Набор для переноса гена в клетки-мишени с помощью ретровируса (варианты)

1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к набору для генного переноса в клетки-мишени. Данный набор позволяет эффективно трансформировать клетки-мишени в различных областях техники, таких как медицинская наука, клеточная технология, генная инженерия и технология развития и многими методами с ними связанных. Предпосылки изобретения Благодаря постижению механизмов многих болезней человека, а также быстрому прогрессу в технологии рекомбинантных ДНК и в технологии генного переноса, в последнее время разработали условия применения соматической генной терапии для лечения серьезных генетических болезней. Кроме того, в настоящее время активизировались попытки применить генную терапию не только для лечения генетических болезней, но также для лечения вирусных инфекций, таких как AIDS и рак. Почти все эксперименты по переносу соответствующего гена у человека, одобренные в прошлом Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США) и (FDA), представляют собой трансдукцию клеток с помощью ретровирусных векторов. Ретровирусные векторы могут эффективно переносить нужный экзогенный ген в клетки для стабильной интеграции данного экзогенного гена в хромосомной ДНК, и поэтому, в частности, они представляют собой предпочтительные средства генного переноса для генной терапии,в которой необходима долговременная экспрессия гена. Такие векторы создавали разнообразными способами, чтобы избежать неблагоприятного воздействия на трансдуцируемые организмы. Например, исключали репликационные функции векторов, чтобы предотвратить не ограничиваемую повторяемость заражения(трансдукцию), обусловленную ауторепликацией данных векторов, используемых для переноса гена в клетки. Поскольку эти векторы (дефектные по репликации ретровирусные векторы) не обладают способностью к ауторепликации, обычно, ретровирусные векторы, упакованные в вирусные частицы, получают путем использования клеток-продуцентов ретровируса(упаковывающие клетки). С другой стороны, клетки костного мозга представляют собой хорошую мишень для терапии соматического гена, поскольку с клетками костного мозга легко манипулировать в условиях in vitro и они содержат гемопоэтические стволовые клетки, способные к ауторепликации. Альтернативно, человеческая пуповинная кровь,как ранее было показано, содержит большое количество незрелых предшественников клеток,в том числе, гемопоэтических стволовых клеток. Когда генную терапию осуществляли путем переноса гена в эти клетки-мишени и транс 003204 2 плантировали их в живой организм, перенесенный таким образом ген, экспрессируемый длительное время в кровяных клетках, оказывая пожизненное лечебное действие. Однако, несмотря на интенсивные исследования в разных группах, гемопоэтические стволовые клетки представляют собой клетки,одни из тех, чье эффективное трансдуцирование является трудным. В прошлом наиболее эффективными условиями переноса гена, относящегося к гемопоэтическим стволовым клеткам мыши и других животных, являлось сокультивирование гемопоэтических стволовых клеток с клетками-продуцентами ретровируса. Однако для клинической генной терапии человека более желательна бесклеточная трансдукция, связанная с биологической безопасностью. К сожалению, эффективный перенос гена в гемопоэтические стволовые клетки, как правило, невозможен без сокультивирования с клеткамипродуцентами ретровируса. Недавно было сообщено, что эффективность переноса гена с помощью ретровирусов можно повысить с помощью компонента внеклеточного матрикса, фибронектина, или, исключительно, с помощью его фрагментов (J.Clin. Invest., 93, pp. 1451-1457 (1994); Blood, 88,pp. 855-862 (1996. Кроме того, обнаружили также, что фрагменты фибронектина, полученные с помощью генной инженерии, обладают такими же свойствами и при их использовании может быть осуществлен эффективный перенос экзогенного гена в гемопоэтические стволовые клетки (WO 95/26200). Связывание домена фибронектина, связывающего гепарин, с ретровирусом означает участие фибронектина в таком улучшении эффективности генного переноса. Во всех этих способах, использующих фибронектин и фрагменты фибронектина, клетки инфицировали с помощью ретровирусов на планшетах, на которых иммобилизовали фибронектин или его фрагменты. Цели изобретения Обсуждается осуществление вышеописанных способов переноса гена, с использованием фибронектина и фибронектиновых фрагментов с помощью молекул фибронектина или его фрагментов, обладающих доменом, связывающим ретровирус, и доменом на этой же молекуле, связывающим клетку-мишень (Nature Medicine, 2, pp. 876-872 (1996. Поэтому, для эффективного генного переноса в различные клеткимишени с использованием вышеупомянутого способа, необходимо приготовить функциональный материал, обладающий обоими доменами, связывающим вирус и связывающим клетку-мишень, на одной молекуле, в соответствующих отдельных клетках, и еще остается проблема в его использовании в качестве обычного способа переноса гена. Далее вышеописанный способ генного переноса осуществляют путем иммобилизации 3 фибронектина или фибронектинового фрагмента на поверхности планшета, используемой для культивирования клеток-мишеней после заражения ретровирусами. Однако для иммобилизации на планшете необходимы сложные методики и это не свидетельствует о простоте и удобстве способа переноса гена. Более того, соответствующий функциональный материал, используемый в вышеописанном способе генного переноса, ограничен в том, что имеющийся домен, связывающий гепарин, получают из фибронектина в качестве домена, связывающего ретровирус. Следовательно, существуют возможности создать улучшенный способ переноса гена при обнаружении любого другого вещества, связывающего ретровирус. Цель настоящего изобретения заключается в решении этого вопроса и в создании более удобного и эффективного способа переноса гена. Краткое изложение существа изобретения Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ретровирусное инфицирование с помощью функционального материала, обычно фибронектина или его фрагмента, можно стимулировать, даже когда область, обладающая доменом, связывающим ретровирус, и область,обладающая доменом, связывающим клетку, не представлены на одной и той же молекуле. Другими словами, авторы настоящего изобретения обнаружили, что эффективность переноса гена с помощью ретровирусов в клетки-мишени можно повысить путем использования эффективного количества функционального материала, содержащего домен, связывающий ретровирус,смешанного с функциональным материалом,обладающим доменом, связывающим клеткумишень. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили также, что ретровирусная инфекция, усиливающая активность с помощью функционального материала, может наблюдаться даже когда этот функциональный материал не иммобилизован на поверхности планшета. Авторы настоящего изобретения обнаружили,кроме того, что эффективность переноса гена в клетки-мишени можно повысить путем контактирования ретровирусов с этими клеткамимишенями в присутствии функционального материала, иммобилизованного на шариках. Вдобавок, авторы настоящего изобретения далее обнаружили вещество, связывающее ретровирус, которое не содержит домена, связывающего гепарин, происходящего из фибронектина, и также обнаружили, что этот материал и его производные пригодны для переноса гена в клетки-мишени с помощью ретровирусов. Более того, авторы настоящего изобретения добились создания функциональных материалов, пригодных для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. В итоге было создано настоящее изобретение. 4 Итак, первый аспект настоящего изобретения связан со способом повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. Этот способ предназначен для трансдукции клеток-мишеней с помощью ретровируса и характеризуется инфицированием соответствующих клеток-мишеней с помощью соответствующего ретровируса в присутствии смеси из эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, чтобы дать возможность перенести соответствующий ген в эти клеткимишени. Соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используемый для этой первой цели настоящего изобретения, специфически не ограничен и, например, он представляет собой функциональный материал, выбранный из определенной группы, состоящей из связывающего Гепарин II домена фибронектина, фактора роста фибробластов, коллагена, полилизина и их функциональных эквивалентов. Соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку-мишень, может представлять собой вещество, содержащее лиганд, которое может связываться с клеткамимишенями. В качестве лиганда выступают клеточные адгезионные белки, гормоны, цитокины,антитела, цепочки сахара, углеводы и метаболиты клеток-мишеней и т.п. Примеры адгезионных белков включают полипептиды домена фибронектина, связывающего клетку. Также как и этот домен фибронектина, связывающий клетку, существуют полипептиды домена, связывающегося с VLA-5 и/или VLA-4. Кроме того,другие примеры лиганда включают эритропоэтин. Указанный функциональный материал, используемый для первой цели настоящего изобретения, может применяться без иммобилизации или может быть иммобилизован, и, при иммобилизации на шариках, удобен в применении. Кроме того, когда лиганд, специфичный для клеток-мишеней, выбран в качестве функционального материала, обладающего доменом,связывающим клетку, первый аспект настоящего изобретения дает возможность удобно трансдуцировать предполагаемые клетки-мишени. Как описано выше, в традиционных способах, которые раскрыты в WO 95/26200 и NatureMedicine рассматривается основной механизм повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса для совместной локализации ретровируса и клетокмишеней на функциональном материале, обладающем и доменом, связывающим ретровирус и доменом, связывающим клетку-мишень на одной и той же молекуле. Однако в соответствии с 5 настоящим изобретением, эффективность генного переноса в клетки-мишени можно повысить путем осуществления генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса в присутствии смеси эффективного количества функционального материала, обладающего доменом,связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала,обладающего доменом, связывающим клеткумишень. Второй аспект настоящего изобретения относится к культуральной среде для клетокмишеней, используемой для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов, которая включает смесь эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективное количество другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень. Благодаря использованию культуральной среды из второго аспекта настоящего изобретения, можно удобным образом осуществить указанный первый аспект настоящего изобретения. Третий аспект настоящего изобретения относится к способу локализации ретровирусов и данный способ отличается инкубированием культуральной среды, содержащей ретровирус,контактируемый со смесью эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень. Четвертый аспект настоящего изобретения относится к набору, используемому для осуществления ретровирус-опосредованного генного переноса в клетки-мишени. Данный набор является объектом данного изобретения. Набор включает:a) эффективное количество функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и/или эффективное количество другого функционального материала,обладающего доменом, связывающим клеткумишень;b) синтетический субстрат для инкубирования клеток-мишеней и ретровируса; иc) ростовой фактор клетки-мишени для предварительной стимуляции соответствующих клеток-мишеней. Благодаря применению реагентного набора из четвертого аспекта настоящего изобретения,можно удобно осуществить первый и третий аспекты настоящего изобретения. Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу, повышающему эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов и данный способ отличается тем, что эти клетки-мишени инфицированы соответствующим ретровирусом в присутствии эффективного количества функционального 6 материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, а также доменом, связывающим ретровирус, полученным из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина,или его функционального эквивалента, на одной и той же молекуле, чтобы дать возможность трансдуцировать данные клетки-мишени. В вышеуказанных традиционных способах, которые описаны в WO 95/26200 и NatureMedicine, фибронектиновые фрагменты раскрыты в качестве материала, который может использоваться для наиболее эффективного способа по улучшению генного переноса в клеткимишени с помощью ретровирусов. Однако, что касается функциональных материалов, иных чем фибронектиновые фрагменты, не существует конкретного описания того, какого рода функциональный материал может применяться для эффективного способа генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. В частности, в традиционном способе, описан лишь 12-14 повтор в фибронектине в качестве домена, связывающего данный ретровирус. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что фактор роста фибробластов, коллаген, полилизин и другие, которые не обладают какой-либо структурной связью с этим повтором 12-14 фибронектина, могут эффективно использоваться в способе по улучшению генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. По этой причине, любой функциональный эквивалент этих материалов,т.е. любой материал, который обладает доменом, связывающим ретровирус, функционально эквивалентен этим материалам и может повышать эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса, может использоваться для осуществления пятой цели настоящего изобретения. Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения, в качестве домена, связывающего клетку-мишень, может использоваться материал, обладающий лигандом, который может связываться с клетками-мишенями, и этот материал присоединен к домену, связывающему ретровирус. Примеры соответствующего лиганда включают клеточные адгезионные белки, гормоны, цитокины, антитела, цепочки сахара, углеводы, метаболиты клеток-мишеней и т.п. Примеры клеточных адгезионных белков включают полипептиды связывающего клетку домена фибронектина. Например, полипептиды домена, связывающегося с VLA-5 и/или VLA-4,могут использоваться в настоящем изобретении. Кроме того, другие примеры лиганда включают эритропоэтин. Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения в качестве фактора роста фибробластов, используемого в качестве домена, связывающего ретровирус, существуют факторы роста фибробластов, выбранные, напри 7 мер, из фактора роста фибробластов, представленного с помощью SEQ. ID No. 3 в списке последовательностей, функционально эквивалентные фактору и полипептидам, содержащим данный фактор, или его функциональные эквиваленты. Примеры этих функциональных материалов включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ. ID Nos. 4 и 5 данного списка последовательностей. Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения, коллагены, используемые в качестве домена, связывающего ретровирус, включают, например, коллагены, выбранные из коллагенового фрагмента, содержащего домен, связывающий инсулин, получаемого из коллагена типа V, функциональных эквивалентов соответствующих фрагментов и полипептидов, содержащих соответствующие фрагменты или их функциональный эквивалент. Кроме того, примеры таких фрагментов включают фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ. ID No. 6 данного списка последовательностей. Примеры этих функциональных материалов включают полипептиды, представленные вSEQ. ID Nos. 7 и 8 данного списка последовательностей. Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения полилизин, используемый в качестве домена, связывающего ретровирус, представляет собой полимер L-лизина и,например, один из них, обладая подходящим уровнем полимеризации, может быть выбран из коммерчески доступных продуктов и использован. Если домен, связывающий ретровирус, получен из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, который, одновременно,обладает доменом, связывающим клеткумишень, эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов можно повысить путем инфицирования клетокмишеней с помощью ретровируса в присутствии эффективного количества домена, связывающего данный ретровирус, полученного из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Если клетки-мишени представляют собой адгезионные клетки, ретровирус и клетки-мишени,соответственно, связываются и приклеиваются к данному функциональному материалу, эффективность генного переноса в данные клеткимишени с помощью ретровируса может быть повышена путем инфицирования этих клетокмишеней с помощью ретровируса в присутствии соответствующего эффективного количества домена, связывающего данный ретровирус, полученный из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Было также обнаружено, что если полипептид, представленный в SEQ. ID No. 1 списка 8 последовательностей (именуемый ниже как Н 271), обладает одновременно доменом, связывающем клетку-мишень, т.е., если клеткимишени связываются с полипептидом Н-271, то эффективность генного переноса в эти клеткимишени с помощью ретровируса можно повысить путем инфицирования данных клетокмишеней с помощью соответствующего ретровируса в присутствии эффективного количества данного полипептида. Другими словами, хотя домен, связывающий соответствующий ретровирус, описанный выше в Nature Medicine, обладает лишь повтором 12-14 фибронектина, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что Н 271 эффективно действует в качестве домена,связывающего клетку-мишень, в соответствии с конкретным видом клеток-мишеней, чтобы улучшить эффективность генного переноса в данные клетки-мишени. Кроме того, в случае когда клетки-мишени представляют собой адгезионные клетки, эти клетки-мишени и ретровирус, соответственно, связываются и слипаются с данным полипептидом, а эффективность генного переноса в эти клетки-мишени с помощью соответствующего ретровируса может быть улучшена путем инфицирования данных клетокмишеней с помощью данного ретровируса в присутствии эффективного количества данного полипептида. Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения функциональный материал может использоваться без иммобилизации или может быть иммобилизован, однако, иммобилизация является предпочтительной для случая, в котором клетки-мишени представляют собой прилипающие клетки. Шестой аспект настоящего изобретения связан с культуральной средой для клетокмишеней, используемой для генного переноса в соответствующие клетки-мишени с помощью ретровируса, которая включает эффективное количество функционального материала, который обладает доменом, связывающим клеткумишень, а также доменом, связывающим ретровирус, полученным из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, или их функционального эквивалента, на одной и той же молекуле. Седьмой аспект настоящего изобретения относится к способу локализации ретровируса,который включает инкубирование культуральной среды, содержащей соответствующий ретровирус, контактируемый с эффективным количеством функционального материала, содержащего домен, связывающий ретровирус, получаемый из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Эти функциональные материалы могут эффективно использоваться для локализации ретровируса для улучшения генного переноса в клетки-мишени с помощью данного ретровируса. 9 Сверх того, данный способ локализации ретровируса настоящего изобретения включает инкубацию данного ретровируса, контактируемого с эффективным количеством функционального материала, включающего домен, который связывается с клеткой-мишенью, а также домен, связывающий ретровирус, полученный из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, или их функционального эквивалента, на одной и той же молекуле. Восьмой аспект настоящего изобретения относится ко второму объекту изобретения и касается набора для осуществления ретровирусопосредованного генного переноса в клеткимишени иданный набор включаетa) эффективное количество функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, а также доменом, связывающим клетку-мишень, полученным от фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина или их функционального эквивалента, на одной и той же молекуле;b) синтетический субстрат для инкубирования клеток-мишеней, контактируемых с ретровирусом и с) фактор роста клетки-мишени для предварительной стимуляции соответствующих клеток-мишеней. На практике могут быть соответственно использованы любой способ первого и пятого аспектов, любая культуральная среда второго и шестого аспектов, любой способ третьего и седьмого аспектов и любой набор четвертого и восьмого аспектов настоящего изобретения,соответствующие функциональные материалы,иммобилизованные на шариках. Девятый аспект настоящего изобретения относится к способу повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса и отличается тем, что данные клетки-мишени инфицированы с помощью ретровируса в присутствии эффективного количества функционального материала, иммобилизованного на шариках, выбранных из практически чистого фибронектина, практически чистого фибронектинового фрагмента или их смеси,чтобы дать возможность трансдуцировать данные клетки-мишени с помощью данного ретровируса. Десятый аспект настоящего изобретения также связан со способом повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса и отличается тем, что данные клетки-мишени инфицированы с помощью ретровируса в присутствии эффективного количества функционального материала, выбранного из практически чистого фибронектина,практически чистого фибронектинового фрагмента или их смеси без иммобилизации, чтобы дать возможность трансдуцировать данные клетки-мишени с помощью соответствующего ретровируса.Medicine, основной механизм повышения эффективности генного переноса с помощью ретровируса заключается в том, что ретровирус и клетки-мишени должны быть солокализованы на функциональном материале, обладающем доменом, связывающим ретровирус, и доменом,связывающим клетку-мишень на одной и той же молекуле. В этих способах указанная солокализация и ретровируса и клеток-мишеней на функциональном материале, обладающем и доменом, связывающим ретровирус, и доменом,связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле, становится возможной, благодаря иммобилизации данного функционального материала, обладающего доменом, связывающим соответствующий ретровирус, и доменом, связывающим соответствующую клетку-мишень,на одной и той же молекуле на культуральном субстрате. Однако в соответствии с настоящим изобретением, даже при использовании практически чистого фибронектина, практически чистого фибронектинового фрагмента или их смеси,неожиданно (обнаружилось, что) эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса может быть эффективно повышена путем использования соответствующего функционального материала, обладающего и доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень на одной и той же молекуле без иммобилизации на культуральном субстрате. Как соответствующие клетки-мишени, используемые в указанных первом, пятом, девятом и десятом аспектах настоящего изобретения, могут использоваться, например, клетки,выбранные из стволовых клеток, гемопоэтических клеток, не адгезирующих при низкой плотности моноядерных клеток, адгезирующих клеток, клеток костного мозга, гемопоэтических стволовых клеток, стволовых клеток периферической крови, клеток пуповинной крови, гемопоэтических стволовых клеток плода, эмбриопластических стволовых клеток, эмбриональных клеток, первичных половых клеток, ооцитов, оогоний, яйцеклеток, сперматоцитов, сперматозоидов, CD 34+ клетки, C-kit+ клетки, мультипотентных предшественников гемопоэтических клеток, унипотентных предшественников гемопоэтических клеток, эритроцитарных клеток-предшественников, лимфоцитарных клетокпредшественников, зрелых клеток крови, лимфоцитов, В-клеток, Т-клеток, фибробластов,нейробластов, клеток нервов, эндотелиальных клеток, ангиоэндотелиальных клеток, гепатоцитов, миобластов, клеток скелетной мускулатуры, клеток гладкой мускулатуры, раковых клеток, миеломных клеток и лейкозных клеток. Как соответствующий ретровирус, используемый для первого, третьего, пятого, седьмого, 11 девятого и десятого аспектов настоящего изобретения, можно использовать ретровирус, содержащий экзогенный ген, и этот ретровирус может представлять собой, например, рекомбинантный ретровирусный вектор. Кроме того,этот ретровирус может представлять собой, например, дефектный по репликации рекомбинантный ретровирусный вектор. Одиннадцатый аспект настоящего изобретения связан с трансдуцируемыми клетками,получаемыми в соответствии с первым, пятым,девятым или десятым аспектом настоящего изобретения. Двенадцатый аспект настоящего изобретения относится к способу трансплантирования клетки для трансплантирования соответствующих трансдуцированных клеток, в соответствии с одиннадцатым аспектом настоящего изобретения, позвоночному животному. Тринадцатый аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, представленномуSEQ. ID No. 13 в списке последовательностей,который может повысить эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, или его функциональным эквивалентам. Четырнадцатый аспект настоящего изобретения относится к гену, кодирующему указанный полипептид, согласно тринадцатому аспекту настоящего изобретения. Примеры такого гена включают ген, представленный SEQ. IDNo. 17 в списке последовательностей, или ген,который может гибридизовать с вышеуказанным геном в строгих условиях, и кодирует полипептид, который может повышать эффективность переноса данного гена в клетки-мишени с помощью ретровируса. В вышеуказанных традиционных способах из WO 95/26200 и Nature Medicine, наиболее эффективный пептид, используемый для переноса гена, представляет собой СН-296. С другой стороны, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что этот же полипептид без домена, связывающего VLA-5 и домена,связывающего VLA-4, может использоваться в настоящем изобретении. Пятнадцатый аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, представленномуSEQ. ID No. 30 в списке последовательностей,который может повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, или к его функциональному эквиваленту. Шестнадцатый аспект настоящего изобретения относится к гену, кодирующему указанный полипептид, согласно пятнадцатому аспекту настоящего изобретения. Примеры этого гена включают ген, представленный SEQ. ID No. 33 в списке последовательностей, или ген, который может гибридизовать с вышеуказанным геном в строгих условиях и кодирует полипептид, который может повышать эффективность генного 12 переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса. Семнадцатый аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, представленному SEQ. ID No. 5, который может повышать эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса, или к его функциональным эквивалентам. Восемнадцатый аспект настоящего изобретения относится к гену, кодирующему полипептид, согласно семнадцатому аспекту настоящего изобретения. Примеры такого гена включают ген, представленный SEQ. ID No. 26 или ген,который может гибридизовать с вышеуказанным геном и кодирует полипептид, который может повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса. Подробное описание настоящего изобретения Для способа генного переноса настоящего изобретения обычно используются рекомбинантные ретровирусные векторы и, в частности,подходящим является дефектный по репликации ретровирусный вектор. Способность к репликации у данного вектора исключали, чтобы предотвратить ауторепликацию в инфицируемых клетках, так, чтобы данный вектор не являлся патогенным. Эти векторы можно внедрять в хозяйские клетки, такие как клетки позвоночного животного, в частности, клетки млекопитающих, чтобы устойчиво интегрировать экзогенные гены, вставленные в эти вектора, в хромосомную ДНК хозяйских клеток. В настоящем изобретении экзогенные гены, переносимые в клетки, могут использоваться путем их инсерцирования в ретровирусный вектор под контролем подходящего промотора,например, промотора LTR, представленного в ретровирусе, или экзогенного промотора. Кроме того, для того чтобы осуществить транскрипцию экзогенного гена, в векторе могут быть также представлены другие регуляторные элементы, которые взаимодействуют с промотором, и сайт инициации транскрипции, например, энхансер может также присутствовать в векторе. Более того, предпочтительно, инсерцируемый ген может обладать нижележащей терминаторной последовательностью. Этот экзогенный ген, переносимый в клетки, может быть природным или искусственным геном, и может обладать дополнительной молекулой ДНК, полученной из гетерологичных источников, присоединенной к нему путем лигирования или другими способами, известными в данной области. Экзогенные гены, инсерцированные в ретровирус, могут представлять собой любые гены,представляющие интерес для трансдукции клеток. Например, эти экзогенные гены могут кодировать фермент, который ассоциирован с лечением болезни, белок, антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим или вспомогательный праймер (смотрите, напр., WO 90/13641), внут 13 риклеточное антитело (смотрите, напр., WO 94/02610), ростовой фактор и т. п. Ретровирусные векторы, используемые в настоящем изобретении, могут обладать маркерным геном, для того чтобы трансдуцируемые клетки можно было легко селектировать. В качестве маркерного гена можно использовать,например, ген лекарственной устойчивости,который обеспечивает трансформированным клеткам устойчивостью к антибиотику, или репортерный ген, который наделяет трансформированные клетки ферментной активностью для их детектирования. В качестве используемых векторов существуют ретровирусные векторы, такие как известный MFG-вектор (АТСС No. 68754), -SGCHematol., vol. 23, pp. 630-638 (1995 оба, используемые в нижеприводимых примерах, содержат гены устойчивости к неомицину (неомицинфосфотрансферазный ген) в качестве своих маркерных генов. Поэтому, клетки,трансформированные с помощью этих векторов,могут распознаваться в качестве клеток, обладающих устойчивостью к антибиотикам (неомицину, G418, и др.), инактивируемых продуктами данных генов. Более того, эти векторы можно получить в виде вирусных частиц, содержащих данные векторы, упакованные в них,путем использования известных упаковывающих клеточных штаммов, например, PG13(ATCC CRL-9641) и др. Термин "эффективное количество" функционального материала, используемого здесь,означает определенное количество, необходимое для трансформации клеток-мишеней геном,переносимом в клетки-мишени с помощью ретровируса. Соответствующее количество можно подобрать в зависимости от конкретного функционального материала, ретровируса и конкретного вида клеток-мишеней, путем использования способа, описанного здесь. Термин "эффективность генного переноса", используемый здесь, означает эффективность трансформации. Способность связывания с ретровирусом функционального материала, т.е. эффективность и пригодность функционального материала настоящего изобретения, может быть установлена с помощью обычных анализов, которые описаны в нижеприводимых примерах. Эти анализы определяют пределы, в которых ретровирусные частицы связаны с функциональным материалом, иммобилизованном на матриксе, используемом в настоящем изобретении, чтобы противостоять смыву с данного матрикса. Коротко, вируссодержащий супернатант, 003204 14 например, можно инкубировать в лунке, содержащей соответствующий иммобилизованный функциональный материал, обладающий доменом, связывающий ретровирус. Затем эту лунку тщательно промывают физиологическим солевым буфером и после этого клетки-мишени инкубируют в данной лунке, чтобы определить уровень инфекционной активности вируса, остающегося в данной лунке. Оценивают снижение инфекционной активности или титра, относительно данного начального вирусного супернатанта, и сравнивают с тем, что получено в аналогичном контроле (т.е. используя лунку,покрытую BSA). Существенно более высокий титр, остающийся в функциональном материале, содержащемся в лунке, по сравнению с вышеуказанной контрольной лункой, свидетельствует о том, что данный материал может использоваться в качестве функционального материала в настоящем изобретении. Для облегчения этой процедуры скринирования данный вирусный вектор может содержать селективный маркерный ген. Функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используемый в настоящем изобретении, можно скринировать с помощью этих анализов. Как таковой, функциональный материал,обладающий доменом, связывающим ретровирус, представляет собой здесь функциональный материал, который обладает доменом, связывающим ретровирус, полученный из связывающего Гепарин-II домена фибронектина, фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Связывание домена, связывающего клетку,из функционального материала, используемого в настоящем изобретении, с клетками, т.е. связывание материала, содержащего лиганд, связывающий клетку-мишень с клетками, можно таким же образом проанализировать, применяя стандартные методики. Например, такие методики включают те, которые описаны в Nature 352: 438-441 (1991). Вкратце, определенный функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку, иммобилизировали на планшете для культивирования и соответствующую анализируемую популяцию клеток загружали в среду, с последующей инкубацией в течение 30 мин - 2 ч. После этого периода инкубации, изымали клетки, не адгезированные с данным функциональным материалом, подсчитывали и анализировали на жизнеспособность. Клетки, прилипшие к данному функциональному материалу также изымали, с использованием трипсина или диссоциирующего клетки буфера (напр., Gibco),подсчитывали и тестировали на жизнеспособность. В некоторых случаях, например для гемопоэтических колониеобразующих клеток, эти клетки культивировали далее в течение дополнительных 12-14 дней для установления колониеобразующих характеристик данных клеток. 15 Затем вычисляли процентную долю адгезирующих клеток и сравнивали со стандартом или стандартным контролем, таким как бычий сывороточный альбумин (BSA), иммобилизованном на культуральном планшете. Существенное связывание клеток-мишеней с анализируемым функциональным веществом указывает, что это сочетание функциональный материал/клетка пригодно для настоящего изобретения и данный функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку, может сосуществовать с или быть присоединенным к определенному функциональному материалу, обладающему доменом, связывающим ретровирус, с последующим оцениванием ретровирусного инфицирования данных клеток-мишеней, для конструирования функционального материала,используемого в настоящем изобретении. Поскольку соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, может использоваться в настоящем изобретении, как описано выше,здесь представлен функциональный материал,который обладает доменом, связывающим ретровирус, полученный из связывающего Гепарин-II домена фибронектина, фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Все вещества, которые обладают доменом, связывающим ретровирус, эквивалентные вышеуказанному, и которые могут повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов путем присоединения к или сосуществования с лигандом, обладающим доменом, связывающим клетку-мишень, включены в соответствующие функциональные эквиваленты соответствующего домена, связывающего ретровирус, получаемого от фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Эффективное количество функционального материала(ов), используемого(ых) в настоящем изобретении, можно определить путем использования клеток-мишеней и ретровируса в способе настоящего изобретения по генному переносу в присутствии выбранного функционального материала, обладающего доменом,связывающим ретровирус, присоединенного к или сосуществующего с соответствующим функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клетку, и оценивания повышения эффективности переноса данного гена, в соответствии с вышеописанным способом. Настоящее изобретение подробно иллюстрируется ниже. Первый аспект настоящего изобретения заключается в создании способа, повышающего эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса. Данный способ отличается инфицированием жизнеспособных клеток-мишеней ретровирусом в присутствии смеси функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и 16 функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клетку-мишень, который является эффективным для повышения эффективности генного переноса в соответствующие клетки-мишени с помощью соответствующего ретровируса. Данный способ может использоваться для получения клеток-трансформантов, трансдуцируемых с помощью соответствующего ретровируса, и для трансплантирования данных клеток индивидуальному организму, осуществляющих генный перенос в индивидуальный организм. Функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используемый в данном способе, специфически не ограничен, а его примеры включают связывающий Гепарин-II домен фибронектина, фактор роста фибробластов, коллаген, полилизин и др. Таким же образом могут использоваться его функциональные эквиваленты, например функциональный материал, обладающий доменом, связывающим гепарин. Кроме того, может использоваться смесь функциональных материалов, полипептид, содержащий функциональный материал, полимер функционального материала,производное функционального материала и тому подобное. Эти функциональные материалы можно получить из естественно встречаемых продуктов, или получить искусственно (напр.,получить с помощью генно-инженерных методик или химическим синтезом). Кроме того, они могут быть получены путем сочетания естественно встречаемых продуктов с синтетическими продуктами. Поскольку домен, связывающий ретровирус, и/или домен, связывающий клетку-мишень,которые могут осуществлять генный перенос с высокой эффективностью, как здесь описывается и утверждается, функциональный материал может быть тем используемым материалом, который обладает мутацией в аминокислотных последовательностях естественно встречаемых полипептидов. В настоящем изобретении, даже если и деления, замена, инсерция и/или добавка,одна или множество, например до нескольких аминокислот, представлены в аминокислотных последовательностях естественно встречаемых полипептидов, поскольку требуемый домен,связывающий ретровирус, и/или домен, связывающий клетку-мишень, сохраняются, такие полипептиды именуются как функциональные эквиваленты данных полипептидов, обладающих естественно встречаемыми аминокислотными последовательностями. Эти функциональные эквиваленты могут быть получены путем создания генов, кодирующих соответствующие функциональные эквиваленты, чтобы произвести указанные эквиваленты и установить их биологические активности. В этом отношении, соответствующие области биотехнологии уже достигли уровня, когда можно рутинно осуществить определенную 17 делецию, замену, добавку или другие модификации аминокислот в требуемых функциональных доменах. Затем, эти полученные аминокислотные последовательности можно, как положено, проскринировать на нужную активность связывания клетки или активность связывания вируса. Ген, кодирующий функциональный эквивалент, можно получить путем поиска генов,гибридизующих с геном, кодирующим вышеуказанный функциональный материал. То есть, ген, кодирующий вышеуказанный функциональный материал или часть его нуклеотидной последовательности, можно использовать в качестве гибридизационного зонда или праймеров метода амплификации гена, такого как PCR, или ему подобного, для отбора гена,кодирующего белок, обладающего активностью,аналогичной данному функциональному материалу. Иногда в этом методе получали фрагмент ДНК, содержащий только часть требуемого гена. В таком случае, после установления того,что полученный фрагмент ДНК представляет собой часть требуемого гена, этот целый требуемый ген получали путем осуществления гибридизации с помощью данного фрагмента ДНК или его частью в качестве зонда или осуществлением PCR с помощью праймеров, синтезируемых на основе нуклеотидной последовательности данного фрагмента ДНК. Вышеуказанную гибридизацию можно осуществить, например, в нижеследующих условиях. А именно, мембрану, на которой иммобилизуют ДНК, инкубируют в 6 х SSC (1 х SSC: 0,15 NaCl, 0,015 натрийцитрата, рН 7,0), содержащем 0,5% SDS, 0,1% BSA, 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% Ficoll 400 и 0,01% денатурированной ДНК спермы лосося вместе с зондом при 50 С в течение 12-20 ч. После завершения инкубации, эту мембрану промывали, вначале, 2 х SSC, содержащего 0,5% SDS, при 37 С, а затем с помощью меняющихся концентраций SSC до 0,1 х SSC и температурах до 50 С до появления сигнала от данной иммобилизованной ДНК,который можно отличить от фона. Кроме того, так или иначе, в том, что полученный таким образом ген представляет собой требуемый ген, можно удостовериться путем проверки активности белка, кодируемого с помощью данного гена, в соответствии с вышеуказанным способом. Как описано в вышеуказанном WO 95/26200, связывающий Гепарин-II домен фибронектина, представляет собой полипептид, обладающий доменом, связывающим ретровирус. Хотя фактор роста фибробластов, коллаген и полилизин не имеют какого-либо структурного сходства со связывающим Гепарин-II доменом фибронектина (напр., сходство в аминокислотных последовательностях), авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти субстанции 18 обладают доменами,связывающими ретровирус. Функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку-мишень, используемый в настоящем изобретении, специфически не ограничен, либо представляет собой вещество, обладающее лигандом, которое может связываться с клетками-мишенями. Примеры этого лиганда включают клеточные адгезионные белки, гормоны, цитокины, антитела к антигенам на клеточных поверхностях, полисахариды, цепочки сахара в гликопротеинах или гликолипидах, метаболиты клеток-мишеней и т.д. Кроме того, здесь могут быть использованы полипептиды, содержащие функциональные материалы, полимеры функциональных материалов, производные функциональных материалов, функциональные эквиваленты функциональных материалов и т.п. Эти функциональные материалы могут быть получены из естественно встречаемых продуктов или полученных искусственно (напр., полученных с помощью генноинженерных методик или методами химического синтеза). Далее, они могут быть получены путем сочетания естественно встречаемых продуктов и синтетических продуктов. Используемые здесь клеточные адгезионные белки представляют собой, например, фибронектин и его фрагменты. Например, связывающий клетку домен человеческого фибронектина, который корреспондирует с Pro1239 -Ser1515,как описано в патенте США 5198423, как было показано, обладает функцией, эквивалентной описанному здесь полипептиду С-274 связывания с клетками, включая клетки ВНК иB16-F10 (Kimizuka с соавт., J. Biochem. Vol. 110,pp. 285-291 (1991. Последовательность, составленная из четырех аминокислот RGDS,представленная в этих полипептидах, представляет собой лиганд для рецептора VLA-5. Экспрессию рецептора VLA-5 наблюдали у широкого круга клеток, и он экспрессируется в недифференцированных клетках лучше, чем в дифференцированных клетках. Кроме того, известно, что область фибронектина CS-1 является лигандом для рецептора VLA-4 и связывается с клетками, экспрессирующими данный рецептор (Т-клетки, В-клетки, моноциты, NK-клетки,ацидофилоциты, базофилы, тимоциты, миеломоноцитарные клетки, клетки-предшественники эритробластов, лимфоцитарные клетки-предшественники, клетки меланомы, мышечные клетки и т.п.). Соответствующий полипептид,описанный в JP-A 3-284700, и представленныйSEQ. ID No. 29 (именуемый ниже как C277CS1), представляет собой полипептид, обладающий лигандами для обоих вышеупомянутых рецепторов VLA-5 и VLA-4, и может использоваться для генного переноса в клетки, обладающими этими рецепторами. Более того, было показано, что Гепарин-II-домен может связываться с фибробластами, эндотелиальными клетками и 19 опухолевыми клетками. Полипептидная последовательность домена, из Гепарин-II-домена,связывающая клетку, пригодна для нацеливания ретровирусной инфекции на мишенируемые клетки в присутствии полипептида из функционального материала, обладающего доменом,связывающим ретровирус. Гормоны и цитокины, обладающие клеточными специфичными активностями, подходят в качестве функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку, в настоящем изобретении. Например, эритропоэтин, который представляет собой цитокин в гемопоэтической системе, может использоваться для генного переноса в эритроцитарные клетки. Использовали эритропоэтин, получаемый в соответствии с известным способом. Кроме того, можно использовать также функциональные эквиваленты данного эритропоэтина и полипептиды, содержащие эритропоэтин или его функциональные эквиваленты. Как описано в нижеприводимых примерах,когда функциональный материал, обладающий ретровирусной связывающей активностью(напр., Н-271 и фактором роста фибробластов),использовали в смеси с С-274, который представляет собой полипептид, обладающий активностью, связывать клетку, получаемый из фибронектина или чего-либо подобного, можно получить высокую эффективность генного переноса. NIH/ЗТЗ-клетки, которые использовались в этих экспериментах, экспрессируют рецепторVLA-5, который может связываться с С-274 и их взаимодействие способствует повышению эффективности генного переноса. Далее наблюдали также один и тот же феномен, когда производное эритропоэтина присутствует при генном переносе в TF-1-клетки,которые экспрессируют рецептор эритропоэтина (Blood, Vol. 73, pp. 375-380 (1989. Более того, этот эффект не наблюдался в клетках, которые не имели какого-либо эритропоэтинового рецептора. Из этих результатов становится ясно, что клеточная специфичность, повышающая эффективность генного переноса, имеет место в присутствии соответствующего функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и соответствующего функционального материала, обладающего доменом,связывающего клетку. В этом аспекте настоящего изобретения,функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используется в форме смеси с другим функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клетку-мишень. В связи с этим, эффективность генного переноса в клетки-мишени, обладающие сродством к функциональным материалам,отчетливо повышается. Так как эффективность генного переноса повышена, можно исключить сокультивирование с клетками-продуцентами 20 вируса, и это является одним из преимуществ настоящего изобретения. Способы по избирательному генному переносу в клетки-мишени весьма полезны и разнообразные исследования были осуществлены. Например, существует невирусный вектор (молекулярно-конъюгированный вектор), в котором материал, связывающийся с рецептором, представленным на клеточной поверхности, присоединяется к ДНК-связывающему материалу. Примеры генного переноса с использованием такого вектора включают генный перенос в клетки печени с помощью асиалогликопротеина(J. Biol. Chem., Vol. 262, pp. 4429-4432 (1987,генный перенос в лимфобласты с помощью трансферрина (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 6099-6103 (1992, генный перенос в раковые клетки с помощью анти-ЕGFрецепторных антител (FEBS Letters, Vol. 338,pp. 167-169 (1994 и др. Эти способы генного переноса с использованием невирусных векторов представляются нежелательными с той точки зрения, что генная экспрессия переносимых генов долговременна, из-за чего эти переносимые гены не интегрируются в хромосомную ДНК клеток. Предпринимались настойчивые попытки использовать ретровирусы, которые широко применяются в качестве векторов, способных инсерцировать гены в хромосомы, для специфического заражения клеток. Например,осуществляли генный перенос в гепатоциты путем прямой химической модификации ретровирусов для присоединения к лактозе (J. Biol.Chem., Vol. 266, pp. 14143-14146 (1991, генный перенос в клетки, экспрессирующие эритропоэтиновый рецептор, путем использования рекомбинантных вирусных частиц, обладающих оболочечным белком, который представляет собой белок, слит с эритропоэтином (Science,Vol. 266, pp. 1373-1376 (1994 и др. Однако для этой цели необходимо получить специальные белковые частицы, согласующиеся с отдельными клетками-мишенями. Кроме того, химическая модификация вирусных частиц требует сложных процедур и вызывает инактивацию вирусов. Более того, что касается вирусной оболочки, модифицируемой с помощью генной инженерии, желаемый продукт, обладающий необходимыми функциями (связывание с клетками-мишенями и конструирование вирусных частиц) получается не всегда. Вышеупомянутый WO 95/26200 позволяет предположить, что ретровирусный вектор, без какой-либо специальной модификации, может переноситься в клетки в присутствии фибронектинового фрагмента, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, обладающий активностью, связывающей клетку. Однако этот способ использует функциональную молекулу,обладающую и активностью, связывающей вирус, и активностью, связывающей клетку, и поэтому необходимо получать индивидуальный 21 специальный функциональный материал, согласующийся с отдельными видами клеток. Кроме того, неизвестно, действительно или нет полученный функциональный материал сохраняет обе активности. Сочетание функционального материала,обладающего доменом, связывающим ретровирус, и отличного функционального материала,обладающего доменом, связывающим клеткумишень настоящего изобретения, создает систему доставки гена с использованием ретровируса для самых разных видов клеток. Для этой цели нет нужды ковалентно присоединять функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, к функциональному материалу, обладающему доменом, связывающим клетку. Поэтому нет надобности получать индивидуальный специальный функциональный материал, в котором соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, ковалентно присоединен к соответствующему функциональному материалу, обладающему доменом,связывающим клетку, согласующийся с отдельными видами клеток, а генный перенос в клетки-мишени может быть удобно и эффективно осуществлен. Примером генного переноса в клеткимишени с использованием данного способа настоящего изобретения является генный перенос в клетки гемопоэтической системы. Было известно, что вышеупомянутая клеточная адгезионная область CS-1 фибронектина пригодна для генного переноса в гемопоэтические стволовые клетки. Кроме того, было также известно, что помимо вышеуказанного эритропоэтина, различные другие клеточные специфичные цитокины участвуют в дифференциации гемопоэтических клеток, и генный перенос можно специфически осуществить в клетки-мишени (клеточные линии) при их использовании. Например, при использовании G-CSF, в качестве клеток-мишеней трансдукции могут использоваться мегакариобласты и клетки-предшественники гранулоцитов. Когда использующееся вещество, которое специфически или преимущественно связывается с малигнизированными клетками в качестве функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку, в такие клеткимишени можно осуществить перенос гена. Например, было известно, что рецепторы,называемые как HER-2 и HER-4, экспрессируются в некоторых клетках карциномы молочной железы (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 92. pp. 9747-9751 (1995. В соответствии с этим представляется возможным контролировать рост клеток карциномы молочной железы путем сочетания герегулина, который представляет собой лиганд для соответствующих рецепторов, с соответствующим функциональным материа 003204 22 лом, обладающим доменом, связывающим ретровирус. Кроме того, благодаря использованию функционального материала, содержащего иод для клеток (раковых) щитовидной железы, или функционального материала, содержащего липопротеин высокой плотности (HDL), асиалогликопротеин или его часть для клеток (раковых) печени, эти клетки могут использоваться в качестве клеток-мишеней для трансдукции. Далее, благодаря использованию антител к антигенам, представленным на клеточных поверхностях, соответственно, моноклональные антитела в качестве функционального материала, обладающего активностью, связывающей клетку, любые клетки, имеющие антитела, могут использоваться в качестве клеток-мишеней. Таким образом, самые различные клетки могут использоваться в качестве клеток-мишеней благодаря применению способа локализации ретровирусного вектора и клеток-мишеней, описанных в настоящем изобретении. В наиболее предпочтительном варианте,эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса повышена,благодаря использованию нового функционального материала. До сих пор был известен только ГепаринII-домен фибронектина, как представитель функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, эффективного для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. Как описано выше, данный домен обладает сам по себе способностью связываться с некоторыми клетками и, в некоторых случаях, эта активность является нежелательно зависящей от определенных клеток-мишеней. В таких случаях, желаемые результаты могут быть получены путем замены связывающего домена на другой домен, связывающий клетку. Таким образом,можно использовать многочисленные функциональные материалы, обладающие различными свойствами, и это создает более широкие возможности применения соответствующей генной терапии в соответствии с настоящим изобретением и легко осуществляемой трансдукцией выбранных клеток-мишеней. Данный новый функциональный материал,обладающий доменом, связывающим ретровирус, созданный с помощью настоящего изобретения, включает факторы роста фибробластов,полипептиды, содержащие соответствующие факторы, фрагменты коллагена, смесь соответствующих фрагментов, полипептиды, содержащие соответствующие фрагменты, полимеры функционального материала и т.п. Полилизины также используются для этой цели настоящего изобретения. Эти функциональные материалы могут быть получены из естественно встречаемых продуктов или могут быть произведены синтетически (напр., произведены с помощью 23 методов генной инженерии или химическим синтезом). Далее, они могут быть произведены путем сочетания естественно встречаемых продуктов и химически синтезируемых продуктов. Данный функциональный материал может использоваться для способа переноса гена из первого аспекта настоящего изобретения, но для генного переноса пригодны также химерные молекулы из данного функционального материала и соответствующего другого функционального материала, обладающего доменом,связывающим клетку. Все вышеописанные функциональные материалы обладают активностью, связывающей ретровирус. Однако эти материалы не содержат Гепарин-II-домена человеческого фибронектина, описанного в WO 95/26200, или полипептида, обладающего аналогичными аминокислотными последовательностями. В качестве фактора роста фибробластов,может использоваться практически чистый естественно встречаемый продукт, или может использоваться продукт, полученный методами генной инженерии. В настоящем изобретении,может использоваться фактор роста фибробластов, который представлен SEQ. ID No. 3 в списке последовательностей, и могут также использоваться модифицированные его производные,сохраняющие функции данного полипептида. Примеры производных фактора роста фибробластов включают полипептид, представленный(именуемый ниже как C-FGFA) . Он представляет собой полипептид, в котором адгезирующий клетку домен полипептида фибронектина присоединен к N-концу фактора роста фибробластов, представленному SEQ. ID No. 3, и может быть получен с помощью методов генной инженерии, как в основном описано в патенте США 5302701. Данный полипептид может быть получен путем использования Е. coli, что было описано в вышеприведенном патенте США, в видеFERM Р-12637, и в настоящее время депонированного по Будапештскому Договору в National(NIBH), Agency of Industrial ScienceTechnology, Ministry of International TradeIndustry of 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan,под инвентарным номером FERM BP-5278 (дата первоначального депонирования; 9 декабря 1991 г.). Полипептидное производное вышеприведенного C-FGFA, обладающее адгезирующим(именуемое ниже в качестве FGF-CS1), получаемое путем использования Escherichia coli,депонировали по Будапештскому Договору вNIBH of 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,Япония, под инвентарным номером FERM ВР 5654 (дата первоначального депонирования: 6 сентября 1996 г.), в соответствии со способом, 003204 24 описанным здесь. Это С-FGF-CS1 особенно пригодно для генного переноса в клеткимишени, обладающие CS-1-связывающим свойством, в частности, гемопоэтические стволовые клетки. В качестве коллагеновых фрагментов, могут использоваться существенно очищенные фрагменты, полученные путем энзиматического или химического расщепления природных коллагенов, или могут использоваться коллагеновые фрагменты, полученные методами генной инженерии. Кроме того, могут использоваться модификации этих фрагментов, сохраняющие их функции. Среди коллагенов, человеческий коллаген тип V обладает сильной активностью,связывающей инсулин (JP-A 2-209899). Примером полипептидов, обладающего доменом, связывающим инсулин является полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в списке последовательностей SEQ. ID No. 28 (именуемую ниже как СоlV). ColV можно получить в соответствии со способом, описанным здесь в примерах. Полипептид, который содержит ColV и представленSEQ. ID No. 7 (именуемый ниже как C277ColV), представляет собой полипептид, в котором адгезирующий клетку домен полипептида фибронектина присоединен к N-концу ColV и может быть получен методом генной инженерии в соответствии с JP-A 5-97698 как описано выше. C277-ColV можно получить путем использования Е. coli, которая описана под инвентарным номером FERM Р-12560 в JP-A 5-97698 и депонирована по Будапештскому Договору вNIBH 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,Япония, под инвентарным номером FERM BP5277 (дата первоначального депонирования: 7 октября 1991 г.). Полипептид (именуемый ниже в качествеC-ColV-CS1), произведенный от C277-ColV,который представлен SEQ. ID No. 8, и обладает доменом CS-1, адгезирующем клетку, произведенным из фибронектина, может быть получен следующим образом. Фрагмент ДНК, выделенный путем амплификации с помощью PCR с использованием вышеуказанной плазмиды, которую получали от Е. coli, депонированной по Будапештскому Договору в NIBH 1-1-3, Higashi,Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Япония, под инвентарным номером FERM BP-2800 (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989 г.) в качестве матрицы и соответствующих праймеровCS1-S (соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ. ID No. 9 в приведенном списке последовательностей) и М 4, и обработанных затем с помощью ферментов рестрикции NheI и SalI. С другой стороны, выделяли фрагмент ДНК в результате амплификации с помощьюPCR с использованием плазмиды pTF7520ColV,которая содержит ген, кодирующий C277-ColV,и полученную из вышеуказанной FERM ВР 25 5277 Е. coli в качестве матрицы, и праймеров CF и CNR, а затем обрабатывали с помощью ферментов рестрикции AccIII и NheI. Нуклеотидные последовательности CF и CNR представлены вSEQ. ID Nos. 10 и 12 приведенного списка последовательностей. Вышеполученные два фрагмента ДНК смешивали и лигировали с, около,4,4 т.п.н. фрагментом ДНК, полученным путем обработки плазмиды pTF7520ColV с помощью ферментов рестрикции AccIII и SalI. Полученная плазмида кодирует полипептид C-ColV-CSl,который обладает CS-1-доменом, адгезирующем клетки по С-концу C277-ColV, и в котором глутаминовая кислота по С-концу ColV и Сконцевой треонин заменены, соответственно,аланином и серином. После культивированияE.coli, трансформированной этой плазмидой, из этой культуры можно получить требуемый полипептид. Этот C-ColV-CSl особенно пригоден для генного переноса в клетку-мишень, особенно стволовую клетку, обладающую CSlсвязывающим свойством. В качестве полилизина, как описано выше,который обладает подходящим уровнем полимеризации, можно выбрать и использовать полилизин из коммерчески доступных полилизинов. Функциональные материалы, используемые в настоящем изобретении, могут включать производные вышерассмотренных функциональных материалов. Их примеры включают вышерассмотренный C-FGF-CS1 или его функциональные эквиваленты и C-ColV-CS1 или его функциональные эквиваленты. Кроме того, в настоящем изобретении могут также использоваться полимеры, полученные путем полимеризации множества молекул из соответствующих функциональных материалов, и модифицированные материалы, полученные путем модификации соответствующих функциональных материалов, в соответствии с известными способами(добавление цепи сахара и т.п.). Эти полимеры и их функциональные эквиваленты можно получить с помощью методов генной инженерии с использованием генов, кодирующих соответствующие полимеры, и генов, колирующих их функциональные эквиваленты. Кроме того,функциональный материал с добавленным цистеином, пригодным для получения полимера из соответствующего функционального материала,можно получить путем добавки, инсерции и замены цистеина в аминокислотной последовательности соответствующего функционального материала. Кроме того, молекула которая представляет собой функциональный материал с добавленным цистеином и обладает доменом,связывающим ретровирус, легко присоединяется к другой молекуле, которая представляет собой функциональный материал с добавленным цистеином, и обладает доменом, связывающим клетку-мишень. К тому же, материал, соединяемый с другим функциональным материалом, 003204 26 можно получить путем использования соответствующего реакционноспособного цистеинового остатка из соответствующего функционального материала с добавленным цистеином. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, генный перенос осуществляют путем использования полимера из связывающего ретровирус домена фибронектина, который повышает эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. Соответствующий функциональный материал представляет собой полипептид, обладающий многочисленными Гепарин-II-связывающими доменами из человеческого фибронектина в одной молекуле, как описано в вышеприведенном WO 95/26200, или производные данного полипептида. Поскольку сохраняется одна и та же активность, такая же как у соответствующего функционального материала, часть функциональных эквивалентов, чьи аминокислотные последовательности отличаются от последовательностей из естественно встречаемых продуктов, могут быть включены. Примеры полимера функционального материала включают те из них, которые получены путем энзиматической или химической полимеризации вышеуказанного полипептида, произведенного из фибронектина или с помощью методов генной инженерии. Пример полипептида,который обладает в молекуле двумя Гепарин-IIсвязывающими доменами, произведенными из фибронектина, включают полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью,представленной в списке последовательностейSEQ. ID No. 13 (именуемой ниже в качестве Н 2547). Н 2-547 можно получить в соответствии со способом, описанным здесь, путем использования E.coli, которую депонировали по Будапештскому Договору в NIBH 1-1-3, Higashi, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Япония, под инвентарным номером FERM ВР-5656 (дата первоначального депонирования: 6 сентября 1996 г.). Полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ. ID No. 14 в списке последовательностей, представляет собой полипептидное производное, содержащее адгезирующий клетку полипептид фибронектина, присоединенный по N-концу Н 2-547 (именуемый ниже в качестве СН 2-826). Этот полипептид можно получить в соответствии со способом, описанным здесь. Далее, полипептид,обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ. ID No. 30 в списке последовательностей, представляет собой полипептидное производное, содержащее адгезирующую клетку, CS-1-область фибронектина,присоединенную по С-концу Н 2-547 (именуемое ниже как H2S-573). Соответствующий полипептид можно получить в соответствии со способом, описанным здесь, путем использования E.coli, которую депонировали по Будапешт 27 скому Договору в NIBH 1-1-3, Higashi, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Япония, под инвентарным номером FERM BP-5655 (дата первоначального депонирования: 6 сентября 1996 г.). H2S-573,обладающий областью адгезии клетки CS-1,пригоден для генного переноса в гемопоэтические стволовые клетки. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, жизнеспособные клетки-мишени заражали дефектным по репликации ретровирусным вектором в присутствии соответствующего функционального материала, иммобилизованного на шариках,которые являются эффективными для повышения эффективности генного переноса в клетки с помощью ретровирусного вектора. Удобные способы для повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусного вектора путем использования соответствующих функциональных материалов, описанные выше в WO 95/26200 иNature Medicine, осуществляли путем иммобилизации функциональных материалов в посуде,используемой для инфицирования клеток вирусом (планшет для клеточного культивирования). Эти способы требуют усложненных процедур,таких как отмывку избытка функционального материала, после обработки данного планшета раствором, содержащим указанный функциональный материал. Поэтому, способы переноса гена с использованием планшета, обладающего функциональными материалами, иммобилизованными в нем, трудно считать удобным способом. С другой стороны способ с использованием функциональных материалов, иммобилизованных на шарике(-ах) имеет следующие преимущества. По сравнению с планшетом, иммобилизацию на шариках можно осуществить в относительно небольшом пространстве, а шарики разместить в герметичной посуде. Так как поверхность планшета, обладающего функциональным материалом, иммобилизованном в нем, выдерживают на воздухе, с ним нужно обращаться осторожно, чтобы предотвратить порчу, или что-либо подобное, связанное с высыханием во время хранения, для случая функционального материала, обладающего сниженной стабильностью. Однако шарики можно хранить путем суспендирования в растворе и избежать таких проблем. Более того, поверхностная площадь функционального материала увеличивается при использовании шариков и, по этой причине,можно получить повышенную эффективность генного переноса по сравнению с планшетом. Иммобилизацию функциональных материалов можно осуществить с помощью удобного способа, например, посуду для культивирования клетки-мишени покрывают соответствующими функциональными материалами или же данные функциональные материалы можно иммобилизовать, например, на шариках, обра 003204 28 ботанных для культивирования клеток. Соответствующий сырьевой материал и вид шариков можно выбрать в зависимости от соответствующего предполагаемого использования. Например, шарик может обладать круговой или сферической сердцевиной в качестве центральной части и поверхность этой сердцевины можно покрыть гидрофильным полимером. Примеры сырьевого материала и вида этой сердцевины и полимера описаны в JP-A 8-501092. Например, биодеградируемые шарики, на которых иммобилизованы эти функциональные материалы, можно вводить в живой организм. Альтернативно, эффективный способ заключается в использовании смеси шариков, на котором иммобилизована молекула, обладающая доменом,связывающим ретровирус, и шариков, на которых иммобилизована молекула, обладающая доменом, связывающим клетку-мишень. Когда, например, эти функциональные материалы используются без иммобилизации, посуда для культивирования клетки-мишени может быть предварительно обработана веществом, которое предотвращает прилипание соответствующих функциональных материалов к данной посуде, например, бычьим сывороточным альбумином (BSA). Таким образом, данные функциональные материалы могут использоваться без неспецифичной адгезии к данной посуде. В соответствии с настоящим изобретением, генный перенос можно эффективно осуществить даже в такой системе, в которой функциональный материал настоящего изобретения используется без иммобилизации. Кроме того, благодаря использованию специфического набора реагентов, предназначенного для осуществления способа настоящего изобретения, как описано ниже, генный перенос в клетки может быть осуществлен очень удобно. Как описано выше, трансформированные клетки, полученные в соответствии со способом настоящего изобретения, можно трансплантировать живому организму, с тем чтобы осуществить генную терапию и чтобы экспрессировать экзогенный ген в живом организме. Например, когда гемопоэтические стволовые клетки используются в качестве клетокмишеней, генную терапию можно осуществлять с помощью следующих процедур. Во-первых,материал, содержащий гемопоэтические клетки,например, ткани костного мозга, периферической крови, крови пуповины плода или др., собирают от донора. Этот собранный материал может использоваться сам по себе. Однако обычно фракцию моноцитов, содержащую гемопоэтические стволовые клетки, получают центрифугированием в градиенте плотности или подобным образом. Альтернативно, гемопоэтические стволовые клетки могут быть выделены очисткой благодаря использованию маркеров на клеточных поверхностях, таких как CD34 и/или 29 С-набор. Полученный материал, содержащий гемопоэтические клетки можно факультативно подвергнуть предварительной стимуляции подходящим фактором роста клеток или другим, а затем эти клетки инфицировать рекомбинантным ретровирусным вектором, в который был инсерцирован предполагаемый ген, в соответствии со способом настоящего изобретения, в частности, в присутствии соответствующего функционального материала, обладающего активностью, связывающей стволовую клетку. Полученные таким образом трансформированные клетки можно трансплантировать реципиенту, например, путем внутривенного введения. Данный реципиент представляет собой, предпочтительно, аутологичного донора, но включает также аллогенные трансплантаты, последнее особенно предпочтительно для трансплантации при использовании клеток из пуповины крови. Генная терапия с использованием гемопоэтических стволовых клеток компенсирует недостаточность или аномальность гена пациента и его примеры включают ADA-недостаточность и болезнь Гоше. Кроме того, иногда, трансдукцию гена лекарственной устойчивости осуществляют для ослабления нарушений гемопоэтических стволовых клеток, связанных с химиотерапией, применяемой при лечении рака, лейкемий и т.п. Известно, что гемопоэтические стволовые клетки экспрессируют VLA-4-рецептор и по этой причине возможно эффективно осуществить генный перенос благодаря использованию соответствующего функционального материала,обладающего CS-1-областью, адгезирующей клетку, описанной в настоящем изобретении. Далее, как описано выше, молекулы, такие какCD34 и С-набор, экспрессируются на соответствующих поверхностях гемопоэтических стволовых клеток, и по этой причине эффективность генного переноса может быть повышена благодаря сочетанию антител против этих молекул или фактора стволовых клеток, который представляет собой лиганд С-набора соответствующего функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус. Сверх того, для генной терапии рака, изучали терапевтический эффект вакцины на новообразования, при этом цитокиновые гены переносили в раковые клетки и, после лишения способности к росту, эти клетки возвращали в организм пациента, чтобы повысить иммунитет к новообразованию (Human Gene Therapy. Vol. 5,pp. 153-164 (1994. Такую обработку можно эффективно осуществлять благодаря применению способа настоящего изобретения с помощью соответствующего функционального материала, обладающего высоким сродством к раковым клеткам. Кроме того, предпринимались настойчивые попытки лечить AIDS при помощи генной терапии. В этом случае, предлагалось перено 003204 30 сить ген, кодирующий молекулу нуклеиновой кислоты, которая подавляет HIV-репликацию или генную экспрессию (напр., антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим и пр.), в Тклетки, которые инфицированы HIV, который вызывает AIDS (J. Virol., Vol. 69, pp. 4045-4052(1995. Генный перенос в Т-клетки можно осуществить способом настоящего изобретения с использованием соответствующего функционального материала, например, CD4-антитела или ему подобного, который может связаться с молекулой, присутствующей на соответствующей поверхности Т-клеток. Таким образом, в качестве клетокмишеней для генного переноса можно использовать любые клетки, поскольку соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку-мишень, доступен или может быть приготовлен. Более того, данный способ настоящего изобретения подходит для условий применения клинической генной терапии, потому что сокультивирование клеток-мишеней в присутствии клеток-продуцентов ретровируса не требуется, и данный способ настоящего изобретения можно осуществить в отсутствие гексадиметринбромида, использование которого оказывает неблагоприятное клиническое воздействие на человеческий организм. Далее, применение, например, настоящего изобретения в других областях техники, иных,чем генная терапия, позволяет проще продуцировать трансгенных позвоночных животных для использования в качестве источника клетокмишеней, эмбриопластических стволовых клеток, первичных половых клеток, ооцитов, оогоний, яйцеклеток, сперматоцитов, сперматозоидов и др. Иными словами, в настоящем изобретении разработали в качестве первого варианта способ клеточного трансплантирования, включающий трансплантирование трансформированных клеток, полученных способом настоящего изобретения, позвоночному животному. Примеры позвоночных животных для трансплантирования трансформированных клеток включают млекопитающих (напр., мышь, крыса, кролик, коза,свинья, лошадь, собака, обезьяна, шимпанзе,человек и т.д.), птиц (напр., курица, индейка,куропатка, дикая утка и т.д.), пресмыкающихся(напр., змея, аллигатор, черепаха и т.д.), земноводных (напр., лягушка, саламандра, тритон и т.д.), рыб (напр., dog mackerel (макрелещука),скумбрия, окунь, луциан, морской окунь, желтохвост, тунец, лосось, форель, карп, а(й)ю,угорь, камбала, акула, скат, осетр и т.д.). Таким образом, в соответствии с этим вариантом осуществления настоящего изобретения подобно практически чистому фибронектину, практически чистым фибронектиновым фрагментам или их смеси, генный перенос с помощью ретровирусов можно осуществить 31 эффективно благодаря соответствующему домену, связывающему ретровирус, и соответствующему домену, связывающему клеткумишень, из функционального материала, используемого в настоящем изобретении. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет метод для перемещения генетического материала в клетки позвоночных животных без какого-либо ограничения традиционных методик. В очередном варианте осуществления настоящего изобретения эффективное количество материала, который обладает доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле и обладает функциями, эквивалентными функциям практически чистого фибронектина, практически чистых фибронектиновых фрагментов или их смеси, используется в качестве соответствующего функционального материала. Такой функциональный материал представляет собой материал, который может осуществить генный перенос с той же эффективностью, что и фибронектин, фибронектиновый фрагмент или их смесь. Обычно, он представляет собой функциональный материал настоящего изобретения, обладающий вышеуказанным новым доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле. В случае использования этих материалов, предполагается, что ретровирусы,также как и клетки-мишени, связывают, как минимум, один функциональный материал. Примеры функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус,и доменом, связывающим мишень, на одной и той же молекуле, включают полипептиды, представленные в списке последовательностей SEQ.ID Nos. 21 и 22 (именуемые ниже соответственно, CHV-181 и CHV-179). Эти пептиды включают сходные последовательности типа III (III-12, III-13 и III-14), содержащиеся в Н-271. В CHV-181, последовательности III-12 и III-13, и в CHV-179, последовательности III-13 и III-14 присоединены через метионин к С-концу адгезирующего клетку полипептида (Pro1239-Ser1515) фибронектина. Плазмиду для экспрессии полипептида CHV-181 можно сконструировать, например, путем следующих операций. Вначале плазмиду pHD101, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий связывающий гепарин полипептид (Н-271) фибронектина, получали в Escherichia coli НВ 101/pHD101 (FERMIII-13 последовательность в этой плазмиде, путем сайт-направленного мутагенеза, с последующей обработкой с помощью NcoI и HindIII, для получения фрагмента ДНК, кодирующего последовательность III-12 и III-13. С другой стороны,плазмидный вектор pINIII-ompA1 обрабатывали с помощью HindIII и SalI для получения фраг 003204 32 мента ДНК, кодирующего область терминатора липопротеина. Далее плазмиду pTF7021, содержащую фрагмент ДНК, кодирующую адгезирующий клетку полипептид (С-279) фибронектина, получали из Escherichia coli JM109/PTF7021(FERM ВР-1941), а NcoI-сайт интродуцировали непосредственно перед терминирующим кодоном С-279 в данной плазмиде путем сайтнаправленного мутагенеза, для получения плазмиды pTF7520. Полученную плазмиду обрабатывали с помощью NcoI и SalI, с последующим смешиванием с фрагментом ДНК, кодирующим последовательность III-12 и III-13, и с фрагментом ДНК, кодирующим область терминатора липопротеина, для их лигирования и получения плазмиды pCHV181 для экспрессии полипептида CHV-181. Нуклеотидная последовательность области, кодирующей полипептид CHV-181 в плазмиде pCHV181, показана в списке последовательностей в SEQ. ID No. 27. Плазмиду для экспрессии полипептидаpHD101, сайт-направленным мутагенезом интродуцировали NcoI-сайт, с последующей обработкой с помощью NcoI и HindIII для получения фрагмента ДНК, кодирующего последовательность III-13 и III-14. Полученный фрагмент смешивали с фрагментом ДНК, кодирующим вышеуказанную область терминатора липопротеина, и с плазмидой pTF7520, обработаннойNcoI и SalI, для их лигирования и получения плазмиды pCHV179 для экспрессирования полипептида CHV-179.CHV-181 и CHV-179 могут быть получены путем культивирования Е. coli, трансформированной,соответственно,вышеуказанными плазмидами, с последующим выделением очисткой из результирующей культуры. Эти функциональные материалы могут использоваться путем иммобилизации, например,на шариках, как описано выше, или без иммобилизации. В очередном варианте настоящего изобретении создали культуральную среду для клетокмишеней, используемую для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов, которая включает (1) вышеописанную смесь эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, или (2) эффективное количество соответствующего функционального материала, обладающего вышеописанным новым доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клеткумишень, на одной и той же молекуле. Данный функциональный материал может быть иммо 33 билизован или может быть использован без иммобилизации. Другие ингредиенты в культуральной среде настоящего изобретения специфически не ограничены, поскольку они могут использоваться в культуре клеток-мишеней, и могут использоваться в коммерчески доступных культуральных средах. Культуральная среда настоящего изобретения может также содержать сыворотку, фактор роста клеток, необходимый для роста клеток-мишеней, антибиотик для предотвращения загрязнения микроорганизмами и т.д. Например, в случае NIH/3T3-клеток, модифицированная Дюльбекко среда Игла (DMEM, JRHBioscience), содержащая 10% сыворотки плода коровы (Gibco), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (оба от Gibco) может использоваться в качестве культуральной среды. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения создали способ локализации ретровируса, который включает инкубирование культуральной среды, содержащей ретровирус, контактируемый с (1) вышеописанной смесью из молекулы, содержащей домен, связывающий ретровирус, и другой молекулы, содержащей домен, связывающий клетку-мишень, (2) вышеописанным функциональным материалом настоящего изобретения, обладающим новым доменом, связывающим ретровирус, и доменом,связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле, или (3) с вышеописанным функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим ретровирус. Как описано выше, данный функциональный материал может быть иммобилизован или может использоваться без иммобилизации. Инкубацию можно осуществлять в соответствии с обычным способом, например, при 37 С в условиях 5%-ной концентрации СО 2 и влажности 99,5%. Эти условия можно подобрать в зависимости от специфики используемых клетокмишеней, а период культивирования можно также изменять в соответствии со спецификой клеток и целей. Благодаря использованию способа настоящего изобретения, вирусные частицы могут быть локализованы в различных конструктах,которые доставляют вирусы в клетки-мишени. В очередном варианте осуществления настоящего изобретения, создали набор для использования ретровирус-опосредованного генного переноса в клетки-мишени. Данный набор включает: а) эффективное количество (1) смеси из молекулы, обладающей вышеописанным доменом, связывающим ретровирус, и другой молекулы, обладающей доменом, связывающим клетку-мишень или (2) функциональный материал, обладающий новым доменом настоящего изобретения, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле;(b) синтетический субстрат для инкубирования ретровируса, контактируемого с клетками-мишенями; и(c) фактор роста клетки-мишени для предварительного стимулирования клеток-мишеней. Функциональный материал (а) может быть иммобилизованным или не иммобилизованным. Данный набор может, кроме того, включать рекомбинантный ретровирусный вектор, необходимые буферы и т.п. В качестве синтетического субстрата можно использовать планшет для культивирования клеток, чашки Петри, флаконы и т.п. Они могут быть изготовлены из полистирола. В случае, когда клетки-мишени представляют собой клетки в G0-фазе, заражение ретровирусом не происходит и по этой причине,предпочтительно, клетки предварительно стимулируют для приведения клеток в определенный клеточный цикл. Для этой цели, клеткимишени культивируют в присутствии соответствующего фактора роста клетки перед инфицированием ретровирусом. Например, в случае генного переноса в клетки костного мозга и гемопоэтические стволовые клетки, можно использовать фактор роста клетки-мишени, такой как интерлейкин-6, или фактор стволовой клетки. Соответствующие представители, составляющие данный набор, могут быть получены в форме лиофилизированных продуктов, гранул,таблеток, кроме водных растворов, per se в соответствии с известными способами. Благодаря использованию набора настоящего изобретения можно получить, например,культуру трансформированной жизнеспособной клетки-мишени и можно проще осуществить ретровирус-опосредованную трансдукцию в клетки-мишени. Настоящее изобретение включает также способ генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, в котором функциональный материал выбран из группы, состоящей из практически чистого фибронектина, практически чистых фибронектиновых фрагментов и их смеси или их полимера, которые иммобилизуют на шариках или используют не иммобилизованными. Настоящее изобретение включает вышеописанный СН 2-826 и его функциональные элементы. Кроме того, в настоящем изобретении создали ген, кодирующий СН-2-826. Одним из его примеров является ген, представленныйSEQ. ID No. 20 в списке последовательностей. Настоящее изобретение включает также функциональные эквиваленты данного гена. Далее в настоящем изобретении создали вышеописанный CHV-181, включая его функциональные эквиваленты. Кроме того, в настоящем изобретении создали ген, кодирующийCHV-181. Одним из примеров данного гена является ген, представленный в списке последова 35 тельностей SEQ.ID No. 27. Настоящее изобретение включает также функциональные эквиваленты данного гена. В настоящем изобретении создали также полимер, содержащий полимер домена, связывающего соответствующий ретровирус и/или полимер домена, связывающего соответствующую клетку-мишень. Специфические примеры данного полимера представляют собой фактор роста фибробластов и полимер полипептида,обладающий доменом, связывающим инсулин,произведенный из коллагена типа V. Как обсуждается ниже, хотя настоящее изобретение не ограничивается какой-либо теорией, предполагается, что генный перенос в клетки с помощью ретровируса, т.е. трансформация, усиливается благодаря связыванию ретровируса с клеткой-мишенью по соответствующим функциональным доменам. Как таковой, функциональный материал,который связывается с ретровирусом, и, таким образом, пригоден для настоящего изобретения,представлен здесь практически чистым фибронектином, практически чистыми фибронектиновыми фрагментами или их смесью. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вышеописанные функциональные материалы настоящего изобретения, обладающие функциями практически теми же, что и практически чистый фибронектин и ему подобные повышают эффективность генного переноса, т.е. эффективность трансформации клеток-мишеней с помощью ретровируса. Фрагменты фибронектина, описанные здесь, могут иметь природное или искусственное происхождение, и могут быть получены практически чистыми из естественно встречаемых продуктов, например, в качестве ранее описанных у Ruoslahti с соавт. (1981) J. Biol. Chem. 256:7277; Patel и Lodish (1986) J. Cell. Biol. 102:449; и Bernardi с соавт. (1987) J. Cell. Biol. 105:489. В этом отношении, ссылка, приводимая здесь, на практически чистый фибронектин или фибронектиновый фрагмент, подразумевает средство, которое практически свободно от других белков, естественно встречаемых с фибронектином. Практически чистый фибронектин или фибронектиновый фрагмент, описанный здесь,может быть также получен методами генной инженерии, например, как в основном описано в патенте США 5198423. В частности, рекомбинантные фрагменты, идентифицированные ниже в примерах в качестве Н-271, Н-296, СН 271 (SEQ ID NO 23) и СН-296 (SEQ ID NO 24),и способы их получения подробно описаны в данном патенте. Фрагмент С-274, используемый в нижеследующих примерах, был получен так,как он описан в патенте США 5102988. Эти фрагменты или фрагменты, из которых они рутинно произведены, доступны благодаря культивированию Е. coli, депонированной в NIBH 1 003204 36 1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Япония, по Будапештскому Договору под инвентарным номером FERM Р-10721 (Н-296) (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989 г.), FERM ВР-2799 (С-277, связанный с Н-271 через метионин) (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989 г.), FERM BP-2800 (С-277, связанный с Н-296 через метионин) (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989 г.), а также как описано в патенте США 5198423. Кроме того, полезные сведения о фибронектиновых фрагментах, используемых здесь,или об исходных материалах для таких фрагментов, можно найти у Kimizuka с соавт., J. Biochem. 110, 284-291 (1991), который к тому же сообщает о вышеописанных рекомбинантных фрагментах; в ЕМВО J., 4, 1755-1759 (1985), где сообщается о структуре гена человеческого фибронектина; и в Biochemistry, 25, 4936-4941CS-1 и домен, связывающий Гепарин-II, значительно усиливают эффективность генного переноса в гемопоэтические клетки и действуют до сих пор. Таким образом, становится очевидным,что фибронектин-связанные полипептиды, описанные здесь, представляют аминокислотную последовательность, обладающую клеточносвязывающей активностью домена фибронектина, адгезирующего клетки CS-1, а также аминокислотной последовательностью домена фибронектина, связывающего Гепарин-II, который связывается с вирусом. Полипептид, связывающий вирус, используемый для усиления трансдукции при помощи ретровирусных векторов, как описано в WO 95/26200, включает (i) первую аминокислотную последовательность, которая корреспондирует сAla1690-Thr1960 из связывающего Гепарин-II домена человеческого фибронектина, который представлен по формуле (SEQ ID NO 1): или достаточно сходной аминокислотной последовательностью, которая, к тому же, прояв 37 ляет способность связывать соответствующий ретровирус; и (ii) вторую аминокислотную последовательность (CS-1), которая корреспондирует с одной частью IIICS-связывающего домена человеческого фибронектина; которая представлена по формуле (SEQ ID No. 2): или достаточно сходной аминокислотной последовательностью, которая к тому же проявляет способность связывать гемопоэтические клетки, такие как первичные половые и/или долговременные репопулирующие (стволовые) клетки. Ретровирус-связывающая активность полипептида, представленного выше с помощьюSEQ. ID No. 1 (H-271) показывает концентрационную зависимость и, как указано ниже в примере 8, показывает практически ту же активность, что и СН-271 при высоких концентрациях. То есть, ретровирус и клетки-мишени связаны, на первое время, как минимум, одной молекулой H-271 в присутствии высокой концентрации H-271. Сильное связывание вируса с доменом,связывающим вирус, функционального материала настоящего изобретения, может использоваться для конструирования систем доставки для вирус-опосредованной терапии посредством широкого круга типов клеток. Для этой цели,полипептид, содержащий ретровирус-связывающий домен функционального материала настоящего изобретения, можно присоединить к любому материалу, содержащему домен, связывающий клетку, который делает этот конструкт специфичным для клеток-мишеней, или может солокализоваться с материалом, содержащем свой домен, связывающий клетку. То есть, полипептид, связывающий определенный вирус,может быть ковалентно присоединен к материалу, связывающему определенную клетку, или они могут быть разными молекулами. Этот подход обходит прежнюю необходимость конструировать ретровирус-специфичные клеточные линии для каждой клетки-мишени и облегчает выбор функционального материала,обладающего наиболее подходящим доменом,связывающим клетку-мишень, в соответствии с видом отдельных клеток-мишеней. По этой причине, благодаря использованию функционального материала настоящего изобретения,специфическую трансдукцию клеток-мишеней легко осуществить, применяя, в частности, способ настоящего изобретения, в котором смесь функционального материала, обладающего ретровирус-связывающим доменом, и функционального метериала, обладающего доменом,связывающим клетку-мишень, особенно пригоден для переноса требуемого гена в предполагаемую клетку-мишень. Кроме того, новый функциональный материал, созданный в на 003204 38 стоящем изобретении, особенно пригоден для данного способа, повышающего эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов, и родственных методов. Далее настоящее изобретение подробно иллюстрируют нижеприведенные примеры, но они не рассматриваются как ограничивающие его объем. Пример 1.CRL-9642), содержащие ретровирусный плазмидный вектор PM5neo, содержащий ген устойчивости к неомицину (Exp. Hematol., 23, 630-638(1995 культивировали в модифицированной Дюльбекко среде ИглаBioscience), содержащей 10% околоплодной сыворотки теленка (FCS, Gibco), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (оба отGibco). Все DMEM, использованные ниже, содержали 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Супернатант,содержащий РМ 5nео-вирус, собирали путем добавления 4 млDMEM, содержащей 10% FCS, в полусообщающиеся чашки для культивирования в течение ночи. Собранную среду фильтровали через 0,45 микронные фильтры (Millipore) для получения вирусного супернатанта, который хранили перед использованием при -80 С. Что касается ретровирусной плазмиды,TKNEO-вектора, (Blood, 78, 310-317 (1991,TKNEO-вирусный супернатант получали раздельно по одним и тем же методикам, что и описанные выше при использовании клеток(2) Определение титра вируса в супернатанте. Титр вируса в супернатанте определяли путем использования клеток NIH/3T3, согласно стандартным методикам (J. Virol., 62, 1120-1124NIH/3 Т 3-клеток вносили в 6-луночную планшету для культивирования ткани. После культивирования в течение ночи, в каждую лунку вносили последовательно разбавленный вирусный супернатант вместе с гексадиметринбромидом(polybrene, выпущенный фирмой Aldrich) в конечной концентрации 7,5 мкг/мл. Этот супернатант инкубировали при 37 С в течение 24 ч и затем используемую среду заменяли средой,содержащей G418 (Gibco) в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Данную планшету инкубировали дальше. G418-устойчивые (G418r) колонии,которые выращивали более 10-12 дней, окрашивали кристаллическим фиолетовым, чтобы произвести подсчет. Количество инфицированных частиц в расчете на 1 мл супернатанта (cfu/ml) вычисляли умножением числа колоний на лунку при определенном уровне разведения и использовали его в качестве титра супернатанта для определения количества вирусного супернатан 39 та, добавляемого в последующих экспериментах. Пример 2.(1) Получение полипептида, произведенного из фибронектина. Полипептид, произведенный из человеческого фибронектина, Н-271 (аминокислотная последовательность показана в SEQ. ID No. 1 списка последовательностей), получали из Е.HB101/pCH101 (FERM BP-2799) культивировали в соответствии со способом, описанным в вышеуказанном патенте, и СН-271 выделяли из полученной культуры. А полипептид СН-296 (аминокислотная последовательность показана SEQ. ID No. 24) получали следующим образом. А именно, Escherichia coli HB101/pCH102 (FERM BP-2800) культивировали в соответствии со способом,описанным в вышеуказанном патенте и СР-296 выделяли из полученной культуры. Полипептид С-274 (аминокислотная последовательность показана в SEQ. ID No. 25 списка последовательностей) получали следующим образом. А именно, Escherichia coliJM109/pTF7221 (FERM BP-1915) культивировали в соответствии со способом, описанным в патенте США 5102988, и С-274 выделяли из полученной культуры. Далее, полипептид C277-CS1 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID.HB101/pCS25, который был описан в JP-A 3284700 под FERM P-11339 и был депонирован в вышеуказанном NIBH из 1-1-3 Higashi, Tsukubashi, Ibaraki-ken, no Будапештскому Договору,под инвентарным номером FERM ВР-5723 (дата первоначального депонирования: 5 марта 1990 г.), культивировали в соответствии со способом,описанным в вышеуказанном патенте, и C277CS1 выделяли из полученной культуры.(2) Получение C-FGFA. Полипептид C-FGFA (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID. No. 4 списка последовательностей) получали следующим образом. А именно, Е. coli, содержащую рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую вышеуказанный полипептид pYMHCFA, т.е., Escherichia coli JM109/pYMH-CFA(FERM BP-5278) культивировали в 5 мл LBбульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина при 37 С в течение 8 ч. Этот прекультивированный бульон инокулировали в 500 мл LB 003204 40 бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 1 мМ IPTG (изопропилD-тиогалактопиранозид) и культивировали при 37 С в течение ночи. Бактериальные клетки собирали, суспендировали в 10 мл PBS (фосфатно-солевой буфер), содержащего 1 мМ PMSF (фенилметансульфонийфторид) и 0,05% Nonidet P-40 и обрабатывали ультразвуком для разрушения полученных клеток. Полученную смесь центрифугировали для получения супернатанта. Для абсорбции 4,000 при 260 нм этого супернатанта добавляли 1 мл 5%-ного полиэтиленимина и эту смесь центрифугировали для получения супернатанта. Полученный супернатант наносили наHiTrap-Heparin-колонку (Pharmacia), уравновешенную PBS. После отмывки, с помощью PBS,не абсорбированной фракции, абсорбированную фракцию элюировали при помощи PBS, содержащего градиент NaCl от 0,5 М до 2 М. Полученный элюат анализировали SDS-электрофорезом в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), который показал наличие двух фракций, содержащих 47 кД полипептид. Одну из фракций, которую элюировали при высокой концентрацииNaCl, собирали и наносили на колонку Superose 6 (Pharmacia), уравновешенную PBS, содержащего 1,5 NaCl. Полученный элюат анализировали с помощью SDS-PAGE и, фракцию, содержащую полипептид, около, 47 кД, собирали для получения выделенного очисткой C-FGFA, который использовали в последующих стадиях.(3) Получение C-FGF-CS1. Вначале конструировали плазмиду для экспрессирования требуемого полипептида, CFCF-CS1 (аминокислотная последовательность показана в SEQ. ID No. 5 cписка последовательностей), в Escherichia coli в качестве хозяина. КультивировалиHB101/pCH102 (FERM ВР-2800) и из полученных бактериальных клеток получали плазмиду рСН 102 щeлoчнo-SDS-мeтoдoм. PCR осуществляли с использованием этой плазмиды в качестве матрицы, а также праймера М 4 (Takara ShuzoCo., Ltd) и праймера CS1-S, нуклеотидная последовательность которого показана в SEQ. IDNo. 9 в списке последовательностей, и амплифицированный фрагмент ДНК в данном реакционном растворе извлекали с помощью этанольного осаждения. Полученный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью NheI и SalI (оба фермента от Takara Shuzo Co., Ltd.), с последующим электрофорезом в агарозном геле для извлечения из данного геля 970 п.н. фрагмента ДНК. Затем культивировали Escherichia coliJM109/pYMH-CFA (FERM BP-5278) и из этих полученных бактериальных клеток щелочноSDS-методом получали плазмиду pYMH-CFA. Реакцию PCR осуществляли с использованием этой плазмиды в качестве матрицы, а также праймера CF, нуклеотидная последовательность которого показана в SEQ. ID No. 10, и праймераFNR, нуклеотидная последовательность которого показана в SEQ. ID No. 11 списка последовательностей, и амплифицированный фрагмент ДНК в этом реакционном растворе извлекали с помощью этанольного осаждения. Этот полученный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью Есо 521 (Takara Shuzo Co., Ltd.) и NheI, с последующим электрофорезом в агаровом геле,чтобы извлечь из данного геля 320 п.н. фрагмент ДНК. Фрагмент ДНК, около 4,1 т.п.н., выделяли путем обработки плазмиды pYMH-CFA с помощью Есо 521 и SalI и подвергали электрофорезу в агарозном геле, смешивали с вышеуказанным 970 п.н. фрагментом ДНК и, около, 320 п.н. фрагментом ДНК для лигирования их с полученной рекомбинантной плазмидой, которую инсерцировали в Е. coli JM109. Плазмиду, полученную из результирующего трансформанта,которая содержала каждую одну молекулу из вышеуказанных трех фрагментов ДНК, отбирали и назвали плазмидой pCFS100. Е. coli JM109,трансформированную с помощью плазмидыpCFS100. Данная плазмида pCFS100 обладает полученной из фибронектина на С-конце CFGFA областью, адгезирующей клетку, и кодирует соответствующий полипептид, C-FGF-CS1,в котором второй лизин с С-конца FGF заменен на аланин. Полипептид С-FGF-CSl получали следующим образом. А именно, вышеуказанную Е. coliJM109/pCFS100 культивировали в 5 мл LBбульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина,при 37 С в течение 8 ч. Этот прокультивированный бульон инокулировали в 500 мл LBбульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 1 мМ IPTG, и культивировали в течение ночи при 37 С для сбора бактериальных клеток. Полученные в итоге бактериальные клетки суспендировали в 10 мл PBS (фосфатно-солевом буфере), содержащем 0,5 М NaCl, 1 мМ PMSF и 0,05% Nonidet P-40, и данные бактериальные клетки обрабатывали ультразвуком на разрушение и центрифугировали для получения супернатанта. Этот супернатант наносили на HiTrap-Heparinколонку, предварительно уравновешенную сPBS, содержащем 0,5 М NaCl, не адсорбированные фракции отмывали с помощью PBS, содержащего 0,5 М NaCl, а адсорбированную фракцию элюировали с помощью PBS, имеющего градиент концентрации NaCl от 0,5 до 2 М. Полученный элюат анализировали с помощьюSDS-полиакриламидного гелевого электрофореза и собирали фракции, около, 50 кД полипептида, чтобы получить выделенный очисткой CFGF-CS1, который использовали в последующих стадиях. Полученную таким образом аминокислотную последовательность, исследовали, от Nконца до пятой аминокислоты выделенного очисткой C-FGF-CS1, и обнаружили совмести 003204 42 мость с последовательностью, которая показана в SEQ. ID No. 5 списка последовательностей. Кроме того, измеренный с помощью массспектроскопии молекулярный вес выделенного очисткой C-FGF-CS1 совпадал с молекулярным весом, ожидаемым от вышеуказанной аминокислотной последовательности.(4) Получение C-277-ColV. Полипептид C277-C01V (аминокислотная последовательность показана в SEQ. ID No. 6 списка последовательностей) выделяли очисткой следующим образом. А именно, Е. coli, содержащую рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую вышеуказанный полипептид, pTF7520ColV, т.е. Escherichia coliJM109/pTF7520 ColV (FERM BP-5277), культивировали в 5 мл LB-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина при 37 С в течение 6,5 ч. Этот прокультивированный бульон инокулировали в 500 мл LB-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина, и культивировали при 37 С. Когда абсорбция при 660 нм достигала 0,6, в этот бульон вносили IPTG в конечной концентрации доведенной до 1 мМ, и этот бульон культивировали в течение ночи, чтобы собрать бактериальные клетки. Полученные бактериальные клетки суспендировали в 10 мл PBS,содержащего 1 мМ ЭДТА, 0,05% Nonidet P-40 и 2 мМ PMSF, и обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин до разрушения клеток. Раствор с разрушенными клетками центрифугировали и полученный в итоге супернатант наносили наResource Q-колонку (Pharmacia) для получения не адсорбированной фракции, содержащей требуемый полипептид. Данную фракцию наносили на HiTrap-Heparin-колонку, уравновешенную с помощью PBS. После отмывания не адсорбированной фракции с помощью PBS, адсорбированную фракцию элюировали с помощью PBS,имеющего градиент NaCl от 0 М до 0,5 М. Полученный элюат анализировали в SDS-PAGE и собирали соответствующие фракции, содержащие 48 кД полипептид, для получения выделенного очисткой С 277-СоlV, который использовали в последующих стадиях.(5) Получение СоlV. Вначале конструировали плазмиду для экспрессирования полипептида ColV (аминокислотная последовательность показана в SEQ.pTF7520ColV (FERM ВР-5277) и из, полученных в итоге, бактериальных клеток щeлoчнoSDS-мeтoдoм получали плазмиду pTF7520ColV. Эту плазмиду обрабатывали с помощью NcoI иBamHI (оба фермента от Takara Shuzo Co., Ltd.),с последующим электрофорезом в агарозном геле для извлечения из данного геля фрагмента ДНК, около, 0,58 т.п.н. Извлеченный фрагмент смешивали с плазмидным вектором pET8C (Novagen), преобработанного с помощью NcoI иBamHI, для лигирования с ним. Итоговую рекомбинантную плазмиду интродуцировали в Е.coli BL21 для получения трансформанта, из которого получали плазмиды, отобрали плазмиду,содержащую только одну молекулу вышеуказанного фрагмента ДНК, около 0,58 т.п.н., и назвали pETColV. Е. coli BL21, трансформированную вышеуказанной плазмидой pETColV, то есть, Escherichia coli BL-21/pETColV, культивировали в течение ночи в 10 мл LB-бульона, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, при 37 С. 0,2 мл этого прекультивированного раствора инокулировали в 100 мл L-бульона, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, с последующим культивированием при 37 С. Когда абсорбция достигала при 600 нм 0,4, в него вносили IPTG до конечной концентрации 1 мМ, с последующим культивированием в течение ночи, чтобы собрать бактериальные клетки. Итоговые бактериальные клетки суспендировали в 5 мл PBS (фосфатно-солевой буфер), содержащем 1 мМ ЭДТА, 0,5 % NonidetP-40, 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина и 2 мМ PMSF, эти клетки подвергали ультразвуковой обработке на разрушение, с последующим центрифугированием для получения супернатанта. Супернатант наносили на HiTrapHeparin-колонку, уравновешенную с PBS, не адсорбированные фракции вымывали с помощью PBS, а адсорбированную фракцию элюировали с помощью PBS, содержащего 0,5 МNaCl. Полученный элюат анализировали в SDSполиакриламидном гелевом электрофорезе и подтверждали практическую гомогенность,около, 18 кД полипептида. Полученный таким образом, выделенный очисткой, ColV использовали в последующих стадиях.(6) Получение Н 2-547. Плазмиду для экспрессирования полипептида Н 2-547 (аминокислотная последовательность показана в SEQ. ID No. 13 cписка последовательностей) конструировали следующим образом. Культивировали Escherichia coliHB101/pCH101 (FERM ВР-2800) и, с использованием щeлoчнo-SDS-мeтoдa, из культивированных клеток получали плазмиду рСН 102. Осуществляли PCR, используя эту плазмиду в качестве матрицы, а также праймер 12S, нуклеотидная последовательность которого показана в SEQ. ID No. 15 списка последовательностей, и праймер 14 А, нуклеотидная последовательность которого показана в SEQ. ID No. 16 списка последовательностей, с последующим электрофорезом в агаровом геле для извлечения из данного геля фрагмента ДНК, около 0,8 т.п.н., кодирующего связывающий гепарин полипептид фибронектина. Извлеченный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью NcoI и 44 в Е. coli JM109. Из итогового трансформанта получали плазмиды, отбирали плазмиду, содержащую вышеуказанный фрагмент ДНК и назвали плазмиду pRH1. Плазмидный вектор, pINIII-ompA1 (TheCo., Ltd.) для извлечения фрагмента ДНК, около 0,9 т.п.н., содержащего липопротеиновую терминаторную область. Извлеченный фрагмент смешивали с плазмидой pRH1, обработанной с помощью BamHI-HincII, для их лигирования,чтобы получить плазмиду pRH1-T, содержащуюlac-промотор, фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, связывающий гепарин, и липопротеиновый терминатор, в данном порядке. Фрагмент ДНК, около 3,1 т.п.н., получали в результате обработки плазмиды pRH1-T, с помощью NheI и ScaI (оба фермента от TakaraShuzo Co., Ltd.), а фрагмент ДНК, около 2,5 т.п.н., получали в результате обработки плазмиды pRH1-Т, соответственно, с помощью Spe I(Takara Shuzo Co., Ltd.) и ScaI, и эти два фрагмента лигировали с получением плазмидыpRH2-T, содержащей lac-промотор, открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, в котором два полипептида, связывающие гепарин, соединены в тандем, и липопротеиновый терминатор, в данном порядке. Нуклеотидная последовательность вышеуказанной открытой рамки считывания показана в SEQ. ID No. 17 списка последовательностей. Полипептид Н 2-547 получали следующим образом. Готовили четыре колбы Эрленмейера по 500 мл, снабженные перегородкой, содержащие 120 мл LB-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина, в который инокулировали Е. coli НВ 101, трансформированную с помощью вышеуказанной плазмиды PRH2-T, то есть Escherichia coli HB101/pRH2-T, для культивирования в течение ночи при 37 С. Культивированные клетки собирали центрифугированием, суспендировали в 40 мл лизирующего буфера (50 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1 мМDTT, 1 мМ PMSF, рН 7,5) и обрабатывали эти бактериальные клетки ультразвуком на разрушение. Супернатант, полученный путем центрифугирования, наносили на колонку High trapHeparin (Pharmacia), уравновешенную буфером для выделения (50 мМ трис-HCl, рН 7,5). Не адсорбированные в колонке фракции вымывали с помощью этого же буфера, с последующим элюированием с помощью буфера для выделения, имеющего градиент концентрации NaCl от 0 до 1 М. Полученный элюат анализировали с помощью SDS-полиакриламидного гелевого электрофореза и собирали фракции, содержащие полипептид, обладающий молекулярным весом около 60000, для получения выделенного очисткой препарата Н 2-547. Количество белка,содержащегося в этом полученном препарате,анализировали с помощью ВСА PROTEIN AS 45SAY REAGENT (Pierce) с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта, свидетельствующего о получении около 10 мг Н 2-547. Исследовали аминокислотную последовательность от N-конца до пятого остатка, выделенного очисткой полученного таким образом Н 2-547, и обнаружили совместимость с аминокислотной последовательностью Н 2-547, ожидаемой из нуклеотидной последовательности,показанной в SEQ. ID No. 17 cписка последовательностей, минус метионин на N-конце (ее последовательность показана в SEQ. ID No. 13 списка последовательностей). Молекулярный вес выделенного очисткой Н 2-547, измеренного с помощью масс-спектрометрии, совместим с ожидаемым молекулярным весом из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ.ID No. 13 списка последовательностей. 7) Получение СН 2-826. Плазмиду для экспрессирования полипептида СН 2-826 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ. ID No. 14 списка последовательностей) конструировали следующим образом. PCR осуществляли с использованием вышеуказанной плазмиды рСН 102 в качестве матрицы, а также праймера CLS, нуклеотидная последовательность которого показана в SEQ.ID No. 18 списка последовательностей, и праймера CLA, нуклеотидная последовательность которого показана в SEQ. ID No. 19 списка последовательностей, с последующим электрофорезом в агаровом геле для извлечения фрагмента ДНК, около 0,8 т.п.н., кодирующего адгезирующий клетку полипептид фибронектина. Этот полученный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью NcoI и BglII (оба фермента от TakaraJM109. Из итогового трансформанта получали плазмиды и плазмиду, содержащую вышеуказанный фрагмент ДНК, отобрали и назвали плазмидой pRCl. Фрагмент ДНК, около 2,5 т.п.н., полученный путем обработки плазмидыpRCl, с помощью SpeI и ScaI, и фрагмент ДНК,около 3,9 т.п.н., полученный путем обработки вышеуказанной плазмиды pRH2-T с помощьюNheI и ScaI, смешивали дли их лигирования,чтобы получить плазмиду pRCH2-T, кодирующую полипептид, в котором два полипептида,связывающие гепарин, тандемно соединены с Сконцевым полипептидом, адгезирующим клетку. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания в этой плазмиде pRCH2-T,кодирующей этот полипептид, показан в SEQ.ID No. 20 списка последовательностей. Полипептид СН 2-826 получали в соответствии с тем же способом, который использовали для получения полипептида Н 2-547, описанного в примере 2(6). Фракции, содержащие полипептид, обладающий молекулярным весом около 46 90000, собирали из элюата колонки High trapHeparin, для получения выделением очисткой СН 2-826.(8) Получение H2S-537. Плазмиду для экспрессирования полипептида H2S-537 (аминокислотная последовательность показана в SEQ. ID No. 30 списка последовательностей) конструировали следующим образом. PCR осуществляли с использованием вышеуказанной плазмиды рСН 102 в качестве матрицы, а также праймера CS1S, нуклеотидная последовательность которого показана в SEQ.ID No. 31 списка последовательностей, и праймера CS1A, нуклеотидная последовательность которого показана в SEQ. ID No. 32 списка последовательностей, с последующим электрофорезом в агаровом геле для извлечения фрагмента ДНК, около 0,1 т.п.н., кодирующей адгезирующий клетку полипептид фибронектина. Извлеченный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью NcoI и BamHI (оба фермента от TakaraJM109. Из итогового трансформанта получали плазмиды и плазмиду, содержащую вышеуказанный фрагмент ДНК, отбирали и назвали плазмидой pRS1. Плазмидный вектор pINIII-ompA1 обрабатывали с помощью BamHI и HincII для извлечения фрагмента ДНК, около 0,9 т.п.н., содержащего область липопротеинового терминатора. Извлеченный фрагмент смешивали с плазмидойpRSl-T, содержащей lac-промотор, фрагмент ДНК, кодирующий CS-1-область полипептида и липопротеиновый терминатор, в данном порядке. Получали фрагмент ДНК, около 2,4 т.п.н.,полученный путем обработки этой плазмидыpRSl-T с помощью NheI и ScaI, и фрагмент ДНК, около 3,3 т.п.н., полученный путем обработки вышеуказанной плазмиды pRH2-T с помощью SpeI, ScaI и PstI (Takara Shuzo Co., Ltd.). Их лигировали с получением плазмиды pRH2ST, содержащей lac-промотор, открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, обладающий такой структурой, в которой два полипептида, связывающие гепарин, тандемно соединены, а затем к его С-концу присоединялиCS-1-область, и липопротеиновый С-терминатор, в данном порядке. Нуклеотидная последовательность вышеуказанной открытой рамки считывания показана в SEQ. ID No. 32 списка последовательностей. Полипептид H2S-573 получали в соответствии с тем же методом, который использовали для получения полипептида Н 2-547, описанного в примере 2 (6). Фракции, содержащие полипептид, обладающие молекулярным весом около 47 60000, собирали из элюата колонки High trapHeparin для получения очищенного H2S-573.(9) Иммобилизация функционального материала на планшете. Для использования планшета, на котором иммобилизовали функциональный материал для проведения эксперимента по заражению клеток ретровирусом (6-луночный планшет для культивирования ткани, Falcon), иммобилизацию осуществляли в соответствии со следующими операциями. А именно, раствор каждого функционального материала, описанного в вышеуказанных примерах, в PBS в подходящей концентрации, наносили на планшет в количестве 2 мл на лунку (донная площадь 9,6 см 2) и планшет инкубировали под УФ-светом при комнатной температуре в течение одного часа, не закрывая его, а затем еще полчаса в закрытом состоянии. Затем, раствор полипептида заменяли на 2 млPBS, содержащего 2 % бычьего сывороточного альбумина (BSA, Boehringer Mannheim) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Планшет промывали с помощью PBS,содержащего 25 мМ HEPES. Сенсибилизированный контрольный планшет, в котором иммобилизовали BSA, получали в соответствии с тем же способом, который приведен выше, за исключением того, что инкубацию с полипептидом не осуществляли. Для эксперимента генного переноса (вирусное заражение) в нижеприведенных Примерах, если не указано иначе, использовали вышеуказанный 6-луночный планшет для тканевой культуры. Если концентрация функционального материала, используемого для иммобилизации на планшете, указывалась, количество полипептида на единицу площади дна лунки описывали с использованием в качестве единицы пмоль/см 2 (и мкг/см 2). Например, когда иммобилизацию осуществляли путем использования в вышеуказанном планшете 2 мл 48 мкг/мл раствора Н-271 (донная площадь 9,6 см 2), то это соответствует описанию "иммобилизация была осуществлена с 333 пмоль/см 2 (10 мкг/см 2) Н-271". А планшет, иммобилизованный С-296, используемый для культивирования не прилипших клеток (TF-1, HL-60) после трансдукции, получали путем иммобилизации 48 пмоль/см 2 (3 мкг/см 2) раствора СН-296, в соответствии с вышеприведенными операциями. В последующих пимерах вирусное заражение клеток-мишеней всегда осуществляли в среде безpolybrene. Если количество вируса, клеток, среды и т.п. указано, то и описано соответствующее количество на лунку, если не оговорено особо. Пример 3.(1) Генный перенос с использованием смеси функциональных материалов. Нижеследующие эксперименты осуществляли для изучения эффекта на генный перенос в случае иммобилизации на планшете смеси материала, связывающего клетку, и материала, 003204 48 связывающего ретровирус. Вначале, каждый полипептид иммобилизовали на планшете путем использования 32 пмоль/см 2 (1,5 мкг/см 2) CFGF-A, смеси 32 пмоль/см 2 (1 мкг/см 2 С-274 и 32 пмоль/см 2 (0,5 мкг/см 2) FGF (Becton Dickinson) в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9). После преинкубации 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000cfu вируса РМ 5nео, на соответствующих планшетах, и контрольном планшете, покрытом BSA при 37 С в течение 30 мин, эти планшеты тщательно промывали с помощью PBS. В каждый из этих планшетов вносили 2 мл среды DMEM,содержащей 2000 клеток NIH/3T3, и инкубировали при 37 С в течение 2 ч в отсутствие polybrene. He адгезированные клетки собирали декантированием, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для отделения их от планшета. Полученные клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины. Одну половинную порцию культивировали в DMEM, a другую порцию культивировали в DMEM, содержащей G418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37 С в течение 10 дней и подсчитывали появляющиеся колонии. Подбор определенного соотношения числа устойчивых G418 (G418r) колоний по отношению к колониям, полученным в среде безG418, в качестве эффективности генного переноса, показан на фиг. 1. На фиг. 1 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 1, в случае 2-х часового ретровирусного заражения при использовании смеси С-274 и FGF, колонии G418r получали с той же эффективностью генного переноса, что и C-FGFA, где эти два полипептида ковалентно соединены, хотя эффективность генного переноса, полученная с использованием одного лишь FGF была ниже, чем с использованием C-FGFA. С целью подробного изучения эффект иммобилизации одного лишь С-274 и одного лишьFGF сравнивали с эффектом иммобилизации их смеси. А именно, оценку осуществляли исключая планшеты, полученные с 32 пмоль/см 2 (1 мкг/см 2) С-274, 32 пмоль/см 2 (0,5 мкг/см 2) FGF и смеси, соответственно, из 32 пмоль/см 2 С-274 и 32 пмоль/см 2 FGF одним и тем же способом,который описан в примере 2 (9). Полученные результаты показаны на фиг. 2. На фиг. 2 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 2 при использовании планшета, на котором осуществляли иммобилизацию смесью из С-274 и FGF, эффективность генного переноса была выше, чем при использовании планшета, на котором иммобилизовали только FGF. А на планшете, на котором иммо 49 билизацию осуществляли с помощью С-274,который не обладает доменом, связывающим какой-либо ретровирус, колонии G418r не появлялись. Это показывает, что при объединенииFGF, который обладает доменом, связывающим ретровирус, с С-274, который обладает доменом, связывающим клетку, можно повысить эффективность генного переноса, в сравнении с переносом, полученным при использовании только FGF, и что ковалентное соединение полипептидов не обязательно требуется для создания такого эффекта этими объединенными полипептидами.(2) Генный перенос с использованием смеси функциональных материалов. В соответствии с тем же способом, который описан в примере 3 (1), оценку осуществляли за исключением того, что полипептид, обладающий доменом, связывающий ретровирус,заменяли на ColV. В этом эксперименте исследовали эффект смешивания С-274 и ColV в различных молярных соотношениях. А именно, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), иммобилизацию на планшетах осуществляли путем использования, соответственно, 330 пмоль/см 2 (6 мкг/см 2) ColV,смеси из 330 пмоль/см 2 (10 мкг/см 2) С-274 и 330 пмоль/см 2 ColV (молярное соотношение C-274 :ColV= 10 : 10), смеси из 100 пмоль/см 2 (3 мкг/см 2) С-274 и 330 пмоль/см 2 ColV (3 : 10),смеси из 33 пмоль/см 2 (1 мкг/см 2) С-274 и 330 пмоль/см 2 ColV (1 : 10), 330 пмоль/см 2 (16 мкг/см 2) С 277-ColV и 330 пмоль/см 2 (10 мкг/см 2) С-274. При использовании полученных таким образом планшетов эффект ретровирусного заражения исследовали в соответствии с тем же способом, который описан выше. Полученные результаты показаны на фиг. 3. На фиг. 3, на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 3, в случае 2-х часового заражения, эффективность заражения планшета, иммобилизованного ColV, была менее 1/2 от планшета, иммобилизованного C277ColV, тогда как инфекционная эффективность планшета, на котором осуществляли иммобилизацию смесью из ColV и его 1/10 количеством С-274, была той же, что и у планшета, иммобилизованного C277-ColV. Следовательно, ретровирусное инфицирование, усиливающее активность С-274, выясняли по наблюдению для случая с FGF. Этот эффект был несколько снижен в случае, в котором количество молекул С-274 относительно молекул ColV было повышено. При покрытии смесью, содержащей те же количества ColV и С-274, существенных различий между данной смесью и одним лишь ColV не имелось.(3) Генный перенос с использованием смеси функциональных материалов. 50 С целью исследовать ретровирусное воздействие на эффективность генного переноса при иммобилизации смесью материала, обладающего доменом, связывающим клетку, и материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, осуществили нижеследующий эксперимент. Прежде всего, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9),осуществили иммобилизацию планшетов с помощью, соответственно, 32 пмоль/см 2 (1 мкг/см 2) С-274, 333 пмоль/см 2 (10 мкг/см 2) Н 271 и смесью из 32 пмоль/см 2 (1 мкг/см 2) С-274 и 333 пмоль/см 2 (10 мкг/см 2) Н-271. После преинкубации 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 cfu вируса РМ 5nео, на соответствующих планшетах при 37 С в течение 30 мин, планшеты тщательно промывали с помощью PBS. В каждый из этих планшетов вносили 2 мл среды DMEM, содержащей 2000 клетокNIH/3T3, и инкубировали при 37 С в течение 2 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для отделения их от планшета. Полученные клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины. Одну половинную порцию культивировали вDMEM, а другую порцию культивировали вDMEM, содержащей G418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37 С в течение 10 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали. Подбор соотношения числа G418r-кoлoний относительно колоний,полученных в среде без G418, в качестве эффективности генного переноса, данные результаты показаны на фиг. 4. На фиг. 4 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 4, при использовании планшета, на котором иммобилизовали смесь из С-274 и Н-271 (молярное соотношение =1 : 10),эффективность инфицирования была существенно повышена. На планшете, с иммобилизованным С-274, генный перенос не наблюдали.C277-CS1. С целью исследовать ретровирусное действие на инфекционную эффективность, при использовании C277-CS1, в качестве материала,обладающего доменом, связывающим клетку, и иммобилизацию его смеси и материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус,осуществили нижеследующий эксперимент. В качестве материала, связывающего ретровирус,использовали полилизин [(Lys)n, поли-Lлизиингидробромид, молекулярный вес: 50000100000, Wako Pure Chemical Co., Ltd.] и Н-271. В качестве соответствующих клеток, использовали не адгезирующие клетки, TF-1-клетки(9), осуществили иммобилизацию на планшетах путем использования нижеследующих растворов: C-277-CS1 (33 пмоль/см 2, 1,1 мкг/см 2), полилизина (133 пмоль/см 2, 10 мкг/см 2), смеси изC-277-CS1 (33 пмоль/см 2) и полилизина (133 пмоль/см 2), Н-271 (333 пмоль/см 2, 10 мкг/см 2) и смеси из C-277-CS1 (33 пмоль/см 2) и Н-271 (333 пмоль/см 2) и СН-296 (33 пмоль/см 2, 2,1 мкг/см 2),соответственно. В каждый планшет вносили среду RPMI-1640 [содержащую 5 нг/мл GM-CFS(Petro Tech), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина], содержащую 1 х 104 cfu вируса TKNEO, 1 х 104 TF-1-клеток и планшет инкубировали при 37 С в течение 24 ч. После инкубации собирали не адгезированные клетки путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с планшета. Полученные клетки объединяли. Одну из пяти порций итоговой клеточной суспензии переносили в два планшета, покрытые СН-296, и инкубировали в течение 24 ч. Затем в одной из порций меняли среду на вышеуказанную среду, а среду из другой порции меняли на вышеуказанную среду,содержащую G418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37 С в течение 8 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали. Частоту G418r - (эффективность переноса гена) колоний вычисляли на основе численностей колоний, появившихся в присутствии и отсутствии G418. Полученные результаты показаны на фиг. 5. На фиг. 5, на абсциссе указаны соответствующие используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса. На фиг. 5, (а) отражает использование соответствующего полилизина в качестве материала, связывающего ретровирус,и (b) отражает использование Н-271. В сравнении с планшетом, на котором иммобилизован только материал, связывающий ретровирус, эффективность генного переноса существенно выше благодаря использованию полилизина или Н-271 вместе с C277-CS1, обладающим доменом, связывающим клетку.(5) Получение полипептида, происходящего из эритропоэтина. Полипептидное производное, которое представляет собой эритропоэтин слитый с глутатион-S-трансферазой (GST-Epo), получали для использования для генного переноса в клетки, обладающие эритропоэтиновым рецептором. Его аминокислотная последовательность показана в SEQ. ID No. 34 списка последовательностей. В этой последовательности аминокислотная последовательность от 233-й аминокислоты до 398-й аминокислоты корреспондирует с эритропоэтином. Вначале с помощью нижеследующих операций сконструировали плазмиду для экспрессии GST-Epo. PCR осуществляли с использова 003204 52 нием кДНК-библиотеки, полученной из печени человеческого плода (Clonetech) в качестве матрицы, и праймеров EPF1 и EPR1, показанных вSEQ. ID Nos. 35 и 36 списка последовательностей). Часть этой реакционной смеси отобрали и использовали в качестве матрицы в дополнительной PCR в присутствии праймеров EPF2 иEPR2 (соответствующие нуклеотидные последовательности праймеров EPF2 и EPR2 показаны в SEQ. ID Nos. 37 и 38 списка последовательностей). Амплифицированные фрагменты ДНК извлекали из реакционной смеси, обрабатывали с помощью EcoRI и BamHI (оба фермента от Takara Shuzo Co., Ltd.) и затем подвергали агарозному электрофорезу для извлечения фрагмента ДНК, около 520 п.н., который содержит область, кодирующую эритропоэтин. Полученный итоговый фрагмент смешивали с плазмидным вектором pTV118N (Takara Shuzo Co.,Ltd.), который обрабатывали с помощью EcoRI(Takara Shuzo Co., Ltd.) и BamHI для лигирования его с данной плазмидой. Затем, этой плазмидой трансформировали Е. coli JM109. Трансформант, удерживающий вышеуказанную плазмиду, отбирали из итоговых трансформантов,чтобы получить плазмиду, которую назвали плазмидой рЕРО. Затем, полученную плазмиду рЕРО обрабатывали с помощью EcoRI и SalI(Takara Shuzo Co., Ltd.) и подвергали агарозному электрофорезу для извлечения фрагмента ДНК, около, 0,5 т.п.н. Этот фрагмент смешивали с плазмидным вектором pGEX5X-3 (Pharmacia), обработанного с помощью EcoRI и SalI,чтобы лигировать их. Этой полученной плазмидой трансформировали Е. coli JM109. Трансформант, удерживающий вышеуказанную плазмиду отбирали из полученных трансформантов,чтобы выделить плазмиду. Плазмида была названа pGSTEPO. Эта плазмида кодирует GSTEPO, в которой аминокислотная последовательность эритропоэтина присоединена к С-концу глутатион-S-трансферазы, произведенной из данного вектора. Нуклеотидную последовательность, кодирующая GST-EPO в плазмидеpGSTEPO, показана в SEQ. ID No. 39 списка последовательностей. Полипептид GST-EPO получали с помощью следующих операций. Готовили семь культуральных пробирок, каждая содержала по 5 млpGSTEPO, Escherichia coli JM109/pGSTEPO,инокулировали в каждый бульон, с последующим инкубированием при 37 С в течение ночи. Затем готовили семь 2-х литровых колб Эрленмейера, каждая содержала 500 мл этого же бульона, и в каждую колбу инокулировали порцию в 5 мл вышеуказанной культуры, с последующим инкубированием при 37 С. Через 3,5 ч после начала инкубации, вносили IPTG до конечной концентрации 1 мМ и продолжали ин 53 кубацию еще 3,5 ч. По завершению культивирования, клетки извлекали из этого культурального бульона центрифугированием, суспендировали в 100 мл PBS, содержащем 1 мМ PMSF и 1 мМ ЭДТА и разрушали с помощью ультразвуковой обработки. К обработанному раствору добавляли 100 мл PBS, содержащий 1 мМPMSF, 1 мМ ЭДТА и 2% Тритона Х-100. Полученную смесь ставили на лед на 30 мин и центрифугировали для получения супернатанта. Полученный супернатант фильтровали через 0,45 мкм фильтр (Millipore) и наносили на колонку глутатион-Sephallose 4B (Pharmacia, 3 мл), уравновешенную PBS. После промывания колонки с помощью PBS, колонку элюировали 50 мМ Трис-HCl, содержащем 10 мМ глутатиона (рН 8,0). Полученный элюат анализировали вSDS-полиакриламидном гелевом электрофорезе и собирали фракцию, содержащую полипептид,обладающий молекулярным весом, около,44000. Эту фракцию диализовали против PBS. Диализованный образец наносили на колонкуResourse Q (Pharmacia), уравновешенную PBS. После промывания колонки с помощью PBS,колонку элюировали с помощью PBS, обладающего градиентом NaCl от 0 М до 0,6 М. В соответствии с тем же способом, который описан выше, эту колонку элюировали с помощью 50 мМ Трис-HCl, содержащего глутатион (рН 8,0), чтобы собрать фракцию, содержащую полипептид, обладающий молекулярным весом,около, 44000. Полученную фракцию с этим полипептидом подвергали ультрафильтрации с помощью Centricon 10 (Amicon) для концентрирования до, около, 50 мкл. Далее ее фильтровали с помощью Ultrafree C3GVSTRL (Millipore) и полученный фильтрат подвергали гельфильтрующей хроматографии с использованием колонки Superdex 200 (Pharmacia, уравновешенная с PBS). Элюированную фракцию, содержащую полипептид, обладающий молекулярным весом, около, 44000, собирали и использовали в качестве GST-EPO-полипептидного раствора в последующих экспериментах. В этом GST-Epoрастворе около 50% общего белка составлял(6) Генный перенос в клетки, экспрессирующие эритропоэтиновый рецептор. Эффект генного переноса с использованием эритропоэтина в качестве материала, обладающего активностью, связывающей клетку,изучали с применением двух видов клеток, TF1, которые экспрессируют эритропоэтиновый рецептор, и HL-60 (АТСС CCL-240), которые не экспрессируют этот эритропоэтиновый рецептор. В данном исследовании, вышеуказанное полипептидное производное эритропоэтина(GST-Epo) использовали в качестве эритропоэтина, а полилизин использовали в качестве материала, связывающего ретровирус. Вначале, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), иммобилизацию на планше 003204 54 тах осуществляли путем использования, соответственно, 34 пмоль/см 2 (1,5 мкг/см 2) GST-Epo,полилизина (133 пмоль/см 2, 10 мкг/см 2), смесиGST-Epo (34 пмоль/см 2) и полилизина (133 пмоль/см 2). В каждый планшет вносили среду,содержащую 1 х 104 cfu вируса TKNEO и 1 х 104 клеток и этот планшет инкубировали при 37 С в течение 24 ч. В качестве среды использовали среду RPMI1640 (содержащую 5 нг/мл GM-CFS,50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина) для TF-1, а для HL-60 использовали среду RPMI (Nissui, содержащую 10 % FCS, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина). После инкубации путем декантирования собирали не прилипшие клетки, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с планшета. Собранные клетки объединяли. Порции, соответствующие одной пятой этой полученной клеточной суспензии, переносили в два планшета, иммобилизованные с СH-296, и инкубировали в течение 24 ч. Затем среду в одной из порций заменяли вышеуказанной средой, а среду в другой порции заменяли вышеуказанной средой,содержащей G418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37 С в течение 8 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали. Частоту G418r-колоний (эффективность генного переноса) вычисляли на основе численностей колоний, возникающих в присутствии и отсутствии G418. Полученные результаты показаны на фиг. 6. На фиг. 6 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а, соответственно,на ординате указана эффективность генного переноса. В случае использования TF-1-клеток,как показано на фиг. 6(а), несмотря на то, что генный перенос имел место с некоторым избытком в планшете, в котором иммобилизовали только полилизин, повышенная эффективность генного переноса была получена в присутствииGST-Epo. С другой стороны, в случае использования HL-60, как показано на фиг. 6(b), в присутствии GST-Epo повышенной эффективности генного переноса не наблюдали. Эти результаты показывают, что генный перенос, специфичный для клетки-мишени, возможен, благодаря использованию эритропоэтина. Кроме того, эксперимент по генному переносу в TF-1-клетки осуществляли путем замены материала, связывающего ретровирус, на Н 2547. В соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9) , иммобилизацию на планшетах осуществляли с использованием,соответственно, Н 2-547 (333 пмоль/см 2, 20 мкг/cм 2), GST-Epo, корреспондирующего с 34 пмоль/см 2, 1,5 мкг/см 2, и смеси из GST-Epo (34 пмоль/см 2) и Н 2-547 (333 пмоль/см 2, 20 мкг/см 2). Одновременно осуществляли контрольный эксперимент с использованием планшета с иммобилизованным BSA. 55 Полученные результаты показаны на фиг. 7. На фиг. 7 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате, соответственно, указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 7 в случае использования Н 2-547, эффективность генного переноса в TF-1-клетки была повышенной в присутствии GST-Epo.(7) Генный перенос с использованием шариков, на которых иммобилизована смесь функциональных материалов. Можно ли повысить эффективность инфицирования ретровирусом путем использования шариков, на которых иммобилизованы оба материала, материал, обладающий доменом, связывающим клетку, и материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, или не иммобилизованы - не исследовали. Шарики, на которых иммобилизовали полипептиды, были получены в соответствии с нижеследующими операциями. В качестве шариков использовали полистироловые шарики,имеющие диаметр 1,14 мкм (Polybeads Polystyrene Microsphere, производимые PolyScience). К 20 мкл 2,5%-ной суспензии вышеуказанных шариков добавляли 80 мкл этанола и 2 мл разных полипептидных растворов в PBS, оставляя затем на ночь при 4 С. К этому добавляли BSA и PBS с получением 4 мл 1%-ной суспензии BSA/PBS. Шарики удаляли из полученной суспензии путем центрифугирования и вновь суспендировали в 5 мл 1%-ной BSA/PBS. Затем, полученную суспензию оставляли при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы получить суспензию шариков, с иммобилизованным полипептидом. В качестве полипептидных растворов использовали 100 мкг/мл С-274, 100 мкг/мл Н-271, 100 мкг/мл СН-271, 100 мкг/мл СH-296 и смесь из 100 мкг/мл Н-271 и 10 мкг/мл С-274. В качестве контроля получали шарики, покрытые 2 %-нымBSA, в соответствии с тем же указанным способом. Одну десятую порцию шариков, иммобилизованных полипептидом, полученных таким образом, извлекали из вышеуказанной суспензии и инкубировали при 37 С в течение ночи вместе, соответственно, с 2000 TF-1-клеток и с 1000 cfu супернатанта вируса TKNEO. Эти клетки извлекали и суспендировали в среде(Petrotech), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина], содержащей 0,3% Бакто-агара (Difco) и высевали в 35 мл чашку на изготовленную вышеуказанную среду, содержащую 0,5% Бакто-агара. Использовали две среды, содержащие 0,75 мг/мл G418 и без G418. Чашку инкубировали в 5%-ном СO2 при 37 С в течение 14 дней. Колонии, которые появлялись в присутствии G418 и в отсутствие G418, подсчитывали и вычисляли возникшее соотношение G418r-кoлoний (эффективность генного переноса). 56 Полученные результаты показаны на фиг. 8. На фиг. 8, на абсциссе указан использованный материал и BSA, а на ординате указана эффективность генного переноса. При использовании шариков, на которых иммобилизована смесь Н 271 и С-274, получали повышенную эффективность генного переноса, по сравнению с использованием шариков, на которых иммобилизовали лишь один Н-271, и шариков, на которых иммобилизовали СН-271 или СН-296, обладающих,соответственно, доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку, на одной и той же молекуле. Пример 4.(1) Генный перенос с использованием FGF и C-FGFA. Эффект FGF (Becton Deckinson) и полипептида, представленного в SEQ. ID No. 4 (CFGFA), на ретровирусное инфицирование исследовали в опыте, образования колоний клетокNIH/3T3. А именно, оценку осуществляли в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), путем иммобилизации на планшетах, соответственно, FGF (132 пмоль/см 2,2,25 мкг/см 2) , и C-FGFA (133 пмоль/см 2, 6,3 мкг/см 2), и иммобилизации BSA на контрольном планшете. В каждый планшет вносили 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 cfu вируса PM5neo, и преинкубировали при 37 С в течение 30 мин, с последующей тщательной отмывкой с помощью PBS. В этот планшет вносили 2 мл среды DMEM, содержащей 2000 клеток NIH/3T3, и инкубировали при 37 С в течение 24 ч с последующей инкубацией на селективной среде, содержащей 0,75 мг/мл G418, в течение 10 дней. Колонии окрашивали и подсчитывали. Полученные результаты показаны на фиг. 9. На фиг. 9, на оси абсцисс указан используемый материал, а на оси ординат указано количество появившихся колоний. Как показано на фиг. 9 в контрольном планшете, в котором иммобилизовали BSA, колонии не возникли. С другой стороны при использовании планшета, иммобилизованногоFGF и C-FGFA, колонии G418r зарегистрировали в обоих планшетах. Эти результаты показывают, что и FGF и C-FGFA, оба, обладают доменом, связывающим ретровирус, и что CFGFA, в котором был присоединен связывающий клетку домен полипептида из фибронектина, показывает наилучший генный перенос с(2) Связь между концентрацией C-FGFA и эффективностью генного переноса. Эффективности генного переноса сравнивали путем использования планшетов, покрытых различными концентрациями C-FGFA. Инфицирование ретровирусом осуществляли в соответствии с теми же операциями, которые описаны в примере 4 (1), за исключением планшета, полученного с использованием 0,521 пмоль/см 2 (0,0247 мкг/см 2) - 5,21 пмоль/см 2(0,247 мкг/см 2) C-FGFA, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), и планшета,иммобилизованного BSA (контрольный планшет). После вирус-инфицирующей обработки,не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету,собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с этого планшета. Клетки, собранные таким образом, объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две части,одну половинную порцию культивировали вDMEM, а другую - культивировали в DMEM,содержащей G418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37 С в течение 10 дней, а количество появившихся колоний подсчитывали. Соотношение численности G418r-кoлoний и численности колоний,полученных в среде, не содержащей G418, рассматривали в качестве эффективности генного переноса. Полученные результаты показаны на фиг. 10. На фиг. 10, на оси абсцисс указаны используемые концентрации C-FGFA иммобилизованного на планшете, а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Результат контрольного планшета в эксперименте также наносили на график полипептидной концентрации от 0 пмоль/см 2. Как показано на фиг. 10,эффективность генного переноса повышалась концентрационно-зависимо, как увеличение концентрации иммобилизованного C-FGFA.(3) Генный перенос в HL-60-клетки. Что касается инфицирования ретровирусом клетки HL-60 (АТСС CCL-240), которая не является адгезирующей клеткой, влияние присутствия разных полипептидов исследовали в соответствии с нижеследующими операциями. А именно, в каждый планшет, полученный с использованием 100 пмоль/см 2 С-FGFA (4,8 мкг/см 2) или C-FGF-CS1 (5,1 МКГ/см 2), в соответствии со способом из примера 2 (9), и контрольный планшет, на котором иммобилизовалиBSA, вносили 2 мл среды RPMI (содержащей 10% FCS, 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина), содержащей 1 Х 104 cfu вируса TKNEO и 2000 клеток HL-60, с последующей инкубацией при 37 С в течение 24 ч. После инкубации, не прилипшие клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали пипетированием и эти клетки объединяли. Каждую 1/2 порцию полученной итоговой клеточной суспензии переносили в планшет, покрытый СН-296, инкубировали в течение 24 ч и меняли данную среду на среду RPMI, содержащую G418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. После инкубации при 37 С в течение 12 дней подсчитывали численность появившихся колоний. Соответствующая численность колоний G418r, полученных с использованием каждого полипептида, показана на фиг. 11. На фиг. 11, соответственно, на оси абсцисс указан соответствующий функциональ 003204 58 ный материал, а на оси ординат указана численность колоний G418r. Как показано на фиг. 11, численностьG418r-кoлoний отчетливо выше при использовании для иммобилизации C-FGFA или C-FGFCS1 на планшете, что свидетельствует о том,что эти полипептиды способствуют инфицированию HL-60-клеток ретровирусом.(4) Генный перенос в мышиные клетки костного мозга. Для изучения влияния FGF, C-FGFA и CFGF-CS1 на ретровирусное инфицирование мышиных миелоидных клеток, осуществляли нижеследующий эксперимент. Мышам (С 3 Н/HeJ), в возрасте 6-8 недель,внутрибрюшинно вводили 150 мг/кг 5 фторурацила (5-FU, Amlesco), через 2 дня после введения выделяли бедренную и большеберцовую кость для сбора костного мозга. Полученный итоговый костный мозг подвергали центрифугированию в градиенте плотности с использованием Ficoll-Hypaque (плотность 1,0875 г/мл, Pharmacia) для получения фракции моноядерных клеток низкой плотности, которые использовали в качестве клеток костного мозга мыши. Полученные клетки костного мозга мыши престимулировали перед инфицированием с помощью ретровируса, в соответствии со способом по Luskey с соавт. (Blood, 80, 396 (1992. А именно, мышиные клетки костного мозга вносили в -МЕМ (Gibco), содержащую 20%FCS, 100 единиц/мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-6 (rhIL-6, Amgen), 100 нг/мл рекомбинантного фактора мышиных стволовых клеток (rmSCF, Amgen), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина при плотности клеток 1 Х 106 клеток/мл, с последующей инкубацией при 37 С в течение 48 ч в 5%-ном СО 2. Эти престимулированные клетки, включая и адгезированные к емкости, собирали отсасыванием с помощью пипетки. Каждые 2 мл среды, использованной для вышеуказанной престимуляции, содержащей 1 Х 106 престимулированных клеток и 1 Х 104 cfu вируса РМ 5nео, вносили в планшет, содержащий 236 пмоль/см 2 (4 мкг/см 2) FGF, 169 пмоль/см 2 (8 мкг/см 2) С-FGFA или 159 пмоль/см 2 (8 мкг/см 2) C-FGF-CS1, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), и вBSA-иммобилизованный планшет (контрольный планшет), с последующей инкубацией при 37 С. Через 2 ч в каждый планшет добавляли свежую среду (2 мл), содержащую то же количество вируса, с последующим продолжением инкубации в течение 22 ч. После завершения инкубации не прилипшие клетки собирали путем декантирования, а клетки, адгезированные к планшету, собирали с использованием диссоциирующего клетки буфера (CDB, не содержащий ферменты, Gibco), эти клетки объединяли и 59 дважды отмывали с помощью этого же буфера. Подсчитывали численность собранных клеток. Собранные клетки подвергали анализу на HPPCFC (Высокопотенциальные пролиферативныеколониеобразующие клетки).HPP-CFC-анализ осуществляли в соответствии со способом по Bradley с соавт. (Aust. J.Exp. Biol. Med. Sci., 44, 287-293 (1966. В качестве среды использовали среду 1%/0,66 %-ного наслоенного мягкого агара с G418, в конечной концентрации 1,5 мг/мл, или без него. К нему добавляли инфицированные клетки в количестве 1 Х 104 клеток/лунку, с последующей инкубацией при 37 С в течение 13 дней в 10 %-номCO2. После завершения инкубации, колонии,которые возникали, наблюдали под инверсионным микроскопом и подсчитывали численность высокоплотных колоний (обладающие диаметром не менее чем 0,5 мм), полученных в HPPCFC, для вычисления частоты встречаемости(эффективность генного переноса) G418rкoлoний. Полученные результаты показаны на фиг. 12. На фиг. 12, на оси абсцисс указан используемый функциональный материал и BSA,а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 12 на планшетах, покрытых с помощью BSA, в качестве контроля,G418r-колонии не возникают, тогда как при использовании планшетов, на которых иммобилизовали вышеуказанные полипептиды, получалиG418r-колонии. Эффективности генного переноса были повышены на порядок для FGF, CFGFA и C-FGF-CS1, что дает основание полагать, что наличие адгезирующего соответствующую клетку домена, полученного из фибронектина, и полипептида CS-1, который обладает активностью домена, связывающегося с клетками, повышает инфицирование клеток костного мозга с помощью ретровируса.(5) Связь между концентрацией C277ColV, используемого для иммобилизации на планшете, и эффективность генного переноса. Эффективности генного переноса сравнивали путем использования планшетов, покрытых различными концентрациями C277-ColV, в соответствии с нижеследующими операциями. Соответствующие планшеты готовили в соответствии со способом, описанным в примере 2(9), применяя 0,1 пмоль/см 2 (0,1 мкг/см 2) - 416 пмоль/см 2 (20 мкг/см 2) C277-ColV. 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 cfu вируса РМ 5nео, вносили в соответствующие планшеты и осуществляли преинкубирование при 37 С в течение 30 мин, с последующим тщательным отмыванием с помощью PBS. В каждый планшет вносили 2 мл среды DMEM, содержащей 2000 клеток NIH/3T3, и такой планшет инкубировали при 37 С в течение 24 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, адгезированные с планшетом, собирали путем трипсиновой обра 003204 60 ботки для их отделения от планшета и эти клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины и одну половинную порцию культивировали в DMEM,а другую порцию инкубировали в DMEM, содержащей G418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл при 37 С в течение 10 дней, а численность появляющихся колоний подсчитывали. Соотношение численности G418r-колоний и численности колоний, полученных в среде, не содержащей G418, брали в качестве эффективности генного переноса. Полученные результаты показаны на фиг. 13. На фиг. 13, на абсциссе указан используемый функциональный материал, а на ординате указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 13, при использовании иммобилизованного C277-ColV планшета,эффективность генного переноса была повышена в зависимости от концентрации C277-ColV,используемого для иммобилизации.(6) Генный перенос с использованием полилизина. Связывание полилизина [(Lys)n] исследовали в нижеследующих операциях. В качестве полилизина использовали поли-L-лизиингидробромид (молекулярный вес: 50000-100000, WakoPure Chemical) и в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), его иммобилизовали на планшете путем использования 133 пмоль/см 2 (10 мкг/см 2) раствора полилизина в PBS. Эффективности генного переноса в этом планшете и в контрольном планшете, в котором иммобилизовали BSA, оценивали в соответствии с тем же способом, который описан в примере 4 (2). Полученные результаты показаны на фиг. 14. На фиг. 14, на оси абсцисс указан функциональный материал, а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 14, в контрольном планшете,покрытым BSA, колония не возникает, тогда как на планшете, иммобилизованном полилизином,появляются G418r-колонии, что дает основание полагать, что после промывки ретровирус остается на планшете потому, что этот ретровирус связывается с полилизином, иммобилизованном в данном планшете. Пример 5.(1) Генный перенос с использованием полимера полипептида. Перенос гена с использованием полимера полипептида осуществляли без иммобилизации полипептида в планшете. В планшет, покрытыйNIH/3T3 и соответствующий полипептид (Н 271, СН-271, Н 2-547 и СН 2-826) в конечной концентрации 0,63 нмоль/мл, с последующей инкубацией в течение 24 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем