Способ получения антистафилококковой плазмы крови

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСТАФИЛОКОККОВОЙ ПЛАЗМЫ КРОВИ Изобретение относится к медицине, а именно к иммунному донорству, и касается получения высококачественного сырья (гипериммунной плазмы) из крови иммунизированных доноров для производства иммунобиологических лекарственных средств - иммуноглобулин человека антистафилококковый и плазма человека антистафилококковая. Задача заявляемого изобретения заключается в получении плазмы крови с повышенными титрами антистафилолизина от иммунных доноров, сокращении сроков иммунизации, снижении антигенной нагрузки на организм доноров. Сущность изобретения заключается в том, что проводят двукратную иммунизацию донора. Первую иммунизацию проводят адсорбированным стафилококковым анатоксином в количестве 1 мл подкожно в область нижнего угла левой лопатки и дополнительно ронколейкином в дозе 1000 МЕ/кг, который вводят подкожно в область нижнего угла правой лопатки через 30 мин после введения адсорбированного стафилококкового анатоксина. Через 7 дней после этого проводят вторую иммунизацию путем введения в организм донора адсорбированного стафилококкового анатоксина в количестве 1 мл. Через каждые две недели после начала иммунизации осуществляют забор крови с последующим выделением из нее плазмы. Потапнев Михаил Петрович, Пешняк Жанна Витальевна, Мальцева Линура Марсовна (BY), Смирнов Михаил Николаевич (RU)(56) Н. А. Михайлова и др. Опыт применения вакцины "пиопол" для иммунизации доноровдобровольцев. Иммунология. 2006, том 27, 2, с. 80-83WO-A1-1993017044 Е. А. Федоровская и др. Имунный ответ организма доноров при иммунизации стафилококковым анатоксином. Врачебное дело. 2/89, с. 70-72 ISSN 0049-8804(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР ТРАНСФУЗИОЛОГИИ И МЕДИЦИНСКИХ БИОТЕХНОЛОГИЙ (BY); ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ 016268 Изобретение относится к медицине, а именно к иммунному донорству, и касается получения высококачественного сырья (гипериммунной плазмы) из крови иммунизированных доноров для производства иммунобиологических лекарственных средств - иммуноглобулин человека антистафилококковый и плазма человека антистафилококковая. Известен способ получения плазмы крови от доноров, иммунизированных вакциной Staphylococcusepidermidis, после чего из плазмы доноров получали иммуноглобулин человека для профилактики и лечения стафилококковой инфекции, обусловленной Staphylococcus epidermidis [1]. Недостатком способа является трудоемкость приготовления данной вакцины и использование дорогостоящих методов для определения опсонофагоцитарной бактериальной активности плазмы к Staphylococcus epidermidis, полученной от каждого иммунизированного донора. Известен способ получения биологически активной сыворотки крови, заключающийся в том, что перед взятием крови донора вводят в состояние двигательной, гипоксической, термической, пищевой,звуковой, антиалкогольной или антиникотиновой мотивации в течение от 10 мин до 3 ч, выделяют из крови донора биологически активную сыворотку, после чего сыворотку замораживают [2]. Недостатком способа является косвенное воздействие на иммунную систему и получение сыворотки крови, не обладающей противоинфекциоными свойствами. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения биологически активной плазмы крови, заключающийся в трехкратном введении адсорбированного стафилококкового анатоксина (ACA) по следующей схеме: первое введение (первая иммунизация) - 1 млACA, через 7 дней - 1 мл ACA и еще через 7 дней 2 мл ACA согласно действующей "Инструкции по иммунизации доноров стафилококковым анатоксином и проведению плазмафереза для получения антистафилококковой плазмы" [3]. Недостатками данного способа являются следующие: 1) выявлено, что у лиц, у которых отмечен слабовыраженный иммунный ответ после двух инъекцийACA, не наблюдается повышения титров антистафилолизина и после 3-й инъекции двойной дозойACA; 2) около 60% доноров имеют невысокий и непродолжительный иммунный ответ при иммунизацииACA по вышеуказанной схеме, а некоторые доноры остаются ареактивными к данному антигенному стимулу; 3) у некоторых иммунизированных доноров наблюдается реакция на введение ACA, которая может быть общей (недомогание, озноб, субфебрильная температура) и местной (гиперемия, инфильтрат до 5 мм диаметром в месте введения). Общие реакции могут сохраняться в течение 24-48 ч. Гиперемия обычно исчезает в течение 3-4 суток, инфильтрат сохраняется до 10 суток, а у части иммунизированных доноров - до 30 и более суток в виде безболезненного уплотнения. Причем, если интенсивность вышеуказанных побочных эффектов слабая, то лечения не требуется, а если умеренная, то требуется симптоматическое лечение, в частности введение кетопрофена (кетонала) 50-100 мг/сутки в соответствии с инструкцией по применению ACA [4]. Задача заявляемого изобретения заключается в получении плазмы крови с повышенными титрами антистафилолизина от иммунных доноров, сокращении сроков иммунизации, снижении антигенной нагрузки на организм доноров. Поставленная задача достигается за счет того, что в способе получения антистафилококковой плазмы крови, включающей двукратную иммунизацию донора путем введения в его организм адсорбированного стафилококкового анатоксина в количестве 1 мл с интервалом 7 дней, после чего через каждые две недели после начала иммунизации осуществляют забор крови с последующим выделением из нее плазмы, новым является то, что первую иммунизацию проводят адсорбированным стафилококковым анатоксином подкожно в область нижнего угла левой лопатки и дополнительно ронколейкином в дозе 1000 МЕ/кг, который вводят подкожно в область нижнего угла правой лопатки через 30 мин после введения адсорбированного стафилококкового анатоксина. Сущность изобретения заключается в следующем: 1) 1 мл ACA вводится глубоко подкожно в область нижнего угла левой лопатки донора. Общая и местная реакция на введение должна отсутствовать в течение 30 мин. Через 30 мин после этого раствор ронколейкина, разведенный стерильной водой для инъекций до 100000 МЕ/мл, вводится подкожно в область нижнего угла правой лопатки в количестве 1000 МЕ/кг веса, то есть при весе донора до 60 кг - 0,6 мл; при весе донора от 61 кг до 70 кг - 0,7 мл; при весе донора от 71 кг до 80 кг - 0,8 мл; при весе донора от 81 кг до 90 кг - 0,9 мл; при весе донора от 91 кг до 100 кг и более - 1,0 мл. 2) Через 7 дней после начала иммунизации повторно вводится 1 мл ACA в подлопаточную область.ACA представляет собой инактивированный токсин золотистого стафилококка, который сохраняет-1 016268 свою антигенную структуру и является иммуногенным. Препарат вызывает образование специфических антитоксических антител и применяется при иммунизации доноров с целью получения антистафилококковой плазмы и антистафилококкового иммуноглобулина [4]. Ронколейкин - препарат рекомбинантного дрожжевого ИЛ-2 человека, производства ООО "Биотех"(Санкт-Петербург, Россия). Практика более чем 8-летнего использования ронколейкина в клинической медицине выявила его приоритет во многих областях цитокиновой иммунокорригирующей терапии рекомбинантным ИЛ-2(рИЛ-2) по сравнению с препаратами, применяемыми в зарубежных странах [5]. Ронколейкин создан на основе продуцента непатогенных штаммов дрожжей-сахаромицетов Saccharomyces cerevisiae. В результате этой технологии производства получается рИЛ-2, идентичный по аминокислотной последовательности пептидному фрагменту эндогенного человеческого ИЛ-2. Технология производства на основе дрожжевого продуцента является более экономичной по сравнению с продуцентом на основе E. coli, поэтому конечная стоимость препарата ниже, чем у зарубежных аналогов рИЛ-2 (Proleukin, Aldesleukin,Teceleukin, Macrolin IL-2, Bioleukin). Зарубежным аналогом Ронколейкина, созданным в 2002 году по сходной технологии, является препарат рИЛ-2 Albuleukin (albumininterleukin-2, Human Genome Sciences,Inc.) Ввиду того, что ронколейкин является структурным и функциональным аналогом эндогенного человеческого ИЛ-2, то для оценки иммунокорригирующей эффективности данного препарата следует отметить главные механизмы иммунных эффектов эндогенного ИЛ-2. ИЛ-2 относится к семейству цитокиновгематопоэтинов и представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 15000 Да (в гликолизированной форме 17000-22000 Да). Основной фармакологический эффект - иммуномодулирующий [6]. Иммунологическая роль ИЛ-2 заключается в регуляции специфического (антигензависимого) иммунного ответа за счет стимуляции пролиферации и дифференцировки иммунных клеток, участвующих в его реализации. Взаимодействуя с рецепторами клеток, ИЛ-2 индуцирует рост, дифференцировку и пролиферацию T- и B-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, олигодендроглиальных клеток, эпидермальных клеток Лангерганса. ИЛ-2 вызывает образование лимфокинактивированных киллеров. Он также стимулирует цитолитическую активность натуральных киллеров и цитотоксических Tлимфоцитов, повышает устойчивость клеток к программированной клеточной гибели - апоптозу. Применение препарата ИЛ-2 обеспечивает иммунную защиту, направленную против опухолевых клеток, а также возбудителей вирусной, бактериальной и грибковой инфекции. Показаниями к его применению является комплексная терапия септических состояний различной этиологии, сопровождающихся иммуносупрессией у взрослых лиц, в хирургии, травматологии, гинекологии, ожоговый сепсис, тяжелые пневмонии, лечение рака почки у взрослых лиц. Сущность изобретения и полученные положительные результаты по применению заявляемого способа поясняются графическими материалами, в которых приведено: на фиг. 1 - показатели общего анализа крови доноров, иммунизированных по заявляемому способу(донор И.) и по прототипу (донор Р.), на фиг. 2 -показатели биохимического анализа крови доноров, иммунизированных по заявляемому способу (донор И.) и по прототипу (донор Р.), на фиг. 3 - содержание ИЛ-2 в сыворотке крови доноров, иммунизированных по заявляемому способу (донор И.) и по прототипу(донор Р.), на фиг. 4 - содержание ИФН- в сыворотке крови доноров, иммунизированных по заявляемому способу (донор И.) и по прототипу (донор Р.), на фиг. 5 - титры антистафилолизина у доноров, иммунизированных по заявляемому способу и по прототипу, на фиг. 6 - анализ основных данных при иммунизации доноров по заявляемой схеме и по прототипу, на фиг. 7 - показатели общего анализа крови доноров, иммунизированных по заявляемому способу и по прототипу, на фиг. 8 - показатели биохимического анализа крови доноров, иммунизированных по заявляемому способу и по прототипу, на фиг. 9 содержание интерлейкина-2 в сыворотке крови доноров, иммунизированных по заявляемому способу и по прототипу, на фиг. 10 - содержание интерферонаальфа (ИФН-) в сыворотке крови доноров, иммунизированных по заявляемому способу и по прототипу. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Донору И. вводили ACA и ронколейкин по заявляемому способу. Определение титров антистафилолизина в течение 3 месяцев наблюдения до и через каждые 14 дней после начала иммунизации перед плазмаферезом позволило установить следующие результаты: за 2 недели до иммунизации 0,5 МЕ/мл, в день иммунизации - 1,5 МЕ/мл, через 2, 4, 6 и 11 недель после иммунизации - 9 МЕ/мл. Пример 2. Донор Р., проиммунизированный по стандартной схеме иммунизации ACA (1 млACA+через 7 дней 1 мл ACA+через 7 дней 2 мл ACA), имел следующие титры: за 2 недели до иммунизации - 0 МЕ/мл, в день иммунизации - 1,5 МЕ/мл, через 2, 4, 6 и 11 недель после иммунизации - 2 МЕ/мл. Данные показателей общего анализа крови, биохимического анализа крови, содержания ИЛ-2 в сыворотке крови, а также содержания ИФН- в сыворотке крови донора И. и донора Р. приведены на фиг. 1-4. Все изменения исследуемых показателей анализа крови находились в пределах нормативных значений.-2 016268 Клинические испытания заявляемого способа получения плазмы крови проведены на 15 донорах мужского пола в возрасте от 20 до 50 лет. Одновременно в качестве сравнения была проведена иммунизация 15 донорам по прототипу. Статистически значимые различия (P0,05) оценивали при применении однофакторного дисперсионного анализа в F-тесте. Как видно из данных, приведенных на фиг. 5, исходные титры антистафилолизина достоверно не отличались в исследуемых группах доноров и составляли соответственно для доноров, иммунизированных по заявляемому способу (иммунизация ACA+Ронколейкин) - 0,60,46 МЕ/мл, а для доноров, иммунизированных по прототипу (иммунизация ACA) - 0,550,53 МЕ/мл. Установлено, что ронколейкин оказывал наиболее выраженный стимулирующий эффект на продукцию антистафилолизина в период со 2 по 11 неделю после введения совместно с ACA по заявляемому способу в сравнении с прототипом. Однократное введение препарата ронколейкин по заявляемому способу повышает титры антистафилолизина по сравнению с прототипом следующим образом: через 2 недели после начала иммунизации - в 2,1 раза, через 4 недели - в 1,9 раза, через 6 недель - в 1,9 раза,через 11 недель - в 2,0 раза. Следует отметить, что у доноров, иммунизированных по заявляемому способу, со 2 по 11 недели после начала иммунизации титры были не менее 2 МЕ/мл у 15 доноров из 15, не менее 6 МЕ/мл: через 2 недели - у 9 доноров из 15, через 4 недели - у 11 доноров из 15, через 6 недель - у 11 доноров из 15, через 11 недель - у 7 доноров из 15 (фиг. 6). У доноров, иммунизированных по прототипу, установлены титры антистафилолизина не менее 2 МЕ/мл через 2 недели после начала иммунизации у 10 доноров из 15, через 4 недели - у 13 из 15, через 6 недель - у 12 из 15, через 11 недель - у 11 из 15; не менее 6 МЕ/мл через 2 недели - у 5 доноров из 15, через 4 недели - у 6 доноров из 15, через 6 недель - у 6 из 15, через 11 недель - у 2 из 15. В результате от доноров, иммунизированных по заявляемому способу за весь период наблюдения после начала иммунизации, получено плазмы с титрами более 2 МЕ/мл - 36,0 л, с титрами более 6 МЕ/мл - 22,8 л, а от доноров, иммунизированных по прототипу, получено плазмы с титрами более 2 МЕ/мл - 27,6 л и с титрами более 6 МЕ/мл -11,4 л (что в 1,3 и в 2 раза соответственно меньше, чем по заявляемому способу). Безопасность применения ронколейкина при иммунизации доноров по заявляемому способу определяли, оценивая их состояние на основе изучения комплекса клинико-лабораторных показателей, в том числе показателей общего анализа крови с лейкоцитарной формулой и биохимического анализа крови,содержания в сыворотке крови доноров эндогенных цитокинов ИЛ-2 и ИФН-. При иммунизации в исследуемых группах не отмечалось патологических клинических и аллергических реакций. После иммунизации по заявляемому способу и по прототипу отклонений от нормы в состоянии здоровья доноров и показателях общего анализа крови за весь период наблюдения выявлено не было (данные приведены на фиг. 7). Исключение составило достоверное повышение относительного количества эозинофилов через 11 недель после иммунизации у доноров, иммунизированных по заявляемому способу по сравнению с показателями, полученными у доноров, иммунизированных по прототипу(2,41,6% и 2,10,9% соответственно, P=0,045), не выходящее за диапазон нормативных значений (0,55%). Однократное введение препарата Ронколейкин в дозе 1000 МЕ/кг с ACA по заявляемому способу хорошо переносилось донорами, у доноров отсутствовала реакция со стороны лимфоидной ткани. За 2 недели до иммунизации и через 4 и 11 недель после начала иммунизации по заявляемому способу отклонений от диапазона нормативных значений в исследуемых показателях биохимического анализа крови у доноров выявлено не было (фиг. 8). Через 11 недель после начала иммунизации в группе доноров, иммунизированных по прототипу, выявлено достоверное повышение показателей общего билирубина (отмечаемое у 1 из 15 доноров), ACT и АЛТ (наблюдаемое у 2 из 15 доноров) по сравнению с аналогичными показателями в группе доноров, иммунизированных по заявляемому способу. Однократное введение препарата ронколейкин в дозе 1000 МЕ/кг с ACA по заявляемому способу не вызывало у доноров отклонений от нормы биохимических показателей крови. За 2 недели до иммунизации и через 4 и 11 недель после начала иммунизации в обследуемых группах доноров значимых отклонений от диапазона значений нормы в содержании эндогенных ИЛ-2 и ИФН- в сыворотке крови доноров выявлено не было (фиг. 9 и 10). В группе доноров, иммунизированных по заявляемому способу иммунизации, за 2 недели до начала иммунизации выявлено достоверное снижение содержания ИЛ-2 в сыворотке крови доноров (0,180,37 пг/мл) по сравнению с содержанием ИЛ-2 в группе доноров, иммунизированных по прототипу (0,40,8 пг/мл). В данной группе доноров через 4 недели наблюдения количество ИЛ-2 повысилось в 10,1 раза по сравнению с исходным уровнем (1,814,45 пг/мл) и было достоверно выше в 2,8 раза, чем у доноров,иммунизированныхпо прототипу (0,651,2 пг/мл). Через 11 недель наблюдения у доноров, иммунизированных по заявляемому способу, содержание ИЛ-2 в 3,0 раза было достоверно выше, чем в группе доноров, иммунизированных по прототипу (1,573,53 пг/мл и 0,520,93 пг/мл соответственно, P=0,00012). В группе доноров, иммунизируемых по заявляемому способу как до, так и через 4 недели после начала иммунизации отмечалось достоверно низкое содержание ИФН- по сравнению с данным показателем в группе доноров, иммунизированных по прототипу. Через 11 недель после начала иммунизации его-3 016268 содержание во всех группах снизилось и достоверно не различалось между группами доноров. Однократное введение препарата ронколейкин с ACA по заявляемому способу не вызывало выходящего за пределы нормы повышения уровня эндогенных цитокинов ИЛ-2 и ИФН- в сыворотке крови у доноров. Заявляемый способ предусматривает повышение в 2,0 раза титров антистафилолизина у иммунизированных доноров, отмену проведения третьей иммунизации доноров двойной дозой (2 мл) ACA, в результате чего снижается антигенная нагрузка на организм донора и на 1 неделю сокращаются сроки иммунизации, что влечет экономию финансовых затрат при получении антистафилококкой плазмы. Данный подход при иммунизации донора будет способствовать получению высококачественного сырья для производства плазмы человека антистафилококковой и иммуноглобулина человека антистафилококкового, лекарственных средств, необходимых при лечении септических и тяжелых инфекционных состояний. Источники информации 1. Патент США на изобретение 6632432 "Directed human immune globulin for the prevention andtreatment of staphylococcal infections", МПК A61K39/00, опубл. 2003.10.14. 2. Патент РФ на изобретение 2120301 "Способ получения биологически активной сыворотки крови", МПК А 61 К 39/00, опубл. 1998.10.20. 3. Инструкция по иммунизации доноров стафилококковым анатоксином и проведению плазмафереза для получения антистафилококковой плазмы. - М. - Центральный ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени научно-исслед. институт гематологии и переливания крови. 1977, c. 4-5. 4. Инструкция по применению анатоксина стафилококкового очищенного адсорбированного жидкого: утв. Мин. здравоохранения Российской Федерации 26.12.2003. Москва, 2 с. 5. Попович A.M. Достижения и перспективы клинического применения ронколейкина при лечении иммунодефицитов различной этиологии // Материалы VII Всероссийского форума с межд. участием"Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" им. Акад. В.И. Иоффе, 2003, c. 2-7. 6. Михайленко А.А., Коненков В.И., Базанов Г.А., Покровский В.И. Руководство по клинической иммунологии, аллергологии, иммуногенетике и иммунофармакологии (для врачей общеклинической практики) / Под ред. В.И. Покровского. Т. 2. Тверь, ООО "Издательство "Триада" ", 2005, с. 395. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антистафилококковой плазмы крови, включающий двукратную иммунизацию донора путем введения в его организм адсорбированного стафилококкового анатоксина в количестве 1 мл с интервалом 7 дней, после чего через каждые две недели после начала иммунизации осуществляют забор крови с последующим выделением из нее плазмы, отличающийся тем, что первую иммунизацию проводят адсорбированным стафилококковым анатоксином подкожно в область нижнего угла левой лопатки и дополнительно ронколейкином, причем ронколейкин в дозе 1000 МЕ/кг вводят подкожно в область нижнего угла правой лопатки через 30 мин после введения адсорбированного стафилококкового анатоксина.