Полипептиды, кодируемые геном, подобным гену липазы человека, содержащие их композиции и способы использования композиций
Номер патента: 3293
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Амин Дилип В., Линч Кевин Дж., Доан Ким-Анх Тхи, Джей Майкл К., Саут Виктория Дж., Кравик Джон А.
Формула / Реферат
1. Выделенный полипептид, кодируемый геном, подобным гену липазы, где указанный полипептид
(a) связывается с гепарином;
(b) имеет гомологию с липопротеидлипазой и липазой печени человека и
(c) включает каталитический домен массой 39 кДа семейства триацилглицероллипаз,
где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8.
2. Выделенный полипептид по п.1, где указанный каталитический домен массой 39 кДа семейства триацилглицероллипаз имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
3. Выделенный полипептид по п.1, где указанный выделенный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и расчетную молекулярную массу около 55 кДа.
4. Выделенный полипептид по п.1, где указанный выделенный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и кажущуюся молекулярную массу около 68 кДа по результатам электрофореза в 10% ДСН-ПААГ.
5. Композиция, содержащая полипептид, охарактеризованный в п.1, и биологически совместимый раствор.
6. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, охарактеризованный в п.1, и фармацевтически приемлемый носитель.
7. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, охарактеризованный в п.1, где указанная выделенная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и нуклеотиды 252-1754 SEQ ID NO: 7.
8. Выделенная нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность SEQ ID NO: 5 или 7, и где указанные условия высокой жесткости представляют собой 0,1 x SSC, 0,5% ДСН при 68шС.
9. Выделенная нуклеиновая кислота по п.8, которая включает 20 нуклеотидов.
10. Выделенная нуклеиновая кислота по п.8, которая является антисмысловой нуклеиновой кислотой.
11. Выделенная нуклеиновая кислота по п.10, где указанная антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты оперативно соединена с областью, регулирующей экспрессию гена.
12. Выделенная нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с мишенью, состоящей из нуклеотидов 1036-1065 SEQ ID NO: 5.
13. Композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в п.10, и биологически совместимый раствор.
14. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в п.10, и фармацевтически приемлемый носитель.
15. Вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в пп.7 и 8, оперативно соединенную с регуляторной областью.
16. Вектор по п.15, где указанная регуляторная область получена из гетерологичного источника.
17. Вектор по п.15 или 16, который является вирусным вектором.
18. Вектор по п.17, который является аденовирусным вектором.
19. Штамм эукариотических клеток, содержащих вектор по пп.15-18, где указанные клетки выбраны из группы, состоящей из клетки клеточной линии PsiCRIP, клетки клеточной линии GP+envA-12, клетки CHO, клетки THP-1, клетки HUVEC, клетки HCEAC и клетки COS-7.
20. Штамм клеток по п.20, где указанные клетки являются клетками COS-7.
21. Композиция, содержащая вектор, охарактеризованный в пп.15-18, и биологически совместимый раствор.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор, охарактеризованный в пп.15-18, и фармацевтически приемлемый носитель.
23. Способ получения полипептида по п.1, предусматривающий культивирование рекомбинантных клеток, охарактеризованных в пп. 19-21, в условиях, благоприятствующих экспрессии указанного полипептида, с последующим выделением полипептида из рекомбинантных клеток.
24. Способ скрининга для выявления агонистов или антагонистов LLG-активности, предусматривающий
(a) контактирование потенциальных агонистов или антагонистов с полипептидом LLG по п.1 и
(b) измерение способности потенциальных агонистов или антагонистов усиливать или ингибировать LLG-активность.
25. Способ ферментативного гидролиза сложного эфира фосфатидилхолина, предусматривающий контактирование указанного сложного эфира фосфатидилхолина с полипептидом, охарактеризованным в п.1.
26. Способ улучшения липидного профиля сыворотки человека или иного животного, имеющего нежелательный липидный профиль, где указанный способ предусматривает введение эффективного количества фармацевтической композиции, охарактеризованной в п.6 или 14.
27. Выделенный полипептид, кодируемый геном, подобным гену липазы, где указанный полипептид
(a) связывается с гепарином,
(b) имеет гомологию с липопротеидлипазой и липазой печени человека,
(c) включает каталитический домен массой 39 кДа семейства триацилглицероллипаз и
(d) происходит от кролика,
где указанный выделенный полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
28. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид, охарактеризованный в п.27.
29. Выделенная нуклеиновая кислота по п.28, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11.
30. Поликлональное антитело, способное специфично связываться с выделенным полипептидом, охарактеризованным в п.1.
31. Поликлональное антитело по п.30, нейтрализующее фосфолипазную активность полипептида, охарактеризованного в п.1.
32. Композиция, содержащая поликлональное антитело, охарактеризованное в пп.30-31, и биологически совместимый раствор.
33. Фармацевтическая композиция, содержащая поликлональное антитело, охарактеризованное в пп.30-31, и фармацевтически приемлемый носитель.
Текст
1 Настоящая заявка притязает на преимущества двух предварительных заявок 60/032254 и 60/032783, одновременно поданных 6 декабря 1996 г. Область изобретения Настоящее изобретение относится к полипептидам семейства триацилглицерол-липаз, к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные полипептиды, к антисмысловым последовательностям, производным указанных нуклеиновых кислот, и к антителам против указанных полипептидов. Настоящее изобретение также относится к получению указанных полипептидов с использованием рекомбинантной технологии, и к использованию указанных полипептидов для скрининга в целях выявления агонистов или антагонистов указанных полипептидов. Настоящее изобретение также относится к способам терапевтического использования таких полипептидов и последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих указанные полипептиды, в фармацевтических композициях, включая композиции для генной терапии и композиции для лечения нарушений метаболизма липидов и липопротеинов. Предпосылки изобретения А. Липиды Липиды представляют собой нерастворимые в воде органические биологические молекулы, которые являются непременными участниками различных биологических функций,включая накопление, транспорт и метаболизм энергии, а также играют важную роль для структуры и текучести мембраны. Липиды, содержащиеся в организме человека и других животных, образуются из двух источников: некоторые липиды поступают с пищевыми жирами и маслами, а другие липиды биологически синтезируются организмом человека или животного. У млекопитающих, по крайней мере, 10% от их массы тела составляют липиды, большинство из которых присутствует в форме триацилглицеринов. Триацилглицерины, известные также как триглицериды или триацилглицериды, состоят из трех жирных кислот, этерифицированных глицерином. Пищевые триацилглицериды накапливаются в жировой ткани как источник энергии или гидролизуются в пищеварительном тракте триацилглицерол-липазами, из которых наиболее важной является панкреатическая липаза. Триацилглицерины транспортируются между тканями в форме липопротеинов. Липопротеины представляют собой мицеллоподобные структуры, обнаруживаемые в плазме и содержащие варьирующиеся соотношения различных типов липидов и белков (называемых апопротеинами). Имеется пять основных классов липопротеинов плазмы, главной функцией которых является транспорт липидов. Такими классами являются, в порядке возрастания плотности: хиломикроны, липопротеины 2 очень низкой плотности (ЛОНП), липопротеины промежуточной плотности (ЛПП), липопротеины низкой плотности (ЛНП) и липопротеины высокой плотности (ЛВП). Хотя каждый класс липопротеинов включает в себя много типов липидов, однако, каждый класс транспортирует преимущественно один тип липидов: триацилглицерины, описанные выше, транспортируются в составе хиломикронов, ЛОНП и ЛПП; тогда как фосфолипиды и сложные эфиры холестерина транспортируются в составе ЛВП и ЛНП, соответственно. Фосфолипиды представляют собой сложные эфиры двухосновной жирной кислоты и глицеринфосфата, также содержащие полярную группу, связанную с фосфатом. Фосфолипиды являются важными структурными компонентами клеточных мембран. Фосфолипиды гидролизуются ферментами, называемыми фосфолипазами. Фосфатидилхолин, типичный фосфолипид, является главным компонентом мембран большинства эукариотических клеток. Холестерин представляет собой метаболический предшественник стероидных гормонов и желчных кислот и является также основным компонентом клеточных мембран. У человека и других животных холестерин поступает с пищей, а также синтезируется печенью и другими тканями. Холестерин транспортируется между тканями в форме сложных эфиров холестерина,входящих в состав ЛНП и других липопротеинов. Каждая живая клетка окружена мембранами, которые служат барьером между внутриклеточными и внеклеточными компартментами. Мембраны также окружают ядро эукариотической клетки, входят в состав эндоплазматического ретикулума и осуществляют специальные функции, такие как функции в миелиновой оболочке, которая окружает аксоны. Типичная мембрана содержит около 40% липида и 60% белка, но имеются и существенные вариации. Главными липидными компонентами являются фосфолипиды, в частности фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин, и холестерин. Физикохимические свойства мембран, такие как текучесть, могут быть изменены путем модификации либо профилей жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов, либо содержания холестерина. Модуляция состава и структуры мембранных липидов также приводит к модуляции мембрано-ассоциированных клеточных функций, таких как рецепторная активность, эндоцитоз и поступление холестерина. В. Ферменты Триацилглицерол-липазы представляют семейство ферментов, которые играют несколько ключевых ролей в метаболизме липидов в организме. Были описаны три члена семейства триацилглицерол-липаз: панкреатическая липаза, липопротеин-липаза и липаза печени (Goldberg, I.J., Le, N.-A., Ginsberg, H.N., Krauss, R.M., 3Lindgren, F.T. (1988) J. Clin. Invest., 81, 561568; Goldberg, I.J., Le, N., Paterniti J.R., Ginsberg,H.N., Lindgren, F.T.Brown, W.V. (1982) J.Clin. Invest., 70, 1184-1192; Hide, W.A., Chan, L., Li, W.-H. (1992) J. Lipid. Res. 33, 167-178). Панкреатическая липаза ответственна, главным образом, за гидролиз пищевых липидов. Были описаны варианты панкреатической липазы, но их физиологическая роль не была определена(Giller, Т., Buchwald, P., Blum-Kaelin, D.,Hunziker, W. (1992) J. Biol. Chem., 267, 1650916516). Липопротеин-липаза является главным ферментом, ответственным за распределение и утилизацию триглицеридов в организме. Липопротеин-липаза гидролизует триглицериды как в составе хиломикронов, так и в виде ЛОНП. Липаза печени гидролизует триглицериды с образованием ЛПП и ЛВП и ответственна за ремоделирование липопротеинов. Липаза печени также действует как фосфолипаза и гидролизует фосфолипиды с образованием ЛВП. Фосфолипазы играют важную роль в катаболизме и ремоделировании фосфолипидного компонента липопротеинов и фосфолипидов мембран. Фосфолипазы также играют определенную роль в высвобождении арахидоновой кислоты с последующем образованием простагландинов, лейкотриенов и других липидов,которые участвуют в ряде воспалительных процессов. Полипептиды липазы, кодируемые генами липазы, имеют последовательность длиной приблизительно в 450 аминокислот с пептидами лидерной сигнальной последовательности для облегчения секреции. Белки липазы состоят из двух главных доменов (Winkler, К., D'Arcy, A., Hunziker, W. (1990) Nature, 343, 771-774). Амино-концевой домен содержит каталитический центр, а карбоксиконцевой домен, очевидно, ответственен за связывание с субстратом,присоединение кофактора и взаимодействие с клеточными рецепторами (Wong, H., Davis, R.C,Nikazy, J., Seebart, K.E.,Schotz, M.C. (1991)(1994) J. Biol. Chem. 269, 18001-18006). Общий уровень аминокислотной гомологии между членами этого семейства составляет 22-65%, при этом имеются локальные области высокой гомологии, соответствующие структурной гомологии, которая связана с ферментативной функцией. Природная липопротеин-липаза (LPL) гликозилирована, и это гликозилирование необходимо для LPL-ферментативной активности (Semenkovich, C.F., Luo, С.-С., Nakanishi, M.K., 003293Biol. Chem., 265, 5429-5433). В липазе печени и липопротеин-липазе присутствуют два сайта Nгликозилирования, а в панкреатической липазе присутствует один сайт N-гликозилирования. Кроме того, четыре группы цистеинов образуют дисульфидные мостики, которые имеют важное значение в сохранении структурной целостности для обеспечения ферментативной активности (Lo, J.-Y., Smith, L.C.,Chen, L. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 266-271;Brady, L., Brzozowski, A.M., Derewenda, Z.S.,Dodson, E., Dodson, G., Tolley, S., Turkenburg,J.P., Christiansen, L., Huge-Jensen В., Norskov, L.,Thim, L.,Menge, U. (1990) Nature 343, 767770). Члены семейства триацилглицерол-липаз имеют ряд общих консервативных структурных особенностей. Одной из таких особенностей является мотив "GXSXG", в котором центральный сериновый остаток является одним из трех остатков, составляющих "каталитическую триаду" (Winkler, K., D'Arcy, A.,Hunziker, W.(1990) Nature, 343, 771-774; Faustinella, F., Smith,L.C.,Chan, L. (1992) Biochemistry 31, 72197223). Остальные остатки каталитической триады составляют консервативные аспартатные и гистидиновые остатки. Короткий участок из 1923 аминокислот (область "крышки") образуют амфипатическую спиральную структуру и покрывают каталитический "карман" ферментаNature, 343, 771-774). Эта область отличается у разных членов этого семейства, а недавно было установлено, что эта область сообщает ферменту субстратную специфичность (Dugi, К.A., Dichek H.L.,Santamarina-Fojo, S. (1995) J. Biol.Chem., 270, 25396-25401). Сравнение липазы печени и липопротеин-липазы показало, что различия в активностях триацилглицероллипазы и фосфолипазы опосредовано отчасти данной областью "крышки" (Dugi, K.A., DichekChem., 270, 25396-25401). Триацилглицерол-липазы обладают различными степенями гепарин-связывающей активности. Липопротеин-липаза имеет наиболее высокое сродство к гепарину, и в соответствии с проведенным картированием эта область связывающей активности простирается до положительно заряженных остатков в амино-концевом домене (Ma, Y., Henderson, H.E., Liu, M.-S.,Zhang, H., Forsythe, I.J., Clarke-Lewis, I., Hayden,M.R.,Brunzell, J.D., J. Lipid Res. 35, 20492059). Локализация липопротеин-липазы на поверхности эндотелиальной клетки (Cheng, C.F.,Oosta, G.M., Bensadoun, A.,Rosenberg, R.D.Clin. Invest., 90, 2013-2021) . Именно эта связывающая активность позволяет ферменту ускорять поглощение ЛНП, действуя в качестве мостика между ЛНП и клеточной поверхностью(1980) Int. J. Cancer 26, 171-176). Известно, что как липопротеин-липаза, так и липаза печени функционируют в сочетании с белками коактиваторами: аполипо-протеином СИ для липопротеин-липазы, и колипазой для панкреатической липазы. Генетические последовательности, кодирующие панкреатическую липазу, липазу печени и липопротеин-липазу человека, описаны в литературе (Genbank, регистрационные номера М 93285, J03540 и М 15856 соответственно). Информационные РНК липазы печени и панкреатической липазы человека имеют длину приблизительно 1,7 и 1,8 тысяч пар оснований соответственно. Два мРНК-транскрипта длиной 3,6 и 3,2 тысяч пар оснований транскрибируется с гена липопротеин-липазы человека. Эти два транскрипта используют альтернативные сигналы полиаденилирования и отличаются по эффективности своей трансляции (Ranganathan, G.,Ong, J.M , Yukht, A., Saghizadeh, M., Simsolo,R.B., Pauer, A.,Kern, P.A. (1995) J. Biol.Chem., 270, 7149-7155). С. Физиологические процессы Метаболизм липидов осуществляется посредством взаимодействия липидов, апопротеинов, липопротеинов и ферментов. Липаза печени и липопротеин-липаза представляют собой многофункциональные белки, которые опосредуют связывание, утилизацию, катаболизм и ремоделирование липопротеинов и фосфолипидов. Липопротеин-липаза и липаза печени функционируют посредством связывания с люминальной поверхностью эндотелиальной клетки в периферических тканях и в печени соответственно. Оба эти фермента участвуют в обратном транспорте холестерина,который заключается в переносе холестерина из периферических тканей в печень либо для экскреции из организма, либо для повторного метаболического цикла. Известно, что генетические дефекты как липазы печени, так и липопротеин-липазы вызывают наследственные нарушения метаболизма липопротеина. Дефекты в метаболизме липопротеинов приводят к серьезным метаболическим расстройствам, включая гиперхолестеринемию, гиперлипидемию и атеросклероз. 6 Атеросклероз представляет собой комплексное полигенное заболевание, которое с гистологической точки зрения определяется как отложение (липидные или фибролипидные бляшки) липидов и других производных крови на стенках кровеносных сосудов, особенно крупных артерий (в аорте, коронарной артерии,сонной артерии) . Эти бляшки, которые являются более или менее кальцифицированными в соответствии со стадией атеросклеротического процесса, могут быть связаны с поражениями и ассоциироваться с аккумуляцией в кровеносных сосудах жировых отложений, состоящих в основном из сложных эфиров холестерина. Эти бляшки сопровождаются утолщением стенки кровеносного сосуда, гипертрофией гладкой мускулатуры, появлением "пенистых" клеток(нагруженных липидом клеток, образующихся в результате нерегулируемого поглощения холестерина "рекрутированными" макрофагами) и аккумуляцией фиброзной ткани. Атероматозные бляшки заметно выступают на стенке сосуда,что сообщает им стенозирующие свойства, ответственные за окклюзию сосудов вследствие атеромы, тромбоза или эмболии, развивающихся у тех пациентов, которые наиболее восприимчивы к этим поражениям. Указанные поражения могут приводить к серьезным сердечнососудистым патологиям, таким как инфаркт,внезапная смерть, сердечная недостаточность и инсульт. Роль триацилглицерол-липаз в сосудистых патологиях, таких как атеросклероз, является объектом интенсивного исследования (см., обзор G.,Olivecrona, G.,Olivecrona, T. (1995)Curr. Opin. Lipid 6, 291-305). В основном, действие триацилглицерол-липаз является, очевидно,антиатерогенным, поскольку эти ферменты снижают уровень триацилглицерина в сыворотке и стимулируют образование ЛВП. Трансгенные животные,экспрессирующие липопротеин-липазу или липазу печени человека,обнаруживали пониженный уровень триглицеридов в плазме и повышенный уровень липопротеинов высокой плотности (ЛВП) (Shimada,M. Shimano, H., Gotoda, Т., Yamamoto, K., Kawamura, M., Inaba, Т., Yazaki, Т.,Yamada, N.(1993) J. Biol. Chem. 268, 17924-17929; Liu, M.S., Jirik, F.R., LeBoeuf, R.C., Henderson, H., Castellani, L.W., Lusis, A.J., Ma, Y., Forsythe, I.J.,Zhang, H., Kirk, E., Brunzell, J.D.,Hayden,M.R. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11417-11424). Было установлено, что люди с генетическими дефектами, приводящими к снижению уровней липопротеин-липазной активности, подвержены гипертриглицеридемии, но без повышенного риска возникновения ишемической болезни сердца. Сообщалось, что это обусловлено отсутствием продуцирования атерогенных липопротеинов промежуточных размеров, которые могут аккумулироваться в субэндотелиальном 7 пространстве (Zilversmit, D.B. (1973) Circ. Res. 33, 633-638). Однако было высказано предположение,что в локализованной области атеросклеротического поражения повышенный уровень липазной активности ускоряет атерогенный процессZambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C.,Moojani, S., Lupien, P.J., Hayden M.R.Brunzell,J.D. (1993) Lancet 341, 1119-1121). Это может быть обусловлено увеличением связывания и поглощения липопротеинов сосудистой тканью,опосредованным липазами (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T. Vlodavsky, I. (1992) J.(1995) Art. Thromb. and Vase. Biol. 15, 551-561). Кроме того, высокий локальный уровень липазной активности может приводить к цитотоксическим уровням жирных кислот и лизофосфатидилхолина, продуцируемого в предшественниках атеросклеротических повреждений. Несмотря на появление все возрастающих сведений относительно роли, которую играет липазная активность в липидном гомеостазе,тем не менее, необходимость в идентификации дополнительных генов, кодирующих белки, регулирующие липидный метаболизм, остаются актуальной. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к обнаружению гена, подобного гену липазы (LLG), к полипептидным продуктам экспрессии этого гена, а также к композициям и к способам их использования. LLG-полипептид связывается с гепарином, обладает гомологией с липопротеинлипазой и липазой печени человека и включает каталитический 39 кДа-домен семейства триацилглицерол-липаз. В другом варианте осуществления изобретения этот полипептид обладает активностью фосфолипазы А. Настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему последовательность SEQ ID No: 10. Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему последовательность SEQ ID No: 8 и имеющему кажущуюся молекулярную массу около 55 кДа или 68 кДа на 10% ДСН-ПААГ-геле. Настоящее изобретение также относится к выделенному полипептиду, содержащему последовательность SEQ ID No: 6 и имеющему кажущуюся молекулярную массу около 40 кДа на 10% ДСН-ПААГ-геле. Кроме того, настоящее изобретение относится к антигенному фрагменту LLG-полипептида. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой ки 003293 8 слоте, кодирующей полипептид, имеющий вышеуказанную последовательность. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, включающему вышеуказанную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид и правильно присоединенную к регуляторной области, такой как промотор. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке,включающей вышеуказанный вектор. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения полипептида, предусматривающему культивирование рекомбинантных клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид, в условиях, благоприятствующих экспрессии указанного полипептида. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителу, способному специфически связываться с полипептидами настоящего изобретения и/или нейтрализовать биологическую активность этих полипептидов. Действительно, дополнительное свойство полипептида настоящего изобретения заключается в том, что он специфически связывается с антителом настоящего изобретения, то есть с антителом, являющимся специфичным по отношению к LLG-полипептиду. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей полипептид, нуклеиновую кислоту, вектор, антисмысловую нуклеиновую кислоту или антитело настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга в целях выявления агонистов или антагонистов ферментативной активности, которой обладают полипептиды настоящего изобретения, где указанный способ предусматривает контактирование потенциальных агонистов или антагонистов с указанными полипептидами и их субстратом и измерение способности потенциальных агонистов или антагонистов усиливать или ингибировать эту активность. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ферментативного гидролиза сложного эфира фосфатидилхолина,предусматривающему контактирование указанного сложного эфира фосфатидилхолина с полипептидом настоящего изобретения. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения человека или животного в целях улучшения профиля содержания липидов в сыворотке данного человека или животного, имеющего нежелательный липидный профиль, где указанный способ предусматривает введение эффективного количества композиции настоящего изобретения. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или преду 9 преждения атеросклероза у человека или животного, предусматривающему введение данному человеку или животному эффективного количества композиции настоящего изобретения. Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения, кроме того, проиллюстрированы на рисунках и в подробном описании предпочтительных вариантов его осуществления. Краткое описание рисунков На фиг. 1 показаны последовательности(SEQ ID No: 17-31) праймеров, использованные для экспериментальных PCR-амплификаций. На фиг. 2 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID No: 1) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No: 2) продукта RT-PCR-реакции (проводимой методом дифференциального отображения), содержащего кДНК ген, подобный гену липазы. Последовательности,соответствующие двум праймерам, используемым при амплификации,подчеркнуты. Стоп-кодон и сигнал полиаденилирования выделены рамкой. Мотивы GAATTC и фланкирующая последовательность являются производными вектора pCRII, в который был клонирован этот продукт. На фиг. 3 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID No: 3) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No: 4) 5'RACE-удлинения кДНК для LLG. Последовательности, соответствующие двум праймерам,используемым при амплификации, подчеркнуты. Мотивы GAATTC и фланкирующая последовательность происходят от вектора pCRII, в который был клонирован этот продукт. На фиг. 4 показана последовательность(SEQ ID No: 7) кДНК, содержащая полную открытую рамку считывания гена, подобного гену липазы LLGXL. Старт-кодон (ATG) и стопкодон (TAG) выделены рамкой. DraI-сайт(ТТТААА) и SrfI-сайт (GCCCGGGC), использованные при конструировании экспрессирующих векторов, подчеркнуты. На фиг. 5 показана выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No: 8) белка LLGXL. Предполагаемая сигнальная последовательность подчеркнута. На фиг. 6 показано сравнение первичных последовательностей членов семейства генов триацилглицерол-липаз (SEQ ID No: 13-15). Заштрихованные остатки идентичны белкуLLGXL (SEQ ID No: 8). Бреши были введены в последовательности для максимизации сравнения первичных последовательностей с использованием программы CLUSTAL. На фиг. 7 показан Нозерн-анализ мРНКLLG в клетках ТНР-1. Клетки были стимулированы либо РМА, либо РМА и окисленным LDL(РМА + окис. LDL). Цифры слева указывают на положения РНК-стандартов (тысяч пар оснований). 10 На фиг. 8 показан Нозерн-анализ мРНК из множества тканей человека, зондированных с использованием кДНК LLG, липопротеинлипазы (LPL) и бета-актина человека. Положение 4,4 т.п.о. РНК-стандарт указано слева от панелей LLG и LPL. На фиг. 9 показан Нозерн-анализ экспрессии LLG и LPL в культивированных эндотелиальных клетках и в клетках ТНР-1 человека. Эти клетки либо не стимулировали (не обрабатывали РМА), либо стимулировали РMА. На фиг. 10 показана последовательность иммунизирующего пептида (SEQ ID No: 16) и его родство с последовательностью белкаLLGXL. Этот пептид показан в заштрихованной рамке. Терминальный цистеин был введен путем присоединения пептида к белку-носителю. На фиг. 11 показан Вестерн-анализ белков,концентрированных на гепарин-сефарозе, из кондиционированной среды от культивированных эндотелиальных клеток. Блот зондировали с использованием антисыворотки против LLG. Цифры слева указывают на положение белковстандартов в килодальтонах. На фиг. 12 показан Вестерн-анализ на белки, связанные с гепарин-сефарозой из кондиционированной среды от клеток COS-7, кратковременно трансфицированных экспрессирующим вектором, содержащим кДНК для LLGN или LLGXL или не содержащим ДНК (контроль). Белки от РMА-стимулированных эндотелиальных клеток (НСАЕС + РMА) были включены для сравнения размеров. Цифры слева обозначают кажущуюся молекулярную массу основных иммунореактивных белков, определенную путем сравнения с белкамистандартами. На фиг. 13 показана последовательностьNo: 12) и сравнение первичных последовательностей PCR-продукта кроличьего LLG и соответствующей последовательности кДНК человека (LLG7742A). Идентичные нуклеотиды заштрихованы. На фиг. 14 проиллюстрирована фосфолипазная (А) активность LPL, LLGN и LLGXL с использованием фосфатидилхолинового субстрата. На фиг. 15 проиллюстрирована фосфолипазная (А) активность LPL, LLGN и LLGXL с использованием триолеинового субстрата. На фиг. 16 показана гибридизация LLG- иLPL-зондов для геномных ДНК, происходящих от различных видов. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к обнаружению гена, подобного гену липазы (LLG), и к полипептидным продуктам его экспрессии. Эти полипептидные продукты, члены семейства триацилглицерол-липаз, содержат каталитический домен приблизительно 39 кДа, характерный для семейства триацилглицерол-липаз, на 11 пример, имеющий последовательность SEQ IDNo: 10. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к полипептиду LLGN,имеющему 354 аминокислот. В своем втором варианте настоящее изобретение относится к полипептиду LLGXL, содержащему 500 аминокислот и имеющему 43%-ное сходство с липопротеин-липазой человека и 37%-ное сходство с липазой печени человека. Полипептид LLGXL обладает фосфолипазной (А) активностью. Авторами настоящего изобретения была выделена неполная кДНК из мРНК клеток ТНР 1, которые были обработаны форболовым сложным эфиром и окисленными ЛНП. После 5'RACE-удлинения этой неполной кДНК, была выделена более мелкая альтернативно сплайсированная кДНК. Вторая более крупная кДНК была выделена из кДНК-библиотеки плаценты человека. Нозерн-анализ показал, что ген LLG экспрессируется в эндотелиальных клетках. Антисыворотка, продуцированная против пептида,предсказанного исходя из открытой рамки считывания кДНК, позволила обнаружить белки ожидаемых размеров для LLGN и LLGXL в кондиционированной среде от культивированных эндотелиальных клеток. Обработка эндотелиальных клеток форболовыми сложными эфирами приводит к повышенному продуцированию LLG как на уровне мРНК, так и на уровне белков. Этот белок является первым членом семейства триацилглицерол-липаз, который, как было обнаружено, экспрессируется эндотелиальными клетками. А. Определения Ниже приводится определение терминов,используемых в описании настоящего изобретения, которое может быть полезным для понимания существа и применения настоящего изобретения."Полипептид" представляет собой полимерное соединение, состоящее из ковалентно связанных аминокислотных остатков. Аминокислоты имеют следующую общую структуру: Аминокислоты были подразделены на семь групп в соответствии со своими боковыми цепями R: (1) алифатические боковые цепи, (2) боковые цепи, содержащие гидроксильную группу (ОН), (3) боковые цепи, содержащие атомы серы, (4) боковые цепи, содержащие кислотные или амидные группы, (5) боковые цепи,содержащие основные группы, (6) боковые цепи, содержащие ароматическое кольцо, и (7) пролин, аминокислота, в которой боковая цепь связана с аминогруппой."Белок" представляет собой полипептид,который играет определенную структурную или функциональную роль в живой клетке. 12 Полипептиды и белки настоящего изобретения могут быть гликозилированными или негликозилированными. Термин "гомология" означает сходство последовательностей, отражающее их общее эволюционное происхождение. Считается, что полипептиды или белки имеют гомологию или сходство, если значительное число их аминокислот является либо (1) идентичными, либо (2) имеют химически подобную боковую цепь R. Считается, что нуклеиновые кислоты имеют гомологию, если значительное число их нуклеотидов являются идентичными."Выделенный полипептид" или "выделенный белок" представляет собой полипептид или белок, который, в основном, не содержит тех соединений, которые обычно ассоциируются с ними в природных условиях (например, другие белки или полипептиды, нуклеиновые кислоты,углеводы, липиды). Термин "выделенный" не означает, что он исключает искусственные или синтетические смеси с другими соединениями или присутствия примесей, которые не влияют на биологическую активность и которые могут присутствовать, например, из-за неполной очистки, добавления стабилизаторов или изготовления фармацевтически приемлемых препаратов. Молекула является "антигенной", если она способна специфически взаимодействовать с ангигенраспознающей молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или рецептор для Т-клеточного антигена. Антигенный полипептид содержит, по крайней мере,около 5, а предпочтительно, по крайней мере,около 10 аминокислот. Антигенный участок молекулы может быть тем участком, который является иммунодоминантным для антитела или для распознавания Т-клеточного рецептора, либо он может быть участком, используемым для продуцирования антитела к данной молекуле путем конъюгирования антигенного участка с молекулой-носителем для иммунизации. Молекула, которая является антигенной, необязательно должна быть сама иммуногенной, то есть, способной индуцировать иммунный ответ в отсутствии носителя."Полипептид LLGN" и "белок LLGN" означают полипептид, включающий последовательность SEQ ID No: 6, где указанный полипептид является гликозилированным или негликозилированным."Полипептид LLGXL" и "белок LLGXL" означают полипептид, включающий последовательность SEQ ID No: 8, где указанный полипептид является гликозилированным или негликозилированным.LLG-полипептидом или белком настоящего изобретения является любой аналог, фраг 13 мент, производное или мутант, который происходит от LLG-полипептида и который сохраняет, по крайней мере, одно биологическое свойство LLG-полипептида. В природе существуют различные варианты LLG-полипептида. Эти варианты могут быть аллельными вариантами,характеризующимися различиями нуклеотидных последовательностей структурного гена,кодирующего данный белок, либо они могут отличаться по сплайсингу или по посттрансляционной модификации. Каждый специалист может самостоятельно получить варианты,имеющие одно или множество аминокислотных замен, делеций, добавлений или перестановок. Такими вариантами могут быть, inter alia, (а) варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативными или неконсервативными аминокислотами,(b) варианты, в которых одна или несколько аминокислот добавлены к LLG-полипептиду, (с) варианты, в которых одна или несколько аминокислот включают замещающую группу, и (d) варианты, в которых LLG-полипептид соединен с другим полипептидом, таким как сывороточный альбумин. Другими LLG-полипептидами настоящего изобретения являются варианты, в которых аминокислотные остатки, происходящие от одного вида, заменены на соответствующие аминокислотные остатки от другого вида либо в консервативных, либо в неконсервативных положениях. В другом варианте осуществления изобретения аминокислотные остатки в неконсервативных положениях заменены консервативными или неконсервативными остатками. Способы получения этих вариантов,включая генетические (суппрессии, делеции,мутации, и т.п.), химические и ферментативные способы, известны каждому среднему специалисту. Если такие аллельные варианты, аналоги,фрагменты, производные, мутанты и модификации, включая альтернативные формы мРНКсплайсинга и альтернативные формы посттрансляционной модификации, приводят к продуцированию производных LLG-полипептида,которые сохраняют любые из биологических свойств этого LLG-полипептида, то все они входят в объем настоящего изобретения."Нуклеиновая кислота" представляет собой полимерное соединение, состоящее из ковалентно связанных субъединиц, называемых нуклеотидами. Нуклеиновыми кислотами является полирибонуклеиновая кислота (РНК) и полидезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), обе из которых могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. ДНК может представлять собой кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК и полусинтетическую ДНК. Последовательность нуклеотидов, которая кодирует белок,называется смысловой последовательностью."Антисмысловая нуклеиновая кислота" представляет собой последовательность нуклео 003293 14 тидов, которая комплементарна смысловой последовательности. Антисмысловая последовательность может быть использована для ингибирования или блокирования экспрессии полипептида, кодированного смысловой цепью. Термин "выделенная нуклеиновая кислота" означает нуклеиновую кислоту, которая, в основном, не содержит соединений, обычно ассоциирующихся с ней в природных условиях. Термин "выделенный" не означает, что он исключает искусственные или синтетические смеси с другими соединениями или присутствия примесей, которые не влияют на биологическую активность и которые могут присутствовать,например, из-за неполной очистки, добавления стабилизаторов или изготовления фармацевтически приемлемых препаратов. Фраза "нуклеиновая кислота, которая гибридизируется в условиях высокой жесткости" означает, что гибридизированные нуклеиновые кислоты способны выдерживать промывку в условиях высокой жесткости. Примером промывки в условиях высокой жесткости для гибридов ДНК-ДНК является промывка 0,1 х SSC,0,5% ДСН при 68 С. Специалистам известны и другие промывки в условиях высокой жесткости. Термин "регуляторная область" означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию нуклеиновой кислоты. Регуляторная область может включать последовательности, которые по своей природе ответственны за экспрессию конкретной аминокислоты (гомологичная область), или она может включать последовательности различного происхождения (ответственные за экспрессию различных белков или даже синтетических белков). В частности, такими последовательностями могут быть последовательности эукариотических генов или вирусных генов или производные от них последовательности, стимулирующие или подавляющие транскрипцию гена специфическим или неспецифическим способом и индуцируемым или не индуцируемым способом. Регуляторные области включают участки инициации репликации, сайты сплайсинга РНК, энхансеры,последовательности терминации транскрипции,сигнальные последовательности, которые направляют полипептид по секреторному пути в клетки-мишени, и промоторы. Регуляторная область из "гетерологичного источника" представляет собой регуляторную область, которая в природных условиях не ассоциируется с экспрессируемой нуклеиновой кислотой. К гетерологичным регуляторным областям относятся регуляторные области особей другого вида, регуляторные области другого гена, гибридные регуляторные последовательности и регуляторные последовательности, которые не встречаются в природе, но которые были сконструированы искусственно. 15 Термин "вектор" означает любую последовательность, предназначенную для переноса нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в клетку-хозяина. Термин "вектор" включает векторы вирусного и невирусного происхождения,используемые для введения нуклеиновой кислоты в прокариотическую или эукариотическую клетку in vitro, ex vivo или in vivo. Векторами невирусного происхождения являются плазмиды, липосомы, липиды с электрическим зарядом(цитофектины), комплексы ДНК-белок и биологические полимеры. Вирусными векторами являются ретровирусы, аденоассоциированные вирусы, векторы на основе поксвирусов, бакуловирусов, вирусов коровьей оспы, вирусов простого герпеса, вирусов Эпштейна-Барра и аденовирусов. Помимо нуклеиновой кислоты настоящего изобретения вектор может также содержать одну или несколько регуляторных областей и/или селективные маркеры, используемые для отбора, измерения и мониторинга результатов переноса нуклеиновой кислоты (переноса в ткани, продолжительности экспрессии и т.п.)."Рекомбинантная клетка" представляет собой клетку, содержащую нуклеиновую кислоту,которая в природных условиях не присутствует в данной клетке. Термин "рекомбинантная клетка" включает высшие эукариотические клетки,такие как клетки млекопитающих, низшие эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки, прокариотические клетки, и архебактериальные клетки."Фармацевтически приемлемый носитель" включает разбавители и наполнители, которые являются фармацевтически приемлемыми для данного способа введения и стерильными и могут представлять собой водные или масляные суспензии, изготовленные с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Выбор конкретного фармацевтически приемлемого носителя и отношения содержания активного соединения к содержанию этого носителя определяется растворимостью и химическими свойствами композиции, конкретным способом введения и стандартной фармацевтической практикой."Липаза" представляет собой белок, который может ферментативно расщеплять липидный субстрат."Фосфолипаза" представляет собой белок,который может ферментативно расщеплять фосфолипидный субстрат."Триацилглицерол-липаза" представляет собой белок, который может ферментативно расщеплять триацилглицеридный субстрат."Фосфатидилхолин" представляет собой глицеринсодержащий фосфолипид, имеющий следующую структуру: где R и R' представляют углеводородные боковые цепи жирных кислот. Фосфатидилхолин также известен как лецитин. Термин "липидный профиль" означает серию концентраций холестерина, триглицерида,липопротеинового холестерина и других липидов в организме человека или животного."Нежелательный липидный профиль" представляет собой состояние, при котором концентрации холестерина, триглицерида, или липопротеинового холестерина находятся вне стандартных пределов, определенных для данного возраста и пола. Обычно, нежелательным липидным профилем считаются концентрации общего холестерина 200 мг/дл, триглицеридов плазмы 200 мг/дл, холестерина ЛНП 130 мг/дл, холестерина ЛВП 39 мг/дл или отношения общего холестерина к холестерину ЛВП 4,0. Нежелательный липидный профиль ассоциирован с рядом патологических состояний,включая гиперлипидемию, диабетическую гиперхолестеринемию, атеросклероз и другие формы ишемической болезни сердца. В. Полипептиды Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые являются членами семейства триацилглицерол-липаз и которые включают каталитический 39 кДа-домен семейства триацилглицерол-липаз, например домен, имеющий последовательность SEQ ID No: 10. Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является выделенный LLG-полипептид, содержащий последовательность SEQ ID No: 6 и имеющий кажущуюся молекулярную массу около 40 кДа на 10% ПААГ-ДСН-геле. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенный LLG-полипептид,содержащий последовательность SEQ ID No: 8 и имеющий кажущуюся молекулярную массу около 55 кДа или 68 кДа на 10% ПААГ-ДСНгеле. Полипептиды и белки настоящего изобретения могут быть рекомбинантными полипептидами, природными полипептидами или синтетическими полипептидами и могут происходить от человека, кролика или от других животных. Эти полипептиды характеризуются репродуцируемыми одной молекулярной массой и/или множеством молекулярных масс хроматографическими реакциями и профилями элюции, аминокислотным составом и аминокислотной последовательностью, а также биологической активностью. Полипептиды настоящего изобретения могут быть выделены из природных источников,таких как экстракты плаценты, плазма человека 17 или кондиционированные среды от культивированных клеток, таких как макрофаги или эндотелиальные клетки, с использованием процедур очистки, хорошо известных специалистам. Альтернативно, полипептиды настоящего изобретения могут быть получены с использованием метода рекомбинантных ДНК, который предусматривает встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей данный полипептид, в подходящий вектор, введение полученного вектора в подходящую клетку-хозяин, выделение полипептида, продуцированного полученной клеткой-хозяином, и очистку этого выделенного полипептида. С. Нуклеиновые кислоты Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, которые кодируют LLG-полипептиды. Настоящее изобретение также относится к антисмысловым нуклеиновым кислотам, которые могут быть использованы для супрессии или блокирования экспрессии LLG-полипептидов in vitro, ex vivo или in vivo. Техника рекомбинантных ДНК известна каждому специалисту в этой области. Общие методы клонирования и экспрессии рекомбинантных молекул описаны в руководстве Maniatis (Molecular Cloning, Cold Spring Harborin Molecular Biology, Wiley and Sons, 1987), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения могут быть соединены с одной или несколькими регуляторными областями. Выбор соответствующей регуляторной области или регуляторных областей представляет собой рутинный метод, доступный каждому среднему специалисту. Регуляторные области включают промоторы и могут включать энхансеры, супрессоры и т.п. Промоторами, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются конститутивные промоторы и регулируемые(индуцибельные) промоторы. Эти промоторы могут быть прокариотическими или эукариотическими в зависимости от хозяина. Прокариотическими промоторами (включая бактериофаговые промоторы), которые могут быть использованы в целях настоящего изобретения,являются lacI, lacZ, Т 3, Т 7, лямбда Рr, Рl, и trpпромоторы. Эукариотическими промоторами(включая вирусные промоторы), которые могут быть использованы в целях настоящего изобретения, являются конститутивные промоторы(например, промоторы HPRT, виментина, актина, тубулина); промоторы промежуточных филаментов (например, промоторы десмина, нейрофиламентов, кератина, GFAP); промоторы терапевтических генов (например, типа MDR,CFTR, фактора VIII); тканеспецифические промоторы (например, промотор актина в клетках 18 гладких мышц или промоторы Flt и Flk, активные в эндотелиальных клетках); промоторы,которые преимущественно активируются в делящихся клетках; промоторы, которые восприимчивы к стимуляторам (например, рецептор стероидного гормона, рецептор ретиноевой кислоты); регулируемые тетрациклином модуляторы транскрипции; предранние промоторы цитомегаловируса; длинные концевые повторы(LTR) ретровирусов; промоторы металлотионеина; промоторы SV40; промоторы Е 1 а; и промоторы MLP. Регулируемые тетрациклином модуляторы транскрипции и промоторы CMV описаны в WO 96/01313, в патентах США 5168062 и 5385839, содержание которых вводится в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительно, чтобы вирусные векторы, используемые в генной терапии, были дефектными по репликации, то есть предпочтительно, чтобы они были неспособны автономно реплицироваться в клетках-мишенях. В основном в геноме дефектных по репликации вирусных векторов, которые используются в настоящем изобретении, отсутствует, по крайней мере,одна область, необходимая для репликации вируса в инфицированных клетках. Эти области могут быть либо элиминированы (полностью или частично), либо сделаны не функциональными известными способами. Эти способы предусматривают полное удаление, замену (другими последовательностями, в частности инсертированной нуклеиновой кислотой), частичную делецию или добавление одного или нескольких оснований к главной (для репликации) области. Эти способы могут быть осуществлены in vitro(на выделенной ДНК) или in situ с использованием техники модификации генов или путем обработки мутагенными агентами. При этом предпочтительно, чтобы дефектный по репликации вирус сохранял последовательности своего генома, необходимые для образования капсида вирусных частиц. Ретровирусы представляют собой интегрирующиеся вирусы, которые инфицируют делящиеся клетки. Геном ретровируса включает дваLTR (длинных концевых повтора), последовательность, ответственную за образование капсида, и три кодирующих области (gag, pol иenv). Было описано конструирование рекомбинантных ретровирусных векторов: см., в частности, ЕР 453242, ЕР 178220, Bernstein et al.,Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 и т.п. В рекомсинантных ретровирусных векторах гены gag, pol и env обычно делетированы полностью или частично и заменены нужной гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты. Эти векторы могут быть сконструированы из ретровирусов различных типов, таких как MoMuLV ("мышиный вирус лейкоза Молони"), MSV ("мышиный вирус саркомы Молони"), HaSV ("вирус сарко 19 мы Харвея"); SNV ("вирус некроза селезенки");RSV ("вирус саркомы Рауса") и вируса Фрейнда. В основном, для конструирования рекомбинантных ретровирусов, содержащих последовательность, кодирующую LLG-полипептид настоящего изобретения, была сконструирована плазмида, которая содержит LTR, последовательность, ответственную за образование капсида, и кодирующую последовательность. Эту конструкцию использовали для трансфекции упаковывающей клеточной линии, которая способна обеспечивать в транс-положении ретровирусные функции, отсутствующие в плазмиде. Таким образом, упаковывающие клеточные линии в основном способны экспрессировать геныgag, pol и env. Такие упаковывающие клеточные линии были описаны ранее, а в частности клеточная линия РА 317 (US4861719), клеточная линия PsiCRIP (WO 90/02806) и клеточная линия GP+envAm-12 (WO 89/07150). Кроме того,рекомбинантные ретровирусные векторы могут содержать модификации в LTR для ингибирования транскрипционной активности, а также удлиненные последовательности, ответственные за образование капсида, которые могут включать часть гена gag (Bender et al., J. Virol, 61(1987) 1639). Рекомбинантные ретровирусные векторы очищают с помощью стандартных методик, хорошо известных специалисту. Аденоассоциированными вирусами (ААВ) являются ДНК-содержащие вирусы относительно небольшого размера, которые могут интегрироваться стабильным и сайт-специфическим способом в геном клеток, которые они инфицируют. Эти вирусы способны инфицировать широкий спектр клеток без индуцирования какоголибо воздействия на рост, морфологию или дифференцировку клеток, и они, очевидно, не вызывают каких-либо патологий у человека. Геном ААВ был клонирован, секвенирован и охарактеризован. Он содержит приблизительно 4700 оснований и содержит область инвертированных концевых повторов (ITR) приблизительно в 145 оснований на каждом конце, которая является областью инициации репликации вируса. Остальная часть генома делится на две основные области, несущие функции образования капсида: левостороннюю часть генома, которая содержит ген rep, участвующий в репликации вируса и экспрессии вирусных генов; и правостороннюю часть генома, которая содержит ген cap, кодирующий капсидные белки вируса. Использование векторов, происходящих от ААВ, для переноса генов in vitro и in vivo описано в работах (см. WO 91/18088, WO 93/09239; патенты США 4797368; 5139941, ЕР 488528). В этих публикациях описаны различные происходящие от ААВ конструкции, в которых гены rep и/или cap были делегированы и заменены нужным геном, а также использование этих конструкций для переноса указанного нужного гена(непосредственно в организм). Дефектные по репликации рекомбинантные ААВ настоящего изобретения могут быть получены путем котрансфекции плазмиды, содержащей нужную последовательность нуклеиновой кислоты,фланкированную двумя областями инвертированных концевых повторов (ITR) ААВ, и плазмиды, несущей гены, ответственные за образование капсида ААВ (гены rep и cap), в клеточную линию, инфицированную человеческим вирусом-помощником (например аденовирусом). Затем продуцированные рекомбинанты ААВ очищают стандартными методами. Следовательно настоящее изобретение относится к производному от ААВ рекомбинантному вирусу, геном которого охватывает последовательность, кодирующую LLG-полипептид, фланкированный AAB-ITR. Настоящее изобретение также относится к плазмиде, включающей последовательность, кодирующую LLG-полипептид, фланкированный двумя ITR от ААВ. Такая плазмида также может быть использована для переноса последовательности LLG, причем эта плазмида, если это необходимо, может быть введена в липосомный вектор (псевдовирус). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения таким вектором является аденовирусный вектор. Аденовирусы представляют собой эукариотические ДНК-вирусы, которые могут быть модифицированы для доставки нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в клетки различных типов. Существуют различные серотипы аденовирусов. Из этих серотипов, с точки зрения настоящего изобретения, предпочтительно использовать аденовирусы человека типа 2 или 5(Ad2 или Ad5) или аденовирусы, происходящие от животных (см. WO 94/26914). Такими аденовирусами животного происхождения, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются аденовирусы собак, коров,мышей (например, Mavl, Beard et al., Virology 75(1990) 81), овец, свиней, птиц и обезьян (например, SAV). Предпочтительными аденовирусами,происходящими от животных, являются аденовирусы собак, более предпочтительно аденовирус CAV2 (например, штамм Манхэттен) или штамм А 26/61 (например, АТСС VR-800). Предпочтительные дефектные по репликации аденовирусные векторы настоящего изобретения содержат ITR, последовательность образования капсида и нужную нуклеиновую кислоту. Еще более предпочтительно чтобы, по крайней мере, область Е 1 аденовирусного вектора была нефункциональной. При этом предпочтительно, чтобы делеция в области Е 1 охватывала область от нуклеотида 455 до нуклеотида 3329 в последовательности аденовируса Ad5. Могут быть также модифицированы другие области, в частности область Е 3 (WO 95/02697), 21 область Е 2 (WO 94/28938), область Е 4 (WO 94/28152, WO 94/12649 и WO 95/02697) или область в любом из поздних генов L1-L5. Дефектные ретровирусные векторы описаны в WO 95/02697. В предпочтительном варианте осуществления изобретения аденовирусный вектор имеет делецию в областях Е 1 и Е 4. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения аденовирусный вектор имеет делецию в области Е 1, в которую были встроены область Е 4 и последовательность, кодирующая LLG (см. FR 9413355). Дефектные по репликации рекомбинантные аденовирусы настоящего изобретения могут быть получены любым способом, известным специалистам (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, ЕР 185573; Graham, EMBO J., 3 (1984) 2917). В частности, они могут быть получены путем гомологичной рекомбинации между аденовирусом и плазмидой, которая содержит interalia нужную ДНК-последовательность. Эта гомологичная рекомбинация осуществляется после котрансфекции указанного аденовируса и плазмиды в соответствующую клеточную линию. Используемая клеточная линия должна быть предпочтительно (i) трансформируемой указанными элементами и (ii) содержать последовательности, комплементарные части генома,дефектного по репликации аденовируса, предпочтительно в интегрированной форме для устранения риска рекомбинации. Примерами клеточных линий, которые могут быть использованы, являются почечная клеточная линия эмбриона человека 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), которая содержит левостороннюю часть генома аденовируса Ad5 (12%), интегрированную в ее геном, и клеточные линии, способные к комплементации функций Е 1 и Е 4, как описано в заявках WO 94/26914 и WO 95/02697. Рекомбинантные аденовирусы выделяли и очищали с использованием стандартных методов молекулярной биологии, хорошо известных каждому специалисту. Ингибирование экспрессии гена с использованием антисмысловых нуклеиновых кислот может быть достигнуто на трансляционном или транскрипционном уровне. Антисмысловые нуклеиновые кислоты настоящего изобретения предпочтительно представляют собой фрагменты нуклеиновых кислот, способных специфически гибридизироваться со всей или с частью нуклеиновой кислоты, кодирующей LLG или соответствующую информационную РНК. Эти антисмысловые нуклеиновые кислоты могут представлять собой синтетические олигонуклеотиды, необязательно модифицированные для повышения их стабильности и селективности. Они могут также представлять собой ДНКпоследовательности, экспрессия которых в клетке приводит к продуцированию РНК, комплементарной всей или части мРНК LLG. Анти 003293 22 смысловые нуклеиновые кислоты могут быть получены путем экспрессии всей или части последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ IDNo: 7 или SEQ ID No: 11, и находящейся в противоположной ориентации, как описано в ЕР 140308. Для осуществления настоящего изобретения подходящей является антисмысловая последовательность любой длины при условии,что она способна ингибировать или блокировать экспрессию LLG. Предпочтительно, чтобы длина антисмысловой последовательности составляла, по крайней мере, 20 нуклеотидов. Получение и использование антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК, кодирующих антисмысловые РНК, и использование олиго- и генных антисмысловых последовательностей описано в заявке WO 92/15680, содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки.D. Антитела Настоящее изобретение относится к антителам против LLG-полипептида. Эти антитела могут быть моноклональными или поликлональными антителами. Настоящее изобретение включает химерные, одноцепочечные, "гуманизированные" антитела, а также Fab-фрагменты и продукты библиотеки экспрессируемых Fabфрагментов. Могут быть получены поликлональные антитела против антигенного фрагмента LLGполипептида, как описано в примере 4 А. Могут быть также продуцированы антитела против интактного LLG-белка или полипептида, либо против фрагмента, производного или эпитопа этого белка или полипептида. Антитела могут быть продуцированы после введения белка, полипептида, фрагмента, производного или эпитопа животному с использованием техники и процедур, известных специалистам. Моноклональные антитела могут быть получены методом Mishell, В.В., et al., SelectedMethods in Cellular Immunology (W.H. Freeman,ed.) San Francisco (1980). Для этого, полипептид настоящего изобретения используют для иммунизации клеток селезенки мышей BALB/c. Иммунизированные клетки селезенки подвергают слиянию с миеломными клетками. Слитые клетки, обладающие свойствами клетки селезенки и миеломной клетки, выделяют путем культивирования в среде HAT, то есть в среде, на которой обе родительские клетки погибают, но продукты слитых клеток выживают и растут. Моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть "гуманизированы" для предотвращения вырабатывания у хозяина иммунного ответа на эти антитела. "Гуманизированное антитело" представляет собой антитело,в котором гипервариабельные области (определяющие комплементарность области - CDR) и/или другие области каркасных вариабельных доменов легкой и/или тяжелой цепи являются производными иммуноглобулина, отличного от 23 человеческого, а остальные участки молекулы происходят от одного или нескольких иммуноглобулинов человека. "Гуманизированными" антителами также являются антитела, характеризующиеся тем, что у них "гуманизированная" тяжелая цепь ассоциирована с донорной или акцепторной немодифицированной легкой цепью или с химерной легкой цепью, или наоборот. "Гуманизирование" антител может быть осуществлено методами, известными специалистам (см., например, G.E. MarkЕ.А. Padlan,"Chapter 4. Humanization of Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113, Springer-Verlag, New York,1994). Для продуцирования "гуманизированных" антител могут быть использованы трансгенные животные. Для продуцирования одноцепочечных антител против иммуногенных полипептидов и белков настоящего изобретения могут быть приспособлены методики, известные специалистам и используемые для продуцирования одноцепочечных антител. Антитела против LLG могут быть использованы в анализах для обнаружения или для количественной оценки уровней LLG. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, эти анализы позволят проводить клиническую диагностику и оценку уровней LLG на различных стадиях заболевания и осуществлять мониторинг эффективности лечения.E. Методы скрининга для выявления агонистов или антагонистов Настоящее изобретение относится к способам скрининга библиотек небольших молекул или источников природных продуктов для выявления агонистов (энхансеров или коактиваторов, включая белковые коактиваторы) или антагонистов (ингибиторов) LLGXL-активности. Предполагаемый агонист или антагонист подвергают контакту с белком LLGXL и субстратом LLGXL и оценивают способность предполагаемого агониста или антагониста усиливать или ингибировать активность LLGXL. Белок LLGXL, используемый в данном способе, может быть продуцирован рекомбинантным методом в ряде клеток-хозяев, включая клетки млекопитающих (как показано в примере 7), клетки, инфицированные бакуловирусом,дрожжи и бактерии. Экспрессия LLG в стабильно трансфицированных клетках СНО может быть оптимизирована путем метотрексатамплификации этих клеток. Белок LLGXL может быть также выделен из природных источников, таких как плазма человека, плацентарные экстракты или кондиционированная среда от культивированных эндотелиальных клеток, клеток ТНР-1 или макрофагов. Оптимизация аналитических параметров,включая pH, концентрацию ионов, температуру,концентрацию субстрата и условия эмульгиро 003293 24 вания может быть проведена эмпирически любым специалистом. Жирнокислотные заместители субстратов могут варьироваться по длине цепи, а также по степени и положению ненасыщенности. Субстраты могут быть помечены радиоактивной меткой в любом из нескольких положений. Фосфолипидные субстраты, такие как фосфатидилхолин, могут быть подвергнуты радиоактивному мечению, например в положении жирных кислот Sn-1 или Sn-2, или в глицериновой, фосфатной или полярной головной группе (холин в случае фосфатидилхолина) . В качестве альтернативы радиоактивным субстратам в методах скрининга могут быть также использованы и другие классы меченых субстратов, такие как флуоресцентные субстраты или тиосодержащие субстраты. Флуоресцентные субстраты являются особенно подходящими для использования в анализах скрининга, поскольку в этом случае ферментативный катализ может оцениваться непрерывно путем измерения интенсивности флуоресценции, не прибегая к физическому отделению (экстракции) продуктов от субстратов. Примером флуоресцентного фосфатидилхолинового субстрата является C6NBD-PC-1-ацил-2[6-(нитро-2,1,3-бензоксадиазол-4-ил)амино]капроилфосфатидилхолин. Тиосодержащими субстратами являются 1,2-бис(гексаноилтио)-1,2-дидезокси-sn-глицеро-3-фосфорилхолин (L.J. Reynolds, W.N. Washburn, R.A. Deems,E.A. Dennis, 1991, MethodsF. Гидролиз сложных эфиров фофсфатидилхолина Настоящее изобретение относится к способу ферментативного гидролиза сложных эфиров фофсфатидилхолина, например, для промышленной или пищевой обработки или для получения моющих средств для стирки белья. Полипептиды настоящего изобретения могут быть использованы для гидролиза сложных эфиров фофсфатидилхолина в растворе либо эти ферменты могут быть связаны с твердым носителем, который может быть затем подвергнут контакту с субстратом. Этот метод может быть использован для продуцирования лизофосфолипидов и свободных жирных кислот.G. Композиции Настоящее изобретение относится к композициям в биологически совместимом растворе, включающем полипептиды, нуклеиновые кислоты, векторы и антитела настоящего изобретения. Биологически совместимый раствор представляет собой раствор, в котором полипептид, нуклеиновая кислота, вектор или антитело настоящего изобретения поддерживаются в 25 активной форме, например в форме, благоприятствующей для осуществления биологической активности. Так, например, полипептид настоящего изобретения должен обладать фосфолипазной активностью, нуклеиновая кислота должна быть способной к репликации и к трансляции транскрипта, или гибридизироваться с комплементарной нуклеиновой кислотой; вектор должен быть способен трансфицировать клетку-мишень; а антитело должно связываться с полипептидом настоящего изобретения. В основном таким биологически совместимым раствором является водный буфер, например Трис,фосфат или буфер HEPES, содержащий ионы соли. Обычно, концентрация ионов соли аналогична физиологическим уровням. В конкретном варианте осуществления изобретения биологически совместимый раствор представляет собой фармацевтически приемлемую композицию. Биологически совместимые растворы могут включать стабилизирующие агенты и консерванты. Такие композиции могут быть изготовлены для местного перорального, парентерального, интраназального, подкожного и внутриглазного введения. Под парентеральным введением подразумевается внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция, внутриартериальная инъекция или инфузия. Данная композиция может быть введена парентерально в виде готовых лекарственных форм, содержащих стандартные,хорошо известные нетоксичные физиологически приемлемые носители, адъюванты и наполнители, если это необходимо. Предпочтительными стерильными инъецируемыми препаратами могут быть раствор или суспензия в нетоксичном парентерально приемлемом растворителе или разбавителе. Примерами фармацевтически приемлемых носителей являются физиологический раствор,забуференный физиологический раствор, изотонический физиологический раствор (например,однозамещенный фосфат натрия, двузамещенный фосфат натрия, хлорид натрия, калия, кальция или магния или смеси этих солей), раствор Рингера, декстроза, вода, стерильная вода, глицерин, этанол и их комбинации. Обычно в качестве растворителей или суспендирующих сред используют 1,3-бутандиол и стерильные жирные масла. Для этой цели может быть использовано любое мягкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. В препаратах для инъекций могут быть также использованы жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. Средой для композиций может быть также гидрогель, который получают из любого биологически совместимого или нетоксичного (гомоили гетеро-) полимера, такого как гидрофильный полимер полиакриловой кислоты, который может действовать как губка, абсорбирующая лекарственное средство. Такие полимеры были 26 описаны, например, в заявке WO 93/08845, содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки. Некоторые из них, в частности такие как полимеры, получаемые из этилена и/или окиси пропилена, являются коммерчески доступными. Гидрогель может быть осажден непосредственно на поверхность обрабатываемой ткани, например, во время хирургического вмешательства. В другом предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции,включающий дефектный по репликации рекомбинантный вирус и полоксамер. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей дефектный по репликации рекомбинантный вирус, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую LLG-полипептид, и полоксамер. Предпочтительным полоксамером является полоксамер 407, который имеется в продаже (BASF, Parsippany, NJ), а наиболее предпочтительным является нетоксичный биологически совместимый многоатомный спирт. Полоксамер, пропитанный рекомбинантным вирусом, может быть осажден непосредственно на поверхности обрабатываемой ткани, например, во время хирургического вмешательства. Полоксамер обладает в основном теми же преимуществами, что и гидрогель, но при этом он имеет более низкую вязкость. Н. Способы лечения Настоящее изобретение относится к способам лечения, предусматривающим введение человеку или другому животному эффективного количества композиции настоящего изобретения. Эффективные количества композиции могут варьироваться в зависимости от возраста,типа и тяжести состояния пациента, подвергаемого лечению, а также от массы тела, необходимой продолжительности лечения, способа введения и других параметров. Эффективные количества определяются лечащим врачом и другим квалифицированным медицинским персоналом. Полипептиды настоящего изобретения вводят в основном в дозах, составляющих от около 0,01 до около 100 мг/кг, предпочтительно от около 0,1 до около 50 мг/кг, а наиболее предпочтительно от около 1 до около 10 мг/кг массы тела в день. Рекомбинантные вирусы настоящего изобретения обычно продуцируют и вводят в дозах от около 104 до около 1014 б.о.е. В случае ААВ и аденовирусов предпочтительно использовать дозы от около 106 до около 1011 б.о.е. Термин"б.о.е" (бляшкообразующая единица) соответствует инфекционной способности суспензии вирионов, которая определяется инфекцией соответствующей клеточной культуры, и измеряется числом образованных бляшек. Способы опреде 27 ления титра б.о.е вирусного раствора хорошо описаны в литературе. Настоящее изобретение относится к способам лечения атеросклероза, где указанный атеросклероз является результатом избыточной,аномальной или неадекватной экспрессии LLGполипептидной активности. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения человека или другого животного, имеющего нежелательный липидный профиль, где указанный нежелательный липидный профиль является результатом высокой или неадекватной экспрессии LLGполипептидной активности. Настоящее изобретение также относится к способам лечения сахарного диабета, гиперлипидемии, внутрипеченочного холестаза или других метаболических нарушений, где указанные сахарный диабет, гиперлипидемия, внутрипеченочный холестаз или другие метаболические нарушения являются результатом высокой или неадекватной экспрессии LLG-полипептидной активности. 1. Коррекция нежелательных липидных профилей, ассоциированных с повышенной экспрессией LLG-полипептида Способы снижения экспрессии LLGполипептида для коррекции указанных состояний, где эти состояния или нарушения, ассоциированные с нежелательным липидным профилем, обусловлены LLG-полипептидной активностью, предусматривают, но не ограничиваются, ведение композиции, содержащей антисмысловую нуклеиновую кислоту; введение композиции, содержащей внутриклеточный связывающий белок, такой как антитело; введение композиции, содержащей LLGN-полипептид или другие фрагменты LLG; и введение композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая кодирует LLGN-полипептид или другой фрагмент LLG. В одном из вариантов осуществления изобретения композицию, содержащую антисмысловую нуклеиновую кислоту, используют для подавления или блокирования экспрессии LLG. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная нуклеиновая кислота кодирует антисмысловые РНК-молекулы. В этом варианте настоящего изобретения нуклеиновую кислоту правильно соединяют с сигнальными последовательностями, обеспечивающими экспрессию нуклеотидной последовательности, и встраивают в клетку, используя предпочтительно рекомбинантные векторные конструкции,которые способны экспрессировать антисмысловую нуклеиновую кислоту после введения этого вектора в клетку. Примерами подходящих векторов являются плазмиды, аденовирусы,аденоассоциированные вирусы, ретровирусы и вирусы герпеса. Предпочтительным вектором является аденовирус. Наиболее предпочтительным вектором является дефектный по реплика 003293 28 ции аденовирус, имеющий делецию в областях вируса Е 1 и/или Е 3. В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения экспрессия LLG ингибируется или блокируется посредством экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей внутриклеточный связывающий белок, способный избирательно взаимодействовать с LLG. В заявках WO 94/29446 и WO 94/02610, содержание которых вводится в настоящее описание посредством ссылки, описана трансфекция клеток генами, кодирующими внутриклеточный связывающий белок. Внутриклеточным связывающим белком является любой белок, способный избирательно взаимодействовать или связываться с LLG в клетке, в которой он экспрессируется, и нейтрализовать функцию связанного LLG. Предпочтительным внутриклеточным связывающим белком является антитело или фрагмент антитела. Более предпочтительным внутриклеточным связывающим белком является одноцепочечное антитело. В WO 94/02610 описаны получение антител и идентификация нуклеиновой кислоты,кодирующей конкретное антитело. С использованием LLG или его фрагмента, специфическое моноклональное антитело может быть получено способами, известными специалистам. Для использования в способе настоящего изобретения может быть затем получен вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую внутриклеточный связывающий белок или его фрагмент, и способный экспрессироваться в клетке-хозяине. Альтернативно, LLG-активность может быть блокирована путем введения нейтрализующего антитела в кровоток. Это нейтрализующее антитело может быть введено непосредственно в виде белка либо оно может быть экспрессировано из вектора (содержащего секреторный сигнал). В другом варианте настоящего изобретения LLGXL-активность ингибируют путем введения композиции, содержащей полипептидLLGN или другой фрагмент LLG. Эта композиция может быть введена стандартным способом,таким как пероральное, местное, внутривенное,внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, интраназальное или чрескожное введение. Эта композиция может быть введена непосредственно либо она может быть инкапсулирована(например, в липидной системе, в аминокислотных микросферах или в глобулярных дендримерах). В некоторых случаях этот полипептид может быть присоединен к другому полимеру, такому как сывороточный альбумин или поливинилпирролидон. В другом варианте настоящего изобретения LLGXL-активность ингибируют посредством использования низкомолекулярных соединений, которые подавляют его ферментативные свойства или предотвращают его распознавание клеточными сайтами связывания. 29 В другом варианте настоящего изобретения LLGXL-активность ингибируют путем использования генной терапии, то есть путем введения соединения, содержащего нуклеиновую кислоту, которая кодирует и направляет экспрессию полипептида LLGN или другого фрагмента LLG. В конкретном варианте осуществления изобретения ген LLG настоящего изобретения также обладает сродством к гепарину. LLGполипептид, связывающийся с внеклеточным гепарином в полости кровеносных сосудов, позволяет LLG связываться и ускорять поглощение ЛНП, действуя в качестве мостиковой связи между ЛНП и внеклеточным гепарином. Предполагается, что в области локализации атеросклеротических поражений повышенный уровень липазной активности ускоряет атерогенный процесс (Zilversmit, D.B. (1995) Clin. Chem. 41, 153-158; Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S.,Gagne, C., Moojani, S., Lupien, P.J., Hayden M.R., Brunzell, J.D. (1993) Lancet 341, 1119-1121). Это может быть обусловлено повышением уровня связывания и поглощения липопротеинов сосудистой тканью, опосредованным липазами (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona,Т., Vlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest., 90, 20132021; Tabas, I., Li, I., Brocia R.W., Xu, S.W.,Swenson, T.L., Williams, K.J. (1993) J. Biol.Thromb. and Vasс. Biol. 15, 551-561). Кроме того,высокий локальный уровень липазной активности может приводить к цитотоксическим уровням жирных кислот и лизофосфатидилхолина,продуцируемого в предшественниках атеросклеротических поражений. Эта конкретная активность LLG может способствовать развитию или прогрессированию атеросклероза, особенно на фоне избыточных уровней липидов, обусловленных питанием или генетическими факторами. Таким образом, настоящее изобретение позволяет ингибировать аккумуляцию липопротеинов путем ингибирования экспрессии LLGполипептида или связывания с липопротеином(например, ЛНП). 2. Коррекция нежелательных липидных профилей, ассоциированных с недостаточной активностью LLG-полипептида Способы повышения экспрессии LLG для коррекции тех состояний, в которых активностьLLG-полипептида способствует развитию заболеваний или нарушений, ассоциированных с нежелательным липидным профилем, предусматривают, но не ограничиваются, введение композиции, содержащей полипептид LLGXL, и введение композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептидLLGXL. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения LLGXL-активность по 003293 30 вышают путем введения композиции, содержащей полипептид LLGXL. Эта композиция может быть введена стандартным способом, таким как пероральное, местное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное,интраназальное или чрескожное введение. Эта композиция может быть введена непосредственно либо она может быть инкапсулирована(например, в липидной системе, в аминокислотных микросферах или в глобулярных дендримерах). В некоторых случаях этот полипептид может быть присоединен к другому полимеру, такому как сывороточный альбумин или поливинилпирролидон. В другом варианте настоящего изобретения LLGXL-активность повышают путем использования низкомолекулярных соединений,которые могут усиливать экспрессию LLGXL на уровне транскрипции, трансляции или после трансляции. В другом варианте настоящего изобретения уровень LLGXL повышают путем введения композиции, содержащей нуклеиновую кислоту,которая кодирует и направляет экспрессиюLLGXL-полипептида. Внутрипеченочный холестаз может быть охарактеризован как увеличение уровней холестерина и фосфолипида в сыворотке. Недавно сообщалось, что модель внутрипеченочного холестаза у крыс, индуцированного лекарственным средством фаллоидином, продемонстрировала значительное увеличение уровней холестерина и фосфолипида в сыворотке (Ishizaki, K.,Kinbara, S., Miyazawa, N., Takeuchi, Y., Hirabayashi, N., Kasai, H.,Araki, T. (1997) Toxicol.Letters 90, 29-34). Продукты настоящего изобретения могут быть использованы для лечения внутрипеченочного холестаза у пациентов с повышенными уровнями холестерина и/или фосфолипида в сыворотке. Кроме того, эта модель с использованием крыс также показала значительное снижение скоростей выведения холестерина с желчью. LLG-полипептид и продукты нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть использованы для лечения пациентов с нарушениями системы желчевыделения. Внутрипеченочный холестаз характеризуется как нарушение выделения желчи из печени. Недавно проведенное картирование показало,что локусы для прогрессирующего наследственного внутрипеченочного холестаза (ПНВХ или болезнь Байлера) и доброкачественный рецидивирующий внутрипеченочный холестазGenet. 8, 380-386, соответственно). Поскольку ген LLG был картирован на этой хромосоме в области 18q21, то ген LLG или продукты на 31 стоящего изобретения могут быть использованы для лечения пациентов, страдающих внутрипеченочным холестазом, вызванным мутацией или дефектной экспрессией гена (генов), ответственного за заболевание ПНВХ/ДРВХ. В другом варианте осуществления настоящего изобретения ген LLG или полипептидные продукты этого изобретения могут быть использованы для лечения пациентов, страдающих внутрипеченочным холестазом, не вызываемым дефектом гена, ответственного за заболевание ПНВХ/ДРВХ, в области 18q21-q22. Недавно проведенные исследования позволили предположить, что другой локус, расположенный за пределами области 18q21-q22, может также продуцировать ПНВХ-фенотип (Strautnieks,S.S., Kagalwalla, A.F., Tanner, M.S., Gardiner,R.M.Thompson, R.J. (1996) J. Med. Genet. 33,833-836). Тем не менее, введение LLGполипептида либо непосредственно, либо посредством генной терапии может облегчить состояние, вызываемое этой формой заболевания. В генной терапии одна или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, а также регуляторные области, контролирующие ее экспрессию, переносят в клетки-мишени человека или другого животного. Этот перенос осуществляют либо ex vivo способом, в котором нуклеиновую кислоту переносят в клетки в лаборатории, а затем модифицированные клетки вводят человеку или другому животному, либоin vivo способом, в котором нуклеиновую кислоту вводят непосредственно в клетки человека или другого животного. Перенос нуклеиновых кислот может быть осуществлен с использованием либо вирусных, либо невирусных векторов, описанных выше. Невирусные векторы могут быть перенесены в клетки любыми методами, известными специалистам, включая копреципитацию фосфатом кальция, липофекцию (с использованием синтетических анионных и катионных липосом), опосредованную рецептором доставку гена, инъекцию "голой" ДНК, электропорацию и доставку методами биобаллистики или ускорения частиц. Примеры Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами. Эти примеры приводятся только в иллюстративных целях и не ограничивают объем притязаний. Пример 1. Идентификация дифференциально экспрессированной кДНК А) Получение РНК Моноцитарные клетки ТНР-1 человека 32 на G и 100 единиц/мл сульфата стрептомицина. Клетки высевали в 15 см-чашки для культивирования ткани при концентрации 1,5 х 107 клеток/чашку и обрабатывали 40 нг/мл 12 миристат-13-ацетатом форбола (Sigma) в течение 48 ч для индуцирования дифференцировки клеток. Человеческие липопротеины низкой плотности (ЛНП), поставляемые фирмой Calbiochem, подвергали исчерпывающему диализу против PBS при 4 С. Затем ЛНП разводили до 500 мкг/мл и диализовали против 5 мкМ CuSO4 в PBS при 37 С в течение 16 ч. Для прекращения окисления ЛНП подвергали исчерпывающему диализу против 150 мМ NaCl, 0,3 мМEDTA, а затем фильтр стерилизовали. Концентрацию белка определяли методом ВСА (Schuh,J., Fairclough, G.F., and Haschemeyer, R.H.(1978)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3173-3177)(Pierce). Степень окисления была определена методомTBARS (Chomczynski, P. (1993) Biotechniques 15, 532-537) и составляла 25-30 нмоль эквивалентов MDA/мг белка. Дифференцированные клетки ТНР-1 обрабатывали в течение 24 ч либо 50 мкг/мл окисленного ЛНП, либо NaCl-EDTAбуфером в среде RPMI, содержащей 10%-ную фетальную бычью сыворотку с дефицитом липопротеина (Sigma). Для сбора РНК чашки промывали 10 мл PBS, а затем в каждую чашку добавляли 14 мл TRIZOL (Liang, P.Pardee, А.В.(1992) Science 257, 967-971) (GIBCO). Раствор несколько раз пипетировали для получения смеси, а затем одинаковые образцы объединяли в центрифужные пробирки, добавляли 3 мл хлороформа на чашку и смешивали. Пробирки центрифугировали в течение 15 мин при 12000 х д. После центрифугирования верхний слой переносили в новую пробирку, а затем добавляли 7,5 мл изопропанола на чашку и смешивали. Пробирки центрифугировали при 12000 х g в течение 20 мин. Осадок после центрифугирования промывали охлажденным на льду 70%-ным этанолом и сушили при комнатной температуре. Осадки суспендировали в 500 мкл ТЕ (ТрисEDTA) и обрабатывали 200 единицами ДНКазыI, не содержащей РНКазы, и 200 единицами РНКазина, плацентарного ингибитора РНКазы,(Promega) в течение 30 мин при 37 С. РНК очищали путем последовательной экстракции фенолом,фенолом/хлороформом/изоамиловым спиртом (25:24:1) и хлороформом/изоамиловым спиртом (24:1), а затем осаждали этанолом. В) Синтез кДНК Синтез кДНК и PCR-амплификацию осуществляли в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для осуществления метода дифференциального отображения (DifferentialDisplay Kit, версия 1,0, Display Systems Biotechnology, Inc.). Эта система основана на методе,впервые описанном Liang и Pardee (Mead, D.A.,Реу, N.K., Herrnstadt, С., Marcil, R.A.,Smith,L.M. (1991) Bio/Technology 9657-663). Пары праймеров, которые давали кДНК-фрагмент, 33 содержащий первую информацию о гене липазоподобного полипептида, представляли собой прямой праймер 7 и обратный праймер 15. кДНК для амплификации синтезировали как описано ниже, с использованием РНК, происходящей от клеток ТНР-1, обработанных РМА и экспонированных либо буфером, либо окисленным ЛНП: 3 мкл 25 мкМ прямого праймера 7 и 7,5 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC), добавляли к 300 нг (3,0 мкл) РНК от любого образца РНК ТНР-1. Эту смесь нагревали до 70 С в течение 10 мин, а затем охлаждали на льду. В эту пробирку добавляли 3 мкл 5 х PCR-буфера (250 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 375 мМ КС 1) (GIBCO), 3 мкл 25 мМ МgСl2, 3 мкл 0,1 М ДТТ, 1,2 мкл 500 мкМ dNTP, 0,7 мкл РНКазина, и 5,6 мкл DEPC-обработанной воды. Пробирки инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре, после чего добавляли 1,5 мкл (300 единиц) Superscript II РНКазы Нобратной транскриптазы (GIBCO). Пробирки инкубировали последовательно при комнатной температуре в течение 2 мин, 60 мин при 37 С и 5 мин при 95 С, а затем охлаждали на льду.(мас./об.) желатина), 70,2 мкл 25 мМ МgСl2, 5,9 мкл альфа-33 Р-dАТР (10 м Ки/мл. DuPont NEN),4,7 мкл 500 мкМ смеси dNTP, 11 мкл ДНКполимеразы Ampli-Taq (5 единиц/мкл, PerkinElmer) и 493,3 мкл DEPC-обработанной воды. Для каждой реакции 12 мкл набора Master Mix добавляли к 2 мкл прямого праймера 7, 1 мкл кДНК и 5 мкл обратного праймера 15. Реакционные смеси нагревали до 94 С в течение 1 мин,а затем подвергали 40 термоциклам со стадией денатурации при 94 С в течение 15 с; стадией отжига при 40 С в течение 1 мин и со стадией удлинения при 72 С в течение 30 с. После проведения 40 циклов реакционные смеси инкубировали при 72 С в течение 5 мин и хранили при 10 С. PCR-реакции осуществляли в термоячейкеGeneAmp System 9600 Perkin-Elmer. Четыре микролитра реакционной смеси для амплификации смешивали с равным объемом буфера для загрузки (0,2% бромфенолового синего, 0,2% ксилолцианола, 10 мМ EDTA рН 8,0, и 20% глицерина). Четыре микролитра этой смеси подвергали электрофорезу в 6%-ном неденатурирующем акриламидном секвенирующем геле в течение 3 ч при 1200 В (постоянное напряжение). Этот гель сушили при 80 С в течение 1,5 ч и экспонировали с пленкой Kodak XAR. Был идентифицирован амплифицированный продукт, обнаруженный только в реакционной смеси, содержащей кДНК от клеток ТНР-1, обработанных окисленным ЛНП, а затем этот продукт вырезали из геля. В микроцентрифужную пробирку, содержащую вырезанный гелевый фрагмент, добавляли 100 мкл DEPC 003293 34 обработанной воды, а затем инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем еще в течение 15 мин при 95 С. Для проведения повторной амплификацииPCR-продукта, 26,5 мкл элюированной ДНК использовали в реакции амплификации, которая также включала 5 мкл 10 х PCR-буфера, 3 мкл 25 мМ МgСl2, 5 мкл 500 мкМ dNTP, 5 мкл 2 мкМ прямого праймера 7, 7,5 мкл обратного праймера 15 и 0,5 мкл полимеразы Amplitaq. Параметры PCR-циклов и оборудование были описаны выше. После амплификации 20 мкл повторно амплифицированной реакционной смеси анализировали на агарозном геле и 4 мкл использовали для субклонирования PCR-продуктов в вектор pCRII с использованием системы клонирования ТА (Frohman, M.A., Dush, M.K.Martin,G.R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 89989002) (Invitrogen). После лигирования в течение ночи при 14 С лигированные продукты использовали для трансформации Е. coli. Полученные трансформанты собирали и 3 мл ночных культур использовали для приготовления плазмидных минипрепаратов. Размеры вставок определяли с использованием EcoRI-гидролиза плазмид, и клоны, содержащие вставки, приблизительно размера исходного PCR-продукта, секвенировали с использованием реагентовтерминаторов и флуоресцентного красителя(Prism, Applied Biosystems), и с использованием ДНК-секвенатора Applied Biosystems 373. Последовательность PCR-продукта показана на фиг. 2. Последовательность амплифицированных праймеров подчеркнута. С) Реакция 5'RACE Удлинение кДНК, идентифицированной посредством RT-PCR, осуществляли с использованием системы 5' RACE (Loh, E.Y., Eliot, J.F.,Cwirla, S., Lanier, L.L.,Davis, M.M. (1989)Sitaraman, K., (1991) Focus 1399 (GIBCO. Один микрограмм РНК ТНР-1 (обработанных окисленным ЛНП), использованных первоначально в реакциях дифференциального отображения,использовали в реакции 5'RACE: 1 мкл (1 мкг) РНК объединяли с 3 мкл (3 пмоль) праймера 2 а и 11 мкл DEPCобработанной воды и нагревали до 70 С в течение 10 мин, а затем выдерживали в течение 1 мин на льду. Затем добавляли 2,5 мкл 10 х буфера для реакции (200 мМ Трис-HCl, рН 8,4, 500 мМ KСl), 3 мкл 25 мМ МgСl2, 1 мкл 10 мМ смеси dNTP и 2,5 мкл 0,1 М ДТТ. Эту смесь инкубировали в течение 2 мин при 42 С, а затем добавляли 1 мкл обратной транскриптазы Superscript II. Реакционную смесь инкубировали еще 30 мин при 42 С, 15 мин при 70 С и 1 мин на льду. Затем добавляли один микролитр РНКазы Н (2 единицы) и смесь инкубировали при 55 С в течение 10 мин. кДНК очищали с использованием колонок GlassMax (Sambrook, J. Fritsch, E.FManiatis T. (1989) Molecular Cloning: A Labo 35Laboratory Press, Plainview, NY), включенных в набор. Эту кДНК элюировали из колонки в 50 мкл dH2O, лиофилизовали и ресуспендировали в 21 мкл dH2O. Наращивание цепи кДНК осуществляли в следующей реакции: 7,5 мкл dH2O, 2,5 мкл буфера для реакции (200 мМ Трис-HCl, рН 8,4, 500 мМ KСl), 1,5 мкл 25 мМ МgСl2, 2,5 мкл 2 мМ dCTP и 10 мкл кДНК инкубировали при 94 С в течение 3 мин, а затем на льду в течение 1 мин. Затем добавляли 1 мкл (10 единиц) концевой дезоксинуклеотидил-трансферазы и смесь инкубировали в течение 10 мин при 37 С. Фермент подвергали тепловой инактивации путем инкубирования при 70 С в течение 10 мин, а затем смесь помещали на лед. PCR-амплификацию кДНК осуществляли в следующих стадиях: 5 мкл кДНК с наращенным концом было включено в реакционную смесь, которая также содержала 5 мкл 10 х PCR-буфера (500 мМ KСl, 100 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 15 мМMgCl2 и 0,01% (мас./об.) желатина), 1 мкл 10 мМ смеси dNTP, 2 мкл (10 пмоль) якорного праймера, 1 мкл (20 пмоль) праймера 3 а и 35 мкл dH2O. Реакционную смесь нагревали до 95 С в течение 1 мин, а затем добавляли 0,9 мкл(4,5 единиц) полимеразы Amplitaq. Реакцию проводили в 40 циклов при следующих условиях: 94 С - 5 с, 50 С - 20 с и 72 С - 30 с. Один микролитр этой реакционной смеси использовали для "гнездовой" повторной амплификации в целях повышения уровней специфического продукта для последующего выделения. Для повторной амплификации использовали: 1 мкл смеси для первичной амплификации, 5 мкл 10 х(20 пмоль) универсального праймера для амплификации, 2 мкл (20 пмоль) праймера 4 а и 38 мкл dH2O. Реакционную смесь нагревали до 95 С в течение 1 мин, а затем добавляли 0,7 мкл(3,5 единиц) полимеразы Amplitaq. Реакцию проводили в 40 циклов при следующих условиях: 94 С - 5 с, 50 С - 20 с и 72 С - 30 с. Амплифицированные продукты анализировали путем электрофореза в 0,8% агарозном геле. Был обнаружен преобладающий продукт, содержащий примерно 1,2 т.п.о. Два микролитра продуктов реакции клонировали в вектор pCRII из набора для клонирования ТА (Invitrogen) и инкубировали в течение ночи при 14 С. Эти продукты лигирования использовали для трансформации Е. coli. Размеры вставок полученных трансформантов определяли путем EcoRI-гидролиза. Клоны, содержащие вставки приблизительно размера PCR-продукта, секвенировали с использованием реагентов-терминаторов - флуоресцентного красителя (Prism, Applied Bio-systems),и с использованием ДНК-секвентатора Applied 36 ный праймер и праймер, комплементарный 5'RACE-праймеру 4 а) подчеркнуты. Пример 2. Клонирование и локализация гена LLGXL на хромосоме. А) Скрининг библиотеки кДНК Плацентарную библиотеку кДНК человекаClontech (Palo Alto, CA). Радиоактивно меченный зонд создавали путем вырезания вставки плазмиды, содержащей вышеописанный PCRпродукт 5'-RACE-реакции. Зонд радиоактивно метили с использованием техники рандомизированного праймирования: ДНК-фрагмент (50100 нг) инкубировали с 1 мкг рандомизированных гексамеров (Gibco) при 95 С в течение 10 мин, а затем на льду в течение 1 мин. Затем при комнатной температуре были добавлены 3 мкл 10 х буфера Кленова (100 мМ Трис-HCl, рН 7,5,50 мМ МgСl2, 57 мМ дитиотрейтол; New England Biolabs), 3 мкл (0,5 мМ dATP, dGTP, dTTP),100 мкКи -32PdCTP (3000 Ки/ммоль, New England Nuclear) и 1 мкл фрагмента Кленова ДНКполимеразы I (5 единиц, Gibco). Реакционную смесь инкубировали в течение 2-3 ч при комнатной температуре, а затем реакцию прекращали путем повышения объема до 100 мкл с использованием ТЕ, рН 8,0 и путем добавленияEDTA до конечной концентрации 1 мМ. Не включенные нуклеотиды удаляли путем повышения объема реакционной смеси до 100 мкл и ее пропускания через центрифужную колонкуG-50 (Boehringer Mannheim). Полученные зонды имели специфическую активность, превышающую 5 х 108 имп/мин/мкг ДНК. Библиотеку зондировали стандартными методами (Walter, P., Gilmore, R.,Blobel, G.(1984) Cell 38, 5-8). Для этого фильтры гибридизовали в течение 24 ч при 65 С в 4,8 Х SSPEEDTA, рН 7,7), 20 мМ Трис-HCl рН 7,6, 1 х растворе Денхардта (100 Х = 2% фиколл 400, 2% поливинилпирролидон, 2% BSA), 10% сульфате декстрана, 0,1% ДСН, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося и 1 х 106 имп/мин/мл радиоактивно меченного зонда. Затем фильтры промывали три раза в течение 15 мин при комнатной температуре в 2 х SSC (1 х SSC = 150 мМ NaCl, 15 мМ цитрат натрия, рН 7,0), 0,1% додецилсульфате натрия (ДСН), а затем промывали три раза в течение 15 мин при 65 С каждым из 0,5 х SSC и 0,1% ДСН. Фаг, который гибридизовался с зондом, выделяли и амплифицировали. ДНК очищали из амплифицированного фага с использованием реактива LambdaSorb (Promega) в соответствии с инструкциями производителей. Вставки вырезали из фаговой ДНК путем гидролиза ферментом EcoRI. Эти вставки субклонировали в EcoRI-сайт плазмидного вектора(Bluescript II SK, Stratagene). Путем вышеописанного автоматического секвенирования была определена последовательность открытой рамки 37 считывания, находящаяся внутри 2,6 т.п.о.EcoRI-фрагмента кДНК. Эта последовательность показана на фиг. 4. Аминокислотная последовательность предсказанного белка, кодированного открытой рамкой считывания, показана на фиг. 5 и обозначена LLGXL. Было предположено, что первый метионин кодируется парами нуклеотидов 252-254. Предсказанный белок имеет длину в 500 аминокислот. Первые 18 аминокислот образуют последовательность,характерную для секреторного сигнального пептида (Higgins, D.G.Sharp, P.M. (1988)Gene 73, 237-244). Предсказанный пропептид имеет молекулярную массу 56800 Дальтон. Если предположить, что расщепление сигнального пептида происходит в положении 18, то молекулярная масса не модифицированного зрелого белка составляет 54724 Дальтон. Полное сходство между этим белком и другими известными членами семейства триацилглицерол-липазы проиллюстрировано на фиг. 6 и в табл. 1. В сравнении первичных последовательностей, показанном на фиг. 6, LLG представляет собой полипептид (SEQ ID No: 6),кодированный кДНК (SEQ ID No: 5), описанной в примере 1, и далее обозначается LLGN. По своим аминоконцевым 345 остаткам этот белок идентичен белку LLGXL. 9 уникальных остатков следуют за стоп-кодоном и продуцируют полипептид 39,3 кДа и зрелый белок 37,3 кДа. Последовательности, которые являются общими для LLGN и LLGXL, представляют собой последовательность нуклеиновой кислоты SEQ IDSEQ ID No: 10. Интересно отметить, что положение, в котором белки LLGN и LLGXL различаются,представляет собой область, которая, как известно из структуры другой липазы, находится между амино- и карбоксидоменами этих белков. Поэтому белок LLGN, очевидно, состоит только из одного из двух доменов триацилглицероллипаз. Эта последовательность содержит характерный мотив "GXSXG" липазы в положениях 167-171, а также консервативные остатки каталитической триады в Ser 169, Asp 193 и His 274. Консервативность цистеиновых остатков (положения 64, 77, 252, 272, 297, 308, 311, 316, 463 и 483), которые участвуют в дисульфидных связях в других липазах, дает основание предположить, что белок LLGXL имеет структурное сходство с другими ферментами. Имеются пять предполагаемых сайтов N-гликозилирования в положениях аминокислот 80, 136, 393, 469 и 491. Последовательностями белка, используемыми для сравнения, являются липопротеинлипаза человека (LPL; Genbank, номер доступаM15856, SEQ ID No: 13), липаза печени человека (HL, Genbank, номер доступа J03540, SEQ 38 липазе человека (PLRP-1; Genbank, номер доступа M93283), белок-2, родственный панкреатической липазе человека (PLRP-2; Genbank,номер доступа M93284). Таблица 1. Сходство семейства генов триацилглицерол-липаз Процент сходства оценивали исходя из сравнения пар оснований первичных структур с использованием алгоритма Clustal (Camps, L,Reina, M., Llobera, M., Vilaro, S.,Olivecrona,T. (1990) Am. J. Physiol. 258, C673-C681) программы Megalign в наборе программ LasergeneBiocomputing Software Suite (Dnastar). В) Локализация на хромосоме ДНК от клона PI (Sternberg, N., Ruether, J.DeRiel, К. The New Biologist 2: 151-62, 1990),содержащего геномную ДНК LLG, метили UTP"ник"-трансляции. Меченный зонд объединяли с фрагментированной ДНК человека и гибридизовали с РНА, стимулированной лимфоцитами периферической крови, взятыми от донора мужчины, в растворе, содержащем 50% формамида, 10% сульфата декстрана и 2 х SSC. Специфические сигналы гибридизации детектировали путем инкубирования гибридизованных клеток с флуоресцентно помеченными антителами против дигоксигенина с последующим контрастным окрашиванием DAPI. Этот предварительный эксперимент приводил к специфическому мечению хромосомы группы Е, которая, исходя из DAPI-окрашивания, является,очевидно, хромосомой 18. Затем проводили второй эксперимент, в котором меченный биотином зонд, специфичный для центромеры хромосомы 18, совместно гибридизовали LLG-зондом. Этот эксперимент приводил к специфическому окрашиванию центромеры хромосомы 18 красным и длинного плеча хромосомы 18 зеленым. Измерения 11 специфически меченных гибридизованных хромосом 18 продемонстрировали, что LLG имеетFlter 0,67 (измерения по Франку 0,38), что соответствует полосе 18q21. Некоторые наследственные заболевания, включая внутрипеченочный холестаз, колбочко-палочковую дистрофию(сетчатки) и наследственный остеолиз, очевидно, обусловлены дефектами в этой области хромосомы. Пример 3. Анализ РНК LLG. А) Экспрессия РНК LLG в клетках ТНР-1 Анализ мРНК, из которой получают кДНК,осуществляли путем Нозерн-анализа РНК ТНР 1. РНК от этих клеток получали как описано выше. Эту мРНК выделяли из полной РНК с использованием системы poly-dT-магнитных 39 сфер (Polyattract system, Promega). Три микрограмма poly(А)-содержащей мРНК подвергали электрофорезу на 1% агарозном формальдегидном геле. Этот гель промывали в течение 30 мин в dH2O. РНК переносили в условиях вакуума на найлоновую мембрану с использованием щелочного буфера для переноса (3 М NaCl, 8 мМNaOH, 2 мМ саркозил). После переноса блот нейтрализовали путем инкубирования в течение 5 мин в 200 мМ фосфатном буфере, рН 6,8. РНК перекрестно сшивали с мембраной с использованием прибора для УФ-сшивания (Stratagene). Зонд получали путем вырезания вставки плазмиды, содержащей 5'RACE-продукт PCRреакции, описанный выше. Этот зонд подвергали радиоактивному мечению с использованием техники рандомизированного праймирования,описанной в примере 2. Фильтры предварительно гибридизовали в растворе для быстрой гибридизации QuikHyb(Stratagene) в течение 30 мин при 65 С. Радиоактивно меченный зонд (1-2 х 106 имп/мин/мл) и обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (конечная концентрация 100 мкг/мл) денатурировали путем нагревания в течение 10 мин до 95 С и быстро охлаждали льдом, после чего переносили на фильтр в раствор QuikHyb. Гибридизацию проводили 3 ч при 65 С. Негибридизированный зонд удаляли путем двукратной 15 минутной промывки фильтров 2 х SSC, 0,1% додецилсульфатом натрия при комнатной температуре с последующей двукратной 15 минутной промывкой фильтров 0,1 х SSC, 0,1% ДСН при 62 С. После промывки фильтры быстро осушали, а затем экспонировали с пленкой-80 С. Результаты проиллюстрированы на фиг. 7, где показаны крупные мРНК-молекулы, составляющие приблизительно 4,5 тысяч пар оснований. Присутствовали также и более мелкие молекулы длиной 4,3 и 1,6 тысяч пар оснований. Ожидаемый размер кДНК LLGN составлял 1,6 т.п.о. Последовательность LLGXL, очевидно,кодируется крупными молекулами детектированной мРНК. В) Экспрессия РНК LLG в различных тканях человека Коммерчески доступный готовый фильтр,содержащий 3 мкг каждой из мРНК от различных тканей человека (сердца, головного мозга,плаценты, легких, печени, скелетной мышцы,почек и поджелудочной железы), получали от фирмы Clonetech (Catalog 7760-1). Этот фильтр зондировали и обрабатывали, как описано выше. После зондирования радиоактивно меченным фрагментом LLG и радиоавтографии, зонд очищали путем промывки в кипящем 0,1 х SSC,0,1% ДСН в инкубаторе при 65 С в течение 2 х 15 мин. Затем мембраны зондировали с использованием ДНК-фрагмента в 1,4 т.п.о., кодирующего липопротеин-липазу человека. Этот фрагмент получали посредством полимеразной цеп 003293 40 ной реакции с обратной транскриптазой (RTPCR) РНК от клеток ТНР-1 (обработанных РMА и окис. ЛНП) с использованием 5'LPL- и 3'LPLпраймеров, показанных на фиг. 1, и условий RTPCR, описанных выше. После авторадиографии,мембраны снова очищали и снова зондировали радиоактивно меченным фрагментом кДНК бета-актина человека для нормализации содержания РНК. Результаты этих анализов проиллюстрированы на фиг. 8. Наиболее высокие уровни транскрипта LLG обнаруживались в РНК плаценты, а более низкие уровни обнаруживались в РНК, происходящих от тканей легких, печени и почек. В соответствии с предыдущими исследованиями других авторов (Verhoeven, A.J.M., Jansen, H. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1211, 121124) транскрипт липопротеин-липазы обнаруживался во многих тканях, при этом наибольшие уровни обнаруживались в тканях сердца и скелетной мышцы. Результаты этих анализов показали, что распределение экспрессии LLG в тканях очень отличается от распределения LPL. Характер экспрессии LLG также отличается от характера экспрессии липазы печени или панкреатической липазы, как сообщалось другими исследователями (Wang, C.-S.,Hartsuck, J.A.(1993) Biochem. Biophys. Acta 1166, 1-19; Semenkovich, C.F., Chen S.-W., Wims, M., Luo C.C., Li, W.-H.,Chan, L. (1989) J. Lipid Res. 30,423-431; Adams, M.D, Kerlavage, A.R., Fields, C., Venter, C. (1993) Nature Genet. 4, 256-265). Для определения характера экспрессии в других тканях человека, другая коммерчески доступная мембрана была зондирована с использованием кДНК LLGXL. Этот дот-блот(РНК человека Master Blot, Clontech Cat.77701) содержал 100-500 нг мРНК из 50 различных тканей и был нормализован на эквивалентную экспрессию генов "домашнего хозяйства" (Chan,L.,Morin, R. (1971) Biochem. Biophys. Acta 231, 194-197). 1,6 т.п.о. DraI-SrfI-фрагмент кДНК LLGXL метили 32PdCTP с использованием рандомизированной системы олигонуклеотидного праймирования (Prime It II, Stratagene) с соответствии с инструкциями производителей. После 30-минутной предгибридизации при 65 С зонд добавляли к гибридизационному растворуQuikHyb при 1,3 х 106 имп/мин/мл. Гибридизацию проводили в течение 2 ч при 65 С. Негибридизованный зонд удаляли путем двукратной промывки фильтров 2 х SSC в течение 15 мин, а затем 0,1% додецилсульфатом натрия при комнатной температуре с последующей двукратной промывкой в течение 15 мин в 0,1 х SSC, 0,1% ДСН при 62 С. После промывки фильтры подвергали быстрой сушке, а затем экспонировали с пленкой Kodak XAR-2 с использованием усиливающих экранов при -80 С в различные периоды времени. Полученные изображения количественно оценивали путем денситометрии. Результаты представлены в табл. 2. Относительные уровни экспрессии в тканях, опреде 41 ленные с помощью Нозерн-анализа множества тканей и с помощью дот-блотов, полученных от множества тканей, были аналогичны, при этом наиболее высокие уровни наблюдались в плаценте, а более низкие уровни наблюдались в легких, печени и почках. В фетальной печени,почках и легком также экспрессировались почти те же самые уровни, что и в тканях взрослых индивидуумов. Неожиданно было обнаружено,что из всех представленных тканей, ткани щитовидной железы экспрессировали наиболее высокие уровни, которые составляли 122% от уровня, экспрессируемого в тканях плаценты. Хотя экспрессия липазы в плаценте наблюдалась ранее (Rothwell, J.E., Elphick, M.C. (1982) J.Biophys. Acta 618, 449-460), однако, экспрессия какой-либо липазы в щитовидной железе ранее не наблюдалась. Эти результаты дают основание предположить, что экспрессия LLG может способствовать сохранению плаценты, где LLG может служить для высвобождения свободных жирных кислот из субстратов, таких как фосфолипиды, как источников энергии. LLG, экспрессированный в щитовидной железе, может служить предшественником для синтеза биологически активных молекул этой железой. Таблица 2. Экспрессия мРНК LLG в различных тканях человека Весь голов- н.о ной мозг Миндалина н.о. Хвост ядра Мозжечок Кора голов- н.о. ного мозга Лобная доля н.о. черное вещество височная доля таламус подбугорное ядро спинной мозг сердце предстательная железа желудок яички Продолговатый мозг Затылочная доля Скорлупа скелетная мышца толстая кишка мочевой пузырь щитовидная железа слюнная железа Данные величины представляют собой проценты экспрессии; при этом уровни в тканях плаценты были произвольно приняты за 100%. Эти величины представляют собой средние значения из денситометрических измерений, полученных из двух авторадиографических экспонирований, н.о. - не обнаруживали. С) Экспрессия РНК LLG в культивированных эндотелиальных клетках Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) и эндотелиальные клетки коронарной артерии человека (НСАЕС) получали от Clonetics. HUVEC были размножены в коммерчески доступной среде для роста эндотелиальных клеток (EGM, Clonetics), в которую было добавлено 3 мг/мл экстракта бычьего головного мозга (Maciag, Т., Cerundolo, J., Ilsley,S., Kelley, P.R.,Forand, R. (1979) Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 76, 5674-5678, Clonetics), а НСАЕС были размножены в среде EGM, в которую было добавлено 3 мг/мл экстракта бычьего перифериче- н.о. печень пло- 14 ский лейкоцит да лимфоузел н.о. селезенка н.о. плода костный мозг н.о. тимус плода н.о. аппендикс головного мозга и 3% фетальной бычьей сыворотки (в конечной концентрации 5%). Клетки культивировали до достижения конфлюентности, после чего эту среду заменяли на средуEGM, не содержащую экстракта бычьего головного мозга. Культуры стимулировали путем добавления 100 нг/мл миристата форбола(Sigma). После 24-часового инкубирования,РНК экстрагировали из клеток методом с использованием тризола, описанным выше. 20 мкг полной РНК подвергали электрофорезу и переносили на мембрану для анализа. Мембраны зондировали LLG- и LPL-зондами, как описано выше. Результаты проиллюстрированы на фиг. 9. 20 мкг полной РНК из клеток ТНР-1, стимулированных РМА, подвергали блот-анализу для сравнения. РНК, гибридизирующуюся с LLGзондом, обнаруживали в нестимулированных и РМА-стимулированных клетках HUVEC. В противоположность этому, детектируемые уровни мРНК LLG обнаруживались только в культурах НСАЕС после стимуляции РМА. В соответствии с предшествующими исследованиями дру 43 гих авторов какого-либо детектируемого уровня мРНК липопротеин-липазы не было обнаружено ни в одной из эндотелиальных РНК (Verhoeven,A.J.M., Jansen, H. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1211, 121-124). Пример 4. Анализ на белок LLG. А) Получение антител Продуцировали антисыворотку против пептидов, имеющих последовательность, соответствующую области, которая, предположительно, кодируется открытой рамкой считывания кДНК LLG. Был выбран именно этот пептид, поскольку он имеет высокий предсказанный индекс антигенности (Jameson В.А.Wolf,H. (1988) Comput. Applic. in the Biosciences 4,181-186). Последовательность иммунизирующего пептида не была обнаружена ни в одном белке или в транслированной ДНК-последовательности, имеющихся в базе данных Genbank. Соответствующее положению этой последовательности в белке LLG показано на фиг. 10. Карбоксиконцевой цистеин этого пептида не соответствует остатку в предполагаемом белкеLLG, но он был введен для облегчения связывания с белком-носителем. Этот пептид синтезировали на синтезаторе пептидов Applied Bio-systems Model 433A. Два миллиграмма пептида объединяли с двумя миллиграммами активированного малеимидом гемоцианина лимфы улитки в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору Imject Activated Immunogen Conjugation Kit (PierceChemical). После обессоливания половину этого конъюгата эмульгировали с использованием равного объема полного адъюванта Фрейнда(Pierce). Эту эмульгированную смесь вводили новозеландским белым кроликам. Через четыре недели после первоначальной инокуляции была сделана бустер-инокуляция, при этом эмульгирование проводили точно также как было описано выше, за исключением того, что использовали неполный адъювант Фрейнда (Pierce). Через две недели после бустер-инокуляции брали пробу крови и титры специфических антител определяли посредством анализа ELISA с использованием иммобилизованного пептида. Следующую бустер-инокуляцию проводили через месяц после первой бустер-инокуляции. В) Вестерн-анализ среды от эндотелиальных клеточных культур Клетки HUVEC и НСЕАС культивировали и стимулировали РМА, как описано в примере 3 С, за исключением того, что клетки стимулировали РМА в течение 48 ч. Образцы кондиционированной среды (9 мл) инкубировали с 500 мкл 50%-ной суспензии гепарина-сефарозы CL6B в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, 150 мМ хлорид натрия, 100 мМ фосфат натрия, рН 7,2). Для частичной очистки и концентрирования белков LLG была выбрана именно гепарин-сефароза, поскольку консервативность остатков в последовательностиLLGXL была идентифицирована как критическая для гепарин-связывающей активности LPLBrunzell, J.D., J. Lipid Res. 35, 2049-2059; и на фиг. 6). После вихревого перемешивания при 4 С в течение 1 ч образцы центрифугировали в течение 5 мин при 150 х g. Затем среду отсасывали и сефарозу промывали 14 мл PBS. После центрифугирования и отсасывания осажденную гепарин-сефарозу суспендировали в 200 мкл 2 х ДСН-буфера для загрузки (4% ДСН, 20% глицерин, 2% -меркаптоэтанол, 0,002% бромфеноловый синий и 120 мМ Трис, рН 6,8). Образцы нагревали до 95 С в течение 5 мин и 40 мкл образцов наносили на 10%-ный Трис-глициновый гель с ДСН. После электрофореза при 140 В приблизительно в течение 90 мин белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью аппарата для электроблоттинга Novex (210 В, 1 ч). Мембраны блокировали в течение 30 мин в блокирующем буфере (5% обезжиренное сухое молоко, 0,1% Твин-20, 150 мМ хлорид натрия, 25 мМ Трис, рН 7,2). Антипептидные антисыворотки и нормальную кроличью сыворотку разводили 1:5000 в блокирующем буфере и инкубировали с мембранами в течение ночи при 4 С при мягком помешивании. Затем мембраны 4 раза в течение 15 мин промывали TBST(0,1% Твин-20, 150 мМ хлорид натрия, 25 мМ Трис, рН 7,2). Козьи антикроличьи антисыворотки, конъюгированные с пероксидазой, (Boehringer Mannheim) разводили 1:5000 в блокирующем буфере и инкубировали, перемешивая,с мембраной в течение 1 ч. Эти мембраны промывали как описано выше, а затем подвергали реакции с хемилюминесцентным реагентомRenaissance (DuPont NEN) и экспонировали с пленкой Kodak XAR-2. Результаты представлены на фиг. 11. В образцах от нестимулированных клеток HUVEC и НСАЕС присутствовали два вида иммунореактивных белков. Уровни иммунореактивного белка в нестимулированных образцах НСАЕС были гораздо ниже, чем уровни, соответствующие образцу HUVEC. После стимуляции РМА три иммунореактивных белка были секретированы эндотелиальными клеточными культурами. Обработка РМА значительно повышала уровень белков LLG, продуцированных культурами НСАЕС. РМАиндуцирование белков LLG в культурах HUVEC не играло существенной роли. Пример 5. Продуцирование рекомбинантного белка LLG. А) LLG-экспрессирующие конструкции кДНК, кодирующие белки LLGN иLLGXL, клонировали в экспрессирующий вектор рСDNА 3 млекопитающего (Invitrogen). Этот вектор позволяет экспрессировать чужеродные гены во многих клетках млекопитающих благодаря использованию главного позднего промотора цитомегаловируса. Этот 5'RACE-продуктLLGN клонировали в EcoRI-сайт pCDNA3. кДНК LLGXL гидролизовали ферментами DraI и SrfI с получением кДНК размером 1,55 т.п.о.(см. фиг. 4). Полученный вектор гидролизовали рестриктирующим ферментом EcoRV, а затем вектор и вставку лигировали с использованием ДНК-лигазы Т 4 и реагентов из набора для быстрого лигирования Rapid Ligation Kit (BoehringerMannheim) в соответствии с инструкциями производителей. Эти лигированные продукты были использованы для трансформации компетентной Е. coli. Полученные колонии скринировали путем рестрикционного анализа и секвенировали на присутствие и ориентацию вставки в экспрессирующем векторе. В) Кратковременная трансфекция LLG в клетках COS-7LLG-экспрессирующие векторы вводили в клетки COS-7 с использованием катионного липидного реагента липофектамина (GIBCO). За 24 ч до трансфекции клетки COS-7 высевали на 60 мм-чашки для культивирования ткани при плотности 2 х 105 клеток/чашку. Эти клетки размножали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM; GIBCO), в которую были добавлены 10% фетальная сыворотка теленка, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. К 300 мкл бессывороточной среды Орtimem I (Gibco) добавляли один микрограмм плазмидной ДНК. Десять микролитров липофектаминового реагента разводили в 300 мкл среды Optimem I и этот раствор объединяли с раствором ДНК и оставляли для перемешивания при комнатной температуре на 30 мин. Затем, среду удаляли из чашек и клетки промывали 2 мл среды Optimem I. Раствор ДНК и липофектамина добавляли в чашки вместе с 2,7 мл среды Optimem и эти чашки инкубировали в течение 5 ч при 37 С. После инкубирования бессывороточную среду удаляли и заменяли средой DMEM, в которую были добавлены 2%FBS и антибиотики. Через 12 ч после трансфекции определенную часть культур обрабатывали либо 0,25 мМ Pefabloc SC (BoehringerMannheim), либо ингибитором протеазы, либо 10 ед/мл гепарина. За 30 мин до сбора, обработанные гепарином образцы обрабатывали еще 40 ед/мл гепарина. Среду удаляли из клеток через 60 ч после трансфекции. К 1 мл среды добавляли гепаринсефарозу CL-4B (200 мкл 50% суспензии в PBS, рН 7,2) и размешивали при 4 С в течение 1 ч. Затем сефарозу осаждали путем центрифугирования при низкой скорости и три раза промывали 1 мл холодного PBS. Эту сефарозу осаждали и суспендировали в 100 мкл 2 х буфера для загрузки. Образцы нагревали до 95 С в течение 5 мин. 40 мкл каждого образца наносили на 10% ДСН-ПААГ-гель. Электрофорез и вестерн-анализ осуществляли с использованием антисыворотки против LLG как описано выше. Результаты представлены на фиг. 12. Белки из кондиционированной среды от НСАЕС 46 были включены для сравнения размеров. LLGN мигрирует приблизительно при 40 кДа, что соответствует самой нижней полосе в НСАЕС. Среда от клеток COS, трансфицированных кДНК LLGXL, содержит типы белка 68 кДа и 40 кДа. При обработке этих клеток гепарином количество белков 68 кДа и 40 кДа, выделенных из среды, резко увеличивалось, что указывало либо на высвобождение из клеточной поверхности белка, связанного с протеогликаном, либо на стабилизацию этих белков гепарином. При обработке клеток ингибитором протеазы Pefabloc количество белка 68 кДа увеличивалось по сравнению с белком типа 40 кДа. Это дает основание предположить, что белок с более низкой молекулярной массой, продуцированный этими клетками, представляет собой продукт протеолиза более крупной 68 кДа-формы. Роль мРНК,идентифицированной посредством дифференциального отображения, которая кодирует более короткие виды белка 40 кДа, до сих пор не известна. Однако сообщалось, что была получена альтернативно сплайсированной, форма липазы печени, которая, очевидно, экспрессируется тканеспецифическим образом и должна продуцировать усеченный белок. Пример 6. LLG у животных различных видов. А) Клонирование кроличьего гомологаLLG Коммерчески доступную библиотеку кДНК лямбда, происходящую от легочной ткани кролика (Clontech, кат.TL1010b), использовали для выделения фрагмента кроличьего гомолога гена LLG. Пять микролитров исходной библиотеки добавляли к 45 мкл воды и нагревали до 95 С в течение 10 мин. Были добавлены следующие материалы в конечном объеме 100 мкл: 200 мкМ dNTP, 20 мМ Трис-HCl, рН 8,4, 50 мМ KСl, 1,5 мМ МgСl2, 100 мкМ каждого из праймеров DLIP774 и LLGgen2a и 2,5 единиц полимеразы Taq (GIBCO). Реакцию проводили в 35 термоциклов при следующих условиях: 15 с - 94 С, 20 с - 50 С и 30 с -72 С. 10 микролитров этой реакционной смеси анализировали путем электрофореза в агарозном геле. Был обнаружен продукт приблизительно в 300 пар оснований. Часть (4 мкл) этой реакционной смеси использовали для клонирования продукта с помощью системы клонирования ТА. Вставку полученного клона секвенировали (SEQ ID No: 11). Сравнение первичных выведенной кроличьей аминокислотной последовательности (SEQID No: 12) и соответствующей последовательности кДНК человека также показано на фиг. 14. Для нуклеотидов, которые не являются частью любого праймера для амплификации, наблюдалось 85,8%-ное сходство между кроличьей последовательностью и последовательностьюLLG человека. Предсказанный белок, кодированный этой кроличьей кДНК, имеет 94,6%-ную идентичность с белком человека, при этом, 47 большинство нуклеотидных замен находится в третьем положении или в положениях нестрогого соответствия ("качелей") кодонов. Следует особо отметить, что эта область охватывает последовательность "крышки" предсказанных белков LLG и представляет собой вариабельный домен в семействе генов липазы. Очевидно, это обеспечивает высокую степень консервативности этого гена для различных видов. В) LLG в других видах Для демонстрации присутствия генов LLG в других видах геномные ДНК от различных видов гидролизовали рестриктирующим ферментом EcoRI, выделяли путем электрофореза в агарозных гелях и блотировали на нитроцеллюлозных мембранах. Мембраны гибридизовали в течение ночи при 65 С с 2,5 х 106 имп/мин/мл рандомизированно праймированного зонда 32P-LLG или 32PLPL (липопротеинлипаза) в растворе для гибридизации: 6 х SSC, 10% сульфат декстрана, 5 X раствор Денхардта, 1% ДСН и 5 мкг/мл ДНК спермы лосося. Эти мембраны промывали 0,1 хSSC, 0,5% ДСН в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем последовательно в течение 10 мин при температуре 40, 50 и 55 С. Авторадиограммы блотов показаны на фиг. 16. На фиг. 16 проиллюстрировано присутствие генов LLG и LPL во всех оцениваемых видах, за исключением того, что гибридизации с зондом LLG против ДНК крысы не наблюдалось. Исключительные данные, полученные для крысы, могут представлять артефакт, вызванный генерированием рестрикционных фрагментов аномального размера, содержащих последовательности LLG. Такие фрагменты могут находиться вне пределов фракционирования агарозного геля или могут быть следствием неэффективного блотирования. Различные полосы,обнаруженные посредством двух зондов, указывают на то, что LPL и LLG представляют собой отдельные эволюционно консервативные гены. Пример 7. Ферментативная активностьLLGXL. А) Фосфолипазная активность Кондиционированные среды от клетокLLGXL, анализировали на фосфолипазную активность. Минимальную поддерживающую среду (MEM), содержащую 10% FBS (MEM),использовали в качестве слепого контроля, а кондиционированную среду от клеток COS-7,трансфецированных антисмысловой LLGXLплазмидой (AS), использовали в качестве негативного контроля. Фосфатидилхолиновую (PC) эмульсию готовили с использованием 10 мкл фосфатидилхолина (10 мМ), 40 мкл 14 С-фосфатидилхолина,дипальмитоила (2 мкКи), меченного в 1 и 2 положениях, и 100 мкл Трис-TCNB (100 мМ Трис,1% Тритон, 5 мМ СаСl2, 200 мМ NaCl, 0,1%BSA). Полученную эмульсию упаривали в течение 10 мин, а затем доводили до конечного объема 1 мл в Трис-TCNB. Реакции проводили в дубликате, и они содержали 50 мкл эмульсии PC и 950 мкл среды. Образцы инкубировали в водяной бане со встряхиванием в течение 2-4 ч при 37 С. Реакции завершали путем добавления 1 мл 1 н. НСl,а затем экстрагировали 4 мл 2 пропанола:гексана (1:1). Верхний 1,8 мл гексановый слой пропускали через колонку с силикагелем и выделенные не содержащие 14 С жирные кислоты, находящиеся в проточной фракции,количественно оценивали в сцинтилляционном счетчике. Результаты этих анализов показаны на фиг. 14. В) Триацилглицерол-липазная активность Кондиционированную среду от клетокLLGXL, анализировали на триглицероллипазную активность. MEM, содержащую 10%FBS, использовали в качестве слепого контроля,а кондиционированную среду из клеток COS-7,трансфицированную антисмысловой LLGXLплазмидой (AS), использовали в качестве негативного контроля. Концентрированный субстрат получали в виде безводной эмульсии меченного триолеина[9,10-3H(N)] и немеченого триолеина (конечное содержание полного триолеина = 150 мг при 6,25 х 108 имп/мин), которую стабилизировали путем добавления 9 мг лецитина в 100% глицерина. 0,56 мл 3 Н-триолеина (0,28 мКи) смешивали с 0,17 мл немеченного триолеина и 90 мкл лецитина (9 мг) . Полученную смесь упаривали в потоке азота. Осушенную липидную смесь эмульгировали в 2,5 мл 100% глицерина путем обработки ультразвуком (30-секундные импульсы на уровне 2 с последующими двухсекундными циклами охлаждении в течение 5 мин). Субстрат для анализа был получен путем разведения 1 объема концентрированного субстрата четырьмя объемами 0,2 М Трис-НСlбуфера (рН 8,0), содержащего 3% мас./об. альбумина бычьей сыворотки, в котором отсутствовала жирная кислота. Разведенный субстрат интенсивно перемешивали в течение 5 с. Реакции проводили в дубликате в полном объеме 0,2 мл, содержащем 0,1 мл субстрата для анализа и 0,1 мл указанной кондиционированной среды. Реакционные смеси инкубировали в течение 90 мин при 37 С. Реакции прекращали путем добавления 3,25 мл метанолахлороформа-гептана (1,41:1,25:1)(об./об./об.), а затем, 1,05 мл 0,1 М калийкарбонатного/боратного буфера (рН 10,5). После интенсивного размешивания в течение 15 с, образцы центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. 1,0 мл-аликвоту верхней водной фазы оценивали в сцинтилляционном счетчике. Результаты этих анализов показаны на фиг. 15. 49 Пример 8. Использование LLG-полипептида для скрининга в целях выявления агонистов или антагонистов. Рекомбинантный LLG продуцировали в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусом. Рекомбинантный LLG очищали из содержащей или не содержащей сыворотку кондиционированной среды с помощью хроматографии на гепаринсефарозе, а затем, с помощью хроматографии на катионообменной смоле. Если это было необходимо, то при очистке LLG использовали третью хроматографическую стадию, такую как гель-фильтрация. Во время очистки антитела против пептидов использовали для мониторинга белка LLG, а фосфолипазный анализ использовали для определения LLGактивности. Во флуоресцентном анализе конечные условия анализа предусматривали использование приблизительно 10 мМ Трис-НСl (рН 7,4), 100 мМ KСl, 2 мМ СаСl2, 5 мкМ C6NBD-PC1-ацил 2-[6-(нитро-2,1,3-бензоксадиазол-4-ил)]амино капроилфосфатидилхолин и белок LLG (прибл. 1-100 нг) . Реакционную смесь подвергали флуоресцентному возбуждению при 470 нм и осуществляли мониторинг ферментной активности, измеренной по флуоресцентному излучению при 540 нм. Затем соединения и/или вещества, тестируемые на стимуляцию и/или ингибирование LLG-активности, добавляли в виде 10-200 мМ растворов в диметилсульфоксиде. Соединения, которые стимулируют или ингибируют LLG-активность, идентифицировали как соединения, вызывающие повышение или снижение флуоресцентного излучения при 540 нм. В этом тио-анализе конечные условия анализа предусматривали использование приблизительно 25 мМ Трис-HCl (рН 8,5), 100 мМ KСl,10 мМ СаСl2, 4,24 мМ Тритон Х-100, 0,5 мМ 1,2-бис(гексаноилтио)-1,2-дидезокси-sn-глицеро-3-фосфорилхолин, 5 мМ 4,4'-дитиобиспиридин (из 50 мМ исходного раствора в этаноле) и 1-100 нг рекомбинантного LLG. Фосфолипазную активность определяли путем измерения увеличения поглощения при 342 нм. Соединения и/или вещества, тестируемые на стимуляцию и/или ингибирование LLG-активности, добавляли в виде 10-200 мМ растворов в диметилсульфоксиде. Соединения, которые стимулируют или ингибируют LLG-активность, идентифицировали как соединения, вызывающие увеличение или снижение поглощения при 342 нм. Пример 9. Трансгенные мыши, экспрессирующие LLG человека. Для дальнейшего исследования физиологической роли LLG были продуцированы трансгенные мыши, экспрессирующие LLG человека. Рестрикционный 1,53 т.п.о.-DraI/SrfI-фрагмент, кодирующий LLGXL (см. фиг. 4), клонировали в плазмидный вектор (pHMG) ниже промотора для конститутивно экспрессируемого гена редуктазы 3-гидрокси-3-метилглутарил 003293 50 кофермента A (HMG СоА). Трансгенных мышей, у которых экспрессировались различные уровни LLGXL человека, получали стандартными методами (см., например, G.L. Tromp etal., Gene 1565: 199-205, 1995). Этих трансгенных мышей использовали для определения влияния сверхэкспрессии LLGXL на липидный профиль,сосудистую патологию, скорость развития и тяжесть атеросклероза и других физиологических параметров. Пример 10. Экспрессия LLG в атеросклеротических тканях. Экспрессию LLGXL при атеросклерозе оценивали путем проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RTPCR) с использованием мРНК, выделенной путем сосудистой биопсии от четырех пациентов с атеросклерозом. Образцы тканей брали из стенки аорты (один образец), подвздошной артерии(два образца) и сонной артерии (один образец). Биопсию из атеросклеротических сосудов получали из клиники (Gloucesterhire Royal Hospital,England),после чего получали роlу(А)+мРНК и ресуспендировали в обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC) воде при концентрации 0,5 мкг/мкл мРНК. Реакции с обратной транскриптазой осуществляли в соответствии с протоколом Gibco BRL, прилагаемым к системе предварительной амплификации (Superscript Preamplification System) для синтеза первой цепи кДНК. Вкратце, кДНК синтезировали следующим образом: 2 мкл каждой мРНК добавляли к 1 мкл oligo (dT)12-18-праймера и 9 мклDEPC-воды. Пробирки инкубировали в течение 10 мин при 70 С и помещали на 1 мин на лед. К каждой пробирке добавляли следующие компоненты: 2 мкл 10 х PCR-буфера, 2 мкл 25 мМMgCl2, 1 мкл 10 мМ dNTP-смеси и 2 мкл 0,1 М ДТТ. После 5-минутного выдерживания при 42 С добавляли 1 мкл (200 единиц) обратной транскриптазы Super Script II. Реакционную смесь слегка размешивали, а затем инкубировали 50 мин при 42 С. Реакции завершали путем инкубирования в течение 15 мин при 70 С, а затем реакционные смеси помещали на лед. Оставшуюся мРНК разрушали путем добавления в каждую пробирку 1 мкл РНКазы Н и инкубировали в течение 20 мин при 37 С.PCR-амплификацию осуществляли с использованием 2 мкл кДНК-реакционной смеси. В каждую пробирку добавляли следующие компоненты: 5 мкл 10 х PCR-буфера, 5 мкл 2 мМ(20 пмоль/мл, см. фиг. 1), 1,5 мкл 50 мМ MgCl2,0,5 мкл полимеразы Taq (5 ед/мл) и 34 мкл воды. После выдерживания реакционных смесей в течение 2 мин при 95 С проводили 30 цикловPCR при следующих условиях: 15 с при 94 С,20 с при 52 С и 30 с при 72 С. Заключительные реакции проводили в течение 10 мин при 72 С,а затем осуществляли анализ путем электрофо 51 реза в агарозном геле, hllg-gsp-праймеры являются специфичными к LLG и дают ожидаемый продукт в 300 п.о. В параллельной PCR было показано, что реакции синтеза кДНК были успешными, при этом использовали праймеры,специфичные к гену "домашнего хозяйства" и к(глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы) (1 мкл каждого при концентрации 20 пмоль/мл).G3PDH-праймеры (см. фиг. 1) давали ожидаемый продукт в 983 п.о. для всех четырех образцов сосудистой биопсии. Экспрессия LLG обнаруживалась в трех из четырех образцов, а в образце, взятом из сонной артерии, этой экспрессии не наблюдалось. Все обсуждаемые работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Для каждого специалиста очевидно, что настоящее изобретение может быть легко адаптировано для осуществления целей изобретения и достижения нужных результатов и вышеупомянутых преимуществ настоящего изобретения. Пептиды, полинуклеотиды, способы, процедуры и техника, описанные в данной заявке, представлены как предпочтительные варианты осуществления изобретения и приводятся в иллюстративных целях, а поэтому они не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения. В настоящее изобретение могут быть внесены изменения и другие варианты его использования, однако, не должны выходить за рамки существа и объема изобретения, сформулированные в прилагаемой формуле изобретения. Список последовательностейLLG семейства триацилглицерол-липаз, композиции и способы их использования в ферментативном гидролизе, и терапия с использованием белков и генов
МПК / Метки
МПК: C07K 16/40, C12N 9/20, A61K 38/46
Метки: подобным, композиции, использования, человека, способы, липазы, гену, содержащие, полипептиды, композиций, кодируемые, геном
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-3293-polipeptidy-kodiruemye-genom-podobnym-genu-lipazy-cheloveka-soderzhashhie-ih-kompozicii-i-sposoby-ispolzovaniya-kompozicijj.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Полипептиды, кодируемые геном, подобным гену липазы человека, содержащие их композиции и способы использования композиций</a>
Мутантный il-6 человека и его внутренний фрагмент, кодирующие их последовательности днк, способы их получения, содержащие их фармацевтические композиции, содержащие их векторы, линии клеток- хозяев испособ лечения il-6 опосредованных заболеваний
Номер патента: 852
Опубликовано: 26.06.2000
Авторы: Розе-Йон Штефан, Гротзингер Йоахим, Элерс Марк
МПК: A61P 19/10, A61P 35/00, A61K 38/20...
Метки: фармацевтические, лечения, хозяев, способы, векторы, испособ, человека, внутренний, мутантный, клеток, последовательности, фрагмент, композиции, линии, содержащие, днк, кодирующие, заболеваний, получения, опосредованных
Формула / Реферат:
1. Мутантный интерлейкин-6 (IL-6) человека, имеющий аминокислотную последовательность содержащую следующие точечные мутации по сравнению с природным IL-6 человека: Pro 54, Glu 159, Pro 162, Leu 170 и Аrg 176. 2. Внутренний фрагмент мутантного IL-6 человека по п.1 формулы, обладающий аналогичной биологической активностью. 3. Последовательность ДНК, кодирующая мутантный IL-6 человека по п.1 формулы. 4. Последовательность ДНК, кодирующая...
Легкие экструдированные композиции, содержащие легкий экструдируемый керамический носитель, способы их применения и способы их приготовления
Номер патента: 3033
Опубликовано: 26.12.2002
Авторы: Такаянаги Нориказу, Кимпара Масаоми, Сузуки Мунехиро
МПК: A01N 25/08
Метки: экструдируемый, легкий, экструдированные, керамический, приготовления, легкие, содержащие, способы, применения, композиции, носитель
Формула / Реферат:
1. Легкая экструдированная композиция, которая включает, по меньшей мере, одно соединение сельскохозяйственного назначения, легкий экструдируемый керамический носитель и, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество. 2. Композиция по п.1, которая далее включает минеральный носитель и связующее вещество. 3. Композиция по п.2, которая включает в пересчете на массу от примерно 0,5 до 75% одного или нескольких соединений...
Композиции и способы использования нитроксидов в сочетании с биологически совместимыми макромолекулами
Номер патента: 618
Опубликовано: 29.12.1999
Автор: Хсиа Дзен-Чанг
МПК: A61K 31/40
Метки: совместимыми, композиции, использования, биологически, сочетании, макромолекулами, способы, нитроксидов
Формула / Реферат:
1. Способ стимулирования превращений in vivo гидроксиламиновой формы нитроксида в парамагнитную форму, отличающийся тем, что включает проведение реакции нитроксида в гидроксиламиновой форме с макромолекулой полинитроксида с получением фермент-имитирующей активности в качестве гидроксиламиноксидазы, причем фермент-имитирующим соединением является нитроксидсодержащее соединение, имеющее нитроксильную группу, которая является менее стабильной, чем...
Бензотиофены, содержащие их фармацевтические композиции и способы лечения патологических состояний с их использованием
Номер патента: 1257
Опубликовано: 25.12.2000
Авторы: Дэлдер Брайан В., Стратфорд Роберт Е., Эрбутнот Гордон Н., Хартауэр Керри Дж., Льюк Вейн Д.
МПК: C07D 333/56, A61K 31/381
Метки: использованием, способы, состояний, бензотиофены, лечения, фармацевтические, патологических, содержащие, композиции
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы I и его фармацевтически приемлемые соли и сольваты, характеризующееся тем, что оно находится в форме частиц, причем эти частицы имеют средний размер менее 25 микрон. 2. Соединение по п.1, где указанные частицы имеют средний размер в диапазоне примерно от 5 до 20 микрон. 3. Соединение по п.1 или 2, где, по меньшей мере, 90% указанных частиц имеют размер менее чем 50 микрон. 4. Соединение по п.3, где, по меньшей мере, 90%...
Антибактериальные соединения карбапенема, содержащие их фармацевтические композиции и способы лечения
Номер патента: 1296
Опубликовано: 25.12.2000
Авторы: Близзард Тимоти А., Вилкенинг Роберт Р., Рэтклифф Рональд В.
МПК: C07D 477/14, A61K 31/428
Метки: лечения, карбапенема, фармацевтические, соединения, композиции, способы, содержащие, антибактериальные
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы I или его фармацевтически приемлемые соли, где R1 обозначает Н или метил; СО2М обозначает карбоновую кислоту, карбоксилатный анион, фармацевтически приемлемую сложноэфирную группу или карбоновую кислоту, защищенную защитной группой; Р обозначает водород, гидроксил, F или гидроксил, защищенный гидроксилзащитной группой; каждый R независимо выбирают из -R*; -Q; водорода; галогена; -CN; -NO2; -NRaRb; -ORc; -SRc; -C(O)NRaRb;...
Предыдущий патент: Устройство для быстрого соединения и разъединения ряда корпусных секций
Следующий патент: Ингибиторы металлопротеиназы, фармацевтические композиции, их содержащие, и их фармацевтические применения
Случайный патент: Хинолиновые антагонисты лейкотриенов