Вариант эндолизина со встроенным катионным пептидом с активностью, разрушающей липополисахарид

ВАРИАНТ ЭНДОЛИЗИНА СО ВСТРОЕННЫМ КАТИОННЫМ ПЕПТИДОМ С АКТИВНОСТЬЮ, РАЗРУШАЮЩЕЙ ЛИПОПОЛИСАХАРИД Изобретение относится к варианту эндолизина, в который встроен катионный пептид с активностью, разрушающей липополисахарид (ЛПС), а также к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант эндолизина, вектору, содержащему молекулу данной нуклеиновой кислоты, и клетке-хозяину, содержащей либо молекулу упомянутой нуклеиновой кислоты, либо упомянутый вектор. Кроме того, заявленное изобретение относится к способу получения упомянутого варианта эндолизина, к применению вышеупомянутого варианта эндолизина в качестве лекарственного препарата для лечения и/или профилактики дисфункций,заболеваний или симптоматики, ассоциируемых с заражением патогенными грамотрицательными бактериями. Наконец, заявленное изобретение относится к фармацевтической композиции с улучшенной антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий, содержащей вариант эндолизина.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: КАТХОЛИКЕ УНИВЕРСИТЕЙТ ЛВЕН К.У. ЛВЕН Р ЭНД Д (BE) Изобретение относится к модифицированным вариантам эндолизина с улучшенной антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий. Упомянутые модифицированные варианты эндолизина включают эндолизин и катионный пептид, слитый с эндолизином для повышения катионности данного эндолизина. Настоящее изобретение также относится к микроорганизму, трансформированному с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина с улучшенной катионностью. Кроме того, изобретение относится к способу получения варианта эндолизина с использованием микроорганизма, трансформированного с применением нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, и используемого в качестве продуцирующего организма. В частности, данное изобретение относится к вариантам эндолизина, содержащим эндолизин, с которым слита пептидная цепочка, обладающая активностью, разрушающей мембрану или липополисахарид (ЛПС). Более того, заявленное изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим упомянутый модифицированный вариант эндолизина, векторам, содержащим молекулы данной нуклеиновой кислоты, и клеткам-хозяинам, содержащим либо молекулы упомянутой нуклеиновой кислоты,либо упомянутые векторы. Кроме того, заявленное изобретение относится к способу получения упомянутого варианта эндолизина, более того - к применению вышеупомянутого варианта эндолизина в качестве лекарственного препарата, в частности, для лечения или профилактики инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, в качестве средства диагностики, дезинфектанта или ингредиента косметических средств. Заявленное изобретение также относится к устранению, уменьшению или предотвращению заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, загрязнению оборудования на предприятиях пищевой отрасли, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами,изделий медицинского назначения, рабочих поверхностей в больницах и хирургических блоках. Более того, заявленное изобретение относится к применению вышеупомянутого варианта эндолизина в качестве диагностического средства в медицинской, пищевой отраслях промышленности и охране окружающей среды. Наконец, заявленное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей упомянутый модифицированный вариант эндолизина. Эндолизины представляют собой пептидогликангидролазы, кодируемые бактериофагами (или бактериальными вирусами). Они синтезируются во время экспрессии "поздних" генов в литическом цикле мультипликации фагов и опосредуют высвобождение прогенных вирионов из инфицированных клеток путем разрушения бактериального пептидогликана. Они являются либо (1,4)-гликолазами (лизосимами), трансгликолазами, амидазами или эндопептидазами. Антимикробное применение эндолизинов было предложено Гассоном еще в 1991 г. (патент GB2243611). Несмотря на то что антимикробная функция эндолизинов была предметом изучения в течение достаточно длительного периода, применению этих эндолизинов в качестве антибактериальных агентов не уделялось должного внимания вследствие доминировавшего господства антибиотиков. И только после открытия мультирезистентных к антибиотикам бактерий, великолепный в своей простоте принцип применения эндолизинов для борьбы с патогенными организмами, поражающими человека, получил заслуженное признание. Насущной проблемой стала задача разработки абсолютно новых классов антибактериальных агентов, и эндолизины, используемые в качестве "энзибиотиков" (термин - сочетание "энзимов" с "антибиотиками"), явились превосходным решением данной проблемы. В 2001 г. Фискетти и соавторы продемонстрировали в первый раз терапевтический потенциал эндолизина-бактериофага CI в отношении стрептококков (streptococci) группы A (Nelson et al., 2001). С тех пор множество публикаций утвердили эндолизины в качестве эффективного и дополнительного замещающего средства для борьбы с бактериальными инфекциями, в частности, вызванными грамположительными бактериями. В последующем, различные эндолизины, эффективные в отношении других грамположительных патогенных организмов, таких как стрептококк пневмонии (Streptococcus pneumonia) (Loeffler et al., 2001), возбудитель сибирской язвы (Bacillus anthracis) (Schuch et al.,2002), S. agalactiae (Cheng et al., 2005) и золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) (Rashel et al.,2007), подтвердили свою полезность в качестве энзибиотиков. В настоящее время самой насущной проблемой лечения с применением эндолизинов является нечувствительность грамотрицательных бактерий к экзогенному действию эндолизинов, поскольку внешняя мембрана препятствует проникновению эндолизинов из пептидогликана. Данное обстоятельство препятствует расширению сферы эффективного применения эндолизинов в отношении злостных грамотрицательных патогенов. Грамотрицательные бактерии имеют внешнюю мембрану с характерным асимметричным двойным слоем, выступающим как барьер. Двойной слой внешней мембраны состоит из внутреннего одностороннего слоя, содержащего фосфолипиды (преимущественно, фосфатидил этаноламин), и наружного одностороннего слоя, содержащего преимущественно единичный гликолипид, липополисахарид (ЛПС). Существует множество вариантов структур ЛПС в мире бактерий и строение ЛПС может изменяться в ответ на воздействие условий окружающей среды. Стабильность слоя ЛПС и взаимодействие между различными молекулами ЛПС, по существу, достигаются за счет электростатического взаимодействия бивалентных ионов (Mg2+, Ca2+) с анионными элементами молекулы ЛПС (фосфатные группы липида А,внутреннее ядро и карбоксильные группы кетодезоксиоктоната (КДО. В связи с этим, катион-1 024794 связывающие участки играют очень важную роль в целостности внешней мембраны (Vaara 1992). Поликатионные агенты, такие как поли-L-лизин полимеры (с как минимум 20 остатками) повышают проницаемость внешней мембраны путем замещения данных стабилизирующих бивалентных катионов. Кроме того, они запускают механизм так называемой "самореализуемого поглощения" (Hancock and Wong,1984). Вследствие своей громоздкости, они нарушают нормальную барьерную функцию внешней мембраны и создают промежуточные трещины, тем самым способствуя собственному поглощению (Vaaraand Vaara, 1983). Более того, плотная и упорядоченная упаковка гидрофобной составляющей липида А,возникновению которой способствует отсутствие ненасыщенных жирных кислот, формирует жесткую структуру с высокой вязкостью, что делает его менее проницаемым для липофильных молекул и придает дополнительную устойчивость внешней мембране (ВМ). Все чаще, однако, микробная устойчивость к антибиотикам создает трудности в лечении все большего числа инфекций, вызванных бактериями, в особенности, такими как грамотрицательные бактерии,например синегнойная палочка и энтеробактерии. Таким образом, существует явная потребность в новых антимикробных агентах, эффективных в отношении грамотрицательных бактерий. Данная цель достигается практической реализацией предмета изобретения, описанного в формуле изобретения. Следующие фигуры иллюстрируют заявленное изобретение. Фиг. 1 представляет схематическое описание, показывающее плазмидную структуру рекомбинантного воспроизведения (POLY)n-gp144 POLY)n-KZ144). Предварительно, pEXP5CT/POLY-gp144(pEXP5CT/POLY-KZ144) построили при помощи хвоста ПЦР (с сайтом рестрикции BamHI и первой поликатионной кассетой в 5' хвостовом праймере). Плазмид линеаризовали с использованием BamHI, дефосфорилировали и лигандировали с использованием кассеты, содержащей выступающие концы BamHI. Данная кассета получена при помощи гибридизации двух комплементарных олигонуклеотидов и кодирует 9 положительно заряженных остатков. Один положительно заряженный остаток аргинина присутствует в сайте соединения между первой и второй кассетами, вместе с серином. Аналогичным образом,путем повторения цикла построили более длинные pEXP5CT/(POLY)n-gp144 (pEXP5CT/(POLY)n-KZ144) варианты. Фиг. 2 представляет экспрессию и секрецию POLY-gp144 в Pichia pastoris. 30 мкл супернатанта экспрессионной культуры P. pastoris X33 [после 1 дня (квадрат), 3 дней (треугольник) и 4 дней (окружность)] добавили к 270 мкл хлороформ-пермеабилизированным клеткам P. aeruginosa PAO1p. В качестве буфера были приняты оптимальные энзиматические условия POLY-gp144 (KH2PO4/K2HPO4) I = 120 мМ(pH 6,2). Далее, методом спектрофотометрии измерили оптическую плотность. Уменьшение показателей оптической плотности указывает на секрецию муралитического энзима P. pastoris. В качестве отрицательного контроля включили P. pastoris X33 без экспрессионного плазмида (алмаз). Фиг. 3 представляет графическое изображение антибактериальной активности немодифицированных эндолизинов phiKZgp144 и ELgp188, модифицированных вариантов POLY-gp144 и POLY-gp188,состоящих из пептидной цепочки, содержащей 9 положительно заряженных аминокислотных остатков и модифицированных вариантов (POLY)2-gp144 и (POLY)2-gp188, состоящих из пептидной цепочки, содержащей 18 положительно заряженных аминокислотных остатков, в отношении клеток Pseudomonasaeruginosa PAO1p. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений. Фиг. 4 представляет изображение кумасси-помеченных SDS-PAGE (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) с результатами экспрессии и очистки немодифицированного эндолизина PSP3gp10 и его модифицированного варианта эндолизина PKPSP3gp10. Дорожка LMW относится к размерному маркеру (LMW лесенка). Следующие три дорожки относятся к протеиновым фракциям очищенного белка в элюирующем буфере (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7,4; 0,5 М NaCl; 500 мМ имидазола) после Ni2+ аффинной хроматографии. Дорожка FT относится к поперечному потоку, а дорожка W - к побочным фракциям. На изображении очищенных протеиновых фракций видны единичные вторичные бэнды, что указывает на высокую чистоту рекомбинантных протеинов (90%). Фиг. 5 А-5 Г представляет графическое изображение антибактериальной активности немодифицированного PSP3gp10 и модифицированного PKPSP3gp10 в различных сочетаниях в отношении некоторых экспоненциально растущих грамотрицательных бактерий после инкубации при комнатной температуре и без встряхивания. Каждый вид грамотрицательных бактерий подвергли инкубации в течение 30 мин с составом, содержащим 0,5 мМ ЭДТК, но без эндолизина, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного PSP3gp10, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированногоPKPSP3gp10, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного PSP3gp10 и 0,5 мМ ЭДТК и с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного PKPSP3gp10 и 0,5 мМ ЭДТК. На фиг. 5 А представлена антибактериальная активность в отношении клеток P. aeruginosa РА 01 р, на фиг. 5 Б - антибактериальная активность в отношении клеток Р. aeruginosa Br667, на фиг. 5 В - антибактериальная активность в отношении клеток E.coli WK 6 и на фиг. 5 Г - антибактериальная активность в отношении клеток Salmonella typhimurium. "А" показывает разницу в активности между соответственно образцами PSP3gp10 и PKPSP3gp10. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения сред-2 024794 них значений. Фиг. 6 представляет изображение кумасси-помеченных SDS-PAGE (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) с результатами экспрессии и очистки немодифицированного эндолизина Р 2gp09 и его модифицированного варианта эндолизина PKP2gp09. Дорожка LMW относится к размерному маркеру (LMW лесенка). Следующие три дорожки относятся к протеиновым фракциям очищенного белка в элюирующем буфере (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7,4; 0,5 М NaCl; 500 мМ имидазола) после Ni2+ аффинной хроматографии. Дорожка FT относится к поперечному потоку, а дорожка W - к побочным фракциям. На изображении очищенных протеиновых фракций видны единичные вторичные бэнды, что указывает на высокую чистоту рекомбинантных протеинов (95%). Фиг. 7 А-7 Е представляет графическое изображение антибактериальной активности немодифицированного Р 2gp09 и модифицированного PKP2gp09 в различных сочетаниях в отношении некоторых экспоненциально растущих грамотрицательных бактерий после инкубации при комнатной температуре и без встряхивания. Каждый вид грамотрицательных бактерий подвергли инкубации в течение 30 мин с составом, содержащим 0,5 мМ ЭДТК, но без эндолизина, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного Р 2gp09, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного PKP2gp09,но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного Р 2gp09 и 0,5 мМ ЭДТК и с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного PKP2gp09 и 0,5 мМ ЭДТК. На фиг. 7 А представлена антибактериальная активность в отношении клеток P. aeruginosa PAO1p, на фиг. 7 Б - антибактериальная активность в отношении клеток P. aeruginosa Br667, на фиг. 7 В - антибактериальная активность в отношении клеток Е.coli WK 6, на фиг. 7 Г - антибактериальная активность в отношении клеток(SGSC2317). показывает разницу в активности между соответственно образцами Р 2gp09 иPKP2gp09. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений. Фиг. 8 представляет изображение кумасси-помеченных SDS-PAGE (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) с результатами экспрессии и очистки немодифицированного эндолизина OBPgpLYS и его модифицированного варианта эндолизина PKOBPgpLYS. Дорожка LMW относится к размерному маркеру (LMW лесенка). Следующие три дорожки относятся к протеиновым фракциям очищенного белка в элюирующем буфере (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7,4; 0,5 М NaCl; 500 мМ имидазола) после Ni2+ аффинной хроматографии. Дорожка FT относится к поперечному потоку, а дорожка W - к побочным фракциям. На изображении очищенных протеиновых фракций видны единичные вторичные бэнды, что указывает на высокую чистоту рекомбинантных протеинов (90%). Фиг. 9 А-9 Е представляет графическое изображение антибактериальной активности немодифицированного OBPgpLYS и модифицированного PKOBPgpLYS в различных сочетаниях в отношении некоторых экспоненциально растущих грамотрицательных бактерий после инкубации при комнатной температуре и без встряхивания. Каждый вид грамотрицательных бактерий подвергли инкубации в течение 30 мин с составом, содержащим 0,5 мМ ЭДТК, но без эндолизина, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного OBPgpLYS, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированногоPKOBPgpLYS, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного OBPgpLYS и 0,5 мМ ЭДТК и с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного PKOBPgpLYS и 0,5 мМ ЭДТК. На фиг. 9 А представлена антибактериальная активность в отношении клеток Escherichia coli WK6, на фиг. 9 Б - антибактериальная активность в отношении клеток Salmonella typhimurium LT2 (SGSC2317), на фиг. 9 В - антибактериальная активность в отношении клеток Pseudomonas aeruginosa PAO1p, на фиг. 9 Г антибактериальная активность в отношении клеток Pseudomonas aeruginosa Br667, на фиг. 9 Д - антибактериальная активность в отношении клеток Pseudomonas putida G1 и на фиг. 9 Е - антибактериальная активность в отношении клеток Burkholderia pseudomallei. показывает разницу в активности между соответственно образцами OBPgpLYS и PKOBPgpLYS. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений. Термин "белок" в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения,соотносится синонимично с термином "полипептид". Термин "белок" в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к линейному полимеру аминокислотных остатков, соединенных пептидными звеньями (цепями) в особой последовательности. Аминокислотные остатки протеина могут модифицироваться, к примеру, ковалентными прикреплениями различных групп, таких, как углеводы и фосфаты. Прочие вещества могут менее прочно присоединяться к полипептидным цепочкам, как, например, гем или липид, образовывая конъюгированные белки, которые также обозначаются термином "белок", используемым в описании заявленного изобретения. Это различные способы, которыми выявляются полипептидные цепочки, в частности, что касается присутствия альфаспиралей и бета-складок. Термин "белок", используемый в описании заявленного изобретения, относится ко всем четырем классам белков, а именно альфа, бета, альфа/бета и альфа-плюс-бета. Термин "слитый белок", используемый в описании заявленного изобретения, относится к продукту экспрессии, образующемуся в результате слияния двух нуклеиновых последовательностей. Такой проте-3 024794 ин можно получить, например, в экспрессионной системе рекомбинантной ДНК. Кроме того, термин"слитый белок", используемый в описании заявленного изобретения, относится к слиянию первой аминокислотной последовательности, в частности эндолизина, аутолизина и/или другой пептидогликангидролазы, со второй или третьей аминокислотной последовательностью. Вторая или последующая аминокислотная последовательность предпочтительно представляет собой пептидную цепочку, в частности катионный и/или поликатионный пептид. Более предпочтительно, данная вторая и/или последующая аминокислотная последовательность является чужеродной и не гомологична в какой-либо степени по отношению к любым доменам первой аминокислотной последовательности. Термин "модифицированный вариант эндолизина" используется в описании заявленного изобретения синонимично с термином "вариант эндолизина". Оба термина относятся к слитым белкам, содержащим эндолизин и пептидную цепочку, в частности катионный и/или поликатионный пептид. Термин "пептидная цепочка", используемый в описании заявленного изобретения, относится к любому виду пептида, соединенного с белком, таким как эндолизин, аутолизин и/или пептидогликангидролаза. В частности, термин "пептидная цепочка", используемый в описании заявленного изобретения, относится к катионному пептиду и/или поликатионному пептиду. Однако пептидная цепочка в том значении, в котором она трактуется в заявленном изобретении, не относится к His-меткам, Strep-меткам, Aviметкам, Мус-меткам, Gst-меткам, JS-меткам, цистеин-меткам, FLAG-меткам или другим меткам, известным из уровня техники, тиоредоксин- или мальтоза-связывающим белкам (МСБ). Термин "метка" или"таг", в отличие от термина "пептидная цепочка", используемый в описании заявленного изобретения,относится к пептиду, который применяется для облегчения экспрессии и/или аффинной очистки полипептида, для иммобилизации полипептида на поверхности, или для применения в качестве маркера или меченой составляющей для обнаружения полипептида, например, при помощи связывания антител в различных форматах энзим связанного иммуносорбентного метода исследования (ELISA), если только функция построения метки, применяемая для любой из вышеперечисленных фасилитаций, не вызвана положительным зарядом упомянутого пептида. Тем не менее, His-метка может, в зависимости от соответствующего показателя pH, быть положительно заряженной, но использоваться в качестве средства аффинной очистки вследствие своей способности связываться с иммобилизированными бивалентными катионами, а не как пептидная цепочка, в соответствии с заявленным изобретением. Термин "пептид", используемый в описании заявленного изобретения, относится к коротким полипептидам, состоящим из приблизительно от 2 до 100 аминокислотных остатков, более предпочтительно примерно от 4 до 50 аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно примерно от 5 до 30 аминокислотных остатков, причем аминогруппа одного аминокислотного остатка связана пептидной связью с карбоксильной группой другого аминокислотного остатка. Пептид (белок) может выполнять специфическую функцию, может являться естественно построенным белком, или смоделированным и синтезированным в искусственных условиях. Пептид, к примеру, можно получить или выделить из нативного белка путем энзимного или химического расщепления, или построить с помощью обычных методов белкового синтеза (например, твердофазный синтез) или методами молекулярной биологии (Sambrook, J. et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989. Предпочтительно синтетически получаемые пептиды представляют собой, например, катионные или поликатионные пептиды. В описании заявленного изобретения термин "катионный пептид" относится к пептиду с положительно заряженными аминокислотными остатками. Предпочтительно катионный пептид имеет значение рКа (отрицательный десятичный логарифм константы диссоциации) равное 9,0 или выше. Как правило,по крайней мере четыре аминокислотных остатка катионного пептида могут быть положительно заряженными, например лизин или аргинин. Термин "положительно заряженные" относится к боковым цепочкам аминокислотных остатков, которые имеют чистый положительный заряд при физических условиях. Термин "катионный пептид", используемый в заявленном изобретении, также относится к поликатионным пептидам. Термин "поликатионный пептид", используемый в описании заявленного изобретения, относится к смоделированным и синтезированным пептидам, состоящих преимущественно из положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности, остатков лизина, аргинина и/или гистидина, наиболее предпочтительно остатков лизина и/или аргинина. Пептид состоит преимущественно из положительно заряженных аминокислотных остатков, причем как минимум примерно 20, 30, 40, 50, 60,70, 75, 80, 85, 90, 95 или около 100% аминокислотных остатков представляют собой положительно заряженные аминокислотные остатки, в частности остатки лизина и/или аргинина. Те из аминокислотных остатков, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки и/или отрицательно заряженные аминокислотные остатки и/или гидрофобные аминокислотные остатки. Более предпочтительно, те из аминокислотных остатков, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки, в частности серин и/или глицин. Термин "эндолизин", используемый в описании заявленного изобретения, относится к энзиму, который эффективен для гидролизации стенок бактериальных клеток. "Эндолизины" состоят как минимум из одного "энзим активного домена" (ЭАД) с как минимум одной из нижеследующих функций: эндопеп-4 024794(амидаза),N-ацетил-мурамидаза,N-ацетилглюкозаминидаза (ликозим) или трансгликолазы. В дополнение, эндолизины могут также содержать энзим неактивные участки, и прикрепляться к клеточной стенке бактерии-хозяина, т.н. ДСКС (домены связывания клеточных стенок). Эндолизин может содержать один, два или более ДСКС. Однако термин"эндолизин" в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения, также относится к энзимам, содержащим как минимум один ЭАД, но ни одного ДСКС. Как правило, домен связывания клеточных стенок обладает способностью связывать различные компоненты на поверхности бактерии. Предпочтительно домен связывания клеточных стенок представляет собой пептидогликансвязывающий домен, который связан с пептидогликаном бактерии. Термин "клеточная стенка", используемый в описании заявленного изобретения, относится ко всем компонентам, образующим внешнюю оболочку клетки грамотрицательной бактерии, обеспечивая, таким образом, ее целостность. В частности, термин "клеточная стенка" в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептидогликану, внешней мембране грамотрицательной бактерии с липополисахаридом, клеточной мембране бактерии, а также к дополнительным слоям на пептидогликане, как, например, капсулы, внешние протеиновые слои или слаймы. Термин "аутолизины", используемый в описании заявленного изобретения, относится к энзимам, а именно эндолизинам, но кодированным бактериями и включенным, например, в процессы деления клеток и метаболизма в клеточной стенке. Описание аутолизинов содержится в издании "Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases. Vollmer W., Joris B., Charlier P., Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar; 32(2):259-86". Термин "ЭАД", используемый в описании заявленного изобретения, относится к энзим-активному домену эндолизина. ЭАД отвечает за гидролиз бактериальных пептидогликанов, выполняя как минимум одну энзим функцию эндолизина. ЭАД может также состоять из более чем одного энзим-активного модуля. Термин "ЭАД" используется в описании заявленного изобретения синонимично с термином "каталитический домен". Термин "делеция", используемый в описании заявленного изобретения, относится к делеции 1, 2, 3,4, 5 или более аминокислотных остатков из соответствующей начальной последовательности. Термин "инсерция" или "аддиция", используемые в описании заявленного изобретения, относится к инсерции или аддиции 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислотных остатков из соответствующей начальной последовательности. Термин "субституция", используемый в описании заявленного изобретения, относится к субституции аминокислотного остатка, локализованного в определенном положении, на другой аминокислотный остаток. Заявленное изобретение относится к улучшенным антибактериальным агентам, используемым в отношении грамотрицательных бактерий, in casu модифицированным вариантам эндолизина, содержащим эндолизин, слитый с пептидом с липополисахаридом (ЛПС) или с фактором, разрушающим общую мембрану. ЛПС является основным компонентом внешней мембраны грамотрицательной бактерии. Он повышает отрицательный заряд клеточной мембраны и защищает мембрану от некоторых видов химического воздействия. В определенной степени, упомянутый ЛПС защищает мембрану грамотрицательной бактерии также и от эндолизинов внешней среды бактерии. Тем не менее, ЛПС можно разрушить пептидными цепочками, обладающими ЛПС-разрушающей способностью, как, например, положительно заряженные пептиды. Кроме того, упомянутые пептидные цепочки могут включаться в механизм транспортировки протеинов внешней мембраны, дестабилизацию структурных протеинов внешней мембраны и/или липид-зависимую дестабилизацию. Авторы заявленного изобретения с удивлением обнаружили,что пептидная цепочка с ЛПС-разрушающей активностью или в общем с разрушающей мембрану активностью, способствует переносу эндолизина, слитого с упомянутой пептидной цепочкой, через внешние мембраны грамотрицательных бактерий. После такого переноса эндолизина сквозь внешние мембраны грамотрицательных бактерий, клеточную стенку грамотрицательной бактерии можно легко повредить или разрушить эндолизином вследствие деградации пептидогликанного слоя, с последующим осмотическим лизисом, вызванным невозможностью противостоять внутреннему клеточному давлению бактерии. Таким образом, заявленное изобретение относится к слитым протеинам, состоящим из эндолизина с разрушающей клеточные стенки грамотрицательных бактерий активностью и пептидной цепочки с разрушающей мембрану активностью, причем упомянутая пептидная цепочка связана с энзимом в N- и/или С-концах. Упомянутые слитые протеины, в соответствии с заявленным изобретением, также называются модифицированными вариантами эндолизина или просто вариантами эндолизина или модифицированными эндолизинами. Эндолизин как часть модифицированного варианта эндолизина предпочтительно кодируется бактериофагами, характерными для грамотрицательных бактерий, таких как грамотрицательные бактерии бактериальных групп, семейств, родов или видов, включающих штаммы, патогенные для человека или животных, как, например, бактерии Enterobacteriaceae (Escherichia, в особенности, Е.coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, в особенности К. pneumoniae, Morganella,Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, в особенности Р. aeruginosa,-5 024794Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema и Borrelia), Leptospiraceae, Campylobacter,Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, в особенности A. baumanii. Помимо этого, эндолизин предпочтительно обладает разрушающей активностью на клеточные стенки грамотрицательных бактерий бактериальных групп, семейств, родов или видов, включающих штаммы strains, патогенные для человека или животных, как, например, бактерии Enterobacteriaceae (Escherichia, в особенности Е.coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, в особенности К. pneumoniae, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae(Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, в особенности A. baumanii. Предпочтительно эндолизиновую составляющую получают из фага или природного эндолизина,как приведено в нижеследующей таблице:PG - пептидогликан. Также предпочтительно эндолизиновую составляющую получают из эндолизинов Pseudomonas aeruginosa фага FKZ и EL, фага seudomonas putida ОВР, фага LUZ24, или из Т 4 лизосомы, gp61 мурамидазы и PSP3 эндолизина. Более предпочтительно, эндолизиновую составляющую выбирают из группы, состоящей изphiKZgp144 в соответствии с SEQ ID NO: 1, ELgp188 в соответствии с SEQ ID NO: 2, эндолизин Salmonella в соответствии с SEQ ID NO: 3, эндолизин Enterobacteria фаг Т 4 в соответствии с SEQ ID NO: 4,эндолизин Acinetobacter baumanii в соответствии с SEQ ID NO: 5, эндолизин E.coli фаг K1F в соответствии с SEQ ID NO: 6, OBPgpLYS в соответствии с SEQ ID NO: 7, PSP3 эндолизин Salmonella (PSP3gp10) в соответствии с SEQ ID NO: 8 и эндолизин E.coli фаг Р 2 (Р 2gp09) в соответствии с SEQ ID NO: 9. При другом предпочтительном практическом воплощении заявленного изобретения, эндолизины модифицированных вариантов эндолизинов согласно заявленному изобретению, включают модификации и/или изменения в аминокислотных последовательностях. Такие изменения и/или модификации могут содержать как мутации, так и делеции, инсерции и аддиции, их субституции или комбинации и/или химические и изменения аминокислотных остатков, например, биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, SH- или карбоксильных групп. Упомянутые модифицированные и/или измененные энолизины обладают литической активностью, характерной для эндолизина природного происхождения. Тем не менее, упомянутая активность может быть выше или ниже активности соответствующего природного эндолизина. Упомянутая активность может быть на уровне примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или примерно 200% и даже более от активности соответствующего природного эндолизина. Активность можно измерить посредством анализов, известных специалистам в данной области техники, а именно анализ лизиса в чашке Петри или жидколизисный анализ (Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533 (2007. В одном из аспектов заявленного изобретения пептид с мембраной и/или ЛПС-разрушающей активностью состоит из положительно заряженного пептида, который содержит один или более положительно заряженных аминокислотных остатков - лизина, аргинина и/или гистидина. Предпочтительно более 80%, более предпочтительно более 90%, наиболее предпочтительно 100% аминокислот в данном пептиде являются положительно заряженными аминокислотами. Как дополнительное преимущество,катионный пептид слит в N-конце и/или С-конце вариантов эндолизина, тем самым увеличивая катионность данных протеинов. В другом варианте воплощения заявленного изобретения, катионный пептид слит с эндолизином в участке длиной как минимум в 5, наиболее предпочтительно как минимум в 9 аминокислот. В предпочтительном варианте воплощения заявленного изобретения, вариант эндолизина состоит из эндолизина и пептида, слитых таким образом, что упомянутый пептид содержит от примерно 3 до примерно 50, наиболее предпочтительно от примерно 5 до примерно 20, в частности от примерно 5 до примерно 15 аминокислотных остатков, как минимум 20, 30, 40, 50, 60 или 70%, наиболее предпочтительно как минимум 80%, например, как минимум 90% упомянутых аминокислотных остатков представляют собой остатки аргинина или лизина. В другом предпочтительном варианте воплощения заявленного изобретения, вариант эндолизина состоит из эндолизина и пептида, слитых таким образом, что упомянутый пептид содержит от примерно 3 до примерно 50, наиболее предпочтительно от примерно 5 до примерно 20, в частности от примерно 5 до примерно 15 аминокислотных остатков, а упомянутые аминокислотные остатки представляют собой остатки аргинина или лизина. Предпочтительно пептидная цепочка модифицированного варианта эндолизина слита с N-концом и/или С-концом эндолизина. В наиболее предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, упомянутая пептидная цепочка слита только с N-концом эндолизина. Тем не менее, предпочтительными также являются случаи, при которых модифицированные варианты эндолизина имеют пептидную цепочку как на N-, так и С-концах. Упомянутые пептидные цепочки на N-конце и на С-конце могут быть как одной, так и разными пептидными цепочками. Пептидная цепочка модифицированного варианта эндолизина, в соответствии с заявленным изобретением, предпочтительно ковалентно связана с энзимом. В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, упомянутая пептидная цепочка состоит как минимум из 5, более предпочтительно как минимум из 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или как минимум 100 аминокислотных остатков. Наиболее предпочтительной является пептидная цепочка, состоящая из примерно от 5 до примерно 100 аминокислотных остатков, от примерно 5 до примерно 50 или от примерно 5 до примерно 30 аминокислотных остатков. Более предпочтительной является пептидная цепочка, состоящая из примерно от 6 до примерно 42 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 39 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 38 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 31 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 25 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 24 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 22 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 21 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 20 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 19 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 16 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 14 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 12 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 10 аминокислотных остатков или от примерно 6 до примерно 9 аминокислотных остатков. В одном из аспектов заявленного изобретения слитая пептидная цепочка является катионным и/или поликатионным пептидом, который состоит из одного или более положительно заряженных аминокислотных остатков лизина, аргинина и/или гистидина, в частности, лизина и/или аргинина. Предпочтительно более 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% аминокислотных остатков в упомянутой пептидной цепочке представляют собой положительно заряженные аминокислотные остатки, в частности остатки лизина, аргинина и/или гистидина, в частности, лизина и/или аргинина. Наиболее предпочтительными являются пептидные цепочки, состоящие из примерно 100% положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков аргинина и/или лизина, причем предпочтительно примерно от 60% до примерно 70% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки лизина и примерно от 30% до примерно 40% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки аргинина. Более предпочтительной является пептидная цепочка, состоящая из примерно 100% положительно заряженных аминокислотных остатков, в част-8 024794 ности остатков аргинина и/или лизина, причем предпочтительно от примерно 64% до примерно 68% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки лизина и примерно от 32% до примерно 36% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки аргинина. Также предпочтительными являются пептидные цепочки, состоящие либо только из аргинина, либо только лизина. Наиболее предпочтительными являются катионные и/или поликатионные пептидные цепочки, состоящие как минимум из одного мотива в соответствии с SEQ ID NO: 10 (KRKKRK). В частности, катионные пептидные цепочки, состоящие как минимум из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 мотивов в соответствии с SEQ ID NO: 10 (KRKKRK) являются предпочтительными. Более предпочтительны - катионные пептидные цепочки, состоящие как минимум из KRK мотива (лизин-аргининлизин), предпочтительно как минимум из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или 33 KRK мотивов. В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, катионная пептидная цепочка состоит, помимо положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина и/или аргинина, из нейтрально заряженных аминокислотных остатков, в частности из остатков глицина и/или серина. Предпочтительными являются катионные пептидные цепочки,состоящие из примерно от 70% до примерно 100%, или от примерно 80% до примерно 95%, или от примерно 85% до примерно 90% положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина, аргинина и/или гистидина, более предпочтительно, остатков лизина и/или аргинина и примерно от 0% до примерно 30%, или примерно от 5% до примерно 20%, или примерно от 10% до примерно 20% нейтрально заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков глицина и/или серина. Предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие из примерно от 4% до примерно 8% остатков серина, из примерно от 33% до примерно 36% остатков аргинина и от примерно 56% до примерно 63% остатков лизина. Наиболее предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие как из минимум одного мотива в соответствии с SEQ ID NO: 32 (KRXKR), причем X является любой другой аминокислотой, кроме лизина, аргинина и гистидина. Наиболее предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие как минимум из одного мотива в соответствии с SEQ ID NO: 33 (KRSKR). Более предпочтительны катионные цепочки, состоящие как минимум из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19 или примерно 20 мотивов в соответствии с SEQ ID NO: 32 (KRXKR) или SEQ IDNO: 33 (KRSKR). Также предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие из примерно от 9 до примерно 16% остатков глицина, от примерно 4 до примерно 11% остатков серина, от примерно 26 до примерно 32% остатков аргинина и примерно от 47 до примерно 55% остатков лизина. Наиболее предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие как минимум из одного мотива в соответствии с SEQ ID NO: 34 (KRGSG). Более предпочтительными являются катионные цепочки, состоящие как минимум из примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или примерно 20 мотивов в соответствии с SEQ ID NO: 34 (KRGSG). В другом варианте предпочтительного воплощения заявленного изобретения, катионная пептидная цепочка состоит, помимо положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина и/или аргинина, из гидрофобных аминокислотных остатков, в частности остатков валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и глицина, более предпочтительно из остатков аланина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина и/или триптофана. Предпочтительными являются катионные пептидные цепочки, состоящие из примерно от 70 до примерно 100%, или примерно от 80 до примерно 95%, или от примерно 85 до примерно 90% положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина и/или аргинина и от примерно 0 до примерно 30%, или от примерно 5 до примерно 20%, или от примерно 10 до примерно 20% гидрофобных аминокислотных остатков, остатков валина, изолейцина, лейцина,метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и глицина, более предпочтительно из остатков аланина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина и/или триптофана. Наиболее предпочтительными являются пептидные цепочки, выбираемые из группы, состоящей из следующих последовательностей: Предпочтительно пептидная цепочка не является меткой, как, например, His-метка, Strep-метка,Avi-метка, Мус-метка, Gst-метка, JS-метка, цистеин-метка, FLAG-метка или прочие метки, известные из уровня техники, и не тиоредоксин- или мальтоза-связывающими протеинами (МСП-МВР). Однако, пептидная цепочка и/или модифицированный вариант эндолизина, в соответствии с заявленным изобретением, могут включать как дополнение такие метки. В предпочтительном варианте воплощения заявленного изобретения пептидная цепочка выполняет функцию переноса модифицированного варианта эндолизина через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, но обладает нулевой или минимальной активностью в случае отсутствия слития с энзимом. Функция переноса модифицированного варианта эндолизина через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий осуществляется благодаря потенциалу внешней мембраны или ЛПСразрушающей активности упомянутой пептидной цепочки. Наиболее предпочтительными являются модифицированные варианты эндолизина, выбираемые из группы, состоящей из следующих модифицированных вариантов эндолизина: Модифицированные варианты эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, и в частности, наиболее предпочтительные модифицированные варианты эндолизина в соответствии с SEQ ID NO: 35 до 49, 53, 57, 61 до 64 и от 66 до 78, могут дополнительно включать метку, например, для очищения. Предпочтительной является His6-метка, предпочтительно в С-конце модифицированного варианта эндолизина. Упомянутую метку можно связать с модифицированным вариантом эндолизина при помощи дополнительных аминокислотных остатков, например, вследствие клонирования. Предпочтительно упомянутую метку можно связать с модифицированным вариантом эндолизина при помощи как минимум 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте воплощения заявленного изобретения, модифицированный вариант эндолизина включает His6-метку, в своем С-конце, связанную с модифицированным вариантом эндолизина при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Lys-Gly) или лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu). В частности, предпочтительными являются модифицированные варианты эндолизина в том виде, в котором они описаны в нижеследующих примерах. Модифицированные варианты эндолизина в соответствии с SEQ ID NO: 35 до 42, 53, 57 и 61, приведенные в примерах, включают His6-метку в С-конце, связанную с соответствующим вариантом эндолизина при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Lys-Gly). Модифицированные варианты эндолизина в соответствии с SEQ ID NO: 43 до 49 и 75, приведенные в примерах, включают His6-метку в С-конце, связанную с соответствующим вариантом эндолизина при помощи дополнительных аминокислотных остатков лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu). Слитые протеины образуются путем связывания как минимум двух нуклеиновых последовательностей с использованием стандартных методик клонирования, как описано Sambrook, J. et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual. Такой протеин можно получить, например, методом рекомбинантных ДНК. Такие слитые протеины в соответствии с заявленным изобретением можно получить слитием/связыванием нуклеиновых кислот с эндолизином и соответствующей пептидной цепочкой. Поскольку некоторые слитые протеины могут либо проявлять токсическое действие после контакта с бактериями, либо не быть гомогенными вследствие протеиновой деградации, решение может заключаться в экспрессии данных слитых протеинов в слитии или связке с другими дополнительными протеинами. Примерами таких дополнительных протеинов может служить Тиоредоксин, который способствует экспрессии токсичных антимикробных пептидов в клетках E.coli (TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli. Zhou L., Zhao Z., Li B., Cai Y., ZhangS. Protein Expr Purif. 2009 Apr; 64(2):225-230). Для усиления антимикробных характеристик слитых протеинов необходимым может представиться удаление дополнительного слитого протеина путем протеолитического расщепления. С данной целью возможно использование имеющихся в продаже наборов, как, например, экспрессионная система рЕТ 32(Novagen), для модификации, например, N-конца слитого протеина, в зависимости от используемой протеазы, например из MGS до AMGS (SEQ ID NO: 31), если бы остаток аланина явился бы результатом введенного сайта расщепления энтерокиназы. В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, пептидные цепочки модифицированных вариантов эндолизина в соответствии с заявленным изобретением,содержат модификации и/или изменения в аминокислотных последовательностях. Такие изменения и/или модификации могут включать мутации, как, например, удаления, вставления или добавления, их замены/субституции или комбинации, и/или химические изменения аминокислотных остатков, например, биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, SH- или карбоксильных групп. В дополнение к вышеперечисленному, заявленное изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением. Заявленное изобретение также относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с заявленным изобретением. Упомянутый вектор может способствовать конститутивной или индуцируемой экспрессии упомянутого модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением. Заявленное изобретение также относится к способу получения упомянутых модифицированных вариантов эндолизина из микроорганизма, такого, как генетически модифицированная стабильная (устойчивая) клетка-хозяин, которая кодирует упомянутый модифицированный вариант эндолизина. Данная клетка-хозяин может представлять собой микроорганизм, как, например, бактерия, или дрожжевая клетка, или грибок, или животная клетка, как, например, клетка млекопитающего, в частности клетка человеческого организма. В одном из вариантов воплощения заявленного изобретения, дрожжевая клетка представляет собой клетку Pichia pastoris. Хозяина можно выбирать как на основе только биотехнологических параметров, как то выход, растворимость, стоимость и пр., а также целесообразности по медицинским показателям, например, исходя из непатологичности бактерии или дрожжевой клетки, клетки человеческого организма. В другом аспекте заявленное изобретение относится к способу генетического трансформирования подходящей клетки-хозяина с целью получения методом экспрессии модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, при котором клетку-хозяина подвергают генетической модификации путем введения генетического материала, кодирующего упомянутые модифицированные варианты эндолизина в клетке-хозяине и получения из трансляции и экспрессии при помощи методов генетического инжиниринга, известных специалистам в данной области техники. В другом аспекте заявленное изобретение относится к композиции, предпочтительно фармацевтической композиции, содержащей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или клетку-хозяина, трансформированную с использованием молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением. В предпочтительном варианте воплощения заявленного изобретения, упомянутая композиция содержит дополнительные агенты, пермеабилизирующие внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, такие как хелаты металлов, например этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), гидроксиметиламинометан (TRIS), лактовая кислота, лактоферрин, полимиксин, лимонная кислота и/или другие вещества, согласно описанию автора Vaara (Agents that increase the permeability of the outer membrane. VaaraM. Microbiol Rev. 1992 Sep; 56(3):395-441). Также предпочтительными являются композиции, содержащие комбинации вышеупомянутых пермеабилизирующих агентов. Наиболее предпочтительной является композиция, содержащая примерно от 10 мкМ до примерно 100 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 50 мкМ до примерно 10 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до примерно 10 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до примерно 2 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до 1 мМ ЭДТК. Тем не менее, предпочтительными являются также композиции, содержащие от примерно 10 мкМ до примерно 0,5 мМ ЭДТК. Предпочтительной также является композиция, содержащая от примерно 0,5 мМ до примерно 2 мМ ЭДТК, более предпочтительно примерно 1 мМ ЭДТК и дополнительно от примерно 10 до примерно 100 мМ TRIS. Заявленное изобретение также относится к модифицированному варианту эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, для применения в качестве медикаментозного средства. В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к применению модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, для применения в производстве медикаментозных средств для лечения и/или профилактики дис- 13024794 функций, заболеваний или симптоматики, ассоциируемых с заражением патогенными грамотрицательными бактериями. В частности, лечение и/или профилактика тех дисфункций, заболеваний или симптоматики, которые могут вызываться грамотрицательными бактериями бактериальных групп, семейств,родов или видов, включающих strains, патогенных для человека или животных, как, например, Enterobacteriaceae (Escherichia, в особенности Е.coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter,Hafnia, Klebsiella, в особенности K. pneumoniae, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, в особенности P. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella,Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema и Borrelia), Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, в особенности A. baumanii. Предпочтительно упомянутые дисфункции, заболевания или симптоматика могут вызываться Pseudomonas, в особенности Pseudomonas aeruginosa и/или Pseudomonas putida, Burkholderia, в особенностиBurkholderia pseudomallei и/или Burkholderia solanacearum, сальмонелла, в особенности Salmonella typhimurium и/или Salmonella Enteritidis, Acinetobacter, в особенности Acinetobacter baumannii, Escherichia coli и/или Klebsiella, в особенности Klebsiella pneumoniae. Заявленное изобретение также относится к медикаментозному средству, содержащему модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением. В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к способу лечения дисфункций, заболеваний или симптоматики у людей или животных при наличии достаточных показаний, причем данный метод включает в себя введение или прием эффективной дозы модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, и/или эффективной дозы хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением или композицией в соответствии с заявленным изобретением. Предпочтительно упомянутый способ лечения представляет собой лечение и/или профилактику инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, в частности вышеупомянутыми грамотрицательными бактериями. В частности, упомянутый способ лечения представляет собой лечение и/или профилактику инфекций кожи, мягких тканей, дыхательной системы, легких, пищеварительного тракта,глаз, ушей, зубов, носоглотки, ротовой полости, костной и мочеполовой систем, раневых поверхностей при бактериемии и/или эндокардите, вызванных грамотрицательными бактериями, в частности вышеупомянутыми грамотрицательными бактериями. Дозировка и путь введения, используемые в способе лечения (или профилактики) в соответствии с заявленным изобретением, зависят от специфики заболевания/места локализации инфекции. Путь введения может, например, быть пероральный, локальный, носоглоточный, парентеральный, ингаляционный,внутривенный, внутримышечный, интратекальный (субарахноидальный), интраспинальный, эндобронхиальный, интрапульмональный, внутрикостный, интракардиальный, внутрисуставной, ректальный, вагинальный или любой другой путь введения. Для введения модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или эффективной дозы хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную цепочку, кодирующую модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением или композицию в соответствии с заявленным изобретением, в очаги инфекции (или в места, где присутствует потенциальная вероятность заражения), применяют такую форму упаковки, которая защищает активные компоненты от воздействий внешних факторов, таких как протеазы, окисление, иммунный ответ и т.п., вплоть до достижения ими очага инфекции. Следовательно, лекарственная форма может представлять собой капсулу, драже, таблетку, порошок, суппозиторий, эмульсию,гель, лосьон, крем, мазь, инъекционный раствор, сироп, спрей, состав для ингаляций или любую другую приемлемую по медицинским показаниям упаковку. Предпочтительно фармацевтическая композиция может содержать подобранные носители, стабилизаторы, красители, буферы или другие подходящие реагенты. Например, для местного нанесения лекарственная форма может представлять собой лосьон,крем, гель, мазь или пластырь, для назофарингального применения - физраствор для интраназального нанесения при помощи спрея. Для перорального применения с целью лечения и/или профилактики очага инфекции, к примеру, во внутренних органах, возникает необходимость в дополнительной защите модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением от агрессивного воздействия среды желудочно-кишечного тракта вплоть до проникновения в очаг инфекции. Таким образом,при пероральном введении в очаг инфекции во внутренних органах требуется использование бактерии как носителя, который преодолеет начальные стадии пищеварения в желудке и только после этого секрецируется на модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением. В одном из узконаправленных воплощений заявленного изобретения использование модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяина, трансформиро- 14024794 ванного с использованием вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, для применения в производстве медикаментозного средства для лечения и/или профилактики дисфункции, заболевания или симптоматики, вызванных Pseudomonas, в особенности Pseudomonasaeruginosa в особенности, поражения внутренних органов, в частности у грудных младенцев, инфекционные менингиты, например геморрагический менингит, инфекции среднего уха, кожного покрова (Ecthyma gangraenosum), в частности ожоги, мочеполового тракта, риниты, бактериальные пневмонии, в частности, при которых пациент страдает от кистозного фиброза (муковисцидоза) или гематологических осложнений, например, при лейкемии, при развитии нейтропении в период проведения иммунодепрессивной терапии, септицемии, в особенности вследствие длительной внутривенной или мочевой катетеризации, полостных хирургических операций и тяжелых ожоговых поражений, эндокардита, в частности,при котором пациент находится на внутривенном катетерном введении лекарственных препаратов, или пациент с осложнениями после открытого хирургического вмешательства на сердце, при тяжелых инфекциях глаз, в частности, после использования зараженных офтальмологических растворов или тяжелых ожоговых поражений лица, остеохондроза, в частности вследствие тяжелых травм или колотых ран с входным отверстием сквозь грязную одежду. В другом специализированном варианте практического воплощения заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Burkholderia pseudomallei, в особенности болезнь Уитмора, хроническая пневмония, септицемия, в частности, при которой у пациента наблюдается травматическое поражение кожного покрова. В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Salmonella thyphimurium и Salmonella enteritidis, в особенности острые гастроэнтериты и локальные гнойные процессы, в частности остеомиелит, эндокардит,холецистит и особенно менингит, вызванный бактериями Salmonella thyphimurium, при котором возраст пациента менее 2 лет. В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Acinetobacter baumannii, в частности, бронхит, пневмония, раневые инфекции и септицемия, в особенности вследствие внутривенной катетеризации. В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Escherichia coli, в особенности экстраинтестинальные инфекции, в частности аппендицит, гнойный холецистит, периотонит, гнойный менингит и инфекции мочеполового тракта, интраинтестинальные инфекции, вызванные бактериями Е.coli, в частности эпидемический энтерит, а также инфекционные заболевания, подобные дизентерии, септицемия, энтеротоксемия, мастит и дизентерия. В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Klebsiella pneumoniae, в частности пневмония, бактериемия, менингит и инфекции мочеполового тракта. Предпочтительно модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением используется как компонент терапии или профилактики, в случае, если инфекция вызвана мультирезистентными бактериальными штаммами, в частности, штаммами, устойчивыми к одному или более из следующей группы антибиотиков: стрептомицин, тетрациклин, цефалотин, гентамицин, цефатоксин,цефалоспорин, цефтазидим или имипенем. Кроме этого, модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением применяют как компонент терапии путем введения в сочетании с традиционными антибактериальными препаратами, такими как антибиотики, лантибиотики, бактериоцины или эндолизины и т.п. Заявленное изобретение также относится к фармацевтическому препарату, содержащему одно или более отделений, причем как минимум одно отделение содержит один или более модифицированных вариантов эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или один или более хозяинов,трансформированных с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью,кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, или композицию в соответствии с заявленным изобретением. В другом аспекте практической реализации заявленное изобретение относится к процессу приготовления фармацевтической композиции, причем данный процесс включает добавление путем смешивания одной или более модифицированных вариантов эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или один или более хозяев, трансформированных с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, с фармацевтически приемлемым растворителем, эксципиентом или носителем. В более расширенном аспекте композиция в соответствии с заявленным изобретением представляет собой косметическую композицию. Некоторые виды бактерий могут вызывать раздражение на открытых участках тела пациента, например на кожном покрове. Для предотвращения появления таких раздражений кожного покрова или вероятного патогенного влияния упомянутых бактериальных организмов,- 15024794 представляется возможным применение специальных косметических составов, которые содержат достаточное количество модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением для разрушения уже размножившихся или потенциально опасных очагов инфекции, вызванных грамотрицательными бактериями. В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к применению модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением в качестве средства диагностики в здравоохранении, пищевой промышленности и природоохранной деятельности, в частности в качестве средства диагностики для диагностирования бактериальных инфекций, вызванных в частности грамотрицательными бактериями. Модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением можно применять в качестве инструмента направленного разрушения патогенных бактерий, в особенности грамотрицательных патогенных бактерий. Разрушению бактериальных стенок модифицированным вариантом эндолизина в соответствии с заявленным изобретением можно способствовать путем добавления детергентов, как, например, Triton X-100 или других добавок, которые ослабляют клеточную защиту бактерий,например полимиксин В. Специально направленное разрушение клеток необходимо как начальный этап последующего направленного уничтожения бактерий с использованием НК-методов, как, например, полимеразная цепная реакция (ПЦР), гибридизация нуклеиновой кислоты или амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот, иммунобиологических методов, например, IMS, иммунофлюоресценции или анализ ELISA, или методов, основанных на распознавании клеточного материала бактерий, как то энзим-анализы с использованием протеинов, чувствительных к определенным группам или видам бактерий (например, -галактоидаза для энтеробактерий, коагулаза для коагулаз-позитивных штаммов). В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к использованию модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, для устранения, уменьшения и/или профилактики заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на пищеперерабатывающих предприятиях, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами,как, например, полки и места хранения пищевых продуктов, а также в любой другой области, где присутствует вероятность заражения пищевых продуктов, медицинского инструментария или прочих поверхностей в клиниках и хирургических блоках патогенными, потенциально болезнетворными и пр. нежелательными бактериями. В частности, модифицированные варианты эндолизина в соответствии с заявленным изобретением можно применять в профилактических целях в качестве обеззараживающего средства. Такое обеззараживающее средство можно использовать до или после хирургических вмешательств, или, например, во время гемодиализа. Кроме того, модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением можно применять как компонент терапии у недоношенных детей, пациентов с ослабленной иммунной реакцией, или пациентов с протезными устройствами. Данную терапию можно проводить как профилактику, так и в острый период. В этом же контексте, внутрибольничные инфекции, в особенности вызванные резистентными к антибиотикам штаммами, как, например, бактериями Pseudomonasaeruginosa (FQRP), Acinetobacter и энтеробактерии, как, например E.coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter,Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia и Yersinia можно лечить - как профилактически, так и в стадии острого обострения - с использованием модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением. В связи с этим, модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением можно использовать в качестве дезинфицирующего средства, а также в сочетании с другими ингредиентами в составе дезинфицирующего раствора, как, например, детергенты, поверхностно-активные вещества, растворители, антибиотики, лантибиотики или бактериоцины. Применение модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением в качестве дезинфицирующего средства, например, в клиниках, стоматологических и ветеринарных кабинетах, кухне или ванной комнате сопровождается приготовлением состава в виде жидкости, порошка,геля, или ингредиента дезинфицирующих салфеток или простыней. В данный состав можно дополнительно включить подходящий носитель, добавки, растворители и/или эксципиенты для различных способов применения, а также агенты, которые способствуют повышению антимикробной активности, такие, как, например, ЭДТК или агенты, повышающие антимикробную активность слитых протеинов. Слитые протеины можно использовать с традиционными дезинфицирующими агентами, такими как, например, этиловые спирты, альдегиды, окислители, фенолы, четвертичные аммониевые соединения или УФ-излучение. Для дезинфекции, например, поверхностей, объектов и/или приборов, модифицированный вариант эндолизина можно наносить на указанные поверхности, объекты и/или приборы. Нанесение можно осуществлять при помощи мягкой ткани, смоченной в дезинфицирующем составе, нанесенном при помощи спрея или окунания. Слитые протеины можно использовать в различных концентрациях, в зависимости от соответствующего способа нанесения и времени воздействия для достижения эффекта полного обеззараживания. Далее по тексту описания заявленного изобретения следует расширенное описание применимости заявленного изобретения; тем не менее, следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, при том, что таковые служат исключительно цели продемонстрировать примеры практического воплощения заявленного изобретения, не носят ограничительный характер, поскольку различные изменения и модификации, не выходящие за рамки цели и задач изобретения, понятны специалистам в данной области техники. Необходимо понимать, что как описание, так и примеры носят иллюстративный характер и не являются ограничительными касательно сути заявленного изобретения. Если не указано иначе, в нижеследующих примерах использованы стандартные методики, принятые в молекулярной биологии, как, например, описано в издании Sambrock et al., 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка модифицированных вариантов эндолизинаphiKZgp144, как указано в SEQ ID NO: 1 и ELgp188 и SEQ ID NO: 2, представляют собой модифицированные эндолизины, получаемые из фагов Pseudomonas aeruginosa KZ и EL с пептидогликансвязью на N-конце и каталитическим доменом на С-конце (Briers et al., 2007). Для амплификации открытой рамки считывания (ОРС, ORF) применили phiKZgp144 ELgp188 ПЦР стандартный 5' праймер (для phiKZgp144: 5' ATGAAAGTATTACGCAAA 3' (SEQ ID NO: 83); дляELgp188: ATACGAAAT AACGTGACGA (SEQ ID NO: 82). Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей phiKZgp144 или ELgp188 с фрагментом гена, кодирующего девять положительно заряженных остатков (Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys - SEQ ID NO: 11), применили хвост ПЦР с удлиненным 5' праймером (для phiKZgp144: 5' ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAGTATTACGCAAAG 3' (SEQ ID NO 79); для ELgp188: 5' ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAA CGCAAAAACTTCCGGACGAAG 3' (SEQ ID NO: 80 и стандартные 3' праймеры в соответствии с SEQ ID NO: 81 и 82. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионном векторе рЕХР 5 СТ/ТОРО (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Задействовали аргининовые триплеты, помимо лизиновых триплетов, с целью избежать tPHK деплеции и уменьшить риск сдвигов рамки (единственными двумя возможными триплетами для лизина являютсяAAA и AAG, с последующими длинными А-цепями). Инсерция дополнительных катионных кассет в рестрикционный сайт BamHI удлиняет хвост дополнительными катионными остатками. Такая инсерция создает аргининовый и сериновый триплет в каждом сайте соединения (фиг. 1). До четырех поликатионных пептидных цепочек были слиты с phiKZgp144 и ELgp188, маркированными (POLY)n-gp144 или(POLY)n-gp188 (n=1, 2, 3, 4), содержащими соответственно 9, 19, 29 и 39 положительно заряженных аминокислотных остатков в N-конце. Соответственно, следующие конструкции экспрессировали в клетках Е.coli BL21 (DE3) pLysS (экспоненциально растущие клетки при 37 С, индукция с использованием 1 мМ Модифицированные варианты эндолизина POLY-gp144 (SEQ ID NO: 35), (POLY)2-gp144 (SEQ IDNO: 36), POLY-gp188 (SEQ ID NO: 39) и (POLY)2-gp188 (SEQ ID NO: 40) использовали для последующих исследований. Упомянутые протеины подвергли очистке с использованием Ni2+ аффинной хроматографии с использованием С-конечной 6xHis-метки (Akta жидкостная экспресс-хроматография белков с использованием 1 мл His-трапа Ni-NTA колонки). Общий выход на 1 л экспрессионной культуры Е.coli определили при помощи спектрометрического измерения концентрации протеина и общего объема очищенного раствора. Очистку производных gp188 провели при более жестких условиях (65 мМ имидазола) в сравнении с производными gp144 (50 мМ имидазола) для обеспечения высокой степени очистки. Данные по общему выходу на 1 л экспрессионной культуры E.coli приведены в табл. 1. Таблица 1 Выход рекомбинантной очистки производных эндолизина на 1 л экспрессионной культуры Е.coli Очищенные маточные растворы имели чистоту 90%. Масс-спектрометрический анализ очищенных растворов POLY- производных показал наличие следов Е.coli 50S рибосомного субъединичного протеина L2 и 16S rRNA уридин-516 псевдоуридилат синтазы. Все производные phiKZgp144 показали мультимерную формацию, которую можно конвертировать в мономеры путем присоединения меркаптоэтанола, что свидетельствует о том, что интерсульфидные связи вызывают мультимеризацию. Пример 2. Антибактериальная активность модифицированных вариантов phiKZgp144 и ELgp188. Экспоненциальные клетки (106/мл) P. aeruginosa PAO1p (Pirnay J.P. et al. (2003), J. Clin Microbiol.,41(3): 1192-1202) разбавили 100(конечная плотность эквивалентна 106/мл) и инкубировали при комнатной температуре вместе с 10 мкг недиализированного протеина для каждого образца (немодифицированные варианты эндолизинов phiKZgp144 (SEQ ID NO: 1) и ELpg188 (SEQ ID NO: 2) и модифицированные варианты эндолизинов POLY-gp144 (SEQ ID NO: 35), (POLY)2-gp144 (SEQ ID NO: 36), POLY-gp188(SEQ ID NO: 39) и (POLY)2-gp188 (SEQ ID NO: 40) при конечной концентрации 100 мкг/мл в буфере (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7.4; 0.5 М NaCl; 0.5 М имидазола). По истечении 1 ч клеточные суспензии растворили в ФСБ буфере (10 е-5, 10 е-4 и 10 е-3) и поместили в чашку Петри (стандартная среда ЛурияБертани, инкубация в течение ночи при 37 С). Дополнительно, поместили в чашку Петри отрицательный контроль с клетками в ФСБ-буфере. Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации. На основе подсчета числа клеток высчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию(%) (=100-(Ni/No)100, где N0 = число необработанных клеток, a Ni = число обработанных клеток) и в логарифмических юнитах (=log10N0/Ni) (табл. 2). Все образцы реплицировали в шесть раз. Средние/стандартные девиации приведены. Статистический анализ провели с использованием обычного tтеста. Немодифицированные эндолизины phiKZgp144 и ELgp188 не уменьшают значительно число клеток по сравнению с отрицательным контролем. Данное наблюдение иллюстрирует эффективность функции внешней мембраны как барьера для эндолизина, разрушающего клеточные стенки грамотрицательных бактерий. В отличие от приведенных в табл. 2, инкубация с модифицированными эндолизинами POLYgp144, (POLY)2-gp144, POLY-gp188 и (POLY)2-gp188 вызывает значительное снижение ( = 0.05) числа бактериальных клеток (99.850.09% для POLY-gp144 и 98.00.2% для POLY-gp188). Увеличение длины поликатионной пептидной цепочки в свою очередь способствует увеличению антибактериальной активности, в особенности в случае phiKZgp144 (достигается уменьшение до 99,980.02% или 3,70.3 log units в течение 1 ч для (POLY)2-gp144). Кроме того, испытания показали, что модифицированные эндолизиныphiKZgp144 обладают более высокой антибактериальной активностью по сравнению с модифицированными эндолизинами ELgp188. Таблица 2 Антибактериальный эффект эндолизинов - немодифицированных и модифицированных phiKZgp144 и ELgp188 вариантов Таким образом, пример демонстрирует, что аддиция короткопептидной цепочки из девяти катионных остатков в N-конце к phiKZgp144 (SEQ ID NO: 1) уже само по себе является достаточным для того,чтобы уничтожить почти 99,9% клеток в течение 1 ч. Поли-L-лизин также обладает неотъемлемой антибактериальной активностью, хотя это свойство до сих пор приписывалось полимерам как минимум с 20 остатками (Vaara and Vaara, 1983a, 1983b). Тем не менее, совместное действие поликатионной пептидной цепочки и эндолизина уничтожает клетки. В продолжение опыта, модифицированный эндолизин POLY-gp144 подвергли диализу до 50 мМKH2PO4/K2HPO4 pH 7 и использовали вместо раствора недиализированного протеина, как описано выше. При этом уровень инактивации дополнительно вырос с 2,90,3 лог юнитов до 3,90,2 лог юнитов. Пример 3. Экспрессия модифицированных вариантов phiKZgp144 и ELgp188 в Pichia pastoris в качестве хозяина для нетоксичного рекомбинантного воспроизведения. Открытую рамку считывания, кодирующую POLY-gp144 (SEQ ID NO: 35), клонировали в pPICZA шаттл-векторе (Invitrogen), который затем интегрировали в геном P. pastoris путем гомологенного рекомбинирования (в соответствии с указаниями компании-производителя; клетки P. pastoris X33, Invitrogen). Рекомбинирование гена индуцировали при помощи метанола (1%) в BMMY-среде, супернатат проанализировали на предмет наличия энзимной активности по истечении 1, 3 и 4 дней. Затем, супернатат в объеме 30 мкл экспрессионной культуры P. Pastoris добавили к 270 мкл хлороформ-пермеабилизированных клеток P. aeruginosa PAO1p (Pirnay J.P. et al. (2003), J. Clin Microbiol., 41(3):1192-1202) после 1, 3 и 4 дней(буферные условия: KH2PO4/K2HPO4 I = 120 мМ pH 6,2). Затем, измерили при помощи спектрофотометрии оптическую плотность (фиг. 2). Снижение показателей оптической плотности свидетельствует о секреции муралитического энзима Р. pastoris. В качестве отрицательного контроля добавили P. pastoris X33 без экспрессионного плазмида. Таким образом, лизис субстрата после добавления образца супернатата является показателем успешного рекомбинантного воспроизводства и секреции POLY-gp144 (SEQ IDNO: 35) клетками P. pastoris. По истечении 1 дня можно наблюдать ограниченную энзиматическую активность. Максимальную активность наблюдали по истечении 3 дней, поскольку на четвертый день отсутствовали признаки сколь-нибудь значительного повышения активности супернататов. Также не наблюдалось токсического эффекта на плотность клеток P. pastoris. Во время экспрессии P. pastoris, -секреционный сигнал вектора вызывает секрецию рекомбинантного протеина в окружающую среду, что позволяет облегчить очистку, поскольку секрецировалось только ограниченное число других протеинов. Сайт рестрикции BamHI в 5' конце открытой рамки считывания позволяет добавить больше кассет, кодирующих дополнительные поликатионные пептидные цепочки. Пример 4. Модифицированные варианты эндолизина phiKZgp144 с различными поликатионными пептидными цепочками. Для испытания и сравнения потенциала поликатионных пептидов phiKZgp144 синтезировали варианты других эндолизинов, кодирующих гены, с различными поликатионными пептидами в N-конце протеина. Варианты с пептидными цепочками различаются по длине, составу и инсерции связывающих последовательностей. С одной стороны, получили поликатионные пептидные цепочки с мультиплицированными N-концами KRK мотива. С другой стороны, получили поликатионные пептидные цепочки, состоящие только из аргинина (R) или лизина (K). Более того, для улучшения трансляции длинных поликатионных пептидных цепочек, получили поликатионные пептидные цепочки, содержащие связывающую последовательность. В экспрессионном векторе pET32b (Novagen, Darmstadt, Germany) клонировали различные продукты для уменьшения потенциальной токсичности поликатионного пептида в отношении хозяина Е.coli. Кодированный в векторе слитый протеин (тиоредоксин) маскирует поликатионный пептид и может быть устранен во время процесса очистки. Аналогичным образом, следующие модифицированные варианты эндолизина экспрессировали в клетках Е.coli BL21 (DE3) при 37 С до достижения показателя оптической плотности OD600HM=0,6. Затем протеиновую экспрессию индуцировали с использованием 1 мМ IPTG (конечная концентрация) и провели экспрессию в течение 4 ч. Затем вырастили клетки Е.coli центрифугированием в течение 20 мин при 6000, провели разрушение (расщепление) клеток и протеиновую очистку в соответствии с рекомендациями комплекта очистки S-метки (Novagen, Darmstadt, Germany): Все протеины очистили с использованием S-Tag rEK Purification Kit (Novagen, Darmstadt, Germany). При использовании вектора pET32b экспрессированные протеины были нетоксичны в отношении хозяина, что привело к более высокому выходу получаемого протеина. Очищенные маточные растворы показали высокий уровень очистки. Экспоненциальные клетки (106/мл) P. aeruginosa PAO1p (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital,Brussels; Pirnay JP et al. (2003), J. Clin Microbiol., 41 (3):1192-1202) разбавили 100(конечная концентрация эквивалентна 106/мл), инкубировали при комнатной температуре вместе с 10 мкг недиализированного протеина для каждого образца (немодифицированные варианты эндолизинов при конечной концентрации в 100 мкг/мл в буфере (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7.4; 0.5 М NaCl; 0,5 М имидазола. По истечении 1 ч клеточные суспензии разбавили 1:100 и поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Дополнительно, поместили в чашку Петри отрицательный контроль с использованием буфера (20 мМNaH2PO4-NaOH pH 7.4; 0.5 М NaCl; 0,5 М имидазола). Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37 С. На основе подсчета числа клеток высчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию (%) (=100-(Ni/No)100, где N0 = число необработанных клеток, a Ni = число обработанных клеток) (табл. 3). Все образцы реплицировали как минимум в четыре раза. Таблица 3 Антибактериальный эффект эндолизинов - немодифицированных и модифицированных phiKZgp144 и ELgp188 вариантов Немодифицированные phiKZgp144 не уменьшают значительно число клеток по сравнению с отрицательным контролем. Более того, модифицированные варианты phiKZgp144 с поликатионнопептидными N-конечными мультипликациями KRK мотива значительно увеличивают антибактериальную активность. Тем не менее, варианты с гомомерной пептидной цепочкой лизина или аргинина также показали значительное снижение числа клеток по сравнению с немодифицированными phiKZgp144. К тому же вариант с поликатионной пептидной цепочкой с 38 аминокислотными остатками и связывающей последовательностью также показал значительное повышение антибактериального эффекта. Пример 5. Модифицированные варианты эндолизина из Salmonella typhimurium фага PSP3.PSP3gp10 в соответствии с SEQ ID NO: 8 представляет собой глобулярный эндолизин со 165 аминокислотными остатками, полученный из Salmonella typhimurium фага PSP3 с каталитическим лямбдамурамидазным доменом. Как показал анализ BLASTp и Pfam, эндолизин PSP3gp10 содержит в себе каталитический домен в пределах от примерно 34 аминокислотного остатка до примерно 152 аминокислотного остатка. Очищенный геном ДНК фага PSP3 использовали в качестве образца для амплификации открытой рамки считывания (ОРС) PSP3gp10 в реакции Hot Start Taq polymerase ПЦР (Qiagen, Germany) со следующими параметрами ПЦР: Для упомянутого ПЦР применили стандартный 5' праймер (5' ATGGGATCCCCGGTCATTAATACTCACCAG 3' (SEQ ID NO: 50 и стандартный 3' праймер (5' TGCCATCACCCCGCCAGCCGTG 3' (SEQ ID NO: 51. Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей PSP3gp10 с фрагментом гена, кодирующего поликатионный 9-мерный пептид Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(SEQ ID NO: 11), применили хвост ПЦР (Hot Start Taq polymerase ПЦР с аналогичными параметрами) с удлиненным 5' праймером (5'ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAACCGGTCATTAA токолу ТА-клонирования компании-производителя. Рекомбинантную экспрессию PSP3gp10 в соответствии с SEQ ID NO: 8 PKPSP3gp10 в соответствии с SEQ ID NO: 53 провели в экспоненциально растущих клетках Е.coli BL21 (ADE3) pLysS (Invitrogen) после индукции с 1 мМ IPTG (изопропилтиогалактозид) при 37 С в течение 4 ч. Оба протеина подвергли очистке с использованием Ni2+ аффинной хроматографии (Akta FPLC, GE Healthcare), применяя Сконечную 6xHis-метку, кодированную рЕХР 5 СТ/TOPO экспрессионным вектором. Ni2+ аффинную хроматографию провели в 4 последующих этапа, все при комнатной температуре. 1. Эквилибрация Histrap HP 1 мл колонки (GE Healthcare) с 10 объемами колонки отмывочного буфера (60 мМ имидазола, 0.5 мМ NaCl и 20 мМ NaH2PO4-NaOH при pH 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин. 2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом эндолизина) в Histrap HP 1 мл колонки при скорости потока 0,5 мл/мин. 3. Отмывка колонки с 15 объемами колонки отмывочного буфера при скорости потока 1 мл/мин. 4. Элюирование связанного эндолизина из колонки с 10 объемами колонки элюирующего буфера(500 мМ имидазола, 5 мМ NaCl и 20 мМ NaH2PO4-NaOH при pH 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин. Общий выход обоих очищенных рекомбинантных протеинов на 1 л экспрессионной культуры E.coli приведен в табл. 4. Значения определили при помощи спектрофотометрического измерения протеиновой концентрации, а общий объем очищенного маточного раствора - при длине волны 280 нм. Очищенные маточные растворы, состоящие из PSP3gp10 и PKPSP3gp10 соответственно, в элюирующем буфере (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7,4; 0,5 М NaCl; 500 мМ имидазола) показали степень чистоты как минимум 90%,как определено визуально на SDS-PAGE (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) гелях. Таблица 4 Выход очищенного рекомбинантного PSP3gp10 эндолизина и его модифицированного варианта PKPSP3gp10 на 1 л экспрессионной культуры Е.coli Для определения антиграмотрицательного спектра PKPSP3gp10 эндолизина в соответствии с SEQID NO: 53, испытали комбинацию 1,315 мкМ PKPSP3gp10 эндолизина и 0,5 мМ ЭДТК на клинических штаммах P. aeruginosa PAO1p и Br667, Escherichia coli WK6, и Salmonella typhimurium (см. табл. 5). Экспоненциально растущие бактериальные клетки (OD600nm 0.6), разбавленные в 100 раз до конечной плотности примерно 106/мл каждого штамма, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания, с немодифицированным эндолизином PSP2gp10 (SEQ ID NO: 8) и модифицированным эндолизином PKPSP3gp10 (SEQ ID NO: 53), каждый образец в комбинации без и вместе с 0,5 мМ ЭДТК. Для инкубации оба эндолизина использовали в буфере (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7.4; 0,5 М NaCl; 0,5 М имидазола), причем инкубацию провели при конечной концентрации эндолизина 1.315 мкМ. В качестве контроля каждый штамм также подвергли инкубации в течение 30 мин с 0,5 мМ ЭДТК (в таком же, как и вышеупомянутый буфер), но без эндолизина. Таблица 5 Перечень применяемых грамотрицательных штаммов(3):1192-1202. После инкубации клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно 105-104-103 клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37 С. На основе подсчета количества клеток рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах (=log10N0/Ni, где Таблица 6 Антибактериальная активность немодифицированного эндолизина (PSP3gp10) и его модифицированного варианта (PKPSP3gp10) с и без ЭДТК-Na2 в отношении различных экспоненциально растущих грамотрицательных видов бактерий Все образцы реплицировали три раза. Представлены средние +/- стандартные девиации. Максимальная наблюдаемая редукция зависит от уровня детекции 10 клеток/мл и первоначальной плотности клеток. В случае РА 01 р, ЭДТК наблюдается синергическое действие, как с немодифицированнымPSP3gp10 эндолизином, так и с его модифицированным вариантом PKPSP3gp10. Пример 6. Модифицированные варианты эндолизина из Escherichia coli фага Р 2. Р 2gp09 в соответствии с SEQ ID NO: 9 представляет собой глобулярный эндолизин со 165 аминокислотными остатками, полученный из Escherichia coli фага Р 2 с каталитическим лямбда-мурамидазным доменом. Как показал анализ BLASTp и Pfam, эндолизин Р 2gp09 содержит в себе каталитический домен в пределах от примерно 34 аминокислотного остатка до примерно 152 аминокислотного остатка. Очищенный геном ДНК фага Р 2 использовали в качестве образца для амплификации открытой рамки считывания (ОРС) Р 2gp09 в стандартной ПЦР реакции с Pfu полимеразой (Fermentas), со следующими параметрами ПЦР: Для упомянутого ПЦР применили стандартный 5' праймер (5' ATGGGATCCCCGGTAATTAACACGCATC 3' (SEQ ID NO: 54 и стандартный 3' праймер (5' AGCCGGTACGCCGCCAGCGGTACGC 3' (SEQ ID NO: 55. Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей Р 2gp09 с фрагментом гена, кодирующего поликатионный 9-мерный пептид Lys-Arg-Lys-LysArg-Lys-Lys-Arg-Lys (SEQ ID NO: 11), применили хвост ПЦР (с аналогичными параметрами, как и упомянутый выше стандартный ПЦР) с удлиненным 5' праймером (5' ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAACCGGTAATTAACACGCAT С 3' (SEQ ID NO: 56) и стандартный 3' праймер в соответствии с SEQ ID NO 55. Оригинальный немодифицированный Р 2gp09 ПЦР фрагмент и удлиненный фрагмент лигандировали в рЕХР 5 СТ/ТОРО экспрессионном векторе (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),следуя протоколу ТА-клонирования компании-производителя. Рекомбинантную экспрессию Р 2gp09 в соответствии с SEQ ID NO: 9 и PKP2gp09 в соответствии сSEQ ID NO: 57 провели в экспоненциально растущих клетках Е.coli BL21 (ADE3) pLysS (Invitrogen) после индукции с 1 мМ IPTG (изопропилтиогалактозид) при 37 С в течение 4 ч. Оба протеина подвергли очистке с использованием Ni2+ аффинной хроматографии (Akta FPLC, GE Healthcare) применяя Сконечную 6xHis-метку, кодированную рЕХР 5 СТ/ТОРО экспрессионным вектором. The Ni2+ аффинную хроматографию провели в 4 последующих этапа, все при комнатной температуре. 1. Эквилибрация Histrap HP 1 мл колонки (GE Healthcare) с 10 объемами колонки отмывочного буфера (60 мМ имидазола, 0,5 мМ NaCl и 20 мМ NaH2PO4-NaOH при pH 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин. 2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом эндолизина) в Histrap HP 1 мл колонки при скорости потока 0,5 мл/мин. 3. Отмывка колонки с 15 объемами колонки отмывочного буфера при скорости потока 1 мл/мин. 4. Элюирование связанного эндолизина из колонки с 10 объемами колонки элюирующего буфера(500 мМ имидазола, 5 мМ NaCl и 20 мМ NaH2PO4-NaOH при pH 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин. Общий выход обоих очищенных рекомбинантных протеинов на 1 л экспрессионной культуры E.coli приведен в табл. 7. Значения определили при помощи спектрофотометрического измерения протеиновой концентрации, а общий объем очищенного маточного раствора при длине волны 280 нм. Очищенные маточные растворы, состоящие из Р 2gp09 и PKP2gp09 соответственно, в элюирующем буфере (20 мМNaH2PO4-NaOH pH 7.4; 0,5 М NaCl; 500 мМ имидазола) показали степень чистоты как минимум 95%, как определено визуально на SDS-PAGE (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) гелях. Таблица 7 Выход очищенного рекомбинантного Р 2gp09 эндолизина и его РК-модифицированного производного PKP2gp09 на 1 л экспрессионной культуры Е.coli Для определения антиграмотрицательного спектра PK2gp09 эндолизина в соответствии с SEQ IDNO: 57, испытали комбинацию 1,315 мкМ PK2gp09 эндолизина и 0,5 мМ ЭДТК на клинических штаммахP. aeruginosa PAO1p и Br667 и на Escherichia coli WK6 (см. табл. 9). Экспоненциально растущие бактериальные клетки (OD600HM из 0,6) разбавленные в 100 раз до конечной плотности примерно 106/мл каждого штамма, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания, с немодифицированным эндолизином P2gp09 (SEQ ID NO: 9) модифицированным эндолизином PKP2gp09 (SEQ IDNO: 57) каждый образец в комбинации без и вместе с 0,5 мМ ЭДТК. Для инкубации оба эндолизина использовали в буфере (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7.4; 0,5 М NaCl; 0,5 М имидазола) причем инкубацию провели при конечной концентрации эндолизина 1,315 мкМ. В качестве контроля, каждый штамм также подвергли инкубации в течение 30 мин с 0,5 мМ ЭДТК (в таком же, как и вышеупомянутый буфер), но без эндолизина. После инкубации клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно 105-104-103 клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37 С. На основе подсчета количества клеток рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах(=logioN0/Ni, где N0 = число необработанных клеток, a Ni = число обработанных клеток, оба показателя рассчитаны после инкубации) (табл. 8). Таблица 8 Антибактериальная активность немодифицированного эндолизина (Р 2gp09) и его модифицированного варианта (Р 2gp09) с и без ЭДТК-Na2 в отношении различных экспоненциально растущих грамотрицательных видов бактерий Все образцы реплицировали три раза. Представлены средние +/- стандартные девиации. Максимальная наблюдаемая редукция зависит от уровня детекции 10 клеток/мл и первоначальной плотности клеток. Таблица 9 Перечень применяемых грамотрицательных штаммовaeruginosa colonization in a burn unit: persistence of a multidrugresistant clone and a silver sulfadiazine-resistant clone. J. Clin Microbiol., 41 (3):1192-1202. Пример 7. Модифицированные варианты эндолизина из Pseudomonas putida фага ОВР.OBPgpLYS в соответствии с SEQ ID NO: 7 представляет собой модульный эндолизин с 328 аминокислотными остатками, полученный из Pseudomonas putida фага ОВР с putative N-конечными пептидогликан-связывающими доменами и С-конечным каталитическим хитиназным доменом. Как показал анализ BLASTp и Pfam, эндолизин OBPgpLYS содержит в себе каталитический домен в пределах от примерно 126 аминокислотного остатка до примерно 292 аминокислотного остатка и N-конечный пептидогликан-связывающий домен в пределах примерно с 7 по 96 аминокислотные остатки. Очищенный геном ДНК фага ОВР использовали в качестве образца для амплификации открытой рамки считывания (ОРС) OBPgpLYS в стандартной ПЦР реакции с Pfu polymerase (Fermentas, Ontario,Canada), со следующими параметрами ПЦР: Применили стандартный 5' праймер (5' ATGAAAAATAGCGAGAAGAAT 3' (SEQ ID NO: 58 и стандартный 3' праймер (5' AACTATTCCGAGTGCTTTCTTTGT 3' (SEQ ID NO: 59. Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей OBPgpLYS с фрагментом гена, кодирующего поликатионный 9-мерный пептид Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys- (SEQ ID NO: 11), применили хвост ПЦР (с аналогичными параметрами, как и упомянутый выше стандартный ПЦР) с удлиненным 5' праймером (5' ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAAATAGCGAGAAGAAT 3'(SEQ ID NO: 60 и стандартный 3' праймер в соответствии с SEQ ID NO 59. Оригинальный немодифицированный OBPgpLYS ПЦР фрагмент и удлиненный фрагмент лигандировали в рЕХР 5 СТ/ТОРО экспрессионном векторе (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) следуя протоколу ТА-клонирования компаниипроизводителя. Рекомбинантную экспрессию OBPgpLYS в соответствии с SEQ ID NO: 7 и PKOBPgpLYS в соответствии с SEQ ID NO: 61 провели в экспоненциально растущих клетках Е.coli BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen) после индукции с 1 мМ IPTG (изопропилтиогалактозид) при 37 С в течение 4 ч. Оба протеина подвергли очистке с использованием Ni2+ аффинной хроматографии (Akta FPLC, GE Healthcare) применяя Сконечную 6xHis-метку, кодированную рЕХР 5 СТ/ТОРО экспрессионным вектором. Ni2+ аффинную хроматографию провели в 4 последующих этапа, все при комнатной температуре. 1. Эквилибрация Histrap HP 1 мл колонки (GE Healthcare) с 10 объемами колонки отмывочного буфера (60 мМ имидазола, 0,5 мМ NaCl и 20 мМ NaH2PO4-NaOH при pH 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин. 2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом эндолизина) в Histrap HP 1 мл колонки при скорости потока 0,5 мл/мин. 3. Отмывка колонки с 15 объемами колонки отмывочного буфера при скорости потока 1 мл/мин. 4. Элюирование связанного эндолизина из колонки с 10 объемами колонки элюирующего буфера(500 мМ имидазола, 5 мМ NaCl и 20 мМ NaH2PO4-NaOH при pH 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин. Общий выход обоих очищенных рекомбинантных протеинов на 1 л экспрессионной культуры Е.coli приведен в табл. 10. Значения определили при помощи спектрофотометрического измерения протеиновой концентрации, а общий объем очищенного маточного раствора при длине волны 280 нм. Очищенные маточные растворы, состоящие из OBPgpLYS и PKOBPgpLYS соответственно, в элюирующем буфере(20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7,4; 0,5 М NaCl; 500 мМ имидазола) показали степень чистоты как минимум 90%, как определено визуально на SDS-PAGE (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) гелях. Таблица 10 Выход очищенного рекомбинантного OBPgpLYS эндолизина и его РК-модифицированного производного PKOBPgpLYS на 1 л экспрессионной культуры Е.coli Для определения антиграмотрицательного спектра PKOBPgpLYS эндолизина в соответствии с SEQID NO: 61, испытали комбинацию 1,313 мкМ РК OBPgpLYS эндолизина и 0,5 мМ ЭДТК на клинических мультирезистентных штаммах P. aeruginosa Br667, Pseudomonas putida G1 (хозяин фага ОВР) и на гамме других грамотрицательных патогенов (Escherichia coli WK6, Salmonella typhimurium LT2 и Burkholderiapseudomallei) (см. табл. 12). Экспоненциально растущие бактериальные клетки (OD600nm из 0,6) разбавленные в 100 раз до конечной плотности примерно 106/мл каждого штамма инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания, с немодифицированным эндолизином OBPgpLYS(SEQ ID NO: 7) и модифицированным эндолизином PKOBPgpLYS (SEQ ID NO: 61), каждый образец в комбинации без и вместе с 0,5 мМ ЭДТК. Для инкубации оба эндолизина использовали в буфере (20 мМNaH2PO4-NaOH pH 7,4; 0,5 М NaCl; 0,5 М имидазола), причем инкубацию провели при конечной концентрации эндолизина 1,313 мкМ. В качестве контроля, каждый штамм также подвергли инкубации в течение 30 мин с 0,5 мМ ЭДТК (в таком же, как и вышеупомянутый буфер), но без эндолизина. После инкубации клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно 105-104-103 клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37 С. На основе подсчета количества клеток, рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах (=log10N0/Ni, где N0 = число необработанных клеток, a Ni = число обработанных клеток, оба показателя рассчитаны после инкубации)(табл. 11). Все образцы реплицировали в три раза. Средние +/- стандартные девиации приведены. Максимальная редукция зависит от уровня детекции в 10 клеток/мл и первоначальной клеточной плотности. Таблица 11 Антибактериальная активность немодифицированного эндолизина (OBPgpLYS) и его модифицированного варианта (PKOBPgpLYS) с и без ЭДТК-Na2 на различных экспоненциально растущих грамотрицательных видах бактерий Таблица 12 Перечень применяемых грамотрицательных штаммовpersistence of a multidrug-resistant clone and a silver sulfadiazineresistant clone. J. Clin Microbiol., 41 (3):1192-1202. Поскольку общий эффект лечения при помощи OBPgpLYS зависит от вида бактерий, данные в табл. 11 показывают добавочный эффект PKOBPgpLYS по сравнению с немодифицированным OBPgpLYS в отношении всех испытуемых видов бактерий, как в отсутствии, так и в присутствии 0,5 мМ ЭДТК. Для Pseudomonas и Burkholderia, наблюдается выраженный синергический эффект с ЭДТК в активности PKOBPgpLYS. Пример 8. Влияние различной концентрации ЭДТК на антибактериальную активность OBPgpLYS иPKOBPgpLYS. Для определения влияния ЭДТК на антибактериальную активность немодифицированного и модифицированного эндолизинов, антибактериальную активность немодифицированного OBPgpLYS эндолизина (SEQ ID NO: 7) и PKOBPgpLYS эндолизина (SEQ ID NO: 61) испытали на клетках Pseudomonas aeruginosa PAO1p (Pirnay JP et al. J. Clin Microbiol., 41(3): 1192-1202 (2003, с использованием различных концентраций ЭДТК и эндолизинов. Экспоненциально растущие бактериальные клетки (OD600HM из 0,6) разбавили в 100 раз до достижения показателя конечной плотности примерно 106/мл и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания вместе с немодифицированным эндолизином OBPgpLYS (SEQ ID NO: 7) и модифицированным эндолизином PKOBPgpLYS (SEQ ID NO: 61). Для инкубации каждый тип эндолизина использовали в буфере (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7,4; 0,5 М NaCl; 0,5 М имидазола) при конечных концентрациях эндолизина 0,013; 0,131 и 1,315 мкМ. При этом использовали различные концентрации ЭДТК: 0; 0,05; 0,5 и 10 мМ. В качестве контроля, инкубировали также один образец в течение 30 мин без эндолизина, вместо которого использовали добавочный буфер (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7,4; 0,5 МNaCl; 0,5 М имидазола). После инкубации клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно,105-104-103 клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Пересчитали остаточные колонии после ночной инкубации при 37 С. На основе подсчета числа клеток,рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах(=log10N0/Ni, где N0 = число необработанных клеток, a Ni = число обработанных клеток, расчеты проводились в обоих случаях после инкубации) (табл. 13). Все образцы реплицировали в три раза. Средние +/стандартные девиации приведены. По результатам анализа, максимальное уменьшение (5,69 лог-юнитов) зависит от уровня детекции 10 клеток/мл и первоначальной клеточной плотности. показывает разницу в показателях активности соответствующих образцов OBPgpLYS и PKOBPgpLYS. Таблица 13 Антибактериальный эффект немодифицированного эндолизина (OBPgpLYS) и его модифицированного варианта (PKOBPgpLYS) в комбинации с различными концентрациями ЭДТК в отношении экспоненциально растущих клеток Pseudomonas aeruginosa PAO1p Как следует из табл. 13, немодифицированный эндолизин OBPgpLYS уменьшают значительно число клеток с более чем 2,5 лог-юнитов для 1,315 мкМ и с +/- 1 лог-юнит для 0,013 мкМ, по сравнению с отрицательным контролем. Модифицированный эндолизин PKOBPgpLYS показывает уменьшение в дополнительные 0,5 лог-юнитов в отношении экспоненциально растущих PAO1p клеток. Наблюдаемый антибактериальный эффект можно увеличить вплоть до редукции в 5,69 лог-юнитов (ниже уровня обнаружения) путем комбинирования PKOBPgpLYS с пермеабилизатором внешней мембраны ЭДТК-Na2 при концентрации 0,5 и 10 мМ ЭДТК. Различие в активности между немодифицированным OBPgpLYS и пируваткиназа(ПК)-модифицированным OBPgpLYS повышается при увеличении количества добавляемого эндолизина (начиная с 0,013-1,315 мкМ эндолизина). Пример 9. Антибактериальная активность модифицированных вариантов phiKZgp144 в отношении различных грамотрицательных бактерий. Для испытания и сравнения потенциала поликатионных пептидов phiKZgp144 и других эндолизинов, синтезировали кодирующие гены, с различными поликатионными пептидами в N-конце протеина. В экспрессионном векторе pET32b (Novagen, Darmstadt, Germany) клонировали различные продукты, для уменьшения потенциальной токсичности поликатионного пептида в отношении хозяина Е.coli. Кодированный в векторе слитый протеин (тиоредоксин) маскирует поликатионный пептид и может устранении во время процесса очистки. Гены, кодирующие smi01 (YP001712536) и KRK9smi01 (SEQ ID NO: 75), полностью синтезировали (Entelechon, Regensburg, Germany) и клонировали в pET32b. Аналогичным образом, следующие модифицированные варианты эндолизина экспрессировали в клетках Е.coli BL21 (DE3) при 37 С до достижения показателя оптической плотности OD600HM=0,6: smi01NO: 43) и POLYKZ144 (SEQ ID NO: 35). Протеиновую экспрессию индуцировали с использованием 1 мМIPTG (конечная концентрация) и провели экспрессию в течение 4 ч. Затем вырастили клетки Е.coli центрифугированием в течение 20 мин при 6000g, провели разрушение (расщепления) клеток и протеиновую очистку в соответствии с рекомендациями комплекта очистки S-Tag rEK Purification Kit (Novagen,Darmstadt, Germany). При использовании вектора pET32b, экспрессированные протеины были нетоксичны в отношении хозяина, что привело к более высокому выходу получаемого протеина. Очищенные маточные растворы показали высокий уровень очистки. Для испытаний и контрольного опыта синтезировали и очистили phiKZgp144 и POLYgp144 в соответствии со способом, описанным в примере 1. Экспоненциально (106/мл) растущие клетки P. aeruginosa PAO1p (Burn wound isolate, Queen Astrid(DSMZ 30007) или Burkholderia solanaceum (Isolate provided by Prof. С. Michiels) разбавили 100(конечная плотность эквивалентна 106/мл), инкубировали при комнатной температуре вместе с 10 мкг недиализированного протеина для каждого образца при конечной концентрации в 100 мкг/мл в буфере (20 мМNaH2PO4-NaOH pH 7,4; 0,5 М NaCl; 0,5 М имидазола). По истечении 1 ч клеточные суспензии разбавили 1:100 и поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Дополнительно, поместили в чашку Петри отрицательный контроль с использованием буфера (20 мМ NaH2PO4-NaOH pH 7,4; 0,5 М NaCl; 0,5 М имидазола). Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37 С. На основе подсчета числа клеток, рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию (%) (=100(Ni/No)100, где N0 = число необработанных клеток, a Ni = число обработанных клеток) (табл. 3). Все образцы реплицировали как минимум в четыре раза. Таблица 14 Антибактериальный эффект различных модифицированных вариантов эндолизинов(NCBI количества - в скобках) на различные виды бактерий Немодифицированные эндолизины phiKZgp144 и smi01 (YP001712536) не уменьшают значительно число клеток по сравнению с отрицательным контролем. Данный опыт снова свидетельствует об эффективности внешней мембраны как барьера для разрушающего действия эндолизина на клеточные стенки грамотрицательных бактерий. В сравнении с приведенными в табл. 14 данными, инкубация с модифицированными эндолизинами KRK9smi01, pKKZ144pET32b и POLY-gp144 вызывает значительную редукцию количества бактериальных клеток в отношении Acinetobacter baumanii (50% для KRKsmi01; 99,9% для pKKZ144pET32b), Pseudomonas aeruginosa (90-99,9% для pKKZ144pET32b) и Burkholderia solanaceum (90-99,9% для POLYKZ144). Данные опыты демонстрируют применимость способа катионного/поликатионного слияния для других эндолизинов. Более того, опыты убедительно продемонстрировали, что модифицированные эндолизины обладают подтвержденной антимикробной активностью в отношении целого ряда бактерий.