Получение рекомбинантных факторов свертывания крови в линиях клеток человека

1 Введение Данное изобретение относится к усовершенствованному способу получения рекомбинантных факторов свертывания крови человека,в частности фактора VIII и IX, с использованием линии иммортализованных клеток человека,стабильно экспрессирующих вирусные белки активаторов транскрипции и несущие вектор,имеющий промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей коагулирующий фактор крови, при условии, что указанный промотор не является вирусным промотором, который стимулируется указанными вирусными белками активаторами транскрипции; к линии иммортализованных клеток человека, несущих указанный вектор; к мутеинам фактора VIII, в частности, подходящим для указанного выше способа получения; к фармацевтическим композициям, содержащим такие мутеины фактора VIII и к применению таких мутеинов фактора VIII для получения лекарственного средства для лечения гемофилии. Краткое изложение предшествующего уровня техники Больные гемофилией страдают от геморрагической болезни, причиной которой является нарушение функции белковых компонентов каскада коагуляции крови. В зависимости от пораженного фактора свертывания можно различить два типа гемофилии. Общим при гемофилии обоих типов является ингибированное превращение растворимого фибриногена в нерастворимый сгусток фибрина. Эти болезни являются рецессивными сцепленными с Ххромосомой генетическими заболеваниями, поражающими, главным образом, мужскую популяцию. Гемофилия А поражает 1-2 человека из 10000 мужчин. Это заболевание вызвано дефицитом или отсутствием фактора VIII, очень крупного гликопротеина (М.м. примерно 330 кД(Furie В., Furie B.C., Cell (1988) 53, 505-518),который представляет собой важный элемент каскада коагуляции крови. Полипептидную последовательность можно подразделить на три участка, N-концевой участок, состоящий из так называемых А 1- и А 2-доменов, В-домен центрального участка и С-концевой участок, состоящий из доменов A3, С 1 и С 2. В крови фактор коагуляции VIII находится в виде неактивного предшественника. Он тесно и нековалентно связан с фактором фон Виллебранда (vWF),который действует как стабилизирующий белок-носитель. Протеолитическое расщепление фактора VIII тромбином в трех конкретных положениях (740, 372, 1689) приводит к его отделению от vWF и высвобождает прокоагулянтную функцию в пределах каскада. В своей активной форме фактор VIII функционирует как кофактор для фактора IХа, усиливая таким образом протеолитическую активацию фактора Х на несколько порядков значений. 2 Гемофилия В встречается примерно у 1 из 25000 мужчин. Она характеризуется дефицитом фактора IX, являющегося сериновой протеазой(рождественский фактор). Указанный полипептид из 415 аминокислот синтезируется в печени в виде гликопротеина с М.м. 56 кД. Для приобретения свойственной ему функции необходима стадия посттрансляционного карбоксилирования, которое происходит только в присутствии витамина К. Лечение обоих типов расстройств, связанных с кровотечением, обычно включает инфузии полученными из плазмы человека белковыми концентратами фактора VIII или фактора IX. Хотя указанный способ представляет собой эффективный способ лечения гемофилии, он несет в себе риск переноса различных инфекционных агентов, таких как вирусы, вызывающие гепатит или СПИД, или тромбоэмболических факторов. В качестве альтернативы описано несколько технологий на основе рекомбинантных ДНК для получения факторов свертывания. Для этой цели выделили соответствующие кДНК фактораVIII и фактора IX дикого типа, и их клонировали в подходящие векторы экспрессии (ЕР-А 160457; WO-A-86/01961, патенты США 4770999 и 5521070. В случае фактора VIII в данной области известна экспрессия рекомбинантных субъединиц для получения комплексов, проявляющих коагулирующую активность (например, в ЕР-А 150735, ЕР-А-232112, ЕР-А-0500734, WO 91/07490, WO 95/13300, патентах США 5045455 и 5789203). Кроме того, описана экспрессия укороченных кДНК-версий, в которых частично или полностью отсутствует последовательность, кодирующая В-домен, гликозилированный в высокой степени (например, в WO 86/06101, WO 87/04187, WO 87/07144, WO 88/00381, ЕР-А-251843, ЕР-А-253455, ЕР-А 254076, патентах США 4868112 и 4980456,ЕР-А-294910, ЕР-А-265778, ЕР-А-303540 и WO 91/09122). Совсем недавно было введено множество отобранных точечных мутаций для того,чтобы ингибировать протеолитическую инактивацию фактора VIII активированным белком С или чтобы уменьшить иммуногенность, приводящую к образованию ингибирующих антител у пациентов, которым проводят лечение (например, патенты США 5859204, 5422260 и 5451521,WO-97/49725 и WO-99/29848). Рекомбинантные факторы свертывания обычно выделяли из среды линий стабильно трансфицированных эукариотических клеток и предпочтительно из линий клеток млекопитающих. Однако общей практикой было использование линий, не относящихся к человеку, клеток в способах получения, раскрытых в ссылках,указанных в данном описании выше, для того,чтобы исключить риск совместной очистки некоторых инфекционных агентов, которые клетки человека могут нести и экспрессировать. 3 Однако особенно для фактора VIII применение линий клеток, не относящихся к человеку,сталкивается с некоторыми недостатками. Например, сообщалось о неудовлетворительных уровнях секреции экспрессируемого белка в среду. Это может быть следствием небольших различий между разными типами клеток млекопитающих, касающихся внутриклеточных путей трансляции и модификации белков, которые также могут влиять на биологическую активность экспрессируемого полипептида. Кроме этого, сообщалось о том, что терапевтически используемые белки, очищенные из систем экспрессии, не относящихся к человеку, загрязнены клеточными компонентами, которые могут вызывать антигенные реакции у пациентов. Кроме того, белки, экспрессированные системами экспрессии, не относящимися к человеку, могут иметь другой характер гликозилирования, отличный от гликозилирования у человека, вызывающий антигенные реакции у пациента. Однако характер N-гликозилирования в значительной степени влияет на биологическую стабильность и эффективность факторов свертывания. Особенно важны периферические и концевые моносахариды, так как они выявляются специфичными рецепторами клеток, которые ответственны за их деградацию. Факторы свертывания в качестве концевых моносахаридов несут остатки сиаловой кислоты. Результатом модификации в составе сиаловых кислот в усиках гликопротеинов, таких, например, как факторы свертывания, могут быть гетерогенные картины гликозилирования. Таким образом,биологическая стабильность и эффективность является ключевым признаком, который затрагивается в том случае, когда происходит модификация. Следовательно, важным анализом при получении рекомбинантных факторов свертывания является оценка влияния гликозилирования в продуцирующих линиях клеток, не относящихся к человеку, по сравнению с линиями клеток человека. Вообще говоря, выглядит правдоподобным, что линии клеток человека являются более подходящими для продукции рекомбинантных факторов свертывания, чем линии клеток, не относящихся к человеку. Основанием для такого предположения является то, что вероятно в ходе синтеза рекомбинантных факторов в олигосахаридный компонент не будут включены чужеродные олигосахариды. С другой стороны, в течение некоторого времени стали доступными общие способы экспрессии белка требуемого гена на высоком уровне, включающие применение линий иммортализованных, стабильно трансфицированных клеток млекопитающих, экспрессирующих вирусные белки активаторов транскрипции (например, патент США 5712119). Кроме того, указанные линии клеток трансформированы векторной конструкцией, в которой подходящий вирусный транскрипционный промотор функ 004317 4 ционально связан с последовательностью ДНК,определяющей представляющий интерес ген,белки активаторов транскрипции активируют вирусный транскрипционный промотор и, следовательно, инициируют экспрессию представляющего интерес гена. И опять, считалось, что белки транскрипционных факторов, экспрессируемые указанными линиями клеток, могут давать загрязнения терапевтического белкамишени. В свете сказанного выше существует необходимость в эффективном способе получения факторов свертывания крови человека. Неожиданно было обнаружено, что не содержащий загрязнений фактор свертывания крови можно получить с помощью указанных выше иммортализованных линий клеток человека. В частности, иммортализованные линии клеток - в том случае, если они несут вектор,имеющий промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей фактор свертывания крови, и, несмотря на тот факт,что промотор не является вирусным промотором, который стимулируется указанными вирусными белками-активаторами транскрипции способны экспрессировать фактор свертывания крови. В комбинации с подходящими протоколами очистки белка и инактивации вирусов указанный способ предоставляет эффективную систему для получения безопасных и высокоактивных рекомбинантных факторов свертывания крови для терапевтического применения на человеке. Более того, были обнаружены особые мутеины фактора VIII, которые исключительно стабильны по отношению к протеолитической инактивации и таким образом позволяют подвергать их энергичным способам инактивации вирусов. Сущность изобретения Данное изобретение представляет:(1) способ получения рекомбинантного фактора свертывания крови человека, который включает:(а) культивирование линии иммортализованных клеток человека, стабильно экспрессирующих по меньшей мере один вирусный белок активатора транскрипции и несущих вектор,имеющий промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей фактор свертывания крови человека, при условии,что указанный промотор не является вирусным промотором, который стимулируется по меньшей мере одним указанным вирусным белком активатора транскрипции, и(b) выделение фактора свертывания крови из культурального бульона;(2) предпочтительный вариант способа,охарактеризованного в (1) выше, отличается тем, что фактором свертывания крови человека является фактор VIII или его мутеин; 5 тем, что фактором VIII является мутеин, имеющий по меньшей мере одну из следующих мутаций:(a) Val в положении 162 заменен остатком другой нейтральной аминокислоты,(b) Ser в положении 2011 заменен остатком другой гидрофильной аминокислоты,(c) Val в положении 2223 заменен остатком другой кислой аминокислоты, иGlu1649 был заменен линкерным пептидом, богатым Аrg, содержащим от 10 до 25, предпочтительно от 14 до 20 аминокислотных остатков,при этом указанная нумерация для фактора VIII соответствует последовательности зрелого фактора VIII дикого типа, показанной в SEQ ID NO: 2;(4) предпочтительный вариант способа,охарактеризованного в (1) выше, отличается тем, что фактором свертывания крови человека является фактор IX или его мутеин;(5) линия иммортализованных клеток человека, несущих вектор, кодирующий фактор свертывания крови человека, как определено в(7) последовательность ДНК, кодирующая мутеин фактора VIII, как определено в (6) выше;(11) фармацевтическая композиция, содержащая мутеин фактора VIII, как определено в (6) выше, или вектор-переносчик генов, как определено в (9) выше;(12) применение мутеина фактора VIII, как определено в (6) выше, или векторапереносчика генов, как определено в (9) выше,для получения лекарственного средства для лечения гемофилии; и(13) способ лечения гемофилии, включающий введение человеку, страдающему гемофилией, мутеина фактора VIII, как определено в (6) выше, или вектора-переносчика генов,как определено в (9) выше. Описание фигур На фиг. 1 показаны фрагменты, используемые для конструирования фактора VIII с делетированным В-доменом (пример 1); на фиг. 2 показан вектор pTGF8-1, кольцевая ДНК длиной 8720 п.н., точная последовательность его ДНК приведена в SEQ ID NO: 3(последовательность белка фактора VIII, кодируемого указанной последовательностью ДНК,как показано в SEQ ID NO: 4); 6 на фиг. 3 - вектор pTGFG36, кольцевая ДНК длиной 5753 п.н., точная последовательность ДНК которой приведена в SEQ ID NO: 6(основания 689-2071 в SEQ ID NO: 6, кодирующие белок фактора IX); на фиг. 4 - вектор pTG36hyg, кольцевая ДНК длиной 8124 п.н.; на фиг. 5 А - предпочтительная линкерная последовательность согласно данному изобретению (SEQ ID NO: 9); на фиг. 5 В - время коагуляции для рекомбинантного hFVIII, которое определено в примере 6; на фиг. 6 - общая молекулярная структураpTGF8-2hyg-s и pTGF8-3, кольцевой ДНК длиной 10698 п.н., точная последовательность ДНК которых приведена в SEQ ID NO: 12 и 14 (последовательность белка фактора VIII, кодируемого указанной последовательностью ДНК,приведена в SEQ ID NO: 13 и 15); на фиг. 7 А - калибровочная кривая дляELISA фактора FVIII, которая описана в примере 5; На фиг. 7 В изображены результаты определения концентраций рекомбинантного FVIII в разных фильтратах культур, как описано в примере 5. на фиг. 8 - результаты специфичного иммунофлуоресцентного анализа фактора VIII,который описан в примере 9. Верхний ряд: клетки 293T, стабильно трансфицированныеpTGF8-3, клон 49/19. Нижний ряд: негативный контроль: нетрансфицированные клетки 293 Т. А и С: белый свет без фильтра; В и D: определение фактора VIII посредством флуоресценции,фильтр 550 нм; на фиг. 9 - влияние термической обработки на активность FIX в фильтрате культуры, как описано в примере 10; на фиг. 10 - зависимость экспрессии активного рекомбинантного фактора IX от добавления витамина К в культуральную среду. Подробное описание изобретения Функционально связанный относится к структурам вектора, в которых промотор локализован в векторе таким образом, что он может стимулировать транскрипцию последовательности ДНК, кодирующей фактор свертывания крови человека. Нефункционально связанный относится к структуре, в которой промотор локализован удаленно от экспрессируемой последовательности гена фактора свертывания крови,так что он не может стимулировать его транскрипцию. Ген относится к последовательности ДНК, кодирующей полипептид, необязательно включающей лидерные или концевые последовательности и интроны и экзоны. Вектор относится к любой генетической конструкции, такой как плазмида, фаг, космида и т.д., которая способна к репликации в том случае, когда связана с соответствующими ре 7 гуляторными элементами. Термин включает в себя клонирующие и экспрессирующие носители. Перенос вектора включает в себя как стабильное, так и временное внедрение функциональных фрагментов ДНК в клетку-хозяина. Однако предпочтительно стабильное внедрение. Вектор переноса генов согласно данному изобретению включает в себя вектор, подходящий для генотерапии. Такой вектор содержит функциональные последовательности для требуемых целей, которые известны в данной области. Термин зрелый относится к молекулярной структуре данного белка непосредственно после его секреции из клеток (т.е. к структуре, в которой отсутствует N-концевой полипептид,являющийся сигналом для экспорта). Промотор относится к участку регуляторных последовательностей ДНК для регуляции транскрипции гена, с которым связываются РНК-полимеразы. Терапевтически эффективная доза фармацевтической композиции согласно изобретению относится к дозе, эффективной при лечении или профилактике, например, к дозе, которая обеспечивает эффективное лечение или ослабление симптомов гемофилии. Определение терапевтически эффективной дозы находится в компетенции специалиста в данной области. Кодирует или кодирующий относится к свойству последовательности нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) или транслируется (в случае РНК) в полипептид in vitro или in vivo в том случае, когда помещена под контроль соответствующей регуляторной последовательности. Для целей данной заявки экспрессируют, экспрессирующий или экспрессия относится к транскрипции и трансляции гена, кодирующего белок. Данное изобретение, которое описано выше в (1)-(13), далее описывается более подробно. Согласно варианту (1) изобретения, описанного в данной заявке, промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей фактор свертывания крови человека, не является вирусным промотором, который стимулируется, по меньшей мере, одним белкомактиватором транскрипции, экспрессируемым в линии иммортализованных клеток человека. Иммортализованной линией клеток человека предпочтительно является иммортализованная клетка почки, мочевого пузыря, печени,легкого, сердечной мышцы, гладкой мышцы,яичника или желудочно-кишечного тракта. Более предпочтительно линией иммортализованных клеток человека является линия, полученная из клетки эмбриональной почки человека, и наиболее предпочтительно она является линией клеток 293 Т (ЕСАСС; tsa201, ref. 96121229; 8 По меньшей мере один белок-активатор транскрипции, экспрессируемый линией иммортализованных клеток, включает Т-антиген вируса обезьян, белки Е 1 А или Е 1 В аденовируса,белок, кодируемый последовательностью ДНК раннего участка вируса папилломы быка и белки IE вируса герпеса. Предпочтительно иммортализованная клетка экспрессирует по меньшей мере два вирусных белка-активатора транскрипции, например, температурочувствительный Т-антиген SV40 и белок Е 1 А аденовируса(такая, как указанная выше линия клеток 293 Т). Промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей фактор свертывания крови человека, предпочтительно включает(i) вирусные промоторы, не стимулируемые белком-активатором, экспрессируемым иммортализованной клеткой, который определен выше (такие как SV40 и CMV);(ii) промоторы-хозяева генов домашнего хозяйства (альбумин); и(iii) тканеспецифичные промоторы (такие как -антитрипсин для печени). Наиболее предпочтительным промотором согласно изобретению является промотор CMV (так как белок активатора транскрипции, экспрессируемый иммортализованной клеткой, не стимулирует указанный промотор). Согласно изобретению вектор может нести дополнительные вирусные промоторы, которые стимулируются указанными вирусными белками-активаторами транскрипции, но которые не связаны функционально с фактором свертывания крови. Такие вирусные промоторы выбраны из промоторов, полученных из аденовируса,вируса саркомы Рауса и цитомегаловируса. Вектор может дополнительно включать один или более из следующих функциональных последовательностей: маркеры селекции, регуляторные последовательности (например, PRE), и т.д. Фактор свертывания крови человека согласно варианту (1) изобретения включает, но не ограничен указанным, фактор IX, факторVIII, фактор VII, фактор V, фактор фон Виллебранда (vWF) и тому подобное. В предпочтительном варианте (2) изобретения вектор содержит последовательность ДНК, кодирующую фактор VIII или его мутеин. Тогда как рекомбинантный фактор IX в общем структурно идентичен белку дикого типа, выделенному из плазмы крови, для рекомбинантной экспрессии сконструировано несколько модифицированных конструкций, экспрессирующих фактор VIII. При анализе доменной структуры функционального полипептида фактора VIII важные сайты взаимодействия с vWF локализованы в домене A3 (аминокислоты 1680-1689) и в домене С 2 (Kaufman and Pipe, Haemophilia(1998) 4, 370-379). Предполагалось, что расщепление после 1689 высвобождает фактор VIII от связи с vWF и позволяет фактору VIII взаимо 9 действовать с заряженными фосфолипидами. Показано, что конструкции рекомбинантного фактора VIII, в которых отсутствует сайт связывания vWF, крайне подвержены протеолитическому расщеплению при инъекции мышам с дефицитом фактора VIII. Рекомбинантная экспрессия конструкций укороченного фактораVIII в культурах клеток млекопитающих показала, что полная делеция В-домена не изменяла биологическую активность соответствующего белка, подобного фактору VIII (Eaton et al., Biochemistry (1986) 25, 8343-8347). Кроме того,наблюдаемые степени экспрессии конструкций с делетированным В-доменом были значительно выше по сравнению с фактором VIII дикого типа вследствие повышенного уровня мРНК в клетках (Pittman et al., Blood (1993) 81, 29252935). В настоящее время на рынке имеется четыре рекомбинантных продукта фактора VIIIWyeth, Genetics Institute). В предпочтительном варианте (3) изобретения мутеин фактора VIII содержит по меньшей мере одну из следующих мутаций (а)-(d):(a) Val в положении 162 заменен остатком другой нейтральной аминокислоты;(b) Ser в положении 2011 заменен остатком другой гидрофильной аминокислоты;(c) Val в положении 2223 заменен остатком другой кислой аминокислоты; иGlu1649 был заменен линкерным пептидом, богатым Arg, содержащим от 10 до 25, предпочтительно от 14 до 20 аминокислотных остатков,при этом указанная нумерация для фактора VIII соответствует аминокислотной последовательности фактора VIII дикого типа, показанной вSEQ ID NO: 2 (являющейся аминокислотной последовательностью зрелого пептида, не содержащего 19 аминокислот сигнального пептида, но содержащего полный В-домен (WO 99/29848. Остаток другой нейтральной аминокислоты согласно данному изобретению включаетGly, Ala, Leu, Ile, Met и Pro и предпочтительно является Ala. Другая гидрофильная аминокислота включает Asn, Thr и Gln и предпочтительно является Asn. Остаток кислой аминокислоты выбран из Glu и Asp и предпочтительно представляет собой Glu. Среди мутеинов фактора VIII согласно варианту (3) предпочтительно, чтобы мутеин фактора VIII имел по меньшей мере одну из мутаций (а), (b) и (с), более предпочтительно по меньшей мере одну из мутаций (а) и (b) и наиболее предпочтительно все три мутации (а)-(с),которые определены выше. Особенно предпочтительно, чтобы мутеин содержал все три мутации V162A, S2011N и V2223E. По тому же признаку последовательность ДНК, включенная в состав вектора согласно 10 варианту (4) изобретения, имеет мутации Т 485 С, G6032A и Т 6668 А по сравнению с последовательностью ДНК зрелого фактора VIII дикого типа, показанной в SEQ ID NO: 1. В предпочтительном варианте последовательность ДНК также содержит молчащую (т.е. не проявляющуюся) мутацию Т 6816 С (и опять указанная нумерация приведена относительно последовательности ДНК зрелого фактора VIII дикого типа). Среди мутеинов фактора VIII согласно варианту (3) в альтернативном случае предпочтительно, чтобы мутеин фактора VIII имел мутацию (d), определенную выше. Предпочтительная система экспрессии согласно изобретению использует уникальный мутеин фактора VIII, в котором - кроме точечной мутации (а)-(с), которая охарактеризована здесь выше - частично или полностью отсутствует его В-домен, предпочтительно мутеин, в котором В-домен между положениями R740 и Е 1649 заменен характерным аминокислотным спейсером, богатым Аrg, который охарактеризован в (d) выше. Богатый Аrg согласно данному изобретению означает, что указанный спейсер содержит по меньшей мере 3, предпочтительно по меньшей мере 4 остатка Arg. В наиболее предпочтительном варианте указанный спейсер состоит из восьми аминокислот Вдомена дикого типа, за которыми следуют восемь аминокислот вариабельного домена (см. фиг. 5 А, SEQ ID NO: 9). В такой конструкции,имеющей модификации В-домена, обсуждавшиеся выше, предполагаемый сайт связыванийvWF остается неизменным, чтобы предотвратить немедленное протеолитическое расщепление секретируемого фактора VIII в среде культивирования клеток или позже в крови пациентов, подвергаемых лечению. Только после специфичной активации при расщеплении тромбином фактор VIII будет освобождаться от vWF. кДНК предпочтительного фактора VIII конструировали посредством сборки четырех фрагментов ДНК, например, как описано в примере 1. Белок варианта (3) согласно изобретению может содержать дополнительные N- или Сконцевые последовательности, включая, но не ограничивая указанным, природный сигнальный пептид для экспорта (соответствующий аминокислотным остаткам от -19 до -1 белков, показанных в SEQ ID NO: 4, 13 и 15) или его фрагмент или аналог, искусственные пептиды (например, олиго-His-метки для высокоаффинной очистки) и тому подобное. Наиболее предпочтительным вектором для экспрессии фактора VIII является векторpTGF8-l, показанный на фиг. 2. Последовательность ДНК указанного вектора показана в SEQID NO: 3, и она включает в себя все пять мутаций, указанных выше (мутеины Т 485 С, G6032A,Т 6668 А и Т 6816 С (здесь: Т 1217 С, G4088A,Т 4724 А и Т 4872 С) и последовательность ДНК, 11 кодирующую линкер В-домена SEQ ID NO: 9) и кодирует мутеин фактора VIII, изображенный вSEQ ID NO: 4. Кроме того, наиболее предпочтительными векторами являются pTGF8-2hyg-s и pTGF8-3,общая молекулярная структура которых изображена на фиг. 6.pTGF8-2hyg-s, показанная в SEQ ID NO: 12, содержит только молчащую мутацию Т 6816 С, результатом которой является мутеин фактора, имеющий замену В-домена линкерным пептидом SEQ ID NO: 9, но не имеет, кроме этого, изменения в первичной структуре белка по сравнению с последовательностью дикого типаpTGF8-3, показанная в SEQ ID NO: 14, содержит мутации Т 485 С, Т 6668 А и Т 6816 С, результатом которых является мутеин фактораV162A и V2223E по сравнению с SEQ ID NO: 2,в дополнение к замене В-домена, которая описана выше. В случае получения фактора VIII культивирование проводят в присутствии фактора фон Виллебранда. Фактор фон Виллебранда предпочтительно используют в количестве от 10 до 100, более предпочтительно от 50 до 60 мольvWF на моль фактора VIII (в культуральном бульоне и/или в растворе фактора VIII во время процедуры очистки (см. ниже. В предпочтительном варианте (4) данного изобретения фактором свертывания крови человека является фактор IX или его мутеин, предпочтительно фактор IX дикого типа, показанный в SEQ ID NO: 5. Подходящие мутеины фактора IX включают формы с точечными мутациями и укороченные формы фактора IX. Наиболее предпочтительными векторами для экспрессии фактора IX являются векторы pTGFG36 и pTG36hyg, показанные на фиг. 3 и 4 соответственно. В случае получения фактора IX культивирование предпочтительно проводят в присутствии витамина К, который может присутствовать в количестве от 0,1 до 100 мкг/мл культурального бульона, более предпочтительно от 1 до 20 мкг/мл культурального бульона. Способ согласно варианту (1) изобретения дополнительно включает следующие стадии:(c) очистку фактора свертывания крови,выделенного на стадии (b), и/или(d) обработку фактора свертывания крови,выделенного на стадии (b) или очищенного на стадии (с), для инактивации вируса. Подходящие стадии очистки включают способы, которые известны в данной области,чтобы сделать максимальным выход чистого,стабильного и высоко активного продукта, и выбраны из иммуноаффинной хроматографии,анионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии по размеру, и т.д. и их комбинаций. В частности, подробные протоколы 12 очистки коагулирующих факторов из плазмы крови человека, например, описаны в WO 93/15105, ЕР 0813597, WO 96/40883 и WO 96/15140/50. Эти протоколы можно легко адаптировать для конкретных требований, необходимых для выделения рекомбинантных факторов VIII и IX. Для фактора IX был внедрен эффективный протокол, состоящий из стадии осаждения сульфатом аммония с последующейDEAE-хроматографией и хроматографией, основанной на взаимодействии со щупальцами гидрофобных радикалов, а также аффинной хроматографией с гепарином (US 5919909). Количество и активность очищенного белка во время и после процедуры очистки можно контролировать посредством ELISA и анализа коагуляции. Для преодоления проблем возможных инфекционных загрязнений в очищенных образцах белка или в продукте, непосредственно полученном из надосадка культуры клеток, содержащего выбранный секретируемый рекомбинантный белок, образцы и/или надосадок культуры можно обработать способами инактивации вирусом, включая тепловую обработку (в сухом или жидком состоянии, с добавлением или без добавления химических веществ, включая ингибиторы протеаз). После инактивации вирусов может быть необходима дополнительная стадия очистки для удаления химических веществ. В частности для фактора VIII, выделенного из плазмы крови, описано выделение белка высокой чистоты после инактивации вируса с помощью анионообменной хроматографии (WO 93/15105). Кроме того, сообщалось о нескольких способах получения неинфекционных коагулирующих факторов высокой чистоты из плазмы крови или других биологических источников. Вирусы, покрытые липидами, эффективно инактивируют обработкой потенциально инфекционного материала гидрофобной фазой с образованием двухфазной системы, из которой затем удаляют нерастворимую в воде часть. Показано еще одно преимущество дополнения обработки гидрофобной фазой одновременной или последовательной обработкой неионными биосовместимыми детергентами и диалкил- и триалкилфосфатами. (WO 9636369, ЕР 0131740, US 6007979). Не покрытые липидами вирусы требуют использования протокола инактивации,заключающегося в обработке неионными детергентами с последующей стадией нагревания (6065 С) в течение нескольких часов (WO 94/17834). Принимая во внимание указанные выше результаты, предполагается, что комбинирование эффективной системы экспрессии белка,основанной на линии клеток человека, с усовершенствованными способами инактивации потенциально опасных инфекционных агентов,служит в качестве безопасной и легкой в при 13 менении системы получения рекомбинантных факторов свертывания. Кроме того, согласно варианту (6) изобретения предоставляется вышеупомянутый мутант фактора VIII. Указанный мутант фактора VIII может являться частью фармацевтической композиции, его можно использовать для получения лекарственных средств для лечения гемофилии и можно использовать в способах лечения гемофилии (варианты изобретения (11)(13. Указанные выше фармацевтические композиции и указанные выше лекарственные средства могут содержать, фактор VIII в терапевтически эффективной дозе, например, от 50 до 500 мкг (при этом 200 нг фактора VIII соответствуют одной международной единице (IU. В зависимости от типа гемофилии пациент получает ежегодную дозу фактора VIII до 200000 IU, которую обычно вводят еженедельными дозами или дозами дважды в неделю. Фармацевтические композиции, лекарственные средства или препараты, применяемые в способах лечения гемофилии согласно вариантам (11)-(13), содержат терапевтически эффективную дозу мутеина фактора VIII согласно варианту (6) или вектора для переноса гена согласно варианту (9). В первом случае они могут,кроме того, содержать фармацевтически приемлемые добавки, включая сывороточный альбумин человека (САЧ, предпочтительно раствор в концентрации примерно 1 мг/мл); неорганические соли, такие как CaCl2 (предпочтительно от 2 до 5 мМ), аминокислоты, такие как глицин,лизин и гистидин (предпочтительно от 0,1 до 1 М на аминокислоту); дисахариды, такие как сахароза и/или трегалоза (предпочтительно от 0,4 до 1 М); органические соли, такие как Naцитрат (предпочтительно до 50 мМ) и т.д. Препараты могут быть водными и неводными. В последнем случае основным компонентом является глицерин и/или полиэтиленгликоль (например, ПЭГ-300). Препарат также может быть в сухой форме (который перед введением надо растворять в требуемом растворителе). Как указано выше, вектор переноса генов согласно варианту (9) изобретения, также может быть частью фармацевтической композиции,его можно использовать для получения лекарственных средств для лечения гемофилии и можно применять в способах лечения гемофилии(варианты изобретения с (11)-(13. Указанные фармацевтические композиции и лекарственные средства, кроме того, могут содержать подходящие матричные составы, например, липиды или гормоны, как обсуждалось в заявке WO 00/49147 (описание которой включено здесь в виде ссылки). Фармацевтическую композицию или лекарственное средство, содержащее вектор переноса генов, или вектор переноса генов согласно данному изобретению можно вводить перорально, внутривенно, внутримышечно,подкожно, местно, через слизистую оболочку(включая трансбуккальное введение, назальный спрей) или генным пистолетом. Предпочтительно пероральное введение (например, в тонко измельченной гормональной дисперсии). Мутеин фактора VIII согласно варианту (6) изобретения предпочтительно является мутеином, определенным согласно варианту (3) выше. Указанный мутеин FVIII, кроме того, можно получить стандартными рекомбинантными способами, например, способом, включающим(a) культивирование клетки-хозяина,трансформированной вектором согласно варианту (8) и/или содержащему ДНК согласно варианту (7) (что также включает культивирование линии иммортализованных клеток человека,стабильно экспрессирующих по меньшей мере один вирусный белок активатора транскрипции и несущих вектор, имеющий вирусный промотор транскрипции, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей фактор свертывания крови человека, при этом указанный вирусный промотор стимулируется по меньшей мере одним указанным вирусным белком активатора транскрипции); и(b) выделение фактора свертывания крови из культурального бульона. Подходящие линии иммортализованных клеток человека, белков активаторов транскрипции и вирусных промоторов указаны в данном описании выше. Линия иммортализованных клеток человека в указанном способе предпочтительно экспрессирует два вирусных белка-активатора транскрипции,наиболее предпочтительно температурочувствительный Т-антиген SV40 и белок Е 1 А аденовируса. Способ может дополнительно включать стадии очистки и инактивации вирусов (с) и (а),описанные здесь выше. Коммерчески доступная линия клеток 293 Т (ЕСАСС: tsa201, ref. 96121229) депонирована в DMSZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany) 20 февраля 2001 г. под депозитарным номером DSMACC2494. Далее изобретение иллюстрируется следующими примерами. Примеры Пример 1. Клонирование фактора VIII. Последовательность рекомбинантного фактора VIII получали обратной транскрипцией из полного пула РНК клеток печени человека. Затем четыре фрагмента (1/2, 3/4, 5/6, 7/8) амплифицировали стандартной ПЦР с использованием праймеров, сконструированных так, чтобы они содержали сайты рестрикции. Чтобы собрать вместе фрагменты 3/4 и 5/6, SmaI/SalIфрагмент из плазмиды pBSFVIII3/4 встраивали тупыми концами в SalI-сайт pBSFVIII5/6, чтобы получить pBSFVIII3/6. Затем получали фрагмент 3/6 расщеплением pBSFVIII3/6 с помощьюXhoI, получая таким образом pBSFVIII1/6. Фрагмент 7/8 получали расщеплениемMva1269I, и лигировали в pBSFVIII1/6, разрезанный XhoI и Mva1269I, получая pBSFVIII1/8. Наконец Smal/XhoI-фрагмент из pBSFVIII1/8 встраивали тупыми концами в SalI-сайт вектораOctagene pTGFG67 (получение указанного вектора обсуждается в РСТ/ЕР 00/01368), получая в результате эукариотический вектор экспрессии фактора VIII человека pTGF8-1 (см. фиг. 1 и 2). Полученный в результате вектор кодирует мутеин фактора VIII, имеющий мутации V162A,S2011N и V2223E. Пример 2. Клонирование фактора IX. Вектор pUC19 (MBI Fermentas) расщепляли XbaI, обрабатывали ферментом Кленова и снова лигировали. Указанный делетированныйXbaI вектор затем расщепляли EcoRI, обрабатывали ферментом Кленова и снова лигировали для того, чтобы делетировать сайт EcoRI. Для встраивания XbaI-сайта в SacI-сайт указанного вектора его расщепляли SacI, обрабатывали ДНК-полимеразой Т 4, дефосфорилировали щелочной фосфатазой и лигировали с XbaIлинкером CTCTAGAG (Biolabs1032). ДругойXbaI-сайт встраивали расщеплением нового полученного вектора, используя HindIII, обработкой фрагментом Кленова, его дефосфорилированием щелочной фосфатазой и его лигированием с XbaI-линкером CTCTAGAG (Biolabs1032). Полученный вектор назвали pUC19/X. Для того чтобы ликвидировать XbaI-сайт,присутствующий в векторе phGFP-S65T (Clontech), указанный вектор расщепляли XbaI, обрабатывали ферментом Кленова и снова лигировали, получая в результате вектор pGFP/0. Выделяли фрагмент длиной 2,3 т.п.н., содержащий ген GFP, после расщепления pGFP/0 посредством MluI, обработки ферментом Кленова и расщепления BamHI. Полученный фрагмент встраивали в сайт множественного клонирования вектора pUC19/X, который расщепляли SalI,обрабатывали ферментом Кленова и расщепляли BamHI. Полученный в результате вектор назвали pTGFG1. Олигонуклеотиды (Metabion) PRE-S (5'GGG GTA CCA GCT TCG TAG СТА GAA CATCGA AGC TGG TAC CCC-3'; SEQ ID NO: 11) гибридизовали и фосфорилировали посредством киназной реакции, получая в результате вставкуPRE(ds). Вектор pTGFGl расщепляли Есо 0109I, обрабатывали ферментом Кленова и дефосфорилировали щелочной фосфатазой. Затем его ли 004317 16 гировали со вставкой PRE(ds), получая в результате вектор pTGFG5. Вектор pUC19 (MBIFermentas) расщепляли SalI, обрабатывали ферментом Кленова и дефосфорилировали щелочной фосфатазой. Его лигировали с NotIлинкером GCGGCCGC (Biolabs1045), в результате получая вектор pUC19/N. кДНК фактора IX амплифицировали из кДНК печени человека (Clontech), используя два праймера, перекрывающих стартовый кодон и кодон терминации открытой рамки считывания фактора IX, получая в результате фрагмент длиной 1387 п.н., содержащий полную открытую рамку считывания. Сайты рестрикции EcoRIMgSO4] в течение 30 циклов инкубации при 96 С в течение 1 мин, 60 С в течение 1 мин,72C в течение 2 мин, с последующей конечной стадией элонгации при 72 С в течение 10 мин. Продукты реакции лигировали в EcoRI- иBamHI-сайты pUC19 и трансформировали в Е.coli DH5-. Отбирали позитивные клоны. Последовательности подтверждали циклическим секвенированием (Amersham) с обоих концов с мечеными праймерами (IR-700) и автоматизированным анализом в системе секвенированияTTTCCTTAATCC (нижний, SEQ ID NO: 17). Фрагмент длиной 1,4 т.п.н, содержащий открытую рамку считывания фактора свертывания IX человека, выделенный из библиотеки кДНК, встраивали в PstI-сайт полученного как указано выше вектора pUC19/N, который расщепляли PstI, обрабатывали полимеразой Т 4 и дефосфорилировали щелочной фосфатазой. Из полученного в результате вектора pUC19/N-FIX вырезали фрагмент длиной 1,4 т.п.н, содержащий открытую рамку считывания фактора свертывания IX человека, двойным расщеплениемHindIII и NotI. Полученный фрагмент лигировали с фрагментом длиной 4,3 т.п.н. дважды расщепленного HindIII и NotI вектора pTGFG5,получая вектор pTGFG36, показанный на фиг. 3. Указанный вектор является предпочтительным вектором для доставки в клетку экспрессирующей кассеты, кодирующей фактор IX, и последовательность его ДНК приведена в SEQ ID NO: 6. Пример 3. Линия клеток человека для экспрессии белка. Предпочтительной линией клеток являетсяtsA201 (ECACC ref.: 96121229), которая пред 17 ставляет собой линию трансформированных эмбриональных клеток почки человека (293,ЕСАСС номер 85120602), стабильно экспрессирующей температурочувствительный Т-антигенPflugers Arch. 1994; 427: 136; J. Gen. Physiol. 1994; 104: 507; BioTechniques 1993; 15: 906). Другие названия данной линии клеток включают 293tsA1609neo (Mol. Cell. Biol., 1987, 7: 379) и 293 Т. Указанную линию клеток, подобных эпителиальным клеткам, использовали в различных функциональных анализах экспрессии,и сообщалось, что они продуцируют высокие уровни рекомбинантных белков. Эти клетки можно культивировать в DMEM с добавлением 2 мМ глутамина и 10% FCS. Для эффективной продукции фактора IX среду можно модифицировать добавлением до 100 мкг/мл витамина К(US 4770999). Чтобы упростить очистку экспрессируемого полипептида клетки можно культивировать в бессывороточной и не содержащей белков среде, содержащей соответствующие добавки. Для стабильности секретируемый фактор VIII должен находиться в среде vWF (US 5198349). Также сообщалось о добавлении липопротеинов, фосфолипидов, полигликолей, следовых количеств металлов, гепарина, неионных поверхностно-активных веществ или циклодекстрина (ЕР 0254076, US 5679549, US 5198349, US 5250421, US 5576194, ЕР 0872487, WO 94/11525,US 5378612). Пример 4. Трансфекция с помощью фосфата кальция клеток 293 Т для временной продукции факторов VIII и IX. Клетки 293 Т после слияния в монослой помещали при низкой плотности в чашки диаметром 10 см в 6 мл DMEM/10% FCS (10 мкг/мл витамина К в случае FIX) за день до трансфекции. Трансфекцию проводили в основном согласно Chen and Okayama (Mol. Cell Biol., 7: 2745 (1987. Трансфицировали 12 мкг плазмиды pTGF8-1 для продукции фактора VIII иpTGFG36 для продукции фактора IX. Через 6 ч после трансфекции среду заменяли свежей средой и через три дня после трансфекции собирали надосадок и далее либо очищали, либо анализировали без дальнейшей очистки с помощьюELISA или коагулометрии (см. примеры 5 и 6). Пример 5. Определение концентрации FIX и FVIII посредством ELISA. Фактор IX. Уровни рекомбинантного фактора IX человека в надосадке трансфицированных клеток 293 Т определяли посредствомELISA, используя поликлональное козье антитело против FIX человека (Enzyme ResearchLaboratories) в качестве антитела для захвата. Все инкубации проводили в течение 2 ч в увлажненной камере при 22 С. Планшеты (Dynex,Immulon-4) покрывали 100 мкл покрывающего буфера, содержащего 8,8 мкг антитела/мл. При 18 описанных условиях блокирование не требовалось. Промывка планшета четыре раза (Encore 2000, Merck) PBS-Tween (0,1% об./об.) достаточна для того, чтобы блокировать неспецифические взаимодействия. После каждой следующей стадии требовалась промывка, чтобы удалить несвязанные белки. В каждую лунку добавляли 100 мкл надосадка, обработанного 10 мкл 10 мМ PMSF и 10 мкл 0,11 М цитрата натрия. Разведения образцов и стандарта (фактор IX человека, фирменный стандарт, Octapharma) делали в буфере для разведения (HBS-BSA-EDTA-Tween) и инкубировали по 100 мкл/лунку. Регистрирующим антителом было меченое пероксидазой поликлональное козье антитело против FIX (Enzyme Research Laboratories) в концентрации 1 мкг антитела/мл буфера разведения, и вносимое для инкубации по 100 мкл/лунку. В качестве субстрата в каждую лунку добавляли 150 мклABTS (Roche), колориметрическую реакцию детектировали при 405 нм через 1-2 ч. Результаты рассчитывали относительно линейной регрессии концентрации стандарта против оптической плотности стандарта и суммировали в виде следующей таблицы: Количество клеток, /мл 2,1105 8,7105 Концентрация фактора Время свертывания,IX, нг/мл с 36 45 20 79 Нормальная плазма: 37-39 с Плазма, дефицитная по фактору IX: 137-140 с Фактор VIII. Уровни рекомбинантного фактора VIII человека в фильтрате культуры трансфицированных клеток 293 Т определяли посредством ELISA, используя аффинно очищенный поликлональный овечий анти-FVIII:Спрепарат (F8C-EIA-C, Affinity Biologicals) в качестве антитела для захвата. Покрытие осуществляли в течение 2 ч во влажной камере при 22 С. Планшеты (Dynex, Immulon-4) покрывали 100 мкл 100-кратно разведенного антитела в покрывающем буфере (50 мМ карбонат натрия рН 9,6). Промывка планшета четыре раза (Encore 2000, Merck) PBS-Tween (0,1% об./об.) была достаточной для того, чтобы блокировать неспецифичные взаимодействия. После каждой следующей стадии требовалась промывка, чтобы удалить несвязанные белки. В каждую лунку добавляли по 100 мкл каждого из образцов фильтрата культуры, взятых из разных клонов 293 Т, стабильно трансфицированных pTGF8-3, после 48 ч инкубации. Разведения стандарта VIII (фирменный стандарт, Octapharma) делали в буфере для разведения (HBS-BSA-EDTA-Tween) и инкубировали по 100 мкл/лунку. Для детекции инкубировали с 100 мкл на лунку готового к применению разведения меченого пероксидазой поликлонального антитела против FVIII (F8C-EIA-D, Affinity Bi 19ologicals) в течение 60 мин. Для колориметрической реакции таблетку 5 мг о-фенилендиамина(Р-6912, Sigma) растворяли в 12 мл субстратного буфера непосредственно перед использованием, и добавляли 12 мкл 30% H2O2. В каждую лунку добавляли 150 мкл полученного раствора субстрата, и определение колориметрической реакции проводили в регистрирующем устройстве MRX (Dynex) при 490 нм после инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте и остановки реакции добавлением в каждую лунку 50 мкл 2,5 М H2SO4. Результаты рассчитывали относительно линейной регрессии концентраций стандарта против оптической плотности стандарта (фиг. 7 А) и суммировали на фиг. 7 В. Пример 6. Определение активности фактора VIII и фактора IX свертывания крови человека. Коагулирующую активность рекомбинантного фактора VIII человека в надосадках клеточной культуры клеток 293 Т (трансфицированных pTGF8-1 методом преципитации фосфатом кальция, как описано в примере 4) определяли следующим образом. Коагулирующую активность анализировали на основании анализа частичного тромбопластинового времени с использованием активации цефалином (фосфатидилэтеноламин) с помощью ручного прибора для измерения коагуляции (ML-2, Instrumentation Laboratories). Для исследования 100 мкл не разведенного надосадка трансфицированных клеток 293 Т, 100 мкл дефицитной плазмы (Рrogen) и 100 мкл цефалина (Instrumentation Laboratories) инкубировали в течение 5 мин при 37 С. Коагуляцию начинали добавлением 100 мкл CaCl2. Время коагуляции образца сравнивали с нормальной плазмой. Результаты суммированы на фиг. 5 В. На фиг. 5 В можно видеть, что надосадок клеток в случае клеток, трансфицированных pTGF8-1, проявляет коагулирующую активность, сравнимую с активностью нормальной плазмы, тогда как нетрансфицированные клетки дают значение, равное значению плазмы, в которой отсутствует фактор VIII. Сходный анализ выполняли по отношению к фактору IX. Результаты показаны в таблице примера 5. Зависимость экспрессии от наличия витамина К показана на фиг 10. Пример 7. Инактивация вирусов. Инактивацию вирусов проводили согласно способу, описанному в патенте США 6007979. А именно, к раствору потенциально инфекционных белков при перемешивании последовательно добавляли следующие соединения: 1. 0,2 мл Tween-80 и 0,06 мл TNBP добавляли к 19,74 мл раствора или 2. 0,2 мл Triton X-100 и 0,2 мл TNBP добавляли к 19,6 мл раствора. 20 К препаратам 1 и 2 добавляли 1 мл касторового масла и затем интенсивно экстрагировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Для разделения фаз в каждом случае проводили центрифугирование. Для проверки инфекционности из водной фракции несколько раз отбирали образцы по 1 мл каждый. Пример 8. Создание линий клеток, стабильно экспрессирующих фактор VIII и факторpTGFG36 содержат конструкции для временной экспрессии соответственно фактора VIII и фактора IX в клетках млекопитающих. Чтобы обеспечить применение способа селекции стабильно трансфицированного клона клеток кассету гигромицин-В-фосфотрансферазы(HindIII-Mva 1260I-фрагмент из ТK-Нyg, Clontech) субклонировали в SmaI-сайте, присутствующем в обоих векторах. В таком случае полученные в результате конструкции (pTGF8-1-hyg и pTG36hyg) содержат в цис-положении кассеты, экспрессирующие фактор VIII или фактор IX человека, сCMV-промотором и сигналом полиаденилирования SV40, и кассету, экспрессирующую гигромицин-В-фосфотрансферазу с промотором тимидинкиназы HSV и сигналом полиаденилирования тимидинкиназы HSV (см. фиг. 4). Векторы pTGF8-2hyg-s и pTGF8-3 (фиг. 6,SEQ ID NO: 12 и 14) являются производнымиS2011N (pTGF8-3) ревертировали к последовательности дикого типа зависимым от ПЦР способом с использованием протокола QuikChange (Stratagene). Кодирующую последовательность факторов свертывания можно заменить любой другой генной последовательностью по выбору. Указанные конструкции позволяют создавать стабильно экспрессирующие линии клеток путем трансфекции с фосфатом кальция и последующей селекции на устойчивость к гигромицину. Плазмиды дополнительно содержат элемент,реагирующий на прогестерон (PRE). В экспериментах по временной трансфекции pTG36hyg с помощью ELISA и коагулометрического анализа можно наблюдать продукцию примерно 40 нг активного фактора IX в мл культуральной среды(см. примеры 5 и 6). Для получения фактора IX клетки 293 Т культивировали в DMEM с добавлением 10%FCS и 10 мкг/мл витамина К (патент США 4770999; кроме того см. фиг. 10). Сначала необходимо было установить критическую концентрацию антибиотиков для эффективной селекции стабильно трансфицированных клеток 293 Т. С этой целью клетки высевали при небольшом разведении и выращивали в присутствии гигромицина В в концентрации от 10 до 800 мкг/мл. Спустя две недели при концентрации 200 мкг/мл или выше клетки не росли, таким 21 образом, указанную концентрацию выбрали для селекции стабильно трансфицированных клеток. Типичную трансфекцию проводили в чашках диаметром 10 см с клетками 293 Т, разведенными за день до этого в соотношении 1:15. Используя способ преципитации фосфатом кальция (Biotechniques 1988 6:7, 632-638), проводили трансфекцию 12 мкг плазмиды на чашку и спустя два дня среду заменяли свежей средой,содержащей 200 мкг/мл гигромицина В. После 2-3 недель селекции среду тестировали методомELISA (см. пример 5) на наличие фактора VIII или IX. Выделяли позитивные клоны и переносили в 24-луночный планшет. После скрининга методом ELISA и определения активности позитивные клоны подвергали двум следующим раундам субклонирования, затем размножали и их аликвоты замораживали для дальнейшего использования и характеристики. Пример 9. Доказательство фенотипического единообразия стабильно трансфицированных клеток посредством иммунофлуоресцентной детекции экспрессии фактора VIII in situ. Каждую партию 5107 клеток 293 Т, стабильно трансфицированных pTGF8-3 (клон 49/19) и нетрансфицированных клеток 293 Т (негативный контроль) из адгезионных культур вDMEM + 9,1% FBS снимали с культуральных чашек трипсинизацией, несколько раз промывали и снова суспендировали в 5 мл буфера PBS. 2 мкл полученных суспензий клеток переносили на стерильные предметные стекла для микроскопа и инкубировали при комнатной температуре пока не испарится вся жидкость. Клетки фиксировали в 70% этаноле в течение 10 мин и сушили 5 мин при комнатной температуре. Стекла блокировали, чтобы избежать неспецифичного выявления, посредством инкубации в 10% разведении FBS в буфере PBS. Первичное антитело (овечье анти-FVIII:С F8C-EIA-C, Affinity Biologicals) 100-кратно разводили в буфером PBS, содержащим 10% FBS и 0,1% сапонина, и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре во влажной инкубационной камере. После интенсивной промывки PBS, готовили 100-кратное разведение вторичного антитела (кроличье антитело против конъюгата СY3 овцы 313-165-003, Jackson ImmunoResearch) и инкубировали способом, описанным выше. Затем препараты для микроскопа интенсивно промывали и покрывали слоем 50% глицерина и покровным стеклом. Клетки визуально исследовали микроскопией в белом свете и флуоресцентной микроскопией (испускание при 570 нм). Результаты изображены на фиг. 8. Пример 10. Тест на термостабильность рекомбинантного фактора IX в фильтрате культуры. Фильтрат культуры, собранный из клеток 293 Т через 48 ч после временной трансфекцииpTGFG36 в присутствии 100 мкг/мл витамина К и хранившийся при -80 С в течение 7 дней, быстро размораживали, распределяли по аликвотам объемом 7500 мкл, которые затем подвергали следующим термическим инкубациям: Образец 1 2 3 4 5 6 7 Образцы охлаждали на льду и определяли активность FIX, как указано в примере 6 (двойные определения). Результаты показаны на фиг. 9. Активность сохранялась почти стабильной в условиях инкубации вплоть до 240 мин при 37 С. Список последовательностей ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Мутеин фактора VIII, в котором Вдомен между положениями Arg740 и Glu1649 заменен богатым Аrg линкерным пептидом, содержащим по меньшей мере 3 остатка Аrg и включающим 10-25 аминокислотных остатков,при этом нумерация указанного фактора VIII соответствует последовательности зрелого фактора VIII дикого типа, представленной в SEQ IDNO: 2. 2. Мутеин фактора VIII по п.1, отличающийся тем, что имеет по меньшей мере одну из следующих дополнительных мутаций (а), (b) и(a) Val в положении 162 заменен остатком нейтральной аминокислоты, выбранной из Gly,Ala, Leu, Ile, Met и Pro;(b) Ser в положении 2011 заменен остатком гидрофильной аминокислоты, выбранной из(c) Val в положении 2223 заменен остатком кислой аминокислоты, выбранной из Glu и Asp. 3. Мутеин фактора VIII по п.2, отличающийся тем, что имеет по меньшей мере одну из мутаций (а) и (b). 4. Мутеин фактора VIII по п.2, отличающийся тем, что имеет все три мутации (а), (b) и(с). 5. Мутеин фактора VIII по любому из пп.24, отличающийся тем, что при мутации (а) Val в положении 162 заменен на Ala, при мутации (b)Glu. 6. Мутеин фактора VIII по любому из пп.15, отличающийся тем, что богатый Аrg линкерный пептид имеет 14-20 аминокислотных остатков. 7. Мутеин фактора VIII по любому из пп.16, отличающийся тем, что линкер содержит аминокислотную последовательностьSFSQNSRH и/или аминокислотную последовательность QAYRYRRG. 8. Мутеин фактора VIII по п.7, отличающийся тем, что линкер имеет последовательность SFSQNSRHQAYRYRRG. 9. Мутеин фактора VIII по п.1, отличающийся тем, что содержит аминокислоты 1-1440 55 10. Последовательность ДНК, кодирующая мутеин фактора VIII по любому из пп.1-9. 11. Последовательность ДНК по п.10, отличающаяся тем, что содержит по меньшей мере одну из мутаций Т 485 С, G6032A и Т 6668 А по сравнению с последовательностью ДНК зрелого фактора VIII дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, при этом последовательность ДНК предпочтительно содержит все три указанные мутации. 12. Вектор, содержащий ДНК по п.10 или 11. 13. Вектор по п.12, отличающийся тем, что представляет собой pTGF8-1, pTGT8-2hyg-s илиpTGF8-3, представленные в SEQ ID NO: 3, 12 и 14 соответственно. 14. Вектор по п.12, отличающийся тем, что является вектором для переноса генов. 15. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.12 и/или содержащая последовательность ДНК по п.10. 16. Способ получения мутеина фактораVIII по любому из пп.1-9, включающий:(b) выделение мутеина фактора VIII из культуральной среды. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая мутеин фактора VIII по любому из пп.1-9 или вектор для переноса генов по п.14. 18. Применение мутеина фактора VIII по любому из пп.1-9 или вектора для переноса генов по п.14 для получения лекарственного средства для лечения гемофилии, предпочтительно для лечения гемофилии А. 19. Способ по п.16, включающий:(а) культивирование линии иммортализованных клеток человека, стабильно экспресси 004317 56 рующих Т-антиген вируса обезьян и несущих вектор, имеющий промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей мутеин фактора VIII. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что линией иммортализованных клеток человека является иммортализованная клетка почки, мочевого пузыря, печени, легкого, сердечной мышцы, гладкой мышцы, яичника или желудочно-кишечного тракта. 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что линия иммортализованных клеток человека получена из эмбриональной клетки почки человека и предпочтительно является линией клеток 293 Т (DSM ACC2494). 22. Способ по любому из пп.19-21, отличающийся тем, что вектор дополнительно содержит маркер селекции и/или регуляторные последовательности. 23. Способ по любому из пп.19-22, отличающийся тем, что культивирование проводят в присутствии фактора фон Виллебранда (vWF). 24. Способ по любому из пп.16 и 19-23,дополнительно включающий:(с) очистку фактора свертывания крови,выделенного на стадии (b), и/или(d) обработку фактора свертывания крови,выделенного на стадии (b) или очищенного на стадии (с) для инактивации вирусов. 25. Линия иммортализованных клеток человека, стабильно экспрессирующих по меньшей мере один вирусный белок активатора транскрипции и несущих вектор, кодирующий мутеин фактора VIII, определенного способом по любому из пп.19-21.