гибридизоваться при условиях средней жесткости со встречающейся в естественных условиях последовательностью ДНК, кодирующей нативный белок легочной опухоли (или комплементарной последовательностью). Подходящими условиями средней жесткости являются предварительная промывка в растворе 5xSSC, 0,5% ДСН, 1,0 мМ ЭДТА (рН=8,0); гибридизация при 50-65 С в 5xSSC в течение ночи; последующая промывка дважды при 65 С в течение 20 минут в каждом из 2 х, 0,5 х и 0,2xSSC,содержащих 0,1% ДСН. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что вследствие вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей,кодирующих описываемый здесь полипептид. Некоторые из таких полинуклеотидов характеризуются минимальным уровнем гомологии с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее полинуклеотиды,которые варьируются из-за различий в библиотеках кодонов, в частности, предусматриваются настоящим изобретением. Кроме того, аллели генов, включающие представляемые здесь полинуклеотидные последовательности, попадают в объем настоящего изобретения. Аллелями являются эндогенные гены, которые изменены в результате одной или нескольких мутаций, таких как делеции, вставки и/или замены нуклеотидов. Образующиеся в результате мРНК и белок могут иметь измененные структуру и функции, хотя это и не обязательно. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов (таких как гибридизация,амплификация и/или скрининг баз данных по последовательностям). Полинуклеотиды могут быть получены с использованием любого из различных методов. Например, полинуклеотид может быть идентифицирован в соответствии с тем, что подробно описано далее, в результате скрининга микроматрицы кДНК на связанную с опухолью экспрессию (т.е. экспрессию, которая по крайней мере в два раза интенсивнее в легочной опухоли, чем в нормальной ткани по данным репре 005140 22 зентативного анализа, описанного в данном тексте). Указанный скрининг может быть осуществлен с использованием микроматрицы Synteni(Palo Alto, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя (и по существу согласно описанному у Schena et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci.Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2150-2155). Как альтернатива, полипептиды могут быть амплифицированы на материале кДНК, полученной из клеток, экспрессирующих описанные здесь белки, таких как клетки легочной опухоли. Такие полинуклеотиды могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции(ПЦР). Для этого специфичные по последовательности праймеры могут быть сконструированы, исходя из представленных здесь последовательностей, или могут быть куплены или синтезированы. Амплифицированный фрагмент может быть использован для выделения полноразмерного гена из подходящей библиотеки (например, библиотеки кДНК легочной опухоли) с использованием хорошо известных методов. В таких методах библиотеку (кДНК или геномную) подвергают скринингу с использованием одного или нескольких полинуклеотидных зондов или праймеров, пригодных для амплификации. Предпочтительно библиотеку сортируют по размеру с включением более крупных молекул. Случайно праймированные библиотеки также могут быть предпочтительными для идентификации 5'-фланкирующих и вышележащих участков генов. Геномные библиотеки предпочтительны для получения интронов и протяженных 5'-последовательностей. Для методов гибридизации частичная последовательность может быть помечена (например, с помощью ник-трансляции или концевого мечения 32P) с использованием хорошо известных методов. Затем бактериальную или фаговую библиотеку подвергают скринингу путем гибридизации фильтров, содержащих денатурированные бактериальные колонии (или газоны,включающие фаговые бляшки), с меченным зондом (см. Sambrook et al., 1989, "MolecularCloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY). Гибридизовавшие колонии или бляшки отбирают и воспроизводят, а ДНК выделяют для дальнейшего анализа. Клоны кДНК можно анализировать с целью определения величины дополнительной последовательности с помощью, например, ПЦР с использованием праймера для частичной последовательности и праймера для вектора. Рестрикционные карты и частичные последовательности могут быть сформированы так, чтобы идентифицировать один или большее число перекрывающихся клонов. После этого полную последовательность можно определить с помощью стандартных методов, которые могут включать создание серии делеционных кло 23 нов. Полученные в результате перекрывающиеся последовательности затем собирают в единую непрерывную последовательность. Полноразмерная молекула кДНК может быть сформирована путем лигирования подходящих фрагментов с применением хорошо известных методов. Как альтернатива, имеется значительное число методов амплификации для получения полноразмерной кодирующей последовательности на материале частичной последовательности кДНК. В таких методах амплификацию обычно проводят с помощью ПЦР. Любой из множества имеющихся в продаже соответствующих наборов можно использовать для проведения амплификационной стадии. Праймеры могут быть сконструированы с использованием, например,известной в данной области техники компьютерной программы. Длина праймеров предпочтительно составляет 22-30 нуклеотидов, содержание пары GC составляет по крайней мере 50%, а отжиг на последовательность-мишень проводят при температуре примерно 68-72 С. Амплифицированный фрагмент может быть секвенирован в соответствии с описанным выше, а перекрывающиеся последовательности собраны в непрерывную последовательность. Одним из указанных методов амплификации является инверсионная ПЦР (см. Triglia etal., 1988, Nucl. Acids Res., 16, 8186), в которой используют рестриктазы для создания фрагмента в известном участке гена. Затем фрагмент циркуляризуют путем внутримолекулярного лигирования и используют в качестве матрицы для ПЦР с отличающимся праймером, производным от известного участка. При альтернативном подходе последовательности, соседствующие с частичной последовательностью, могут быть выделены с помощью амплификации с праймером, специфичным для линкерной последовательности, и праймером, специфичным для известного участка. Обычно амплифицированные последовательности подвергают второму раунду амплификации с тем же линкерным праймером и вторым праймером, специфичным для известного участка. Вариант данной процедуры, в котором используют два праймера, инициирующие достройку в противоположных направлениях от известной последовательности,описан в международной патентной заявке WO 96/38591. Другой подобный метод известен как быстрая амплификация концов кДНК илиRACE. Данный метод включает использование внутреннего праймера и внешнего праймера,который гибридизуется с полиадениловым участком или векторной последовательностью, с целью идентификации последовательностей,которые находятся с 5'- и 3'-сторон от известной последовательности. Дополнительными методами являются ПЦР-ловушка (Lagerstrom etids Res., 19, 3055-3060). Другие методы, использующие амплификацию, также могут быть применены для получения полноразмерной последовательности кДНК. В некоторых примерах возможно получение полноразмерной последовательности кДНК с помощью анализа последовательностей, представленных в базе данных экспрессированных последовательностей-меток(ЕSТ-маркеров),например, доступных через GenBank. Поиск перекрывающихся ЕSТ-маркеров, в целом, может быть осуществлен с использованием хорошо известных компьютерных программ (например, поисковиков NCBI BLAST), и такие EST могут быть использованы для формирования ассоциированной полноразмерной последовательности. Полноразмерные последовательности ДНК также могут быть получены с помощью анализа геномных фрагментов. Некоторые нуклеотидные последовательности молекул кДНК, кодирующие участки белков легочной опухоли, представлены в SEQ IDNO 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158,160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224,255-337, 345, 347 и 349. В целом, полинуклеотидные варианты могут быть получены с помощью любого известного в данной области техники метода, включая химический синтез, например, твердофазный фосфоамидитный химический синтез. Модификации в полинуклеотидной последовательности также могут быть внесены с использованием стандартных методов мутагенеза, таких как опосредованный олигонуклеотидами сайтспецифичный мутагенез (см. Adelman et al.,1983, DNA, 2, 183). Как альтернатива, молекулы РНК могут быть получены в результате транскрипции in vitro или in vivo последовательностей ДНК, кодирующих белок легочной опухоли или его часть, для чего ДНК встраивают в вектор с подходящим для РНК-полимеразы промотором (таким как Т 7 или SP6). Определенные участки могут быть использованы для получения кодируемого полипептида в соответствии с описанным в данном тексте. Кроме того,или в качестве альтернативы, участок может быть введен больному так, чтобы кодируемый полипептид образовывался in vivo (например,путем трансфекции антиген-презентирующих клеток, таких как дендритные клетки, кДНКконструкцией, кодирующей полипептид легочной опухоли, с последующим введением трансфицированных клеток больному). Сегмент последовательности, комплементарный кодирующей последовательности (т.е. антисмысловой полинуклеотид), также может быть использован в качестве зонда или для модуляции генной экспрессии. Конструкции кДНК, которые могут быть транскрибированы в антисмысловую РНК, также могут быть внесены в клетки тканей для облегчения выработки антисмысловой РНК. В соответствии с описан 25 ным здесь антисмысловой полинуклеотид можно использовать для подавления экспрессии опухолевого белка. Антисмысловую технологию можно применять для контроля за генной экспрессией за счет формирования триплетных спиралей, которые нарушают способность двойной спирали открываться в той степени,которая достаточна для связывания с ней полимераз, транскрипционных факторов или регуляторных молекул (см. Gee et al., 1994, In HuberCarr (eds.) "Molecular and Immunologic Approaches", Futura Publ. Co., Mount Kosco, NY). Как альтернатива, антисмысловая молекула может быть сконструирована так, чтобы гибридизоваться с регуляторным сегментом гена (например, промотором, энхансером или сайтом инициации транскрипции), тем самым блокируя транскрипцию гена, или так, чтобы блокировать трансляцию в результате подавления связывания транскрипта на рибосомах. Сегмент кодирующей последовательности или комплементарной последовательности также может быть сконструирован в виде зонда или праймера для выявления генной экспрессии. Зонды могут быть помечены различными репортерными группами, такими как радионуклиды и ферменты, и предпочтительно они имеют длину по крайней мере 10 нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере 20 нуклеотидов и еще более предпочтительно длину по крайней мере 30 нуклеотидов. Как отмечалось выше, длина праймеров предпочтительно составляет 22-30 нуклеотидов. Любой полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован с целью повышения его стабильности in vivo. Возможные модификации включают, тем самым не ограничиваясь,добавление фланкирующих последовательностей с 5'- и/или 3'-концов; использование фосфотиоата или 2'-O-метила вместо фосфодиэфирных связей в фосфатном скелете; и/или включение редких оснований, таких как инозин,квеуозин и вибутозин, равно как и ацетил-, метил-, тио- и иначе модифицированные формы аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина. Нуклеотидные последовательности, описанные здесь, могут быть присоединены к различным другим нуклеотидным последовательностям с использованием разработанных технологий рекомбинантных ДНК. Например, полинуклеотид можно клонировать в состав любого из множества клонирующих векторов, включая плазмиды, фагмиды, производные -фага и космиды. Представляющими конкретный интерес векторами являются экспрессирующие векторы,репликационные векторы, зондообразующие векторы и секвенационные векторы. В целом,вектор должен включать сайт начала репликации, функциональный по крайней мере в одном организме, удобные рестрикционные сайты и один или несколько селективных маркеров. Присутствие других элементов будет зависеть 26 от предполагаемого использования и будет ясно специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах полинуклеотиды могут быть сформированы так, чтобы обеспечить попадание в клетку млекопитающего и экспрессию в ней. Такие препараты, в частности, применимы для лечебных целей в соответствии с описанным далее. Для специалиста в данной области техники должно быть понятно,что существует много путей достижения экспрессии полинуклеотида в клетке-мишени, и может быть использован любой подходящий метод. Например, полинуклеотид может быть встроен в вирусный вектор, такой как, тем самым не ограничиваясь, аденовирус, аденоассоциированный вирус, ретровирус или вирус коровьей оспы или иной оспяный вирус (например, вирус оспы птиц). Также полинуклеотиды могут быть введены в виде голых плазмидных векторов. Методы включения ДНК в такие векторы хорошо известны специалистам в данной области техники. Ретровирусный вектор может дополнительно переносить или включать ген селективного маркера (с целью идентификации или отбора трансдуцированных клеток) и/или направляющий компонент, такой как ген, который кодирует лиганд для рецептора на поверхности конкретной клетки-мишени, что делает вектор специфичным по такой мишени. Также направленность можно обеспечить с помощью антитела, применяя методы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Другие препараты для лечебных целей включают коллоидные дисперсные системы,такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, шарики и системы на основе липидов, включая масляно-водные эмульсии, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой для использования в качестве доставочного приспособления in vitro и vivo является липосома (т.е. искусственный мембранный пузырек). Приготовление и использование таких систем хорошо известно в данной области техники. Полипептиды легочной опухоли В контексте настоящего изобретения полипептиды могут включать по крайней мере иммуногенный сегмент белка легочной опухоли или его варианта в соответствии с описанным здесь. Как отмечено выше, белок легочной опухоли - это белок, который экспрессируется клетками легочной опухоли. Белки, являющиеся белками легочной опухоли, также на выявляемом уровне взаимодействуют в иммунологическом анализе (таком как ТИФА) с антисыворотками больного с диагнозом рака легкого. Длина описываемых здесь полипептидов может быть любой. Могут присутствовать дополнительные последовательности, производные от нативного белка и/или гетерологичных последовательностей, и такие последовательности могут (хотя и 27 не обязательно) проявлять дополнительные иммуногенные или антигенные свойства. По использованию в данном тексте иммуногенный сегмент обозначает сегмент белка,который распознается (т.е. специфически связывается) В-клеточными и/или Т-клеточными поверхностными рецепторами антигена. Такие иммуногенные сегменты обычно включают по крайней мере 5 аминокислотных остатков, более предпочтительно по крайней мере 10 и еще более предпочтительно по крайней мере 20 аминокислотных остатков из белка легочной опухоли или его варианта. Некоторые предпочтительные иммуногенные сегменты включают пептиды, в которых N-концевая сигнальная (лидерная) последовательность и/или трансмембранный домен делегированы. Другие предпочтительные иммуногенные сегменты могут включать небольшие N- и/или С-концевые делеции (например, 1-30 аминокислот, предпочтительно 5-15 аминокислот) по отношению к зрелому белку. Иммуногенные сегменты обычно могут быть идентифицированы с использованием хорошо известных методов, таких как те, которые обобщены у Paul, 1993, "Fundamental Immunology", 3d ed., 243-247, Raven Press и в цитирующихся там работах. Такие методы включают скрининг полипептидов по их способности взаимодействовать с антиген-специфичными антителами,антисыворотками и/или Тклеточными линиями или клонами. По использованию в данном тексте антисыворотки и антитела являются антиген-специфичными, если они специфически связываются с антигеном(т.е. они взаимодействуют с белком в ТИФА или другом иммунологическом анализе и не взаимодействуют на выявляемом уровне с неродственными белками). Такие антисыворотки и антитела могут быть получены в соответствии с описанным здесь и с использованием хорошо известных методов. Иммуногенный сегмент нативного белка легочной опухоли - это сегмент, который взаимодействует с такими антисыворотками и/или Т-клетками на уровне, который в сколько-нибудь существенной степени не ниже реактивности полноразмерного полипептида (например, в ТИФА и/или анализе на реактивность Т-клеток). Такие иммуногенные сегменты могут взаимодействовать в названных анализах на уровне, который сходен или превышает реактивность полноразмерного полипептида. Такой скрининг обычно может быть проведен с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, например, описанных у HarlowLane,1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", ColdSpring Harbor Laboratory. Например, полипептид может быть иммобилизован на твердую подложку и проконтактирован с сывороткой больного для обеспечения связывания антител из сыворотки с иммобилизованным полипептидом. 28 Несвязанная сыворотка может быть затем удалена, а связанные антитела - выявлены с использованием, например, 125I-меченного белкаА. Как отмечалось выше, композиция может содержать вариант нативного белка легочной опухоли. По использованию в данном тексте полипептидный вариант обозначает полипептид, который отличается от нативного белка легочной опухоли по одной или нескольким заменам, делециям, добавлениям и/или вставкам, в результате чего иммуногенность полипептида по существу не снижается. Другими словами, способность варианта взаимодействовать с антиген-специфичными антисыворотками может быть усилена или остаться неизменной по сравнению с нативным белком, или она может быть снижена менее чем на 50% и предпочтительно менее чем на 20% по сравнению с нативным белком. Такие варианты, в целом, могут быть идентифицированы путем модифицирования одной из вышеприведенных последовательностей полипептидов и оценки реактивности модифицированного полипептида в отношении антиген-специфичных антител или антисывороток в соответствии с описанным в данном тексте. Предпочтительные варианты включают такие варианты, в которых один или несколько сегментов, таких как N-концевая сигнальная последовательность или трансмембранный домен, были удалены. Другие предпочтительные варианты включают варианты, в которых небольшой сегмент (например, 1-30 аминокислот,предпочтительно 5-15 аминокислот) был удален из N- и/или С-концевой части зрелого белка. Полипептидные варианты предпочтительно проявляют по крайней мере примерно 70%,более предпочтительно по крайней мере примерно 90% и наиболее предпочтительно по крайней мере примерно 95% идентичности (что определяется в соответствии с описанным выше) с идентифицированными полипептидами. Предпочтительно вариант включает консервативные замены. Консервативной заменой является такая замена, при которой аминокислота заменяется на другую аминокислоту,обладающую сходными свойствами, в результате чего специалист в области химии пептидов сможет ожидать, что вторичная структура и параметры гидропатичности полипептида по существу окажутся неизменными. В целом, аминокислотные замены могут быть выполнены,исходя из сходства параметров полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатичности аминокислотных остатков. Например, отрицательно заряженными аминокислотами являются аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; положительно заряженными аминокислотами являются лизин и аргинин; аминокислотами с полярными незаряженными головными группами,обладающими сходными величинами гидро 29 фильности, являются лейцин, изолейцин и валин; глицин и аланин; аспарагин и глутамин; серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Другими группами аминокислот, которые могут представлять консервативные замены, являются: (1)(4) Lys, Arg, His; и (5) Phe, Tyr, Trp, His. Также,или в качестве альтернативы, вариант может включать неконсервативные замены. В предпочтительном варианте вариантные полипептиды отличаются от нативной последовательности в результате замены, делеции или вставки пяти аминокислот или меньше. Варианты также (или как альтернатива) могут быть модифицированы,например, в результате делеции или вставки аминокислот, которые обладают минимальным влиянием на иммуногенность, вторичную структуру и параметры гидропатичности полипептида. Как отмечалось выше, полипептиды могут включать сигнальную (или лидерную) последовательность на N-концевой части белка, которая одновременно с трансляцией или после нее обеспечивает перенос белка. Также полипептид может быть соединен с линкером или другой последовательностью для облегчения синтеза,очистки или идентификации полипептида (например, с полигистидиновым хвостом), или для усиления связывания полипептида на твердой подложке. Например, полипептид может быть соединен с Fc-сегментом иммуноглобулина. Полипептиды могут быть получены с использованием любого из различных хорошо известных методов. Рекомбинантные полипептиды, кодируемые описанными выше последовательностями ДНК, легко могут быть получены на материале последовательностей ДНК с использованием различных экспрессирующих векторов, известных специалистам в данной области техники. Экспрессию можно осуществить в любой подходящей клетке-хозяине, которая была трансформирована или трансфицирована экспрессирующим вектором, включающим молекулу ДНК, которая кодирует рекомбинантный полипептид. Подходящими клеткамихозяевами являются прокариоты, дрожжи, высшие эукариотические и растительные клетки. Предпочтительно используемыми клеткамихозяевами являются клетки E.coli, дрожжей или клетки млекопитающих таких линий, как COS или СНО. Надосадочные фракции от подходящих систем хозяин-вектор, которые секретируют рекомбинантный белок или полипептид в культуральную среду, сначала могут быть сконцентрированы с использованием имеющегося в продаже фильтра. После концентрирования концентрат может быть внесен на подходящий матрикс для очистки, такой как аффинный матрикс или ион-обменная смола. Наконец, одна или несколько стадий ВЭЖХ с обращенной фа 005140 30 зой могут быть использованы для дальнейшей очистки рекомбинантного полипептида. Сегменты и другие варианты, состоящие менее чем из примерно 100 аминокислот и обычно менее чем из примерно 50 аминокислот,также могут быть сформированы синтетическим путем с применением методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Например, такие полипептиды могут быть синтезированы с использованием любой имеющейся в продаже твердофазной технологии, такой как метод твердофазного синтеза по Мэррифилду, в котором аминокислоты последовательно добавляют к концу растущей аминокислотной цепочки: см. Merrifield, 1963, J. Amer. Chem.Division (Foster City, CA), имеется оборудование для автоматического синтеза полипептидов, на котором можно работать в соответствии с инструкциями изготовителя. В некоторых конкретных вариантах полипептид может являться химерным белком, который включает несколько полипептидов, описанных здесь, или который включает по крайней мере один полипептид, описанный здесь, и неродственную последовательность, такую как известный опухолевый белок. Партнер по химеризации, например, может способствовать презентированию Т-хелперных эпитопов (иммунологический партнер по химеризации), предпочтительно эпитопов, распознаваемых Т-хелперами человека, или может способствовать экспрессии белка (усилитель экспрессии) на более высоком уровне по сравнению с нативным рекомбинантным белком. Некоторыми предпочтительными партнерами по химеризации являются партнеры по химеризации, одновременно выполняющие иммунологическую роль и роль усиления экспрессии. Другие партнеры по химеризации могут быть выбраны так, чтобы повысить растворимость белка или обеспечить белку попадание в желательные внутриклеточные компартменты. Другими партнерами по химеризации являются аффинные метки, которые облегчают очистку белка. В целом, химерные белки могут быть получены с помощью стандартных методов, включая химическое присоединение. Предпочтительно химерный белок экспрессируют в виде рекомбинантного белка, обеспечивая в экспрессионной системе выработку на повышенном уровне по сравнению с нехимерным белком. Коротко говоря, последовательности ДНК, кодирующие полипептидные компоненты, могут быть собраны по отдельности и лигированы в состав подходящего экспрессирующего вектора. 3'-Конец последовательности ДНК, кодирующей один полипептидный компонент, лигируют через пептидный линкер или без него на 5'конец последовательности ДНК, кодирующей второй полипептидный компонент, таким обра 31 зом, что рамки считывания последовательностей совпадают по фазе. Это обеспечивает трансляцию в единый химерный белок, который сохраняет биологическую активность обоих полипептидных компонентов. Последовательность пептидного линкера может быть использована для разделения первого и второго пептидных компонентов расстоянием, достаточным до того, чтобы гарантировать каждому полипептиду укладку в его вторичную и четвертичную структуру. Такую последовательность пептидного линкера вносят в химерный белок с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. Подходящие последовательности пептидных линкеров могут быть выбраны на основе следующих факторов: (1) их способности принимать гибкую протяженную конфигурацию; (2) их неспособности образовывать вторичную структуру, которая бы могла взаимодействовать с функциональными эпитопами первого и второго полипептидов; и (3) отсутствия гидрофобных или заряженных остатков, которые могли бы взаимодействовать с функциональными эпитопами полипептидов. Предпочтительные последовательности пептидных линкеров включат остатки Gly, Asn и Ser. Также в линкерной последовательности можно использовать другие почти нейтральные аминокислоты, такие какThr и Аlа. Аминокислотные последовательности, которые можно эффективно использовать в качестве линкеров, включают последовательности, описанные у Maratea et al., 1985, Gene, 40,39-46; Murphy et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 83, 8258-8262; в патенте США 4935233 и в патенте США 4751180. Обычно линкерная последовательность может иметь длину от 1 до примерно 50 аминокислот. Линкерные последовательности не нужны, если первый и второй полипептиды имеют не играющие важной роли N-концевые аминокислотные участки, которые могут быть использованы для разделения функциональных доменов и предотвращения стерической интерференции. Лигированные последовательности ДНК функционально присоединяют к подходящим элементам, регулирующим транскрипцию или трансляцию. Регуляторные элементы, ответственные за экспрессию ДНК, расположены только с 5'-стороны от последовательности ДНК,кодирующей первые полипептиды. Сходным образом стоп-кодоны, необходимые для остановки трансляции, и сигналы терминации транскрипции присутствуют только с 3'-стороны от последовательности ДНК, кодирующей второй полипептид. Также предусматриваются химерные белки, которые включают полипептид по настоящему изобретению вместе с неродственным иммуногенным белком. Предпочтительно иммуногенный белок способен вызывать вторичный иммунный ответ. Примерами таких белков яв 005140 32 ляются столбнячные, туберкулезные и гепатитные белки (см., например, Stoute et al., 1997,New England J. Med., 336, 86-91). В предпочтительных вариантах иммунологический партнер по химеризации происходит от белка D - поверхностного белка грамотрицательной бактерии Haemophilus influenza В (международная патентная заявка WO 91/18926). Предпочтительно дериват белка D включает приблизительно первую треть белка(например, первые N-концевые 100-110 аминокислот), причем дериват белка D может быть липидирован. В некоторых предпочтительных вариантах первые 109 остатков липопротеинаD, как химерного партнера, присоединяют к Nконцу с получением полипептида с дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и с повышением уровня экспрессии в E.coli(т.е. функционирующего также в качестве усилителя экспрессии). Липидный хвост обеспечивает оптимальное презентирование антигена на антиген-презентирующих клетках. Другим партнером по химеризации является неструктурный белок вируса гриппа - NS1 (гемагглютинин). Обычно используют расположенные сN-конца 81 аминокислоту, хотя можно использовать и различные фрагменты, которые включают Т-хелперные эпитопы. В другом варианте иммунологический партнер по химеризации является белком, известным как LYTA, или его сегментом (предпочтительно С-концевым сегментом). LYTA происходит от Streptococcus pneumoniae, который синтезирует N-ацетил-L-аланинамидазу,известную под названием амидазы LYTA (кодируется геном LytA: Gene, 1986, 43, 265-292).LYTA является автолизином, который специфически разрушает определенные связи в пептидогликановом скелете. С-концевой домен в составе белка LYTA ответствен за аффинность к холину или некоторым аналогам холина, таким как DEAE. Данное свойство было использовано для формирования плазмид E.coli, экспрессирующих C-LYTA, применимых для экспрессии химерных белков. Ранее была описана очистка химерных белков, включающих фрагмент CLYTA на N-конце (см. Biotechnology, 10, 795798, 1992). В предпочтительном варианте в химерный белок может быть включен повторный сегмент LYTA. Повторный сегмент обнаруживается в С-концевом участке, начиная со 178-го остатка. Особенно предпочтительный повторный сегмент охватывает остатки 188-305. Обычно полипептиды (включая химерные белки) и полинуклеотиды в соответствии с описанным здесь являются изолированными. Изолированным является такой полипептид или полинуклеотид, который выделен из исходной для него среды. Например, встречающийся в естественных условиях белок является изолированным, если он отделен от части или от всех сосуществующих с ним в природной системе 33 материалов. Предпочтительно такие полипептиды могут быть чистыми по крайней мере примерно на 90%, более предпочтительно чистыми по крайней мере на 95% и наиболее предпочтительно чистыми по крайней мере примерно на 99%. Полинуклеотид рассматривается как изолированный, если он, например, клонирован в вектор, который не является частью естественной среды. Связывающие агенты Далее настоящее изобретение представляет агенты, такие как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с белком легочной опухоли. По использованию в данном тексте про антитело или его антиген-связывающий фрагмент говорят, что они специфически связываются с белком легочной опухоли, если они взаимодействуют на выявляемом уровне (например, в тесте ТИФА) с белком легочной опухоли и не взаимодействуют на выявляемом уровне с неродственными белками при сходных условиях. По использованию в данном тексте связывание обозначает такую нековалентную связь между двумя раздельными молекулами, в результате которой образуется комплекс. Способность связываться можно оценить, например, с помощью установления константы связывания для образования комплекса. Константа связывания представляет собой величину, полученную в случае, когда концентрация комплекса разделена на произведение концентраций его компонентов. В целом, в контексте настоящего изобретения про два соединения говорят, что они связываются, если константа связывания для образования комплекса превышает примерно 103 л/моль. Константу связывания можно определить с помощью методов, хорошо известных в данной области техники. Связывающие агенты дополнительно могут обладать способностью разграничивать пациентов, у которых есть или нет ракового заболевания, такого как рак легкого, при использовании описанных здесь репрезентативных анализов. Другими словами, антитела или другие связывающие агенты, которые связываются с белком легочной опухоли, будут генерировать сигнал, указывающий на наличие рака по крайней мере у примерно 20% пациентов с заболеванием, и будут генерировать отрицательный сигнал, указывающий на отсутствие заболевания по крайней мере у примерно 90% субъектов без ракового заболевания. Для определения того, удовлетворяет ли связывающий агент указанному требованию, биологические образцы(например, кровь, сыворотка, мокроты, моча и/или биопсийные пробы опухолей) от пациентов с диагнозом рака или без него (в соответствии с определениями с помощью стандартных клинических анализов) могут быть проанализированы в соответствии с описанным в данном тексте на присутствие полипептидов, которые 34 связываются со связывающимся агентом. Должно быть понятно, что необходимо проанализировать статистически значимое число образцов с диагнозом рака и без него. Каждый связывающий агент должен удовлетворять вышеуказанным критериям: однако, для специалистов в данной области техники будет ясно, что с целью повышения чувствительности связывающие агенты можно использовать в сочетании. Любой агент, который удовлетворяет приведенным выше требованиям, может являться связывающим агентом. Например, связывающий агент может быть рибосомой, имеющей или не имеющей пептидного компонента, молекулой РНК или полипептидом. В предпочтительном варианте связывающий агент является антителом или его антиген-связывающим сегментом. Антитела могут быть получены с помощью любого из различных методов, известных специалистам в данной области техники: см., например, HarlowLane, 1988, "Antibodies:A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory. В целом, антитела могут быть получены с помощью методов культивирования клеток,включая получение моноклональных антител,описанное в данном тексте, или с помощью трансфекции генов антител в подходящие бактериальные клетки-хозяева или клетки-хозяева млекопитающих с целью обеспечения выработки рекомбинантных антител. В одном из методов полипептидсодержащий иммуноген сначала инъецируют любому из широкого круга млекопитающих (например, мыши, крысы, кролики,овцы или козы). На этой стадии полипептиды по настоящему изобретению могут выполнять роль иммуногена без модификаций. Как альтернатива, в частности, в случае относительно коротких полипептидов, более сильный иммунный ответ может быть вызван тогда, когда полипептид присоединен к белку-носителю, такому как бычий сывороточный альбумин или гемоцианин слизня. Иммуноген инъецируют животномуреципиенту, причем предпочтительно в соответствии с заранее составленной схемой, включающей одну или несколько бустерных иммунизаций, и у животных периодически берут пробы крови. Поликлональные антитела, специфичные для полипептида, могут быть затем очищены из таких антисывороток с помощью,например, аффинной хроматографии с использованием полипептида, присоединенного к подходящей твердой подложке. Моноклональные антитела, специфичные для интересующего антигенного полипептида,могут быть получены, например, с использованием метода Келера-Мильштейна (KohlerMilstein, 1976, Eur. J. Immunol., 6, 511-519) и его модификаций. Вкратце, такие методы включают формирование иммортализованной клеточной линии, способной вырабатывать антитела, обладающие желательной специфичностью (т.е. взаимодействующие с интересующим полипеп 35 тидом). Такие клеточные линии могут быть получены, например, на материале клеток селезенки, взятых от животного, иммунизованного в соответствии с описанным выше. Затем клетки селезенки иммортализуют, например, путем слияния с миеломными клетками, являющимися партнерами по гибридизации, предпочтительно такими клетками, которые сингенны иммунизированному животному. Могут быть использованы различные методы слияния. Например, клетки селезенки и миеломные клетки могут быть объединены с неионогенным детергентом на несколько минут и затем высеяны при низкой плотности на селективную среду, которая поддерживает рост гибридных клеток, но не миеломных клеток. В предпочтительном методе отбора используют НАТ-отбор (гипоксантин,аминоптерин, тимидин). По прошествии достаточного времени - обычно примерно 1-2 недели- выявляют колонии гибридов. Отбирают одиночные колонии, и их культуральные надосадочные фракции тестируют на связывающую активность по отношению к полипептиду. Предпочтительными являются гибридомы, характеризующиеся высокой реактивностью и специфичностью. Моноклональные антитела могут быть выделены из надосадочных фракций растущих гибридомных колоний. Кроме того, для повышения выхода можно использовать различные методы, такие как инъекция гибридомных клеток в брюшную полость подходящего позвоночного животного-реципиента, такого как мышь. Затем моноклональные антитела могут быть собраны из асцитной жидкости или крови. Загрязнители могут быть удалены от антител с помощью стандартных методов, таких как хроматография, гель-фильтрация, преципитация и экстракция. Полипептиды по настоящему изобретению могут быть использованы в процессе очистки, например, на стадии аффинной хроматографии. В некоторых вариантах предпочтительным является использование антиген-связывающих фрагментов антител. Такие фрагменты включают Fab-фрагменты, которые могут быть получены с помощью стандартных методов. Вкратце,иммуноглобулины могут быть очищены из кроличьей сыворотки с помощью аффинной хроматографии на гранулярных колонках с белком-АManual", Cold Spring Harbor Laboratory) и расщеплены с помощью папаина с образованием фрагментов Fab и Fc. Фрагменты Fab и Fc можно разделить с помощью аффинной хроматографии на гранулярных колонках с белком-А. Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть соединены с одним или несколькими терапевтическими агентами. Подходящими в этом отношении агентами являются радионуклиды, индукторы дифференцировки, лекарственные средства, токсины и их 36 производные. Предпочтительными радионуклидами являются 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re,211At и 212Bi. Предпочтительными лекарственными средствами являются метотрексат и аналоги пуринов и пиримидинов. Предпочтительными индукторами дифференцировки являются форболовые эфиры и масляная кислота. Предпочтительными токсинами являются рицин,абрин, дифтерийный токсин, холерный токсин,гелонин, экзотоксин Pseudomonas, токсин Shigella и антивирусный белок фитолакки. Терапевтический агент может быть соединен (например, путем ковалентного связывания) с подходящим моноклональным антителом либо напрямую, либо опосредованно (например, через линкерную группу). Прямая реакция между агентом и антителом возможна тогда, когда каждый из них имеет заместители, способные взаимодействовать друг с другом. Например,нуклеофильная группа, такая как аминогруппа или сульфгидрильная группа, на одном из них может взаимодействовать с карбонилсодержащей группой, такой как ангидрид или галогенангидрид, или с алкильной группой, включающей эффективную отщепляемую группу(например, галогенид), на другом. Как альтернатива, желательным может быть соединение терапевтического агента и антитела через линкерную группу. Линкерная группа может функционировать в качестве спейсера, чтобы дистанцировать антитело от агента с целью исключения возможных помех их способности к связыванию. Также линкерная группа может служить для повышения химической реактивности заместителя в составе агента или антитела, тем самым повышая эффективность реакции сочетания. Повышение химической реактивности также может облегчать использование агентов или функциональных групп в составе агентов, что в другом случае оказалось бы невозможным. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что различные бифункциональные или полифункциональные реагенты, как гомо-, так и гетерофункциональные (такие как те, которые описаны в каталоге фирмыPierce Chemical Co., Rockford, IL), могут быть использованы в качестве линкерной группы. Сочетание может быть осуществлено, например, через аминогруппы, карбоксильные группы, сульфгидрильные группы или окисленные углеводные остатки. Имеется много ссылок,описывающих такую методологию, например,патент США 4671958, выданный Rodwell etal. Когда терапевтический агент обладает большей активностью, будучи свободным от антительного сегмента иммуноконъюгатов по настоящему изобретению, желательным может быть использование линкерной группы, которая способна отщепляться в процессе интернализации внутрь клетки или после этого. 37 Был описан ряд различных отщепляемых линкерных групп. Механизмы внутриклеточного высвобождения агента с таких линкерных групп включают отщепление в результате восстановления дисульфидной связи (например, патент США 4489710, выданный Spitler), с помощью облучения светочувствительной связи (например, патент США 4625014, выданный Senteret al.), за счет гидролиза дериватизованных боковых цепей аминокислот (например, патент США 4638045, выданный Kohn et al.), за счет гидролиза, опосредованного сывороточным комплементом (например, патент США 4671958, выданный Rodwell et al.), и в результате катализируемого кислотами гидролиза (например, патент США 4569789, выданныйBlattler et al.). Желательным может быть присоединение к антителу более одного агента. В одном варианте множественные молекулы агента могут быть присоединены к одной молекуле антитела. В другом варианте более одного типа агента можно присоединить к одному антителу. Независимо от конкретного варианта различными способами могут быть приготовлены иммуноконъюгаты с более чем одним агентом. Например, более чем один агент может быть присоединен непосредственно к молекуле антитела,или можно использовать линкеры, которые предоставляют множественные сайты для присоединения. Как альтернатива, можно использовать носитель. Носитель может нести агенты различными способами, включая ковалентное связывание либо напрямую, либо через линкерную группу. Подходящими носителями являются белки, такие как альбумины (например, патент США 4507234, выданный Kato et al.), пептиды и полисахариды, такие как аминодекстран (например,патент США 4699784, выданный Shih et al.). Также носитель может нести агент за счет нековалентного связывания или инкапсуляции, например, внутри липосомного пузырька (например, патенты США 4429008 и 4873088). Носителями, специфичными для радионуклидных агентов, являются небольшие радиогалогенированные молекулы и хелатирующие соединения. Например, в патенте США 4735792 описаны небольшие радиогалогенированные молекулы и их синтез. Хелат радионуклида может быть сформирован с помощью хелатирующих соединений, включая соединения, имеющие атомы азота и серы в качестве донорных атомов для связывания металла или оксида металла, являющегося радионуклидом. Например,в патенте США 4673562, выданном Davisonet al., описаны характерные хелатирующие соединения и их синтез. Могут быть использованы различные пути введения антител и иммуноконъюгатов. Обычно введение должно быть внутривенным, внутримышечным, подкожным или в ложе удаленной 38 опухоли. Должно быть понятно, что точная доза антитела-иммуноконъюгата будет варьироваться в зависимости от используемого антитела,содержания антигена в опухоли и скорости клиренса антитела. Т-лимфоциты Иммунотерапевтические композиции могут также, или в качестве альтернативы, содержать Т-клетки, специфичные для белка легочной опухоли. Такие клетки в принципе могут быть получены in vitro или ex vivo с применением стандартных процедур. Например, Т-клетки можно выделить из костного мозга, периферической крови или фракции костного мозга или периферической крови пациента с использованием имеющихся в продаже систем для разделения клеток, таких как система Isolex, доступная от Nexell Therapeutics Inc., Irvine, CA (см. также патент США 5240856; патент США 5215926; международные патентные заявки WO 89/06280, WO 91/16116 и WO 92/07243). Как альтернатива, Т-клетки могут происходить от родственных или неродственных людей, не являющихся человеком млекопитающих, клеточных линий или культур. Т-клетки могут быть простимулированы полипептидом легочной опухоли, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид, и/или антиген-презентирующей клеткой (АПК), которая экспрессирует такой полипептид. Стимуляцию проводят в условиях и в течение такого времени, которые достаточны для обеспечения образования Т-клеток, специфичных в отношении полипептида. Предпочтительно полипептид или полинуклеотид легочной опухоли находится в составе доставочной системы, такой как микросфера, с целью облегчения образования специфичных Т-клеток. Т-клетки рассматриваются как специфичные в отношении полипептида легочной опухоли, если Т-клетки специфически пролиферируют, секретируют цитокины или уничтожают клетки-мишени, покрытые полипептидом или экспрессирующие ген, кодирующий полипептид. Специфичность Т-клеток можно оценить с использованием любого из известных стандартных методов. Например, в анализе на высвобождение хрома или анализе на пролиферацию индекса стимуляции, соответствующий более чем двукратному увеличению лизиса и/или пролиферации по сравнению с негативными контролями, указывает на специфичность Т-клеток. Такие анализы могут быть осуществлены, например, в соответствии с описанным у Chen etal., 1994, Cancer Res., 54, 1065-1070. Как альтернатива, выявление пролиферации Т-клеток может быть осуществлено с помощью различных известных методов. Например, пролиферацию Т-клеток можно выявить с помощью измерения увеличенного уровня синтеза ДНК (например, в культурах Т-клеток с пульсирующей меткой с использованием меченного тритием тимидина и 39 измерением количества меченного тимидина,внесенного в ДНК). Контактирование с полипептидом легочной опухоли (от 100 нг/мл до 100 мкг/мл, предпочтительно от 200 нг/мл до 25 мкг/мл) в течение 3-7 дней должно обусловливать по крайней мере 2-кратное усиление пролиферации Т-клеток. Контактирование в соответствии с описанным выше в течение 2-3 ч должно приводить к активации Т-клеток в соответствии с измерением в стандартном анализе на цитокины, по результатам которого 2 кратное повышение уровня секреции цитокина(например, TNF или -интерферона) указывает на активацию Т-клеток (см. Coligan et al., 1998,Current Protocols in Immunology, Vol. 1, WileyInterscience, Greene). Т-клетки, которые были активированы в ответ на полипептид легочной опухоли, полинуклеотид или экспрессирующие полипептид АПК,могут быть СD4 позитивными и/или CD8-позитивными. Специфичные в отношении полипептида легочной опухоли Т-клетки могут быть воспроизведены с помощью стандартных методов. В предпочтительных вариантах Т-клетки происходят от больного или родственного или неродственного донора, и их вводят больному после стимуляции и воспроизведения. Для терапевтических целей Т-клетки CD4+ или CD8+, которые пролиферируют в ответ на полипептид легочной опухоли, полинуклеотид и АПК, можно воспроизводить численно как invitro, так и in vivo. Пролиферацию таких Тклеток in vitro можно осуществить различными способами. Например, Т-клетки можно повторно подвергнуть действию полипептида легочной опухоли или короткого пептида, соответствующего иммуногенному сегменту такого полипептида, с добавлением факторов Т-клеточного роста, таких как интерлейкин-2, или без этого и/или стимуляторных клеток, которые синтезируют полипептид легочной опухоли. Как альтернатива, одна или большее число Тклеток, которые пролиферируют в присутствие белка легочной опухоли, могут быть количественно воспроизведены с помощью клонирования. Методы клонирования клеток хорошо известны в данной области техники и включают ограничивающее разведение. Фармацевтические композиции и вакцины В некоторых аспектах полипептиды, полинуклеотиды, Т-клетки и/или связывающие агенты, заявленные здесь, могут быть внесены в состав фармацевтических композиций или иммуногенных композиций (т.е. вакцин). Фармацевтические композиции содержат одно или несколько таких соединений и физиологически приемлемый носитель. Вакцины могут содержать одно или несколько таких соединений и иммуностимулирующее средство. Иммуностимулирующим средством может быть любое вещество, которое усиливает или интенсифицирует иммунный ответ на внешний антиген. При 005140 40 мерами иммуностимулирующих средств являются адъюванты, биоразрушаемые микросферыFullerton). В целом, вакцинный препарат описан,например, у M.F.PowellM.J.Newman (eds.),"Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)". Plenum Press, NY, 1995. Фармацевтические композиции и вакцины в объеме настоящего изобретения также могут содержать другие соединения, которые могут быть биологически активными или неактивными. Например,один или большее число иммуногенных сегментов других опухолевых антигенов могут присутствовать как встроенными в состав химерного белка, так и в виде отдельного соединения в составе композиции или вакцины. Фармацевтическая композиция или вакцина может содержать ДНК, кодирующую один или большее число полипептидов, описанных выше, таким образом, что полипептид образуется in situ. Как отмечалось выше, ДНК может находиться в составе одной из различных доставочных систем, известных специалистам в данной области техники, включая системы экспрессии нуклеиновых кислот, бактериальные и вирусные экспрессионные системы. Многочисленные методы доставки генов хорошо известны в данной области техники, например, в соответствии с описанным у Rolland, 1998, Crit. Rev.Therap. Drug Carrier Systems, 15, 143-198 и в цитируемых там ссылках. Подходящие системы экспрессии нуклеиновых кислот включают последовательности ДНК, необходимые для экспрессии в организме пациента (такие как подходящие промотор и сигнал терминации). Бактериальные доставочные системы включают введение бактерии (такой как Bacillus-CalmetteGuerrin), которая экспрессирует иммуногенную часть полипептида на поверхности своих клеток или секретирует такой эпитоп. В предпочтительном варианте ДНК может быть внесена с использованием вирусной экспрессионной системы (например, вируса коровьей оспы или других типов оспы, ретровируса или аденовируса),которая может включать использование непатогенного (дефектного), но компетентного по репликации вируса. Подходящие системы описаны,например, у Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 86, 317-321; Flexner et al., 1989,Ann. NY Acad. Sci., 569, 86-103; Flexner et al.,1990, Vaccine, 8, 17-21; в патентах США 4603112, 4769330 и 5017487; в международных патентных заявках WO 89/01973 и WO 91/02805; в патенте США 4777127; в британском патенте 2200651; в европейской патентной заявке 0-345242; у Berkner, 1988, Biotechniques,6, 616-627; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252,431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.al., 1993, Cir. Res., 73, 1202-1207. Методы включения ДНК в такие экспрессионные системы хорошо известны специалистам в данной области техники. ДНК также может быть голой,как это описано, например, у Ulmer et al., 1993,Science, 259, 1745-1749 и представлено в обзоре у Cohen, 1993, Science, 259, 1691-1692. Поглощение голой ДНК может быть усилено с помощью нанесения ДНК на биоразрушаемые шарики, которые эффективно переносятся внутрь клеток. При том, что любой подходящий носитель,известный специалистам в данной области техники, может быть использован в фармацевтических композициях по настоящему изобретению,тип носителя будет варьироваться в зависимости от пути введения. Композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены для любого подходящего пути введения, включая, например, топическое, пероральное, интраназальное,внутривенное,внутричерепное,внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно включает воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно использовать любой из перечисленных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза,крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия,тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Биологически разрушаемые микросферы (например, из сополимера молочной и гликолевой кислот) также могут быть использованы в качестве носителей для фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Подходящие биоразрушаемые микросферы описаны, например, в патентах США 4897268 и 5075109. Такие композиции также могут содержать буферы (например, нейтральный забуференный физиологический раствор или фосфатносолевой буфер), углеводы (например, глюкозу,маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, хелатирующие агенты,такие как ЭДТА или глутатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия) и/или консерванты. Как альтернатива, композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены в лиофилизованном виде. Соединения также могут быть заключены в липосомы с использованием хорошо известных технологий. В вакцинах по настоящему изобретению могут быть использованы любые из различных иммуностимулирующих средств. Например,могут быть включены адъюванты. Большинство адъювантов содержат вещество, сформированное так, чтобы защищать антиген от быстрого разрушения, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, а также стимулятор иммун 005140tuberculosis. Подходящие адъюванты имеются в продаже, например, неполный адъювант Фрейнда и полный адъювант Фрейнда (Difco(MerckCo. Inc., Rahway, NJ), AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионно или анионно дериватизованные полисахариды; полифосфазены; биологически разрушаемые микросферы; монофосфориллипид-А и Quil-A. Цитокины, такие как GM-CSF или интерлейкины-2, -7 или -12, также могут быть использованы в качестве адъювантов. В представляемых здесь вакцинах адъювантную композицию предпочтительно выстраивают таким образом, чтобы индуцировать иммунный ответ в основном Thl-типа. Высокие уровни цитокинов Thl-типа (например, интерферон, TNF, IL-2 и IL-12) обусловливают тенденцию, благоприятствующую индукции опосредованных клетками иммунных ответов на введенный антиген. Напротив, высокие уровни цитокинов Тh2-типа (например, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10) связаны с тенденцией, благоприятствующей индукции гуморальных иммунных ответов. После применения вакцины в соответствии с описанным в данном тексте, у больного будет поддерживаться иммунный ответ, который включает ответы и Th1-, и Тh2-типов. В предпочтительном варианте, в котором ответ в основном представлен Th1-типом, уровни цитокинов Th1-типа должны возрастать в более значительной степени, чем уровни цитокинов Тh2 типа. Уровни указанных цитокинов могут быть легко оценены с использованием стандартных тестов. Как обзор по семействам цитокинов, см.MosmannCoffman, 1989, Ann. Rev. Immunol.,7, 145-173. Предпочтительными адъювантами для использования в стимуляции преобладающего ответа Thl-типа являются, например, сочетание монофосфориллипида-А, предпочтительно 3-деO-ацилированного монофосфориллипида-А(Hamilton, MT) (см. патенты США 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094). Содержащие мотив CpG олигонуклеотиды (в которых динуклеотид CpG неметилирован) также индуцируют по преимуществу ответ Thl-типа. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны,например, в международных патентных заявкахWO 96/02555 и WO 99/33488. Иммуностимулирующие последовательности ДНК также описываются, например, у Sato et al., 1996, Science, 273, 352. Другим предпочтительным адъ 43 ювантом является сапонин, предпочтительноInc.,Framingham, MA), который может быть использован отдельно или в сочетании с другим адъювантами. Например, усиленная система включает сочетание монофосфориллипида-А и производного сапонина, например, объединение QS21 и 3D-MPL в соответствии с описанным в международной патентной заявке WO 94/00153, или менее активная композиция, в которой QS21 загашен холестерином, что описано в международной патентной заявке WO 96/33739. Другие предпочтительные препараты содержат масляно-водные эмульсии и токоферол. Особенно,активный адъювантный препарат, содержащийQS21, 3D-MPL и токоферол в масляно-водной эмульсии, описан в международной патентной заявке WO 95/17210. Другими предпочтительными адъювантами являются Montanide ISA 720 (Seppic, Франция), SAF (Chiron, CA, США), ISCOMS (CSL),MF-59 (Chiron), серия адъювантов SBAS (например, SBAS-2 или SBAS-4, доступные от(Ribi ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT),RC-529 (Ribi ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT) и аминоалкилглюкозаминид-4 фосфаты (AGP). Любая представленная здесь вакцина может быть приготовлена с использованием хорошо известных способов, сутью которых является объединение антигена, усилителя иммунных ответов и подходящего носителя или наполнителя. Описанные здесь композиции могут быть введены в составе препарата медленной секреции (т.е. такого препарата, как капсула, тампон или гель, составленного, например, полисахаридами, который обусловливает медленное выделение соединения после введения). Такие препараты в принципе могут быть приготовлены с использованием хорошо известной технологии(см., например, Coombes et al., 1996, Vaccine, 14,1429-1438) и введены, например, путем пероральной, ректальной или подкожной имплантации или имплантации в желательный сайтмишень. Препараты медленной секреции могут содержать полипептид, полинуклеотид или антитело, диспергированные в матриксе носителя и/или находящиеся в резервуаре, окруженном мембраной, которая обеспечивает контроль за скоростью выделения. Носители для использования в таких препаратах биологически совместимы и также могут быть биоразрушаемыми: предпочтительно препарат обеспечивает относительно постоянный уровень выделения активного компонента. Такими носителями являются микрочастицы сополимера молочной и гликолевой кислоты, а также полиакрилат, латекс, крахмал, целлюлоза и декстран. Другими носителями для задержки секреции являются надмолекулярные биовекторы, которые содержат нежидкую гидрофильную 44 сердцевину (например, перекрестно-сшитый полисахарид или олигосахарид) и, что необязательно, внешний слой, содержащий амфифильное соединение, такое как фосфолипид (см.,например, патент США 5151254 и международные патентные заявки WO 94/20078, WO 94/23701 и WO 96/06638). Количество активного соединения в составе препарата медленной секреции зависит от места имплантации, скорости и ожидаемой продолжительности секреции и природы состояния, лечение или профилактика которого проводится. Любое из различных доставочных средств может быть использовано для фармацевтических композиций и вакцин для облегчения выработки антиген-специфичного иммунного ответа, которое направлено на опухолевые клетки. Поставочными средствами являются антигенпрезентирующие клетки (АПК), такие как дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты, моноциты и другие клетки, которые можно преобразовать так, чтобы они были эффективными АПК. Такие клетки могут быть, хотя и не обязательно, генетически модифицированы с целью увеличения способности к презентированию антигена, улучшения активации и/или поддержания Т-клеточного ответа, придания противоопухолевой активности per se и/или обеспечения иммунологической совместимости с реципиентом (т.е. соответствия гаплотипов HLA). АПК обычно могут быть выделены из любых биологических жидкостей и органов, включая опухолевые и ткани, расположенные около опухолевых, и могут быть аутологичными, аллогенными, сингенными или ксеногенными клетками. В некоторых предпочтительных вариантах настоящего изобретения в качестве антигенпрезентирующих клеток используют дендритные клетки или их предшественники. Дендритные клетки являются очень эффективными АПК(BanchereauSteinman, 1998, Nature, 392, 245251) и, как было показано, эффективны в качестве физиологического адъюванта для стимуляции профилактического или лечебного противоопухолевого иммунитета (см. TimmermanLevy, 1999, Ann. Rev. Med., 50, 507-529). В целом, дендритные клетки могут быть идентифицированы на основе их характерной формы (insitu звездчатый, a in vitro с хорошо различимыми цитоплазматическими отростками (дендритами, по их способности захватывать, процессировать и презентировать антигены с высокой эффективностью и по способности активировать к иммунному ответу необученные Т-клетки. Понятно, что дендритные клетки могут быть преобразованы таким образом, чтобы они экспрессировали конкретные поверхностноклеточные рецепторы или лиганды, которые обычно не обнаруживаются на поверхности дендритных клеток in vivo или ex vivo, и такие модифицированные дендритные клетки преду 45 сматриваются настоящим изобретением. В качестве альтернативы дендритным клеткам в вакцинах могут быть использованы пузырьки,секретированные загруженными антигеном дендритными клетками (экзосомы)(см. Zitvogelet al., 1998, Nature Med., 4, 594-600). Дендритные клетки и предшественники могут быть получены из периферической крови,костного мозга, инфильтрующих опухоль клеток, инфильтрующих околоопухолевые ткани клеток, лимфатических узлов, селезенки, кожи,крови пупочного тяжа или любой другой подходящей ткани или жидкости тела. Например,дендритные клетки могут быть дифференцированы ех vivo путем добавления сочетания цитокинов, таких как GM-CSF, IL-4, IL-13 и/илиTNF, к культурам моноцитов, взятых из периферической крови. Как альтернатива, СD34 позитивные клетки, выделенные из периферической крови, крови пупочного тяжа или костного мозга, могут быть дифференцированы в дендритные клетки добавлением в культуральную среду сочетаний GM-CSF, IL-3, TNF, лигандаCD40, ЛПС, лиганда flt3 и/или другого(их) соединения(й), которое индуцирует дифференцировку, созревание и пролиферацию дендритных клеток. Дендритные клетки стандартным образом разделяют на незрелые и зрелые клетки,что представляет собой простой путь разграничения двух хорошо охарактеризованных фенотипов. Однако данная номенклатура не должна быть призвана исключить все возможные промежуточные стадии дифференциации. Незрелые дендритные клетки характеризуют как АПК с высокой способностью к поглощению и процессированию антигена, что коррелирует с высоким уровнем экспрессии рецептора Fc и рецептора маннозы. Зрелый фенотип обычно характеризуется низким уровнем экспрессии указанных маркеров, но интенсивной экспрессией поверхностно-клеточных молекул, отвечающих за активацию Т-клеток, таких как молекулы класса I и класса II МНС, адгезионные молекулы (например, CD54 и CD11) и костимуляторные молекулы (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1 ВВ). Обычно АПК можно трансфицировать полинуклеотидом, кодирующим белок легочной опухоли (или его сегмент или другой вариант) ,таким образом, что полипептид легочной опухоли или его иммуногенный сегмент экспрессируется на поверхности клеток. Такая трансфекция может иметь место ex vivo, и композиция или вакцина, содержащие такие трансфицированные клетки, могут быть затем использованы для терапевтических целей в соответствии с описанным в данном тексте. Как альтернатива,ген-доставочное средство, которое направлено на дендритную или иную антиген-презентирующую клетку, можно вводить больному, что приводит к трансфекции in vivo. Например, 005140 46 трансфекция дендритных клеток in vivo и ехvivo, в целом, может быть осуществлена с помощью любых методов, известных в данной области техники, например, как описано в международной патентной заявке WO 97/24447, или с помощью метода генного ружья, описанного у Mahvi et al., 1997, Immunology and Cell Biology, 75, 456-460. Загрузка антигена на дендритные клетки может быть осуществлена путем инкубации дендритных клеток или клетокпредшественников с полипептидом легочной опухоли, ДНК (голой или в составе плазмидного вектора) или РНК; или с экспрессирующими антиген рекомбинантными бактерией или вирусом (например, векторами вирусов коровьей оспы, куриной оспы, аденовирусов или лентивирусов). Перед загрузкой полипептид можно ковалентно присоединить к иммунологическому партнеру, что выполнит роль хелпера Т-клеток(например, как молекула-носитель). Как альтернатива, дендритную клетку можно обработать не присоединяемым иммунологическим партнером, причем как отдельно, так и в присутствие полипептида. Вакцины и фармацевтические композиции могут быть представлены в емкостях со стандартной дозой или несколькими дозами, таких как закрытые ампулы или флаконы. Такие емкости предпочтительно закрыты герметично, чтобы обеспечить стерильность препарата до момента использования. В целом, препараты могут храниться в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных наполнителях. Как альтернатива, вакцина или фармацевтическая композиция может храниться в лиофилизованном состоянии, которое требует только добавления жидкого стерильного носителя непосредственно накануне использования. Лечение рака В следующих аспектах настоящего изобретения описываемые здесь композиции могут быть использованы для иммунотерапии рака,такого как рак легкого. В таких способах фармацевтические композиции и вакцины обычно вводят пациенту. По использованию в данном тексте пациент обозначает любое теплокровное животное, предпочтительно человека. У пациента может быть, а может и не быть ракового заболевания. Соответственно, указанные выше фармацевтические композиции и вакцины могут быть использованы для профилактики развития рака или для лечения пациента с диагнозом рака. Раковое заболевание может быть диагностировано на основании критериев,обычно, принятых в данной области техники,включая присутствие злокачественной опухоли. Фармацевтические композиции и вакцины могут быть введены как до, так и после хирургического удаления первичных опухолей и/или такого лечения, как применение радиотерапии или стандартных химиотерапевтических средств. 47 В некоторых вариантах иммунотерапия может быть активной иммунотерапией, при которой лечение нацелено на стимуляцию in vivo эндогенной иммунной системы пациента, чтобы она действовала против опухолей, с помощью введения агентов-модификаторов иммунного ответа (таких как описанные здесь полипептиды и полинуклеотиды). В других вариантах иммунотерапия может быть пассивной иммунотерапией, при которой лечение включает доставку агентов, обладающих устойчивой иммунной активностью в отношении опухоли (таких как эффекторные клетки или антитела), которые могут напрямую или опосредованно проявлять противоопухолевые действия и не нуждаются в обязательной зависимости от иммунной системы интактного реципиента. Примерами эффекторных клеток являются описанные выше Т-клетки, Тлимфоциты (такие как СD8-позитивные цитотоксичные Т-лимфоциты и CD4-позитивные Т-хелперные лимфоциты, инфильтрующие опухоль), клетки-киллеры (такие как нативные клетки-киллеры и активируемые лимфокинами клетки-киллеры), В-лимфоциты и антигенпрезентирующие клетки (такие как дендритные клетки и макрофаги), экспрессирующие заявляемый здесь полипептид. Т-клеточные рецепторы и рецепторы антител, специфичные для приведенных в данном тексте полипептидов,могут быть клонированы, экспрессированы и внесены в другие векторы или эффекторные клетки для целей адоптивной иммунотерапии. Представленные здесь полипептиды также можно использовать для формирования антител или антиидиотипических антител (в соответствии с описанным выше и в патенте США 4918164) для целей пассивной иммунотерапии. Эффекторные клетки, в целом, могут быть получены в достаточных количествах для целей адоптивной иммунотерапии за счет культивирования in vitro в соответствии с описанным здесь. Условия культивирования для воспроизведения от отдельной антиген-специфичной эффекторной клетки до нескольких миллиардов клеток с сохранением распознавания антигена in vivo хорошо известны в данной области техники. При таких условиях культивирования in vitro обычно используют перемежающуюся стимуляцию антигеном, часто в присутствие цитокинов(таких как IL-2) и неделящихся клетоккормильцев. Как отмечалось выше, иммунореактивные полипептиды в соответствии с описанным здесь могут быть использованы для быстрого воспроизведения антиген-специфичных Т-клеточных культур с целью получения достаточного для иммунотерапии количества клеток. В частности, антиген-презентирующие клетки,такие как дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и/или В-клетки, могут быть обработаны иммунореактивными полипептидами или трансфицированы одним или несколь 005140 48 кими полинуклеотидами с использованием стандартных методов, хорошо известных в данной области техники. Например, антигенпрезентирующие клетки могут быть трансфицированы полинуклеотидом, включающим промотор, подходящий для усиленной экспрессии в рекомбинантной вирусной или иной экспрессионной системе. Культивируемые эффекторные клетки для использования в терапии должны быть способны расти и широко распределяться,а также сохранять жизнеспособность в течение длительного времени in vivo. Исследования показали, что культивируемые эффекторные клетки могут быть вызваны к росту in vivo и долговременной выживаемости в достаточном количестве путем повторной стимуляции антигеном,дополненным IL-2 (см., например, Cheever et al.,1997, Immunological Reviews, 157, 177). Как альтернатива, вектор, экспрессирующий описанный здесь полипептид, может быть введен в антиген-презентирующие клетки, взятые от пациента, и клонально воспроизведены ех vivo для последующей обратной трансплантации тому же самому пациенту. Трансфицированные клетки могут быть реинтродуцированы пациенту с использованием любых способов,известных в данной области техники, предпочтительно в стерильной форме путем внутривенного, внутриполостного, внутрибрюшинного или внутриопухолевого введения. Пути и частота введения терапевтических композиций, описанных здесь, равно как и дозировки, будут варьироваться от субъекта к субъекту, и они могут быть легко определены с применением стандартных методов. В целом,фармацевтические композиции и вакцины могут быть введены путем инъекции (например, внутрикожной, внутримышечной, внутривенной или подкожной), внутринозально (например, путем вдыхания) или перорально. Предпочтительно от 1 до 10 доз могут быть введены за 52-недельный период. Предпочтительно вводят 6 доз с месячным интервалом, и после этого возможны периодические бустерные вакцинации. Для отдельных пациентов могут быть применены альтернативные протоколы. Подходящей дозой является такое количество соединения, чтобы оно, будучи введено в соответствии с описанным здесь, было способно вызывать противоопухолевый иммунный ответ, который на 1050% превышает фоновый уровень (т.е. без введения). Такой ответ можно проконтролировать путем измерения титра противоопухолевых антител у больного или установления определяемого вакцинами образования цитолитических эффекторных клеток, способных уничтожать опухолевые клетки пациента in vitro. Такие вакцины также должны быть способны обусловливать иммунный ответ, который ведет к улучшенному клиническому результату (например, к большей частоте ремиссий, полному или частичному, или пролонгированному выживанию 49 без болезни) у вакцинированных пациентов по сравнению с невакцинированными пациентами. В целом, в случае фармацевтических композиций и вакцин, содержащих один или большее число полипептидов, количество каждого полипептида находится в диапазоне доз от примерно 25 мкг до 5 мг на 1 кг массы тела реципиента. Подходящие величины доз будут варьироваться в зависимости от размера тела пациента, но обычно будут находиться в диапазоне от примерно 0,1 мл до примерно 5 мл. В целом, соответствующие дозировки и режимы введения предоставляют активный(ые) компонент(ы) в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического и/или профилактического преимущества. Такой ответ можно проконтролировать по получению лучшего клинического результата (например, большей частоты ремиссий, полного или частичного, или пролонгированного выживания без болезни) у пациентов, в отношении которых указанное лечение проводится, по сравнению с пациентами без лечения. Превышение уже существующих иммунных ответов на белок легочной опухоли,обычно, коррелирует с улучшенным клиническим результатом. Такие иммунные ответы обычно могут быть оценены с использованием стандартных анализов на пролиферацию, цитотоксичность или цитокины, которые могут быть осуществлены с использованием образцов, взятых от пациента до и после лечения. Способы диагностики рака В целом, раковое заболевание может быть выявлено у пациента на основе присутствия одного или большего числа белков легочной опухоли и/или полинуклеотидов, кодирующих такие белки, в биологическом образце (например, кровь, сыворотка, мокроты, моча и/или биопсии опухоли), взятом от пациента. Другими словами, такие белки могут быть использованы в качестве маркеров для выявления наличия или отсутствия рака, такого как рак легкого. Кроме того, такие белки могут быть использованы для выявления других форм рака. Предусматриваемые здесь связывающие агенты, в целом, позволяют определять в биологическом образце уровень антигена, который связывается с таким агентом. Полинуклеотидные праймеры и зонды могут быть использованы для определения уровня мРНК, кодирующей опухолевый белок,что также является индикатором наличия или отсутствия рака. В целом, последовательность легочной опухоли должна присутствовать на уровне, который по крайней мере втрое выше в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью. Существует ряд тест-форматов, известных специалистам в данной области техники, предназначенных для использования связывающего агента для выявления полипептидных маркеров в образце: см., например, HarlowLane, 1988,"Antibodies: A Laboratory Manual", Cold SpringHarbor Laboratory. В целом, наличие или отсутствие рака у пациента может быть определено путем: (а) контактирования биологического образца, взятого от пациента, со связывающим агентом; (b) определения в образце уровня полипептида, который связывается со связывающим агентом; и (с) сравнения уровня полипептида с заранее определенной величиной отсечки. В предпочтительном варианте тест включает использование связывающего агента, иммобилизованного на твердую подложку, для связывания с полипептидом и отделения его от остального образца. Затем связанный полипептид может быть выявлен с использованием детекционного реагента, который включает репортерную группу и специфически связывается с комплексом связывающего агента с полипептидом. Такие детекционные реагенты могут включать, например, связывающий агент, который специфически связывается с полипептидом или антителом, или с другим агентом, который специфически связывается со связывающим агентом, таким как антииммуноглобулин, белокG, белок-А или лектин. Как альтернатива, может быть использован конкурентный тест, в котором полипептид помечен репортерной группой и обеспечивают связывание иммобилизованного связывающего агента после инкубации связывающего агента с образцом. Та степень, с которой компоненты образца подавляют связывание меченного полипептида со связывающим агентом, служит индикатором реактивности образца с иммобилизованным связывающим агентом. Подходящими для использования в таких анализах полипептидами являются полноразмерные белки легочной опухоли и их сегменты, с которыми связывается связывающий агент в соответствии с описанным выше. Твердой подложкой может быть любой материал, известный специалистам в данной области техники, к которому можно присоединить опухолевый белок. Например, твердой подложкой может быть тест-лунка микротитровального планшета или нитроцеллюлозная или иная подходящая мембрана. Как альтернатива,подложкой может быть шарик или диск, например, из стекла, фибергласса, латекса или пластмассы, такой как полистирен или поливинилхлорид. Подложкой также может быть намагниченная частица или оптиковолоконный датчик,такой, как, например, описанный в патенте США 5359681. Связывающий агент может быть иммобилизован на твердую подложку с использованием различных методов, известных специалистам в данной области техники, которые подробно описаны в патентной и научной литературе. В контексте настоящего изобретения термин иммобилизация указывает и на нековалентную связь, такую как адсорбция, и на ковалентное связывание (которое может быть прямой связью между антигеном и функцио 51 нальными группами на подложке или может быть связью через перекрестно-сшивающий агент). Связывание с помощью адсорбции на лунке микротитровального планшета или на мембране является предпочтительным. В таких случаях адсорбция может быть осуществлена путем контактирования связывающего агента в подходящем буфере с твердой подложкой в течение подходящего периода времени. Время контакта зависит от температуры, но обычно составляет примерно от 1 ч до 1 дня. В целом,контакт лунки пластмассового микротитровального планшета (такого как планшет из полистирена или поливинилхлорида) с количеством связывающего агента, варьирующимся в пределах от примерно 10 нг до примерно 10 мкг и предпочтительно составляющим от примерно 100 нг до примерно 1 мкг, достаточен для связывания адекватного количества связывающего агента. Ковалентное присоединение связывающего агента к твердой подложке, в целом, может быть осуществлено сначала путем взаимодействия подложки с бифункциональным реагентом,который будет взаимодействовать и с подложкой, и с функциональной группой, такой как гидроксильная или аминогруппа, в составе связывающего агента. Например, связывающий агент может быть ковалентно соединен с подложками, имеющими подходящее полимерное покрытие с бензохиноном, или путем конденсации альдегидной группы на подложке с амином и активным водородом связывающего агентаand Handbook, 1991, A12-A13). В некоторых вариантах анализом является сэндвич-тест с двумя антителами. Данный анализ может быть осуществлен сначала путем контактирования антитела, которое было иммобилизовано на твердую подложку - обычно лунку микротитровального планшета, - с образцом таким образом, что полипептидам в образце обеспечивается связывание с иммобилизованным антителом. Несвязанный образец затем отделяют от иммобилизованных комплексов полипептида и антитела, и добавляют детекционный реагент (предпочтительно второе антитело, способное связываться с отличающимся сайтом полипептида), включающий репортерную группу. Количество детекционного реагента,которое остается связанным с твердой подложкой, затем определяют с использованием метода, соответствующего конкретной репортерной группе. Более конкретно, после того как антитело иммобилизовано на подложку в соответствии с описанным выше, остающиеся белковые сайты связывания на подложке обычно блокируют. Можно использовать любой подходящий блокирующий агент, известный специалистам в данной области техники, такой как бычий сывороточный альбумин или Твин-20 (Sigma 52 ванное антитело инкубируют с образцом, и полипептид может связываться с антителом. Перед инкубацией образец может быть разбавлен подходящим разбавителем, таким как фосфатносолевой буфер (ФСБ). В целом, подходящей продолжительностью контакта (т.е. временем инкубации) является такой период времени, которого достаточно для выявления присутствия полипептида в образце, взятом от пациента с диагнозом рака легкого. Предпочтительно продолжительность контакта достаточна для достижения уровня связывания, который составляет по крайней мере 95% от уровня, достигаемого в состоянии равновесия между связанным и несвязанным полипептидом. Для специалиста в данной области техники будет понятно, что время, необходимое для достижения равновесия, может быть легко определено с помощью анализа уровня связывания, которое происходит за некий период времени. В принципе достаточное при комнатной температуре время инкубации составляет примерно 30 мин. Несвязанный образец может быть затем удален путем промывки твердой подложки подходящим буфером, таким как ФСБ, содержащий 0,1% Твин-20. Второе антитело, которое включает репортерную группу, после этого может быть добавлено к твердой подложке. Предпочтительными репортерными группами являются группы, перечисленные выше. После этого детекционный реагент инкубируют с иммобилизованным комплексом антитело-полипептид в течение времени, достаточного для выявления связанного полипептида. Подходящее количество времени обычно можно определить путем анализа уровня связывания,которое имеет место за определенный отрезок времени. Затем несвязанный детекционный реагент удаляют, а связанный детекционный реагент выявляют с использованием репортерной группы. Метод, используемый для выявления репортерной группы, зависит от природы репортерной группы. Для радиоактивных групп обычно подходящими являются подсчет сцинтилляций или авторадиографические методы. Методы спектроскопии могут быть использованы для выявления красителей, люминесцентных групп и флуоресцентных групп. Биотин можно выявить с помощью авидина, соединенного с иной репортерной группой (обычно радиоактивной или флуоресцентной группой или с ферментом). Обычно ферментные репортерные группы можно выявить путем добавления субстрата (обычно на определенное время) с последующим спектроскопическим или иным анализом продуктов реакции. Для установления наличия или отсутствия рака, такого как рак легкого, сигнал, выявленный от репортерной группы, которая остается связанной с твердой подложкой, обычно сравнивают с сигналом, который соответствует заданному значению отсечки. В предпочтитель 53 ном варианте значение отсечки для выявления рака представляет собой средний сигнал, полученный в случае, когда иммобилизованное антитело инкубируют с образцами, взятыми от пациентов без рака. В целом, образец, дающий сигнал, который превышает заданную величину отсечки на три сигмы, рассматривается как положительный по наличию рака. В альтернативном предпочтительном варианте величину отсечки определяют с использованием операционной калибровочной кривой, полученной в соответствии с методом Sackett et al., "ClinicalEpidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine", Little BrownCo., 1985, pp. 106-107. Вкратце, в данном варианте величина отсечки может быть определена из графика пар истинно положительных значений (т.е. чувствительности) и ложно-положительных значений (100% специфичности), которые соответствуют каждой возможной величине отсечки по результатам диагностического анализа. Та величина отсечки, которая на графике расположена наиболее близко к его левому верхнему углу (т.е. величина, которая охватывает наибольшую площадь), представляет собой наиболее точную величину отсечки, и образец, дающий сигнал,который выше величины отсечки, определенной с помощью указанного метода, может рассматриваться как положительный. Как альтернатива,величина отсечки может быть сдвинута на графике влево с целью минимизации ложноположительных оценок или же вправо с целью минимизации ложно-отрицательных оценок. В целом, образец, дающий сигнал, который превышает величину отсечки, определенной с помощью данного метода, рассматривается как положительный по наличию рака. В близком варианте тест проводят в формате проточного теста или теста на полосках носителя, в которых связывающий агент иммобилизуют на мембрану, такую как нитроцеллюлозная мембрана. В проточном тесте полипептиды в образце связываются с иммобилизованным связывающим агентом по мере прохождения образца через мембрану. Затем второй меченный связывающий агент связывается комплексом связывающий агент-полипептид по мере того, как раствор, содержащий второй связывающий агент, проходит через мембрану. Выявление связанного второго связывающего агента можно затем провести в соответствии с описанным выше. В формате теста на полосках один конец мембраны, на которой связан связывающий агент, погружают в раствор, содержащий образец. Образец движется вдоль мембраны через участок, содержащий второй связывающий агент, и через область с иммобилизованным связывающим агентом. Концентрирование второго связывающего агента в области иммобилизованного антитела указывает на наличие рака. Обычно концентрирование второго связывающего агента в данном месте формиру 005140 54 ет параметр, например, линию, который легко можно определить визуально. Отсутствие такого параметра указывает на отрицательный результат. В целом, количество связывающего агента, иммобилизованного на мембране, выбирают так, чтобы сформировать визуально различимый параметр тогда, когда биологический образец содержит уровень полипептида, который должен быть достаточен для генерирования положительного сигнала в сэндвич-тесте с двумя антителами в обсуждавшемся выше формате. Предпочтительными связывающими агентами для использования в таких тестах являются антитела и их антиген-связывающие фрагменты. Предпочтительно количество антитела, иммобилизованного на мембране, варьируется от примерно 25 нг до примерно 1 мкг, а более предпочтительно - от примерно 50 нг до примерно 500 нг. Такие тесты обычно могут быть проведены при очень небольшом количестве биологического образца. Понятно, что существуют многочисленные другие прописи тестов, которые пригодны для использования в отношении опухолевых белков или связывающих агентов по настоящему изобретению. Приведенные выше описания призваны служить исключительно примерами. Например, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что указанные выше прописи легко могут быть модифицированы для использования полипептидов легочной опухоли для выявления антител, которые связываются с такими полипептидами в биологическом образце. Выявление таких антител, специфичных в отношении белка легочной опухоли, может коррелировать с наличием рака. Также, или как альтернатива, рак может быть выявлен на основе присутствия в биологическом образце Т-лимфоцитов, которые специфическим образом взаимодействуют с белком легочной опухоли. В некоторых методах биологический образец, содержащий CD4-позитивные и/или CDS-позитивные Т-клетки, выделенные от больного, инкубируют с полипептидом легочной опухоли, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид, и/или АПК, которые экспрессируют по крайней мере иммуногенный сегмент такого полипептида, с выявлением присутствия или отсутствия специфической активации Т-клеток. Подходящими биологическими образцами являются, тем самым не ограничиваясь, изолированные Т-клетки. Например, Тклетки могут быть выделены у больного с помощью стандартных методов (таких как центрифугирование в градиенте плотности Ficoll/Hypaque лимфоцитов периферической крови). Т-клетки могут быть проинкубированы invitro в течение 2-9 дней (обычно 4 дней) при 37 С с полипептидом (например, 5-25 мкг/мл). Желательной может быть инкубация другой аликвоты Т-клеточного образца при отсутствии полипептида легочной опухоли, что будет слу 55 жить контролем. Для Т-клеток CD4+ активацию предпочтительно выявляют, оценивая пролиферацию Т-клеток. В случае Т-клеток CD8+ активацию предпочтительно выявляют путем оценки цитолитической активности. Степень пролиферации, которая по крайней мере вдвое выше,и/или уровень цитолитической активности, который по крайней мере на 20% выше, чем у здоровых субъектов, указывают на наличие рака у больного. Как отмечалось выше, рак также, или как альтернатива, может быть выявлен на основе уровня кодирующей белок легочной опухоли мРНК в биологическом образце. Например, по крайней мере два олигонуклеотидных праймера могут быть использованы в основанном на полимеразной цепной реакции (ПЦР) тесте для амплификации части кДНК легочной опухоли,происходящей от биологического образца, в котором по крайней мере один из олигонуклеотидных праймеров специфичен (т.е. гибридизуется с) по отношению к полинуклеотиду, кодирующему белок легочной опухоли. Затем амплифицированную кДНК разделяют и детектируют с использованием методов, хорошо известных в данной области техники, таких как гель-электрофорез. Сходным образом, олигонуклеотидные зонды, которые специфически гибридизуются с полинуклеотидом, кодирующим белок легочной опухоли, могут быть использованы в тесте на гибридизацию для выявления в биологическом образце присутствия полинуклеотида, кодирующего опухолевый белок. Для обеспечения гибридизации в условиях теста олигонуклеотидные праймеры и зонды должны включать олигонуклеотидную последовательность, которая характеризуется по крайней мере примерно 60%-ной, предпочтительно по крайней мере примерно 75%-ной и более предпочтительно по крайней мере примерно 90%-ной идентичностью по отношению к участку полинуклеотида, кодирующего белок легочной опухоли, длина которого составляет по крайней мере 10 нуклеотидов и предпочтительно по крайней мере 20 нуклеотидов. Предпочтительно олигонуклеотидные праймеры и/или зонды будут гибридизоваться с полинуклеотидом, кодирующим заявленный здесь полипептид, при условиях средней жесткости, что было определено выше. Олигонуклеотидные праймеры и/или зонды, которые могут быть эффективно использованы в способах диагностики, описанных в данном тексте, имеют длину предпочтительно по крайней мере 10-40 нуклеотидов. В предпочтительном варианте олигонуклеотидные праймеры включают по крайней мере 10 расположенных подряд нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере 15 расположенных подряд нуклеотидов из молекулы ДНК, последовательность которой приведена в SEQ ID NO 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 005140 56 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255337, 345, 347 и 349. Методики и для анализов на основе ПЦР, и гибридизационных анализов хорошо известны в данной области техники (см.,например, Mullis et al., 1987, Cold Spring HarborSymp. Quant. Biol., 51, 263; Erlich (ed.), 1989,"PCR Technology", Stockton Press, NY). В одном из предпочтительных тестов используют ПЦР с ревертированием, где ПЦР применяют в сочетании с обратной транскрипцией. Обычно РНК экстрагируют из биологического образца, такого как биопсийная проба ткани, и подвергают обратной транскрипции с получением молекул кДНК. ПЦР-амплификация с использованием по крайней мере одного специфичного праймера дает молекулу кДНК, которую можно отделить и визуализовать с использованием, например, гель-электрофореза. Амплификацию можно осуществить на материале биологических образцов, взятых от обследуемого пациента и от субъекта, у которого нет ракового заболевания. Реакцию амплификации можно провести в серии разведений кДНК в масштабе двух порядков. Двукратное или более значительное усиление экспрессии в ряду разведений анализируемого образца от обследуемого пациента по сравнению с такими же разведениями от неракового образца обычно рассматривается как положительный результат. В другом варианте заявленные композиции могут быть использованы в качестве маркеров развития рака. В данном варианте тесты в соответствии с описанным выше для диагностики рака могут быть проведены в течение некоторого времени с оценкой изменения уровня реактивных полипептида(ов) или полинуклеотида. Например, тесты можно проводить каждые 2472 часа в течение периода от 6 месяцев до 1 года и дольше, если это необходимо. В целом, рак считается прогрессирующим у тех пациентов, у которых выявленный уровень полипептида или полинуклеотида возрастает со временем. Напротив, рак не является прогрессирующим, если уровень реактивного полипептида или полинуклеотида либо остается постоянным, либо со временем снижается. Некоторые диагностические тесты in vivo могут быть проведены непосредственно на опухоли. Один такой тест включает контактирование клеток опухоли со связывающим агентом. Связанный связывающий агент затем можно выявить напрямую или косвенно через репортерную группу. Также такие связывающие агенты можно использовать в гистологическом анализе. Как альтернатива, полинуклеотидные зонды могут быть использованы для аналогичного применения. Как отмечалось выше, для повышения чувствительности в данном образце можно протестировать множественные белки-маркеры легочной опухоли. Должно быть понятно, что связывающие агенты, специфичные для разных бел 57 ков, описываемых в данном тексте, могут быть объединены в общем тесте. Кроме того, множественные праймеры или зонды могут быть использованы одновременно. Отбор опухолевых белковых маркеров может быть основан на стандартных экспериментах с целью определения сочетаний, которые обеспечивают оптимальную чувствительность. Кроме того, или в качестве альтернативы, тесты на опухолевые белки, описываемые здесь, могут быть объединены с тестами на другие известные опухолевые антигены. Диагностические наборы Далее настоящее изобретение представляет наборы для использования в любых описанных выше способах диагностики. Обычно такие наборы содержат два или большее число компонентов, необходимых для проведения диагностического теста. Компонентами могут быть соединения, реагенты, емкости и/или оборудование. Например, в одной емкости в составе набора может находиться моно-клональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с белком легочной опухоли. Такие антитела или фрагменты могут быть представлены присоединенными к твердой подложке в соответствии с описанным выше. Одна или несколько дополнительных емкостей могут содержать такие компоненты, как реагенты или буферы, с целью их использования в тесте. Также, или в качестве альтернативы, указанные наборы могут содержать детекционный реагент,описанный выше, который включает репортерную группу, подходящую для прямого или опосредованного выявления связывания антитела. Как альтернатива, набор может быть сформирован так, чтобы выявлять уровень мРНК, кодирующей белок легочной опухоли в биологическом образце. Обычно такие наборы содержат по крайней мере один олигонуклеотидный зонд или праймер, описанные выше,которые гибридизуются с полинуклеотидом,кодирующим белок легочной опухоли. Такой олигонуклеотид можно использовать, например,в ПЦР или гибридизационном тесте. Дополнительными компонентами, которые могут находиться в составе таких наборов, являются второй олигонуклеотид и/или диагностический реагент или емкость для облегчения выявления полинуклеотида, кодирующего белок легочной опухоли. Нижеследующие примеры подобраны в качестве иллюстративных и не являются в чемлибо ограничивающими. Пример 1. Выделение и характеристика последовательностей кДНК, кодирующих полипептиды легочной опухоли. Данный пример иллюстрирует выделение молекул кДНК, кодирующих специфичные для легочной опухоли полипептиды, на материале библиотек кДНК легочной опухоли. 58 А. Выделение последовательностей кДНК из библиотеки плоскоклеточной карциномы легких Экспрессионную библиотеку кДНК плоскоклеточной легочной карциномы человека конструировали на материале полиаденилированных РНК из объединенных тканей двух больных с использованием плазмидной системыSuperscript для синтеза кДНК и набора для плазмидного клонирования (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) в соответствии с прописью изготовителя. В частности, ткани легочной карциномы гомогенизировали на политроне(Kinematica, Швейцария), а тотальную РНК экстрагировали с использованием Trizol (BRL LifeTechnologies) в соответствии с указанным производителем. Затем (ПОЛИ-А+)-РНК очищали с использованием колонки из олиго-дТ-целлюлозы в соответствии с описанным у Sambrook etHarbor, NY. Первую цепь кДНК синтезировали с использованием праймера NotI/Oligo-dT18. Двухцепочечную кДНК синтезировали, лигировали с адаптерами BstXI/EcoRI (Invitrogen, SanDiego, CA) и расщепляли с помощью рестриктазы NotI. После фракционирования по размеру с помощью колонок для фракционирования кДНК по размеру (BRL Life Technologies) кДНК лигировали по BstXI/NotI-сайту в состав pcDNA3.1(Invitrogen), и полученным с помощью электропорации трансформировали клетки ElectroMaxE.coli DH10B (BRL Life Technologies). С использованием той же процедуры экспрессионную библиотеку кДНК нормальных легких человека формировали на материале тканей четырех объединенных образцов. Библиотеки кДНК характеризовали по числу независимых колоний, проценту клонов, несущих вставки, среднему размеру вставки и с помощью секвенационного анализа. Библиотека плоскоклеточной карциномы легких включала 2,7 х 106 независимых клонов при том, что 100% клонов включали вставку при среднем размере вставки 2100 пар нуклеотидов. Библиотека кДНК нормальных легких включала 1,4 х 106 независимых клонов, 90% клонов имели вставки, а средний размер вставки составил 1800 пар нуклеотидов. Секвенационный анализ обеих библиотек показал, что большинство клонов включают полноразмерную последовательность кДНК, и были синтезированы на матрице мРНК. Субтракция (сокращение) библиотеки кДНК была осуществлена с использованием описанных выше библиотек кДНК плоскоклеточной карциномы легких и нормальных легких в соответствии с описанным у Наrа et al. (Blood,84, 189-199, 1994) с некоторыми модификациями. В частности, субтракционная библиотека кДНК, специфичная для плоскоклеточной карциномы легких, была сформирована следующим образом. Библиотеку кДНК нормальной тканиXhoI с последующим заполнением концов с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы. После экстракции фенолом-хлороформом и этанольной преципитации ДНК растворяли в 133 мкл воды, денатурировали нагреванием и смешивали с 133 мкл (133 мкг) биотина Photoprobe(Vector Laboratories, Burlingame, CA). В соответствии с рекомендациями изготовителя, полученную смесь облучали ультрафиолетовой лампой 270 W на льду в течение 20 минут. Дополнительно биотин Photoprobe (67 мкл) добавляли с повторением реакции биотинилирования. После пятикратной бутанольной экстракции ДНК преципи-тировали этанолом и растворяли в 23 мкл воды с получением драйверной (сокращающей) ДНК. Для получения трейсерной (ведомой) ДНК 10 мкг библиотеки кДНК плоскоклеточной карциномы легких расщепляли рестриктазамиNotI и SpeI, экстрагировали фенолом-хлороформом и пропускали через колонку для центрифугирования Chroma spin-400 (Clontech, PaloAlto, CA). Обычно после рассева колонки выделяли 5 мкг кДНК. После преципитации этанолом трейсерную ДНК растворяли в 5 мкл воды. Трейсерную ДНК смешивали с 15 мкл драйверной ДНК и 20 мкл 2 х гибридизационного буфера (1,5 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ HEPES рН=7,5, 0,2% додецилсульфата натрия), покрывали минеральным маслом и полностью денатурировали нагреванием. Незамедлительно образец переносили на водяную баню при 68 С и инкубировали в течение 20 ч (длинная гибридизация [ДГ]). Затем реакционную смесь обрабатывали стрептавидином с последующей экстракцией фенолом-хлороформом. Данный процесс повторяли еще трижды. Субтракционную ДНК преципитировали, растворяли в 12 мкл воды, смешивали с 8 мкл драйверной ДНК и 20 мкл 2 х гибридизационного буфера и гибридизовали при 68 С в течение 2 ч (короткая гибридизация [КГ]). После удаления биотинилированной двухцепочечной ДНК субтракционную ДНК лигировали по NotI/SpeI-сайту плазмиды pBCSK+ с признаком резистентности к хлорамфениколу (Stratagene, La Jolla, CA), и полученным с помощью электропорации трансформировали клетки ElectroMax E.coli DH10B с получением субтракционной библиотеки кДНК, специфичной для плоскоклеточной легочной карциномы (здесь и далее обозначена как легочная субтракция I). Вторая субтракционная библиотека кДНК, специфичная для плоскоклеточной легочной карциномы (обозначена как легочная субтракция II), была сформирована так же, как и как легочная субтракционная библиотека I,за исключением того, что в состав драйверной ДНК были включены восемь часто выделяемых генов из состава легочной субтракции I, после чего выделили 24000 независимых клонов. 60 Для анализа субтракционных библиотек кДНК плазмидную ДНК приготавливали на материале 320 независимых клонов, случайным образом отобранных из субтракционных библиотек, специфичных для плоскоклеточной легочной карциномы. Далее репрезентативные клоны кДНК охарактеризовывали с помощью секвенирования ДНК с применением автоматического секвенатора модели 373 А и/или модели 377 от Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster City, CA). Последовательности кДНК для шестидесяти изолированных клонов представлены в SEQ ID NO 1-60. Указанные последовательности сравнивали с известными последовательностями банков генов с использованием баз данных EMBL и GenBank (выпуск 96). Не было обнаружено существенной гомологии с последовательностями, показанными в SEQ ID NO 2,3, 19, 38 и 46. Было установлено, что последовательности SEQ ID NO 1, 6-8, 10-13, 15, 17, 18,20-27, 29, 30, 32, 34-37, 39-45, 47-49, 51, 52, 54,55 и 57-59 проявляли некоторый уровень гомологии с ранее идентифицированными экспрессируемыми маркерными последовательностями(EST-маркерами). Было показано, что последовательности SEQ ID NO 9, 28, 31 и 33 проявляли некоторую степень гомологии с ранее идентифицированными генными последовательностями, не относящимися к человеку, а последовательности SEQ ID NO 4, 5, 14, 50, 53, 56 и 60 показали некоторый уровень гомологии с генными последовательностями, ранее идентифицированными у человека. Описанную выше процедуру субтракции повторяли с использованием описанной выше библиотеки кДНК плоскоклеточной легочной карциномы в качестве трейсерной ДНК, а в качестве драйверной ДНК использовали описанную выше библиотеку кДНК нормальной легочной ткани и библиотеку кДНК нормальных печени и сердца (сконструированы на материале пула одного образца каждой ткани в соответствии с описанным выше) плюс двадцать разных клонов кДНК, которые часто выделяют из легочных субтракций I и II (легочная субтракция III). Библиотека кДНК нормальных печени и сердца включала 1,76 х 106 независимых колоний при том, что 100% клонов имели вставки, а средний размер вставки составил 1600 пар нуклеотидов. Выделили десять дополнительных клонов (SEQ ID NO 61-70). Сравнение указанных последовательностей кДНК с последовательностями из генного банка в соответствии с описанным выше показало отсутствие существенной гомологии с последовательностями,представленными в SEQ ID NO 62 и 67. Было установлено, что последовательности SEQ IDNO 61, 63-66, 68 и 69 проявили некоторый уровень гомологии с ранее изолированными ESTмаркерами, а последовательность SEQ ID NO 70, как было показано, проявила некоторый