Антитела к n3pglu бета-амилоидному пептиду и их применение

Лу Джиронг, Тан Ин, Дематтос Рональд Брэдли (US) Лыу Т.Н. (RU) Настоящее изобретение относится к анти-N3pGlu A антителам или их антигенсвязывающим фрагментам. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению анти-N3pGlu A антител или их антигенсвязывающих фрагментов для лечения болезни Альцгеймера.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) Настоящее изобретение относится к антителам, которые селективно связывают бета-амилоидный пептид N3pGlu, и их применению в лечении заболеваний, связанных с бета-амилоидным пептидом (A,также называемый Абета). Циркулирующая форма бета-амилоидного пептида состоит из 38-43 аминокислот (в основном 38,40 или 42 аминокислоты) и образуется в результате расщепления белка-предшественника, так называемого белка-предшественника амилоида (АРР). Превращение растворимых форм A пептида в нерастворимые формы с высоким содержанием -складчатых структур и отложение этих нерастворимых форм в виде нейритных и цереброваскулярных бляшек в головном мозге связывают с рядом патологических состояний и заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (AD), синдромом Дауна и церебральную амилоидную ангиопатию (ЦАА). Отложения, обнаруживаемые в бляшках, состоят в основном из гетерогенной смеси бетаамилоидных пептидов. Бета-амилоид N3pGlu, также называемый N3pE или Аp3-42, является усеченной формой амилоидного бета-пептида, обнаруженного только в бляшках. В бета-амилоидном пептидеN3pGlu отсутствуют два первых аминокислотных остатка на N-конце, а в третьем положении присутствует пироглутамат, образованный из глутаминовой кислоты. Хотя бета-амилоидный пептид N3pGlu является минорным компонентом отложений А в мозге, исследования показали, что бета-амилоидный пептид N3pGlu обладает сильными агрегационными свойствами и накапливается в начале каскада процессов, приводящих к образованию отложений. Хотя поликлональные и моноклональные антитела, направленные против бета-амилоидного пептида N3pGlu (US 7122374 и WO 2010/009987), уже были описаны ранее, по-прежнему существует потребность в высокоаффинных моноклональных антителах к бета-амилоиду N3pGlu, которые обеспечивали бы связывание мишени in vivo (то есть связывание с бляшками) и, соответственно, снижение количества бляшек. Кроме того, учитывая, что антитела к А, связывающиеся с его N- и С-концевыми остатками,приводят к увеличению микрокровоизлияний, связанных с церебральной амилоидной ангиопатией(ЦАА), существует потребность в антителах к бета-амилоиду N3pGlu, которые не приводят к увеличению микрокровоизлияний, даже если длительное лечение приводит к значительному снижению числа отложившихся бляшек. Антитела согласно настоящему изобретению представляют собой терапевтически применимые антагонисты бета-амилоидного пептида N3pGlu, которые обладают рядом желаемых свойств. Антитела согласно настоящему изобретению связываются с бета-амилоидный пептидом N3pGlu человека с высокой аффинностью и дозазависимоым образом снижают количество бляшек in vivo без увеличения микрокровоизлияний, связанных с церебральной амилоидной ангиопатией (ЦАА). Согласно настоящему изобретению предложено модифицированное антитело к бета-амилоидуN3pGlu человека или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий Kd1 10-9 M при 25 С в отношении бета-амилоидного пептида N3pGlua человека. В предпочтительном варианте реализации изобретения предложено модифицированное антитело к N3pGlu A человека или его антигенсвязывающий фрагмент с Kd9l0-10 M при 25 С в отношении бета-амилоидного пептида N3pGlu человека. В другом предпочтительном варианте реализации изобретения предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu человека или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающий Kd710-10 M при 25 С в отношении бета-амилоидного пептида N3pGlu человека. В другом предпочтительном варианте реализации изобретения предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu человека или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающий Kd от 910-10 M до 1 10-10 M при 25 С в отношении бета-амилоидного пептида N3pGlu человека. В другом предпочтительном варианте реализации изобретения предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu человека или его антигенсвязывающий фрагмент с Kd от 910-10 M до 110-10 M при 25 С в отношении бетаамилоидного пептида N3pGlu человека. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlua или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий Kd110-9 M или 910-10 М, или 7 10-10 М, или от 910-10 M до 110-10 M при 25 С в отношении бета-амилоидного пептида N3pGlu человека, которое снижает количество бляшек in vivo. В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено модифицированное антитело к бетаамилоидному пептиду N3pGlua ил его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий Kd110-9 M или 910-10 М, или 710-10 М, или от 910-10 M до 110-10 M при 25 С в отношении бета-амилоидного пептида N3pGlua человек, которое снижает количество бляшек in vivo без увеличения микрокровоизлияний,связанных с церебральной амилоидной ангиопатией (ЦАА). Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), в которых LCDR1 (гипервариабельный участок (CDR)1) представляет собой KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 представляет собой AVSKLX4S (SEQ ID NO:52), LCDR3 представляет собой VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) и HCDR1 представляет собой GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 представляет собойX1 представляет собой S или Т, Х 2 представляет собой Q или R, Х 3 представляет собой G или S, Х 4 представляет собой D или G, X5 представляет собой D или Т, Х 6 представляет собой R или D и Х 7 представляет собой I, T, Е или V. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигеневязывающий фрагмент, включающий вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем указанная LCVR включает полипептиды LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и HCVR включает полипептиды HCDR1, HCDR2 иHCDR3, которые выбраны из группы, состоящей из: а) LCDR1, представляющего собой KSSQSLLYSRGKTYLN (SEQ ID NO: 3), LCDR2, представляющего собой AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3, представляющего собой VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5),HCDR1, представляющего собой GYDFTRYYIN (SEQ ID NO: 6), HCDR2, представляющего собойWINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) и HCDR3, представляющего собой EGVTVY (SEQ ID NO: 46). В одном варианте реализации настоящего изобретения предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 3, LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 4, LCDR3 представляет собой SEQ IDNO: 5, HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 6, HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 8, и HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 9. В одном варианте настоящего изобретения предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LCVR и HCVR, причем LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 3, LCDR2 представляет собойSEQ ID NO: 4, LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 5, HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 7,HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 8, и HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 10. В предпочтительном варианте реализации изобретения предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LCVR и HCVR, причем LCDR1 представляет собой SEQ ID NO:3, LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 4, LCDR3 представляет собойHCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 41. В предпочтительном варианте реализации изобретения предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlua или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LCVR и HCVR, причем LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 3,LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 35, LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 5, HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 7, HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 8, и HCDR3 представляет собой SEQID NO: 10. В предпочтительном варианте реализации изобретения предложено модифицированное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие LCVR иHCVR, причем LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 45, LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 4,LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 5, HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 40, HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 8, и HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 46. В другом варианте настоящего изобретения предложено модифицированное антитело к бетаамилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), причем указанные областиSEQ ID NO: 48. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO:11, и HCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 12. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бетаамилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие LCVR имеющую последовательность SEQ ID NO: 11, и HCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 13. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бетаамилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 11, и HCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 42. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бетаамилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 36, и HCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 37. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бетаамилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 47, и HCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 48. Согласно настоящему изобретению также предложено моноклональное антитело к бетаамилоидному пептиду N3pGlu, содержащее легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (НС), причем полипептиды LC и НС выбраны из группы, состоящей из: а) LC, имеющей последовательность SEQ ID NO: 14, и НС, имеющей последовательность SEQ IDNO: 50. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LC, имеющую последовательность SEQ ID NO: 14, и НС, имеющую последовательность SEQ ID NO: 15. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бетаамилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LC, имеющую последовательность SEQ ID NO: 14, и НС, имеющую последовательность SEQ ID NO: 16. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LC, имеющую последовательность SEQ ID NO: 14, и НС, имеющую последовательность SEQ ID NO: 44. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlua или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LC, имеющую последовательностьSEQ ID NO: 38, и НС, имеющую последовательность SEQ ID NO: 39. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бета-амилоидному пептидуN3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий LC, имеющую последовательность SEQID NO: 49, и НС, имеющей последовательность последовательности SEQ ID NO: 50. В предпочтительном варианте реализации изобретения моноклональное антитело к бетаамилоидному пептиду N3pGlu включает две легкие и две тяжелые цепи, причем каждая LC представляет собой полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 14, и каждая НС представляет собой полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 15. В предпочтительном варианте реализации изобретения моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu включает две легкие и две тяжелые цепи, причем каждая LC представляет собой полипептид, имеющий последовательность SEQ IDNO: 14, и каждая НС представляет собой полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 16. В предпочтительном варианте реализации изобретения моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlua включает две легкие и две тяжелые цепи, причем каждая LC представляет собой полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 14, и каждая НС представляет собой полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 44. В предпочтительном варианте реализации изобретения моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu включает две легкие и две тяжелые цепи,причем каждая LC представляет собой полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 38, и ка-3 023021 ждая НС представляет собой полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 39. В предпочтительном варианте реализации изобретения моноклональное антитело к бета-амилоидному пептидуN3pGlu включает две легкие и две тяжелые цепи, причем каждая LC представляет собой полипептид,имеющий последовательность SEQ ID NO: 49, и каждая НС представляет собой полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 50. Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением. В предпочтительном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция включает моноклональное антитело к бета - амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением, а также фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. В другом предпочтительном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция дополнительно включает один или более терапевтических ингредиентов. В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения патологического состояния,связанного с активностью пептида AJ3, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом,моноклонального антитела к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с настоящим изобретением. В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения патологического состояния,выбранного из группы, состоящей из клинической или доклинической стадии болезни Альцгеймера,продромальной формы болезни Альцгеймера, синдрома Дауна и клинической или доклинической стадии ЦАА, причем указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, моноклонального антитела к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с настоящим изобретением. В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения болезни Альцгеймера. В другом аспекте настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бетаамилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в терапии. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в лечении патологического состояния, выбранного из клинической или доклинической стадии болезни Альцгеймера, продромальной формы болезни Альцгеймера, синдрома Дауна и клинической или доклинической стадии ЦАА. В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в лечении болезни Альцгеймера. В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в профилактике патологического состояния, выбранного из клинической или доклинической стадии болезни Альцгеймера, продромальной формы болезни Альцгеймера и клинической или доклинической стадии ЦАА. В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено моноклональное антитело к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в профилактике болезни Альцгеймера. В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение моноклонального антитела к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающего фрагмента в изготовлении лекарственного средства для лечения патологического состояния, выбранного из группы, состоящей из клинической и доклинической стадии болезни Альцгеймера, продромальной формы болезни Альцгеймера, синдрома Дауна и клинической или доклинической стадии ЦАА. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения предложено применение моноклонального антитела к бета-амилоидному пептиду N3pGlu или его антигенсвязывающего фрагмента в изготовлении лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера. Полноразмерное антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, содержащую 2 тяжелые(Н) цепи и 2 легкие (L) цепи, которые связаны между собой дисульфидными связями. Амино-концевая часть каждой цепи содержит вариабельную область, состоящую примерно из 100-110 аминокислот, которая отвечает в основном за распознавание антигена благодаря гипервариабельным участкам (CDR),содержащимся в ней. Карбокси-концевая часть каждой цепи определяет константную область, которая отвечает в основанном за эффекторную функцию. Гипервариабельные участки чередуются с консервативными, называемыми каркасными участками(FR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR) и вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из 3 гипервариабельных участков и 4 каркасных участков, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Три гипервариабельных участка (3CDR) легкой цепи называются "LCDR1, LCDR2 и LCDR3", три гипервариабельных участка тяжелой цепи называются "HCDR1, HCDR2 и HCDR3". Гипервариабельные участки содержат большую часть остатков, которые участвуют в специфических взаимодействиях с антигеном. Нумерация и расположение аминокислотных остатков CDR в областях LCVR и HCVR приведены в соответствии с известной системой нумерации по Кабат. Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда и характеризуется в соответствии с константной областью, как хорошо известно в данной области. Тяжелые цепи классифицируются как гамма,мю, альфа, дельта или эпсилон и определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, соответственно. Антитела IgG могут быть разделены на подклассы, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется соответствующей константной областью с последовательностью, известной в данной области техники. В настоящей заявке термин "моноклональное антитело" (мАТ) относится к антителу, которое получено или выделено из одной копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, но не к методу его получения. Моноклональные антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно представлены однородной или, по существу, однородной популяцией. Полные моноклональные антитела содержат 2 тяжелые цепи и 2 легкие цепи. Словосочетание "антигенсвязывающие фрагменты" включает, например, фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab')2 фрагменты и одноцепочечные фрагменты Fv. Моноклональные антитела согласно настоящему изобретению и антигенсвязывающие фрагменты таких антител могут быть получены, например, с использованием рекомбинантных методик, методики фагового дисплея, методик синтеза, например CDR-прививки, или комбинации указанных методик либо с использованием других методик, известных в данной области техники. Например, мыши могут быть иммунизированы антителами к бета-амилоидному пептидуN3pGlu человека или их фрагментами, полученные в результате антитела могут быть выделены и очищены затем для того, чтобы установить, обладают ли они связывающими и функциональными свойствами, которые сопоставимы или аналогичны свойствам соединений антител, описанных здесь, может быть проведена оценка с использованием способов, по существу, описанных в приведенных ниже примерах. Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть получены с использованием обычных способов. Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области и могут быть найдены, например, в Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, главы 5-8 и 15, ISBN 0-87969-314-2. Словосочетание "модифицированные антитела человека" относится к моноклональным антителам,имеющим связывающие и функциональные свойства согласно настоящему изобретению, и включающим каркасные участки, которые являются по существу человеческими или полностью человеческими и окружают участки CDR, которые являются производными антител, не являющихся человеческими. "Антигенсвязывающие фрагменты" таких модифицированных антител человека включают, например, фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab')2 фрагменты и одноцепочечные фрагменты Fv. "Каркасный участок" или "каркасная последовательность" относится к любому из каркасных участков с 1 по 4. Модифицированные антитела человека и их антигенсвязывающие фрагменты, которые включены в объем настоящего изобретения, включают молекулы, в которых любой один или более каркасных участков с 1 по 4 представляет собой, по существу, полностью или полностью человеческий участок, то есть, присутствует любая из возможных комбинаций отдельных, по существу, полностью или полностью человеческих каркасных участков с 1 по 4. Например, включены молекулы, в которых каркасный участок 1 и 2,каркасный участок 1 и 3, каркасный участок 1, 2 и 3, и т.д. являются, по существу, полностью или полностью человеческими. По существу, человеческие каркасные участки представляют собой участки, которые обладают по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с известной последовательностью каркасного участка зародышевой линии человека. В предпочтительном варианте реализации изобретения последовательности, по существу, человеческих каркасных участков обладают по меньшей мере примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 99% идентичностью последовательности с известной последовательностью каркасного участка зародышевой линии человека. Полностью человеческие каркасные участки представляют собой участки, последовательности которых идентичны известной последовательности каркасного участка зародышевой линии человека. Последовательности каркасных участков зародышевой линии человека могут быть получены в ImMunoGeneTics (IMGT) черезвеб-сайт http://imgt.cines.fr, или из The Immunoglobulin FactsBook by Marie-PauleLefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Например, последовательности каркасных участков легкой цепи зародышевой линии могут быть выбраны из группы, состоящей из: АН,А 17, А 18, А 19, А 20, А 27, А 30, LI, L1i, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, 02 и 08, последовательности каркасных участков тяжелой цепи зародышевой линии могут быть выбраны из группы, состоящей из: VH2-5,VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, ДМС-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, ДМС-18, ДМС-69, VI-137, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 и VH5-51. Помимо антител, описанных в настоящей заявке, модифицированные антитела человека, которые имеют близкие функциональные свойства в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены различными способами. Конкретные молекулы антитела, раскрытые здесь, могут быть использованы в качестве матриц или исходных молекул антител для получения дополнительных молекул антител. В одном подходе участки CDR исходной молекулы антитела прививают в каркасную область человека,последовательность которой характеризуется высоким процентом идентичности с последовательностью каркасной области исходной молекулы антитела. Идентичность последовательности нового каркаса обычно составляет не менее 80%, примерно не менее 85%, примерно не менее 90%, примерно не менее а 95% или примерно не менее 99% идентичности последовательности соответствующего каркаса в молекуле исходного антитела. Такая прививка может привести к снижению аффинности связывания по сравнению с исходным антителом. В этом случае каркас может быть подвергнут обратной мутации в исходный каркасный участок по некоторым положениями на основании определенных критериев, раскрытых вQueen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Дополнительные ссылки, описывающие методы,применимые при гуманизации мышиных антител, включают патенты США 4816397, 5225539 и 5693761,компьютерные программы ABMOD и Encad, как описано Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620, а также метод Winter and co-workers (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323327; and Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536. Идентификация остатков для возможной обратной мутации может быть осуществлена следующим образом: Если аминокислота попадает в следующую категорию, аминокислоту человеческой каркасной последовательности эмбриональной линии, которая используется ("акцепторный каркас"), заменяют аминокислотой каркаса исходной молекула антитела ("донорный каркас"):(а) аминокислота акцепторной каркасной области человека является необычной для этого положения в каркасном участке человека, в то время как соответствующая аминокислота в донорном иммуноглобулине является типичной для этого положения в каркасных областях человека;(б) аминокислота расположена непосредственно возле одного из участков CDR, или(в) любой атом боковой цепи аминокислоты каркасного участка находится в пределах примерно 5-6 ангстрем (от центра до центра) от любого атома аминокислоты CDR в трехмерной модели иммуноглобулина. Если каждая из аминокислот акцепторного каркасного участка человека и соответствующая аминокислота в донорном каркасном участке является обычно несвойственной для этого положения каркасного участка человека, такая аминокислота может быть заменена на аминокислоту, типичную для данного положения каркасной области человека. Такой критерий обратной мутации позволяет восстановить активность исходной молекулы антитела. Другой подход к получению модифицированных антител, имеющих функциональные свойства,аналогичные свойствам раскрытых в настоящей заявке молекул антител, включает случайные мутации аминокислот в привитых участках CDR без изменения каркаса и отбор полученных молекул по аффинности связывания и другим функциональным свойствам, которые эквивалентны или превосходят свойства исходных молекул антител. Одиночные мутации также могут быть введены в любом положении аминокислоты в пределах каждого CDR с последующей оценкой влияния таких мутаций на аффинность и другие функциональные свойства. Одиночные мутации, которые приводят к улучшению свойств, могут быть объединены с целью оценки их эффекта в сочетании друг с другом. Кроме того, возможно использование комбинации указанных подходов. После прививки CDR можно провести обратное мутирование конкретных каркасных участков в дополнение к введению аминокислотных замен в участки CDR. Данная методика описана Wu et al (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162. Применяя идеи настоящего изобретения, специалист в данной области может использовать обычные методики, например сайт-направленный мутагенез, для замены аминокислот в раскрытых в настоящей заявке участке CDR и последовательностях каркасного участка с получением дополнительных аминокислотных последовательностей вариабельной области, являющихся производными последовательностей в соответствии с настоящим изобретением. Все альтернативные встречающиеся в природе аминокислоты могут быть введены в конкретных положениях замен. Способы, раскрытые в настоящей заявке,могут быть использованы для скрининга указанных дополнительных аминокислотных последовательностей вариабельных областей с целью идентификации последовательностей, имеющих указанные функции in vitro. Таким способом могут быть идентифицированы дополнительные последовательности, пригодные для получения модифицированных человеческих антител и их антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением. В предпочтительном варианте аминокислотная замена в каркасном участке ограничивается одной, двумя или тремя положениями в любом одном или более из описанных здесь каркасных участков четырех легких и/или тяжелых цепей. В предпочтительном варианте аминокислотная замена в участке CDR ограничивается одной, двумя или тремя положениями в любом одном или более участков CDR из трех легких цепей и/или тяжелых цепей. Также возможно использование комбинации различных изменений в указанных каркасных участках и CDR-участках, описанных выше. Термин "лечение" (или "лечить" или "терапия") относится к процессам, включающим замедление,прерывание, купирование, контроль, остановку, уменьшение либо обращение прогрессирования или тяжести существующего симптома, расстройства, состояния или заболевания, но необязательно включает полное устранение всех относящихся к заболеванию симптомов, состояний или расстройств, связанных с антителами к бета-амилоидному пептиду N3pGlu. Антитела согласно настоящему изобретению можно применять в качестве лекарственных средств для лечения заболеваний человека, вводимых различными путями. В наиболее предпочтительном варианте указанные фармацевтические композиции предназначены для парентерального введения. Указан-6 023021 ные фармацевтические композиции могут быть получены способами, хорошо известными в данной области (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al.,Mack Publishing Co.), и включать раскрытое в настоящем изобретении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, а также фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Результаты представленных ниже количественных анализов показывают, что моноклональные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению можно применять в лечении состояния, вызванного активностью бета-амилоидного пептида, такого как болезнь Альцгеймера,синдром Дауна и ЦАА. Пример 1. Получение антител Исходная наработка антител: трансгенных мышей FVB иммунизируют усеченным с N-конца и пироглутамат-модифицированным -амилоидным пептидом 3-42 человека (N3pGlu), который предварительно инкубировали при температуре 37 С в течение 24 ч для образования агрегатов. Собирают клетки селезенки мышей и удаляют А 1-40-реактивные клетки при помощи технологии магнитной сортировкиMACS. Оставшиеся клетки сортируются по связыванию с агрегированным бета-амилоидным пептидомN3pGlu. Выделяют РНК из отобранных В-клеток, на основе которой затем синтезируют кДНК с использованием олиго dT. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела получают методом ПЦР с использованием праймеров сигнальной последовательности антитела, полученные в результате ПЦР продукты клонируют в фаговый вектор путем мутагенеза по Канкелю (Kunkel) с получением библиотекиFab-фрагментов. Проводят скрининг библиотеки Fab-фрагментов на связывание с агрегированным пептидомN3pGlu методом одноточечного твердофазного иммуноферментного анализа (SPE), а также на селективность и специфичность методом обратного скрининга против А 1-40. Положительные клоны исследуют путем секвенирования ДНК, экспрессиии Fab-фрагментов, а также анализом связывания с бета-амилоидным пептидомN3pGlu и отсутствия связывания с растворимым пептидом А 1-40 или А 1-42. Создают библиотеку клонов, содержащих точечные мутации, которые проверяют методом SPE на способность связываться с агрегированным бета-амилоидным пептидом N3pGlu, но не А 1-42. Полезные мутации объединяют в комбинаторную библиотеку. Отбирают комбинаторные варианты, оптимизированные по аффинности, которые затем конвертируются в мышиные IgG1 для измерения аффинности с помощью теста BIACORE и связывания с содержащими А бляшками иммуногистохимическими методами. Для проведения исследований эффективности in vivo из идентифицированного клона создают мАТ в двух изотипах мышиных IgG1 (mE8) и IgG2a (mE8c). mE8 не связывается с последовательностьюN3pGlu А мыши (mpE3-16) или A1-42 человека. Последовательности каркасных участков эмбриональной линии человека VH1-69/JH6 и Vk-A18/JK2 используют для начальной гуманизации. Участки CDR из mE8 антител (с четырьмя аффинными мутациями) прививают на каркасные участки антител человека с получением hE8-C6. Дальнейшую оптимизацию аффинности осуществляют на основе последовательности hE8-C6, при этом полезные мутации объединяют с получением гуманизированных вариантов R5, R17, R24 и 2420, обладающих более высокой аффинностью. Второй этап оптимизации с целью улучшения пригодности для дальнейшей разработки препарата: два гуманизированных варианта hE8-C6 и R17, которые служат в качестве основы для второго раунда оптимизации, были выбраны повышения времени полужизни антител в сыворотке за счет снижения неспецифического связывания с клетками и увеличения аффинности антител к растворимому бета - амилоидному пептиду N3pGlu. Синтезируют биотинилированный растворимый пептид, состоящий из четырнадцати N-концевых аминокислот бета - амилоидного пептида N3pGlu (pE3-16B), после этого проводится оценка его эквивалентности бета - амилоидному пептиду N3pGlu в отношении связывания с антителом mE8. Для последующего скрининга связывающей способности вариантов пептида рЕ 3-16 В разрабатывают и применяют высокопроизводительный количественный анализ активности -галактозидазы с помощью использование фильтра. Все соединения, отобранные в результате скрининга с фильтром верифицируют по связыванию с агрегированным бета - амилоидным пептидом N3pGlu. Библиотеки вариантов hE8-C6 подвергают повторному скринингу с помощью количественного анализа переноса на фильтр, что позволяет выявить ряд полезных мутаций. Часть из этих мутаций используют для создания комбинаторной библиотеки. Используя этот подход, выбраны четыре комбинированных варианта (CoII-E10, CoII-G2, CoII-G8 и CoII-Е 2). Для создания структурных моделей V-области hE8-C6, R17, R24 и других вариантов используют компьютерное моделирование. Анализ структурной модели выявляет положительные заряды, введенные для кластеризации мутаций, предназначенных для оптимизации аффинности в сайте связывания, которые являются потенциальной причиной неспецифического связывания антитела с клетками. На основании результатов моделирования отбирают несколько положений для последующего внесения изменений с целью балансировки поверхностного электростатического потенциала. Комбинаторную библиотеку получают путем объединения некоторых полезных мутаций из скрининговой библиотеки и изменений,идентифицированных с помощью структурного моделирования. С помощью этого действия для дальнейших исследований выбраны три варианта (R17m-В 4, R17m-A12 и R17m-B12). Анализ структурной модели также выявил стерическое столкновение между остатком Y36 каркасного участка легкой цепи и остатками CDR3 области тяжелой цепи. Мутацию Y36L вводят в легкую цепь hE8-C6 для получения варианта hE8L. Было установлено, что это одиночное изменение структуры каркасного участка оказывает значительное влияние как на увеличение аффинности антитела, так и снижение его неспецифического связывания с клетками. Другое предпринятое действие заключается в тестировании различных каркасных участков человека в отношении возможности гуманизации. Участки CDR антитела mE8 прививают в каркасные участкиVH5-51/VKO2 (Не 8-51O2), эквивалентен, или даже более эффективен, чем hE8-C6 в отношении связывания с бета - амилоидным пептидом N3pGlu. Введение дополнительных полезных мутаций в hE8-51O2 приводит к созданию комбинированных вариантов CI-A1, CI-B6, CI-C7 и CI-B8. После проведения всех количественных анализов in vitro, в том числе твердофазного ИФА и тестаBIACORE, для определения антигенной специфичности и аффинности, неспецифического связывания с клетками и иммуноцитохимического окрашивания, были отобраны пять вариантов моноклональных антител: B12L, CI-C7, hE8L, R17L и R17. Антитела могут быть получены и очищены до высокой степени чистоты следующим образом. Соответствующие клетки-хозяева, такие как HEK 293 EBNA или СНО, временно или стабильно трансфецируют системой экспрессии, обеспечивающей секрецию антител с использованием установленного оптимального векторного HC:LC в векторе либо одновекторной системой, кодирующий обе НС, например,SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 43 и LC, например SEQ ID NO: 55. Осветленная среда, в которую секретировано антитело, очищают с помощью любого из многочисленных часто используемых способов. Например, среду можно легко внести в колонку, заполненную сепарационной матрицей на основе белка А или G Sepharose FF, которая была уравновешена совместимым буфером, таким как фосфатный буферный раствор (рН 7,4). Колонку промывают, чтобы удалить неспецифически связывающиеся компоненты. Связанное антитело элюируют, например, градиентом рН (например, 0,1 M натрий-фосфатным буфером с рН 6,8 до рН 2,5, используя 0,1 M натрий цитратный буфер). Фракции антитела определяют, например,с помощью ДСН-ПААГ электрофореза, а затем объединяют. Дальнейшая очистка является необязательной и зависит от предполагаемого использования. Антитело может быть сконцентрировано и/или стерильно профильтровано с помощью обычных методов. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалить обычными методами, включая эксклюзионную хроматографию, гидрофобное взаимодействие, ионный обмен или хроматографию на гидроксиапатитном носителе. Чистота антитела после этапов хроматографической очистки составляет более 99%. Продукт может быть немедленно заморожен при температуре -70 С или может быть лиофилизирован. Аминокислотные последовательности указанных антител настоящего изобретения приведены ниже. Таблица 1. Номера последовательностей антител (SEQ ID NOs) Пример 2. Определение аффинности связывания с растворимым N3pGlu Измерение аффинности связывания бета-амилоидного пептида N3pGlu с антителами к N3pGlu осуществляют методом поверхностного плазменного резонанса с использованием системы BIACORE 2000. Если не указано иное, все реагенты и материалы получены из BIACORE AB (Упсала, Швеция). Все измерения проводят при 25 С. Образцы растворяют в буфере HBS-EP (150 мМ хлорида натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,005% (вес/об) ПАВ Р-20 и 10 мМ HEPES, рН 7,4). Серию A пептидов с позиционными изменениями (мутанты по глицину) синтезируются того чтобы оценить влияние данного остатка на связывание антитела и тем самым определить характеристики и последовательность, которая необходима для распознавания антитела: Важность усеченной (дес 1,2) и модифицированной формы глутаминовой кислоты (3 pyr-Е или 3pyr-Glu) оценивают путем сравнения связывания A 1-42 по сравнению с A 3-16 по сравнению с рЕ 3-16(SEQ ID NO: 1 по сравнению с SEQ ID NO: 26 по сравнению с SEQ ID NO: 25, соответственно). Пептиды растворяют в фосфатном буфере до концентрации 5 мг/мл перед разбавлением для проведения экспериментов по изучению связывания. Связывание оценивают с помощью нескольких аналитических циклов, включающих захват антитела, ввод/ассоциацию пептида, длительное промывание буфером для определения константы диссоциации, а также регенерацию поверхности. Для этапа захвата антитела, в зависимости от типа антитела, которое будет захватываться, на чипе СМ 5 иммобилизуют либо белок А или Fc-фрагмент козы к AT мыши. За исключением экспериментов с мышиными антителами, каждый цикл состоит из: ввода 5-7 мкл 10 мкг/мл анти-N3pGlu антитела со скоростью 5 мкл/мин (захват примерно 3000 резонансных единиц), ввода 100 мкл пептида со скоростью 50 мкл/мин (1000 нМ - 62,5 нМ, используя двукратные серийные разведения для каждого цикла), а затем 10 мин для диссоциации. Для мышиного антитела скорость потока составляет 50 мкл/мин, вводя 20 мкл мышиного антитела при скорости 50 мкг/мл. В обоих случаях поверхность чипа восстанавливают с использованием 20 мкл 10 мМ глицина гидрохлорида, рН 1,5. Константа аффинности (KD) затем рассчитывают на основании скоростей ассоциации и диссоциации для каждого цикла с использованием модели связывания в соотношении 1:1 при помощи программного обеспечения BIAevaluation. Анти-N3pGlu антитела B12L и R17L и исходное антитело мыши (mE8 С) специфично распознают N3pGlu A пептид с KD 1 нМ. Анти-N3pGlu антитела B12L и R17L и исходное мышиное антитело (mE8 С) также связываются с рЕ 3-16 с близкой аффинностью, что указывает на локализацию эпитопа в этой области пептидов. Анализ связывания антител с пептидами, мутантными по глицину, показывает, что критические для связывания остатки располагаются между 3 и 7: pyroE в положении 3, F в положении 4, R в положении 5, H в положении 6, D в положении 7. В отношении антител настоящего изобретения не установлено связывание с A1-40 выше предела обнаружения. Пример 3. Определение аффинности связывания с агрегированным N3pGlu Эксперименты с использованием BIACORE также проводят для мониторинга связывания антиN3pGlu антител с агрегированным бета-амилоидным пептидом N3pGlu. В этом эксперименте бетаамилоидный пептид N3pGlu иммобилизуют при различных значениях плотности в проточной кювете 2(низкая плотность, LD), 3 (средняя плотность, MD) и 4 (высокая плотность, HD) на СМ-5 чипе посредством химического связывания через аминогруппы. Различные концентрации бета-амилоидного пептидаN3pGlu иммобилизуют для оценки влияния поверхностной плотности на связывание анти-N3pGlu антител. При иммобилизации большая часть бета-амилоидного пептида N3pGlu агрегирует на поверхности, о чем свидетельствует отсутствие связывания контрольного моноклонального антитела, которое распознает только мономерный пептид. Эта агрегированная форма пептида имитирует свойства агрегированногоA пептида в фибриллярной или амилоидной форме, в которой N-концевая область пептидов экспонируется вовне и может служить мишенью для связывания с антителами. Связывание оценивают с помощью серии аналитических циклов при 25 С. Каждый цикл выполняют при скорости потока 50 мкл/мин, цикл состоит из следующих шагов: ввод 250 мкл раствора антиN3pGlu антитела (начиная с 500 нМ и далее с использованием двукратных серийных разведений для каждого цикла) с последующей инкубацией в течение 20 мин для диссоциации и регенерацией поверхности с использованием 30 мкл 10 мМ глицина гидрохлорида, рН 1,5. Скорость ассоциации и диссоциации для каждого цикла оценивают с помощью модели для гетерогенных лигандов с использованием программного обеспечения BIAevaluation. Поскольку модель связывания в соотношении 1:1 не соответствуют эмпирическим данным, гетерогенная модель дает в результате две величины константы аффинно-9 023021 сти (низкая и высокая аффинность). Антитела R17L и B12L, а также исходное мышиное антитело mE8 с,связываются с агрегированным бета - амилоидным пептидом N3pGlu с высокой аффинностью, при этомKD,1100 пМ, и более низкой аффинностью, когда KD,210 НМ. Максимальное связывание (Rmax) рассчитывалось как сумма Rmax при связывании с низкой и высокой аффинность Показано, что Rmax увеличивается с увеличением плотности пептида на поверхности, как и ожидалось при повышении числа сайтов связывания, доступных на поверхности при более высокой плотности. Исследования связывания показывают, что антитела согласно настоящему изобретению связываются с агрегированным бетаамилоидным пептидом N3pGlu. Пример 4. Исследования захвата мишени ex vivo Проводят иммуногистохимический анализ с экзогенно добавленными антителами к A, чтобы определить захват мишени ex vivo на фиксированных срезах мозга мышей линии PDAPP (24-месячных). Было показано, что у трансгенных мышей линии PDAPP развивается большая часть патологических симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера. Для мышиных антител в качестве метки был использован биотиновый тег, так как этот эксперимент был проведен на мышиных тканях, прямое сравнение между небиотинилированными не мышиными анти-N3pGlu антителами не применимо. БиотинилированноеN-концевое (1-5) антитело 3D6 интенсивно маркирует значительные количества отложений A пептида в гиппокампе мышей PDAPP, в то время как биотинилированное антитело тЕ 8 маркирует только часть отложений. В отличие от мозга пациентов с болезнью Альцгеймера, подавляющее большинство отложений A пептида в мозге мышей линии PDAPP содержит полноразмерный пептид. Подобная маркировка бляшек наблюдается и для небиотинилированных анти-N3pGlu антител, таких как B12L и R17L (по сравнению с тЕ 8). Специфическая маркировка бляшек не наблюдается для контрольных IgG мыши или человека. Поскольку состав и, вероятно, структура A пептида в отложениях резко отличается в пораженном болезнью Альцгеймера мозге, небиотинилированные анти-N3pGlu (3 мкг/мл) антитела исследуются для того, чтобы определить связываются ли они с отложениями A пептида на свежезамороженных срезах мозга, пораженного болезнью Альцгеймера. Антитела для положительного контроля (биотинилированные антитела 3D6) интенсивно маркируют большое количество A бляшяк в мозгу, страдающих болезнью Альцгеймера, в то время как антитела для отрицательного контроля (IgG мыши и человека) демонстрируют отсутствие какого-либо обнаруживаемого связывания. Некоторые из небиотинилированных анти-N3pGlu антител, такие как B12L и R17L, связываются аналогичным образом с отложениями A пептида. Эти гистологические исследования показывают, что анти-N3pGlu антитела согласно настоящему изобретению могут захватывать мишени, т.е. отложения A пептида, ex vivo. Пример 5. Исследования захвата мишени in vitro В этих экспериментах измеряют способность анти-N3pGlu антител захватывать мишень - отложения пептида - in vitro. Субхроническое 4-недельное исследование проводят с использованием биотинилированных мышиных антител 3D6 и mE8 с в дозе 40 мг/кг, которые вводили внутрибрюшинно (IP) раз в неделю. В конце эксперимента извлекают мозг и определяют уровень захвата целевой мишени в гистологическом исследовании головного мозга. У животных, которым вводили биотинилированные антитела 3D6, маркировку бляшек наблюдаели только вдоль гиппокампальной борозды, в то время как у мышей,которым вводили биотинилированные антитела mE8 с, наблюдается сильное окрашивание гиппокампа и коры головного мозга. Очень похожие паттерны захвата целевых мишеней наблюдаются в более остром 3-дневном анализе (окрашивание гиппокампальной борозды антителами 3D6 и окрашивание антителамиmE8 гиппокампа и коры головного мозга). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что антитела 3D6, которые связываются как с растворимой, так и с нерастворимой формой A, насыщаются растворимой формой A и, следовательно, не в состоянии захватывать желаемые целевые отложения пептида. В противоположность этому, анти-N3pGlu антитела мыши mE8c неизменно связываются с намеченной мишенью в обеих важных областях мозга. Высокие и низкие дозы анти-N3pGlu антител R17L и B12L оценивают в аналогичном 3-дневном исследовании in vivo. Антитела вводят в/б в концентрации 10 мг/кг (низкие дозы) или 40 мг/кг (высокие дозы). В конце исследования собирают образцы плазмы и мозга и определяют параметры ФК в плазме. Готовят образцы срезов мозга и проводят иммуногистохимическое окрашивание на симметричных срезах полушарий с использованием анти-человеческих антител (для выявления связанных анти-N3pGlu антител) и 3D6 (для определения общего количества осажденного целевого пептида в срезе). Для того чтобы лучше оценить уровень связывания целевого пептидаin vivo процент площади связывания анти-N3pGlu антител нормирует по отношению к % общей площади возможной мишени (общая площадь отложений бета-амилоидного пептида, визуализированная иммуногистохимическим выявлением экзогенных антител 3D6). Кроме того, общий процент захвата целевого пептида нормирует по отношению к фармакокинетическим параметрам (РК) плазмы для каждой отдельной мыши, так как в конце исследования обнаруживаются значительные значения воздействия. Установлено, что как R17L, так и B12L анти-N3pGlu антитела связываются с отложившимися бляшками и при этом паттерн распределения окрашивания сходен с тем, который наблюдали для мышиных анти-N3pGlu антител (mE8). Эти результаты показывают, что при периферическом введении R17L и B12L антиN3pGlu антитела могут пересекать гематоэнцефалический барьер и захватывать желаемые мишени - от- 10023021 ложения бета-амилоидного пептида, тогда как антитело, которое связывается как с растворимой, так и с нерастворимой формой A, насыщается растворимой формой и не способно захватывать целевое отложение пептида. Пример 6. Исследования терапевтического снижения числа бляшек Исследование терапевтического снижения числа бляшек на 23-месячных мышах PDAPP осуществляют с использованием следующих антител: антитела отрицательного контроля (IgG2a), 3D6, МЕ 8(IgG1) и mE8c (IgG2a). Старым мышам линии PDAPP вводят каждое антитело подкожно в дозе 12,5 мг/кг раз в неделю в течение трех месяцев. Группу мышей вскрывают в начале исследования (нулевое время) для определения начальной нагрузки бляшек в 23-месячном возрасте. В конце исследования собирают образцы плазмы и мозга, готовят образцы мозга для биохимических и гистологических исследований для определения клинических результатов (одно полушарие каждого мозга). Гиппокамп и кору головного мозга гомогенизируют в 5 M гуанидине, содержание A измеряют путем электрофореза в геле с подкисленной мочевиной с последующим анализом методом вестерн-блот. Анализ гуанидиновых лизатов гиппокампа у 23-месячных мышей в нулевой момент времени и когорт, получавших антитела для отрицательного контроля (26-месячные мыши), показывает недостоверное увеличение отложенного А 1-42,тем самым подтверждая, что мозг мышей линии PDAPP находятся на уровне плато. Как и в предыдущих исследованиях на старых мышах линии PDAPP обработка антителами сравнения 3D6 не оказывает влияния на снижение числа бляшек. Обработка антителами N3pGlu, mE8 или mE8c приводит к значительному снижению числа бляшек по сравнению с IgG2a, антителами для отрицательным контроля (р 0,01 и р 0,001, соответственно) (табл. 2). mE8 и mE8 с снижают содержание А 1-42 в гиппокампе на 38 и 53%, соответственно. анти-N3pGlu антитела mE8 с, обладающие максимальной эффекторной функцией,демонстрируют тенденцию к большей эффективности, чем обладающие минимальной эффекторной функцией антитела mE8 (по сравнению с контролем), однако это различие не достигло статистической значимости. Кроме того, антитело mE8 с вызывало достоверное снижение на 30% содержания А 1-42 в гиппокампе по сравнению с этим показателем у мышей в нулевой момент времени (t-тест, р 0,0066), что свидетельствует об устранении ранее отложившихся бляшек. Анализы гуанидиновых лизатов коры дают очень похожие результаты, за исключением того, что только антитела mE8 с с максимальной эффекторной функцией достоверно уменьшают A1-42 отложения. Эти результаты показывают, что длительная терапия антителами к N3pGlu из настоящего примера достоверно уменьшает отложение бляшек у старых мышей PDAPP, причем это действие зависит от эффекторной функции антител. Кроме того, эти результаты подтверждают гипотезу о том, что плохое связывание мишеней для антител против А, которые связываются как с растворимой, так и нерастворимой формой А (в отличие от старения), является фактором, обуславливающим их недостаточную эффективность при применении в терапевтических подходах. Таблица 2. Уменьшение бляшек в гиппокампе и коре головного мозга (нг A1-42/мг живого веса) Пример 7. Анализ микрокровоизлияний у старых мышей линии PDAPP Проводят гистологическое исследование чтобы исследовать вопрос о том, вызовет ли механизм действия антител к N3pGlu, который приводит к пониженному уменьшению бляшек у старых мышейPDAPP, обострение ЦАА-связанных микрокровоизлияний. Предыдущие исследования показали, что лечение пожилых трансгенных мышей АРР некоторыми анти-A антителами, распознающими N- и Сконцевые аминокислоты, приведет к увеличению ЦАА-связанных микрокровоизлияний (Pfeifer et al. 2002; Wilcock et al. 2004; Racke et al. 2005). Хотя механизм, лежащий в основе этого потенциально нежелательного явления, остается неясным, были предложены две не исключающих друг друга гипотезы: перераспределение A в сосуды мозга (Wilcock et al. 2004) или прямое связывание антител с существующим ЦАА (Racke et al. 2005). Биохимические и гистологические анализы показывают, что Ар 3-x является составной частью ЦАА как у пациентов с болезнью Альцгеймера, так и у старых мышей PDAPP. Тщательный гистологический анализ для обнаружения микрокровоизлияний у старых мышей PDAPP(23-26-месячного возраста), которые подвергались терапевтической обработке анти-N3pGlu и контрольными антителами, проводится в течение трех месяцев с подкожным введением 12,5 мг/кг антител еженедельно. Положительным контролем для анализа микрокровоизлияний являются животные, которым хронически вводили 3D6, поскольку ранее на этих мышах было показано, что указанное N-концевое антитело к бета -амилоиду существенно усиливает микрокровоизлияния (Racke et al. 2005). В конце исследования одно полушарие мозга от каждого животного опускали для фиксации в 4% формальдегид и помещали в парафин. Коронарные срезы ткани толщиной в 2 мм нарезали на 50 срезов (четыре 10 мкм слоя на срез). Одиннадцать срезов с равными интервалами по толщине ткани в 2 мм окрашивают Perls Blue для того, чтобы визуализировать гемосидерин (клеточное накопление железа из-за микрокровоизлияний). Подсчет проводят слепым методом вручную в двух слоях на один срез. Хроническая обработка старых мышей PDAPP антителами 3D6 (положительный контроль) значительно усиливает микрокровоизлияния(р 0,001). Важно отметить, что, как показано, обработка mE8 (IgG1) или mE8 с (IgG2a) не усиливает микрокровоизлияния, даже в том случае, когда данные анти-N3pGlu антитела значительно уменьшают отложения A у животных. Эти результаты показывают, что анти-N3pGlu антитела из настоящего примера не усугубляют ЦАА-связанные микрокровоизлияния у старых мышей PDAPP.