Репликационно-дефектные вакцины и вакцинные векторы против флавивирусов

РЕПЛИКАЦИОННО-ДЕФЕКТНЫЕ ВАКЦИНЫ И ВАКЦИННЫЕ ВЕКТОРЫ ПРОТИВ ФЛАВИВИРУСОВ Изобретение относится к репликационно-дефектным вакцинам и вакцинным векторам против флавивирусов, а также к соответствующим композициям и методам. Область применения изобретения Настоящее изобретение относится к репликационно-дефектным вакцинам и вакцинным векторам против флавивирусов, а также к соответствующим композициям и методам. Предпосылки создания изобретения Флавивирусы распространены по всему миру и представляют собой глобальную проблему для здоровья людей. Кроме того, флавивирусы являются значимыми патогенами в ветеринарии. К патогенным флавивирусам относятся вирус жлтой лихорадки (ВЖЛ), вирус лихорадки денге типов 1-4 (ДЕН 1-4),вирус японского энцефалита (ВЯЭ), вирус лихорадки Западного Нила (ВЛЗН), вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) и другие вирусы из серокомплекса ВКЭ, такие как вирус лихорадки кьясанурского леса(ВЛКЛ) и вирус омской геморрагической лихорадки. Разработаны вакцины против жлтой лихорадки[инактивированные вакцины (ИНВ) и ЖАВ] и клещевого энцефалита (ИНВ). В настоящее время лицензированных вакцин для применения у человека против лихорадки денге (ДЕН) и лихорадки Западного Нила (ЛЗН) не существует. Некоторые вакцины применяются в ветеринарии. К таким вакцинам относятся вакцины против ЛЗН у лошадей (ИНВ, рекомбинантные и химерические вакцины) и ЯЭ (ИНВ и ЖАВ), которая используется для профилактики энцефалита у лошадей и мертворождения у свиней в Азии, шотландского энцефаломиелита овец (ИНВ), которая используется для профилактики неврологического заболевания у овец в Соединенном Королевстве, а также вакцина против КЭ (ИНВ), которая используется у сельскохозяйственных животных в Чешской Республике (ИНВ) (Monath and Heinz,Flaviviruses, in Fields et al. Eds., Fields Virology, 3rd Edition, Philadelphia, New York, Lippincott-RavenPublishers, 1996, p. 961-1034). Самым важным из вирусных заболеваний человека, передающихся клещами, является клещевой энцефалит. Это заболевание эндемично для некоторых районов Европы и Северной Америки. Оно обусловливает более 10000 госпитализаций ежегодно; смертность в Европе составляет 0,5-1,5%, а в Сибири и на Дальнем Востоке достигает 6-40%. Значительная часть пациентов страдает от длительных неврологических и психиатрических последствий этой инфекции. Доказана эффективность профилактики этого заболевания с помощью инактивированных вакцин, создаваемых на клеточных культурах куриных эмбрионов. Например, вакцинация 86% населения Австрии (самый высокий показатель в Европе) привела к снижению частоты госпитализаций, примерно на 90% (Heinz and Kunz, Arch. Virol. Suppl. 18:201-205,2004). Инактивированные вакцины дороги и требуют трхкратного введения для первичной иммунизации. Для поддержания иммунитета требуется периодическая ревакцинация (каждые 2 года - 5 лет). Поэтому необходима менее дорогая вакцина против КЭ, которая была бы эффективной после одного-двух введений и создавала бы длительный, желательно пожизненный, иммунитет (такой как создатся при иммунизации против ЖЛ 17D). Эта необходимость признатся ВОЗ в качестве основного приоритета. При разработке кандидатов на звание ЖАВ против КЭ в последние несколько десятилетий посредством эмпирического или рационального ослабления родительского вируса КЭ, как такового, или путм химеризации ВКЭ или вируса Лангат (естественно ослабленного (аттенуированного) флавивируса, который серологически тесно связан с вирусом КЭ) с вирусом Денге 4 возникли определнные трудности. Они были связаны с проблемой остаточной вирулентности кандидатов и/или низкой иммуногенностью либо с чрезмерным ослаблением вируса (Wright et al., Vaccine, 26:882-890, 2008; Maximova et al., J. Virol. 82:5255-5268, 2008; Rumyantsev et al., Vaccine, 24:133-143, 2006; Kofler et al., Arch. Virol. Suppl. 18:191200, 2004; а также ссылки, указанные в этих источниках). Флавивирусы - это мелкие оболочечные вирусы с РНК "плюс-цепь", которые передаются естественным хозяевам через членистоногих (комаров или клещей). Естественными хозяевами, главным образом, являются позвоночные животные, например различные млекопитающие, включая человека, а также птицы. Молекула РНК, составляющая геном флавивируса, содержит около 11000 нуклеотидов и включает в себя длинную открытую рамку считывания (ОРС). Нетранслируемые конечные области генома (3'конец и 5'-конец) включают 120 и 500 нуклеотидов соответственно. ОРС кодирует предшественник полипротеина, который расщепляется во время и после трансляции на отдельные протеины вируса. Протеины закодированы в следующем порядке: C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5, где С (нуклеокапсидный белок), prM/М (предшественник мембранного белка и мембранный белок) и Е (капсульный, или оболочечный, белок) являются структурными белками, т.е. компонентами вирусных частиц, а белки NS представляют собой неструктурные белки, которые участвуют во внутриклеточной репликации вируса. Репликация флавивирусов проходит в цитоплазме клеток хозяина. После инфицирования клеток и трансляции РНК генома вируса начинается процессинг полипротеина. Происходит транслокация (перемещение) участка полипротеина prM в просвет эндоплазматической сети (ЭПС) инфицированных клеток, а затем - транслокация участков Е и NS, которая направляется гидрофобными сигналами для белковprM, Е и NS1. N-концевые участки белков prM, Е и NS1 образуются в результате расщепления клеточной сигналазой, которая располагается в мембране ЭПС со стороны просвета. Получающиеся в результате расщепления отдельные белки остаются заякоренными в мембрану ЭПС своими С-концевыми участками. Большая часть других реакций расщепления, затрагивающих неструктурную область, осуществляется вирусной сериновой протеазой NS2B/NS3. Вирусная протеаза также отвечает за формирование С-концевых участков зрелого белка С, который входит в состав вирионов потомства. Синтезированные молекулы РНК генома вируса и белок С образуют плотный нуклеокапсид сферической формы, который окружается клеточной мембраной, в которую погружены белки Е и prM. Зрелый белок М образуется в результате расщепления белка prM незадолго до высвобождения вирусов с помощью клеточного фермента фурина или аналогичной протеазы. Основной белок оболочки вируса, белок Е, является главной мишенью нейтрализующих антител - основного коррелята иммунитета против флавивирусной инфекции. Другим важным элементом иммунитета является ответ со стороны вирусспецифичных цитотоксичных Т-лимфоцитов (ЦТЛ). Для различных структурных и неструктурных белков флавивирусов описано большое число эпитопов для CD8+ и CD4+ ЦТЛ. Кроме того, ответ со стороны системы врожднного иммунитета также приводит к расщеплению вирусных частиц и участвует в регуляции развития приобретнного иммунитета и иммунологической памяти. В дополнение к инактивированным (ИНВ) и живым аттенуированным вакцинами (ЖАВ) против флавивирусов, которые упоминались выше, разработаны и другие платформы для вакцин. Один из примеров таких платформ основан на химерических флавивирусах, которые включают нуклеокапсид вируса жлтой лихорадки и неструктурные последовательности и белки prME других флавивирусов, к которым предполагается развитие иммунитета. Эта технология использовалась для разработки вакцины против вирусов лихорадки денге (ДЕН), японского энцефалита (ЯЭ), лихорадки Западного Нила (ЛЗН) и энцефалита Сент-Луис (ЭСЛ) (см., например, патенты США 6962708 и 6696281). Клинические исследования химерических флавивирусов, основанных на вирусе жлтой лихорадки, дали многообещающие результаты. Другая платформа для создания вакцин основана на использовании технологии псевдоинфекционных вирусов (ПИВ) (Mason et al., Virology, 351:432-443, 2006; Shustov et al., J. Virol. 21:11737-11748,2007; Widman et al., Adv. Virus. Res. 72:77-126, 2008; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008; Suzuki etal., J. Virol. 83:1870-1880, 2009; Ishikawa et al., Vaccine, 26:2772-2781, 2008; Widman et al., Vaccine 26:2762-2771, 2008). ПИВ - это репликационно-дефектные вирусы, ослабленные делециями генома. В отличие от живых вакцин против флавивирусов, эти вирусы осуществляют только один цикл репликации в живом организме (или как вариант - ограниченное число репликационных циклов; это касается двухкомпонентных конструкций, см. далее), что предоставляет определнные преимущества в плане безопасности. ПИВ также не приводят к развитию виремии и системной инфекции. Более того, в отличие от инактивированных вакцин, ПИВ имитируют инфекцию, вызванную интактными вирусными частицами,что может привести к повышению эффективности вакцины вследствие индукции выраженного ответа со стороны Т- и В-клеток, большей длительности иммунитета, а также к снижению необходимой дозы вакцины. Как и в случае интактных вирусов, вакцины на основе ПИВ являются мишенью для антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, стимулируют колоколоподобные рецепторы(КПР) и вызывают развитие сбалансированного ответа со стороны Т-хелперов-1/Т-хелперов-2(Тх-1/Тх-2). Кроме того, было показано, что конструкции ПИВ в клетках субстрата культивируются в большем титре, обладают слабым цитопатическим эффектом (ЦПЭ) или вообще лишены его, что позволяет организовать их производство с высоким выходом, возможностью нескольких сборов и/или размножения инфицированных клеток субстрата. Принципы технологии ПИВ представлены на фиг. 1 и 2. Существует два варианта этой технологии. В первом варианте создатся однокомпонентный псевдоинфекционный вирус (о-ПИВ), который характеризуется большой делецией в гене нуклеокапсидного белка С. Этот мутантный вирус не способен к образованию инфекционных вирусных частиц в здоровых клетках. Делеция не затрагивает первые 20 кодонов белка С, которые содержат последовательность циклизации РНК, а также аналогичное число кодонов в конце белка С, которые кодируют сайт расщепления вирусной протеазой и сигнальный пептид для prM. Число о-ПИВ может увеличиваться, например, во время производства в клеточных культурах субстрата (во вспомогательных культурах), в которых происходит транскрипция белка С, например, в стабильно трансфицированных клетках, образующих белок С (или более крупные кассеты вспомогательных молекул, включающие белок С), или в клетках, содержащих репликоны альфа-вируса [например,репликон венесуэльского лошадиного энцефалита (ВЛЭ)], которые экспрессируют белок С, или другие внутриклеточные векторы экспрессии, которые экспрессируют белок С. После введения ПИВ в живой организм, например после иммунизации, эти вирусы осуществляют один цикл репликации в отсутствие транскомплементации делеции и не распространяются в окружающие клетки. В инфицированных клетках образуются пустые вирусоподобные частицы (ВПЧ), являющиеся продуктом генов prME ПИВ. Эти частицы приводят к индукции ответа со стороны нейтрализующих антител. Индукция ответа со стороны Т-клеток происходит через презентацию вирусных эпитопов с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса Т. Этот подход был применн к вирусу ЖЛ 17D, вирусам ЛЗН, а также химерическим вирусам ЛЗН/ЯЭ и ЛЗН/ДЕН 2 (Mason et al., Virology, 351:432-443, 2006; Suzuki et al., J. Virol. 83:1870-1880, 2009; Ishikawa et al., Vaccine, 26:2772-2781, 2008; Widman et al., Vaccine, 26:2762-2771,2008; WO 2007/098267; WO 2008/137163). Во втором варианте создатся двухкомпонентный ПИВ (д-ПИВ) (фиг. 2). Клетки субстрата трансфицируются двумя дефектными вирусными РНК: одной - с делецией в гене С и другой - с делецией ге-2 023888 нов оболочечных белков prM и Е. Два дефектных генома дополняют друг друга, что приводит к накоплению двух типов ПИВ в клеточной культуральной среде (Shustov et al., J. Virol. 21:11737-11748, 2007;Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008). Как вариант, возможно раздельное производство двух ПИВ в соответствующих вспомогательных клеточных линиях и последующее смешивание с получением двухкомпонентного состава. Последний вариант обладает некоторым преимуществом: существует возможность корректировки относительных концентраций двух компонентов, что приводит к увеличению иммуногенности и эффективности вакцины. Этот вид вакцины на основе ПИВ должен характеризоваться ограниченным распространением в живом организме, вследствие коинфицирования некоторых клеток в месте заражения обоими компонентами. Считается, что распространение вирусов будет самоограничивающимся, так как число клеток в тканях превышает число вирусных частиц, выделяемых первоначально коинфицированными клетками. Кроме того, для достаточного коинфицирования необходимо относительное высокое содержание частиц инфицирования (ЧИ) и считается, что клетки вне места введения вакцины не подвергаются коинфицированию (например, клетки дренирующих лимфатических узлов). Клетки, инфицированные только ПИВ ЛС, выделяют высокоиммуногенные ВПЧ. Коинфцированные клетки выделяют два вида упакованных дефектных вирусных частиц, которые также стимулируют образование нейтрализующих антител. Считается, что ограниченная инфекция проводит к более выраженному ответу со стороны нейтрализующих антител и Т-клеток, чем о-ПИВ. Для снижения вероятности рекомбинации во время производства вакцины или в живом организме, включая рекомбинацию с циркулирующими флавивирусами, вирусные последовательности в о-ПИВ и д-ПИВ могут быть модифицированы с помощью, например, замещений синонимичных кодонов, что позволит снизить гомологию нуклеотидных последовательностей, а также мутаций комплементарной циклизации 5'-концевых и 3'-концевых элементов. Сущность изобретения В изобретении представлены репликационно-дефектные или дефектные псевдоинфекционные флавивирусы, в том числе геном флавивируса, который включает (i) одну или большее число делеций или мутаций в последовательности нуклеотидов, которые кодируют один или большее число белков из следующей группы: нуклеокапсидный белок С, предшественник мембранного белка (prM), оболочечный,или капсульный, белок (Е), неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) и неструктурный белок 5 (NS5), а также (ii) последовательности, которые кодируют один или большее число гетерологичных патогенов или иммуногенов, имеющих отношение к раку или аллергии. Например, делеция/мутация может затрагивать последовательности гена нуклеокапсидного белка С; последовательности генов предшественника мембранного белка (prM) и/или оболочечного белка (Е); последовательности генов предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е); последовательности неструктурного белка 1 (NS1). Гетерологичный иммуноген может быть получен, например, из следующих патогенов: вируса бешенства (например, эпитопа белка G вируса бешенства), Borrelia burgdorferi (например, иммуногенаOspA или иммуногенного фрагмента этого патогена), клеща (например, белка слюны клеща, представленного одним из следующих белков: 64TRP, Isac и Salp20 - или иммуногенными фрагментами этих белков), вируса гриппа (например, вируса гриппа М 2, эпитопов гемагглютинина (ГА), или нейраминидазы(НА), или иммуногенного фрагмента этих патогенов), вируса иммунодефицита человека (например, кодон-оптимизированного белка ВИЧ gag, tat/nef и gp120 или иммуногенных фрагментов этих белков), вируса папилломы человека (например, нуклеокапсидных белков ВПЧ 16 или ВПЧ 18 L1, L2 или иммуногенных фрагментов этих белков), респираторно-синцитиального вируса (например, гликопротеина F илиG респираторно-синцитиального вируса), паразита малярии и Mycobacterium tuberculosis (см. также ниже). К репликационно-дефектным псевдоинфекционным флавивирусам могут относиться последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка (prM) и/или оболочечный белок (Е). Кроме того, геном репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса может быть представлен геномом вируса жлтой лихорадки, вируса Западного Нила, вируса клещевого энцефалита, вируса Лангат, вируса японского энцефалита, вируса лихорадки денге, вируса энцефалита Сент-Луиса, аттенуированными штаммами этих вирусов, а также химерами этих вирусов (также см. ниже). К примерам химер относятся последовательности генов предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка(Е) первого флавивируса (например, вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат) и последовательности генов нуклеокапсидного белка (С) и неструктурных белков второго флавивируса, отличающегося от первого (например, вируса жлтой лихорадки, вируса лихорадки Западного Нила или вируса Лангат). Геном репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса может быть упакован в частицы, включающие последовательности предшественника мембранного белка (prM) и оболочечного белка (Е) этого же или другого флавивируса. Кроме того, последовательности, кодирующие гетерологичные иммуногены, могут быть вставлены в геном вместо делеций или мутаций в генах одного или большего числа белков, а также включаться в геном в сочетании с такими мутациями или делециями. Последовательности, кодирующие гетерологичные иммуногены, могут быть вставлены в геномы флавивирусов в последовательности, кодирующие оболочечный белок (Е), в последовательности, коди-3 023888 рующие неструктурный белок 1 (NS1), в последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка (prM), между последовательностями, кодирующими оболочечный белок (Е) и неструктурный белок 1 (NS1), между последовательностями, кодирующими неструктурный белок 2 В (NS2B) и неструктурный белок 3 (NS3) и/или иметь вид бицистронной инсерции в нетранслируемой 3'-концевой области генома флавивируса. В изобретении также представлены составы, включающие первый репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус, как это описано выше, и второй (третий, четвртый, ) репликационнодефектный псевдоинфекционный флавивирус, отличающийся от первого, геном которого включает одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, которые кодируют один или большее число белков из следующей группы: нуклеокапсидный белок С, предшественник мембранного белка (prM), оболочечный, или капсульный, белок (Е), неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) и неструктурный белок 5 (NS5). В этих составах один или большее число белков, кодируемых последовательностями, в которых произошли мутации или делеции, второго репликационнодефектного псевдоинфекционного флавивируса, отличаются от одного или большего числа белков, кодируемых последовательностями, в которых произошли делеции, первого репликационно-дефектного псевдоинфекционного флавивируса, отличающегося от второго вируса. В изобретении также представлены методы индукции иммунного ответа на иммуноген со стороны субъекта, которые включают введение субъекту одного или большего числа репликационно-дефектных псевдоинфекционных флавивирусов и/или составов, как это описано в настоящем изобретении. В различных примерах реализации изобретения субъект подвержен риску, однако у него нет инфекции, вызванной этим патогеном, а также заболевания или состояния, связанного с иммуногеном, имеющим отношение к раку или аллергии. В других примерах реализации изобретения у субъекта имеется инфекция,вызванная этим патогеном, или заболевание или состояние, связанное с иммуногеном, имеющим отношение к раку или аллергии. Таким образом, изобретение включает профилактические и лечебные методы. В этих методах иммуноген может быть получен из одного из следующих патогенов: вируса бешенства, Borrelia burgdorferi, клеща, вируса гриппа, вируса иммунодефицита человека, вируса иммунодефицита обезьян, вируса папилломы человека, респираторно-синцитиального вируса, паразита малярии и Mycobacterium tuberculosis (также см. ниже). Кроме того, эти методы могут быть использованы для индукции иммунного ответа на белок, закодированный в геноме флавивируса, в дополнение к источнику иммуногена. В различных реализациях изобретения субъект подвержен риску, однако у него нет инфекции,вызванной флавивирусом, который соответствует геному псевдоинфекционного флавивируса, который включает последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и/или оболочечный белок флавивируса. В других примерах реализации изобретения у субъекта имеется инфекция, вызванная флавивирусом, который соответствует геному псевдоинфекционного флавивируса, который включает последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и/или оболочечный белок флавивируса. В настоящем изобретении также представлены живые, аттенуированные химерические флавивирусы, в том числе вирус жлтой лихорадки, в котором последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и оболочечный белок, замещены последовательностями, кодирующими предшественник мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, и сигнальная последовательность между генами нуклеокапсидного белка и предшественника мембранного белка химерического флавивируса включает гибрид сигнальных последовательностей нуклеокапсидного белка и предшественника мембранного белка вируса жлтой лихорадки и вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, а также варианты этих последовательностей. В различных примерах реализации изобретения сигнальная последовательность нуклеокапсидного белка/предшественника мембранного белка химерического флавивируса включает последовательности N-конечной области вируса жлтой лихорадки и последовательности С-концевой области вирусов клещевого энцефалита или вируса Лангат (см. ниже). В настоящем изобретении также представлены живые, аттенуированные химерические флавивирусы, в том числе вирус лихорадки Западного Нила, в котором последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и оболочечный белок, замещены последовательностями, кодирующими предшественника мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, и сигнальная последовательность между генами нуклеокапсидного белка и предшественника мембранного белка химерического флавивируса включает гибрид сигнальных последовательностей нуклеокапсидного белка и предшественника мембранного белка вируса жлтой лихорадки и вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, а также варианты этих последовательностей. В изобретении также представлены фармацевтические составы, включающие один или большее число флавивирусов, составов или живых аттенуированных флавивирусов, описанных в настоящем изобретении, и фармакологически приемлемый носитель или растворитель. Кроме того, составы могут включать адъюванты, или вспомогательные вещества. В изобретении также представлены репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, включающим одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклео-4 023888 тидов, кодирующих неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) или неструктурный белок 5 (NS5). Кроме того, в изобретении представлены молекулы нуклеиновых кислот, соответствующих геному псевдоинфекционных флавивирусов или геному живых аттенуированных флавивирусов, описанных в настоящем изобретении, а также комплементарные молекулы. В изобретении также представлены методы получения репликационно-дефектных псевдоинфекционных флавивирусов (описаны ниже), включающие введение одной или большего числа молекул нуклеиновых кислот, упомянутых выше, в клетку, которая экспрессирует белки, соответствующие последовательностям, удалнным из генома флавивирусов репликационно-дефектных псевдоинфекционных вирусов. Согласно этим методам белок может экспрессироваться клеткой из генома второго (третьего, четвртого, ) репликационно-дефектного флавивируса, отличающегося от первого вируса. В других примерах реализации изобретения белок экспрессируется из репликона (например, репликона альфа-вируса,такого как репликон вируса венесуэльского лошадиного энцефалита; см. ниже). В настоящем изобретении также представлены составы из двух или большего числа репликационно-дефектных псевдоинфекционных флавивирусов, в которых два репликационно-дефектных псевдоинфекционных флавивируса - это вирусы из следующей группы: (а) репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса японского энцефалита, и репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса лихорадки денге; (b) репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса жлтой лихорадки, и репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса лихорадки денге;(с) репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат и вставленные в этот геном последовательности, кодирующие иммуноген Borrelia burgdorferi, и репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат и вставленные в этот геном последовательности, кодирующие иммуноген белка слюны клеща,или репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом, содержащим последовательности вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат со вставленными в этот геном последовательностями, кодирующими иммуноген Borrelia burgdorferi и иммуноген белка слюны клеща. В настоящем изобретении также представлены фармацевтические композиции, включающие описанные здесь живые аттенуированные химерические флавивирусы. Кроме того, в изобретении представлены методы индукции иммунного ответа на вирус клещевого энцефалита или вирус Лангат со стороны субъекта, включающие введение этому субъекту такой фармацевтической композиции. В различных примерах реализации изобретения субъект подвержен риску заражения, однако у него нет инфекции,вызванной вирусом клещевого энцефалита или вируса Лангат. В других примерах реализации изобретения субъект инфицирован вирусом клещевого энцефалита или вирусом Лангат. В настоящем изобретении, кроме того, представлены репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом флавивируса, включающего одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, кодирующих один или большее число белков из следующей группы: нуклеокапсидный белок С, предшественник мембранного белка (prM), оболочечный, или капсульный, белок (Е), неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) и неструктурный белок 5(NS5). Геном флавивируса в этих случаях включает последовательности вируса жлтой лихорадки, причм последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и оболочечный белок, замещены последовательностями, кодирующими предшественника мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, и последовательности, кодирующие сигнальную последовательность между белками нуклеокапсида и предшественником мембранного белка генома флавивируса, включают гибрид последовательностей, кодирующих сигнальные последовательности белков нуклеокапсида/предшественника мембранного белка вируса жлтой лихорадки и вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат или варианты этих последовательностей. В различных примерах последовательности, кодирующие сигнальную последовательность нуклеокапсидного белка/предшественника мембранного белка генома флавивируса, включают последовательности 5'-конечной области вируса жлтой лихорадки и последовательности 3'-конечной области вирусов клещевого энцефалита или вируса Лангат. Кроме того, в настоящем изобретении представлены репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы с геномом флавивируса, включающего одну или большее число делеций или мутаций в последовательностях нуклеотидов, кодирующих один или большее число белков из следующей группы: нуклеокапсидный белок С, предшественник мембранного белка (prM), оболочечный, или капсульный, белок (Е), неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) и неструктурный белок 5(NS5). Геном флавивируса в этих случаях включает последовательности вируса лихорадки Западного Нила, причм последовательности, кодирующие предшественника мембранного белка и оболочечный белок, замещены последовательностями, кодирующими предшественника мембранного белка и оболочечный белок вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, и последовательности, кодирующие сиг-5 023888 нальную последовательность между белками нуклеокапсида и предшественником мембранного белка генома флавивируса, включают последовательности, кодирующие сигнальную последовательность белков нулеокапсида/предшественника мембранного белка вируса клещевого энцефалита или вируса Лангат, или варианты этих последовательностей. Кроме того, в изобретении представлены репликационно-дефектные псевдоинфекционные флавивирусы, в том числе геном флавивируса, который включает одну или большее число делеций или мутаций в последовательности нуклеотидов, которые кодируют один или большее число белков из следующей группы: нуклеокапсидный белок С, предшественник мембранного белка (prM), оболочечный, или капсульный, белок (Е), неструктурный белок 1 (NS1), неструктурный белок 3 (NS3) и неструктурный белок 5 (NS5), где любой белок из группы, состоящей из нуклеокапсидного белка (С) и неструктурных белков (NS), в геноме флавивируса принадлежит вирусу Лангат, а любой из предшественников мембранного белка (prM) или оболочечный белок (Е) принадлежит вирусу клещевого энцефалита. Под термином "репликационно-дефектный псевдоинфекционный флавивирус", или "ПИВ", подразумевается флавивирус с недостаточностью репликации вследствие делеции или мутации в геноме флавивируса. Эта делеция или мутация может являться, например, делецией большой последовательности,такой как большая часть гена нуклеокапсидного белка, что описано в настоящем изобретении (с циклизацией оставшейся последовательности; см. ниже). В других примерах делеции подвержены последовательности, кодирующие различные белки (например, prM, Е, NS1, NS3, и/или NS5; см. ниже) или комбинации белков (например, prME или CprME). Этот вид делеции может предоставлять некоторые преимущества, если ПИВ используется в качестве вектора для введения гетерологичного иммуногена, так как делеция создат условия для инсерции последовательности, которая может, например, достигать размера последовательности, затронутой делецией. В других примерах реализации изобретения мутация может быть, например, точечной мутацией, что может приводить к недостаточности репликации, как это указывалось выше. Вследствие делеции или мутации геном не кодирует все белки, необходимые для создания полноценных вирусных частиц. Отсутствующие последовательности могут транскрибироваться в комплементарных клеточных линиях, созданных методами генной инженерии для экспрессии отсутствующих последовательностей (например, с помощью репликона; о-ПИВ; см. ниже), или путм коэкспрессии двух репликационно-дефектных геномов в одной клетке, когда два репликационно-дефектных генома вместе взятых кодируют все белки, необходимые для создания вирусных частиц (система д-ПИВ; см. ниже). После введения в клетки, которые не экспрессируют комплементарные белки, геномы реплицируются и в определнных условиях образуют "вирусоподобные частицы", которые высвобождаются из клеток. Эти частицы способны покинуть клетку, обладают иммуногенностью, но не могут инфицировать другие клетки и приводить к образованию потомства. Например, в случае ПИВ с делецией последовательности, кодирующей нуклеокапсидный белок, после инфицирования клеток нуклеокапсид не экспрессируется, и из клеток выделяются ВПЧ, содержащие белки prME. По причине отсутствия белка нуклеокапсида ВПЧ лишены нуклеокапсида и не имеют генома (нуклеиновой кислоты). В случае д-ПИВ возможно образование ПИВ в клетках, инфицированных двумя видами ПИВ, являющимися комплементарными друг к другу в отношении образования всех необходимых белков (см. ниже). Настоящее изобретение обладает определнными преимуществами. Например, векторы ПИВ и ПИВ, представленные в настоящем изобретении, - сильно ослабленные вирусы, которые после введения одной-двух доз эффективно обеспечивают развитие длительного иммунитета. Более того, в отличие от инактивированных вакцин, ПИВ имитируют инфекцию, вызванную интактными вирусными частицами,что может привести к повышению эффективности вакцины вследствие индукции выраженного ответа со стороны Т- и В-клеток, большей длительности иммунитета, а также к снижению необходимой дозы вакцины. Крометого, как и в случае интактных вирусов, вакцины на основе ПИВ являются мишенью для антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, стимулируют колоколоподобные рецепторы (КПР) и вызывают развитие сбалансированного ответа со стороны Т-хелперов-1/Т-хелперов-2(Тх-1/Тх-2). Было показано, что конструкции ПИВ в клетках субстрата культивируются в большем титре,обладают слабым цитопатическим эффектом (ЦПЭ) или вообще лишены его, что позволяет организовать их производство с высоким выходом, возможностью нескольких сборов и/или размножения инфицированных клеток субстрата. Кроме того, векторы ПИВ, представленные в настоящем изобретении, предоставляют возможность разработки вакцин к патогенам, не являющимся флавивирусами, для которых вакцин в настоящее время не существует. Другие свойства и преимущества настоящего изобретения будут раскрыты далее при более подробном описании изобретения, в пунктах формулы изобретения и фигурах. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - схематическое изображение технологии однокомпонентных ПИВ (о-ПИВ). Фиг. 2 - схематическое изображение технологии двухкомпонентных ПИВ (Д-ПИВ). Фиг. 3 - схематическое изображение общего дизайна эксперимента исследования иммуногенности и эффективности ПИВ у мышей. Фиг. 4 - схема, на которой показано сравнение иммунного ответа, вызываемого ПИВ ЛЗН(ВБ-ЛЗН - вакциной на основе вируса бешенства против лихорадки Западного Нила), и иммунного ответа, вызываемого ЖАВ против ЖЛ/ЛЗН (ХВ-ЛЗН - химерической вакциной против жлтой лихорадки и лихорадки Западного Нила) у мышей. Фиг. 5 - схемы, на которых представлены результаты инфицирования хомяков, иммунизированных ПИВ-ЖЛ (ВБ-ЖЛ), ЖЛ 17D, ПИВ-ЛЗН (ВБ-ЛЗН) и ЖАВ ЖЛ/ЛЗН (ХВ-ЛЗН), адаптированным к хомякам штаммом Asibi (вакцины ПИВ-ЖЛ и ЖЛ 17D) и диким типом вируса ЛЗН (штамм NY99) (вакцины ПИВЛЗН и ЖАВ ЖЛ/ЛЗН). Фиг. 6 - таблица, в которой приведены титры вирусов ЖЛ/КЭ и ЖЛ/ЛГТ (Лангат) и описана морфология бляшек, которые получаются с указанными химерическими флавивирусами. Фиг. 7 - таблица, в которой приведены титры ПИВ ЛЗН/КЭ и показаны примеры иммунофлуоресценции клеток, содержащих указанные ПИВ. Фиг. 8 - схемы, на которых показана кинетика репликации ЖАВ ЖЛ/КЭ и ПИВ-ЛЗН/КЭ в клеточных линиях Vero и ПДХ (почек детнышей хомяков) (ХВ-Hypr = ЖАВ ЖЛ/Hypr; ХВ-ЛГТ = ЖАВ ЖЛ/ЛГТ; ВБ-ЛЗН/ВКЭ = ПИВ-ЛЗН/ВКЭ). Фиг. 9 - схемы, на которых показана выживаемость мышей, инфицированных внутрикожно ПИВКЭ и ЖАВ ЖЛ/КЭ в тесте нейровирулентности (мыши ICR в возрасте 3,5 недели; ВБ-ЛЗН/Hypr = ПИВЛЗН/КЭ(Hypr); ХВ-Hypr = ЖАВ ЖЛ/КЭ(Hypr); ХВ-ЛГТ = ЖАВ ЖЛ/ЛГТ). Фиг. 10 - схемы, на которых показана выживаемость мышей, инфицированных внутрибрюшинно конструкциями ПИВ-ЛЗН/КЭ(Hypr) (ВБ-ЛЗН/Hypr), ЖАВ ЖЛ/КЭ(Hypr) (ХВ-Hypr) и ЖАВ ЖЛ/ЛГТ(ХВ-ЛГТ) и ЖЛ 17D в тесте нейровирулентности (мыши ICR в возрасте 3,5 недели). Фиг. 11 - схемы, на которых показана заболеваемость у мышей, которую отражает динамика потери массы тела после инфицирования вирусом КЭ. Показаны результаты для групп, иммунизированных оПИВ-КЭ (верхняя левая часть фигуры), химерическими вирусами ЖЛ/КЭ и ЖЛ/ЛГТ (верхняя правая часть фигуры) и контрольной группы (ЖЛ 17D, человеческой убитой вакциной против КЭ и имитацией вакцины; нижняя часть фигуры). Фиг. 12 - схематическое изображение конструкций ПИВ, которые экспрессируют белок G вируса бешенства, а также изображение упаковки конструкций с образованием псевдоинфекционного вируса и иммунизации. Фиг. 13 - схематическое изображение инсерций, провидящих к получению жизнеспособных/экспрессирующих конструкций (на примере белка G вируса бешенства). Фиг. 14 - изображения, показывающие результат иммунофлуоресцентного анализа, и схемы, показывающие кривые роста клеток, трансфицированных указанными конструкциями ПИВ-ЛЗН(С-G вируса бешенства, prM-E-G вируса бешенства и CprME-G вируса бешенства). Фиг. 15 - изображения, показывающие результат иммунофлуоресцентного анализа RabG, который экпрессируется в клетках культуры Vero, трансфицированных конструкциями ПИВ (С-G вируса бешенства, prM-E-G вируса бешенства и С-PrM-E-G вируса бешенства). Фиг. 16 - схематическое изображение конструкции ПИВ-ЛЗН-G вируса бешенства и изображения,на которых показано, что эта конструкция распространяется во вспомогательных клетках, но не в обычных клетках. Фиг. 17 - схемы, на которых показана стабильность гена белка G вируса бешенства в векторах ПИВ-ЛЗН. Фиг. 18 - изображения, показывающих распространение однокомпонентных и двухкомпонентных вариантов ПИВ-ЛЗН-G вируса в клетках культуры Vero. Фиг. 19 - изображения анализа иммунофлуоресценции, который показывает экспрессию полномерного белка F респираторно-синцитиального вируса (РСВ) (штамм А 2) компонентом prME д-ПИВ-ЛЗН во вспомогательных клетках после трансфекции. Подробное описание изобретения В настоящем изобретении представлены векторы на основе репликационно-дефектных или дефектных псевдоинфекционных вирусов (ПИВ), включающие последовательности флавивирусов, которые могут быть использованы для индукции иммунитета против гетерологичных патогенов и иммуногенов,имеющих отношение к раку или аллергии, которые вставляются в векторы, а также, возможно, против самих векторов. В изобретении также представлены составы, включающие сочетание ПИВ и/или векторов на основе ПИВ, как это описано ниже, а также методов использования таких составов для индукции иммунного ответа против вставленных последовательностей иммуногенов и/или последовательностей самих ПИВ. Кроме того, в изобретении представлены конкретные ПИВ и живые аттенуированные химерические флавивирусы, включающие последовательности вируса клещевого энцефалита, и связанные с этими вирусами векторы, составы и методы их использования. Описание векторов на основе ПИВ, ПИВ и живых аттенуированных химерических флавивирусов, составов и методов настоящего изобретения приводится ниже. Векторы на основе ПИВ и ПИВ. Векторы на основе ПИВ и ПИВ, представленные в настоящем изобретении, могут основываться на одно- и двухкомпонентных ПИВ, описанные выше (см. также изобретения WO 2007/098267 иWO 2008/137163). Например, в случае однокомпонентных ПИВ, векторы на основе ПИВ и ПИВ могут включать геном, имеющий большую делецию в последовательности, кодирующей белок нуклеокапсида,и образовываться в комплементарной клеточной линии, в которой также образуется нуклеокапсидный белок (однокомпонентный ПИВ, фиг. 1 и 12). В соответствии с этим подходом делеции подвергается большая часть области генома, кодирующей нуклеокапсидный белок, что не допускает образования инфекционного потомства в обычных здоровых клеточных линиях (т.е. клеточных линиях, не экспрессирующих последовательность нуклеокапсида) и у вакцинированных субъектов. Делеция гена нуклеокапсида обычно не нарушает целостность последовательности РНК, необходимой для циклизации геномаprM (предшественника мембранного белка), необходимой для созревания prM в М (мембранный белок). В определнных примерах реализации изобретения удалнные последовательности соответствуют последовательностям, кодирующим аминокислоты 26-100, 26-93, 31-100 или 31-93 белка С (нуклеокапсида). В клеточных линиях, экспрессирующих С или кассету CprME, может происходить размножение векторов на основе однокомпонентных ПИВ или ПИВ, которые реплицируются в таких линиях в большом количестве. Примерами клеточных линий, которые могут быть использованы для экспрессии векторов на основе однокомпонентных ПИВ и ПИВ, могут служить клеточные линии ПДХ-21 (почек детнышей хомяков) (например, АТСС CCL-10), Vero (например, АТСС CCL-81), C7/10 и другие клетки позвоночных и комаров. В таких клетках могут экспрессироваться белок С или кассета CprME благодаря применению репликона из вирусного вектора, такого как репликон альфа-вируса (например, репликона, основанного на вирусе венесуэльского лошадиного энцефалита (ВВЛЭ), вирусе лихорадки Синдбис, вирусе леса Семлики (ВСЛ), вирусе восточного лошадиного энцефалита (ВВоЛЭ), вирусе западного лошадиного энцефалита (ВЗЛЭ) или вирусе лихорадки реки Росс). Для снижения вероятности продуктивной рекомбинации между векторами на основе ПИВ/ПИВ и комплементарными последовательностями последовательности в репликонах (кодирующие белки С, prM и/или Е) могут включать мутации нуклеотидов. Например, последовательности, кодирующие комплементарный белок С, могут включать ненормальную последовательность циклизации. Мутации могут соответствовать оптимизации кодона, что может предоставить дополнительное преимущество в отношении выхода ПИВ. Кроме того, в случае комплементарных клеток, экспрессирующих последовательности белка С (и кассеты CprME), может оказаться полезным включить якорную последовательность в С-концевую область белка С, включающую,например, около 20 аминокислот prM (см., например, изобретение WO 2007/098267). Векторы на основе ПИВ и ПИВ, представленные в настоящем изобретении, также могут быть основаны на технологии двухкомпонентного генома, которая описана выше. Эта технология предполагает использование двух частичных конструкций генома, каждая из которых характеризуется дефектом экспрессии по меньшей мере одного белка, необходимого для продуктивной репликации (нуклеокапсидного или prM/Е). Однако если эти геномы присутствуют в одной и той же клетке, то это приводит к образованию всех компонентов, необходимых для создания ПИВ. В одном из примеров технологии двухкомпонентного генома первый компонент имеет большую делецию гена С, как это описано выше для однокомпонентных ПИВ, а второй компонент имеет делецию prM и Е (фиг. 2 и 12). В другом примере реализации изобретения первый компонент имеет делецию С, prM и Е, а второй компонент - делецию NS1(фиг. 12). Оба компонента могут включать цис-элементы промотора, необходимые для репликации РНК,и полный набор неструктурных белков, которые образуют комплекс репликативных ферментов. Таким образом, оба дефектных генома могут включать 5'-концевую нетранслируемую область и по меньшей мере около 60 нуклеотидов (элемент 1) следующей естественной последовательности, кодирующей белок, которая составляет N-концевой фрагмент белка нуклеокапсида. За этой последовательностью может следовать последовательность расщепления протеазой, такая, как, например, последовательность убихитина или протеазы 2 А, специфичной к вирусу ящура, которая может сливаться с последовательностями,кодирующими белок нуклеокапсида или оболочки (prME). Кроме того, для исключения возможности рекомбинации между двумя дефектными вирусными геномами, что могло бы привести к образованию репликационно-компетентного вируса, могут использоваться искусственные кодон-оптимизированные последовательности (см., например, WO 2008/137163). Подход с двухкомпонентным геномом не требует создания клеточных линий, экспрессирующих комплементарные геномы, таких как клетки, трансформированные с помощью репликонов, как это описывалось выше для подхода с однокомпонентными ПИВ. Примерами клеточных линий, которые могут быть использованы в подходе с двухкомпонентным геномом, могут служить клеточные линии Vero (например, АТСС CCL-81), ПДХ-21 (почек детнышей хомяков) (например, АТСС CCL-10), C7/10 и другие клетки позвоночных и комаров. Дополнительные примеры подхода с д-ПИВ, которые могут использоваться в настоящем изобретении, основаны на использовании комплементарных геномов, включающих делеции последовательностейNS3 или NS5. Возможно использование делеции, например, в генах белков NS1, NS3 или NS5. Эта делеция может включать несколько сотен аминокислот в ОРС, всю последовательность определнного белка или затрагивать одну аминокислоту, инактивируя ферментную активность белка (например, активность РНК-полимеразы NS5, активность геликазы NS3 и т.д.). Кроме того, в последовательности белков NS может происходить точечное изменение аминокислоты (1 мутация, изменяющая аминокислоту, или, как вариант, большее число мутаций). Эти мутации также будут приводить к инактивации фермента. В дополнение к этому, в одной вспомогательной могут сочетаться несколько делеций NS. Тот же гетерологичный ген, например, экспрессирующийся первым компонентом д-ПИВ, может экспрессироваться вместо или в сочетании с делецией(ями) во втором компоненте, увеличивая количество экспрессированного иммуногена. Следует отметить, что мкость вспомогательных клеток для инсерций будет возрастать пропорционально величине делеции(ий) NS. Кроме того, вместо делеции во вспомогательной клетке может вставляться другой чужеродный иммуноген (или иммуногены), что приведет к получению поливалентной вакцины. Кроме того, для получения векторов на основе ПИВ или ПИВ, использующихся в настоящем изобретении, как это описано выше, могут применяться и другие дополнительные подходы (см., например,изобретения WO 99/28487, WO 03/046189, WO 2004/108936, US 2004/0265338, US 2007/0249032 и патент США 7332322). Векторы на основе ПИВ и ПИВ, описанные в настоящем изобретении, могут состоять из последовательностей одного из видов флавивирусов (например, вируса клещевого энцефалита (ВКЭ, например штамма Hypr), вируса Лангат (ЛГТ), вируса жлтой лихорадки (ЖЛ 17D), вируса лихорадки Западного Нила, вируса японского энцефалита, вируса лихорадки денге (серотипов 1-4), вируса энцефалита СентЛуис, вируса Куньин, вируса энцефалита Росио, вируса Ильеуса, вируса центрально-европейского энцефалита, вируса сибирского энцефалита, вируса русского весеннее-летнего энцефалита, вируса лихорадки Кьясанурского леса, вируса омской геморрагической лихорадки, вируса шотландского энцефаломиелита овец, вируса Повассан, вируса Негиши, вируса Абсерратова, вируса Хансалова, вируса Апои) или могут включать последовательности двух и большего числа вирусов. Последовательности некоторых штаммов этих вирусов легкодоступны в общеизвестных базах данных последовательностей; последовательности других штаммов можно легко установить с помощью методов, известных специалистам в этой области науки. В случае векторов на основе ПИВ и ПИВ, включающих последовательности более чем одного флавивируса, последовательности могут принадлежать химерическим флавиврусам, как это описано выше (также см., например, патенты США 6962708; 6696281; 6184024). В определнных примерах реализации изобретения химеры включают последовательности генов предшественника мембранного белка и оболочечного белка от одного флавивируса (такого как флавивирус, к которому предполагается развитие иммунитета) и последовательности генов нуклеокапсидного и неструктурных белков от другого вируса, отличающегося от первого. В отдельном примере реализации изобретения вторым вирусом является вирус жлтой лихорадки, например вакцинным штаммом ЖЛ 17D. К другим примерам относятся химеры ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ, описанные ниже. Другим примером является химера ЛГТ/КЭ, основанная на геноме вируса ЛГТ и содержащая белки prME вируса КЭ. Вакцина на основе ППИВ, основанная на этом генетическом подходе, должна обладать рядом преимуществ, поскольку вирус ЛГТ реплицируется in vitro очень эффективно и является высокоаттенуированным вирусом, иммуногенным для людей. Таким образом, химерическая вакцина на основе ПИВ ЛГТ/КЭ, как ожидается, будет обеспечивать развитие мощного специфического иммунного ответа у человека против КЭ, в частности,вследствие включения генов prME КЭ. Векторы, представленные в настоящем изобретении, могут иметь в своей основе ПИВ или живой аттенуированный химерический флавивирус, как это описано в настоящем изобретении (в частности,ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ; см. ниже). Использование конструкций ПИВ в качестве векторов предоставляет определнные преимущества при определнных обстоятельствах, поскольку эти конструкции при необходимости включают большие делеции, что делает эти конструкции более подходящими для размещения инсерций. Эти инсерции могут достигать размеров удалнных сегментов, не приводя к потере репликационной активности. Таким образом, векторы на основе ПИВ могут включать очень маленькие инсерции (например, величиной в 6-10, 11-20, 21-100, 101-500 (или больше) аминокислотных остатков в сочетании с делецией С или другими делециями), а также относительно крупные инсерций или инсерций промежуточного размера (например, величиной в 501-1000, 1001-1700, 1701-3000 или 3001-4000 (или больше) остатков). В отличие от этого, в определнных примерах реализации изобретения может оказаться более выгодным экспрессировать относительно короткие последовательности в живых аттенуированных вирусах, особенно если инсерции произошли без соответствующей делеции. Дополнительная информация, касающаяся сайтов инсерций, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, приведена ниже. В дополнение к этому, как это будет описано далее, экспрессия иммуногенов, не принадлежащих к флавивирусам, в ПИВ и химерических флавивирусах настоящего изобретения может привести в созданию двойных вакцин, которые будут проявлять защитные иммуногенные свойства против патогена векторного флавивируса и целевого гетерологичного иммуногена (например, патогена (такого как бактериальный, вирусный, паразитарный или грибковый патоген) или иммуногена, имеющего отношение к раку или аллергии). Как указывалось выше, векторы на основе ПИВ и ПИВ настоящего изобретения могут включать последовательности химерических флавивирусов, например химерического флавивируса, включающего гены предшественника мембранного белка и оболочечного белка первого флавивируса (например, флавивируса, к которому предполагается развитие иммунитета), и гены нуклеокапсидного и неструктурных белков второго флавивируса, отличающегося от первого, такого как вирус жлтой лихорадки (например,ЖЛ 17D; см. ниже, а также патенты США 6962708; 6696281; 6184024). Кроме того, химерические вирусы, представленные в настоящем изобретении, используемые в качестве источника для создания ПИВ или в качестве вакцины/вакцинного вектора, могут также включать одну или большее число специфичных аттенуирующих мутаций (например, мутации гена белка Е, гена белка prM, делецию в гене белка С и/или делецию в 3'-концевой нетранслируемой области генома), таких как описанные в изобретенииWO 2006/116182. Например, делеция белка С или делеция в 3'-концевой нетранслируемой области генома может непосредственно затрагивать химеры ЖЛ/КЭ или ЖЛ/ЛГТ. Аналогичные делеции могут быть разработаны и введены в химерические вирусы-кандидаты на звание ЖАВ, такие как химеры, основанные на геномах ЛГТ/КЭ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ. Что касается мутаций гена белка Е, то следует указать, что могут быть разработаны и использованы аттенуирующие мутации, аналогичные описанным для химеры ЖЛ/ЛЗН в изобретении WO 2006/116182. Эти мутации основаны на кристаллической структуре белка Е(Rey et al., Nature, 375(6529):291-298, 1995). Более того, дополнительные примеры аттенуирующих мутаций гена белка Е, описанные для вируса КЭ и других флавивирусов, представлены в табл. 9. Эти мутации также могут быть введены в вирусы-кандидаты на звание химерической вакцины. В изобретении также представлены новые, в частности, химерические флавивирусы, которые могут использоваться для создания векторов на основе ПИВ и ПИВ как векторы на основе живых аттенуированных химерических вирусов, а также как вакцины против источника предшественника мембранного белка и оболочечного белка химеры. Эти химеры включают вирус клещевого энцефалита (КЭ) или связанные с этим вирусом последовательности prME. Таким образом, химеры могут включать последовательности prME, например, от вируса КЭ штамма Hypr или вируса Лангат (ЛТТ). К нуклеокапсидным и неструктурным белкам химеры могут относиться белки вируса жлтой лихорадки (например, ЖЛ 17D) или вируса лихорадки Западного Нила (например, NY99). Основным свойством этих химер, приведенных здесь в качестве примеров (ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ,ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ), является наличие сигнальной последовательности между генами нуклеокапсидного белка и предшественника мембранного белка. Как показано в примерах (см. ниже), авторами было установлено, что в случае химер ПИВ на основе вируса ЖЛ наиболее выгодно использовать сигнальную последовательность, включающую последовательности вируса жлтой лихорадки и КЭ. В одном примере реализации изобретения сигнальная последовательность включает последовательность вируса жлтой лихорадки в N-концевой области генома (например, последовательность SHDVLTVQFLIL) и последовательность вируса С-концевой области генома вируса КЭ (например, GMLGMTIA), что приводит к получению последовательности SHDVLTVQFLILGMLGMTIA. Нами также было установлено, что в случае химер, основанных на ПИВ ЛЗН, наиболее выгодно использовать сигнальную последовательность, состоящую из сигнальной последовательности вируса КЭ (например, GGTDWMSWLLVIGMLGMTIA). В настоящем изобретении представлены химеры ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ, как ПИВ, так и ЖАВ, которые включают указанные выше сигнальные последовательности или варианты этих последовательностей, включающие замещения, делеции или инсерции 1-8, 2-7 или 4-5 аминокислот, что не оказывает значимого влияния на процессинг сигнальной последовательности. В различных примерах реализации изобретения замещения представлены "консервативными замещениями", которые характеризуются замещением одного аминокислотного остатка другим, биологически сходным остатком. К примерам консервативного замещения относятся замещения одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин,валин, лейцин или метионин, на другой или замещение полярного остатка на другой, как, например, замена аргинина на лизин (и наоборот), глутаминовой кислоты на аспарагиновую (и наоборот), глутамина на аспарагин (и наоборот) и т.д. Дополнительная информация, касающаяся химер, приведена ниже, в разделе "Примеры". Сайты инсерции. Последовательности, кодирующие иммуногены, могут вставляться в один или большее число различных сайтов векторов, представленных в настоящем изобретении. Относительно короткие пептиды могут получаться на поверхности гликопротеинов ПИВ и ЖАВ (например, белков prM, Е и/или белковNS1) и/или в контексте других белков (для индукции преимущественного ответа со стороны В-клеток и Т-клеток соответственно). Другие вставки, включая более крупные части чужеродных белков, а также полноценные белки, могут экспрессироваться между генами на N- и С-концевых участках полипротеина,а также бицистронно (например, в пределах ОРС под СВВР (сайтом внутреннего входа рибосом) или в пределах 3'-концевой нетранслируемой области под СВВР; см., например, изобретения WO 02/102828,WO 2008/036146, WO 2008/094674, WO 2008/100464, WO 2008/115314, а также более подробно далее по тексту). В конструкциях ПИВ имеется дополнительная возможность инсерции чужеродных последовательностей аминокислот непосредственно в место делеции(ий). Инсерции могут происходить, например,в участках С, prME, С-prM-E, NS1, NS3 и NS5. Таким образом, в одном из примеров реализации изобретения в случае о-ПИВ и делеции компонента С (С) д-ПИВ последовательности, кодирующие иммуноген, могут вставляться в место удалнных последовательностей гена белка нуклеокапсида. Последовательности, кодирующие иммуноген, могут также вставляться в место удалнных последовательностей в компоненте prME (prME) д-ПИВ. В другом примере реализации изобретения последовательности вставляются в место удалнных последовательностей конструкций С-prM-E или инсерции происходят в комбинации с такими делециями. Примеры таких инсерций представлены в разделе "Примеры"(см. ниже). В случае инсерции в место делеции ПИВ они могут происходить с несколькими (например, 1, 2, 3, 4 или 5) дополнительными вектор-специфичными остатками на N- и/или С-концевом участке чужеродного иммуногена, если эта последовательность хорошо сочетается внутри рамки считывания (например, 20 первых аминокислот и несколько последних остатков белка С, если последовательность вставляется вместо делеции С). Эти инсерции также могут происходить без дополнительных остатков, если чужеродный иммуноген на концах содержит широко встречающиеся в природе соответствующие элементы (например, сайты расщепления вирусной протеазой; сайты расщепления клеточной протеазой, такой как сигналаза, фурин и т.д.; аутопротеаза; терминирующий кодон и/или элементы СВВР). Если белок экспрессируется за пределами непрерывной вирусной открытой рамки считывания(ОРС), например если векторная и невекторная последовательности разделяются сайтом внутреннего входа рибосом (СВВР), то может наблюдаться цитоплазматическая экспрессия продукта или продукт может направляться сразу по секреторному пути благодаря использованию соответствующих сигнальных/якорных сегментов. Если белок экспрессируется в пределах векторной ОРС, то к важным моментам такой экспрессии относятся отщепление чужеродного белка от образующейся полипротеиновой последовательности, а также поддержание правильной топологии чужеродного белка и вирусных белков (для обеспечения жизнеспособности вектора) относительно мембраны ЭПС, например транслокация секретируемых белков в просвет ЭПС, или удерживание цитоплазматических белков или белков, связанных с мембраной, в цитоплазме/в связи с мембраной ЭПС. Рассмотренный выше подход к образованию инсерций может включать использование, например,соответствующих векторных, инсерционных или не связанных с векторами и инсерциями сигнальных и якорных последовательностей, включнных в N- или С-концы гликопротеиновых вставок. Стандартные аутопротеазы, такие как аутопротеаза вируса ящура А 2 (20 аминокислот), или убихитин (ген, содержащий 500 нуклеотидов), или фланкирующие сайты расщепления вирусной протеазой NS2B/NS3 могут использоваться для прямого отщепления экспрессированного продукта из растущей полипептидной цепочки и для выделения чужеродного белка из полипротеина вектора, а также для обеспечения жизнеспособности конструкции. Кроме того, рост полипротеиновой цепочки может останавливаться терминирующим кодоном, например, следующим за вставкой чужеродного гена, а синтез остальных белков в конструкциях может быть начинаться благодаря включению элемента СВВР, например, СВВР вируса энцефаломиокардита, который часто используется в вирусных векторах на основе РНК. Жизнеспособные рекомбинанты могут получаться во вспомогательных клетках (или в обычных клетках в случае подхода на основе д-ПИВ). Кроме того, основные последовательности ПИВ могут быть перегруппированы, например, если это приведт к более эффективной экспрессии чужеродного гена. Например, перегруппировка генов была применена к вирусу КЭ, в котором гены prME были перемещены к 3'-концевой области генома под контролем СВВР (Orlinger et al., J. Virol. 80:12197-12208, 2006). Транслокация генов prME и любых других генов может применяться у ПИВ - кандидатов на звание вакцины против флавивирусов, а также в векторах экспрессии, в соответствии с изобретением. Дополнительные подробности, касающиеся различных сайтов экспрессии, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, представлены ниже (см. также изобретения WO 02/102828,WO 2008/036146, WO 2008/094674, WO 2008/100464, WO 2008/115314, как указывалось выше). Последовательности, кодирующие пептиды, могут вставляться в ген оболочечного белка, который является ос- 11023888 новной мишенью для нейтрализующих антител. Последовательность может вставляться в ген оболочечного белка, например, в положениях, соответствующих аминокислотам 59, 207, 231, 277, 287, 340 и/или 436 оболочечного белка вируса японского энцефалита (см., например, изобретения WO 2008/115314 и WO 02/102828). Для определения соответствующих локусов в различных флавивирусах последовательности этих флавивирусов необходимо сопоставить с последовательностью вируса японского энцефалита. Поскольку точное соответствие может не наблюдаться, следует учитывать, что в других вирусах сайты инсерции могут отличаться, например, на 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в любом направлении. Более того, учитывая определение таких сайтов в качестве допустимых для вируса ЯЭ, они также могут варьировать, например, на 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в обе стороны. С помощью других методов, таких как транспозонный мутагенез (см., например, изобретения WO 02/102828 иWO 2008/036146), возможно определение и других допустимых сайтов инсерций. Инсерции могут происходить в сайтах указанных аминокислот и иметь вид инсерции у С-концевой части указанных аминокислот (т.е. между аминокислотами 51-52, 207-208, 231-232, 277-278, 287-288, 340-341 и 436-437) или происходить в месте коротких делеций (например, делеций 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот), начинающихся с указанных аминокислот (или в пределах 1-5 аминокислот по отношению к указанным позициям в обе стороны). В дополнение к гену оболочечного белка, инсерции могут происходить в генах других вирусных белков, в том числе, например, в гене предшественника мембранного белка/гене мембранного белка и в гене неструктурного белка NS1 (см., например, изобретение 2008/036146). Например, инсерции могут происходить в последовательности, предшествующие сайту расщепления нуклеокапсидного белка/предшественника мембранного белка (например, в позициях -4, -2 или -1), или в пределах первых 50 аминокислот предшественника мембранного белка (например, в позиции 26), и/или между аминокислотами 236 и 237 неструктурного белка NS1 (или в областях, окружающих указанные последовательности,как это писано выше). В других примерах реализации изобретения инсерции могут происходить между генами. Например, инсерции могут происходить между генами белков Е и NS1 и/или между генами белков NS2B и NS3 (см., например, изобретение WO 2008/100464). В одном из примеров межгенной инсерции вставленная последовательность может соединяться с С-концевой частью белка Е вектора, находиться после С-концевого участка сигнальной/якорной последовательности белка Е. Также инсерция может включать С-концевую якорную/сигнальную последовательность, которая соединяется с последовательностью NS1 вектора. В другом примере межгенной инсерции вставленные последовательности,имеющие фланкирующие сайты расщепления протеазой (например, сайты расщепления ЖЛ 17D), могут находиться в отдельном ограниченном сайте - в соединении NS2B/NS3 (WO 2008/100464). В других примерах реализации изобретения последовательность может быть вставлена в контекст сайта внутреннего входа рибосом (СВВР, например СВВР вируса энцефаломиокардита), как это указывалось выше, например в 3'-нетранслируемой области генома (WO 2008/094674). В одном примере такого вектора, основанного, например, на последовательности вируса жлтой лихорадки, кассета СВВР/-иммуноген может вставляться в сайт множественного клонирования, находящийся в 3'нетранслируемой области генома вектора, например в место делеции (например, делеции 136 нуклеотидов вируса жлтой лихорадки) после стоп-кодона полипротеина (WO 2008/094674). Подробности, касающиеся инсерции белка G вируса бешенства и полномерного белка F респираторно-синцитиального вируса в векторы на основе о-ПИВ и д-ПИВ, представленные в настоящем изобретении, указаны в примере 3. Принцип, описанный в примере 3, может применяться в отношении других векторов и иммуногенов, описанных в настоящем изобретении. Иммуногены. ПИВ (о-ПИВ и д-ПИВ), основанные на последовательностях флавивирусов и живых аттенуированных (ослабленных) химерических флавивирусов (например, ЖЛ/КЭ, ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ и ЛЗН/ЛГТ), как это описано выше, могут использоваться в различных вариантах реализации изобретения для представления чужеродных патогенов (например, не являющихся патогенами флавивирусов, т.е. вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных патогенов) и иммуногенов, имеющих отношение к раку или аллергии. Как будет указано далее, в определнных примерах реализации изобретения может оказаться выгодным выбор в качестве мишени нескольких патогенов, которые занимают ту же экологическую нишу, например, встречающихся в одном географическом регионе. Отдельные, но не исключительные примеры таких иммуногенов представлены ниже. В дополнение к вирусу КЭ, клещи, как известно, передают и другое распространнное заболевание - болезнь Лайма. Таким образом, в первом примере реализации изобретения ПИВ, представленные в настоящем изобретении, такие как ПИВ, включающие последовательности вирусов КЭ/ЛГТ, а также химерические флавивирусы, включающие последовательности вируса КЭ (например, ЖЛ/КЭ,ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ, ЛГТ/КЭ и ЛЗН/ЛГТ; во всех случаях, где используется вирус КЭ, возможно использование штамма Hypr этого вируса), могут использоваться как векторы для представления защитных иммуногенов причинного фактора болезни Лайма (клещевой спирохеты Borrelia burgdorferi). Эта комбинация, предназначенная для индукции иммунитета против обоих инфекционных агентов (КЭ и В.burgdorferi), обладает рядом преимуществ, поскольку КЭ и болезнь Лайма являются заболеваниями,- 12023888 передающимися клещами. Подход на основе ПИВ может применяться и для химер (например, ЖЛ/КЭ,ЖЛ/ЛГТ, ЛЗН/КЭ или ЛЗН/ЛГТ) в соответствии с настоящим изобретением, а также для нехимерических вирусов КЭ и ЛГТ. Примером иммуногена В.burgdorferi, который может быть использован в одном из вариантов реализации настоящего изобретения, является OspA (Gipson et al., Vaccine, 21:3875-3884,2003). Кроме того, для повышения безопасности и/или увеличения иммуногенности OspA может подвергаться мутациям, которые будут снижать вероятность аутоиммунного ответа и/или лишать его нежелательных сайтов посттрансляционной модификации в клетках позвоночных животных, такой какN-связанное гликозилирование, что может влиять на иммуногенность продукта экспрессии. Мутации,которые снижают вероятность аутоиммунного ответа, могут включать, например, мутации, описанныеWillett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:1303-1308, 2004. В одном из примеров реализации данного изобретения изменяется FTK-OspA, предполагаемый перекрстно-реагирующий эпитоп для Т-клеток,Bb OspA165-173 (YVLEGTLTA), что делает его похожим на соответствующую последовательность пептидаBorrelia afzelli (FTLEGKVAN). В FTK-OspA соответствующая последовательность выглядит как В настоящем изобретении может использоваться вся последовательность и/или иммуногенные фрагменты полномерной последовательности. К примерам таких фрагментов относятся один или большее число из следующих доменов: домен 1 (аминокислоты 34-41),домен 2 (аминокислоты 65-75),домен 3 (аминокислоты 190-220) и домен 4 (аминокислоты 250-270) (Jiang et al., Clin. Diag. Lab. Immun. 1(4):406-412, 1994). Таким образом, например, может быть получен пептид, включающий любую одну или несколько из следующих последовательностей (которые включают вариации последовательностей, которые могут быть включены в указанные выше последовательности в любой комбинации): В дополнение к иммуногенам В.burgdorferi, могут экспрессироваться белки слюны клещей, такие как 64TRP, Isac и Salp20, что позволит, например, создать кандидата на звание трхвалентной специфичной вакцины (КЭ + болезнь Лайма + клещи). Кроме того, белки слюны клещей могут экспрессироваться вместо иммуногенов В.burgdorferi в векторах, содержащих последовательности вируса КЭ. Также существует большое число других белков слюны клещей, которые могут использоваться для создания вакцины против клещей, в соответствии с настоящим изобретением (Francischetti et al., Insect Biochem. Mol.Biol. 35:1142-1161, 2005). Один или несколько из этих иммуногенов могут экспрессироваться в о-ПИВ-КЭ. Как бы то ни было, также возможно применение д-ПИВ вследствие их большой мкости для инсерций. В дополнение к ПИВ-КЭ, в качестве векторов могут быть использованы и другие вакцины на основе ПИВ, например, для защиты от болезни Лайма и другого заболевания, вызываемого флавивирусами, например лихорадки Западного Нила. Экспрессия этих иммуногенов может оцениваться в клеточной культуре, а иммуногенность/защитные свойства могут изучаться на доступных животных моделях(например, как это описано Gipson et al., Vaccine, 21:3875-3884, 2003; Labuda et al., Pathog. 2(e27):02510259, 2006). Иммуногены и другие патогены могут аналогично экспрессироваться в дополнение к иммуногенам возбудителя болезни Лайма и клещей, что позволит создавать кандидатов на звание поливалентной вакцины. К примерам иммуногенов слюны клещей, которые могут использоваться в качестве вариантов реализации настоящего изобретения, относятся: Более подробная информация, касающаяся ПИВ, связанных с вирусом КЭ, и ЖАВ, представлена в примере 2 (см. ниже). В изобретении также представлены вакцины на основе векторов, в роли которых могут выступать ПИВ и ЖАВ, против других патогенов, не являющихся флавивирусами, включая вакцины с двойным действием, которые вызывают развитие защитного иммунитета как против флавивирусов (в зависимости от того, оболочечный белок какого вируса закодирован в векторе) и других патогенов, не являющихся флавивирусами (в зависимости от экпрессируемых иммунологических детерминант). Этот подход аналогичен примеру векторной вакцины на основе ПИВ против КЭ, болезни Лайма и клещей, описанному ранее. Как указывалось выше, возможно создание таких вакцин с двойным действием против широкого круга патогенов путм экспрессии вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных иммуногенов, а также иммуногенов, связанных с раком и аллергиями. В качестве отдельных, но не исключительных примеров приведм здесь описание структуры и биологических свойств кандидатов на звание вакцины на основе векторов в виде ПИВ и вирусов бешенства и респираторно-синцитиального вируса, сконструированных путм экспрессии белка G вируса бешенства и полномерного белка F РСВ в месте делеций или в сочетании с различными делениями в векторах, представленных одно- или двухкомпонентными ПИВ. Как показано в примерах ниже, конструкции на основе о-ПИВ могут обладать определенными преимуществами для стабильного представления относительно коротких чужеродных иммуногенов (похожих на белок OspA возбудителя болезни Лайма и белки слюны клещей), поскольку эти инсерции сочетаются с относительно короткими делениями АС. Векторы на основе двухкомпонентных ПИВ могут обладать преимуществами для стабильного представления относительно крупных иммуногенов, таких как белок G вируса бешенства и белок F РСВ, поскольку инсерции в таких векторах сочетаются, например, с большими делециями prME, CprME и NS1. Некоторые из компонентов д-ПИВ могут изготавливаться и использоваться как вакцины, например конструкция ПИВ-F РСВ, описанная ниже, содержащая делецию CprME. В этом случае вакцина вызывает развитие иммунного ответа (т.е. появление нейтрализующих антител) преимущественно против экспрессирующегося белка, но не против патогена векторафлавивируса. В других примерах реализации изобретения возможно получение вакцины двойного действия, вызывающей развитие иммунитета против вектора и вставленного компонента. Кроме того, по причине большой мкости для инсерций векторов на основе ПИВ и возможности использования двухкомпонентных геномов векторы на основе ПИВ предлагают возможность одновременного воздействия на несколько патогенов флавивирусов, например, путм экспрессии чужеродных иммуногенов сразу двух различных флавивирусов в двух компонентах д-ПИВ. В дополнение к белку F РСВ, белку G вируса бешенства, защитным иммуногенам возбудителя болезни Лайма и белкам слюны клещей, приведенных выше в качестве примеров чужеродных иммуногенов, возможна экспрессия других чужеродных иммуногенов, что может использоваться для воздействия на другие заболевания, включая, например, иммуногены вируса гриппа типов А и В. В этих примерах реализации изобретения возможно использование нескольких коротких эпитопов и/или целых генов белков вирусных частиц, таких как гены вируса гриппа А М 2, НА и NA и/или гены вируса гриппа В NB или ВМ 2. Более короткие фрагменты М 2, NB и ВМ 2, соответствующие, например, М 2 е или внеклеточному фрагменту М 2, также могут быть использованы. В дополнение к этому возможно использование фрагментов гена НА, включая эпитопы, обозначаемые как НА 0 (23 аминокислоты в длину, что соответствует месту отщепления НА). К отдельным примерам последовательностей, связанных с вирусом гриппа, которые могут быть использованы в вариантах реализации настоящего изобретения, относятся: Дополнительные последовательности М 2 е, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают последовательности из внеклеточного домена белка ВМ 2 вируса гриппа В (консенсусMLEPFQ, например LEPFQILSISGC), а также последовательности пептида М 2 е вируса птичьего гриппаH5N1 (MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD). К другим примерам патогенных иммуногенов, которые могут представляться в векторах этого изобретения, относятся кодон-оптимизированные последовательности белков gag (55 кДа), gp120, gp160 ВИЧ и ВИО (вируса иммунодефицита человека и вируса иммунодефицита обезьян), геныmac239-rev/tat/nef ВИО или аналогичные гены ВИЧ, а также другие иммуногены ВИЧ; иммуногены ВПЧ(вируса папилломы человека), такие как ВПЧ 16, ВПЧ 18 и другие, например нуклеокапсидный белок L1,который самостоятельно формирует ВПЧ-подобные частицы, нуклеокапсидный белок L2 или его иммунодоминантные порции (например, аминокислоты 1-200, 1-88 или 17-36), белки Е 6 и Е 7, которые участвуют в трансформации и иммортализации клеток млекопитающих, соединяясь и соответствующим образом мутируя (соединение двух генов приводит к образованию белка слияния, известного под названиемE6E7Rb-, который примерно в 10 раз слабее вызывает трансформацию фибробластов, и мутации компонента Е 7 во втором остатке делает получившийся мутированный белок слияния неспособным вызывать трансформацию) (Boursnell et al., Vaccine, 14:1485-1494, 1996). К другим иммуногенам относятся защитные иммуногены против энцефаломиокардита, ЦМВ (цитомегаловируса), ВПГ 2 (вируса простого герпеса 2 типа), вирусов паразита малярии, Mycobacterium tuberculosis, вызывающей туберкулз, С.difficile и других известных возбудителей нозокомиальных инфекций, а также грибковых патогенов, иммуногенов рака, белков, связанных с аллергией, которые можно использовать в качестве мишеней для вакцинации. Вставки чужеродных иммуногенов, представленные в настоящем изобретении, могут модифицироваться по различным механизмам. Например, для увеличения уровня экспрессии и удаления длинных повторов последовательностей нуклеотидов, что позволит увеличить стабильность РНК-генома векторов на основе ПИВ, применяется оптимизация кодона. Иммуногенность может быть повышена путм химеризации белков с известными иммуностимулирующими элементами, таким как агонисты КПР (колоколоподобных рецепторов), стимулирующие цитокины, компоненты системы комплемента, белки теплового шока и т.д. (например, см. обзор Immunopotentiators in Modern Vaccines, Schijns and O'Hagan Eds.,2006, Elsevier Academic Press: Amsterdam, Boston). Что касается конструкций двойных вакцин против бешенства и других заболеваний, вызываемых флавивирусами, то для применения у человека и в ветеринарии в определнных географических областях могут представлять интерес и другие комбинации, такие как сочетание КЭ + бешенство, ЖЛ + бешенство и т.д. Такие комбинации могут быть сформированы аналогично. Возможная структура конструкций экспрессии не ограничивается описанными здесь примерами. Например, делеции и инсерции могут модифицироваться, генетические элементы могут перегруппировываться, также могут использоваться другие генетические элементы, облегчающие презентацию антигена и увеличивающие иммуногенность (например, сигналы секреции, детерминанты внутриклеточного транспорта, включения или слияния с иммуностимулирующими элементами, такими как цитокины, агонисты КПР, такие как флагеллин, компоненты мультимеризации, такие как лейциновая "застжка-молния", а также пептиды, которые увеличивают время циркуляции белка в крови; эти элементы могут происходить не от флавивирусов и не от вируса бешенства). Кроме того, такая структура может применяться для о-ПИВ и д-ПИВ - кандидатов на звание вакцины, основанных на векторных геномах других флавивирусов и экспрессирующих иммуногены других патогенов, например, патогенов, описанных в настоящем изобретении, а также других патогенов. К другим примерам векторов на основе ПИВ и ЖАВ, представленных в настоящем изобретении,относятся комбинированные вакцины, такие как вакцина против ДЕН + вируса Чикунгунья (ЧИКВ) и ЖЛ + ЧИКВ. ЧИКВ - это альфа-вирус, эндемичный для Африки, Юго-Восточной Азии, Индийского субконтинента с островами, островов Тихого океана. Этот вирус делит экологическую/географическую нишу с вирусами ЖЛ и ДЕН 1-4. Он вызывает тяжлое заболевание, которое характеризуется выраженной болью (артритом, другими симптомами, напоминающими ДЕН) и длительными последствиями у большинства пациентов (Simon et al., Med. Clin. North Am. 92:1323-1343, 2008; Seneviratne et al., J. Travel Med. 14:320-325, 2007). К другим примерам векторов на основе ПИВ и ЖАВ, представленных в настоящем изобретении, являются ЖЛ + Эбола или ДЕН + Эбола, которые совместно циркулируют в Африке. Иммуногены к указанным патогенам, не относящимся к флавивирусам, последствия заражения которыми хорошо известны в медицинских кругах, могут включать гликопротеин В или белок слияния рр 65/IE1 ЦМВ (Reap et al., Vaccine, 25(42):7441-7449, 2007 и указанные в этом источнике ссылки), некоторые белки клещей (обзор: Skeiky et al., Nat. Rev. Microbiol. 4(6):469-476, 2006), антигены паразита ма- 15023888 лярии, такие как RTS,S (преэритроцитарный белок циркумспорозоита, БЦС) и другие иммуногены (например, см. обзор: Li et al., Vaccine, 25(14):2567-2574, 2007), оболочечные белки E1 и E1 ЧИКВ (или кассеты С-Е 2-Е 1, Е 2-Е 1), структурные белки ВГС (вируса гепатита С) С-Е 1-Е 2, которые образуют ВПЧ(Ezelle et al., J. Virol. 76(23): 12325-12334, 2002) или другие белки, которые индуцируют ответ со стороны Т-клеток, гликопротеин GP вируса Эбола (Yang et al., Virology, 377(2):255-264, 2008). В дополнение к иммуногенам, описанным выше, представленные здесь векторы могут включать один или несколько иммуногенов, полученных из одного или нескольких вирусов или направляющих иммунный ответ против одного или нескольких вирусов (например, вирусные целевые антигены, включающие, например, дцДНК-вирус (например, аденовирус, герпесвирус, вирус Эпштейна-Барра, вирус простого герпеса 1 типа, вирус простого герпеса 2 типа, вирус простого герпеса человека 8 типа, цитомегаловирус человека, вирус опоясывающего лишая, поксвирус); оцДНК-вирус (например, парвовирус,папилломавирус (например, Е 1, Е 2, Е 3, Е 4, Е 5, Е 6, Е 7, Е 8, БПВ 1 (бычий папилломавирус 1), БПВ, БПВ,БПВ, БПВ и БПВ (Из: Papillomavirus and Human Cancer, под ред. Н. Pfister (CRC Press, Inc. 1990;Lancaster et al., Cancer Metast. Rev. p. 6653-6664, 1987; Pfister et al., Adv. Cancer Res. 48:113-147, 1987; дцРНК-вирусы (например, реовирусы); (+)оцРНК-вирусы (например, пикорнавирус, вирус Коксаки, вирус гепатита А, полиовирус, тогавирус, вирус краснухи, флавивирус, вирус гепатита С, вирус жлтой лихорадки, вирус лихорадки денге, вирус лихорадки Западного Нила); (-)оцРНК-вирусы (например, ортомиксовирус, вирус гриппа, рабдовирус, парамиксовирус, вирус кори, вирус свинки, вирус парагриппа,рабдовирус, вирус бешенства); оцРНК-РТ-вирусы (например, ретровирус, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ); оцДНК-РТ-вирусы (например, гепаднавирус, вирус гепатита В). Иммуногены могут также происходить от других вирусов, не указанных здесь, но доступных для специалистов в области вирусологии. Что касается ВИЧ, то иммуногены могут получаться из любого изолята ВИЧ. Как принято в вирусологии, изоляты ВИЧ в настоящее время классифицируются на отдельные генетические подтипы. Известно, что ВИЧ-1 представлен как минимум десятью подтипами (A, B, C, D, E, F, G, H, J и K). Известно,что ВИЧ-2 представлен как минимум пятью подтипами (A, B, C, D и E). Подтип В связан с эпидемией ВИЧ у гомосексуалистов и потребителей внутривенных наркотиков из различных стран мира. Большинство иммуногенов ВИЧ-1, лабораторных адаптированных изолятов, реагентов и картированных эпитопов принадлежит к подтипу В. В африканских странах, расположенных южнее Сахары, в Индии и Китае, т.е. в областях с высокой частотой вновь выявленных случаев ВИЧ-инфекции, с ВИЧ-1 подтипа В связана лишь небольшая часть инфекций, а самым распространнным инфекционным подтипом, по-видимому,является подтип С. Таким образом, в определнных вариантах реализации этого изобретения может быть полезным использование иммуногенов ВИЧ-1 от подтипов В и/или С. Может также быть полезным включить иммуногены от различных подтипов ВИЧ (например, подтипов В и С ВИЧ-1, подтипов А и В ВИЧ-2 или комбинацию подтипов ВИЧ-1 и ВИЧ-2) в одну иммунологическую композицию. Подходящими для этого иммуногенами являются, например, ENV, GAG, POL, NEF, а также их варианты, производные и полученные из них белки слияния. Иммуногены могут также получаться из бактерий одного или нескольких видов, а также направлять иммунный ответ против бактерий одно или нескольких видов (spp.) (например, бактериальные целевые антигены, включающие, например, Bacillus spp. (например, Bacillus anthracis), Bordetella spp. (например,Bordetella pertussis), Borrelia spp. (например, Borrelia burgdorferi), Brucella spp. (например, Brucella(например, Treponema pallidum), Vibrio spp. (например, Vibrio cholerae) и Yersinia spp. (Yersinia pestis). Иммуногены могут также происходить от бактерий других видов или направлять иммунный ответ против бактерий других видов, не указанных здесь, но доступных для специалистов в области микробиологии. Иммуногены могут также получаться из паразитарных организмов одного или нескольких видов, а также направлять иммунный ответ против бактерий одно или нескольких видов (spp.) (например, парази- 16023888erinaceieuropaei, Strongyloides stercoralis, Taenia spp. (например, Т.saginata, Т.solium), Toxocara spp. (например, Т.canis, Т.cati), Toxoplasma spp. (например, Т.gondii), Trichobilharzia regenti, Trichinella spiralis,Trichuris trichiura, Trombiculidae spp., Trypanosoma spp., Tunga penetrans и/или Wuchereria bancrofti. Иммуногены могут также происходить от паразитарных организмов других видов или направлять иммунный ответ против паразитарных организмов других видов, не указанных здесь, но доступных для специалистов в области паразитологии. Иммуногены могут быть получены из опухолевых целевых антигенов или направлять развитие иммунитета против опухолевых целевых антигенов (например, опухолевых целевых антигенов). Термин"опухолевый целевой антиген" (ОЦА) может включать как антигены, связанные с опухолью (АСО), так и опухольспецифичные антигены (ОСА), когда источником антигена является опухолевая клетка. ОЦА могут быть представлены антигеном, который экспрессируется на поверхности опухолевых клеток в больших количествах, чем на нормальных клетках, а также антигеном, который экспрессируется на нормальных клетках во время эмбрионального развития. ОСА, как правило, - это антигены, уникальные для опухолевых клеток; они не экспрессируются нормальными клетками. Классификация ОЦА предполагает выделение пяти категорий в соответствии с паттерном экспрессии, функцией и генетическим происхождением: антигены рака яичек (РЯ) (например, MAGE, NY-ESO-1); антигены дифференцировки меланоцитов (например, Melan A/MART-1, tyrosinase, g100); мутационные антигены (например, MUM-1,p53, CDK-4); сверхэкспрессируемые аутоантигены (например, HER-2/neu, р 53) и вирусные антигеныet al., Blood, 85:2680-2684, 1995), p53 (Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:11993-11997, 1995),p185 HER2/neu (erb-B1; Fisk et al., J. Exp. Med., 181:2109-2117, 1995), рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР) (Harris et al., Breast Cancer Res. Treat, 29:1-2, 1994), канцероэмбриогенные антигены (КЭА)(Kwong et al., J. Natl. Cancer Inst., 85:982-990, 1995), патенты США 5756103; 5274087; 5571710; 6071716; 5698530; 6045802; ЕР 263933; ЕР 346710 и ЕР 784483; мутированные муцины, связанные с карциномой (например, продукты гена MUC-1; Jerome et al., J. Immunol., 151:1654-1662, 1993); продукты гена EBNA вируса Эпштейна-Барра (например, EBNA-1; Rickinson et al., Cancer Subbay, 13:53-80, 1992); белки E7, E6 папилломавируса человека (Ressing et al., J. Immunol. 154:5934-5943, 1995); простатспецифичный антиген (PSA; Xue et al., The Prostate 30:73-78, 1997); простат-специфичный мембранный антиген (PSMA; Israeli et al., Cancer Res. 54:1807-1811, 1994); идиотипичные эпитопы антигенов, например идиотипы иммуноглобулина или идиотипы рецептора Т-клеток (Chen et al., J. Immunol. 153:47754787, 1994); KSA (патент США 5348887), кинезин-2 (Dietz, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 275(3):731-738, 2000), HIP-55, TGF (антиапоптотический фактор) (Toomey et al., Br. J. Biomed. Sci. 58(3):177-183, 2001), опухолевый белок D52 (Bryne et al., Genomics 35:523-532, 1996), H1FT, NY-BR-1Research Institute, New York, NY) и/или антигены рака поджелудочной железы (например, SEQ ID NO: 1288 патента США 7473531). Иммуногены могут также происходить от других ОЦА или направлять иммунный ответ против других ОЦА, не указанных здесь, но доступных для специалистов в области онкологии. В дополнение к последовательностям специфичных иммуногенов, указанным выше, настоящее изобретение также включает применение аналогов этих последовательностей. К таким аналогам относятся последовательности, которые, например, на 80, 90, 95 или 99% совпадают с основными последовательностями или их фрагментами. К аналогам также относятся фрагменты основных последовательностей, которые включают, например, один или несколько иммуногенных эпитопов последовательностей. Кроме того, к аналогам относятся усечнные или расширенные последовательности (например, инсерции дополнительных/повторных иммунодоминантных эпитопов/эпитопов вспомогательных клеток), отличающиеся от основных последовательностей на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-20 и т.д. аминокислот с одного конца или обоих концов. Усечение может приводить к удалению иммунологически незначимых или значимых последовательностей, например, в пределах известных структурных/иммунологических доменов или между доменами; также может происходить полное удаление нежелательных доменов; такие модификации могут затрагивать 21-30, 31-50, 51-100, 101-400 и т.д. аминокислот. Модификации также могут затрагивать, например, 20-400, 30-100 и 50-100 аминокислот. Коктейли. В изобретении также представлены составы из двух и большего числа ПИВ и/или векторов на основе ПИВ, как это описано в настоящем изобретении. Как указывалось выше, использование таких комбинаций, или коктейлей, может предоставлять преимущества для индукции иммунитета против более чем одного иммуногена и/или патогена. Это может оказаться полезным, например, при вакцинации против различных флавивирусов, эндемичных для определнного географического региона, в котором проживают вакцинируемые лица. Это также может оказаться полезным в плане введения сразу нескольких иммуногенов против одной и той же мишени. К примерам коктейлей ПИВ, представленных в настоящем изобретении, относятся ПИВ-ЯЭ + ПИВ-ДЕН и ПИВ-ЖЛ + ПИВ-ДЕН, а также другие коктейли. В обоих этих примерах один из компонентов или оба ПИВ могут быть как одно-, так и двухкомпонентными ПИВ, как это указывалось ранее. В дополнение, в случае ПИВ-ДЕН ПИВ может включать последовательности только одного серотипа вируса лихорадки денге из группы серотипов вируса лихорадки денге 1-4. Кроме того, коктейль может включать ПИВ, экспрессирующие последовательности двух, трх или всех четырх серотипов. Кроме того, описанные в настоящем изобретении вакцины против вируса КЭ/Borrelia burgdorferi/белка слюны клещей (например, 64TRP, Isac, Salp20) могут быть основаны на включении различных иммуногенов в один ПИВ или живой аттенуированный вирус, а также могут быть основаны на комбинации ПИВ (или ЖАВ), каждый из которых включает один или несколько иммуногенов. Коктейли, представленные в настоящем изобретении, могут применяться в виде готовых форм или смешиваться непосредственно перед введением. Использование, лекарственные формы и введение вакцины. В настоящем изобретении представлены векторы на основе ПИВ, ПИВ, векторы на основе ЖАВ и ЖАВ, а также соответствующие им молекулы нуклеиновых кислот, фармацевтические или вакцинные композиции и методы их использования и получения. Векторы на основе ПИВ, ПИВ, векторы на основе ЖАВ и ЖАВ, представленные в настоящем изобретении, могут использоваться, например, в целях вакцинации для индукции иммунного ответа против вируса КЭ, других флавивирусов и/или других экспрессирующихся иммуногенов, как это описано в настоящем изобретении. Эти методы могут являться профилактическими; в этом случае эти средства применяются у субъектов (например, у человека или других млекопитающих), у которых в настоящее время нет инфекции, вызываемой вирусом КЭ или другими флавивирусами и/или патогенами, из которых был получен экспрессируемый иммуноген, но риск развития такой инфекции повышен. Методы также могут носить лечебный характер; в этом случае они применяются у субъектов, страдающих от инфекции, вызываемой одним или несколькими соответствующими патогенами. Кроме того, вирусы и векторы могут использоваться по отдельности или в сочетании друг с другом или с другими вакцинами. Субъекты, которые получают лечение в соответствии с методами настоящего изобретения, - это человек, а также другие представители млекопитающих (например, скот(крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, козы) и домашние животные, в том числе коты и собаки). Приготовление лекарственной формы векторов на основе ПИВ, ПИВ, векторов на основе ЖАВ и ЖАВ, представленных в настоящем изобретении, может осуществляться по стандартным методикам,принятым в фармакологии. Для приготовления вакцин возможно использование большого числа фармакологически приемлемых растворов; эти растворы при профессиональном подходе легко могут адаптироваться к настоящему изобретению (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed.A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). В двух отдельных примерах реализации настоящего изобретения препараты векторов на основе ПИВ, ПИВ, векторов на основе ЖАВ и ЖАВ приготавливаются на минимально-эссенциальной среде Эрля (МЭСЭ), содержащей 7,5% лактозы и 2,5% альбумина человеческой сыворотки, или на МЭСЭ, содержащей 10% сорбитола. В любом случае векторы ПИВ,ПИВ, векторы на основе ЖАВ и ЖАВ могут просто разводиться в физиологически приемлемом растворе, таком как стерильный солевой раствор или стерильный буферный солевой раствор. Векторы на основе ПИВ, ПИВ, векторы на основе ЖАВ и ЖАВ, представленные в настоящем изобретении, могут применяться по методикам, принятым в медицине, а необходимое количество вирусов и векторов легко определяется при профессиональном подходе. Необходимое количество вируса, которое следует ввести пациенту, может определяться на основании таких факторов, как, например, размер и общее состояние здоровья субъекта, которому предполагается введение вируса. Например, в случае живых аттенуированных вирусов, представленных в настоящем изобретении, вирусы могут приготавливаться в виде стерильного водного раствора, содержащего 102-108, например 103-107, инфекционных единиц (например, бляшкообразующих единиц или тканевых культуральных инфекционных доз) в определнном объеме препарата (0,1-1,0 мл). ПИВ могут вводиться в таких же дозах и в таком же объме. Титры ПИВ,тем не менее, обычно измеряются, например, в фокусообразующих единицах, что определяется иммунологическим окрашиванием фокусов, поскольку эти дефектные конструкции, как правило, не образуют вирусоподобные частицы. Дозы могут варьировать от 102 до 108 БОЕ, а объм введения может составлять от 0,1 до 1,0 мл. Все вирусы и векторы, представленные в настоящем изобретении, могут вводиться, например,внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно или перорально. В отдельных примерах реализации этого изобретения дендритные клетки активизируются при внутрикожном или чрескожном введении препарата с помощью, например, микроигл или микроабразивных устройств. Кроме того, вакцины, представленные в настоящем изобретении, могут вводиться в виде одиночной дозы или, как вариант, их введение может предполагать назначение нагрузочной дозы с последующей ревакцинацией, которая проводится, например, через 2-6 месяцев, что определяется медицинскими показаниями. Кроме того, вакцины на основе ПИВ могут назначаться путм иммунизации ДНК или РНК с использованием методов, известных в медицине (Chang et al., Nat. Biotechnol. 26:571-577, 2008; Kofler et al., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 101:1951-1956, 2004). Кроме того, при введении вирусов и вакцин, представленных в изобретении, возможно применение адъювантов, известных в медицине. Адъюванты могут использоваться для усиления иммуногенности вирусов. К таким адъювантам относятся, например, липосомальные лекарственные формы, синтетические адъюванты, такие как QS21, мурамилдипептид, монофосфориллипид А, полифосфазин, олигонуклеотиды CpG или другие молекулы, которые активизируют колоколоподобные рецепторы (КПР) на поверхности клеток или на ядерной мембране внутри клетки. Несмотря на то что эти адъюванты обычно используются для усиления иммунного ответа на инактивированные вакцины, они также могут использоваться с живыми или репликационно-дефектными вакцинами. В случае живых и репликационнодефектных вакцинам полезными могут оказаться как агонисты, так и антагонисты КПР. Кандидаты на звание вакцины могут создаваться так, чтобы экспрессировать агонисты КПР. В случае вирусов, которые поступают в организм через слизистые, например, перорально, возможно применение слизистых адъювантов, таких как термолабильный токсин Е.coli (LT) или мутантные производные LT. В дополнение к этому, гены, кодирующие цитокины, также обладают адъювантной активностью и могут вводиться в геном кандидатов на звание вакцины. Таким образом, гены, кодирующие определнные цитокины, такие как ГМ-КСФ, ИЛ-2 (интерлейкин-2), ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-5 и т.д., могут вводиться в геном вместе с чужеродными иммуногенами. Полученная в результате вакцина будет характеризоваться усиленным иммунным ответом или будет модулировать иммунитет в сторону преимущественного развития клеточного, гуморального ответа или ответа со стороны слизистой оболочки (например, см. обзор: Immunopotentiators in Modern Vaccines, Schijns and O'Hagan Eds., 2006, Elsevier Academic Press: Amsterdam, Boston,и др.). Кроме того, в месте введения вакцины, как вариант, возможно применение пластыря, содержащего соответствующий адъювант в виде токсина. Токсин вызывает местное воспаление, вызывая миграцию лейкоцитов, что приводит к более выраженному иммунному ответу. Примеры Дополнительная информация об изобретении приведена в разделе "Примеры". В разделе "Примеры" приводится описание экспериментов, в которых исследовались ПИВ, основанные на вирусах ЛЗН,ЯЭ и ЖЛ (см., например, WO 2007/098267 и WO 2008/137163). Сначала было показано, что полученные конструкции значительно менее патогенны (по данным теста нейровирулентности у чувствительных грудных мышат; отсутствие смертельных случаев для всех исследованных доз), чем доступные ЖАВ,использовавшиеся в качестве контроля (ЖЛ 17D, ЖАВ ЖЛ/ЯЭ, ЖАВ ЖЛ/ЛЗН). Авторы показали, что конструкции д-ПИВ в данной модели авирулентны, следовательно, двухкомпонентные ПИВ не вызывают неконтролируемого (неограниченного) распространения вирусов in vivo и не могут приводить к развитию клинических симптомов. Во-вторых, авторы сравнили иммуногенность и эффективность ПИВ и ЖАВ и показали, что вакцины на основе ПИВ могут вызывать развитие иммунного ответа, сравнимого с таковым для ЖАВ; таким образом, эти вакцины равноэффективны (например, это наблюдалось для пары вакцин ПИВ-ЛЗН и ЖАВ ЖЛ/ЛЗН). Для одной из исследованных пар оказалось, что ЖАВ ЖЛ 17D значимо более иммуногенен, чем ПИВ-ЖЛ. Следовательно, образование ВПЧ может различаться для разных конструкций ПИВ аналогичной структуры. Было предположено, что ПИВ-ЖЛ не приводит к образованию большого количества ВПЧ ЖЛ, в отличие от ПИВ-ЛЗН (ВПЧ ЛЗН), и что увеличенное образование ВПЧ может быть достигнуто путм генетических модификаций в соединении CprM субоптимальных конструкций ПИВ. Соединение CprM - это важная позиция в полипротеине флавивируса, которая участвует в образовании оболочки вируса и в синтезе вирусных белков (Yamshchikov and Compans,- 19023888Virology, 192:38-51, 1993; Amberg and Rice, J. Virol. 73:8083-8094, 1999; Stocks and Lobigs, J. Virol. 72:2141-2149, 1998). Авторы изобретения предположили, что выделение ВПЧ в клетках, инфицированных ПИВ, в отличие от образования вирусных частиц при инфицировании цельным вирусом, может усиливаться путм разъединения вирусной протеазы и сайтов расщепления сигналазой в месте соединения, а также путм применения сильного гетерологичного сигнального пептида (ТАП (тканевый активатор плазминогена) и т.д.) вместо сигнала для prM, а также путм мутагенеза сигнала для prM. Эффективность расщепления сигналазой в соединении CprM у флавивирусов низкая (Stocks and Lobigs, J. Virol. 72:2141-2149, 1998), например, по прогнозам он-лайн-программы Signal P 3.0. Ожидается, что более эффективное расщепление может быть достигнуто путм анализа замещений специфичных аминокислот в области сайта расщепления с помощью Signal P 3.0 (например, как описано в заявке WO 2008/100464) с последующим включением избранных мутаций в геномы ПИВ, восстановлением потомства ПИВ и измерением выделения ВПЧ. Сигналы нефлавивирусного происхождения вставляются в геном флавивирусов по стандартным методикам. Разъединение сайтов расщепления вирусной протеазой и сигналазой может достигаться путм абляции вирусного сайта расщепления любой неконсервативной мутацией (например,RRS в С вируса ЖЛ 17D до RRA, или GRS, или RSS и т.д.) или делецией всего сайта или нескольких из его 3 остатков. При необходимости, образование свободного N-концевого участка чужеродного белка может достигаться с помощью таких элементов, как аутопротеаза или терминирующий кодон, следующий за СВВР. Кроме того, нативный инициирующий кодон AUG гена белка С также может подвергаться абляции (в конструкциях, где последовательность белка С не является необходимой, например, С ПИВ), и AUG может размещаться перед чужеродным антигеном. Оптимизация сигналов вектора может проводиться путм случайного мутагенеза, например путм инсерции синтетической рандомизированной последовательности с последующей идентификацией жизнеспособных вариантов ПИВ с повышенной секрецией ВПЧ. Авторы также установили, что конструкции ПИВ были гораздо более иммуногенными у хомяков при внутрибрюшинном введении, чем при подкожном. По-видимому, это связано с более направленным воздействием на антигенпрезентирующие клетки в лимфоидной ткани, которых много в брюшной полости и гораздо меньше в подкожной клетчатке. На основании этих наблюдений пришли к выводу, что эффективное воздействие ПИВ на дендритные клетки, которых много в коже, возможно при чрескожном введении вакцины, например при микроабразии кожи или внутрикожном введении с помощью микроигл(Dean et al., Hum Vaccin. 1:106-111, 2005). Кроме того, были проведены эксперименты, подтверждающие осуществимость введения смесей,или коктейлей, различных ПИВ, как это описано в настоящем изобретении (например, ЯЭ + ДЕН и ЖЛ + ДЕН). При введении коктейлей очень важно подтвердить, что взаимодействие между одновременно назначаемыми компонентами отсутствует и что индуцируется развитие сбалансированного иммунного ответа. Для иммунизации грызунов использовались различные смеси ПИВ. Развивающийся иммунный ответ сравнивался с иммунным ответом на введение конструкций ПИВ по отдельности. Взаимодействия компонентов смеси не наблюдалось. Таким образом, применение коктейлей ПИВ вполне осуществимо. Такие составы могут иметь особое значение в географических регионах, в которых одновременно циркулируют несколько различных флавивирусов. Этот подход также может быть использован для одновременного введения нескольких вакцин на основе ПИВ против патогенов нефлавивирусного происхождения. Более того, было показано, что после введения по меньшей мере двух доз ПИВ ответа со стороны нейтрализующих антител против пакующей оболочки вируса не развивалось (выявлялись антитела против ВПЧ, выделяющихся из инфицированной клетки). Это было показано с помощью вспомогательного компонента д-ПИВ (см. фиг. 2) (prME), упакованного отдельно, а также путм определения нейтрализующих антител к гетерологичным пакующим оболочкам (например, к оболочке вируса ЛЗН, которая использовалась для упаковки ПИВ-ЯЭ во вспомогательных клетках, в которых транскрибируются ЛЗНспецифичные белки CprME). Последнее наблюдение подтверждает целесообразность последовательного применения различных вакцин на основе ПИВ, произведенных на универсальной пакующей клеточной линии, и последовательного применения различных рекомбинантных вакцин на основе ПИВ-векторов у одного пациента, как указывалось выше. В дополнение, авторы подтвердили прежние наблюдения, что конструкции ПИВ могут стабильно распространяться с высоким выходом in vitro и что рекомбинантного восстановления полноценных вирусных частиц после длительного и многократного пассажа в субстратных клетках не происходит (Mason et al., Virology 351:432-443, 2006; Shustov et al., J. Virol. 21:1173711748, 2007). Эти и другие аспекты изобретения обсуждаются далее в разделе "Примеры". Пример 1. Исследования создания платформы на основе псевдоинфекционных вирусов. Аттенюирование в модели нейровирулентности (НВ) на грудных мышатах. Материалы, использованные в исследованиях, описание которых дано ниже, характеризуются в табл. 1 и цитированных в ней литературных источниках. К таким материалам относятся о-ПИВ-ЛЗН (основанный на последовательностях вируса ЛЗН дикого типа штамма NY99), о-ПИВ-ЯЭ, о-ПИВ-ЛЗН/ЯЭ(основанный на остове вируса ЛЗН дикого типа и генах prME вируса ЯЭ дикого типа штамма Накаяма[Nakayama]), о-ПИВ-ЖЛ/ЛЗН (остов вируса ЖЛ 17D и гены prME вируса ЛЗН) и о-ПИВ-ЖЛ (основанный на последовательностях вируса ЖЛ 17D). К дополнительным материалам относятся д-ПИВ-ЖЛ(д-ПИВ ЖЛ, выращенный на обычных клетках ПДХ (почек детнышей хомяков); Shustov et al., J. Virol. 21:11737-11748, 2007) и двухкомпонентный д-ПИВ-ЛЗН (выращенный на обычных клетках среды Vero;Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008). Результат аттенуирования (ослабления) этих прототипов ПИВ сравнивался с ЖАВ ЖЛ 17D, химерическим вирусом ЖЛ/ЯЭ и химерическим вирусом ЖЛ/ЛЗН в тесте НВ на грудных мышатах (внутрикожное введение вируса). Для этого использовались высокочувствительные 5-дневные мыши линии ICR. Химерические вирусы включали нуклеокапсид и неструктурные последовательности вируса желтой лихорадки и последовательности prME вируса ЯЭ или ЛЗН). Ни у одного из животных, которым вводилась конструкция ПИВ, не было выявлено клинических признаков заболевания; смертельных случаев также не было. Смертельные случаи наблюдались у животных, инфицированных ЖАВ (табл. 2). Вирус ЖЛ 17D нейровирулентен для мышей всех возрастов, тогда как химерические вакцины не являются нейровирулентными для взрослых мышей, но могут приводить к дозозависимой смертности у более чувствительных грудных мышат (Guirakhoo et al., Virology, 257:363-372, 1999; Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507,2004). В соответствии с этим 90-100% грудных мышат, которым была введена как минимум 1 БОЕ вируса ЖЛ 17D, погибли. ЖАВ ЖЛ/JE и ЖЛ/ЛЗН вызывали частичную смертность при введении в значительно более высоких дозах 2 log10 БОЕ и 3 log10 БОЕ соответственно), а средняя продолжительность жизни (СПЖ) у умерших животных, как и ожидалась, была выше. Таким образом, эта чувствительная модель показала, что конструкции ПИВ совершенно авирулентны (по меньшей мере в 20000-200000 раз менее нейровирулентны, чем лицензированная вакцина ЖЛ 17D). д-ПИВ ЖЛ и ЖЛ ЛЗН не приводили к появлению клинических симптомов заболевания, а смертельных случаев зарегистрировано не было. Следовательно, двухкомпонентные варианты ПИВ, которые теоретически могут распространяться в ткани мозга, вследствие коинфицирования клеток обоими компонентами, не приводили к развитию заболевания. Более того, авторы попытались определить д-ПИВ в ткани головного мозга дополнительных животных в условиях этого эксперимента. Мыши забивались на 6-й день после введения ПИВ. Титрование не выявило д-ПИВ в ткани головного мозга (головной мозг 10 и 11 мышей, которым было введено 4 log10 БОЕ д-ПИВ ЖЛ и д-ПИВ ЛЗН соответственно, гомогенизировался и титровался). Таким образом, д-ПИВ не приводят к распространению инфекции, что было бы характерно для полноценного вируса. ЖАВ ЖЛ/ЯЭ, как было показано, реплицируется в головном мозге взрослых мышей линии ICR, заражнных внутрикожно, с пиковым титром на 6-й день, составляющим вирусом 6 log10 БОЕ/г, что протекает, однако, бессимптомно (Guirakhoo et al., Virology, 257:363-372,1999). Коинфицирование клеток компонентами д-ПИВ, очевидно, менее эффективный процесс в плане распространения инфекции, чем инфицирование полноценным вирусом. Данные указывают на то, что репликация д-ПИВ in vivo быстро попадает под контроль врожднного иммунитета (а также приобретнного иммунитета у взрослых животных). Иммуногенностъ/эффективностъ у мышей и хомяков. Иммуногенность/эффективность прототипов ПИВ, описанных выше, сравнивалась с соответствующими характеристиками химерических ЖАВ и вируса ЖЛ 17D на мышах и сирийских хомяках. Общий принцип эксперимента показан на фиг. 3 (мыши, внутрибрюшинная иммунизация). Эксперименты на хомяках проводились аналогично (плюс-минус несколько дней, подкожное или внутрибрюшинное введение вирусов, дозы указаны ниже). Мыши линии ICR в возрасте 3,5 недели (группы о-ПИВ-ЛЗН и о-ПИВ-ЖЛ, ЖАВ ЖЛ/ЛЗН и ЖЛ 17D) и мыши линии C57/BL6 (группы о-ПИВ-ЯЭ и ЖАВ ЖЛ/ЯЭ) иммунизировались внутрибрюшинно различными дозами конструкций ПИВ (4-6 log10 ФОН на дозу) или химерических ЖАВ и ЖАВ ЖЛ 17D (4 log10 БОЕ). Группы ПИВ-ЛЗН, ПИВ-ЯЭ и ПИВ-ЖЛ ревакцинировались на 21-й день соответствующими конструкциями в дозе 5 log10 БОЕ (табл. 3). С помощью стандартного метода PRNT50 (реакции нейтрализации редукции бляшек) в сыворотке определялся уровень нейтрализующих антител против ЖАВ ЖЛ/ЛЗН или /ЯЭ, а также против вируса ЖЛ 17D. ПИВ-ЛЗН индуцировал сильно выраженный ответ со стороны нейтрализующих ЛЗН-специфических антител во всех группах животных как с ревакцинацией, так и без не, на что указывали титры PRNT50, определяемые в пулах плазмы иммунизированных животных на 20- и 34-й дни; эти титры были сравнимы с титрами в контрольной группе ЖАВ ЖЛ/ЛЗН. В соответствии с этим животные, иммунизированные ПИВ-ЛЗН и ЖАВ ЖЛ/ЛЗН, были защищены от потенциально летального заражения вирусом ЛЗН дикого типа, которое проводилось на 35-й день (внутрибрюшинно, 270 ЛД 50), чего не происходило с животными, иммунизированными имитацией вакцины (табл. 3). При определении уровня ЛЗН-нейтрализующих антител в сыворотке отдельных мышей отмечалась высокая степень однородности иммунного ответа у различных животных (фиг. 4). Таким образом, вакцины на основе ПИВ с одним циклом репликации могут быть равны по иммуногенности и эффективности соответствующим ЖАВ. ПИВ-ЯЭ также оказались высокоиммуногенными (у чрных мышей), тогда как иммуногенность ПИВОЖЛ была значительно ниже, чем у контрольного вируса ЖЛ 17D (мыши ICR). Тем не менее, отмечалась дозозависимая защита животных,иммунизированных ПИВ-ЖЛ (но не животных, которым вводилась имитация вакцины), после тяжлого,потенциально летального внутрикожного заражения вирусом ЖЛ дикого типа (штамм Асиби [Asibi])(500 ЛД 50) (табл. 3). Эти данные согласуются с тем, что защитным по отношению к флавивирусной инфекции считается титр нейтрализующих антител, равный 1:10. Контрольный вирус ЖЛ 17D был высокоиммуногенным (например, на 34-й день титр PRNT50 составлял 1:1280); этот вирус мог инфицировать клетки и эффективно реплицироваться in vivo, а его оболочка является сильным иммуногеном. Следовательно, маловероятно, что низкая иммуногенность ПИВЖЛ была связана с его неспособностью инфицировать клетки или реплицироваться в инфицированных клетках in vivo. Авторы изобретения считают, что низкая иммуногенность ПИВ-ЖЛ (например, по сравнению с ПИВ-ЛЗН), вероятнее всего, связана с низким уровнем образования ЖЛ-специфичных ВПЧ в клетках, инфицированных ПИВ-ЖЛ (тогда как в клетках, инфицированных ПИВ-ЛЗН, секреция ВПЧ высока). Как указывалось выше, мы предполагаем, что иммуногенность ПИВ-ЖЛ может быть значительно повышена, например, путм соответствующих модификаций соединения CprM, например путм разъединения сайтов расщепления двумя протеазами, которое происходит в этом соединении (т.е. сайтов расщепления вирусной протеазой и сигналазой), и/или применением сильного гетерологичного сигнала[например, сигнала белка G вируса бешенства или сигнала эукариотического тканевого активатора плазминогена (ТАП) (Malin et al., Microbes and Infection, 2:1677-1685, 2000) и др.] вместо сигнала ЖЛ дляprM. Аналогичный эксперимент был проведен на сирийских хомяках в возрасте 4,5 недели; сравнивалась иммуногенность конструкций ПИВ и контрольных ЖАВ. Животные иммунизировались подкожно исследуемыми вирусами в различных дозах (табл. 4). ПИВ-ЛЗН характеризовался высокой иммуногенностью, например, титр ЛЗН-специфичных антител (PRNT50) на 38-й день составлял 1:320, 1:640 и 1:1280 в группах животных, которым было введено 5, 6 и 6 (нагрузочная доза) + 5 (ревакцинация) log10 БОЕ, соответственно. Такой результат был несколько ниже, чем для контрольного ЖАВ ЖЛ/ЛЗН (доза 4 log10 БОЕ, титр 1:2560). ПИВ-ЯЭ и ПИВ-ЖЛ индуцировали образование специфических нейтрализующих антител, титр которых был вс же ниже, чем для контрольных вирусов ЖАВ Л/ЯЭ и ЖЛ 17D. Все животные, иммунизированные ПИВ-ЛЗН и ЖЛ/ЛЗН, были наджно защищены от потенциально летального заражения ЛЗН дикого типа, на что указывало отсутствие смертельных случаев и заболеваемости (например, потери массы тела после заражения), а также отсутствие или значительное снижение уровня виремии вируса ЛЗН после заражения. Животные, которым вводилась имитация вакцины, были не защищены от заражения (табл. 4). ПИВ-ЯЭ и ПИВ-ЛЗН защищали животных от последующего заражения дозозависимым образом. Эффективность защиты в этом эксперименте показана на фиг. 5. Например, у животных, которым вводилась имитация вакцины, отмечалась высокая виремия вируса ЖЛ после заражения (штамм Asibi, адаптированный к хомякам). Пик виремии отмечался на 3-ий день, титр вирусов составлял 8 log10 БОЕ/мл (верхняя левая часть фигуры); у всех этих животных определялась потеря массы тела, одно из 4-х животных погибло (верхняя правая часть фигуры). В отличие от этого виремия была значительно более низкой или отсутствовала вообще у хомяков, иммунизированных ПИВ-ЖЛ (две дозы), несмотря на относительно низкий титр нейтрализующих антител, или вирусом ЖЛ 17D; ни у одного из этих животных снижения массы тела не было. Аналогично, животные, иммунизированные ПИВ-ЛЗН или ЖАВ ЖЛ/ЛЗН, были полностью или в значительной степени защищены от виремии вируса ЛЗН после заражения, от снижения массы тела и смерти, чего не отмечалось в случае животных, которым была введена имитация вакцины. Следовательно, на второй животной модели была показана высокая иммуногенность и эффективность ПИВ. В другом эксперименте на хомяках животные иммунизировались конструкциями ПИВ внутрибрюшинно; всего вводилось две дозы вакцины. В табл. 5 приведены результаты сравнения иммунного ответа со стороны нейтрализующих антител (специфичных для каждой вакцины), содержание которых определялось в пулах плазмы хомяков в предыдущем эксперименте (подкожное введение вакцины), и после внутрибрюшинной иммунизации. Сравнение проводилось для ПИВ-ЛЗН, ПИВ-ЖЛ/ЛЗН, ПИВ-ЛЗН/ЯЭ и ПИВ-ЖЛ после введения первой дозы (20-21-й день) и после введения второй дозы (34-38-й день). Было выявлено чткое влияние пути иммунизации после введения первой и второй доз вакцины. Например,после введения первой дозы ПИВ-ЛЗН при подкожной иммунизации уровень ЛЗН-специфичных антител составлял 1:40 (по данным PRNT50), тогда как при внутрибрюшинной иммунизации титр антител был значительно выше (1:320). Та же картина наблюдалась и после введения второй дозы вакцины (титры были такими же). Для других конструкций было выявлено более выраженное влияние пути иммунизации после введения первой и второй доз вакцины. Интересно, что ПИВ-ЖЛ/ЛЗН оказался высоко иммуногенным при внутрибрюшинном введении (титр 1:320 после внутрибрюшинного введения первой дозы и 1:20 после подкожного введения первой дозы вакцины; титр 1:1280 после внутрибрюшинного введения первой дозы и 1:160 после подкожного введения второй дозы). Аналогично, было отмечено значительное увеличение иммуногенности ПИВ-ЯЭ (например, титр ЯЭ-специфичных антител после внутрибрюшинного введения двух дох составлял 1:640). Таким образом, более прицельное воздействие на клетки лимфоидной ткани, в частности, на антиген-презентирующие клетки, число которых в брюшной полости гораздо выше, чем в тканях под кожей, является важным фактором успешного применения вакцин на основе ПИВ. У человека эффективное воздействие на дендритные клетки кожи, что увеличивает амплитуду иммунного ответа, возможно при внутрикожном введении вакцины. Это предлагаемый авторами способ иммунизации ПИВ человека. В описанных выше экспериментах также проводили определение индукции образования нейтрализующих антител против пакующих оболочек (отдельно от ответа на ВПЧ, которые закодированы в конструкциях ПИВ и выделяются инфицированными клетками). Метод PRNT50 не выявил ЛЗНспецифичных нейтрализующих антител у животных, иммунизированных 5 log10 БОЕ второго компонента д-ПИВ ЛЗН, содержащим делецию CprME и, таким образом, не кодирующим ВПЧ, по пакующим оболочки ЛЗН во вспомогательных клетках линии ПДХ - CprME (ЛЗН). В сыворотке животных, иммунизированных 4 log10 БОЕ второго компонента д-ПИВ ЖЛ, упакованного в оболочки ЖЛ, ЖЛ-специфичных нейтрализующих антител обнаружено не было. Две дозы ПИВ-ЖЛ/ЛЗН, упакованного в оболочку ЖЛ,не индуцировали образование ЖЛ-специфичных нейтрализующих антител. Аналогично, две дозы ПИВЯЭ, упакованного в оболочку ЛЗН не индуцировали образования ЛЗН-специфичных антител. Отсутствие нейтрализующих антител против пакующих оболочек позволяет наладить производство различных вакцин ПИВ на одной (универсальной) вспомогательной клеточной линии, а также проводить иммунизацию пациента различными рекомбинантными вакцинами, основанными на одно и том же векторе, в соответствии с настоящим изобретением. Коктейли ПИВ. ПИВ осуществляют один цикл репликации in vivo (как вариант, возможно осуществление нескольких циклов, число которых ограниченно). Поэтому считаем, что смеси различных ПИВ могут назначаться одновременно без взаимодействия между отдельными конструкциями полученной смеси, или коктейля. Для подтверждения возможности использования вакцин на основе ПИВ в виде коктейлей иммунные ответы у мышей и хомяков против некоторых конструкций ПИВ, назначаемых в виде смесей, сравнивались с иммунными ответами против этих же конструкций, вводимых по отдельности. В обеих животных моделях были получены одинаковые результаты. Результаты эксперимента на мышах приведены в табл. 6. В пулах сыворотки от животных, которым вводилась одна или две дозы смеси ПИВ-ЯЭ + ПИВЛЗН или только ПИВ-ЯЭ, определялись схожие титры ЯЭ-специфичных нейтрализующих антител (1:20 и 1:80; 1:640 и 1:160 для одной и двух доз соответственно). Аналогично, титры ЛЗН-специфичных антител при введении смеси ПИВ-ЯЭ + ПИВ-ЛЗН и только одного ПИВ-ЛЗН были похожими (1:320 и 1:640; 1:5120 и 1:5120 для одной и двух доз соответственно). Перекрстно-специфичный ответ при введении ПИВ-ЯЭ или ПИВ-ЛЗН практически не развивался или был слабо выражен. Эти результаты также подтверждают титры антител в сыворотке отдельных животных, измеренные с помощью PRNT50. Таким образом, понятно, что вакцины на основе ПИВ могут эффективно назначаться в виде коктейлей, индуцируя развитие иммунитета против двух или большего числа патогенов флавивирусного происхождения. В дополнение следует сказать, что, как указывалось выше, различные коктейли могут включать вакцины,основанные на ПИВ нефлавивирусного происхождения, а также вакцины, основанные на ПИВфлавивирусах и ПИВ нефлавивирусного происхождения. Исследования in vitro. Различные прототипы ПИВ серийно пассажировались до 10 раз во вспомогательных клетках среды ПДХ или в обычных клетках среды Vero (для д-ПИВ). Образцы, забираемые после каждого пассажа,титровались в клетках среды Vero путм иммунологического окрашивания. Конструкции размножались до высоких титров, однако рекомбинантного восстановления полноценного вируса не наблюдалось. Например, число ПИВ-ЛЗН постепенно выросло до титра 7-8 log10 БОЕ/мл во вспомогательных клетках среды ПДХ - C-prM-E (ЛЗН), содержащих репликон вируса венесуэльского лошадиного энцефалита(ВЛЭ), экспрессирующий белки C-prM-E вируса ЛЗН, а число д-ПИВ ЛЗН возрастало до 8 log10 БОЕ/мл в клетках культуры Vero, причм рекомбинации не отмечалось. Пример 2. ПИВ-КЭ. Последовательности кандидатов на звание вакцины на основе ПИВ-КЭ могут основываться на последовательностях вируса КЭ дикого типа или серологически сходного с ним вируса Лангат (ЛГТ) (естественно аттенуированный вирус, например штамм дикого типа ТР-21 или его эмпирически аттенуированный вариант, штамм Е 5) или основываться на химерических последовательностях, содержащих остов(нуклеокапсидная и неструктурные последовательности) вируса ЖЛ 17D или других флавивирусов, например вируса ЛЗН, и гены белков prME вирусов КЭ, ЛГТ или других серологически близких флавивирусов из серокомплекса вируса КЭ. Кандидаты на звание ЖАВ ДЛ/КЭ сконструированы на основе остова вируса ЖЛ 17D и генов prME вируса КЭ или связанных с ним вирусов (например, вируса ЛГТ, штамм Е 5), т.е. по тому же принципу, что и другие химерические вакцины на основе ЖАВ. Конструирование прототипов вакцины ПИВ-КЭ и ЖАВ ЖЛ/КЭ проводилось путм клонирования соответствующих генетических элементов в плазмиды для получения ПИВ-ЛЗН (Mason et al., Virology,- 23023888 351:432-443, 2006; Suzuki et al., J. Virol. 82:6942-6951, 2008) или в плазмиды для получения химерических ЖАВ (например, pBSA-AR1 - одноплазмидная версия инфекционного клона ЖАФ ЖЛ/ЯЭ;WO 2008/036146) в соответствии со стандартными методиками, принятыми в генетике. Сначала проводили компьютерную оптимизацию кодона последовательностей prM штамма Hypr вируса КЭ (номер доступа в GenBank U39292) и штамма Е 5 вируса ЛГТ (номер доступа в GenBank AF253420), чтобы соответствовать предпочтительному использованию кодона в геноме человека, а также для выявления повторяющихся последовательностей, превышающих в размерах 8 нуклеотидов, для обеспечения высокой генетической стабильности вставок (при необходимости может быть выполнено дальнейшее сокращение величины повторяющихся последовательностей нуклеотидов). Гены синтезировались химически и клонировались в плазмиды для получения ПИВ-ЛЗН и ЖАВ ЖЛ/ЯЭ. Получившиеся в результате плазмиды транскрибировались in vitro. Затем транскрипты РНК трансфицировались в соответствующие клетки(клетки культуры Vero для химерических вирусов или вспомогательные клетки ПДХ для ПИВ). Так получались образцы вируса и ПИВ. Конструкции ЖАВ ЖЛ/КЭ. В конструкциях ЖЛ/КЭ, содержащих гены prME штамма Hypr вируса КЭ (плазмиды р 42, р 45 и р 59) или штамма Е 5 вируса ЛГТ (плазмида Р 43), сначала изучались два различных вида соединения CprM (см. фиг. 6; соединения С-prM приведены в приложении 1, и полная последовательность 5'-концевого участка, покрывающая 5'-концевую нетранслируемую область-C-prM-E-начало областиNS1, приведена в приложении 2). Химера ЖЛ 17D/Hypr из плазмиды р 42 содержала сигнальный пептид гибрида ЖЛ 17D/Hypr для белка prM, тогда как химера ЖЛ 17D/Hypr из плазмиды р 45 содержала сигнальный пептид гибрида ЖЛ 17D/ЛЗН для белка prM (приложение 1). Первый химерический вирус создавал очень высокие титры в Р 0 (сразу же после трансфекции) и Р 1 (следующий пассаж в клетках культуры Vero) - до 7,9 log10 БОЕ/мл, что было в 0,5 log10 раз выше, чем титры последнего вируса; в дополнение к этому, первый вирус образовывал в клетках культуры Vero значительно большие бляшки (фиг. 6). Следовательно, использование КЭ-специфичных остатков в сигнальном пептиде для prM предоставляло значительные преимущества в росте вирусов, по сравнению с сигналом, содержащим ЛЗН-специфичные остатки. Химеры ЖЛ 17D/ЛГТ из плазмид включали такой же сигнал для prM, что и вирус из плазмид р 42. Эти химеры также характеризовались очень высоким титром в пассажах Р 0 и Р 1 (до 8,1 log10 БОЕ/мл) и образовывали крупные бляшки. Вирус, производный от вируса из плазмид р 42, также образовывался в плазмидах р 59, которые содержали сильную аттенуирующую мутацию, которая описывалась ранее в контексте вирусной вакцины на основе ЖАВ ЖЛ/ЛЗН, а именно 3-а.а.-делецию в гене специфичного для ЖЛ 17D белка С (PSR, остатки 40-42 в начале -спирали I; WO 2006/116182). Как и ожидалось,вирус из р 59 рос в меньших титрах (5,6 и 6,5 log10 БОЕ/мл в Р 0 и Р 1 соответственно) и образовывались меньшие бляшки (что определялось в отдельном эксперименте с титрованием; это не отражено на фиг. 6) по сравнению с родительской химерой из плазмид р 42. Эти первоначальные наблюдения о ростовых свойствах прототипов ЖАВ ЖЛ/КЭ и корреляция репликации in vitro с морфологией бляшек были подтверждены в экспериментах с кривыми роста (фиг. 8). Конструкции ПИВ-КЭ. Конструировались варианты ПИВ-ЛЗН/КЭ. Упакованные образцы ПИВ получались в плазмидах р 39 и р 40 (фиг. 7; приложение 1 для последовательности соединения CprM, приложение 3 для полной последовательности 5'-нетранслируемая концевая область-CprME-начало NS1). Эти образы содержали полноценные сигналы prM вирусов Hypr и ЛЗН соответственно. Оба ПИВ успешно восстанавливались и размножались во вспомогательных клетках культуры ПДХ-CprME (ЛЗН) или ПДХ-С (ЛЗН) (Mason et al.,Virology, 351:432-443, 2006; Widman et al., Vaccine, 26:2762-2771, 2008). Титры образов в Р 0 и P1 варианта из р 39 были в 0,2-1,0 log10 раз выше, чем титры варианта из плазмид р 40. В дополнение к этому, клетки культуры Vero, инфицированные вариантом р 39, в иммунофлуоресцентном анализе, в котором использовались поликлональные КЭ-специфичные антитела, окрашивались ярче, чем клетки, инфицированные вариантом р 40, что указывает на более эффективную репликацию (фиг. 7). Более высокая скорость репликации кандидата р 39, чем кандидата р 40 была подтверждена в эксперименте с кривыми роста(фиг. 8). В последнем эксперименте оба кандидата, по-видимому, лучше росли на вспомогательных клетках культуры ПДХ-С(ЛЗН), чем на клетках культуры ПДХ-CprME (ЛЗН); так, титр варианта р 39 достигал 7 log10 БОЕ/мл на 5-й день (заметьте: пиковые титры достигнуты не были). Открытие эффекта сигнала prM на скорость репликации кандидатов на звание вакцины на основе ПИВ и химерических ЖАВ, а также сравнение способности различных сигналов образовывать более эффективно реплицирующуюся и более иммуногенную конструкцию являются отличительными чертами данного подхода. Как указывалось выше, настоящее изобретение также включает использование других сигналов флавивирусов,включая сигналы с соответствующими мутациями, с разъединением сайтов расщепления вирусной протеазой и сигналазой в соединении CprM, например, путм мутации или удаления сайта расщепления вирусной протеазой в С-концевой участке гена С, предшествующему сигналу prM, с использованием сильных сигналов нефлавивирусного происхождения (например, сигнала ТАП и др.) вместо сигнала prM, а также с оптимизацией последовательностей, расположенных дальше сайта расщепления сигналазой. В изобретении также представлены и другие варианты ПИВ-КЭ, основанные на вирусе КЭ дикого типа (штамм Hypr) и вирусе ЛГТ (штамм дикого типа ТР 21 или аттенуированный штамм Е 5), а также химерические вирусы, содержащие остов вируса ЖЛ 17D и последовательности prME вирусов КЭ или ЛГТ. Вспомогательные клетки, экспрессирующие белки С, CprME и т.д. (например, КЭ-специфичные белки), необходимые для транскомплементации, могут создаваться путм трансфекции стабильной ДНК или с помощью соответствующего вектора, например репликона альфа-вируса, такого как репликон штамма ТС-83 вируса венесуэльского лошадиного энцефалита, с последующей селекцией клеток, содержащих репликон, с помощью антибиотика. В реализации изобретения на практике могут использоваться клетки культур Vero и ПДХ-21. Последняя культура - это признанный субстрат для изготовления вакцин для применения у человека; кроме того, возможно использование других клеточных линий, пригодных для создания вакцин для применения у человека или в ветеринарии. В дополнение к конструкциям о-ПИВ, возможно также создание конструкций д-ПИВ. Для получения дополнительных гарантий безопасности вакцин для человека, животных и окружающей среды в них могут водиться соответствующие модификации, включая применение дегенеративных кодонов и комплементарных мутаций в 5'- и 3'-элементов CS, что позволит снизить вероятность рекомбинаций, которые теоретически могут привести к появлению жизнеспособного вируса. После конструирования кандидаты на звание вакцины могут оцениваться in vitro на стабильность и пригодность к массовому производству и in vivo на аттенуирование и иммуногенность/эффективность. Для этого могут использоваться доступные доклинические животные модели, например, такие, как модели, использованные для создания и контроля качества вакцин против КЭ и ЖЛ. Нейровирулентностъ и нейроинвазивностъ конструкций ПИВ-КЭ и ЖАВ ЖЛ/КЭ у мышей. Молодые взрослые мыши линии ICR (возраст 3,5 недели) инфицировались кандидатами на звание ПИВ-КЭ и ЖАВ ЖЛ/КЭ в различных дозах; для определении нейровирулентности проводилось внутрикожное заражение, а для определения нейроинвазивности - внутрибрюшинное заражение (позднее также определялись иммуногенность и эффективность). Животные, которым вводилось 5 log10 ФОБ ПИВ-Hypr(варианты р 39 и р 40) обоими способами, выживали, слабости у них также не определялось, как и у животных, которым вводилась имитация вакцины (табл. 7); таким образом, вакцины на основе ПИВ-КЭ полностью авирулентны. У мышей, заражнных внутрикожно контрольными вирусами ЖЛ 17D (1-3 log10 БОЕ), определялась дозозависимая смертность, тогда как животные, заражнные внутрибрюшинно(5 log10 БОЕ), выживали, что соответствует представлениям об отсутствии нейроинвазивности вируса ЖЛ 17D. Все животные, которым вводились различные дозы прототипов ЖАВ ЖЛ/КЭ (р 42, р 45, р 43 и р 59) (2-4 log10 БОЕ), умерли (была совершена эвтаназия умирающих животных). Эти варианты, повидимому, менее аттенуированы, чем вирус ЖЛ 17D, например, об этом свидетельствует 100%-ная смертность и более короткая СПЖ при введении вирусов в дозе 2 log10 БОЕ - самой низкой из исследованных доз для кандидата на звание ЖАВ ЖЛ/КЭ. Фенотип ПИВ-КЭ, характеризующийся отсутствием нейровирулентности, вирулентный фенотип ЖАВ ЖЛ/КЭ и фенотип ЖЛ 17D с промежуточной вирулентностью представлены на фиг. 9, на котором показаны кривые выживания мышей после внутрикожного заражения. Следует отметить, что варианты р 43 (гены prME вируса ЛГТ) и р 59 (вариант ЖАВ ЖЛ/Hypr с делецией dC2) были менее нейровирулентными, чем конструкции ЖАВ ЖЛ/Hypr р 42 и р 45,на что указывает разница в СПЖ для соответствующих доз вирусов (табл. 7). В дополнение к этому, кандидаты р 43 и р 59 характеризовались отсутствием нейроинвазивности, тогда как р 42 и р 45 приводили к частичной смертности после внутрибрюшинного введения в дозе 5 log10 БОЕ (табл. 7; фиг. 10). Следует отметить, что, как бы то ни было, все конструкции ЖАВ ЖЛ/КЭ были значительно слабее (т.е. были аттенуированы), чем вирусы КЭ дикого типа, например чем вирус штамма Hypr дикого типа, который был одинаково высоко вирулентен для мышей в низких дозах при внутрикожном (ЛД 50 0,1 БОЕ) и внутрибрюшинном введении (ЛД 50 10 БОЕ) (Wallner et al., J. Gen. Virol. 77:1035-1042, 1996; Mandl et al., J.Virol. 72:2132-2140, 1998; Mandl et al., J. Gen. Virol. 78:1049-1057, 1997). Иммуногенность/эффективность конструкций ПИВ-КЭ и ЖАВ ЖЛ/КЭ у мышей. Определялся ответ со стороны КЭ-специфичных нейтрализующих антител у мышей, иммунизированных одной или двумя дозами описанных выше вариантов ПИВ-КЭ или ЖАВ ЖЛ/КЭ, а также человеческой вакциной против КЭ, инактивированной в формалине (1:30 человеческой дозы) (внутрибрюшинная иммунизация). Затем животные заражались вирусом штамма Hypr КЭ дикого типа (500 БОЕ внутрибрюшинно); определялась заболеваемость (например, снижение массы тела) и смертность после заражения. На 20-й день после иммунизации определялся ответ со стороны КЭ-специфичных нейтрализующих антител у мышей, иммунизированных одной или двумя дозами описанных выше вариантов ПИВ-КЭ или ЖАВ ЖЛ/КЭ (см описание эксперимента в табл. 7), а также человеческой вакциной против КЭ, инактивированной в формалине (1:20 человеческой дозы, одна или две дозы) и контролем - имитацией вакцины ЖЛ 17D (внутрибрюшинная иммунизация). Определение антител против вируса КЭ штамма Hypr дикого типа проводилось методом PRNT50 (реакция нейтрализации редукции бляшек на 50%) (табл. 8; вторая доза указанных исследуемых вакцин вводилась на 14-й день). Проводилось определение титров антител в сыворотке отдельных животных, в пулах сыворотки от двух животных (в большинстве случаев) и в пулах сыворотки от 4 животных для групп отрицательного контроля (ЖЛ 17D и имитация вакцины). Титры антител в отдельных сыворотках, а также средние геометрические титры (СГТ) для каждой из групп приведены в табл. 8. Титры антител в исследованных образцах были сходными в пределах каждой группы, например, в группах, иммунизированных ПИВ, что указывает на высокую однородность иммунного ответа у животных. Как и ожидалось, нейтрализующих КЭ-специфичных антител в группах отрицательного контроля не определялось (группы ЖЛ 17D и имитации вакцины; СГТ 1:10); в соответствии с этим животные в этих группах оказались незащищнными от заражения на 21-й день после иммунизации вирусом КЭ дикого типа (штамм Hypr) в высокой дозе (500 БОЕ внутрибрюшинно). Данные о смертности за ограниченный период наблюдения (9 дней после заражения; наблюдение было продолжено) представлены в табл. 8, а динамика средней массы тела после заражения, указывающая на заболеваемость, приведена на фиг. 11. Нейтрализующие антитела были выявлены в организмах убитых животных в группе вакцинного контроля; титр этих антител был особенно высок после введения двух доз вакцины (СГТ 1:1496); животные в группе 2 доз вакцины были полностью защищены от КЭ, и смертности или потери массы тела в этой группе не было (это не относится к животным из группы 1 дозы вакцины). У животных, которым была введена одна или две дозы ПИВ-Hypr р 39, титр антител был очень высок (СГТ 1:665 и 1:10584); эти животные были наджно защищены от КЭ. Это указывает на то, что введение дефектной вакцины на основе о-ПИВ-КЭ приводит к развитию бурного иммунитета. У двух животных, выживших после иммунизации химерой ЖЛ/Hypr р 42 (см. табл. 7), титр антител также был высоким (СГТ 1:6085); эти животные были защищены от заражения вирусом дикого типа (табл. 8; фиг. 11). Интересно, что ПИВ-Hypr р 40 и ЖЛ/Hypr р 45 оказались слабоиммуногенными (СГТ 1:15 и 1:153 для одной и двух доз и 1:68 соответственно. Как указывалось выше, эти вакцины содержали ЛЗНспецифичные последовательности в сигнале для prM, тогда как высокоиммуногенные конструкции ПИВHypr р 39 и ЖЛ/Hypr р 42 содержали КЭ-специфичные сигнальные последовательности. В соответствии с приведенными выше данными этот результат указывает на важность правильного выбора сигнала дляprM, например, КЭ-специфичного сигнала. Это позволит добиться высокого уровня репликации и выделения ВПЧ, что в рамках этого эксперимента in vivo приводило к совершенно другому иммунному ответу. Иммуногенность химер ЖЛ/ЛГТ р 43 и ЖЛ/Hypr dC2 p59 была относительно низкой, что, впрочем, и ожидалось. Это объясняется использованием гетерологичной оболочки (оболочки вируса ЛГТ, отличающейся от оболочки вируса КЭ, которым проводилось заражение) и выраженным аттенуирующим эффектом делеции dC2 соответственно. Пример 3. Экспрессия чужеродных генов. В примерах конструкций рекомбинантных ПИВ, описанных ниже, проводилась оптимизация кодона (например, для эффективной экспрессии в целевой клетке-хозяине); также было проведено удаление длинных повторяющихся последовательностей нуклеотидов, что позволило увеличить стабильность вставок (размером 8 нуклеотидов; при необходимости может быть выполнено дополнительное укорочение повторов). Затем проводился химический синтез генов. Гены клонировались в векторные плазмиды ПИВ-ЛЗН по стандартным методам, принятым в молекулярной биологии, упакованные ПИВ восстанавливались после транскрипции in vitro и трансфекции соответствующих вспомогательных (для о-ПИВ) или обычных (для д-ПИВ) клеток. Экспрессия белка G вируса бешенства в о-ПИВ и д-ПИВ ЛЗН. Вирус бешенства из семейства Rhabdoviridae - это серьзный патоген, поражающий человека и животных. Несмотря на доступность нескольких убитых вакцин, в медицине и ветеринарии существует потребность в усовершенствованных вакцинах (например, недорогих профилактических прединфекционных вакцин). Гликопротеин G вируса бешенства опосредует попадание вируса в клетки и является основным иммуногеном этого вируса. Для создания ветеринарных вакцин этот гликопротеин экспрессировался на различных векторах (например, Pastoret and Brochier, Epidemio. Infect. 116:235-240, 1996; Li etal., Virology, 356:147-154, 2006). Проводилась оптимизация кодона полномерного белка G вируса бешенства (оригинальный пастеровский изолят вируса, номер доступа GenBank NC 001542). Ген синтезировался химически и вставлялся в области делеций С, prME и CprME в векторы ПИВ-ЛЗН (фиг. 12). Последовательности конструкций приведены в приложении 4. Общая структура конструкций представлена на фиг. 13. Полный ген белка G, содержащий свой собственный сигнальный пептид, вставлялся в рамке за геном С ЛЗН. Эта инсерция комбинировалась с делецией С (конструкции С и CprME) или не сочеталась с ней (prME) и находилась за несколько остатков от сигнала prM. За последовательностью трансмембранного С-концевого якоря белка G вставлялась аутопротеаза 2 А вируса ящура. Это обеспечивало отщепление С-концевого участка G от вирусного полипротеина во время трансляции. За элементом А 2 вируса ящура следовал ЛЗН-специфичный сигнал для prM и гены prME-NS1-5 (в случае конструкции С) или сигнал для NS1 и гены NS1-5 в конструкциях prME и CprME. Упакованные ПИВ ЛЗН(С)-G вируса бешенства, ЛЗН(prME)-G вируса бешенства и ЛЗН(prME)G вируса бешенства получались в результате трансфекции во вспомогательных клетках ПДХ, дополняющих делецию вектора на основе ПИВ [содержащих репликон вируса венесуэльской лошадиной лихорадки (штамм ТС-83) и экспрессирующие структурные белки, необходимые для транс- 26023888 радки (штамм ТС-83) и экспрессирующие структурные белки, необходимые для транс-комплементации]. Эффективная репликация и экспрессия белка G вируса бешенства для всех трх конструкций, которыми трансфицировались/инфицировались вспомогательные клетки ПДХ-С(ЛЗН) и/или ПДХ-CprME (ЛЗН), а также обычные клетки культуры ПДХ, подтверждались путм окрашивания с применением иммунологической метки и иммунофлуоресцентным анализом (ИФА) с помощью моноклональных антител к белку G вируса бешенства (RabG-МАЦ) (фиг. 14). Титры антител определялись в клетках культуры Vero окрашиванием с применением иммунологической метки с помощью МАЦ или поликлональных антител против вируса ЛЗН. Кривые роста конструкций в клетках ПДХ-CprME (ЛЗН) после трансфекции транскриптами РНК in vitro приведены на фиг. 14 (нижняя часть фигуры). Отмечался эффективный рост ПИВ до титров 6 - 7 log10 БОЕ/мл. Важно отметить, что окрашивание с помощью RabG-МАЦ и антител к ЛЗН определялись почти одинаковые титры, что представляло собой первой доказательство генетической стабильности вставки. В фиксированных без нарушения проницаемости мембраны клетках культуры Vero, инфицированных ПИВ, при окрашивании с помощью RabG-МАЦ наблюдалось выраженное окрашивание мембраны. Это говорит о том, что продукт экспрессии эффективно доставлялся к поверхности клеток (фиг. 15). Это явление считается главной предпосылкой для высокой иммуногенности экспрессируемого белка G. Отдельные упакованные ПИВ могут распространяться в инфицированных вспомогательных клетках ПДХ, но не могут размножаться в обычных клетках, как это показано для ПИВ ЛЗН(C)-G вируса бешенства на фиг. 16. Факт отсутствия распространения в обычных клетках ПДХ говорит о том, что рекомбинантные РНК-геномы не могут неспецифически упаковываться в мембранные носители, содержащие белок G, если образуются в инфицированных клетках. Такие же результаты были получены для белка G другого рабдовируса - вируса везикулярного стоматита (ВВС), в отличие от более ранних наблюдений про неспецифическую упаковку репликона вируса леса Семлики (ВЛС), экспрессирующего белок G ВВС (Rolls et al., Cell, 79:497-506, 1994). Это является желательной чертой с точки зрения безопасности. В противоположном случае неспецифическая упаковка может приводить к ограниченному распространению ПИВ in vivo, возможно усиливая антирабический иммунный ответ. Это явление также может предоставлять определенные преимущества, учитывая, что безопасность таких ПИВ также была продемонстрирована. Стабильность вставок гена белка G вируса бешенства в трх ПИВ была показана путм серии пассажей во вспомогательных клетках ПДХ-CprME (ЛЗН) при высоком и низком содержании ЧИ (частиц инфицирования) (0,1 или 0,001 БОЕ на клетку). При каждом пассаже собирались клеточные супернатанты; этот материал титровался в обычных клетках (например, клетках культурыVero) иммунологическим окрашиванием с помощью анти-ЛЗН поликлональных антител. Так определялся общий титр ПИВ. Титр частиц, содержащих ген G, определялся с помощью моноклонального антитела к белку G вируса бешенства (результаты отражены на фиг. 17 для содержания ЧИ 0,1; аналогичные результаты были получены и для содержания ЧИ 0,001). ПИВ ЛЗН(С)-G вирус бешенства были стабильными во всех 5 пассажах, тогда как титр ПИВ, содержащих вставки, на 6-ом пассаже начал снижаться, что указывает на нестабильность вставки. Это явление вполне ожидаемо, поскольку в этой конструкции крупная вставка гена G (1500 нуклеотидов) сочетается с небольшой делецией С (200 нуклеотидов), что значительно увеличивает общий размер рекомбинантного РНК-генома. В отличие от этого, в ПИВ ЛЗН(prME)-G вируса бешенства и ЛЗН(CprME)-G вируса бешенства вставки сочетаются со значительно большей делецией ( 000 нуклеотидов). Поэтому в этих конструкциях вставка оставалась стабильной на протяжении всех 10 пассажей (фиг. 17). Кроме того, как можно видеть на фиг. 17, на некоторых пассажах для всех трх ПИВ достигались высокие титры (8 log10 БОЕ/мл и выше), что является дополнительным доказательством того, что ПИВ можно легко производить в больших количествах. После введения in vivo о-ПИВ ЛЗН(C)-G вируса бешенства индуцирует сильный ответ со стороны нейтрализующих антител против вирусов ЛЗН и бешенства, а также ответ со стороны Т-клеток. ПИВ ЛЗН(prME)-G вируса бешенства и ЛЗН(CprME)-G вируса бешенства будут индуцировать гуморальный иммунный ответ только против вируса бешенства, поскольку они не кодируют белки prME вируса ДЗН. Инфицирование конструкцией о-ПИВ ЛЗН(C)-G вируса бешенства можно также сочетать с введением конструкции ЛЗН(prME)-G вируса бешенства в виде д-ПИВ (см. фиг. 12), что позволит увеличить дозу экспрессируемого белка G и усилить иммунитет против обоих патогенов, вследствие ограниченного распространения вируса. Примером распространения могут служить следующие данные. Результаты титрования в клетках культуры Vero образца о-ПИВ (ПИВ ЛЗН(prME)-G вируса бешенства) и образца д-ПИВ (ПИВ ЛЗН(prME)-G вируса бешенства + ЛЗН(С); последний ПИВ не кодирует белок G вируса бешенства) показаны на фиг. 18. Инфицирование обычных клеток культуры Vero o-ПИВ приводило к тому, что с помощью RabG-МАЦ окрашивались лишь отдельные клетки (или небольшие скопления клеток, образованные вследствие деления клеток). В отличие от этого, после инфицирования клеток д-ПИВ наблюдались большие очаги окрашенных клеток (фиг. 18, правая часть), что являлось результатом коинфицирования ПИВ обоих типов. Конструкция ЛЗН(CprME)-G вируса бешенства также может использоваться для создания д-ПИВ,если ввести эту конструкцию в геном вспомогательных клеток, в которых транскрибируются последовательности CprME (см. фиг. 12). Например, такой конструкцией может быть геном вируса ЛЗН, содержа- 27023888 щий делецию одного из белков NS, например, NS1, NS3 или NS5, которые, как известно, могут быть транс-комплементарными (Khromykh et al., J. Virol. 73:10272-10280, 1999; Khromykh et al., J. Virol. 74:3253-3263, 2000). Авторы изобретения сконструировали геном ЛЗН-NS1 (последовательность представлена в приложении 4) и получили подтверждение коинфекции конструкциями ЛЗН(prME)-G вируса бешенства или ЛЗН(CprME)-G вируса и распространения вируса in vitro с помощью метода окрашивания с применением иммунологической метки. В случаях тонких д-ПИВ во вспомогательный геном можно вставить белок G вируса бешенства, что приведт к его экспрессии, например, в геном ЛЗН-NS1. Это позволит увеличить количество экспрессируемого белка G вируса бешенства и в результате этого увеличить интенсивность антирабического иммунного ответа. Как в случае любых версий д-ПИВ, один иммуноген может принадлежать одному патогену (например, белок G вируса бешенства), а другой - второму патогену, что приведт к тройной антигенной специфичности вакцины. Как указывалось ранее, делецииNS1 в других примерах реализации изобретения могут заменяться делециями/мутациями NS3 и/илиNS5. Экспрессия белка F РСВ в о-ПИВ и д-ПИВ ЛЗН. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), принадлежащий к семейству Paramyxoviridae, является одной из самых частых причин тяжлых заболеваний дыхательных путей у маленьких детей во всм мире (Collins and Crowe, Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovirus, In: Knipe et al. Eds., FieldsVirology, 5 ed., Philadelphia: Wolters Kluwer/Lippincott Williams and Wilkins, 2007:1601-1646). Белок слияния вируса - это основной вирусный антиген, который можно использовать для создания безопасной и эффективной вакцины. Чтобы избежать поствакцинального обострения РСВ-инфекции, что наблюдалось ранее для кандидата на звание формалин-инактивированной вакцины, необходимо создать сбалансированный ответ на F со стороны Тх-1/Тх-2. Этого можно добиться путм улучшения стимуляции КПР необходимого условия для индукции образования высокоаффинных антител (Delgado et al., Nat. Med. 15:34-41, 2009). А это, в свою очередь, может быть достигнуто введением F в активный вектор на основе вируса. Ранее нами было показана способность химерических векторов на основе ЖАВ жлтой лихорадки индуцировать развитие сильного, сбалансированного ответа со стороны Tx-1/Tx-1 in vivo против антигена вируса гриппа (WO 2008/036146). В настоящем изобретении для представления белка F и индукции оптимального иммунного ответа использовались химерическая ЖАВ и вектор на основе ПИВ жлтой лихорадки. Для этих целей также могут использоваться и другие ЖАВ и ПИВ, описанные в настоящем изобретении. Сначала была проведена оптимизация кодона полномерного белка F штамма А 2 РСВ (номер доступа в GenBank P03420), как это описывалось ранее. Затем последовательность синтезировалась и клонировалась в плазмиды для получения О-ПИВ и д-ПИВ ЛЗН с помощью схем инсерции, приведенных на фиг. 12 и 13 для белка G вируса бешенства, с применением стандартных методов, принятых в молекулярной биологии. Точные последовательности инсерции и соседних генетических элементов представлены в приложении 5. Для трансфекции вспомогательных клеток ПДХ-CprME(ЛЗН) применялись полученные in vitro транскрипты РНК ПИВ ЛЗН(С)-F РСВ, ЛЗН(prME)-F РСВ и ЛЗН(prME)-F РСВ. Эффективная репликация и экспрессия белка F РСВ была продемонстрирована с помощью иммунологического окрашивания трансфицированных клеток МАЦ анти-F РСВ, как это показано для конструкции ЛЗН(prME)-F РСВ на фиг. 19. Присутствие упакованного ПИВ в супернатанте от транфицированных клеток (титр достигал 7 log10 БОЕ/мл) подтверждалось путм титрования в клетках культуры Vero с иммунологическим окрашиванием. Кроме того, возможно использование похожих конструкций, которые содержат модифицированный ген полномерного белка F. Например, N-концевой сигнальный пептид белка F в модифицированном белке F замещн на соответствующий сигнальный пептид белка G вируса бешенства. Эта модификация предназначена для выяснения, поможет ли использование гетерологичного сигнала увеличить скорость синтеза белка F и/или репликацию ПИВ. Таблица 1 Конструкции прототипа ПИВ, которые использовались в исследованиях создания платформы для вакцины Таблица 2 Безопасность: нейровирулентность для грудных мышат