Гуманизированный иммуноглобулин, который специфически связывается с бета-амилоидным пептидом, способы его применения

010469 Предпосылки создания изобретения Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой прогрессирующее заболевание, приводящее к старческой деменции. См. в целом Selkoe, TINS 16:403; Hardy et al., Международная заявка WO 92/13069;Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994); Duff et al., Nature 373:476 (1995); Games et al., Nature 373:523 (1995). Вообще говоря, это заболевание делится на два типа: с поздним (позже 65 лет) началом и с ранним началом, которое активно развивается в пресенильный период, т.е. между 35 и 60 годами. При любом типе заболевания патология одинакова, но аномалии обычно более тяжелы и обширны в случаях с более ранним началом. Заболевание характеризуют по меньшей мере два типа поражения мозга: нейрофибриллярные клубки и сенильные бляшки. Нейрофибриллярные клубки представляют собой внутриклеточные отложения связывающегося с микротрубочками тау-белка, состоящего из двух нитей, попарно скрученных друг с другом. Сенильные бляшки (например, амилоидные бляшки) представляют собой участки дезорганизованного нейропиля до 150 мкм с внеклеточными амилоидными отложениями в центре, видимые под микроскопом при исследовании срезов тканей мозга. Аккумуляция амилоидных бляшек в тканях мозга связана также с синдромом Дауна и другими когнитивными нарушениями. Основной компонент бляшек представляет собой белок, называемый А или -амилоидный белок.A белок представляет собой состоящий из 39-43 аминокислот внутренний фрагмент - размером 4 кДа более протяжнного трансмембранного гликопротеина, называемого белком-предшественником амилоидного белка (АРР). Вследствие протеолитического процессинга АРР при участии различных секретазA первоначально обнаружен как в короткой форме, протяжнностью 40 аминокислот, так и в длинной форме протяжнностью от 42-43 аминокислот. Часть гидрофобного трансмембранного домена АРР обнаружена на карбоксильном конце A, и она может быть ответственна за способность объединяться в виде бляшек, в особенности, в случае длинной формы. Накопление амилоидных бляшек в мозгу в конечном счте приводит к некрозу нейронных клеток. Физические симптомы, обусловленные такого рода деградацией нервной системы, характеризуют болезнь Альцгеймера. Некоторые мутации АРР белка коррелируются с наличием болезни Альцгеймера. См., например,Goate et al., Nature 349:704 (1991) (валин 717 в изолейцин); Charlier Harlan et al., Nature 353:844 (1991) (валин 717 в глицин); Murrell et al., Science 254:97 (1991) (валин 717 в фенилаланин); Mullan et al., Nature Genet. 1:345 (1992) (двойная мутация с заменой пары лизин 595-метионин 596 на пару аспарагин 595-лейцин 596). Полагают, что такие мутации вызывают болезнь Альцгеймера за счт повышения или изменения процессинга АРР в A, в частности, процессинга АРР в повышенные количества длинной формы A (т.е. А 142 и A 1-43). Полагают, что мутации в других генах, таких как пресенильные гены PS1 и PS2, опосредованно влияет на процессинг АРР, при котором образуются повышенные количества длинной формы A(см. Hardy, TINS 20:154 (1997. Для определения важности амилоидных бляшек для болезни Альцгеймера успешно применялись мышиные модели (Games et al., см. выше, Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1550 (1997. В частности, когда трансгенным мышам PDAPP (клетки которых экспрессируют мутантную форму человеческого АРР и у которых в раннем возрасте развивается болезнь Альцгеймера) инъецируют длинную форму A, у них наблюдается как замедление развития болезни Альцгеймера, так и повышение титра антител к белку A (Schenk et al., Nature 400, 173 (1999. Вышеописанные наблюдения показывают,что белок A, в частности, его длинная форма, является элементом, вызывающим болезнь Альцгеймера.McMichael в Европейском патенте ЕР 526511 предлагает вводить больным с установленной AD гомеопатические дозы (меньшие или равные 10-2 мг/день). Полагают, что у обычного человека, содержащего около 5 л плазмы, даже при верхнем пределе этой дозы достигается концентрация не более 2 пг/мл. Нормальная концентрация белка A в человеческой плазме обычно находится в интервале 50-200 пг/мл(Seubert et al., Nature 359:325 (1992. Так как предлагаемая в ЕР 526511 дозировка очень мало изменяет уровень эндогенного белка A в кровотоке и так как в этом патенте не рекомендуется применения адъюванта, такого как иммуностимулятор, кажется невероятным, что это даст какой-либо терапевтический эффект. Следовательно, существует необходимость в новых лекарственных средствах и реагентах для лечения болезни Альцгеймера, в частности, в лекарственных средствах и реагентах, способных вызывать терапевтический эффект при введении в физиологических (например, нетоксических) дозах. Сущность изобретения Настоящее изобретение включает новые иммунологические реагенты, в частности, терапевтические препараты антител для предотвращения и лечения заболевания с амилоидной (амилоидогенной) этиологией (например, болезни Альцгеймера). В основе данного изобретения частично лежит идентификация и характеристика двух моноклональных антител, которые специфически связываются с белком A и эффективно уменьшают "бляшечную нагрузку" и нейритную дистрофию, обусловленные амилоидными нарушениями. Структурный и функциональный анализ этих антител позволяет создать различные гуманизированные антитела для профилактических и/или терапевтических целей. В частности, данное изобретение охватывает гуманизацию вариабельных областей этих антител и, соответственно, включает цепи гуманизированного иммуноглобулина или антитела, интактные гуманизированные иммуноглобу-1 010469 лины или антитела и функциональные фрагменты, в особенности, антигенсвязывающие фрагменты характеристичных (заявляемых) антител. Также предлагаются полипептиды, содержащие гипервариабельные участки заявляемых моноклональных антител, а также полинуклеотидные реагенты, векторы и хозяева, применимые для кодирования указанных полипептидов. Предлагаются способы лечения амилоидогенных заболеваний или нарушений (например, болезни Альцгеймера), а также применяемые для этого фармацевтические композиции и наборы. Также охватываются способы идентификации остатков предлагаемых (характеристичных) моноклональных антител, важных для соответствующей иммунологической функции и для идентификации остатков, подлежащих замене при создании гуманизированных антител, проявляющих при использовании в качестве терапевтических агентов повышенную аффинность к связыванию и/или пониженную иммуногенность. Краткое описание фигур На фиг. 1 показан сравнительный анализ первичной структуры аминокислотных последовательностей лгкой цепи антител: мышиного 3D6, гуманизированного 3D6, Kabat ID 109230 и зародышевой линии А 19. Участки CDR показаны стрелками. Жирным курсивом показаны редкие (минорные) аминокислотные остатки мышиной последовательности. Жирным шрифтом показана упаковка остатков (VH +VL). Чрным закрашены канонические/CDR - взаимодействующие остатки. Звздочками отмечены остатки, выбираемые для обратной мутации в гуманизированном 3D6, версия 1. На фиг. 2 показан сравнительный анализ первичной структуры аминокислотных последовательностей тяжлой цепи антител: мышиного 3D6, гуманизированного 3D6, Kabat ID 045919 и зародышевой линии VH3-23. Пояснения те же, что и для фиг. 1. На фиг. 3 графически изображена способность 3D6, химерного 3D6 и 10D5 связываться с белкомA. Фиг. 3 А представляет собой график связывания A с химерным 3D6 (РК 1614) по сравнению с мышиным 3D6. На фиг. 3B графически показана конкуренция биотинилированного 3D6 с немечеными 3D6,РК 1614 и 10D5 за связывание с A. На фиг. 4 представлена модель гомологии VH и VL 3D6, показывающая -углеродный скелет молекулы. VH показана штрихом, a VL сплошной линией. Участки CDR показаны в виде ленты. На фиг. 5 графически изображена способность химерного 3D6 и гуманизированного 3D6 связываться с белком A. На фиг. 5 А показаны результаты определения методом ELISA связывания гуманизированного 3D6vl и химерного 3D6 с агрегированным A. На фиг. 5 В показаны результаты определения методом ELISA связывания гуманизированного 3D6v1 и гуманизированного 3D6v2 с агрегированнымA. На фиг. 6 дан график, полученный в результате количественного определения связывания гуманизированного 3D6 и химерного 3D6 с бляшками A срезов тканей отделов мозга мышей PDAPP. Фиг. 7 представляет собой график, полученный в результате анализа конкурентного связывания, в котором изучается способность вариантов (версий) 1 и 2 гуманизированного 3D6, химерного 3D6, мышиного 3D6 и 10D5 конкурировать с мышиным 3D6 за связывание с белком A. На фиг. 8 графически изображены результаты ex vivo анализа фагоцитов, в котором изучается способность гуманизированного 3D6v2, химерного 3D6 и человеческого IgG опосредовать усвоение микроглией белка A. На фиг. 9 показан сравнительный анализ первичной структуры аминокислотных последовательностей 10D5 VL и 3D6 VL. Жирным шрифтом выделены остатки, которые точно совпадают с 10D5. На фиг. 10 показан сравнительный анализ первичной структуры аминокислотных последовательностей 10D5 VH и 3D6 VH. Жирным шрифтом выделены остатки, которые точно совпадают с 10D5. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение охватывает новые иммунологические реагенты и способы предупреждения или лечения болезни Альцгеймера или других амилоидогенных заболеваний. Основой данного изобретения, по меньшей мере частично, является определение характеристик двух моноклональных иммуноглобулинов, 3D6 и 10D5, эффективно связывающих бета-амилоидный белок (A) (например, связывающих растворимый или агрегированный A), опосредующих фагоцитоз (например, агрегированного A), снижающих содержание (нагрузку) бляшек и/или уменьшающие нейритную дистрофию (например, у больного). Дополнительным основанием для данного изобретения является определение и структурная характеристика первичной и вторичной структуры вариабельной лгкой и тяжлой цепи этих иммуноглобулинов и идентификация остатков, важных для активности и иммуногенности. Охватываются иммуноглобулины, которые включают вариабельную лгкую и/или вариабельную тяжлую цепь предпочтительных моноклональных иммуноглобулинов, представленных в данном описании. Охватываются предпочтительные иммуноглобулины, например, терапевтические иммуноглобулины, которые включают гуманизированную вариабельную лгкую и/или гуманизированную вариабельную тяжлую цепь. Предпочтительные вариабельная лгкая и/или вариабельная тяжлая цепи включают-2 010469 гипервариабельный участок (CDR) моноклонального иммуноглобулина (например, иммуноглобулина донора) и вариабельные области каркаса, в основном (главным образом), человеческого акцепторного иммуноглобулина. Выражение "в основном (главным образом), человеческого акцепторного иммуноглобулина" обозначает, что основная часть или ключевые остатки скелета берут из человеческой акцепторной последовательности, допуская, однако, замену остатков в определнных положениях на остатки, выбираемые с целью увеличения активности гуманизированного иммуноглобулина (например, изменения активности таким образом, чтобы наиболее близко имитировать активность донорного иммуноглобулина) или с целью понижения иммуногенности гуманизированного иммуноглобулина. В одном варианте изобретение включает лгкую или тяжлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая содержит гипервариабельные участки (CDR) вариабельной области 3D6 (т.е. содержит один, два или три CDR-участка последовательности вариабельной области лгкой цепи, изображнной как SEQ ID NO:2, или содержит один, два или три CDR-участка последовательности вариабельной области тяжлой цепи, изображнной как SEQ ID NO:4) и включает вариабельную область скелета последовательности лгкой или тяжлой цепи, главным образом, человеческого акцепторного иммуноглобулина, при условии, что по меньшей мере один остаток фрагмента скелета претерпевает обратную мутацию в соответствующий остаток мышиной последовательности, при этом указанная обратная мутация практически не влияет на способность цепи управлять A-связыванием. В другом варианте данное изобретение включает лгкую и тяжлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая содержит гипервариабельные участки (CDR) вариабельной области 3D6 (например, содержит один, два или три CDR-участка последовательности вариабельной области лгкой цепи, изображнной как SEQ ID NO:2, или содержит один, два или три CDR-участка последовательности вариабельной области тяжлой цепи, изображнной как SEQ ID NO:4) и включает вариабельную область скелета последовательности лгкой или тяжлой цепи, главным образом, человеческого акцепторного иммуноглобулина, при условии, что по меньшей мере один остаток фрагмента скелета замещается на соответствующий аминокислотный остаток последовательности вариабельной области лгкой или тяжлой цепи мышиного 3D6, при этом фрагмент каркаса выбирают из группы, состоящей из (а) остатка, который непосредственно связывается не-ковалентной связью с антигеном; (б) остатка, прилегающего кCDR; (в) остатка, взаимодействующего с CDR (например, идентифицированного путм моделирования лгкой и тяжлой цепи на разрешнной структуре гомологичной цепи известного иммуноглобулина); и(г) остатка, находящегося на границе раздела (интерфейс) VL-VH. В другом варианте данное изобретение включает лгкую и тяжлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая содержит участки CDR вариабельной области и вариабельные области каркаса последовательности лгкой или тяжлой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина при условии, что по меньшей мере один остаток каркаса заменяется на соответствующий аминокислотный остаток последовательности вариабельной области лгкой или тяжлой цепи мышиного 3D6, где остаток каркаса представляет собой остаток (фрагмент), способный влиять на конформацию вариабельной области лгкой цепи или функционировать как фрагмент, идентифицированный с помощью анализа трхмерной модели вариабельной области, например, фрагмент (остаток), способный взаимодействовать с антигеном, остаток, проксимальный к сайту связывания антигена, остаток, способный взаимодействовать с CDR, остаток, прилегающий к CDR, остаток в пределах 6 от остатка CDR, тврдо установленный (канонический) остаток, остаток в верньер-зоне, остаток междуцепной упаковки, необычный остаток или остаток сайта гликозилирования на поверхности структурной модели. В другом варианте изобретение охватывает лгкую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая включает CDR-участки вариабельной области 3D6 (например, последовательность вариабельной области лгкой цепи 3D6, изображнной как SEQ ID NO:2) и вариабельную область каркаса человеческого акцепторного иммуноглобулина, при условии, что по меньшей мере один остаток остова, выбираемый из группы, состоящей из L1, L2, L36 и L46 (нумерация по Кабату), заменяется на соответствующий аминокислотный остаток последовательности вариабельной области лгкой цепи мышиного 3D6. В другом варианте данное изобретение включает тяжлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая содержит CDR-участки вариабельной области 3D6 (например, последовательности вариабельной области тяжлой цепи 3D6, изображнной как SEQ ID NO:4) и вариабельную область человеческого акцепторного иммуноглобулина, при условии, что по меньшей мере один остаток каркаса, выбираемый из группы, состоящей из Н 49, Н 93 и Н 94 (нумерация по Кабату), заменяется на соответствующий аминокислотный остаток последовательности вариабельной области тяжлой цепи мышиного 3D6. Предпочтительные лгкие цепи включают области каппа II подтипа каппа II (условие Кабата), например, области каркаса акцепторного иммуноглобулина Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 и Kabat ID U41645. Предпочтительные тяжлые цепи включают остатки области каркаса субтипа III (условие Кабата), например, области каркаса акцепторного иммуноглобулина Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 иKabat ID M23691. В одном варианте данное изобретение охватывает лгкую и тяжлую цепь иммунизированного иммуноглобулина, которая включает гипервариабельные участки (CDR) вариабельной области 10D5 (т.е.-3 010469 содержит один, два или три CDR-участка последовательности вариабельной области лгкой цепи, изображнной как SEQ ID NO:14, или содержит один, два или три CDR-участка последовательности вариабельной области тяжлой цепи, изображнной как SEQ ID NO:16) и включает вариабельную область скелета последовательности лгкой или тяжлой цепи, главным образом, человеческого акцепторного иммуноглобулина, при условии, что по меньшей мере один остаток фрагмента скелета претерпевает обратную мутацию в соответствующий остаток мышиной последовательности, при этом указанная обратная мутация практически не влияет на способность цепи управлять A-связыванием. Другой вариант данного изобретения охватывает лгкую или тяжлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая включает гипервариабельные участки (CDR) вариабельной области 10D5(например, содержит один, два или три CDR-участка последовательности вариабельной области лгкой цепи, изображнной как SEQ ID NO:14, или содержит один, два или три CDR-участка последовательности вариабельной области тяжлой цепи, изображнной как SEQ ID NO:16) и включает вариабельную область каркаса последовательности лгкой или тяжлой цепи, главным образом, человеческого акцепторного иммуноглобулина, при условии, что по меньшей мере один остаток фрагмента скелета замещается на соответствующий аминокислотный остаток последовательности вариабельной области лгкой или тяжлой цепи мышиного 3D6, при этом фрагмент каркаса выбирают из группы, состоящей из (а) остатка, который непосредственно связывается нековалентной связью с антигеном; (б) остатка, прилегающего к CDR; (в) остатка, взаимодействующего с CDR (например, идентифицированного путм моделирования лгкой и тяжлой цепи на разрешнной структуре гомологичной цепи известного иммуноглобулина); и (г) остатка, находящегося на границе раздела (интерфейс) VL-VH. В другом варианте данное изобретение охватывает лгкую или тяжлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая содержит участки CDR вариабельной области и вариабельные области каркаса последовательности лгкой или тяжлой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина при условии, что по меньшей мере один остаток каркаса заменяется на соответствующий аминокислотный остаток последовательности вариабельной области лгкой или тяжлой цепи мышиного 10D5, где остаток каркаса представляет собой остаток (фрагмент), способный влиять на конформацию вариабельной области лгкой цепи или функционировать как фрагмент, идентифицированный с помощью анализа трхмерной модели вариабельной области, например, фрагмент (остаток), способный взаимодействовать с антигеном, остаток, проксимальный к сайту связывания антигена, остаток, способный взаимодействовать с CDR, остаток, прилегающий к CDR, остаток в пределах 6 от остатка CDR, тврдо установленный (канонический) остаток, остаток в верньер-зоне, остаток междуцепной упаковки, необычный остаток или остаток сайта гликозилирования на поверхности структурной модели. В другом варианте изобретение включает, помимо замен, описанных выше, замену по меньшей мере одного минорного остатка человеческого каркаса. Например, минорный остаток может быть замещн на аминокислотный, общий для последовательностей человеческой вариабельной цепи в этом положении. Или же минорный остаток может быть заменн на соответствующий аминокислотный остаток последовательности вариабельной цепи зародышевой линии, например, минорный остаток лгкой цепи каркаса может быть заменн на соответствующий остаток зародышевой линии из последовательности иммуноглобулина зародышевой линии А 1, А 17, А 18, А 2 или А 19 или минорный остаток тяжлой цепи каркаса может быть заменн на соответствующий остаток зародышевой линии из последовательности иммуноглобулина зародышевой линии VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 или VH3-11. В другом варианте данное изобретение включает гуманизированный иммуноглобулин, который содержит лгкую цепь и тяжлую цепь, описанных выше, или антигенсвязывающий фрагмент указанного иммуноглобулина. В примере варианта изобретения гуманизированный иммуноглобулин связывается(например, специфически связывается) с бета-амилоидным пептидом (A) с аффинностью связывания по меньшей мере 107 M-1, 108 M-1 или 109 М-1. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент включает тяжлую цепь, имеющую изотип 1. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент связывается (например, специфически связывается) как с растворимым бета-амилоидным белком (А), так и с агрегированным A. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент опосредует фагоцитоз (например,индуцирует фагоцитоз) бета-амилоидного белка (А). Ещ в одном варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент проникает через гематоэнцефалический барьер субъекта. Ещ в одном варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент уменьшает как содержание бета-амилоидного белка (А), так и нейритную дистрофию у субъекта. В другом варианте изобретение включает химерные иммуноглобулины, содержащие вариабельные области 3D6 (например, последовательности вариабельной области, изображнные как SEQ ID NO:2 илиSEQ ID NO:4). Ещ в одном варианте изобретение охватывает иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий вариабельную область тяжлой цепи, представленную SEQ ID NO:8, и вариабельную область лгкой цепи, представленную SEQ ID NO:5. Ещ в одном варианте изобретение охватывает иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий вариабельную область тяжлой цепи, представленную SEQ ID NO:12, и вариабельную область лгкой цепи, представлен-4 010469 ную SEQ ID NO:11. В другом варианте изобретение охватывает химерные иммуноглобулины, которые включают вариабельные области 10D5 (например, последовательности вариабельной области, изображнные как SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:16). Ещ в одном варианте изобретения иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно включает константные области IgG1. Иммуноглобулины, представленные в данном описании, особенно пригодны для использования в терапевтических методах, имеющих целью предупреждение или лечение амилоидогенных заболеваний. В одном варианте настоящее изобретение охватывает способ предупреждения или лечения амилоидогенного заболевания (например, болезни Альцгеймера), который заключается во введении больному эффективной дозы представленного в данном описании гуманизированного иммуноглобулина. В другом варианте изобретение охватывает фармацевтические композиции, которые включают гуманизированный иммуноглобулин по данному описанию и фармацевтический носитель. Кроме того, охватываются молекулы выделенных нуклеиновых кислот, векторы и клетки-хозяева для продуцирования иммуноглобулинов или фрагментов иммуноглобулинов или цепей по данному описанию, а также способы продуцирования указанных иммуноглобулинов, фрагментов иммуноглобулинов или цепей иммуноглобулинов. Настоящее изобретение включает далее способ идентификации остатков 3D6 или 10D5, подлежащих замене при продуцировании гуманизированного 3D6 или 10D5 иммуноглобулина, соответственно. Например, способ идентификации остатков вариабельной области скелета, подлежащих замене, включает моделирование трхмерной структуры вариабельной области 3D6 или 10 В 5 на разрешнной структуре гомологичного иммуноглобулина и анализ указанной модели с целью определения остатков, способных влиять на конформацию или функцию вариабельной области иммуноглобулина 3D6 или 10D5, чтобы идентифицировать остатки, подлежащие замене. Данное изобретение далее включает применение последовательности вариабельной области, изображнной как SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или какой-либо их части, для создания трхмерного изображения иммуноглобулина 3D6, цепи иммуноглобулина 3D6 или е домена. Также охватывается применение последовательности вариабельной области, изображнной как SEQ ID NO:14, или SEQ ID NO:16, или какой-либо их части, для создания трхмерного изображения иммуноглобулина 10D5, цепи иммуноглобулина 10D5 или е домена. Для лучшего понимания данного изобретения полезно перед его описанием дать определения некоторых терминов, используемых далее по всему описанию. Термин "иммуноглобулин" или "антитело" (применяемые в данном описании как синонимы) относятся к антигенсвязывающему белку, имеющему основную четырхцепную полипептидную структуру,состоящую из двух тяжлых и двух лгких цепей, причм указанные цепи стабилизированы, например,межцепными дисульфидными связями, которые способны специфически связываться с антигеном. Как тяжлые, так и лгкие цепи скручиваются в области (домены). Термин "область" относится к глобулярной области полипептида тяжлой или лгкой цепи, содержащей пептидные петли (например, содержащие 3-4-пептидные петли), стабилизированные, например, с помощью -складки и/или внутрицепной дисульфидной связи. Кроме того, области (домены) в данном описании определяются как "константные" или "вариабельные" в зависимости от относительного отсутствия изменения внутри областей (доменов) различных представителей класса в случае "константной" области, или от значительного изменения внутри областей различных представителей класса в случае "вариабельной "области. Термин "константные" области для лгкой цепи употребляется во взаимозаменяемых выражениях "константные области лгкой цепи", "константные домены лгкой цепи", "CL"-области или "CL"-домены. Термин "константные" области для тяжлой цепи употребляется во взаимозаменяемых выражениях "константные области тяжлой цепи", "константные домены тяжлой цепи", "СН"-области или "СН"-домены. Термин "вариабельные" области для лгкой цепи употребляется во взаимозаменяемых выражениях "вариабельные области лгкой цепи", "вариабельные домены лгкой цепи", "VL"-области или "VL"-домены. Термин "вариабельные" области для тяжлой цепи употребляется во взаимозаменяемых выражениях "вариабельные области тяжлой цепи", "вариабельные домены тяжлой цепи", "VH"-области или "VH"-домены. Термин "область" относится к части или участку цепи антитела и включает константные или вариабельные области по определению в данном описании, а также более дискретные части или участки указанных областей. Например, вариабельные домены или области лгкой цепи включают "гипервариабельные участки", или "CDR", вкраплнные в "остовные (каркасные, скелетные) области" или "FR" по определению в данном описании. Иммуноглобулины или антитела могут существовать в мономерной или полимерной форме. Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который связывается с антигеном или конкурирует с интактным антителом (например, с интактным антителом, из которого он образован) за связывание с антигеном (т.е. специфическое связывание). Термин "конформация" относится к третичной структуре белка или пептида (например, антитела,цепи антитела, его области или участку). Например, выражение "конформация лгкой (или тяжлой) цепи относится к третичной структуре вариабельной области лгкой (или тяжлой) цепи, а выражение"конформация антитела" или "конформация фрагмента антитела" относится к третичной структуре антитела или его фрагмента."Специфическое связывание"антитела означает, что антитело проявляет заметное сродство к анти-5 010469 гену или предпочтительному эпитопу и, предпочтительно, не проявляет ощутимой перекрстной реактивности. "Заметное, ощутимое" или предпочтительное связывание включает связывание с величиной аффинности по меньшей мере 106, 107, 108, 109 М-1 или 1010 М-1. Более предпочтительной является аффинность выше 107 М-1, предпочтительно выше 108 М-1. Предполагается, что значения, промежуточные между значениями, представленными выше, также входят в объм настоящего изобретения, и предпочтительная аффинность связывания может быть указана в виде интервала величин аффинности, например,106 М-1-1010 М-1, предпочтительно 107-1010 М-1, более предпочтительно 108-1010 М-1. Антитело, которое"не проявляет заметной перекрстной реактивности", обозначает такое антитело, которое не связывается ощутимо (заметно, в значительной степени) с нежелательным организмом (например, нежелательным белковым телом). Например, антитело, которое специфически связывается с A, в заметной степени(ощутимо) связывает A, но не реагирует в значительной степени с не-A белками или пептидами (например, с не-A белками или пептидами, входящими в состав бляшек). Антитело, против предпочтительного эпитопа не будет, например, в заметной степени перекрстно реагировать с отдалнными эпитопами того же белка или пептида. Специфическое связывание можно определять любыми признанными в технике способами определения такого связывания. Предпочтительно, специфическое связывание определяют методом Scatchard (Скэтчарда) и/или методами конкурентного связывания. Связывающие фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов. Связывающие фрагменты включают Fab, Fab',F(ab')2, Fabc, Fv, одиночные цепи и одноцепные антитела. Понятно, что иммуноглобулин или антитело,иные, нежели "биспецифические" или "бифункциональные" иммуноглобулины или антитела, имеют каждый из своих идентичных сайтов связывания. "Биспецифическое" или "бифункциональное антитело" представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различных пары тяжлой/лгкой цепей и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получать различными способами, включая слияние гибридом или сшивание фрагментов Fab'. См., например, SongsivilaiLachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). Термин "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" относится к иммуноглобулину или антителу, которое содержит по меньшей мере одну гуманизированную цепь иммуноглобулина или антитела (т.е. по меньшей мере одну гуманизированную лгкую или тяжлую цепь). Термин "гуманизированная цепь иммуноглобулина" или "гуманизированная цепь антитела" (т.е. "гуманизированная лгкая цепь иммуноглобулина" или "гуманизированная тяжлая цепь иммуноглобулина") относится к цепи иммуноглобулина или антитела (т.е. лгкой или тяжлой цепи, соответственно), содержащей вариабельную область, которая включает вариабельную остовную область, главным образом, человеческого иммуноглобулина или антитела, и гипервариабельные участки (CDR) (например, по меньшей мере один CDR, предпочтительно два CDR, более предпочтительно три CDR), главным образом,нечеловеческого иммуноглобулина или антитела, и дополнительно включает константные области (например, по меньшей мере одну константную область или е часть в случае лгкой цепи и предпочтительно три константных области в случае тяжлой цепи). Термин "гуманизированная вариабельная область"(например, "гуманизированная вариабельная область лгкой цепи" или "гуманизированная вариабельная область тяжлой цепи") относится к вариабельной области, которая включает вариабельную остовную область, главным образом, человеческого иммуноглобулина или антитела, и гипервариабельные участки(CDR), главным образом, нечеловеческого иммуноглобулина или антитела. Выражение "главным образом (в основном, практически, в значительной степени), человеческого иммуноглобулина или антитела" или "главным образом (и т.д.) человеческий" означает, что при сравнении первичной структуры с аминокислотной последовательностью человеческого иммуноглобулина или антитела идентичность области с последовательностью человеческой остовной или константной области составляет по меньшей мере 80-90%, предпочтительно 90-95%, более предпочтительно 95-99% (т.е. локальная идентичность последовательности), допуская, например, консервативные замены, замены согласованной последовательности, замены зародышевой линии, обратные мутации и т.п. Введение консервативных замен, замен согласованной последовательности, замен зародышевой линии, обратных мутаций и т.п. часто называют "оптимизацией" гуманизированного антитела или цепи. Выражение "главным образом (в основном и т.д.), нечеловеческого иммуноглобулина или антитела" или "главным образом (в основном и т.д.), нечеловеческий" означает наличие последовательности иммуноглобулина или антитела по меньшей степени на 80-95%, предпочтительно на 90-95%, более предпочтительно на 96, 97, 98% или на 99% идентичной последовательности из иного организма, нежели человек, например, иного млекопитающего, нежели человек (не человека). Соответственно, все области или остатки гуманизированного иммуноглобулина или антитела или иммунизированной цепи иммуноглобулина или антитела, за исключением, возможно, CDR, практически идентичны соответствующим областям или остаткам одной или более последовательностей нативного человеческого иммуноглобулина. Термин "соответствующая область" или "соответствующий остаток" относится к области или остатку во второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая(ый) занимает то же самое (т.е. эквивалентное) положение, что и область или остаток в первой ами-6 010469 нокислотной или нуклеотидной последовательности, когда проводят сравнение первичных структур первой и второй последовательностей при оптимальном их взаимном расположении. Термин "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" не предполагают охватить химерные иммуноглобулины или антитела по определению, данному ниже. Хотя гуманизированные иммуноглобулины или антитела химерны по своей конструкции (т.е. содержат области из более чем одного вида белка), они имеют дополнительные особенности (т.е. вариабельные области, содержащие CDR-остатки и акцепторные остовные остатки), не обнаруживаемые в химерных иммуноглобулинах и антителах по определению в данном описании. Термин "значительная (заметная) идентичность" означает, что две полипептидные последовательности, при оптимальном способе сравнения первичных структур, например, с помощью программ GAP или BESTFIT, с применением весов гэпов по умолчанию, идентичны по меньшей мере на 50-60%, предпочтительно 60-70%, более предпочтительно когда последовательности идентичны на 70-80%, ещ более предпочтительно идентичность последовательностей 80-90%, ещ более предпочтительна идентичность последовательностей по меньшей мере 90-95%, и ещ более предпочтительно, когда последовательности идентичны по меньшей мере на 95% или более (например, последовательности идентичны на 99% или более). Термин "практическая идентичность" означает, что две полипептидные последовательности, при оптимальном способе сравнения первичных структур, например, с помощью программ GAP или BESTFIT, с применением весов гэпов по умолчанию, идентичны по меньшей мере на 80-90%, предпочтительно последовательности идентичны на 90-95% и более предпочтительно, когда последовательности идентичны по меньшей мере на 95% или более (например, последовательности идентичны на 99% или более). Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность является эталонной, с которой сравнивают испытуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей последовательности испытуемой и эталонной последовательностей вводят в компьютер, если требуется, устанавливают координаты субпоследовательностей и устанавливают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Затем, используя алгоритм сравнения последовательностей,вычисляют процент идентичности последовательностей для испытуемой(ых) последовательности(ей) с эталонной последовательностью, используя введнные параметры программы. Термины "идентичность последовательности" и "sequence identity" используют в данном описании как синонимы. Оптимальный сравнительный анализ первичной структуры последовательностей можно осуществлять, например, при использовании локального алгоритма гомологий SmithWaterman, Adv. Appl.Biol. 48:443 (1970), метода поиска подобия по PearsonLipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988), компьютерной реализацией этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном обеспечении Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) и с помощью визуального наблюдения (см. в целом Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Один примером алгоритма, пригодного для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, является алгоритм BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). Программное обеспечение для осуществления анализа BLAST можно получить черезHealth NCBI). Как правило, для проведения сравнения последовательностей можно использовать параметры программы по умолчанию, хотя можно также применять специальные (приспособленные) параметры (настроить). Для аминокислотных последовательностей программа BLAST по умолчанию использует разрядность (W) 3, ожидание (Е) 10 и оценочную матрицу BLOSUM62 (см. HenrikoffHenrikoff,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989. Предположительно, положения остатков, которые не являются идентичными, различаются консервативными аминокислотными заменами. С целью классификации аминокислотных последовательностей как консервативных или неконсервативных аминокислоты группируют следующим образом: группа I (гидрофобные боковые цепи): leu, met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr; группа III (кислые боковые цепи): asp, glu; группа IV (основные боковые цепи): asn, gin, his, lys, arg; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): gly, pro; и группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe. Консервативные замены включают замены на аминокислоты того же класса. Неконсервативные замены представляют собой замену представителя одного из этих классов на представителя другого класса. Предпочтительно, гуманизированные иммуноглобулины или антитела связывают антиген с аффинностью, в три, четыре или пять раз большей аффинности соответствующего нечеловеческого антитела. Например, если величина аффинности связывания нечеловеческого антитела составляет 109M-1, человеческое антитело будет иметь аффинность связывания по меньшей мере 3109 M-1, 4109 M-1 или 5109M-1. При описании свойств связывания цепи иммуноглобулина или антитела можно основываться-7 010469 на е способности "контролировать (управлять, направлять) связывание с антигеном (например, с A)". Говорят, что цепь "контролирует связывание с антигеном", когда она придат интактному иммуноглобулину или антителу (или его антигенсвязывающему фрагменту) свойство специфического связывания или аффинность связывания. Говорят, что мутация (например, обратная мутация) существенно (практически) влияет на способность тяжлой или лгкой цепи контролировать (направлять и т.д.) связывание с антигеном, если она изменяет (например, уменьшает) аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего указанную цепь, по меньшей мере, на порядок по сравнению с аффинностью связывания антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, не включающую указанной мутации. Мутация практически не влияет (например, в сторону понижения) на способность цепи контролировать (направлять и т.п.) связывание с антигеном, если она изменяет (например, в сторону понижения) аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего указанную цепь, только в два, три или четыре раза по сравнению с аффинностью связывания антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, не включающую указанной мутации. Термин "химерный иммуноглобулин" или "химерное антитело" относится к иммуноглобулину или к антителу, лгкая и тяжлая цепи которого образованы из различных видов. Химерные иммуноглобулины или антитела можно конструировать, например, методами генной инженерии (рекомбинантной ДНК) из сегментов генов иммуноглобулина, принадлежащих к различным видам."Антиген" представляет собой объект (например, белковый объект или пептид), с которым специфически связывается антитело. Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к сайту антигена, с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент). Эпитопы могут образовываться как из смежных аминокислот, так и несмежных аминокислот, накладывающихся друг на друга при трхмерной (третичной) укладке белка. Эпитопы, образованные из соседних аминокислот, как правило, сохраняются при обработке денатурирующим растворителем, тогда как эпитопы,образованные при третичной укладке, как правило, утрачиваются под действием денатурирующих растворителей. Эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в единственной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеноструктурный анализ и двухмерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E.Morris, Ed. (1996). Антитела, которые распознают одинаковый эпитоп, можно идентифицировать простым иммуноанализом, показывающим способность антитела блокировать связывание другого антитела с целевым антигеном, т.е. методом конкурентного связывания. Конкурентное связывание определяют таким образом,что испытуемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном, таким как A. Известно много методов анализа конкурентного связывания: (конкурентносвязывающего анализа): тврдофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (RIA, РИА), тврдофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ИФА, EIA), конкурентный иммуноферментный сэндвич-анализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983; тврдофазный прямой иммуноферментный анализ с применением биотина-авидина (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986; тврдофазный прямой анализ с мечением, тврдофазный прямой сэндвич-анализ с мечением (см. Harlowand Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988; тврдофазный прямой радиоиммуноанализ с мечением меткой 1-125 (см. Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988; тврдофазный прямой иммуноферментный анализ с применением биотина-авидина (Cheung et al., Virology 176:546(1990; и прямой радиоиммуноанализ с мечением (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990. Как правило, такой анализ включает использование очищенного антигена, связанного с тврдой поверхностью, или клеток с каким-либо антигеном, немеченого испытуемого иммуноглобулина и меченого эталонного иммуноглобулина. Конкурентное торможение измеряют, определяя количество метки, связывающейся с тврдой поверхностью или клетками в присутствии испытуемого иммуноглобулина Обычно испытуемый иммуноглобулин присутствует в избытке. И обычно, когда конкурентное антитело присутствует в избытке, он тормозит специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75% или более. Эпитоп также распознатся иммунокомпетентными клетками, например, В-клетками и/или Тклетками. Клеточное распознавание эпитопа можно определить in vitro анализом, в котором измеряют антигензависимую пролиферацию, таким как включение Н-тимидина, секреция цитокинов, секреция антитела или антигензависимый цитолиз (анализ цитотоксических Т-лимфоцитов). Примеры эпитопов или антигенных детерминант можно обнаружить в человеческом амилоидном белке-предшественнике (АРР), но, предпочтительно, их находят в A пептиде АРР. Существует много изоформ АРР, например, АРР 695 АРР 751 и АРР 770. Аминокислотам в молекуле АРР даются номера в соответствии с последовательностью изоформы АРР 770 (см., например, GenBank Accession No. P05067, изо-8 010469 бражаемой в виде SEQ ID NO:38). Пептид A (также в данном описании называемый бета-амилоидный пептид и А-бета) представляет собой внутренний фрагмент АРР (размером 4 кДа), состоящий из 39-43 аминокислот (A39, A40, A41, A42 и A43).A40, например, состоит из остатков 672-711 АРР, а A42 состоит из остатков 673-713 АРР. В результате протеолитического процессинга АРР различными секретазами in vivo или in situ, A обнаруживается как в "короткой форме", протяжнностью в 40 аминокислот, так и в "длинной форме", протяжнностью в 42-43 аминокислоты. Предпочтительные эпитопы или антигенные детерминанты по данному изобретению локализованы на N-конце А-пептида и включают остатки 1-10 пептида A, предпочтительно остатки 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 или 3-7 пептида A42. Дополнительные эпитопы или антигенные детерминанты включают остатки 2-4, 5, 6, 7 или 8 A, остатки 3-5, 6, 7, 8 или 9 пептида A или остатки 4-7, 8, 9 или 10 пептида A42. Термин "амилоидное заболевание" включает любое заболевание, ассоциируемое с (или вызываемое) образованием или отложением нерастворимых амилоидных фибрилл. Примеры амилоидных заболеваний включают, но без ограничения, системный амилоидоз, болезнь Альцгеймера, диабет у взрослых,болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона (Хантингтона), лобно-височную деменцию и вызванные прионами трансмиссивные губчатые энцефалопатии (куру и болезнь Крейтцфельдта (Кройцфельдта) - Якоба у человека и скрапи (scrapie) и BSE у овец и крупного рогатого скота, соответственно). Различные амилоидные заболевания определяют или отличают по характеру полипептидного компонента отлагающихся фибрилл. Например, у субъектов или пациентов с болезнью Альцгеймера -амилоидный белок (например, дикого типа, вариант или усечнный -амилоидный белок) является отличительным компонентом амилоидного отложения. Следовательно, Болезнь Альцгеймера является примером "заболевания,характеризуемого отложениями белка A или "заболевания, обусловленного отложениями белка A,например, в мозгу субъекта или пациента. Термины "-амилоидный белок", "-амилоидный пептид", "амилоид", "A и "пептид A используют в данном описании взаимозаменяемо в качестве синонимов. Термин "эффективная доза" или "эффективная дозировка" определяется как количество, достаточное для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения заданного эффекта. Термин "терапевтически эффективная доза" определяется как количество, достаточное для излечения или, по меньшей мере, частичного прекращения заболевания и его осложнений у больного, уже страдающего этим заболеванием. Количество, эффективное для такого применения, зависит от тяжести инфекции и общего состояния иммунной системы больного. Термин "пациент, больной" включает человека и других млекопитающих, которые получают профилактическое или терапевтическое лечение. Термин "растворимый" или "диссоциированный" A относится к неагрегированному или переставшему быть агрегированным A-полипептиду. Термин "нерастворимый" A относится к агрегированномуA-полипептиду, например, A, ассоциированному за счт нековалентных связей. Полагают, что A (например, A42) агрегирует, по меньшей мере частично, благодаря присутствию гидрофобных остатков на С-конце пептида (часть трансмембранного домена АРР). Одним способом получения растворимого A является растворение лиофилизированного пептида в чистом ДМСО под действием ультразвука. Образовавшийся раствор центрифугируют для удаления нерастворимых частиц.I. Иммунологические и терапевтические реагенты. Иммунологические и терапевтические реагенты по изобретению содержат иммуногены или антитела или их функциональные или антигенсвязывающие фрагменты по данному описанию, или состоят из них. Известно, что основная структурная единица антитела состоит из четырх субъединиц (тетрамер). Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара содержит одну"лгкую" (около 25 кДа) и одну "тяжлую" (около 50-70 кДа) цепь. Аминоконцевой участок каждой цепи включает вариабельную область (домен) протяжнностью около 100-110 или более аминокислот, главным образом ответственных за распознавание антигена. Карбоксиконцевой участок каждой цепи определяет константную область, в первую очередь отвечающую за эффекторную функцию. Лгкие цепи классифицируют либо как каппа, либо как лямбда и их протяжнность составляет около 230 остатков. Тяжлые цепи классифицируют как гамма , мю , альфа , дельтаили эпсилон, их протяжнность составляет около 450-600 остатков, и они определяют изотип антитела как IgG,IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Как тяжлая, так и лгкая цепи скручиваются (укладываются) в домены (области). Термин "домен", "область" относится к глобулярной области белка, например, иммуноглобулина или антитела. Домены иммуноглобулина или антитела включают, например, три или четыре пептидных петли, стабилизирующихся за счт -складки и межцепной дисульфидной связи. Интактные лгкие цепи имеют, например, два домена (VL и CL), а интактные тяжлые цепи содержат, например, четыре или пять доменов (VH, CH1, CH2 и CH3). Внутри лгкой и тяжлой цепей вариабельные и константные области соединяются областью "J",содержащей около 12 или более аминокислот, при этом тяжлая цепь также содержит область "D", состоящую, примерно, из 10 аминокислот. (См. Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press,-9 010469N.Y. (1989), Ch. 7). Вариабельные области каждой пары "лгкая/тяжлая цепь" образуют сайт связывания антитела. Таким образом, интактное антитело имеет два сайта связывания. Два сайта связывания одинаковы, за исключением бифункциональных или биспецифических антител. Все цепи имеют одинаковую общую структуру: относительно консервативные остовные области (FR), соединнные тремя гипервариабельными участками, также называемыми hv участками или CDR. Природные цепи или рекомбинантные цепи можно экспрессировать при участии лидерной последовательности, которая удаляется в результате клеточного процессинга, и в результате получают цепь зрелого белка. Цепи зрелого белка с неприродной(искусственной) лидерной последовательностью можно получать методами рекомбинантной ДНК, например, с целью повышения секреции или изменения процессинга конкретной интересующей цепи.CDR-участки двух зрелых цепей каждой пары выравнивают по остовным областям, делающим возможным связывание со специфическим эпитопом. От N-конца до С-конца как лгкая, так и тяжлая цепи содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. "FR4" в технике также называют областьюD/J вариабельного домена тяжлой цепи и области J вариабельного домена лгкой цепи. Отнесение аминокислот к каждому домену делают в соответствии с определениями Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991). Альтернативное определение структуры предложено Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); and J. Mol.Biol. 186:651 (1989) (далее в данном описании вместе цитируемые как "Chothia et al."). А. Антитела к A. Терапевтические агенты по изобретению включают антитела, которые специфически связываются сA или другим компонентом амилоидных бляшек. Такие антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Некоторые такие антитела специфически связываются с агрегированной формой A,не связываясь с растворимой формой. Некоторые антитела связываются как с агрегированной, так и с растворимой формой. Некоторые такие антитела связываются с природной короткой формой A (т.е.A39, 40 или 41), не связываясь с природной длинной формой A (т.е. A42 и A43). Некоторые антитела связываются с длинной формой A, не связываясь с короткой формой. Некоторые антитела связываются с A, не связываясь с полноразмерным амилоидным белком-предшественником. Антитела, используемые для терапевтических целей, предпочтительно, имеют интактную константную область или по меньшей мере часть константной области, достаточную для взаимодействия с рецептором Fc. Предпочтительным является человеческий изотип IgG1, так как он имеет наивысшую среди человеческих изотипов аффинность к рецептору FcRI фагоцитов. Также можно использовать биспецифические фрагментыFab, у которых одно плечо антитела специфично в отношении A, а другое - в отношении рецептора Fc. Предпочтительные антитела связываются с A с аффинностью связывания, более высокой чем (или равной) примерно 106, 107, 108, 109 или 1010 М-1 (включая промежуточные значения). Поликлональные сыворотки, как правило, содержат смешанные популяции антител, связывающихся с несколькими эпитопами вдоль A. Однако поликлональные сыворотки могут быть специфическими в отношении конкретного сегмента A, например А-10. Моноклональные антитела связываются с конкретным эпитопом в A, который может быть конформационным или неконформационным эпитопом. Профилактическую и терапевтическую эффективность антител можно проверить на трансгенной животной модели, соответствующие методики описаны в примерах. Предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом среди остатков 1-10 A (с первым N-концевым остатком природного A,обозначенным 1). Некоторые предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом,расположенным между аминокислотами 1-5, а некоторые из них связываются с эпитопом, расположенным между аминокислотами 5-10. Некоторые предпочтительные антитела связываются с эпитопами между аминокислотами 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 или 3-7. Некоторые предпочтительные антитела связываются с эпитопом, начинающимся во фрагменте из остатков 1-3 и оканчивающимся во фрагменте из остатков 711 пептида A. Менее предпочтительные антитела включают антитела, которые связываются с эпитопами внутри остатков 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20, 30 или 10-25 пептида A. Рекомендуется, чтобы перед использованием такие тела подвергали скринингу на активность на мышиных моделях, описанных в примерах. Например, было найдено, что у некоторых антител к эпитопам внутри остатков 10-18, 16-24,18-21 и 33-42 недостаточная активность (например, недостаточная способность уменьшать содержание бляшек и/или корригировать нейритную патологию, обусловленную болезнью Альцгеймера). В некоторых методах используется несколько моноклональных антител, специфично связывающихся с различными эпитопами. Такие антитела можно вводить последовательно или одновременно. Можно также использовать антитела к амилоидным компонентам, иным, нежели A (например, вводимым или вводимым совместно). Например, антитела могут быть направлены на синуклеин, белок, ассоциированный с амилоидом. Когда говорят, что антитело связывается с эпитопом в конкретных остатках, например, таких какA 1-5, это означает, что антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим конкретные остатки (т.е. A 1-5 в этом примере). Такое антитело необязательно контактирует с каждым остатком вA 1-5. Не каждая отдельная аминокислотная замена или делеция в A 1-5 обязательно заметно влияет на аффинность связывания. Специфичность антитела в отношении эпитопа можно определить, например, создав библиотеку выявления фагов, в которой различные составляющие выявляют различные последовательности A. Затем в библиотеке выявления фагов проводят отбор членов, специфично связывающихся с антителом при испытании. Выделяют семейство последовательностей. Как правило, различные представители такого семейства содержат общую ядерную последовательность и фланкирующие последовательности различной протяжнности. Наиболее короткая ядерная последовательность, обнаруживающая специфическое связывание с антителом, определяет эпитоп, связываемый антителом. Можно также испытывать антитела на специфичность в конкурентном анализе с использованием антитела,специфичность которого в отношении эпитопа уже определена. Например, антитела, которые конкурируют с антителом 3D6 за связывание с A, связываются с тем же или аналогичным эпитопом, что и 3D6,т.е. находящимся в границах остатков A 1-5. Аналогично антитела, которые конкурируют с антителом 10D5, связываются с тем же или аналогичным эпитопом, т.е. находящимся в пределах остатков A 3-7. Скрининг антител на специфичность в отношении эпитопа помогает прогнозировать терапевтическую эффективность. Например, антитело, для которого определено связывание с эпитопом внутри остатков 17 белка A, по-видимому, эффективно предупреждает и лечит болезнь Альцгеймера в соответствии с методологией по данному изобретению. Моноклональные или поликлональные антитела, которые специфически связываются с предпочтительным сегментом A, не связываясь с другими областями A, имеют ряд преимуществ в сравнении с моноклональными антителами, связывающимися с другими областями, или с поликлональными сыворотками для интактного A. Во-первых, при равных весовых дозах, дозы антител, которые специфически связываются с предпочтительными сегментами, содержат более высокие молярные дозы антител, эффективные для освобождения от амилоидных бляшек. Во-вторых, антитела, специфически связывающиеся с предпочтительными сегментами, могут инициировать очищение от амилоидных отложений, не вызывая такой реакции очищения у интактного полипептида АРР, тем самым уменьшая возможные побочные эффекты. 1. Получение нечеловеческих антител. Настоящее изобретение охватывает нечеловеческие антитела, например антитела, специфические в отношении предпочтительных A эпитопов по изобретению. Такие антитела можно использовать для приготовления различных терапевтических композиций по изобретению или, предпочтительно, они предоставляют гипервариабельные участки с целью получения гуманизированных или химерных антител(подробно описанных ниже). Получать нечеловеческие моноклональные антитела можно, например, иммунизируя животное пептидом A. Также можно использовать более протяжнный полипептид, содержащий A, или иммуногенный фрагмент A, или антиидиотипические антитела к антителу к A. (HarlowLane, см. выше). Такой иммуноген можно получать из природного источника пептидным синтезом или рекомбинантной экспрессией. Необязательно иммуноген можно вводить в виде слитого белка или в виде полученного другим способом комплекса с белком-носителем, как описано ниже. Необязательно иммуноген можно вводить с адъювантом. Термин "адъювант"относится к соединению, которое, при введении в сочетании с антигеном, усиливает иммунный ответ на антиген, но при индивидуальном введении не вызывает иммунного ответа на антиген. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ по нескольким механизмам, включая рекрутинг лимфоцитов, стимуляцию В и/или Т клеток и стимуляцию макрофагов. Некоторые виды адъювантов можно использовать как описано ниже. Для иммунизации лабораторных животных предпочтительным является полный адъювант Фрейнда. Для получения поликлональных антител обычно используются кролики или морские свинки. Препарат поликлональных антител, например, для пассивной защиты, можно приготовить следующим образом. 125 Нетрансгенных мышей иммунизируют, вводя 100 мкг A 1-42, плюс адъювант CFA/IFA, и умерщвляют через 4-5 месяцев. У иммунизированных мышей отбирают кровь. IgG отделяют от других компонентов крови. Антитело, специфическое в отношении иммуногена, можно частично очистить аффинной хроматографией. В среднем от мыши получают около 0,5-1 мг иммуноген-специфического антитела, а всего получают 60-120 мг. Для получения моноклональных антител обычно используют мышей. Можно приготовить моноклональные антитела против фрагмента, инъецируя фрагмент или более протяжнную форму A в мышь,получая гибридомы и подвергая гибридомы скринингу на антитело, которое специфически связывается сA. Необязательно антитела подвергают скринингу на связывание со специфической областью заданного фрагмента A в отсутствие связывания с другими перекрывающими фрагментами A. Последний скрининг можно осуществлять, определяя связывание антитела с коллекцией делетированных мутантов пептида A и выясняя, какие из делетированных мутантов связываются с антителом. Связывание можно оценивать, например, вестерн-блоттингом или методом ELISA. Наименьший фрагмент, у которого обнаружено специфическое связывание с антителом, определяют как эпитоп к антителу. Или же специфичность в отношении эпитопа можно определять конкурентным анализом, в котором испытуемое и эталонное антитела конкурируют за связывание с A. Если испытуемое и эталонное антитела конкурируют,- 11010469 тогда они связываются с тем же самым эпитопом или с теми же самыми эпитопами достаточно проксимально, так что связывание одного антитела мешает связыванию другого антитела. Предпочтительным изотипом для таких антител является мышиный изотип IgG2a или эквивалентный изотип в других видах. Мышиный изотип IgG2a является эквивалентным человеческому изотипу IgG1. 2. Химерные и гуманизированные антитела. Настоящее изобретение также охватывает химерные и/или гуманизированные антитела (т.е. химерные и/или гуманизированные иммуноглобулины), специфические в отношении бета-амилоидного пептида. Химерные и/или гуманизированные антитела имеют одинаковую или аналогичную специфичность и аффинность связывания, что и мышиное или другое нечеловеческое антитело, которое предоставляет исходный материал для конструкции химерного или гуманизированного антитела.A. Получение химерных антител. Термин "химерное антитело" относится к антителу, гены лгкой и тяжлой цепей которого созданы,обычно методом рекомбинантной ДНК, из сегментов гена иммуноглобулина, принадлежащих к разным видам. Например, вариабельные (V) сегменты генов мышиного моноклонального антитела могут быть соединены с человеческими константными (С) сегментами, такими как IgG1 и IgG4. Предпочтительным является человеческий изотип IgG1. Таким образом, типичное химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из V или антигенсвязывающей области мышиного антитела и С или эффекторной области человеческого антитела.B. Получение гуманизированных антител. Термин "гуманизированное антитело" относится к антителу, содержащему по меньшей мере одну цепь, включающую остатки остова вариабельной области, главным образом, цепи человеческого антитела (называемого "акцепторный иммуноглобулин или акцепторное антитело"), и по меньшей мере один гипервариабельный участок, главным образом мышиного антитела (называемого "донорный иммуноглобулин или донорное антитело"). См. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), патенты США 5530101, 5585089, 5693761, 5693762, Selick et al., Международная заявка WO 90/07861, иWinter, патент США 5225539. Константная(ые) область(и), если таковая(ые) имее(ю)тся, берут в основном или полностью из человеческого иммуноглобулина. Наиболее вероятно, что замена мышиных CDR на остов человеческой вариабельной области приводит к сохранению их корректной пространственной ориентации, если каркас человеческой вариабельной области принимает ту же конформацию, что и остов мышиной вариабельной области, из которой взятыCDR, или сходную с ней. Этого достигают, получая человеческие вариабельные области из человеческих антител, остовные последовательности которых в высокой степени идентичны вариабельным областям мышиного каркаса, из которых взяты CDR. Вариабельные области тяжлой и лгкой цепи могут быть взяты из одной и той же последовательности или из разных последовательностей человеческого антитела. Последовательности человеческого антитела могут представлять собой последовательности природных человеческих антител или согласованные последовательности нескольких человеческих антител. См. Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993) иCarter et al., Международная заявка WO 92/22653. После идентификации гипервариабельных участков мышиного донорного иммуноглобулина и соответствующих человеческих акцепторных иммуноглобулинов следующей стадией является определение, какие остатки (если только есть такие остатки) из этих компонентов следует заместить для оптимизации свойств образующегося в результате гуманизированного антитела. Как правило, замена человеческих аминокислотных остатков на мышиные должна быть сведена к минимуму, так как введение мышиных остатков повышает риск того, что антитело вызовет у людей реакцию антитела человека на антитело козы (НАМА). Мониторинг НАМА ответа у конкретного больного или в клинических испытаниях можно осуществлять признанными в технике методами определения иммунного ответа. У больных, которым вводят гуманизированные антитела, можно оценивать иммуногенность в начале и в ходе проведения указанной терапии. НАМА-ответ измеряют, например, определяя антитела к гуманизированному терапевтическому реагенту в образцах сыворотки крови больных известным в технике методом, включая технологию резонанса на длине волны поверхностного плазмона (BIACORE) и/или тврдофазный ELISA анализ. Некоторые аминокислоты вариабельной области человеческой последовательности выбирают для замены, исходя из их возможного влияния на конформацию CDR и /или связывание с антигеном. Неестественное наложение мышиных CDR-участков на человеческую вариабельную область может привести к конформационным затруднениям, которые, если не корректировать с применением аминокислотных замен, приводят к утрате аффинности связывания. Отбор аминокислотных остатков для замены частично осуществляют с помощью компьютерного моделирования. Компьютерные аппаратные средства и программное обеспечение для получения трхмерного изображения молекул иммуноглобулина представлены в данном описании. Вообще говоря, молекулярные модели получают, исходя из решнных структур иммуноглобулиновых цепей или их областей. Ищут сходство аминокислотных последовательностей модельных цепей с цепями или областями решнных трхмерных структур и цепь(и) или область(и) с наибольшим сходством последовательностей выбирается(ются) в качестве отправной точки для построения молекулярной модели. Для моделирования- 12010469 выбирают цепи или модели, последовательности которых идентичны по меньшей мере на 50%, предпочтительно для моделирования выбирают последовательности, идентичные по меньшей мере на 60, 70, 80,90% или более. Решнные (расшифрованные) исходные структуры модифицируют, чтобы учесть (сделать поправку на) различия между действительными аминокислотами в моделируемых цепях или областях иммуноглобулина и аминокислотами в исходной структуре. Затем модифицированные структуры собирают в составной иммуноглобулин. Наконец, модель уточняют по минимуму энергии и проверяют,чтобы все атомы находились на соответствующем расстоянии друг от друга и чтобы длины связей и углы не выходили за допустимые с точки зрения химии пределы. Отбор аминокислотных остатков для замены можно также проводить, частично, изучая характеристики аминокислот, занимающих конкретное местоположение, или наблюдая на опыте эффекты замены или мутагенеза конкретной аминокислоты. Например, когда в мышиной вариабельной области и в выбираемой человеческой вариабельной области аминокислоты различаются, человеческую остовную аминокислоту обычно следует заменить эквивалентной остовной аминокислотой мышиного антитела, когда логично ожидать, что аминокислота:(1) непосредственно связывается с антигеном нековалентной связью,(2) прилегает к CDR-участку,(3) иным образом взаимодействует с CDR-участком (например, находится на расстоянии 3-6 от участка CDR, как определено компьютерным моделированием), или(4) участвует в VL-VH интерфейсе. Остатки, которые "непосредственно связываются с антигеном нековалентной связью", включают аминокислоты в положениях в остовных областях, где имеется высокая вероятность взаимодействия с аминокислотами антигена, принимая во внимание установленные химические взаимодействия, например, водородную связь, взаимодействие Ван дер Ваальса, гидрофобные взаимодействия и т.п.CDR и остовные области по определению Kabat et al. или Clothia et al., см. выше. Когда остовные остатки, по определению Kabat et al., см выше, составляют остатки структурной петли по определениюClothia et al., см. выше, аминокислоты мышиного антитела можно отбирать для замены в гуманизированное антитело. Остатки, которые "прилегают к CDR-участку", включают аминокислотные остатки в положениях, непосредственно прилегающих к одному или более CDR в первичной последовательности гуманизированной цепи иммуноглобулина, например, в положениях, непосредственно прилегающих кCDR и, будучи выбраны из акцептора, деформируют CDR и снижают аффинность. Помимо этого, прилегающие аминокислоты могут взаимодействовать непосредственно с антигеном (Amit et al., Science,233:747 (1986, и выбор этих аминокислот из донора может быть желательным для сохранения всех связей антигена, благодаря которым оригинальное антитело обладает аффинностью. Остатки, которые "иным образом взаимодействуют с CDR-участком", включают такие остатки, у которых с помощью анализа вторичной структуры определена ориентация, подходящая для того, чтобы влиять на участок CDR. В одном варианте изобретения остатки, которые "иным образом взаимодействуют с CDR-участком", определяют, анализируя трхмерную модель донорного иммуноглобулина (например, компьютерную модель). Трхмерная модель, как правило, оригинального донорного антитела, показывает, что некоторые аминокислоты вне участков CDR расположены близко к участкам CDR и имеют хорошую возможность взаимодействовать с аминокислотами участков CDR за счт водородных связей,сил Ван дер Ваальса, гидрофобного взаимодействия и т.д. В этих аминокислотных положениях можно выбрать скорее аминокислоту донорного иммуноглобулина, нежели аминокислоту акцепторного иммуноглобулина. Аминокислоты, соответствующие этому критерию, как правило, содержат атом в боковой цепи в пределах, примерно, 3 ангстремот некоего атома в CDR и должны иметь атом, который мог бы взаимодействовать с атомами CDR за счт известных химических взаимодействий, таких, как вышеперечисленные. В случае атомов, которые могут образовывать водородную связь, 3 - это расстояние между их ядрами, но в случае атомов, которые не образуют связь, 3 - это расстояние между их ван-дер-ваальсовыми поверхностями. Следовательно, в последнем случае расстояние между ядрами составляет около 6 (3 плюс сумма ван-дер-ваальсовых радиусов) для атомов, как предполагается, способных взаимодействовать. Во многих случаях расстояние между ядрами составляет от 4 или 5 до 6. При определении, может ли аминокислота взаимодействовать с участками CDR, предпочтительно не рассматривать последние 8 аминокислот тяжлой цепи CDR2 как часть CDR, так как с точки зрения структуры эти 8 аминокислот ведут себя скорее как часть каркаса. Аминокислоты, которые способны взаимодействовать с аминокислотами в CDR, можно идентифицировать ещ одним способом. Площадь поверхности, доступную для растворителя, вычисляют двумя путями: (1) в интактном антителе, и (2) в гипотетической молекуле, состоящей из антитела, у которого удалены его CDR. Значительная разница между этими значениями, около 10 квадратных ангстрем или более, показывает, что доступ остовной аминокислоты к растворителю, по меньшей мере, частично блокирован участ- 13010469 ками CDR, и, следовательно, у аминокислоты есть контакт с CDR. Площадь поверхности аминокислоты,доступную для растворителя, можно вычислить исходя из трхмерной модели антитела, используя алгоритмы, известные в технике (например, Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983) и Lee and Richards, J. Mol.Biol. 55:379 (1971. Остовные аминокислоты могут также иногда взаимодействовать с участками CDR опосредованно, влияя на конформацию другой остовной аминокислоты, которая, в свою очередь, контактирует с CDR. Известно, что аминокислоты в некоторых положениях в каркасе способны взаимодействовать с участками CDR во многих антителах (Clothia and Lesk, см. выше; Clothia et al., см. выше, и Tramontano etal., J. Mol. Biol. 215:175 (1990. Следует заметить, известно, что аминокислоты в положениях 2, 48, 64 и 71 лгкой цепи и 26-30, 71 и 94 тяжлой цепи (нумерация по Kabat) способны взаимодействовать с участками CDR многих антител. Аминокислоты в положениях 35 лгкой цепи и 93 и 103 тяжлой цепи, повидимому, также взаимодействуют с участками CDR. Во всех перечисленных положениях в гуманизированном иммуноглобулине предпочтительным является выбор скорее донорной аминокислоты, нежели акцепторной аминокислоты (когда они различаются). С другой стороны, некоторые остатки, способные взаимодействовать с участком CDR, такие как первые 5 аминокислот лгкой цепи, иногда можно выбирать из акцепторного иммуноглобулина, не утрачивая аффинности в гуманизированном иммуноглобулине. Остатки, которые "участвуют в VL-VH интерфейсе", или "остатки упаковки" включают те остатки на границе раздела (интерфейс) между VL и VH по определению, например, Novotny and Haber, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-16 (1985) или Clothia et al., см. выше. В целом, необычные остатки упаковки следует оставлять в гуманизированном антителе, если они отличаются от остатков в каркасах человеческих антител. В целом, заменяются одна или более аминокислот, удовлетворяющих вышеприведнным критериям. В некоторых вариантах изобретения заменяются все или большинство аминокислот, удовлетворяющих вышеприведнным критериям. Иногда когда имеется некоторая неясность, соответствует ли конкретная аминокислота вышеуказанным критериям, получают альтернативные варианты иммуноглобулинов, один из которых содержит эту конкретную замену, а другие нет. Полученные таким образом альтернативные версии иммуноглобулинов можно испытывать любым представленным в данном описании методом анализа заданной активности, и выбирают предпочтительный иммуноглобулин. Обычно участки CDR в гуманизированных антителах практически идентичны, и более обычно,идентичны соответствующим участкам CDR донорного антитела. Хотя обычно это нежелательно, иногда возможно сделать одну или более консервативных аминокислотных замен остатков CDR, не влияя заметно на аффинность связывания образующегося в результате гуманизированного иммуноглобулина. Под консервативными заменами понимают такие комбинации, как gly, ala, val, ile, leu; asp, glu; asn, gln;ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие остовные аминокислоты, необычные или "редкие" (минорные) для человеческого иммуноглобулина в этом положении. Эти аминокислоты могут быть заменены на аминокислоты в эквивалентном положении мышиного донорного антитела или в эквивалентных положениях более типичных человеческих иммуноглобулинов. Например, замена может быть желательной, когда аминокислота в человеческой остовной области акцепторного иммуноглобулина является редкой для этого положения, а соответствующая аминокислота в донорном иммуноглобулине обычна для этого положения в последовательностях человеческого иммуноглобулина; или когда аминокислота в акцепторном иммуноглобулине является редкой для этого положения и соответствующая аминокислота в донорном иммуноглобулине также является редкой, по сравнению с другими человеческими последовательностями. Эти критерии помогают гарантировать, что атипическая аминокислота каркаса человеческой последовательности не разрушит структуру антитела. Кроме того, замена необычной человеческой акцепторной аминокислоты на аминокислоту донорного антитела, которая случайно оказывается типичной для человеческих антител, может сделать гуманизированное антитело менее иммуногенным. Термин "редкий (минорный)", применяемый в данном описании, показывает, что аминокислота в данном положении встречается в репрезентативной выборке последовательностей, примерно, в менее чем 20%, но обычно, примерно, в менее чем 10% последовательностей; а термин "обычный, общий",применяемый в данном описании, указывает, что аминокислота в данном положении встречается в репрезентативной выборке последовательностей, примерно, в более чем 25%, но обычно, примерно, в более чем 50% последовательностей. Например, все человеческие последовательности вариабельной области лгкой и тяжлой цепи делят, соответственно, на "подгруппы" последовательностей, которые особенно гомологичны друг другу и имеют одинаковые аминокислоты в определнных важных положениях(Kabat et al., см. выше). При решении вопроса, является ли аминокислота в человеческой акцепторной последовательности "редкой" или "обычной" в человеческих последовательностях, часто предпочтительно рассматривать только человеческие последовательности в той же подгруппе, что и акцепторная последовательность. Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие остовные амино- 14010469 кислоты, которые идентифицируют как часть участка CDR по альтернативному определению Clothia etal., см. выше. Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие остовные аминокислоты, которые идентифицируют как часть участка CDR при определениях AbM и/или соединений. Следует отметить, что CDR1 в вариабельной области тяжлой цепи определяют как включающую остатки 26-32. Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие остовные остатки,которые соответствуют редкому или необычному донорному остовному остатку. Редкие или необычные донорные остовные остатки представляют собой такие остатки, которые являются редкими или необычными (по данному описанию) для мышиных антител в этом положении. Для мышиных антител подгруппу можно определить по Kabat, и положения остатков, которые отличаются от консенсусных, идентифицируют. Эти донорспецифические различия могут указать на соматическую мутацию в мышиной последовательности, которые повышают активность. Сохраняют необычные остатки, которые прогнозируемо влияют на связывание, тогда как остатки, которые, как показывает прогноз, не являются важными для связывания, можно заменить. Дополнительными кандидатами на замену являются остатки незародышевой линии в акцепторной остовной области. Например, когда цепь акцепторного антитела (например, цепь человеческого антитела, в значительной степени идентичную цепи донорного антитела) выравнивают с цепью антитела зародышевой линии (аналогичным образом в значительной степени идентичной донорной цепи), остатки, не соответствующие каркасу акцепторной цепи и каркасу цепи зародышевой линии, можно заменить на соответствующие остатки из последовательности зародышевой линии. Иные, нежели специфические аминокислотные замены, обсуждаемые выше, остовные области гуманизированных иммуноглобулинов обычно практически идентичны, и более обычно, идентичны остовным областям человеческих антител, из которых они образованы. Конечно, многие аминокислоты остовной области вносят малый непосредственный вклад или не вносят никакого непосредственного вклада в специфичность или в аффинность антитела. Таким образом, многие отдельные консервативные замены остовных остатков могут переноситься без заметного изменения специфичности или аффинности получающегося в результате гуманизированного иммуноглобулина. Таким образом, в одном варианте изобретения вариабельная остовная область гуманизированного иммуноглобулина по меньшей мере на 85% идентична последовательности человеческой вариабельной остовной последовательности или консенсусу таких последовательностей. В другом варианте изобретения вариабельная остовная область гуманизированного иммуноглобулина по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 95%, ещ более предпочтительно на 96, 97, 98 или на 99% идентична последовательности человеческой вариабельной остовной последовательности или консенсусу таких последовательностей. Однако в целом такие замены нежелательны. Предпочтительно, когда гуманизированные антитела проявляют специфическую аффинность в отношении антигена, составляющую по меньшей мере 107, 108, 109 или 1010 M-1. Обычно верхний предел аффинности связывания гуманизированных антител с антигеном в три, четыре или пять раз больше верхнего предела аффинности связывания донорного иммуноглобулина. Часто нижний предел аффинности связывания также в три, четыре или пять раз больше нижнего предела аффинности связывания донорного иммуноглобулина. Или же аффинность связывания можно сравнить с аффинностью связывания гуманизированного антитела, не имеющего замен (например, содержащего донорные участки CDR и акцепторные FR, но не содержащие замены FR). В таких примерах предпочтительное связывание оптимизированного антитела (с заменами) по крайней мере в два-три раза больше или в три-четыре раза больше, чем связывание незамещнного антитела. С целью сравнения можно определять активность различных антител, например, с помощью BIACORE (т.е. резонанса на длине волны поверхностного плазмона с применением немеченых реагентов) или анализами конкурентного связывания. С. Получение гуманизированных антител 3D6. Предпочтительный вариант настоящего изобретения включает гуманизированное антитело к Nконцу A, в частности, для применения в терапевтических и/или диагностических методах по данному описанию. Особенно предпочтительным исходным материалом для получения гуманизированных антител является 3D6. 3D6 специфично в отношении N-конца A и, как было показано, опосредует фагоцитоз(например, индуцирует фагоцитоз) амилоидных бляшек (см. примеры I-V). Клонирование и секвенирование кДНК, кодирующей вариабельные области тяжлой и лгкой цепи антитела 3D6, описано в примере VI. Соответствующие последовательности человеческого акцепторного антитела определяют с помощью компьютерного сравнения аминокислотных последовательностей вариабельных областей мышиного антитела с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение осуществляют отдельно для тяжлой и для лгкой цепей, но принципы этого сравнения одинаковы. В частности, вариабельные домены человеческих антител, в которых наблюдается высокая степень идентичности остовных последовательностей с мышиными VL и VH основными областями, идентифицируют по запросу к базе данных Kabat, используя NCBI BLAST (доступ через интернет-сервер National Institutes of Health NCBI), с- 15010469 соответствующими мышиными остовными последовательностями. В одном варианте изобретения выбирают акцепторные последовательности, более чем на 50% идентичные мышиным донорным последовательностям. Предпочтительно выбирают последовательности акцепторных антител с идентичностью 60,70, 80, 90% или более. Компьютерное сравнение 3D6 показало, что последовательность лгкой цепи 3 В 6 имеет наиболее идентичные человеческим лгким цепям подтипа каппа II, и что у последовательностей тяжлых цепей 3 В 6 наиболее высокая степень идентичности с человеческими тяжлыми цепями подтипа III, по определению Kabat et al., см. выше. Таким образом, лгкие и тяжлые человеческие остовные области, предпочтительно, получают из человеческих антител этих подтипов или из консенсусных последовательностей таких подтипов. Предпочтительные человеческие вариабельные области лгкой цепи, которые наиболее идентичны соответствующей области 3D6, получены из антител, имеющих по Kabat ID следующие номера: 019230, 005131, 005058, 005057, 005059, U21040 и U41645, причм более предпочтительным является антитело 019230. Предпочтительные человеческие вариабельные области тяжлой цепи, которые наиболее идентичны соответствующей области 3D6, получены из антител, имеющих по Kabat ID следующие номера: 045919, 000459, 000553, 000386 и М 23691, причм более предпочтительным является антитело 045919. Остатки для замены выбираются следующим образом. Если в вариабельной области 3D6 и в эквивалентной человеческой вариабельной области аминокислоты различаются, человеческую остовную аминокислоту обычно следует заменить эквивалентной остовной аминокислотой мышиного антитела,когда логично ожидать, что аминокислота:(1) непосредственно связывается с антигеном нековалентной связью,(2) прилегает к CDR-участку, является частью участка CDR по альтернативному определению,предложенному Clothia et al., см. выше, или другим способом взаимодействует с участком CDR (например, в пределах, примерно, 3 от участка CDR) (например, аминокислоты в положениях L2, Н 49 и Н 94 3D6), или(3) участвует в VL-VH интерфейсе (например, аминокислоты в положениях L36, L46 и Н 933D6). Компьютерное моделирование вариабельных областей тяжлой и лгкой цепей антитела 3D6 и гуманизация антитела 3D6 описаны в примере VII. Коротко говоря, трхмерную модель создают на основе наиболее близких решнных структур мышиного антитела для тяжлой и лгкой цепей. С этой целью антитело, обозначенное 1CR9 (Protein Data Bank (PDB) ID: 1CR9, Kanyo et al., J. Mol. Biol. 293:855(1999, выбирают в качестве матрицы для моделирования лгкой цепи 3D6, а антитело, обозначенное 10PG (PDB ID: 10PG, Kodandapani et al., J. Biol. Chem. 270:2268 (1995, выбирают в качестве матрицы для моделирования тяжлой цепи. Модель далее уточняют с помощью нескольких стадий минимизации энергии для выявления нежелательных атомных контактов и оптимизации электростатических и ван-дерваальсовых взаимодействий. Решнную структуру 1qkz (PDB ID: 1QKZ, Derrick et al., J. Mol. Biol. 293:81(1999 выбирают в качестве матрицы для моделирования CDR3 тяжлой цепи, так как при сравнении первичных структур (выравнивании) у последовательностей 3D6 и 1OPG не наблюдается заметной гомологии в этой области. Информацию о трхмерной структуре антител, представленных в данном описании, можно получить в банке данных Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank (PDB). Свободный доступ в PDB можно получить через World Wide Web (сеть интернет), и PDB описан Berman et al.(2000) Nucleic Acids Research, 28:235. Компьютерное моделирование структуры 3D6 может, в свою очередь, служить отправной точкой для прогнозирования трхмерной структуры антитела, содержащего гипервариабельные участки 3D6, замещаемые в человеческих остовных структурах. Можно конструировать дополнительные модели, представляющие структуру, получающуюся по мере введения дополнительных аминокислотных замен. В целом, желательна замена одной, большинства или всех аминокислот, удовлетворяющих вышеуказанным критериям. Соответственно, гуманизированные антитела по настоящему изобретению обычно содержат замену остовного остатка человеческой лгкой цепи соответствующим остатком 3D6, по меньшей мере в 1, 2 или 3 и, более обычно, в 4 из следующих положений: L1, L2, L3 и L46. Гуманизированные антитела также обычно содержат замену остовного остатка человеческой тяжлой цепи соответствующим остатком 3D6 по меньшей мере в 1, 2 и иногда 3 следующих положений: Н 49, Н 93 и Н 94. Гуманизированные антитела могут содержать также замену остовного остатка человеческой тяжлой цепи соответствующим остатком зародышевой линии по меньшей мере 1, 2 и иногда 3 следующих положений: Н 74, Н 77 и Н 89. Однако иногда, когда имеется некоторая неясность, соответствует ли конкретная аминокислота вышеуказанным критериям, получают альтернативные варианты иммуноглобулинов, один из которых содержит эту конкретную замену, а другие нет. В примерах, в которых замена на остаток мышиной последовательности вводит остаток, редкий (минорный) для конкретного положения человеческого иммуноглобулина, желательным может быть тестирование антитела - с конкретной заменой и без не - на активность. Если активность (например, аффинность связывания и/или специфичность связывания) с заменой и без замены, примерно, одинакова, может быть предпочтительным антитело без замены, так как- 16010469 полагают, что оно вызывает менее сильный НАНА ответ, по данному описанию. Другими кандидатами для замены являются человеческие остовные аминокислоты, необычные в данном положении для иммуноглобулинов. Эти аминокислоты могут быть заменены аминокислотами,находящимися в эквивалентном положении более типичных человеческих иммуноглобулинов. Или же аминокислоты в эквивалентных положениях в мышином 3D6 можно вводить в человеческие остовные области, когда такие аминокислоты являются типичными для человеческого иммуноглобулина в эквивалентных положениях. В дополнительных вариантах изобретения, когда акцепторный иммуноглобулин с человеческой лгкой цепью представляет собой Kabat ID 019230, лгкая цепь содержит замены по меньшей мере в 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или, более обычно, в 13 из следующих положений: L7, L10, L12, L15, L17, L39,L45, L63, L78, L83, L85, L100 или L104. В дополнительных вариантах изобретения, когда акцепторный иммуноглобулин с человеческой тяжлой цепью представляет собой Kabat ID 045919, тяжлая цепь содержит замены по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или, более обычно, в 15 из следующих положений: H3, Н 5, Н 13, Н 16, Н 19, Н 40, Н 41, Н 42, Н 44, Н 72, Н 77, Н 82 А, Н 83, Н 84 или Н 102. Аминокислоты в этих положениях заменяют на аминокислоты из эквивалентного положения человеческого иммуноглобулина, содержащего более типичный аминокислотный остаток. Примеры аминокислот,подходящих для замены, показаны на фиг. 1 и 2. Другие кандидаты для замены представляют собой остатки незародышевой линии, расположенные в остовной области. Проведнное с помощью компьютера сравнение 3 В 6 с известными последовательностями зародышевой линии показывает, что тяжлые цепи с наибольшей степенью идентичности последовательностей включают последовательности вариабельных областей зародышевой линии VH3-48,VH3-23, VH3-7, VH3-21 и VH3-11, причм предпочтительной является VH3-23. Совмещение (выравнивание) последовательностей Kabat ID 045919 и VH3-23 показывает, что остатки Н 74, Н 77 и/или Н 89 можно выбрать для замены на соответствующие остатки зародышевой линии (например, остатки Н 74,Н 77 и/или Н 89 при сравнении Kabat ID 045919 с VH3-23). Аналогично последовательности зародышевой линии, имеющие наибольшую степень идентичности последовательности лгкой цепи, включают A1,A17, А 18, А 2 и А 19, причем предпочтительной является А 19. Остатки выбранного акцепторного каркаса лгкой цепи, не совпадающие с остатками этих последовательностей зародышевой линии, можно выбирать для замены на соответствующий остаток зародышевой линии. В табл. 1 суммированы результаты анализа последовательностей областей VH и VL антитела 3D6. Представлены дополнительные структуры мыши и человека, которые можно использовать для компьютерного моделирования антитела 3D6 и дополнительных человеческих антител, а также последовательности зародышевой линии, которые можно использовать при выборе аминокислотных замен. Редкие остатки мышиных последовательностей также представлены в табл. 1. Редкие остатки мышиных последовательностей идентифицируют, сравнивая донорные VL и/или VH последовательности с последовательностями других членов подгруппы, к которой принадлежат донорные последовательности VL и/или VH,и определяют положения остатков, которые отличаются от консенсуса. Эти донорспецифические различия могут указывать на соматические мутации, которые повышают активность. Обычные или редкие остатки, расположенные рядом с сайтом связывания, вероятно, могут контактировать с антигеном, тогда желательно сохранить остаток мышиной последовательности. Однако, если необычный остаток мышиной последовательности не является важным для связывания, предпочтительно использовать соответствующий акцепторный остаток, так как остаток мышиной последовательности может создать иммуногенные неоэпитопы в гуманизированном антителе. В тех ситуациях, когда необычный остаток в донорной последовательности действительно является обычным остатком в соответствующей акцепторной поверхности, предпочтительным, естественно, является акцепторный остаток. тяжлая цепь и лгкая цепь одного и того же антитела Последовательности Kabat ID, на которые даны ссылки в данном описании, являются общедоступными, например, через базу данных Northwestern University Biomedical Engineering Department's KabatDatabase of Sequences of Proteins of Immunological Interest. Информацию о трхмерной структуре антител,представленную в данном описании, можно получить через банк данных Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank (PDB). Свободный доступ в PDB можно получить через интернет(World Wide Web), путь описан Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research, p. 235-242. Доступ к последовательностям гена зародышевой линии, на которые имеются ссылки в данном описании, можно получить через базу данных последовательностей в коллекциях V генов Igh, Ig каппа and Ig лямбда зародышевых линий Национального Центра Информации по Биотехнологии (National Center for Biotechnology Informa- 18010469tion (NCBI (в качестве отделения Национальной Медицинской Библиотеки (National Library of Medicine(NLM при Национальном Институте Здоровья (National Institutes of Health (NIH. Поиск гомологии в базе данных NCBI "Ig Germline Genes" ("Гены Ig зародышевой линии") предоставлен IgG BLAST. В предпочтительном варианте гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит(i) лгкую цепь, включающую вариабельную область, содержащую участки CDR VL мышиного 3D6, и человеческий акцепторный каркас (остов), причм остов содержит по меньшей мере один, предпочтительно два, три или четыре остатка, выбираемых из группы, состоящей из L1, L2, L36 и L46, замещнных на соответствующий остаток 3D6, и (ii) тяжлую цепь, включающую участки 3D6 VH CDR, и человеческий акцепторный каркас (остов), причм остов содержит по меньшей мере один, предпочтительно два,или три остатка, выбираемых из группы, состоящей из Н 49, Н 93 и Н 94, замещнных на соответствующий остаток 3D6, и, необязательно, по меньшей мере один, предпочтительно два или три остатка, выбираемых из группы, состоящей из Н 74, Н 77 и Н 89, заменяется на соответствующий остаток зародышевой линии человека. В более предпочтительном варианте гуманизированное антитело по изобретению содержит (i) лгкую цепь, включающую вариабельную область, содержащую участки CDR VL мышиного 3D6, и человеческий акцепторный каркас (остов), причм остов содержит остаток 1, замещнный на tyr (Y), остаток 2,замещнный на val (V), остаток 36, замещнный на leu (L), и/или остаток 46, замещнный на arg (R), и (ii) тяжлую цепь, включающую участки 3D6 VH CDR, и человеческий акцепторный каркас (остов), причм остов содержит остаток 49, замещнный на ala (А), остаток 93, замещнный на val (V), и/или остаток 94,замещнный на arg (R), и, необязательно, содержит остаток 74, замещнный на ser (S), остаток 77, замещнный на thr (T), и/или остаток 89, замещнный на val (V). В особенно предпочтительном варианте гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные особенности по данному описанию и, кроме того, проявляет по меньшей мере однуA1-42 (например, определяемый методом ELISA); (2) связывает A в бляшках (например, окрашивание бляшек AD и/или PDAPP); (3) связывает A с аффинностью связывания, в два-три раза более высокой по сравнению с химерным 3D6 (например, 3D6, содержащие мышиные участки CDR и человеческие акцепторные FR); (4) опосредует фагоцитоз A (например, при анализе фагоцитоза ex vivo по данному описанию); и (5) преодолевает гематоэнцефалический барьер (например, демонстрирует кратковременную локализацию в мозгу, например, мышиной модели PDAPP по данному описанию). В другом варианте гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные особенности по данному описанию, связывает A до некоторой степени или с аффинностью, достаточной для проявления по меньшей мере одного из следующих in vivo эффектов: (1) уменьшение содержания A бляшек; (2) предупреждение образования бляшек; (3) снижение уровней растворимого А; (4) уменьшение нейритной патологии, обусловленной амилоидным нарушением; (5) смягчение или ослабление по меньшей мере одного физиологического симптома, обусловленного амилоидным нарушением; и/или (6) улучшение когнитивной функции. В другом варианте гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные особенности по данному описанию и специфически связывается с эпитопом, содержащим остатки 1-5 или 37 A. 3. Человеческие антитела. Человеческие антитела против A получают различными методами, описанными ниже. Некоторые человеческие антитела выбирают с экспериментально конкурентным связыванием, или иным способом,чтобы иметь такую же специфичность эпитопа, что и конкретное мышиное антитело, как, например, одно из мышиных моноклональных антител по данному описанию. Можно также проводить скрининг человеческих антител на конкретную специфичность эпитопа, используя в качестве иммуногена только фрагмент A, и/или скрининг антител против коллекции делеционных мутантов A. Предпочтительно,человеческие антитела проявляют специфичность человеческого IgG1 изотипа. а. Методология триом. Основной способ и пример партнра для слияния клеток, SPAZ-4, для применения по этому способу описан в Oestberg et al., Hybridoma 2:361 (1983); Oestberg, патент США 4634664; и Engleman et al., патент США 4634666 (каждый из этих документов вводится ссылкой во всей полноте для любых целей). Полученные этим методом клеточные линии, продуцирующие антитела, называются триомы, потому что они происходят от трх клеток: двух человеческих и одной мышиной. Сначала клеточную линию мышиной миеломы сливают с человеческим В-лимфоцитом с целью получения продуцирующей неантитело ксеногенной гибридной клетки, такой как клетка линии SPAZ-4, описанной Oestberg et al., см. выше. Затем ксеногенную клетку сливают с иммунизированным человеческим В-лимфоцитом с целью получения продуцирующей антитело триомной клеточной линии. Было найдено, что триомы продуцируют антитело более устойчиво, чем обычные гибридомы, полученные при использовании человеческих клеток. Иммунизированные В-лимфоциты получают из крови, селезнки, лимфатических узлов или костного мозга человека-донора. Если требуются антитела против конкретного антигена или эпитопа, предпоч- 19010469 тительно для иммунизации использовать этот антиген или его эпитоп. Для иммунизации in vivo или invitro В клетки обычно берут у человека, иммунизированного A, его фрагментом, более протяжнным полипептидом, содержащим A или фрагмент, или антиидиотипическим антителом против антитела кA. В некоторых методах В клетки берут у того же больного, которого в конечном итоге будут лечить,вводя антитела. Для иммунизации in vitro В-лимфоциты обычно экспонируют с антигеном в течение 7-14 дней в таких средах, как RPMI-1640 (Engleman, см. выше), дополненной 10% человеческой плазмой. Иммунизированные В-лимфоциты сливают с ксеногенной гибридной клеткой, такой как SPAZ-4,хорошо известными методами. Например, клетки обрабатывают 40-50% полиэтиленгликолем с М.В.(молекулярной массой) 1000-4000, примерно при 37 С в течение 5-10 мин. Клетки выделяют из слитой(реакционной) смеси и выращивают в средах, селективных относительно требуемых гибридов (например, HAT или АН). Клоны, секретирующие антитела с заданной специфичностью связывания, идентифицируют, анализируя культуральную среду триом на способность связываться с A или его фрагментом. Триомы, продуцирующие человеческие антитела с заданной специфичностью, субклонируют методом ограниченного разбавления и выращивают in vitro в культуральной среде. Получают клеточные линии триом, а затем проверяют способность связывать A или его фрагмент. Хотя триомы генетически устойчивы, они не продуцируют высокие уровни антител. Уровни экспрессии можно повысить, клонируя гены антител из триом в один или более векторов экспрессии и трансформируя вектор в стандартные клеточные линии млекопитающих, бактерий или дрожжей.b. Трансгенные млекопитающие, отличные от человека. Человеческие антитела против A можно также получать из трансгенных млекопитающих, отличных от человека, содержащих трансгены, кодирующие, по меньшей мере, сегмент локуса человеческого иммуноглобулина. Обычно локус эндогенного иммуноглобулина таких трансгенных млекопитающих функционально инактивирован. Предпочтительно, сегмент человеческого локуса иммуноглобулина включает нереаранжированные последовательности компонентов тяжлой лгкой цепи. Как инактивации генов эндогенного иммуноглобулина, так и внедрение генов экзогенного иммуноглобулина можно осуществить нацеленной гомологичной рекомбинацией или внедрением хромосом YAC. Трансгенные млекопитающие, полученные в результате этого процесса, способны функционально реаранжировать последовательности компонентов иммуноглобулина и экспрессировать спектр антител различных изотипов,кодируемых генами человеческого иммуноглобулина, не экспрессируя гены эндогенного иммуноглобулина. Получение и свойства млекопитающих, обладающих такими свойствами, подробно описаны, например, в Lonberg et al., Международная заявка WO 93/12227 (1993); патенты США 5877397, 5874299,5814318, 5789650, 5770429, 5661016, 5633425, 5625126, 5569825, 5545806, Nature 148:1547 (1994), NatureBiotechnology 14:826 (1996), Kucherlapati, Международная заявка WO 91/10741 (1991. Особенно пригодными являются трансгенные мыши. Антитела против A получают иммунизацией трансгенного млекопитающего (не человека), например, описанного Lonberg или Kucherlapati, см. выше, например, слиянием В-клеток таких млекопитающих с соответствующими клеточными линиями миеломы по обычной методике Kohler-Milstein. Поликлональные антитела человека можно также получать в форме сыворотки людей, иммунизированных иммуногенным агентом. Необязательно такие поликлональные антитела можно концентрировать аффинной очисткой с использованием амилоидного пептида в качестве аффинного реагента. с. Метод получения и выявления фагов (Фаг-дисплей метод). Другим методом получения антител человека против A является скрининг библиотеки на основе ДНК человеческих В-клеток согласно обычному протоколу, описанному Huse et al., Science 246:12751281 (1989). Как описано для метода триомы, такие В можно получать от человека, иммунизированногоA, фрагментами, более протяжнными полипептидами, содержащими A, или фрагментами или антииодиотипическими антителами. Необязательно такие В клетки берут у того же больного, которого в конечном итоге будут лечить, вводя антитела. Выбирают антитела, связывающиеся с A, или их фрагменты. Затем последовательности, кодирующие такие антитела (или связывающие фрагменты), клонируют и амплифицируют. Методика, описанная Huse, более эффективна в комбинации с методом получения и выявления фагов. См., например, Dower et al., Международная заявка WO 91/17271, McCafferty et al.,Международная заявка WO 92/01047, Herzig et al., патент США 5877218, Winter et al., патент США 5871907, Winter et al., патент США 5858657, Holliger et al., патент США 5837242, Johnson et al., патент США 5733743 и Hoogenboom et al., патент США 5565332. В этих методах получают библиотеки фагов,каждый из компонентов которой визуализует различает антитела на своей внешней поверхности. Антитела обычно визуализуются в виде фрагментов Fv или Fab. Фаги, визуализующие антитела с заданной специфичностью, выбирают по повышению аффинности в отношении пептида A или его фрагмента. В варианте метода получения и выявления фагов можно получать человеческие антитела, обладающие специфичностью связывания выбранного мышиного антитела. См. Winter, Международная заявка WO 92/20791. При использовании этого метода в качестве исходного материала выбирают вариабельную область тяжлой или лгкой цепи выбранного мышиного антитела. Например, если в качестве исходного материала выбирают вариабельную область лгкой цепи, создают библиотеку фагов, компонен- 20010469 ты которой визуализуют одну и ту же вариабельную область лгкой цепи (т.е. мышиный исходный материал) и разную вариабельную область тяжлой цепи. Вариабельные области тяжлой цепи получают при использовании библиотеки вариабельных областей реаранжированной человеческой тяжлой цепи. Выбирают фаг, проявляющий сильное специфическое связывание с A (например, по меньшей мере 108 и предпочтительно по меньшей мере 109 M-1). Вариабельная область человеческой тяжлой цепи этих фагов служит затем в качестве исходного материала для построения дополнительной библиотеки фагов. В этой библиотеке каждый фаг выявляет одну и ту же вариабельную область тяжлой цепи, например, область, идентифицируемую при использовании первой фаг-дисплей библиотеки, и различную вариабельную область лгкой цепи. Вариабельные области лгкой цепи получают при использовании вариабельных областей реаранжированной человеческой лгкой цепи. И снова выбирают фаг, проявляющий сильное специфическое связывание с A. Эти фаги выявляют вариабельные области полностью человеческих антител против A. Эти антитела обычно обладают такой же или аналогичной специфичностью в отношении эпитопа, что и мышиный исходный материал. 4. Получение вариабельных областей. Сделанный концептуальный выбор CDR и остовных компонентов гуманизированных иммуноглобулинов позволяет применять многие методы получения таких иммуноглобулинов. Вследствие вырожденности кода ряд нуклеотидных последовательностей кодирует каждую аминокислотную последовательность иммуноглобулина. Требуемые нуклеотидные последовательности можно получать de novo тврдофазным синтезом ДНК или ПЦР (PCR) мутагенезом ранее полученного варианта заданного полинуклеотида. Опосредуемый олигонуклеотидами мутагенез является предпочтительным методом получения вариантов ДНК с заменами, делециями и инсерциями, кодирующей целевой полипептид. См. Alderman et al., DNA 2:183 (1983). Короче говоря, ДНК, кодирующую целевой полипептид, изменяют гибридизацией олигонуклеотида, кодирующего заданную мутацию, с однонитевой ДНК-матрицей. После гибридизации используют ДНК-полимеразу для синтеза полной второй комплементарной нити матрицы,которая вводит олигонуклеотидный праймер и кодирует выбранное изменение в ДНК, кодирующей целевой полипептид. 5. Отбор константных областей. Вариабельные сегменты антител, получение которых описано выше (например, вариабельные области тяжлой и лгкой цепи химерных, гуманизированных или человеческих антител), как правило, связываются, по меньшей мере, с участком константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина. Человеческие последовательности ДНК константной области можно выделить, применяя хорошо известные методы, из ряда человеческих клеток, но, предпочтительно, иммортализованных В клеток (Kabat et al., см. выше, и Liu et al., Международная заявка WO87/02671) (каждый из источников вводится ссылкой во всей полноте для любых целей). Обычно антитело содержит константные области как лгкой, так и тяжлой цепи. Константная область тяжлой цепи обычно включает участки СН 1, шарнирный, CH2, CH3 и CH4. Антитела по данному описанию включают антитела, содержащие все типы константных областей, включая IgGM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любой изотип, включая IgG1,IgG2, IgG3 и IgG4. Выбор константной области зависит, частично, от того, нужна ли антителозависимая комплемент-опосредованная и/или клеточно-опосредованная токсичность. Например, изотипы IgG1 иIgG3 обладают активностью комплемента, а изотипы IgG2 и IgG4 не обладают. Когда требуется, чтобы антитело (например, гуманизированное антитело) проявляло цитотоксическую активность, константный домен представляет собой константный домен фиксации комплемента, класса, как правило, IgG1. Когда такая цитотоксическая активность нежелательна, константный домен может быть класса IgG2. На выбор изотипа может также влиять прохождение антитела в мозг. Предпочтительным является человеческий изотип IgG1. Константные области лгкой цепи могут быть лямбда или каппа. Гуманизированное антитело может содержать последовательности более чем одного класса или изотипа. Антитела могут экспрессировать в виде тетрамеров, содержащих две лгкие и две тяжлые цепи, в виде отдельных тяжлых цепей, лгких цепей, в виде Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, или в виде одноцепных антител, в которых вариабельные домены тяжлой и лгкой цепи связаны через спейсер. 6. Экспрессия рекомбинантных антител. Химерные, гуманизированные и человеческие антитела получают обычно рекомбинантной экспрессией. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области лгкой и тяжлой цепи, необязательно связанные с константными областями, встраивают в вектор экспрессии. Лгкую и тяжлую цепи можно клонировать в один и тот же вектор экспрессии или в разные векторы экспрессии. Сегменты ДНК, кодирующие цепи иммуноглобулина, функционально связаны с регуляторными последовательностями в векторе(ах) экспрессии полипептидов иммуноглобулина. Последовательности, контролирующие экспрессию, включают, но без ограничения, промоторы (например, ассоциируемые с природными или гетерологичные промоторы), сигнальные последовательности, энхансерные элементы и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительно, последовательности, контролирующие экспрессию,и эукариотические промоторные системы в векторах способны трансформировать или трансфицировать эукариотические клетки-хозяева. Когда вектор внедрн в подходящего хозяина, хозяина выдерживают в- 21010469 условиях, пригодных для экспрессии нуклеотидных последовательностей на высоком уровне, и для сбора и очистки перекрстно реагирующих антител. Эти векторы экспрессии обычно реплицируются в организмах-хозяевах либо в виде эписом, либо как часть целой хромосомной ДНК хозяина. Обычно векторы экспрессии содержат маркры селекции(например, устойчивости к ампициллину, устойчивости к гигромицину, устойчивости к тетрациклину или устойчивости к неомицину) для того, чтобы можно было обнаружить клетки, трансформированные при использовании последовательностей заданных ДНК (см., например, Itakura et al., патент США 4704362). Е. coli представляет собой один из прокариотических хозяев, особенно пригодный для клонирования полинуклеотидов (например, последовательностей ДНК) по данному изобретению. Другие хозяева микробного происхождения, пригодные для использования, такие как Bacillus subtilus, и другие энтеробактерии, такие как Salmonella, Serratia и различные виды Pseudomonas. В этих прокариотических хозяевах можно также получать векторы экспрессии, которые, как правило, будут содержать последовательности, контролирующие экспрессию, совместимые с клетками-хозяевами (например, ориджин репликации). Кроме этого, может присутствовать любое количество различных хорошо известных промоторов,таких как промоторная система лактозы, промоторная система триптофана (trp), промоторная система бета-лактамазы или промоторная система фага лямбда. Как правило, промоторы контролируют экспрессию, необязательно при участии оператора, и имеют сайт связывания рибосом и т.п., для инициации и завершения транскрипции и трансляции. Другие микробы, такие как дрожжи, также применяют для экспрессии. Предпочтительным хозяином среди клеток дрожжей являются Saccharomyces с подходящими векторами, содержащими последовательности, контролирующие экспрессию (например, промоторы), ориджин репликации, терминирующие последовательности и т.п., по желанию. Типичные промоторы включают 3-фосфоглицераткиназу и другие гликолитические ферменты. Индуцибельные промоторы векторов дрожжей включают, наряду с другими, промоторы алкогольдегидрогеназы, изоцитохром С и ферменты, отвечающие за утилизацию мальтозы и галактозы. Помимо микроорганизмов, для экспрессии и продуцирования полипептидов по данному изобретению (например, полинуклеотидов, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты), можно также использовать клеточные культуры тканей млекопитающих. См. Winnacker, From Genes to Clones, VCHPublishers, N.Y., N.Y. (1987). На самом деле предпочтительными являются эукариотические клетки, так как в технике получен ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать гетерологичные белки (например, интактные иммуноглобулины), эти линии клеток хозяев включают СНО клеточные линии, различные клеточные линии Cos, клетки HeLa предпочтительно, клеточные линии миеломы, или трансформированные В-клетки или гибридомы. Предпочтительно, эти клетки не являются человеческими клетками. Векторы экспрессии в этих клетках могут включать последовательности, контролирующие экспрессию, такие как ориджин репликации, промотор, энхансер (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49(1986, и необходимые сайты информации о процессинге, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты аденилирования и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительными последовательностями, контролирующими экспрессию, являются промоторы генов иммуноглобулина, SV40, аденовируса, вируса бычьей папилломы, цитомегаловируса и т.п. См. Со et al., J. Immunol. 148:1149 (1992). Или же последовательности, кодирующие антитело, можно встраивать в трансгены для внедрения в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке трансгенного животного (см., e.g.,Deboer et al., US 5741957, Rosen, US 5304489, and Meade et al., US 5849992). Подходящие трансгены включают кодирующие последовательности лгкой и/или тяжлой цепей при функциональном связывании с промотором и энхансером специфического гена молочной железы, такого как казеин или беталактоглобулин. Векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, представляющие интерес(например, кодирующие последовательности и последовательности, контролирующие экспрессию тяжлой и лгкой цепи), можно перенести в клетку-хозяина хорошо известными методами, которые меняются в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, в прокариотических клетках обычно используют трансфекцию с хлоридом кальция, тогда как кальций-фосфатный метод, электропорацию, липофекцию,бомбардировку микрочастицами или вирусную трансфекцию можно использовать для других клетокхозяев. (См., как правило, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring HarborPress, 2nd ed., 1989. Другие методы, применяемые для трансформации клеток млекопитающих, включают применение полибрена, слияние протопластов, липосомы, электропорацию и микроинъекции (См.,как правило, выше, Sambrook et al.). С целью получения трансгенных животных можно вводить трансгены в виде микроинъекций в оплодотворнные ооциты или можно внедрять в геном эмбриональных стволовых клеток, а ядра таких клеток переносить в безъядерные (энуклированные) ооциты. Когда тяжлую и лгкую цепи клонируют в раздельные векторы экспрессии, векторы котрансфицируют, достигая экспрессии и упорядоченной структуры интактных иммуноглобулинов. После экспрессии целые антитела, их димеры, отдельные лгкие и тяжлые цепи или другие формы иммуноглобулина по данному изобретению можно очищать стандартными методами, известными в технике, включая осажде- 22010469 ние сульфатом аммония, аффинную колоночную хроматографию, колоночную хроматографию, ВЭЖХ,гель-электрофорез и т.п. (см., как правило, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982. Для фармацевтических целей предпочтительными являются иммуноглобулины с гомогенностью по меньшей мере около 90-95%, а наиболее предпочтительной является гомогенность 98-99% или выше. 7. Фрагменты антител. В объм настоящего изобретения также включены фрагменты антител. В одном варианте изобретения предлагаются фрагменты нечеловеческих, химерных и/или человеческих антител. В другом варианте изобретения охватываются фрагменты гуманизированных антител. Как правило, эти фрагменты проявляют специфическое связывание с антигеном с аффинностью по меньшей мере 107, а более обычно 108 или 109 M-1. Фрагменты гуманизированных антител включают отдельные тяжлые цепи, лгкие цепи Fab,Fab' F(ab')2, Fabc и Fv. Фрагменты получают методом рекомбинантной ДНК или ферментативной или химической фрагментацией молекулы интактных иммуноглобулинов. 8. Испытание терапевтической активности антител на животных моделях. В группах 7-8-месячных мышей PDAPP каждой мыши инъецируют 0,5 мг поликлональных антител против A или специфичных против A моноклональных антител в PBS. Все препараты антител очищают, чтобы они имели низкие уровни эндотоксинов. Можно получать моноклональные антитела против фрагмента, инъецируя фрагмент или более протяжнную форму A мыши, получая гибридомы и проводя скрининг гибридом на антитело, которое специфически связывается с заданным фрагментом A, не связываясь с другими неперекрывающимися фрагментами A. Мышам инъецируют внутрибрюшинно (интраперитонеально) количество, необходимое, чтобы поддерживать в течение 4 месяцев в кровотоке концентрации антитела, измеряемые титром ELISA, более чем 1/1000, по определению методом ELISA, относительно A 42 или другого иммуногена. Осуществляют перманентный контроль титров и мышей умерщвляют по окончании 6-месячного периода инъекций. Гистохимические исследования, определение уровней A и токсикологические исследования осуществляют post mortem. В каждой группе по десять мышей. 9. Скрининг антител на активность очищения. Данное изобретение также охватывает способы скрининга антитела на активность очищения от амилоидного отложения или любого другого антигена, или ассоциированного биологического объекта,которое требует активности очищения. Для скрининга на активность против амилоидного отложения образец ткани мозга больного болезнью Альцгеймера или животная модель с характерной для болезни Альцгеймера патологией контактирует с патогенными клетками, несущими рецептор Fc, такими как микроглия (микроглиоциты), и испытуемым антителом в среде in vitro. Фагоциты могут быть первичной культурой или клеточной линией, такой как BV-2, C8-B4 или THP-1. В некоторых методах компоненты объединяют в микроскопический препарат для упрощения контроля под микроскопом. В некоторых методах многократные реакции осуществляют параллельно в лунках микротитрационного планшета. В таком формате отдельный миниатюрный микроскопический препарат может быть заключн в отдельных лунках, или можно осуществлять детектирование в немикроскопическом формате, например, обнаружение A методом ELISA. Предпочтительно, делают серийные измерения количеств амилоидного отложения в in vitro реакционной смеси, начиная с исходного (базового) значения перед началом реакции, и один или более измерений делают в ходе реакции. Антиген можно обнаруживать по окрашиванию, например, антителом с флуоресцентной меткой к A или к другому компоненту амилоидных бляшек. Антитело, используемое для окрашивания, может быть или не быть тем же самым, что и антитело, проверяемое на активность очищения (выведения). Уменьшение относительно базовой линии в ходе реакции амилоидных отложений указывает, что испытуемое соединение обладает активностью очищения. Повидимому, такие антитела пригодны для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера и других амилоидных заболеваний. Аналогичные методы можно применять для скрининга антител на активность при выведении других типов органических объектов. Этот анализ можно применять для обнаружения активности выведения в отношении практически любого рода биологического объекта. Как правило, биологический объект играет некоторую роль в заболевании человека или животного. Биологический объект может быть представлен в виде тканевого образца или в выделенной (изолированной форме). Если он находится в виде тканевого образца, тканевый образец, предпочтительно, представляет собой нефиксируемый тканевый образец, чтобы к компонентам тканевого образца был свободный доступ и чтобы избежать при фиксировании случайного нарушения конформации компонентов. Примеры тканевых образцов, которые можно анализировать этим методом, включают опухолевые ткани, предраковые ткани, ткани, содержащие доброкачественные новообразования, такие как бородавки или родимые пятна, ткани, инфицированные патогенными микроорганизмами, воспалительные инфильтраты, ткани с патологией межклеточного вещества (например, фибринозный перикардит), ткани, несущие аберрантные антигены, и рубцовые ткани. Примеры изолированных биологических объектов, которые можно использовать, включают A, вирусные антигены или вирусы, протеоглиганы, антигены или другие патогенные микроорганизмы, опухолевые антигены и адгезивные молекулы. Такие антигены можно получать из природных источников и, на- 23010469 ряду с другими методами, рекомбинантной экспрессией или химическим синтезом. Образец ткани или выделенный биологический объект контактирует в среде с фагоцитами, несущими рецепторы Fc, такими как моноциты или микроглия, и испытуемым антителом. Антитело может быть специфично в отношении испытываемого биологического объекта или антигена, ассоциируемого с объектом. В последнем случае осуществляют компенсаторный фагоцитоз испытуемого объекта, либо биологического организма (объекта) при использовании антигена. Обычно, хотя и не обязательно, антитело и биологический объект(иногда с ассоциированным антителом) контактируют друг с другом перед добавлением к фагоцитам. Затем проводят мониторинг концентрации биологического объекта и/или ассоциированного антигена,остающегося (если они остаются) в среде. Уменьшение количества или концентрации антигена или ассоциированного биологического объекта в среде указывает на то, что антитело обладает активностью очищения (выведения) в отношении антигена и/или ассоциированного биологического объекта в сочетании с фагоцитами (см., например, пример IV). В. Нуклеиновые кислоты, кодирующие иммунологические и терапевтические агенты. Иммунные реакции против амилоидных отложений можно также вызвать, вводя нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и компоненты их цепей, применяемые для пассивной иммунизации. Такими нуклеиновыми кислотами могут быть ДНК или РНК. Сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий иммуноген, как правило, связан с регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, которые делают возможной экспрессию сегмента ДНК в предполагаемой клетке-мишени больного. Что касается контроля экспрессии в гемоцитах, желательной для индукции иммунного ответа, для этого пригодны промоторный и энхансерный элементы генов лгкой или тяжелой цепи иммуноглобулина или ранний промотор и энхансер основного интермедиата CMV. Связанные регуляторные элементы и кодирующие последовательности часто клонируют в вектор. Для введения двухцепочечных антител можно клонировать две цепи в один и тот же вектор или в разные векторы. Пригодными являются многие вирусные векторные системы, включая ретровирусные системы (см.,например, Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 (1993; аденовирусные векторы (см.,например, Bett et al., J. Virol. 67:5911 (1993; аденоассоциированные вирусные векторы (см., например,Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867 (1994, вирусные векторы семейства поксвирусов, включая вирус коровьей оспы и вирусы оспы птиц, вирусные векторы рода альфа вирусов, такие как полученные при использовании Синдбис вируса и вируса лесов Семлики (см., например, Dubensky et al., J. Virol. 70:508(1996, венесуэльский вирус энцефалита лошадей (см. Johnston et al., патент США 5643576) и рабдовирусы, такие как вирус везикулярного стоматита (см. Rose, Международная заявка WO 96/34625) и вирусы папилломы (Ohe et al., Human Gene Therapy 6:325 (1995); Woo et al., Международная заявка WO 94/12629 и XiaoBrandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996. ДНК, кодирующая иммуноген, или содержащий е вектор могут быть упакованы в липосомы. Соответствующие липиды и родственные аналоги описаны в Eppstein et al., патент США 5208036, Felgner etal., патент США 5264618, Rose, патент США 5279833, и Epand et al., патент США 5283185. Векторы и ДНК, кодирующие иммуноген, могут также адсорбироваться или ассоциироваться с конкретными носителями, примерами которых являются полимеры метилметакрилата и полилактиды и сополимеры лактидов с гликолидами, см., например, McGee et al., J. Micro Encap. (1996). Векторы генной терапии или "голые" (депротеинизированные) полинуклеотиды (например, ДНК) могут доставляться путм введения отдельному пациенту, как правило, путм системного введения (например, внутривенной, внутрибрюшинной, назальной, желудочной, внутрикожной, внутримышечной,подкожной или интракраниальной инфузией) или местным введением (см., например, Anderson et al.,патент США 5399346). Термин "голый полинуклеотид" относится к полинуклеотиду не в виде комплекса с коллоидными материалами. "Голые" полинуклеотиды иногда клонируют в плазмидный вектор. Такие векторы могут дополнительно включать дополнительные агенты, такие как бупивацин (Attardo et al., патент США 5593970). ДНК можно также вводить, применяя генную пушку. XiaoBrandsma, см. выше. ДНК, кодирующая иммуноген, осаждается на поверхности микроскопических металлических гранул."Микроснаряды" ускоряются за счт ударной волны или за счт расширения газообразного гелия и проникают в ткани на глубину нескольких слов клеток. Подходящим является, например, устройство доставки гена (Gene Delivery Device) Accel, выпускаемое Agacetus, Inc. Middleton WI is suitable. Или же депротеинизированная ДНК может проникать в кровоток через кожу при нанесении пятен ДНК с одновременным химическим или механическим раздражением (см. Howell et al., Международная заявка WO 95/05853). B дополнительном варианте векторы, кодирующие иммуногены, можно доставлять к клеткамex vivo, таким, как клетки, взятые у отдельного пациента (например, лимфоциты, аспираты костного мозга, биопсия тканей), или универсальные донорные гемопоэтические стволовые клетки, с последующей повторной имплантацией клеток больному, как правило, после отбора клеток, в которые внедряют вектор. Методы профилактики и лечения. Настоящее изобретение относится, наряду с остальным, к лечению болезни Альцгеймера и других амилоидных заболеваний с помощью терапевтических иммунологических реагентов (например, гумани- 24010469 зированных иммуноглобулинов) к специфическим эпитопам в A, которые вызывают благотворную терапевтическую реакцию у больного в соответствующем состоянии (например, индукцию фагоцитоза A,уменьшение содержания ("нагрузки") бляшек, ингибирование образования бляшек, уменьшение нейритной дистрофии, улучшение когнитивной функции и/или реверсия, лечение или предупреждение когнитивного заболевания), например, к предупреждению или лечению амилоидного заболевания. Изобретение также относится к применению охватываемых им иммунологических реагентов (например, иммунизированных иммуноглобулинов) для производства лекарственного препарата для лечения и предупреждения амилоидного заболевания. Термин "лечение", "терапия" определяется как применение к пациенту или введение ему терапевтического агента, или применение к выделенной ткани или клеточной линии пациента или введение в них терапевтического агента, при условии, что у пациента наблюдается заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью лечения, заживления, облегчения, ослабления,смягчения, изменения, излечения, уменьшения интенсивности заболевания, симптомов заболевания или предрасположенности к заболеванию, для улучшения (состояния) или действия на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию. В одном аспекте данное изобретение охватывает способы предупреждения или лечения заболевания, обусловленного амилоидными отложениями A в тканях мозга больного. Такие заболевания включают болезнь Альцгеймера, синдром Дауна и ухудшение когнитивной функции. Последнее может наблюдаться наряду с другими признаками амилоидного заболевания или в их отсутствие. Некоторые способы по изобретению охватывают применение эффективной дозы антитела, которое специфически связывается с компонентом амилоидных отложений у больного. Такие методы особенно пригодны для лечения болезни Альцгеймера у человека. Приведнные в качестве примеров методы включают введение эффективной дозы антитела, которое связывается с A. Предпочтительные способы включают введение эффективной дозы антитела, которое специфически связывается с эпитопом внутри остатков 1-10 A,например, таких антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 1-3 A, антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 1-4 A, антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 1-5 A, антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 1-7 A, или антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 3-7 A. Ещ в одном аспекте данное изобретение охватывает применение антител, которые связываются с содержащим эпитоп N-концевым остатком A. Ещ в одном аспекте данное изобретение включает применение антител, которые связываются с эпитопом внутри остатков 1-10 A, причм остаток 1 и/или остаток 7 A представляет собой аспарагиновую кислоту. Ещ в одном аспекте данное изобретение включает применение антител, которые специфически связываются с пептидом A, не связываясь с полноразмерным амилоидным белком-предшественником (АРР). Ещ в одном аспекте изобретения изотип антитела представляет собой человеческий IgG1. Ещ в одном аспекте данное изобретение включает применение антител, которые связываются с амилоидными отложениями у больного и индуцируют реакцию выведения компонентов амилоидных отложений. Например, на такую реакцию выведения может влиять фагоцитоз, опосредуемый рецептором Fc. Терапевтические агенты по изобретению, как правило, являются практически очищенными от нежелательных примесей. Это означает, что агент, как правило, имеет чистоту по крайней мере 50 вес.%, а также практически не содержит вредных белков и примесей. Иногда агенты имеют чистоту по меньшей мере около 80 вес.%, более предпочтительно чистоту по меньшей мере 90 вес.% или около 95 вес.%. Однако с помощью обычных методов очистки белков можно получать гомогенные белки с чистотой по меньшей мере 99 вес.%. Эти способы можно применять как в отношении бессимптомных больных, так и в отношении больных с симптомами заболевания. Антитела, используемые в этих методах, могут быть человеческими,гуманизированными, химерными или нечеловеческими антителами, или их фрагментами (например, антигенсвязывающими фрагментами) и могут быть моноклональными или поликлональными, как показано в данном описании. Ещ в одном аспекте данное изобретение включает применение антител человека,иммунизированного пептидом A, причм этот человек может быть больным, который подлежит лечению с применением антитела. В другом аспекте изобретение охватывает применение фармацевтической композиции, содержащей антитело и фармацевтический носитель. Или же антитело можно вводить больному, вводя полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну цепь антитела. Полинуклеотид экспрессирует, продуцируя в организме больного цепь антитела. Необязательно полинуклеотиды кодируют тяжлую и лгкую цепи антитела. Полинуклеотид экспрессирует, продуцируя в организме больного тяжлую и лгкую цепи антитела. В примерах вариантов изобретения осуществляют постоянный контроль уровня вводимого антитела в крови больного. Таким образом, данное изобретение выполняет давно существующую необходимость в лечебной схеме для предупреждения или ослабления клинической неврологии и, у некоторых больных, ослабления познавательных способностей, обусловленных болезнью Альцгеймера.- 25010469 А. Больные, подлежащие лечению. Больные, подлежащие лечению, включают людей с повышенным риском заболевания, но без проявления симптомов, а также больных с наблюдаемыми симптомами. Что касается болезни Альцгеймера,фактически любой человек находится в состоянии повышенного риска заболеть болезнью Альцгеймера,если он или она живт достаточно долго. Следовательно, способы по настоящему изобретению можно применять для профилактики целой популяции, и нет необходимости какого-либо подтверждения повышенного риска для подлежащего профилактике пациента. Способы по настоящему изобретению особенно применимы для людей с заведомым повышенным риском заболевания болезнью Альцгеймера. В эту категорию входят пациенты, имеющие родственников, болеющих (болевших) этим заболеванием, и те, у которых повышенный риск заболеть обнаружен анализом генетических и биохимических маркров. Генетические маркры повышенного риска заболевания болезнью Альцгеймера включают мутации в гене АРР, в частности, мутации в положении 717 и в положениях 670 и 671, называемые мутации Hardy иSwedish (шведская), соответственно (Hardy, см. выше). Другими маркрами повышенного риска являются мутации в пресенильных генах, PS1 и PS2, и ApoE4, семейный анамнез относительно AD, гиперхолистеринемия или атеросклероз. AD. Больных болезнью Альцгеймера можно узнать по характерной деменции, а также по наличию вышеописанных факторов повышенного риска. Помимо этого, имеется ряд диагностических методов идентификации людей с AD. Эти методы включают определение уровней CSF тау и A42. Повышенные уровни тау и описанного A 42 определяют наличие AD. Диагноз " болезнь Альцгеймера" можно также установить с помощью критерия ADRDA, как обсуждается в разделе "Примеры". У бессимптомных больных лечение можно начинать в любом возрасте (например, в 10, 20, 30 лет). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение до достижения пациентом 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение, как правило, включает многократные дозы в течение некоторого периода времени. Лечение можно контролировать, определяя уровни антител во времени. Если реакция ослабевает, показана бустерная доза. У больных с возможным синдромом Дауна лечение можно начинать в предродовой период,вводя терапевтический агент матери, или вскоре после рождения. В. Схемы лечения и дозировки. В профилактических целях фармацевтические композиции или лекарственные вещества вводят больным, восприимчивым к болезни Альцгеймера, или с повышенным риском заболевания ею, в количестве, достаточном для ликвидации или уменьшения риска, уменьшения тяжести или задержки начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие в ходе развития заболевания. В терапевтических целях композиции или лекарственные вещества вводят больному, у которого подозревают такое заболевание или уже страдающему этим заболеванием, в количестве, достаточном для лечения или, по меньшей мере, частичного прекращения симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая осложнения и промежуточные патологические фенотипы в ходе развития заболевания. В некоторых способах введение агентов уменьшает или ликвидирует ухудшение познавательной функции у больных, у которых ещ не проявилась патология, характерная для болезни Альцгеймера. Количество, позволяющее адекватно выполнять терапевтическое или профилактическое лечение, называют терапевтически или профилактически эффективной дозой. Как по профилактической, так и по терапевтической схемам агенты обычно вводят в виде нескольких доз до достижения удовлетворительного иммунного ответа. Термин "иммунный ответ"или "иммунологический ответ" включает развитие гуморального (опосредуемого антителом) и/или клеточного (опосредуемого антигенспецифическими Т-клетками или другими продуктами секреции) ответа, направленного против антигена в реципиенте. Такой ответ может быть активным ответом, т.е. индуцированным введением иммуногена, или пассивным ответом,т.е. индуцированным введением иммуноглобулина или антитела или примированных Т-клеток."Иммуногенный агент" или "иммуноген" способен индуцировать аутоиммуный ответ при введении млекопитающему, необязательно в сочетании с адъювантом. Как правило, иммунный ответ контролируют и, когда он начинает ослабевать, дают многократные дозы. Эффективные дозы композиций по данному изобретению для лечения вышеописанных состояний меняются в зависимости от многих различных факторов, в зависимости от способа применения, нацеленного сайта, физического состояния больного, вне зависимости от того, человек это или животное, от других вводимых лекарственных веществ, от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациентом является человек, но можно также лечить иных млекопитающих, нежели человек, включая трансгенных млекопитающих. Чтобы достичь оптимальной безопасности и эффективности, нужно определять титр лечебной дозы. Для пассивной иммунизации антителом интервалы доз составляют около 0,0001-100 мг/кг и более обычно 0,01-5 мг/кг веса тела хозяина. Например, дозы могут составлять 1 мг/кг веса тела или 10 мг/кг веса тела или быть в пределах 1-10 мг/кг, предпочтительно по меньшей мере 1 мг/кг. Дозы можно вводить ежедневно, через день, еженедельно или по другой соответствующей схеме, определяемой эмпирическим путм. Пример лечения включает введение многократных доз в течение длительного периода,- 26010469 например по меньшей мере в течение 6 месяцев. Другие примеры схемы лечения включает введение один раз каждые две недели или один раз в месяц каждые 3-6 месяцев. Примерные схемы применения лекарственных препаратов включают введение 1-10 мг/кг или 15 мг/кг в последующие дни, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг еженедельно. В некоторых способах одновременно вводят два или более моноклональных антител с различной специфичностью связывания, в этом случае вводимая доза каждого антитела находится в указанных интервалах. Антитело обычно вводят многократно. Интервалы между однократными дозами могут составлять неделю, месяц или год. Интервалы также могут быть нерегулярными, по показаниям измерения уровней антител к A в крови пациента. В некоторых методах дозы корректируют для достижения концентрации антитела в плазме, равной 1-1000 мкг/мл и, в некоторых методах, 25-300 мкг/мл. Или же антитело можно вводить в виде препарата пролонгированного действия, в этом случае требуется менее частое введение. Доза и частота введения меняются в зависимости от полупериода существования антитела в организме больного. В целом человеческие антитела имеют самый продолжительный полупериод существования,затем идут гуманизированные антитела, химерные антитела и нечеловеческие антитела. Доза и частота введения могут меняться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В случае применения в профилактических целях композиции, содержащие антитела по данному изобретению или их смесь (коктейль), вводят пациенту ещ не в стадии болезни с целью повысить сопротивляемость его организма. Такое количество называют "эффективная профилактическая доза". При таком применении точные количества также зависят от состояния здоровья и общего иммунитета пациента, но в целом, находятся в пределах 0,1-25 мг на дозу, главным образом, 0,5-2,5 мг на дозу. Относительно низкую дозу вводят сравнительно продолжительные интервалы в течение продолжительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца жизни. При применении в терапевтических целях иногда требуются относительно высокие дозы (например, около 1-200 мг антитела на дозу, при этом наиболее употребительными являются дозы 5-25 мг) через сравнительно короткие интервалы до тех пор, пока развитие болезни замедлится или прекратится, и,предпочтительно, до тех пор, пока у больного не будет наблюдаться частичное или полное ослабление симптомов заболевания. Затем больному можно вводить препарат по профилактической схеме. Интервалы доз нуклеиновых кислот, кодирующих антитела, составляют около 10 нг-1 г, 100 нг 100 мг, 1 мкг-10 мг или 30-300 мкг ДНК для пациента. Дозы инфицирующих вирусных векторов варьируются от 10 до 100 или более вирионов на дозу. С целью профилактики и/или лечения терапевтические агенты можно вводить парентеральным, местным, внутривенным, пероральным, подкожным, внутриартериальным, интракраниальным (внутримозговым), внутрибрюшинным, назальным или внутримышечным способами. Наиболее обычным способом применения иммуногенного агента является подкожный, хотя другие способы могут оказаться равно эффективными. Следующим наиболее употребительным способом является внутримышечная инъекция. Эти инъекции наиболее часто делают в мышцы руки или ноги. В некоторых способах агенты инъецируют непосредственно в конкретную ткань, в которой аккумулируются отложения, примером является интракраниальная инъекция. Внутримышечная инъекция или внутривенная инфузия предпочтительны для введения антитела. В некоторых способах конкретные терапевтические антитела инъецируют непосредственно в мозговой череп. В некоторых способах антитела вводят в виде композиции пролонгированного действия или в виде устройства, такого как устройство Medipad. Агенты по изобретению могут необязательно вводиться в комбинации с другими агентами, которые, по меньшей мере, частично эффективны при лечении амилоидного заболевания. В случае болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, при которых в мозгу образуются амилоидные отложения, агенты по изобретению можно также вводить в сочетании с другими агентами, которые повышают способность проникать через гематоэнцефалический барьер. С. Фармацевтические композиции. Агенты по изобретению часто применяют в виде фармацевтических композиций, содержащих активный терапевтический агент и ряд других фармацевтически приемлемых компонентов. См. Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Композиции также могут включать, в зависимости от требуемой рецептуры, фармацевтически приемлемые нетоксические носители или разбавители, которые называют наполнителями, обычно применяемые для приготовления фармацевтических композиций для введения животному или человеку. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы не влиять на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей (растворителей) являются дистиллированная вода, физиологический раствор, с фосфатным буфером, растворы Рингера, раствор глюкозы и раствор Хэнка (Hank). Помимо этого, фармацевтическая композиция или препарат может также включать другие носители, адъюванты или нетоксические, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и т.п. Фармацевтические композиции могут также включать большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, такие как хитозан, полимолочные кислоты, полиглико- 27010469 левые кислоты и сополимеры (такие, как латекс с сефарозой(ТМ), агарозой, целлюлозой и т.п.), полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и липидные агрегаты (такие, как капельки масла или липосомы). Помимо этого, эти носители могут действовать как иммуностимулирующие агенты (т.е. адъюванты). Для парентерального введения агенты по изобретению можно вводить в инъецируемых лекарственных формах раствора или суспензии вещества в приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем, который может быть стерильной жидкостью, такой как вода, масла, физиологический раствор, глицерин или этанол. Кроме этого, в композиции могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества или эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, рН-буферизующие вещества и т.п. Другими компонентами фармацевтических композиций являются вещества, полученные из нефти, вещества животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло и минеральное масло. В целом предпочтительными жидкими носителями, особенно для инъецируемых растворов, являются гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Антитела можно вводить в форме депо-инъекций или имлантатов препаратов, которые можно готовить таким образом, чтобы сделать возможным пролонгированное выделение активного ингредиента. Примерная композиция содержит 5 мг/мл моноклонального антитела в водном буфере, состоящем из 50 мМL-гистидина, 150 мМ NaCl, pH которого с помощью HCl доводят до 6,0. Как правило, композиции готовят в виде инъецируемых препаратов: либо в виде жидких растворов,либо в виде суспензий; также можно готовить тврдые формы для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат можно также эмульгировать или инкапсулировать в липосомы или микрочастицы, такие как полилактидные, полигликолидные или сополимерные микрочастицы,с целью повышенного адъювантного эффекта, как обсуждалось выше (см. Langer, Science 249: 1527(1990) и Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997. Агенты по изобретению можно вводить в форме депо-инъекции или имплантированного препарата, которые можно приготовить таким образом,чтобы выделение активного ингредиента было пролонгированным или происходило в пульсовом режиме. Дополнительные препараты, пригодные для других способов введения, включают препараты для перорального, назального и лгочного введения, суппозитории и трансдермальные пластыри. Связующие и носители для суппозиториев включают, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории можно готовить из смесей, содержащих активный ингредиент в пределах 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные препараты включают эксципиенты, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрий, целлюлоза и карбонат магния. Эти композиции имеют форму растворов,суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов пролонгированного действия или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%. Местное применение может осуществляться с помощью трансдермальной (чрескожной) или интрадермальной (внутрикожной) доставки. Местное введение можно облегчить совместным введением агента с холерогеном или его производными или субъединицами после детоксикации или с другими аналогичными бактериальными токсинами (См. Glenn et al., Nature 391, 851 (1998. Совместное введение можно осуществлять, применяя компоненты в виде смеси или в виде связанных молекул, полученных химическим методом сшивания или экспрессией слитого белка. Или же трансдермальную доставку можно осуществлять, используя кожный пластырь или трансферосомы (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25:3521 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15III. Мониторинг в ходе лечения. Данное изобретение охватывает способы мониторинга в ходе лечения больных, страдающих восприимчивостью к болезни Альцгеймера, т.е. мониторинга курса лечения, проводимого в отношении пациента. Эти способы применимы для контроля как терапевтического лечения пациентов с симптомами,так и профилактического лечения бессимптомных пациентов. В частности, способы применимы для мониторинга пассивной иммунизации (например, измерения уровня вводимого антитела). Некоторые способы включают определение базового (исходного) значения, например, уровня антитела или профиля (характеристик) пациента, перед введением дозы агента, и сравнение их со значением для профиля или уровня после лечения. Значительное увеличение (т.е. больше, чем обычный предел экспериментальной ошибки при повторных измерениях того же образца, выраженный как стандартная девиация от среднего значения при измерениях) величины уровня или профиля является показателем положительного результата лечения (т.е. что введение агента достигло желаемого ответа). Если величина иммунного ответа меняется незначительно или уменьшается, это является показателем отрицательного результата. В других методах контрольное значение (т.е. среднее и стандартное отклонение) уровня или профиля определяют для контрольной популяции. Как правило, пациенты из контрольной популяции ранее не проходили лечения. Затем измеренные значения уровня или профиля у больного после введения терапевтического агента сравнивают с контрольным значением. Значительное увеличение относительно контрольного значения (например, более одного стандартного отклонения от среднего) указывает на поло- 28010469 жительный или удовлетворительный результат лечения. Отсутствие достаточного увеличения или понижение сигнализирует об отрицательном или неудовлетворительном результате лечения. Введение агента,как правило, продолжается пока уровень повышается относительно контрольного значения. Как и ранее,достижение плато относительно контрольных значений является показателем того, что лечение можно прекратить или уменьшить дозу и/или частоту. В других способах контрольное значение уровня или профиля (например, среднее плюс стандартное отклонение) определяют у контрольной группы пациентов, которые не подвергались ранее лечению терапевтическим агентом и у которых в ответ на лечение наблюдается плато в значениях уровней и профиля. Измеренные значения уровней или профилей пациента сравнивают с контрольным значением. Если измеренный уровень у пациента незначительно отличается (например, более одного стандартного отклонения) от контрольного значения, лечение можно прекратить. Если уровень у больного значительно ниже контрольного значения, продолжение применения агента является оправданным. Если уровень у больного остатся ниже контрольного значения, тогда больному может быть показано другое лечение. В других способах у пациента, который в настоящее время не получает лечения, но проходил курс лечения ранее, контролируют уровень антител или профили с целью определения, требуется ли возобновление лечения. Измеренный уровень или профиль больного можно сравнить со значением, полученным у больного ранее, после предыдущего курса лечения. Значительное уменьшение относительно предыдущего измерения (т.е. больше, чем обычный предел ошибки при повторных измерениях того же образца) указывает на то, что лечение можно возобновить. Или же значение, измеренное у больного, можно сравнивать с контрольным значением (среднее плюс стандартное отклонение), определяемым в группе пациентов после проведения курса лечения. Или же измеренное значение можно сравнивать с контрольным значением в популяции профилактически пролеченных пациентов, у которых по-прежнему отсутствуют симптомы заболевания, или в популяции терапевтически пролеченных пациентов, у которых наблюдается уменьшение интенсивности симптомов заболевания. Во всех этих случаях значительное уменьшение относительно контрольного уровня (т.е. более стандартного отклонения) является показателем того, что лечение пациента следует возобновить. Тканевым образцом для анализа обычно является кровь, плазма, сыворотка, слизь или цереброспинальная жидкость (ликвор) пациента. В образце анализируют, например, уровни или профили антител к пептиду A, например, уровни или профили гуманизированных антител. Методы ELISA для обнаружения антител, специфических в отношении A, описаны в разделе "Примеры". В некоторых методах уровень или профиль вводимого антитела определяют, применяя анализ очищения (выведения), например,анализ фагоцитов in vitro, как представлено в данном описании. В таких методах анализируемый тканевый образец пациента контактирует с амилоидными отложениями (например, мыши PDAPP) и фагоцитами, несущими рецепторы Fc. Наличие и величина реакции очищения указывает на присутствие и уровень антител, эффективных для очищения от A в тканевом образце тестируемого пациента. На кривой концентрации антитела сразу после пассивной иммунизации обычно имеется пик после экспоненциального спада. Без дополнительной дозы спад приближается к уровням до начала лечения в течение периода от нескольких дней до нескольких месяцев в зависимости от полупериода существования вводимого антитела. Например, полупериод существования некоторых человеческих антител порядка 20 дней. В некоторых методах перед введением делают базовое (начальное) измерение антитела к A у больного, второе измерение делают вскоре после введения для определения максимального уровня антител, и одно или более дополнительных измерений делают с перерывами для контроля падения уровней антител. Когда уровень антитела упадт до базовой линии или до предварительного максимального (пик), более низкого, чем базовое, значения (например, 50, 25 или 10%), предпринимают введение дополнительной дозы. В некоторых методах максимальное значение или последующие измеряемые уровни, более низкие,чем базовые, сравнивают с определнными ранее стандартными уровнями с целью найти наиболее подходящую схему профилактического или терапевтического лечения других пациентов. Если измеренный уровень антитела значительно ниже, чем стандартный уровень (например, ниже, чем среднее значение минус стандартное отклонение от эталонного значения в группе пациентов, которым лечение помогло),то показано дополнительное введение дозы антитела. Другие методы включают мониторинг в ходе лечения любого общепризнанного в технике физиологического симптома (например, физического или ментального симптома), на который обычно опираются исследователи или врачи при диагностике или мониторинге амилоидных заболеваний (например, болезни Альцгеймера). Например, можно контролировать когнитивное ухудшение (ослабление умственной деятельности). Последнее является симптомом болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, но встречается также при отсутствии других признаков любого из этих заболеваний. Например, когнитивное ухудшение можно контролировать, определяя балл больного в "мини-экзамене", определяющем его умственное состояние (Mini - Mental State Exam) в соответствии с принятыми нормами в течение курса лечения. С. Наборы. Данное изобретение охватывает далее наборы для осуществления описанных выше методов мони- 29010469 торинга. Как правило, такие наборы содержат агент, который специфически связывается с антителом кA. Набор может также содержать метку (реагент для мечения). Для обнаружения антител к A метка,как правило, находится в виде меченых антиидиотипических антител. Для обнаружения антител агент может поставляться в виде предварительно связанного с тврдой фазой, такой, например, как лунки микротитрационного планшета. Наборы также обычно содержат документацию с сопроводительными инструкциями по применению набора. Документация может также включать таблицу или другую соответствующую схему для корреляции уровней определяемой метки с уровнями антител к A. Термин "документация" относится к любому написанному или зарегистрированному материалу, который к этому относится или иным образом сопровождает набор в ходе производства, транспорта, продажи или применения. Например, термин "документация, сопроводительные материалы" охватывает листовки, брошюры,упаковочные материалы, инструкции, аудио- и видеокассеты, компьютерные диски, а также инструкции,напечатанные непосредственно на наборах. Данное изобретение также включает диагностические наборы, например, наборы для исследования,обнаружения и/или диагностики (например, для визуализации in vivo). Такие наборы обычно содержат антитело для связывания с эпитопом A, предпочтительно, внутри остатков 1-10. Предпочтительно, антитело метят или в набор включают вторичный реагент для мечения. Предпочтительно, в набор включают вкладыш или этикетку с инструкциями по соответствующему применению, например, по осуществлению визуализации in vivo. Примеры антител представлены в данном описании.D. In vivo визуализация. Данное изобретение охватывает способы in vivo визуализации амилоидных отложений у больных. Такие способы применимы для диагностики или подтверждения диагноза болезни Альцгеймера или восприимчивости к ней. Например, можно использовать эти методы в отношении больного с симптомами деменции. Если у больного наблюдаются аномальные амилоидные отложения, он, по-видимому, страдает болезнью Альцгеймера. Эти способы могут также использоваться для бессимптомных пациентов. Наличие аномальных отложений амилоида указывает на восприимчивость к будущему симптомному заболеванию. Способы по изобретению также применимы для мониторинга развития заболевания и/или реакции на лечение больных, у которых ранее была диагностирована болезнь Альцгеймера. Эти методы осуществляют путм введения пациенту реагента, такого как антитело, которое связывается с A, и последующего обнаружения агента после его связывания. Предпочтительные антитела связываются с отложениями A в организме пациента, не связываясь с полноразмерным полипептидом АРР. Антитела, связывающиеся с эпитопом A в аминокислотах 1-10, являются особенно предпочтительными. В некоторых методах антитела связываются с эпитопом, находящимся в аминокислотных остатках 7-10 полипептида A. Такие антитела обычно связываются, не вызывая заметной реакции очищения. В других методах антитело связывается с эпитопом во фрагменте, содержащем аминокислоты 1-7A. Такие антитела обычно связываются и индуцируют реакцию очищения на A. Однако реакцию очищения можно избежать, используя фрагменты антитела, у которых отсутствует полноразмерная константная область, такая как Fabs. В некоторых методах одно и то же антитело может служить как в качестве терапевтического, так и в качестве диагностического реагента. В целом, антитела, связывающиеся с эпитопами, С-концевыми к остатку 10, не показывают такого сильного сигнала, как антитела, связывающиеся с эпитопами внутри остатков 1-10, по-видимому, потому, что С-концевые эпитопы в амилоидных отложениях недоступны. Соответственно, такие антитела наименее предпочтительны. Диагностические реагенты можно вводить внутривенной инъекцией в тело пациента или непосредственно в мозг с помощью интракраниальной инъекции, или просверливая отверстие в черепе. Доза реагента должна быть в тех же пределах, что и для целей терапии. Обычно реагент является меченым, хотя в некоторых методах первичный реагент с аффинностью к A является немеченым, и применяют вторичный реагент с меткой для связывания с первичным реагентом. Выбор метки зависит от способа обнаружения. Например, для оптического обнаружения применима флуоресцентная метка. Использование парамагнитных меток применимо для томографического обнаружения без хирургического вмешательства. Радиоактивные метки могут также обнаруживаться с помощью PET или SPECT. Диагностику осуществляют, сравнивая количество, величину и/или интенсивность меченых локусов с соответствующими базовыми значениями. Базовые значения (базовая линия) могут представлять собой средние уровни в популяции не болеющих людей. Базовые значения могут также представлять собой результаты предыдущих определений уровней у того же пациента. Например, базовые значения можно определять у пациента перед началом лечения и измеряемые значения затем можно сравнивать с базовыми. Уменьшение значений относительно базовой линии свидетельствует о положительной реакции на лечение. Настоящее изобретение более полно описывается представленными далее не ограничивающими примерами.