Экспрессионный вектор со сниженным уровнем внутримолекулярной рекомбинации, содержащий гомологичные или гетерологичные нуклеотидные последовательности

ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР СО СНИЖЕННЫМ УРОВНЕМ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ, СОДЕРЖАЩИЙ ГОМОЛОГИЧНЫЕ ИЛИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЕ НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ Изобретение относится к векторам, содержащим две или более гомологичные нуклеотидные последовательности, и к способам их получения. Изобретение затрагивает замещение оснований в гомологичных нуклеотидных последовательностях на отличающиеся основания таким образом,чтобы не изменять кодируемую аминокислотную последовательность. Изобретение делает возможным снижение внутримолекулярной рекомбинации между гомологичными нуклеотидными последовательностями, в особенности в клетках млекопитающих. Уровень техники изобретения Феномен гомологичной рекомбинации нуклеиновых кислот предусматривает физический разрыв и воссоединение разнородных цепей нуклеиновых кислот в пределах гомологичных последовательностей. Рекомбинация и генная конверсия в клетках млекопитающих исследовались многими группами, которые наблюдали восстановление селектируемых генов после инфицирования соответствующим образом сконструированными вирусными или плазмидными субстратами (Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 6:25202526, 1986). Результаты этих экспериментов показывают, что клетки эффективно поддерживают как внутри-, так и межмолекулярную рекомбинацию и генную конверсию (Id). Межмолекулярная рекомбинация относится к рекомбинации между гомологичными последовательностями, представленными в двух различных молекулах нуклеиновой кислоты, тогда как внутримолекулярная рекомбинация относится к рекомбинации между гомологичными последовательностями, представленными в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты. Межмолекулярная рекомбинация может произойти между генами в плазмиде или вирусе и гомологичными последовательностями внутри клетки (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902, 1986). Этот тип рекомбинации может быть причиной образования инфекционного вируса из ослабленного вируса. Fulleret al. кодон-оптимизировали выделенные последовательности генов HIV-1 gag и HIV-1 pol для увеличения их экспрессии в клетках млекопитающих. Эти оптимизации также снизили идентичность нуклеотидов в перекрывающейся области длиной примерно 200 нуклеотидных пар, представленной в HIV генеgag-pol, что также привело к сниженным уровням внутримолекулярной рекомбинации между открытыми рамками считывания gag и pol, расположенными в двух независимых плазмидах, и усеченным геном gag,содержащимся в рекомбинантном ретровирусном векторе (Fuller et al., Hum. Gene Ther. 12:2081-2093,2001.) Внутримолекулярная рекомбинация может происходить между векторами, в которых дуплицированные области гена или генного фрагмента представлены как прямые повторы, разделенные вставочными последовательностями. Этот тип рекомбинации обычно приводит к делеции вставочных последовательностей и одной копии повторяющихся последовательностей. Частота внутримолекулярной рекомбинации обычно намного выше, чем частота межмолекулярной рекомбинации. Уровень внутримолекулярной рекомбинации в плазмидных векторах был подсчитан для клеток животных (Rubnitz and Subrami, Mol. Cell. Biol. 4:2253-2258, 1984). В зависимости от размера гомологичных областей, частота межмолекулярной рекомбинации в трансфицированной плазмидной ДНК варьирует между 0,306 и 0,002% (Id). Низкая эффективность рекомбинации наблюдалась для гомологии всего лишь 14 нуклеотидных пар (Id). Внутримолекулярная рекомбинация между гомологичными последовательностями также подтверждена документально для многих животных вирусов, включая пикорнавирусы, вирус гриппа, аденовирусы и поксвирусы (Gritz et al., J. Virol. 64:5948-5957, 1990). Для вирусов вакцины было показано, что тандемно дуплицированные последовательности являются генетически нестабильными (Id). Для вирусов наблюдаемый уровень внутримолекулярной рекомбинации был гораздо более высоким, чем для плазмидных векторов. Например, для ретровируса частота рекомбинации между двумя идентичными последовательностями в одной и той же РНК молекуле была найдена равной примерно 62% (Zhang et al., J. Virol. 75:63486358, 2001). 99% этих рекомбинаций были внутримолекулярными (между двумя последовательностями одной молекулы РНК), в противоположность межмолекулярной (между двумя молекулами РНК) (Id). Для аденоассоциированного вируса внутримолекулярная рекомбинация также была найдена гораздо более эффективной по сравнению с межмолекулярной рекомбинацией (Choi et al., J. Virol. 79:6801-6807,2005). Было показано, что Herpes simplex вирус тип I также демонстрирует высокие уровни рекомбинации (Dutch et al., J. Virol. 66:277-285). Для поксвирусов наблюдали высокую частоту гомологичной рекомбинации. Экспериментальную систему использовали для определения рекомбинации для вирусов вакцины путем расположения гена тимидинкиназы (tk) между двумя прямыми повторами 1,5 тпо ДНК(Ball, J. Virol. 61: 1788-1795, 1987). В течение каждого из первых восьми пассажей при неселективных условиях 40% tk+ вирусов вакцины потеряли свой tk+ фенотип (Id). При неселективных условиях относительное количество tk- вирусов увеличилось до 99,73% общей популяции вируса (Id). Даже при селективных условиях рекомбинация происходила с такой высокой частотой, что большинство инфекционных вирусных частиц, которые было возможно выделить из единичных бляшек, содержали ДНК, которая уже подверглась рекомбинации, с последующей потерей гена tk (Id). Используя рекомбинантный вирус вакцины, сконструированный для экспрессии трех гетерологичных генов, все экспрессируемые с VV р 7.5 промоторов, Howley et al., Gene 172:233-237, 1996, продемонстрировали рекомбинацию между повторяющимися последовательностями промоторов. Рекомбинант вируса вакцины, сконструированный как содержащий область С-повтора (CRR) из М-белка Streptococcus pyogenes, содержит сложную смесь вариантов, содержащих от 1 до более чем 20 копий CRR (Hruby et al., P.N.A.S. 88:3190-3194, 1991). Хотя и было показано, что множественные гены с гомологией примерно 60-75%, вставленные в различные сайты интеграции MVA, приводят к стабильному множественному рекомбинантному вирусу рые снижают уровень внутримолекулярной рекомбинации в векторах, таких как, например, вирусные векторы, для обеспечения получения стабильных векторов, содержащих множественные гомологичные нуклеотидные последовательности, содержащие более длинные идентичные участки. Изобретение Настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам и способам их изготовления и применения. В особенности, настоящее изобретение охватывает вектор, содержащий две нуклеотидные последовательности размером 300 нуклеотидов, каждая кодирующая 100 аминокислот, где 100 аминокислот,кодируемые каждой из двух нуклеотидных последовательностей, имеют по меньшей мере 75% идентичных аминокислот и где одна из двух нуклеотидных последовательностей имеет по меньшей мере 75 отличных от другой нуклеотидной последовательности нуклеотидов, где отличающиеся нуклеотиды не изменяют идентичные аминокислоты, кодируемые названными двумя нуклеотидными последовательностями. Поразительно, как было показано в соответствии с настоящим изобретением, риск межмолекулярной рекомбинации может быть не только значительно снижен, но и даже избегнут путем систематического замещения однозначных кодонов в по меньшей мере двух похожих или идентичных нуклеотидных последовательностях внутри одной молекулы нуклеиновой кислоты, такой, например, как вектор, таким образом, приводя к созданию стабильных векторов, содержащий по меньшей мере две или более похожие или идентичные нуклеотидные последовательности. Неожиданно, стратегия, используемая в настоящем изобретении, является также применимой для векторов, содержащих три или более похожих нуклеотидных последовательностей. Результаты, полученные в настоящем изобретении, показывают, что является возможным заменить большое количество нуклеотидов в нуклеотидной последовательности для снижения внутримолекулярной рекомбинации в векторе, тогда как, неожиданно, экспрессия кодируемого белка в то же время все еще сохраняется. При введении большого количества нуклеотидных вариантов в длинные участки нуклеотидных последовательностей, как было сделано по настоящему изобретению, квалифицированный специалист может ожидать, что экспрессия указанной последовательности или гена более не будет правильно работать, т.е. не ожидалось, что измененная нуклеотидная последовательность будет оставаться подходящей для эффективной экспрессии. Используемая здесь стратегия пригодна не только для коротких участков нуклеотидных последовательностей длиной 300 нуклеотидов, но также и для гораздо более длинных участков, например, полноразмерных генов, которые, конечно, содержат участки длиной 300 нуклеотидов как заявлено. Результаты являются применимыми для множества различных генов, векторов и вирусов и являются крайне полезными для разработки вакцин, как, например, разработка мультивалентных вакцин, но также могут быть полезными для других технологий, как, например, экспрессия белков или для получения рекомбинантных клеточных линий. В других вариантах осуществления изобретение также охватывает способы получения вирусов и векторов и способы для снижения внутримолекулярной рекомбинации. Изобретение охватывает способ получения вектора, как описано выше, и названный способ включает стадии а) получения первой нуклеотидной последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующей 100 аминокислот; б) получения второй нуклеотидной последовательности длиной 300 нуклеотидов,кодирующей 100 аминокислот, где 100 аминокислот, кодируемые каждой из двух нуклеотидных последовательностей, имеют по меньшей мере 75% аминокислотной идентичности и где одна из двух нуклеотидных последовательностей имеет по меньшей мере 75 нуклеотидов, отличающихся от другой нуклеотидной последовательности, где отличающиеся нуклеотиды не изменяют идентичные аминокислоты,кодируемые названными двумя нуклеотидными последовательностями; в) интеграции двух различающихся нуклеотидных последовательностей в вектор. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретение охватывает способ для снижения внутримолекулярной рекомбинации в векторе, содержащем две нуклеотидные последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующих каждая 100 аминокислот, где 100 аминокислот, кодируемые каждой из двух нуклеотидных последовательностей, имеют по меньшей мере 75% аминокислотной идентичности, названный способ включает замену нуклеотидов в одной или обеих нуклеотидной(ых) последовательности(ях) для получения двух различающихся последовательностей, которые имеют отличие по меньшей мере в 75 нуклеотидов, где отличающиеся нуклеотиды не изменяют идентичные аминокислоты,кодируемые названными двумя нуклеотидными последовательностями. При использовании вирусных векторов способ снижает уровень внутримолекулярной рекомбинации в течение каждого поколения вирусного распространения. Предпочтительно гомологичные нуклеотидные последовательности рекомбинируют менее чем в 20, 15, 10, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05 или 0,01% вирусного потомства на поколение. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение охватывает способ получения вируса, предпочтительно поксвируса, содержащего две гомологичные нуклеотидные последовательности, где указанный способ включает стадии а) получения вируса, содержащего нуклеотидную последовательность длиной 300 нуклеотидов, кодирующую 100 аминокислот, и b) интеграции второй нуклеотид-2 024749 ной последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующей 100 аминокислот, в вирус; где 100 аминокислот, кодируемые каждой из двух нуклеотидных последовательностей, имеют по меньшей мере 75% аминокислотной идентичности и где одна из двух нуклеотидных последовательностей имеет по меньшей мере 75 нуклеотидов, отличающихся от другой нуклеотидной последовательности, где отличающиеся нуклеотиды не изменяют идентичные аминокислоты, кодируемые названными двумя нуклеотидными последовательностями. Как используется здесь, "вектор" может быть любым средством, способным доставлять и экспрессировать молекулы нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина или объект. Так, вектор может быть ПЦРпродуктом или любым фрагментом нуклеиновой кислоты, введенным в клетку и/или интегрированным в клеточный геном; или репликоном, таким как плазмида, фаг или космида, в который может быть вставлен другой фрагмент ДНК таким образом, чтобы осуществлять репликацию вставленного фрагмента. В общем случае, вектор может реплицироваться, когда он ассоциирован с подходящими контрольными элементами. Подходящие векторные основы для использования по настоящему изобретению включают,например, те, что используются повсеместно в области техники, такие как плазмиды, вирусы, искусственные хромосомы, ВАС, YAC или РАС, или даже рекомбинантные клетки, такие как бактерии или эукариотические клетки. Термин "вектор" включает векторы для клонирования и экспрессии, также как и вирусные векторы и интегрирующие векторы. "Экспрессионный вектор" является вектором, который содержит регуляторную область. Подходящие экспрессионные векторы для использования в настоящем изобретении включают, без ограничения, плазмиды и вирусные векторы, полученные из, например, растительных вирусов, бактериофагов, бакуловирусов, вируса табачной мозаики, ретровирусов и поксвирусов. Подходящие невирусные векторы включают плазмиды, такие как pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI(Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329, 840), pVAX и pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi et al,2002, J. Virol. 76, 12735-12746). Многочисленные векторы и экспрессионные системы являются коммерчески доступными у различных корпораций, таких как Novagen (Madison, Wis.), Clontech (Palo Alto,Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif.) и Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, Calif.). При разработке вакцин рекомбинантный вирус может быть использован в качестве векторапереносчика или вектора вакцины для доставки генетического материала в клетку. Оказавшись в клетке,генетическая информация транскрибируется и транслируется в белки, включая интегрированный антиген, направленный против определенного заболевания. Лечение является успешным, если антиген, доставленный вектором в клетку, индуцирует иммунный ответ организма против антигена, который защищает от заболевания. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вектор является плазмидой или вирусным вектором. Вирусный вектор может быть основан на ослабленном вирусе, который не может реплицироваться в клетке-хозяине, но способен индуцировать и экспрессировать чужеродный ген в инфицированной клетке. Вирус или рекомбинантный вирус является, таким образом, способным продуцировать белок и презентировать его иммунной системе хозяина. Некоторые основные характеристики вирусных векторов таковы, что они могут вызывать гуморальный (В-клеточный) и/или клеточно-опосредованный (Тклеточный) иммунный ответ. Вирусные векторы могут быть получены из множества различных вирусов. В одном варианте осуществления, вирус является вирусом животных. Вектор может быть получен специально из вируса, выбранного из группы вирусов, состоящей из ретровируса, пикорнавируса, вируса гриппа, аденовируса,адено-ассоциированного вируса (AAV), поксвируса, вируса герпеса (например, HSV-1), вируса кори и губчатого вируса. Вирусные векторы часто используются исследователями для разработки вакцин для предотвращения и лечения инфекционных заболеваний и рака. Из этих, поксвирусы (включая чуму канареек, коровью оспу и оспу птиц) относятся к группе наиболее распространенных кандидатов для векторных вакцин. Поксвирусы являются предпочтительным выбором для переноса генетического материала в новые хозяева из-за их относительно большой вместимости для вставки последовательностей в вирусный геном и из-за их способности реплицировать их геном и проводить транскрипцию в цитоплазме инфицированной клетки вместо ядра, таким образом минимизируя риск инсерционного мутагенеза путем интегрирования генетического материала в геном клетки-хозяина, как происходит для других векторов, например, ретровирусных векторов. Вирионы поксвирусов являются более большими по сравнению с большинством других вирусов животных (более детально см. Fields et al., eds., Virology, 3rd Edition, Volume 2, Chapter 83, pages 2637 ff). В предпочтительном варианте осуществления изобретения вирусный вектор получен из поксвируса(см., например, Сох et al. in "Viruses in Human Gene Therapy", Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press). Он может быть получен из любого члена poxviridae и может быть, в частности, авипоксвирусом или ортопоксвирусом. Примеры авипоксвирусов, подходящих для использования в настоящем изобретении, включают любой авипоксвирус, такой как Fowlpoxvirus, Canarypoxvirus, Uncopoxvirus, Mynahpoxvirus, Pigeonpoxvirus, Psittacinepoxvirus, Quailpoxvirus, Peacockpoxvirus, Penguinpoxvirus, Sparrowpoxvirus, Starlingpoxvirus иTurkeypoxvirus. Предпочтительными авипоксвирусами являются Canarypoxvirus и Fowlpoxvirus. Авипоксвирусы являются в природе ограниченными по хозяину и продуктивно реплицируются только в птичьих видах и клетках (Taylor et al., Biological and immunogenic properties of a canarypox-rabiesrecombinant, ALVAC-RG (vCP65) in non-avian species, Vaccine 13: 539-549, 1995). Если человеческие клетки инфицированы авипоксвирусами, гетерологичные гены экспрессируются с вирусного генома. Однако авипоксвирус не полностью реплицируется в человеческих клетках и, таким образом, нет риска,что человеческому существу будет нанесен вред продуктивной вирусной репликацией. Различные рекомбинантные авипоксвирусы были сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать так называемые продукты лентивирусных генов (US 5766598), цитокины и/или рак-ассоциированые антигены(US 5833975) или G-гликопротеин бешенства (Taylor et al., Biological and immunogenic properties of a canarypox-rabies recombinant, ALVAC-RG (vCP65) in non-avian species, Vaccine 13: 539-549, 1995). Рекомбинантный canarypox вирус, экспрессирующий четыре HIV гена gag, pol, env и nef, был уже использован в клинических испытаниях (Peters, В.S., The basis for HIV immunotherapeutic vaccines, Vaccine 20: 688705, 2001). Поскольку авипоксвирусы продуктивно реплицируются только в птичьих клетках, эти клетки должны быть использованы для амплификации вируса и для получения рекомбинантных вирусов. Примером canarypox вируса является штамм Rentschler. Очищенный на бляшках Canarypox штамм,названный ALVAC (US 5766598), был помещен в соответствии с условиями Будапештского договора вAmerican Type Culture Collection (ATCC), номер доступа VR-2547. Другой штамм Canarypox является коммерческим canarypox вакцинным штаммом, обозначенным LF2 СЕР 52 4 24 10 75, имеющимся в наличии в Institute Merieux, Inc. Примерами Fowlpox вируса являются штаммы FP-1, FP-5 и TROVAC (US 57 66598). FP-1 являетсяDuvette штаммом, модифицированным для использования в качестве вакцины для цыплят возрастом один день. Штамм является коммерческим вакцинным штаммом fowlpox вируса, обозначенным 0 DCEP 25/СЕР 67/2309 October 1980 и имеющимся в наличии в Institute Merieux, Inc. FP-5 является коммерческим вакцинным штаммом fowlpox вируса, выделенным из эмбрионов цыплят, имеющимся в наличии вLicense No. 165, serial No. 30321. Из поксвирусов виды vaccinia (коровья оспа) и variola (натуральная оспа) являются наиболее известными. Вирус variola является причиной натуральной оспы. В отличие от вируса variola, вирус vaccinia обычно не вызывает системного заболевания у иммунокомпетентных индивидуумов и, таким образом, использовался как живая вакцина для иммунизации против натуральной оспы. Успешная по всему миру вакцинация вирусом vaccinia привела в 1980-х к эрадикации натуральной оспы как природного заболевания (The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification ofsmallpox eradication; History of Public Health, No. 4, Geneva: World Health Organization, 1980). С этого времени вакцинация была приостановлена на много лет, за исключением людей, имеющих высокий риск поксивирусной инфекции (например, работников лабораторий). Однако, возрастает опасение, что, например, variola, вызывающая натуральную оспу, может быть использована как оружие биотерроризма. Более того, существует риск, что другие поксвирусы, такие как коровья оспа, верблюжья оспа и обезьянья оспа, могут потенциально мутировать, посредством механизмов селекции, и приобрести сходные сvariola фенотипы. Таким образом, некоторые правительства накапливают запасы vaccinia-основанных вакцин для использования как перед воздействием (перед встречей с вирусом variola), так и после воздействия (после встречи с вирусом variola) предполагаемой или актуальной атаки натуральной оспы. В детальном предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор является вектором на основе vaccinia вируса (вируса коровьей оспы). Вирус vaccinia (вирус коровьей оспы) является чрезвычайно иммуностимулирующим и вызывает сильный В- (гуморальный) и Т-опосредованный (клеточный) иммунитет как к его собственным генным продуктам, так и к множеству продуктов чужеродных генов, экспрессируемых с генов, интегрированных в vaccinia геном. Вирус vaccinia представляется, таким образом, идеальным вектором для вакцин против натуральной оспы и других инфекционных заболеваний и рака в форме рекомбинантных вакцин. Многие из рекомбинантных вирусов коровьей оспы, описанных в литературе, основаны на полностью компетентном в репликации штамме vaccinia вируса Western Reserve. Однако, известно, что этот штамм имеет чрезвычайную нейровирулентность и является, таким образом, плохо подходящим для применения у людей и животных (Morita et al. 1987, Vaccine 5, 65-70). Подходящий вирус vaccinia (вирус коровьей оспы) может быть выбран из группы, состоящей из штамма Copenhagen (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 and 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196,381- 401), штамма Wyeth, NYVAC (см. WO 92/15672 и Tartaglia et al., 1992, Virology 188, 217-232) и сильно ослабленного модифицированного Ankara (MVA) штамма (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16). Предпочтительным примером подходящего вируса vaccinia является сильно ослабленный штамм вируса vaccinia NYVAC, который получен из клонированного на бляшках изолята вакцинного штаммаCopenhagen путем делеции 18 открытых рамок считывания (ORF) из вирусного генома (Tartaglia et al.,NYVAC: A highly attenuated strain of vaccinia virus, Virology 188, 217-232, 1992). NYVAC характеризуется существенно сниженной способностью к репликации в различных клетках культуры тканей человека, но остающейся способностью к индуцированию сильных иммунных ответов на посторонние антигены. Все вышеописанные вирусы являются одинаково подходящими для использования в настоящем изобретении. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения вирус является модифицированным вирусом коровьей оспы Ankara (MVA), который известен как исключительно безопасный при вакцинации. Модифицированный вирус коровьей оспы Ankara (MVA) относится к вирусу Vaccinia, члену родаOrthopoxvirus в семействе Poxviridae. MVA был получен в 516 последовательных пассажах на фибробластах эмбриона цыпленка дермального vaccinia штамма Ankara (Chorioallantois vaccinia virus Ankara, CVA)(для обзора см. Mayr, A., et al., Passage History: Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA, Infection 3, 6-14, 1975). Вследствие этих долговременных пассажей результирующий вирус MVA потерял примерно 31 килобаз своей геномной последовательности и, таким образом, был описан как сильно ограниченный по хозяину к птичьим клеткам (Meyer, H. et al., MappingVirol. 72, 1031-1038, 1991; (Meisinger-Henschel et al., Genomic sequence of chorioallantois vaccinia virus Ankara, the ancestor of modified vaccinia virus Ankara, J. Gen. Virol. 88, 3249-3259, 2007). Было показано на множестве животных моделей, что результирующий MVA является достоверно авирулентным (Mayr, А.Danner, K. Vaccination against pox diseases under immunosuppressive conditions, Dev. Biol. Stand. 41: 22534, 1978). Дополнительно, этот штамм MVA был протестирован в клинических испытаниях в качестве вакцины для иммунизации против натуральной оспы человека (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. В 167, 375-390 [1987], Stickl et al., MVA vaccination against smallpox: clinical tests with an attenuated live vaccinia virus strain (MVA) (author's transl), Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392, 1974). В этих испытаниях участвовали более 120000 человек, включая пациентов с высоким риском, и было доказано, что в сравнении с вакцинами на основе Vaccinia MVA имеет уменьшенную вирулентность или инфективность, тогда как сохраняет хорошую иммуногенность. Изобретение охватывает рекомбинантные MVA вирусы, полученные с любым и всеми MVA вирусами. Примером MVA штамма является депозит VR-1508, размещенный в American Type Culture collection (ATCC), Manassas, VA 20108, USA. В другом варианте осуществления штамм MVA-Vero или его производный может быть использован в соответствии с настоящим изобретением. Штамм MVA-Vero был помещен в Европейскую Коллекцию Животных Клеточных Культур под номером доступа ЕСАССV99101431 и ЕСАСС 01021411. Дополнительными примерами для MVA вирусных штаммов, используемых в настоящем изобретении, являются штаммы MVA 572 и 575, помещенные в Европейскую Коллекцию Животных Клеточных Культур (ЕСАСС) под номерами доступа ЕСАСС V94012707 и ЕСАССV00120707 соответственно. Особенно предпочтительные MVA вирусы являются MVA вариантными штаммами MVA-BN, как, например, помещенный в ЕСАСС под номером V00083008, и производные,имеющие те же свойства, что MVA-BN.MVA-BN является вирусом, используемым в производстве обособленной противооспенной вакцины третьего поколения. MVA-BN был разработан для дополнительных пассажей MVA штамм 571/572. В настоящее время более чем 1500 субъектов, включая субъекты с атопическим дерматитом(AD) и ВИЧ-инфекцией, были вакцинированы в клинических испытаниях вакциной на основе MVABN. Производные, имеющие те же свойства, что и помещенный в коллекцию штамм MVA-BN, имеют способность репродуктивной репликации in vitro в фибробластах эмбриона цыпленка (CEF), но не способность репродуктивной репликации в человеческих клетках, в которых MVA 575 или MVA 572 могут репродуктивно реплицироваться. Наиболее предпочтительно, MVA не имеет способности репродуктивной репликации в клеточной линии кератиноцитов человека НаСаТ, линии клеток почки эмбриона человека 293, клеточной линии человеческой остеосаркомы кости 143 В и клеточной линии человеческой цервикальной аденосаркомы HeLa. Термин "не способен к репродуктивной репликации" использован в настоящем изобретении, как определено в WO 02/42480 и патенте США 6761893 соответственно. Так, указанный термин применяется к вирусу, который имеет коэффициент вирусной амплификации на 4 день после инфицирования менее чем 1, используя анализ, описанный в патенте США 6761893, который включен здесь посредством ссылки. "Коэффициент амплификации" вируса является отношением количества вируса, продуцированного инфицированной клеткой (Выход), к количеству первоначально используемого для инфицирования клеток вначале (Ввод). Соотношение "1" между Выходом и Вводом определяет статус амплификации, где количество вируса, продуцируемого инфицированной клеткой, является тем же самым, что и количество, первоначально используемое для инфицирования клеток. В наиболее предпочтительном варианте осуществления штамм MVA, используемый в настоящем изобретении, является MVA-BN или его производным, как описано выше. Особенности MVA-BN,описание биологических подходов, позволяющих определить, является ли MVA штамм MVA-BN или его производным, и способы, позволяющие получить MVA-BN или MVA, имеющих свойства MVABN, раскрыты в WO 02/42480. Содержание этих заявок включено в настоящую заявку посредством ссылки. Высоко ослабленный MVA-BN вирус может быть получен, например, путем дополнительного пассирования модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), такого как MVA-572 или MVA575, и, при желании, очисткой на клонах или бляшках. MVA-BN не имеет примерно 13% (26,5 тпо из шести больших и множественных мелких сайтов делеций) генома по сравнению с родовым CVA вирусом. Делеции затрагивают некоторое количество генов вирулентности и круга хозяев, также как и большой фрагмент гена, кодирующего А-тип белка включения (ATI), и гена, кодирующего структурный белок, направляющий зрелые вирусные частицы в тельца включения А-типа. В особенности, сделана ссылка на определение свойств MVA по изобретению, как описано в WO 02/42480, таких как свойства MVA-BN и свойства MVA-BN и определение производных MVA-BN. Указанная ссылка также раскрывает, как MVA и другие вирусы коровьей оспы могут быть размножены. Коротко, эукариотические клетки инфицируются вирусом. Эукариотические клетки являются клетками,которые подвержены инфицированию соответствующим поксвирусом и позволяют репликацию и продукцию инфекционного вируса. Для MVA примером такого типа клеток являются фибробласты эмбриона цыпленка (CEF) и ВНК клетки (Drexler et al., Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates inbaby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells, J. Gen. Virol. 79, 347-352, 1998). CEF клетки можно культивировать при условиях, известных специалисту в области техники. Предпочтительно, CEF клетки культивируют в бессывороточной среде в стационарных флаконах или роллерных флаконах. Инкубацию предпочтительно продолжают 48-96 ч при 37 С. Для инфицирования MVA предпочтительно используется при множественности заражения (MOI) 0,05-1 TCID50; инкубация продолжается предпочтительно 48-72 ч при 37 С. Вирус, при использовании по настоящему изобретению, может быть размножен на различных клеточных культурах, в особенности на культурах клеток животных. Вирусу позволяют инфицировать чувствительные клеточные культуры и репродуктивно реплицироваться. Вирусное потомство собирают с применением обычных в области техники методик. Например, для MVA вирусов и других вирусов коровьей оспы, фибробласты эмбриона цыпленка(CEF) в среде с сывороткой или в бессывороточной среде могут быть инфицированы вирусами. После того, как вирусу позволили репродуктивно реплицироваться, собирают вирусное потомство. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным поксвирусам, предпочтительно вирусу коровьей оспы, в особенности MVA, допускающему экспрессию двух или более гомологичных нуклеотидных последовательностей, в частности, кодирующих последовательностей. Вирус может содержать две, три, четыре или более гомологичных нуклеотидных кодирующих последовательностей. Вектор по настоящему изобретению содержит две нуклеотидные последовательности размером 300 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления вектор содержит три, четыре, пять, шесть и более нуклеотидных последовательностей, которые, конечно, включают также две заявленные нуклеотидные последовательности. 300 нуклеотидов могут, конечно, быть также частью более длинной нуклеотидной последовательности. Кроме того, в различных вариантах осуществления две или более нуклеотидных последовательностей имеют размер 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 или 3000 или даже более нуклеотидов, которые все могут быть частью более длинной нуклеотидной последовательности и которые, конечно, включают 300 нуклеотидов, как заявлено. Как используется здесь, термины "полинуклеотид", "нуклеотидная последовательность", "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты" используются взаимозаменяемо и определяют полимер либо полидезоксирибонуклеотидных (ДНК), либо полирибонуклеотидных (РНК) молекул или любую их комбинацию. Определение включает одно- и двухцепочечные, линейные или кольцевые, встречающиеся в природе или синтетические полинуклеотиды. Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может быть кодирующей последовательностью и может содержать полные гены соответственно. Термин "кодирующая последовательность", как используется здесь, относится к нуклеотидной последовательности, которая кодирует определенную аминокислотную последовательность. Некодирующие последовательности генов включают интроны и контрольные области, такие как промоторы, операторы и терминаторы. Нуклеотидные последовательности также могут содержать фрагменты генов. Нуклеотидные последовательности могут содержать синтетические последовательности, такие как нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные линкерные последовательности или эпитопы. Нуклеотидные последовательности могут состоять из смеси генов, фрагментов генов и синтетических последовательностей. Нуклеотидные последовательности могут также содержать аналоги, такие как нуклеотидные аналоги, аналоги фосфатных эфиров и/или аналоги пентозного сахара. Также в определение нуклеотидных аналогов включены нуклеотиды, в которых фосфатный эфир и/или сахаро-фосфатные эфирные связи замещены другими типами связей, такими как N-(2-аминоэтил)глицин амиды и другие амиды (см., например, Nielsen et al., 1991, Science 254: 1497-1500; WO 92/20702; патент США 5719262; патент США(см., например, Jones et al., 1993, J. Org. Chem. 58: 2983); сульфаматы (см., например, патент США 5470967); 2-аминоэтилглицин, часто упоминаемый как PNA (см., например, Buchardt, WO 92/20702;Nielsen (1991), Science 254:1497-1500); и другие (см., например, патент США 581781; FrierAltman,1997, Nucl. Acids Res. 25:4429 и ссылки, процитированные в них). Аналоги фосфатных эфиров включают, но не ограничиваются, (i) C1-C4-алкилфосфонат, например метилфосфонат; (ii) фосфорамидат;(iii) C1-C6-алкил-фосфотриэфир; (iv) фосфоротиоат и (v) фосфородитиоат. Дополнительные модификации включают химические модификации (например, см. WO 92/03568;US 5118672) с целью увеличения in vivo стабильности нуклеиновой кислоты, усиления ее доставки, или снижения уровня очистки от объектов хозяина. Более того, в одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность может содержать гибридные гены, искусственные гены и полиэпитопы. Гибридный ген, как обозначает здесь, является гибридным геном, сформированным из двух ранее самостоятельных генов, генных фрагментов или искусственной ДНК или эпитопов. Он может возникнуть в результате транслокации, интерстициальной делеции или инверсии. Гибридный ген может быть сконструирован путем соединения по меньшей мере двух ДНК фрагментов, где ДНК фрагменты кодируют идентичные или различные аминокислотные последовательности. Гибридные белки могут облегчать экспрессию и/или очистку белков. Например, полипептид по изобретению может быть получен как глутатион-S-трансфераза (GST) гибридный белок. Такие GST гибридные белки могут быть использованы для облегчения очистки полипептида по изобретению, а именно путем использования глутатион-производных матриксов (см., например, Current Protocols in MolecularBiology, eds. Ausubel et al. (N.Y.: John WileySons, 1991. В другом варианте осуществления, гибридный ген, кодирующий лидерную последовательность для очистки, такую как поли-(His)/сайт расщепления энтерокиназой на N-конце желаемой части рекомбинантного белка, может сделать возможным очистку проэкспрессированного гибридного белка способом аффинной хроматографии с использованиемNi2+ металлической смолы. Лидерная последовательность для очистки может быть удалена при обработке энтерокиназой для получения очищенного белка (например, см. Hochuli et al. (1987), J. Chromatography 411: 177; and Janknecht et al., PNAS USA 88:8972). Дополнительные гетерологичные последовательности,кодирующие полипептид, позволяющий детекцию, изоляцию, растворение и/или стабилизацию полипептида, который был слит, включают поли-His tag, myc, НА, протеин А, протеин G, кальмодулинсвязывающий пептид, тиоредоксин, мальтозасвязывающий белок, полиаргинин, поли-His-Asp, FLAG, часть иммуноглобулинового белка и пептид трансцитоза. Методы получения гибридных генов хорошо известны. Фактически, соединение различных ДНК фрагментов, кодирующих различные полипептидные последовательности, проводится в соответствии с обычными методами, включая тупые и липкие концы для лигирования, расщепление рестрикционными ферментами для получения соответствующих концов, достройка липких концов в случае необходимости,обработка щелочной фосфатазой для избегания нежелаемого соединения и ферментативное лигирование. В другом варианте гибридный ген может быть синтезирован традиционным методом, включающим автоматическое синтезирование ДНК. Альтернативно, ПЦР амплификация фрагментов генов может проводиться с использованием якорных праймеров, что приводит к комплементарному перекрыванию между двумя последовательными фрагментами, которые могут быть последовательно соединены для получения химерной последовательности гена (см., например, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel etal., John WileySons: 1992) и способом гибридизационной ПЦР, где два или более полинуклеотида имеют участок идентичности, который в реакции ПЦР может приводить к гибридной полинуклеотидной последовательности. В другом предпочтительном варианте осуществления нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению кодирует полиэпитоп. Полиэпитом является химерным белком, содержащим отдельные эпитопы из по меньшей мере одного белка/антигена, предпочтительно из более чем одного белка/антигена. Указанные эпитопы могут быть "очищенными" или "биологически чистыми". Термин "очищенный" относится материалу, который является главным образом свободным от компонентов, которые обычно сопутствуют ему, как найдено в его встречающемся в природе окружении. "Очищенный" эпитоп относится к эпитопу, который не содержит соседних аминокислот из всей последовательности антигена или белка, из которого эпитоп происходит. По отношению к аминокислотной последовательности, "эпитоп" является набором аминокислотных остатков, которые вовлечены в распознавание определенным иммуноглобулином, или в контексте Тклеток, эти остатки необходимы для узнавания Т-клеточными рецепторными белками и/или молекулами Главного Комплекса Гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex (MHC. Термин "пептид" относится к ряду аминокислот, соединенных друг с другом, обычно пептидными связями между аминои карбоксильной группами прилегающих аминокислот. Эпитопы имеют определенную длину и связываются с молекулами, функционирующими в иммунной системе, предпочтительно HLA класс I и Т-клеточным рецептором. Эпитопы в полиэпитопном конструкте могут быть эпитопами HLA класса I и, возможно, эпитопами HLA класса II. Эпитопы HLA класса I называют CTL эпитопами, и эпитопы HLA класса II называют HTL эпитопами. Некоторые полиэпитопные конструкты могут иметь подгруппу эпитопов HLA класса I, и другие - подгруппу эпитопов HLA класса II. CTL эпитоп обычно состоит из 13 или менее аминокислотных остатков в длину, 12 или менее аминокислотных остатков в длину или 11 или менее аминокислотных остатков в длину, предпочтительно 8-13 аминокислотных остатков в длину, наиболее предпочтительно 8-11 аминокислотных остатков в длину (т.е. 8, 9, 10 или 11). HTL эпитоп состоит из 50 или менее аминокислотных остатков в длину, и обычно из 6-30 остатков, более обычно из 12-25 и предпочтительно состоит из 15-20 (т.е. 15, 16, 17, 18,19 или 20) аминокислот в длину. Полиэпитопный конструкт по настоящему изобретению предпочтительно включает 2 или более, 5 или более, 10 или более, 13 или более, 15 или более, 20 или более или 25 или более CTL эпитопов. Более точно, полиэпитопный конструкт включает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60 или более CTL эпитопов. Гомологичные нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут быть получены из любого организма, микроорганизма, такого как любой вирус, любая бактерия, любой гриб или паразит. Гомологичные нуклеотидные последовательности могут быть как гетерологичны последовательности вектора, так и гомологичны ему. Когда, например, вирус используется в качестве вектора, также собственные вирусные нуклеотидные последовательности могут быть размножены по настоящему изобретению, например, чтобы сверхэкспрессировать белок вируса для получения усиленной иммунной реактивности или безопасности. Предпочтительно, гомологичные нуклеотидные последовательности получают из инфекционного или патогенного микроорганизма, и наиболее предпочтительно из различных штаммов или кладов, разновидностей, подтипов или серотипов указанного микроорганизма. Термины "штамм" или "клад" являются техническими терминами, известными специалисту, относящимися к таксономии микроорганизмов. Таксономическая система классифицирует все до сих пор охарактеризованные микроорганизмы в иерархическом порядке: семейство, род, вид, штамм (Fields Virology, ed. byFields В. N., Lippincott-Raven Publishers, 4th edition 2001). В то время как критерием для членов семейства являются их филогенетические отношения, рода включают всех участников, которые разделяют общие характеристики, и вид определен как политетический класс, который образовывает воспроизводящуюся линию и занимает определенную экологическую нишу. Термин "штамм" или "клад" описывает микроорганизм, т.е. вирус, который разделяет общие характеристики, такие как основная морфология или структура генома и организацию, но варьирует по биологическим свойствам, таким как диапазон хозяина,тканевой тропизм, географическое распределение, ослабленность или патогенность. Термин "разновидности" или "серотипы" далее различает членов того же самого штамма, также называемых подтипами,которые показывают отдельные спектры инфицирования или аллергенные свойства из-за незначительных геномных изменений. Согласно дальнейшему варианту осуществления настоящего изобретения гомологичные нуклеотидные последовательности предпочтительно отобраны из вирусов. Типичные примеры вирусов включают без ограничения ВИЧ (ВИЧ-1 или ВИЧ-2), вирусы герпеса (например, HSV1 или HSV2), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирусы гепатита (например, вирус гепатита A (HAV),HBV, HCV и вирус гепатита Е), флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки), вирус ветряной оспы(VZV), парамиксовирусы, респираторно-синтициальные вирусы (RSV), вирусы парагриппа, вирус кори,вирусы гриппа и папилломавирусы. В соответствии с другим вариантом осуществления гомологичные нуклеотидные последовательности отобраны из генов вируса Dengue. Наиболее предпочтительными являются гены, полученные из различных серотипов вируса, где эти гены могут быть получены из одного, двух, трех или из всех четырех серотипов вируса Dengue. В предпочтительном варианте осуществления две гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют гены респираторно-синцитиального вируса (RSV). В предпочтительном варианте осуществления гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют RSV-F и/или RSV-G белки. Предпочтительно, один из RSV генов является полноразмерным, а другой является усеченным. В другом предпочтительном варианте осуществления две, предпочтительно три гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют белки вируса Эбола (EBOV). Три гомологичные нуклеотидные последовательности, кодирующие белки вируса Эбола (EBOV), конечно, также покрывают две гомологичные нуклеотидные последовательности. В предпочтительном варианте осуществления гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют EBOV гликопротеины (GP). В наиболее предпочтительном варианте осуществления нуклеотидные последовательности кодируют белки-предшественники гликопротеина из EBOV штаммов EBOV-B (Bundibugyo), EBOV-S (Sudan ebolavirus strain Gulu) и EBOV-Z(Zaire ebola virus strain Mayinga). В другом варианте осуществления гомологичные нуклеотидные последовательности отобраны из бактерий. Типичные примеры подходящих бактерий включают без ограничения: нессерия (например, N.gonorrhea и N. meningitidis); бордетелла (например, В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica), микобактерии (например, М. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, М. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis); легионелла (например, L. pneumophila); эшерихия (например, энтеротоксическая Е. coli, энтерогеморрагическая Е. coli, энтеропатогенная Е. coli); шигелла (например, S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii); сальмонелла (например, S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis); листерия (например, L. monocytogenes); хеликобактер (например, Н. pylori); псевдомона (например, Р. aeruginosa); стафилококк (например, S. aureus, S. epidermidis); энтерококк (например, Е. faecalis, E. faecium); бацилла (например, В. anthracis); коринебактерия (например, С. diphtheriae), и хламидия (например, С. trachomatis, С. pneumoniae,С. psittaci). Типичные примеры паразитов включают без ограничения: плазмодий (например, P. falciparum); токсоплазма (например, Т. gondii); лейшмания (например, L. major); пневмоцистис (например, Р. carinii); и шизостома (например, S. mansoni). Представительные примеры грибов включают без ограничения: кандида (например, С. albicans) и апрегиллус. По меньшей мере две нуклеотидные последовательности могут быть одного размера или разных размеров. В предпочтительном варианте осуществления, одна из двух нуклеотидных последовательностей является усеченной по сравнению с другой. Усечение может быть как с 5'-, так и с 3'-конца. В различных вариантах осуществления 300 нуклеотидов в двух нуклеотидных последовательностях кодируют 100 аминокислот, которые имеют по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% аминокислотной идентичности. В предпочтительном варианте осуществления указанная аминокислотная идентичность находится на участке 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 или более последовательных аминокислот. В особенно предпочтительном варианте осуществления аминокислоты имеют по меньшей мере 75,80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% аминокислотной идентичности на участке по меньшей мере 150 или 200 последовательных аминокислот. В других предпочтительных вариантах осуществления белок, кодируемый двумя нуклеотидными последовательностями, имеет по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% аминокислотной идентичности на участке 300 или 500 последовательных аминокислот. В других предпочтительных вариантах осуществления белок, кодируемый двумя нуклеотидными последовательностями, имеет 85-100%, в особенности 100% аминокислотной идентичности на участке 100, 200, 400, 600 или 800 последовательных аминокислот в попарном сравнении. Как используется здесь, любой термин, относящийся к "процентной идентичности последовательности", такой как "аминокислотная идентичность", относится к степени идентичности между любой данной запрашиваемой последовательностью и последовательностью-объектом. В частности, следующие термины используются для описания родства последовательности между двумя или более нуклеиновыми кислотами, полинуклеотидами или аминокислотными последовательностями: "референсная последовательность", "окно сравнения", "идентичность последовательности", "процент идентичности последовательности" и "структурная идентичность". "Референсная последовательность" является определенной последовательностью, используемой как основа для сравнения последовательности; референсная последовательность может быть частью большей последовательности. Термины "идентичный" или процентно "идентичный", в контексте одной или более последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептида, относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются теми же самыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются теми же (например, 75% идентичный, 80% идентичный, 85% идентичный, 90% идентичный, 99 или 100% идентичный в попарном сравнении), при сравнении и выравнивании для наибольшего соответствия в окне сравнения или обозначенной области при измерении с использованием алгоритма сравнения последовательности или путем ручного выравнивания и визуального осмотра. Процент вычисляют путем опредения числа позиций, в которых гомологичные основания нуклеиновой кислоты или остатки аминокислот присутствуют в обеих последовательностях для получения числа совпавших позиций, деля число совпавших позиций на общее количество позиций в окне сравнения и умножая результаты на 100 для получения процентности идентичности последовательности. Фраза "значительно идентичный", в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов, относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые имеют по меньшей мере примерно 85% идентичности, по меньшей мере примерно 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,98, 99 или 100% идентичности нуклеотидов или аминокислотных остатков, при сравнении и выравнивании попарно для наибольшего соответствия, при измерении с использованием алгоритма сравнения последовательности или путем визуального осмотра. В примере осуществления значительная идентичность имеется в наличии на протяжении области последовательности, которая имеет длину по меньшей мере примерно 50 остатков. В другом примере осуществления значительная идентичность имеется в наличии на протяжении области последовательности, которая имеет длину по меньшей мере примерно 100 остатков. В еще другом примере осуществления значительная идентичность имеется в наличии на протяжении области последовательности, которая имеет длину по меньшей мере примерно 150 или более остатков. В одном примере осуществления последовательности значительно идентичны на протяжении всей длины последовательности нуклеиновой кислоты или последовательности белка. Для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность служит референсной последовательностью, с которой сравнивают тестовые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательности тестовую и референсную последовательности вводят в компьютер,координаты подпоследовательности определяются, в случае необходимости, и определяются параметры программы алгоритма последовательности. Могут использоваться параметры программы по умолчанию,или альтернативные параметры могут быть определены. Алгоритм сравнения последовательности затем вычисляет процент идентичности последовательностей для тестовой последовательности относительно референсной последовательности на основании параметров программы."Окно сравнения", как используется здесь, включает ссылку на отрезок с любым количеством последовательных позиций, отобранных из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно 20-50, от приблизительно 50 до приблизительно 100, от приблизительно 100 до приблизительно 200, чаще от приблизительно 100 до приблизительно 150 или приблизительно 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600,700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 или 3000 или даже больше, в котором последовательность может быть сравнена с референсной последовательностью с тем же самым количеством последовательных позиций после того, как эти две последовательности оптимально выровнены. Процентная идентичность может быть определена с использованием способа сравнения Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970, который является эквивалентным Sellers (SIAM J. of AppliedMath 26; 787-793 (1974. Процентная идентичность может быть определена, например, путем сравнения информации о последовательности с использованием компьютерной программы GAP, версия 6.0, описанной Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) и доступной в University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG), которая использует этот способ сравнения. Предпочтительные параметры по умолчанию для программы GAP включают: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для неидентичности) для нуклеотидов и утяжеленную матрицу сравнения Gribskov и Burgess, Nucl Acids Res. 14:6745, 1986, как описано Schwartz и Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequenceand Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) штраф, равный 3,0 для каждого несоответствия и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом несоответствии; и (3) отсутствие штрафа для окончания несоответствия. Другим подходящим инструментом для применения является ContigExpress из VectorNTI Advance программы (INVITROGEN), например, версии 10.3.1 от 2007 года. В соответствии с настоящим изобретением вырожденность генетического кода используется, чтобы сделать гомологичные или идентичные нуклеотидные последовательности менее гомологичными, с целью предотвращения внутримолекулярной рекомбинации. Указанные различия могут быть уже включены в нуклеотидные последовательности природой и/или включены искусственно путем замещения. В различных вариантах осуществления, количество различных нуклеотидов, берущих начало от природы,плюс от искусственного замещения составляет по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200,250, 300, 350, 400, 450 или 500. Предпочтительно, количество различных оснований составляет по меньшей мере 75, 200 или 450. Количество различий, конечно, варьирует и увеличивается, соответственно, с количеством нуклеотидов в нуклеотидных последовательностях. В предпочтительном варианте осуществления замещены по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 100,125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 нуклеотидов. Указанные замены искусственно введены независимо от количества уже присутствующих отличающихся нуклеотидов, внесенных, например, молчащими мутациями. В различных вариантах осуществления две нуклеотидные последовательности с участками идентичности не более чем 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 или 4 последовательных нуклеотидов после замещения являются предпочтительными. В случае более чем двух нуклеотидных последовательностей, участки идентичности не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 или 4 последовательных нуклеотидов после замещения являются предпочтительными. В другом варианте осуществления нуклеотидные последовательности могут иметь по меньшей мере 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 замещенных нуклеотидов из 300, 400, 500, 600, 700, 800,900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 или 1600 или более нуклеотидов. В контексте этого изобретения замещение нуклеотидов отличными нуклеотидами обозначает техническую или искусственную замену нуклеотидов другими нуклеотидами. Предпочтительно, замещенные нуклеотиды не изменяют кодируемую аминокислотную последовательность. Замещение может быть осуществлено путем идентификации кодонов в двух гомологичных нуклеотидных последовательностях,кодирующих одни и те же аминокислоты и изменения кодонов в одной из двух гомологичных нуклеотидных последовательностей таким образом, что кодоны продолжают кодировать те же самые аминокислоты. Изменение может быть совершено в одной, обеих или всех гомологичных нуклеотидных последовательностях. Например, аминокислота пролин кодируется кодонами ССА, ССС, CCG и CCU (на уровне ДНК U заменяется на Т). Простая нуклеотидная последовательность, СССССС, первоначально кодирующая два пролина в двух гомологичных нуклеотидных последовательностях может быть превращена в CCACCG,также кодирующую два пролина, в одной из двух гомологичных нуклеотидных последовательностей. Альтернативно, одна из последовательностей, кодирующих пролин-пролин, может быть превращена вCCCCCG, и другая в ССАССС. Более сложным примером служит аминокислота серин, которая кодируется кодонами UCA, UCC,UCG, UCU, AGC и AGU. Аналогично, UCAUCA, первоначально кодирующая два различных серина,может быть превращена в множественных гомологичных последовательностях в AGCAGC (не имеющую общих нуклеотидов с UCAUCA) и UCGAGU (имеющую только одну общую позицию с UCAUCA или две позиции с AGCAGC) и так далее. Это позволяет большую гибкость во введении различных нуклеотидных вариантов в две или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих серин-серин. Предпочтительно при кодон-оптимизации, как описано в настоящем изобретении, избегают использования редких кодонов для желаемого хозяина, поскольку редкие кодоны могут блокировать или снизить экспрессию кодируемого белка. Также предпочтительно избегают замен, которые могут ввести сигналы нуклеиновых кислот для желаемого хозяина. Такие сигналы включают, но не ограничиваются, сигналы сплайсинга, сигнала терминации и сигналы инициации. Предпочтительно, следующие мотивы последовательности могут избегаться в зависимости от типа используемого вектора, например, сигнал ранней терминации транскрипции вируса коровьей оспы не нуждается в избегании для многих других векторов, которые не являются поксвирусными векторами: внутренние ТАТА-боксы, chi-сайты и сайты связывания рибосомы; АТ-богатые и GC-богатые участки последовательности;(неявные) донорные и акцепторные сайты сплайсинга и сайты разветвления; и сигналы ранней терминации транскрипции для вируса коровьей оспы: (TTTTTNT). Краткое описание фигур Более полно изобретение может быть понято при обращении к фигурам, на которых изображено следующее. Фиг. 1 изображает сравнение нуклеотидных последовательностей, кодирующих полноразмерныйRSV-F(F) белок с нуклеотидной последовательностью, кодирующей замещенный усеченный RSVFtrunc (Ftrunc) белок. Идентичные последовательности выделены черным, и замещенные нуклеотиды остаются невыделенными. Показано расположение праймеров А 1 и В 2. Фиг. 2 изображает сравнение полноразмерного RSV-F (F) белка с усеченным RSV-Ftrunc (Ftrunc) белком. Полноразмерная последовательность RSV-F усечена на 50 ак, что приводит к получению усеченного RSV-Ftrunc белка. Белок RSV-Ftrunc перекрывает примерно 91% полноразмерного белка. Фиг. 3 изображает экспрессию RSV-F и RSV-Ftrunc из рекомбинантных MVA-BN вирусов в человеческой клеточной линии. Вестерн-блот анализ с экстрактами из инфицированных человеческих клеток после инфицирования различными вирусами на основе MVA-BN, с MOI 10 и лизисом через 24 ч после инфицирования. MVA-BN (контроль с пустым вектором; дорожка 1), MVA-mBN172B (рекомбинантный MVA-BN с полноразмерным RSV-F; дорожка 2), MVA-mBN173B (рекомбинантный MVABN с усеченным RSV-Ftrunc; дорожка 3) и дорожка 4: MVA-mBN175B (рекомбинантный MVA-BN сRSV-F и RSV-Ftrunc). Подсчитанный молекулярный вес белков: RSV-F (61,6 кДа) и RSV-Ftrunc (56,1 кДа). Фиг. 4 А-С изображают ПЦР анализ MVA-mBN175B. Показаны RSV-F (F) и RSV-Ftrunc (Ftrunc). А. Результаты ПЦР с различными праймерными парами. М=маркер (1 kb-ladder, New England Biolabs). Дорожка 1 - MVA-mBN175B. Дорожка 2 - положительная контрольная плазмида (pBN345). Дорожка 3 MVA-mBN. Дорожка 4 водный контроль. Дорожка 5 - положительная контрольная плазмида (pBN343). В. Схема MVA-mBN175B, показывающая расположение праймеров, используемых для ПЦР, показанных на фиг. 4 А. С. Схема MVA-mBN дикого типа, показывающая расположение праймеров. Фиг. 5 А-С изображают гипотетическую рекомбинацию F/Ftrunc между полноразмерным RSV-F геном (F) и усеченным F геном (Ftrunc) в дважды рекомбинантном MVA, и расположение ПЦР праймеров в рекомбинантном и нерекомбинантном вирусах и контрольных плазмидах. A. MVA-mBN175B. В.pMISC173. С. pMISC172. Фиг. 6 изображает анализ ДНК, выделенной из клеток, инфицированных MVA-mBN175B. Дорожки 1 и 7 являются маркерными. Дорожка 2 - MVA-mBN175B. Дорожка 3 является плазмидным контролем для гена F (pBN343). Дорожка 4 является плазмидным контролем для усеченного гена F (pBN345). Дорожка 5 - MVA-BN. Дорожка 6 - водный контроль. Ожидаемый ПЦР продукт гипотетической рекомбинации между RSV-F геном и усеченным F геном RSV-Ftrunc в MVA-mBN175B составляет 613 нуклеотидных пар. Фиг. 7 изображает сравнение трех EBOV (вирус Эбола) GP (гликопротеин) белковых последовательностей. Сравнивали аминокислотные последовательности трех GP белков вируса Эбола штаммовEBOV-B, EBOV-S и EBOV-Z. В сравнении Gaps были не разрешены. Общая идентичность во всех трех белковых последовательностях составила 48,5%. Серый фон: идентичны во всех трех белковых последовательностях. Черный фон: идентичны в двух белках. Фиг. 8 А и 8 В изображают сравнение трех EBOV GP кодирующих последовательностей, используемых в рекомбинантном конструкте на основе MVA-BN. Кодирующие последовательности для GP генов, происходящих из трех EBOV штаммов EBOV-B, -S и -Z, сравнивали перед (неопт; см. фиг. 8 А) и после (опт; см. фиг. 8 В) оптимизации. В сравнении Gaps были не разрешены. Серый фон: идентичные нуклеотидные позиции в трех кодирующих последовательностях. Черный фон: идентичные нуклеотидные позиции в двух кодирующих последовательностях. Идентичность в нуклеотидных позициях трех генов перед оптимизацией (неопт) составляет 45,3%, тогда как после оптимизации (опт) составляет 44,6. Фиг. 9 изображает попарное сравнение трех EBOV GP кодирующих последовательностей, используемых в рекомбинантном конструкте на основе MVA-BN. Кодирующие последовательности для GP генов, происходящие из трех EBOV штаммов EBOV-B, -S и -Z сравнивали попарно перед (неопт; см. фиг. 9 А) и после (опт; см. фиг. 9 В) оптимизации. В сравнении Gaps были не разрешены. Серый фон: идентичные нуклеотидные позиции в кодирующей последовательности. Идентичность в нуклеотидных позициях трех генов перед (неопт) и после (опт) оптимизации сведена в табл. С. Фиг. 10 изображает расщепление рестрикционными ферментами и плазмидную карту плазмидыpMISC210, содержащей полноразмерный (RSV-F) и усеченный (RSV-Ftrunc) белок. Дорожка 1: плазмида pMISC210, содержащая RSV-F и RSV-Ftrunc; дорожка 2: контрольная плазмида pMISC209, содержащая только RSV-Ftrunc; дорожка 3: маркер молекулярного веса. Показан размер полос маркера в парах нуклеотидных оснований (по). Примеры Пример 1. Получение замещенного, усеченного гена F. Было желаемо создание рекомбинантного MVA, экспрессирующего как полноразмерный белокRSV-F, так и усеченную версию RSV-Ftrunc. Однако на основании результатов с MVA и другими вирусами коровьей оспы, содержащими повторяющиеся последовательности, ожидалось, что внутримолекулярная рекомбинация приведет к рекомбинации между двумя копиями гена F, результатом чего будет делеция одной из копий гена F. Чтобы минимизировать наличие длинных участков идентичных нуклеотидов между двумя генамиF, кодоны в нуклеотидной последовательности, кодирующей ген RSV-Ftrunc, были замещены с сохранением аминокислотной последовательности генов F. Избегали использования редких кодонов для млекопитающих и цыплят. Кроме того, избегали замен, которые могли бы ввести сигналы в нуклеиновую кислоту. Такие сигналы включали внутренние ТАТА-боксы, chi-сайты и сайты связывания рибосомы; АТ-богатые и GC-богатые участки последовательности; ARE, INS и CRS элементы последовательности; повторяющиеся последовательности и РНК вторичные структуры; (неявные) донорные и акцепторные сайты сплайсинга, сайты разветвления; и сигналы терминации для коровьей оспы (TTTTTNT). Замещенная нуклеотидная последовательность показана на фиг. 1, в сравнении с кодирующей последовательностью полноразмерного RSV-F белка. Хотя значительная идентичность сохраняется на всем протяжении двух кодирующих последовательностей, в двух кодирующих последовательностях нет остающихся больших участков идентичности, более чем девять последовательных нуклеотидов. На фиг. 2 представлено сравнение белков, кодируемых двумя кодирующими последовательностями. Два белка имеют 100% идентичность на протяжении первых 524 аминокислот (замещенный белок F усечен с карбоксильного конца). Таким образом, хотя эти две кодирующие последовательности кодируют участок идентичных аминокислот, одна из последовательностей была замещена по отношению к другой. Пример 2. Получение рекомбинантных вирусов, содержащих RSV-F гены. ДНК, кодирующая полноразмерный RSV-F ген, была интегрирована в MVA в двух различных сайтах интеграции для получения MVA-mBN170B и MVA-mBN172B (в сайте IGR88/89). Замещенный RSVFtrunc ген был интегрирован в MVA в сайт IGR148/149 для получения MVA-mBN173B. Затем был создан дважды рекомбинантный MVA, содержащий полноразмерный RSV-F ген, интегрированный в MVA в сайте IGR88/89, и замещенный RSV-Ftrunc ген, интегрированный в тот же MVA в сайте IGR148/149. Дважды рекомбинантный вирус был назван MVA-mBN175B. Схематическое изображение этого вируса представлено на фиг. 4 В. Пример 3. Экспрессия F белков с рекомбинантных вирусов. С целью определить, экспрессируется ли белок с замещенной нуклеотидной последовательностью,был проведен вестерн-блот анализ на белковых экстрактах из человеческой клеточной линии, инфицированной рекомбинантным MVA-BNO-основанным вирусом, кодирующим полноразмерный RSV-F ген(MVA-mBN172B), вирусом, кодирующим замещенный RSV-Ftrunc ген (MVA-mBN173B), и дважды рекомбинантным вирусом, кодирующим оба, полноразмерный и RSV-Ftrunc гены (MVA-mBN175B). Все три вируса показали продукцию RSV-F белков соответствующего размера на вестерн-блот анализе(фиг. 3), тогда как MVA-BN контроль (пустой вектор) не показал каких-либо полос, как и ожидалось. Таким образом, полноразмерный F белок и усеченный F белок, экспрессированный с замещенной нуклеотидной последовательности, были экспрессированы индивидуально с однократно рекомбинантногоMVA-BN, но оба были ко-экспрессированы с одного дважды рекомбинантного MVA-BN вируса(MVA-mBN175B) в человеческой клеточной линии. Пример 4. Наращивание рекомбинантного вируса. Клетки фибробластов эмбриона цыпленка были инфицированы MVA-mBN175B, конструктом, содержащим как полноразмерный F ген, так и замещенный RSV-Ftrunc ген, или конструктом, содержащим только один полноразмерный F ген, для получения первого вирусного стока. Сходные титры дважды рекомбинантного вируса, содержащего как полноразмерный F ген, так и замещенный F ген (1,34107TCID50), наблюдали в сравнении с титрами вируса, содержащим только один полноразмерный F ген(1,46107 TCID50). Эти результаты обозначают, что стабильный дважды рекомбинантный MVA был получен, и что рекомбинация между двумя копиями F гена была ограничена путем замещения нуклеотидных оснований в последовательностях. Пример 5. ПЦР анализ рекомбинантных вирусов. ПЦР анализ проводился на ДНК из клеток, инфицированных MVA-mBN175B или MVA-BN, с использованием вставка-специфических или фланк-специфических праймерных пар, изображенных на фиг. 4 В и С. ПЦР А с праймерами А 1/А 2, которые являются специфическими для полноразмерного F гена,детектировала полосу размером 663 нуклеотидные пары (по) в клетках, инфицированных MVAmBN175B, и в специфическом плазмидном положительном контроле, как и ожидалось. Эта полоса, как и ожидалось, отсутствовала в клетках, инфицированных MVA-BN или в водном контроле (фиг. 4 А). ПЦР В с праймерами В 1/В 2, которые являются специфическими для замещенного, усеченного F гена, детектировала полосу размером 625 по в клетках, инфицированных MVA-mBN175B, и в специфическом плазмидном положительном контроле, как и ожидалось. Эта полоса, как и ожидалось, отсутствовала в клетках, инфицированных MVA-BN или в водном контроле (фиг. 4 А). ПЦР С праймерами С 1/С 2,которые детектируют вставки в сайте IGR88/89, детектировала полосу размером 2047 по в клетках, инфицированных MVA-mBN175B, и в специфическом плазмидном положительном контроле, как ожидалось. Эта полоса, как ожидалось, отсутствует в клетках, инфицированных пустым векторным контролемMVA-BN, вместо этого полоса 161 по указывает на ситуацию дикого типа в IGR88/89 в MVA-BN(фиг. 4 А). ПЦР D с праймерами D1/D2, которые детектируют вставки в сайте IGR148/149, детектировала полосу размером 2062 по в клетках, инфицированных MVA-mBN175B, и в специфическом плазмидном положительном контроле, как ожидалось. Эта полоса, как ожидалось, отсутствует в клетках, инфицированных пустым векторным контролем MVA-BN, вместо этого полоса 360 по указывает на ситуацию дикого типа в IGR88/89 в MVA-BN (фиг. 4 А). Рекомбинация между генами F привела бы к гибридному F гену, имеющему части F гена дикого типа и части усеченного F гена (фиг. 5 А). Для определения наличия каких-либо рекомбинантов был проведен ПЦР анализ на ДНК из клеток, инфицированных MVA-mBN175B или MVA-BN, с использованием праймерных пар А 1/В 2 (фиг. 5 В), которым соответствует продукт 613 по, специфический для рекомбинантного гена F. Результаты этой ПЦР не показали детектируемых рекомбинантов (фиг. 6). Эти результаты означают, что был получен стабильный дважды рекомбинантный MVA, и рекомбинация между двумя копиями F гена была ограничена. Пример 6. Получение рекомбинантных генов гликопротеина (GP) трех различных штаммов вируса Эбола(EBOV). Было желаемым получение рекомбинантного MVA, экспрессирующего три гликопротеина (GP) вируса Эбола (EBOV). Штаммы EBOV, используемые здесь, были EBOV-B (Bundibugyo), EBOV-S (Судан) и EBOV-Z (Заир), все принадлежащие к вирусным штаммам, которые высоко детальны для инфицированных людей. Названные три GP имеют общую идентичность 48,5%, что означает, что практически каждая вторая аминокислота в GP белках является идентичной для всех трех штаммов, тогда как процентная идентичность на всем протяжении полноразмерной белковой последовательности в сравнении комбинаций двух штаммов находится между 57,0 и 64,2% (фиг. 7). Для минимизирования наличия длинных участков идентичных нуклеотидов в трех EBOV GP генах,кодоны в трех нуклеотидных последовательностях были замещены, с сохранением кодируемой аминокислотной последовательности трех GP генов. Избегали использования редких для млекопитающих и цыплят кодонов, также как и избегали замен, которые могут ввести в нуклеиновую кислоту сигналы. Такие сигналы включали внутренние ТАТА-боксы, chi-сайты и сайты связывания рибосомы; АТ-богатые иGC-богатые участки последовательности; ARE, INS и CRS элементы последовательности; повторяющиеся последовательности и РНК вторичные структуры; (неявные) донорные и акцепторные сайты сплайсинга, сайты разветвления; и сигналы терминации для коровьей оспы (TTTTTNT). G после ATG старт- 13024749 кодона предусматривает сильную экспрессию и присутствует в оригинальной кодирующей последовательности всех трех EBOV GP генов, и он был сохранен. Хотя от 23,3 до 24,9% нуклеотидов в каждой из 3 оптимизированных EBOV GP кодирующих последовательностей были заменены (см. табл. А), общая идентичность между тремя GP кодирующими последовательностями изменилась несущественно (табл. В). В двух случаях попарное сравнение показало даже незначительно более высокую идентичность после оптимизации кодирующих последовательностей, как показано ниже в табл. В. Таблица А Нуклеотидные замены в трех оптимизированных EBOV GP генах. Таблица показывает количество измененных нуклеотидов в соответствующих позициях в оптимизированных GP кодирующих последовательностях (опт) по сравнению с неоптимизированной (неопт) последовательностью различных штаммовEBOV, на основании общего количества нуклеотидов в [%]. Общее количество по - 1147 Таблица В Идентичные нуклеотидные позиции трех EBOV GP кодирующих последовательностей. Таблица показывает количество идентичных нуклеотидов в соответствующих позициях в двух кодирующих последовательностях различных штаммов EBOV, на основании общего количества нуклеотидов в [%]. Попарные сравнения GP кодирующих последовательностей трех штаммов EBOV EBOV-B, -S и -Z показало идентичность нуклеотидных позиций и распределение идентичностей (фиг. 9). Соответственно,способ по настоящему изобретению привел к укорочению участков нуклеотидной идентичности в EBOVGP-последовательностях. При рассмотрении длинных участков идентичных последовательных нуклеотидов очевидно, что размыкание или укорочение таких участков идентичности является важной частью стратегии для избежания рекомбинации между последовательностями, имеющими некий уровень нуклеотидной идентичности. В таблице С (см. ниже) показано количество участков последовательных идентичных нуклеотидов из попарного сравнения GP кодирующих последовательностей. Перед оптимизацией имеются участки длинной до 23 по, и суммарно имеется 41 участок из 10 или более идентичных нуклеотидов. В оптимизированной версии GP генов найден только один участок длиной 13 по, и могут быть найдены 7 участков длиной 10 или более идентичных нуклеотидов. Таблица С Длинные участки последовательных идентичных нуклеотидов. Таблица показывает количество участков последовательных идентичных нуклеотидов определенной длины в попарном сравнении EBOV GP кодирующих последовательностей перед (неопт) и после (опт) оптимизации. Количество попарных сравнений суммировано в колонке "общее количество". Наиболее длинный участок в неоптимизированном сравнении состоит из 23 последовательных идентичных нуклеотидов, тогда как в оптимизированных генах он уменьшен до максимум 13 нуклеотидов. Показаны только участки длиной 10 или более нуклеотидов. Пример 7. Получение рекомбинантных MVA-BN вирусов с GP генами штаммов EBOV. Три EBOV GP гена были синтезированы GeneArt (Regensburg, Germany) и клонированы в рекомбинантные векторы, учитывая интеграцию в MVA-BN. Был получен рекомбинантный вирус, содержащий три оптимизированных последовательности гомологичных GP генов из трех различных штаммов EBOV. Транскрипция трех интегрированных GP кодирующих последовательностей контролировалась различными отдельными ранний-поздний промоторами. Специфические ПЦР реакции для трех оптимизированных EBOV-GP последовательностей показали наличие трех отдельных генов в рекомбинантном MVA-BN. Пример 8. Получение плазмиды, содержащей RSV-F гены. Две версии RSV-F гена, используемые в примерах 1-5 и показанные на фиг. 1, были клонированы в одну плазмиду и помещены в E.coli TZ101 (Trenzyme GmbH, Konstanz, Germany) с использованием стандартных техник клонирования. Плазмида (см. карту плазмиды на фиг. 10) была выделена и расщеплена рестрикционными ферментами Ale I, Dra III и Spe I, и разделена в 1% ТАЕ агарозном геле (см. фиг. 10). Паттерн полос для pMISC210, кодирующей полноразмерный RSV-F белок и белок RSV-Ftrunc (дорожка 1), также как и контрольная плазмида pMISC209, кодирующая только белок RSV-Ftrunc (дорожка 2) был сравнен с паттернами, ожидаемыми после результатов анализа электронной последовательности плазмид. Ожидаемый размер полос для pMISC210 был 404, 573, 809, 1923 и 4874 по, тогда как дляpMISC209 был ожидаем паттерн полос с размерами 573, 661, 809 и 4874 по. Экспериментально были обнаружены все ожидаемые полосы и никаких дополнительных полос. В случае прохождения рекомбинации между вариантами RSV-F в pMISC210, один или больше наиболее мелких фрагментов были бы утрачены, в зависимости от сайта рекомбинации. В настоящем эксперименте такого однозначно не было найдено. Таким образом, результаты показывают, что плазмида pMISC210 с двумя генами RSV-F (RSV-F и RSV-Ftrunc) является стабильной в E.coli.