Слитый белок против злокачественных новообразований

СЛИТЫЙ БЕЛОК ПРОТИВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ Печиколан Ежи Щепан, Павлак Себастьян Доминик, Жерек Бартломей Мацей, Лемке Кшиштоф Казимеж (PL) Медведев В.Н. (RU) Слитый белок, в особенности рекомбинантный, содержащий домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент последовательности растворимого белка hTRAIL,начинающийся с аминокислоты в положении ниже чем hTRAIL95, или последовательности,имеющей по меньшей мере 70% гомологичность этому; и домен (b), который представляет собой последовательность проапоптотического эффекторного пептида, где данная последовательность домена (b) присоединена к С-концу или N-концу домена (а). Данный слитый белок обладает противоопухолевой активностью. Нуклеотидная последовательность, кодирующая данный слитый белок, вектор экспрессии и клетка-хозяин для получения данного слитого белка, и применение данного слитого белка для лечения онкологических заболеваний. Настоящее изобретение относится к области терапевтических слитых белков, в частности рекомбинантных слитых белков. Конкретнее, настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим фрагмент последовательности растворимого белка TRAIL человека в сочетании с последовательностью короткого проапоптотического пептида, к фармацевтическим композициям, содержащим их, к их применению в терапии, в частности, в качестве средств против злокачественных новообразований и к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим слитые белки, к векторам экспрессии, содержащим полинуклеотидные последовательности, и к клеткам-хозяевам, содержащим эти векторы экспрессии. Апоптоз (программируемая клеточная гибель) представляет собой процесс, который играет важную роль в профилактике злокачественных новообразований и в лечении злокачественных новообразований в результате применения средств, которые индуцируют апоптоз атипичных опухолевых клеток. Инициация апоптоза может происходить вне клетки (внешний или сигнальный путь рецептора смерти) и внутри клетки (внутренний или митохондриальный путь). Для активации внеклеточных путей апоптоза в опухолевых клетках человека требуется, чтобы лиганд связался с рецепторами клеточной гибели для активации рецепторов. После связывания лиганда активированные рецепторы индуцируют сигналы апоптоза. Запуск внутреннего апоптоза внутри клетки по митохондриальному пути может быть инициирован на различных уровнях апоптотического каскада для того, чтобы в результате вызвать индукцию или восстановление функций проапоптогенных белков (цитохром С, SmacDiablo, AIF, р 53, белки семейства Bcl2, в том числе семейство домена ВН 3), деградацию нуклеиновых кислот или активацию каспаз. Белок TRAIL, принадлежащий семейству цитокинов (относящийся к фактору некроза опухоли лиганд, индуцирующий апоптоз; Tumour Necrosis Factor-Related Apoptosis Inducing Ligand), также известный как Apo2L (Аро 2-лиганд), представляет собой белок-активатор апоптоза в опухолевых клетках и в клетках, инфицированных вирусами. TRAIL представляет собой естественный для организма лиганд. Белок TRAIL, его аминокислотная последовательность, кодирующие ДНК последовательности и системы экспрессии белка были впервые описаны в ЕР 0835305 А 1. Белок TRAIL оказывает свою активность против злокачественных новообразований, связывая проапоптотические поверхностные рецепторы 1 и 2 TRAIL (TRAIL-R1/R2) и затем активируя эти рецепторы. Эти рецепторы, также известные как DR4 и DR5 (рецептор смерти 4 и рецептор смерти 5), принадлежат семейству рецепторов TNF и сверхэкспрессируются различными типами опухолевых клеток. Активация этих рецепторов может индуцировать внешний путь апоптоза, независимый от гена-супрессора р 53, что посредством активированной каспазы-8 приводит к активации исполнительных каспаз и тем самым - к деградации нуклеиновых кислот. Каспаза-8, высвобожденная после активации TRAIL, также может быть причиной высвобождения белка Bid и, вследствие этого, непрямой активации митохондриального пути, белок Bid, который перемещается в митохондрии, где стимулирует высвобождение цитохрома С, таким образом, косвенно усиливает апоптотический сигнал рецепторов смерти.TRAIL действует выборочно в опухолевых клетках, преимущественно не вызывая индукции апоптоза здоровых клеток, которые являются резистентными к этому белку. По этой причине, из-за своего огромного потенциала, TRAIL был признан средством против злокачественных новообразований, действующим на широкий спектр различных типов опухолевых клеток, в том числе, гематологических злокачественных новообразований и солидных опухолей, и в то же время не затрагивающим нормальные клетки и вызывающим относительно небольшое количество побочных эффектов. Белок TRAIL представляет собой мембранный белок II типа длиной 281 аминокислот, и его внеклеточная область, содержащая аминокислотные остатки 114-281, после расщепления протеазами образует растворимую молекулу sTRAIL размером 20 кДа, которая тоже является биологически активной. Обе формы, TRAIL и sTRAIL, способны индуцировать апоптоз в результате взаимодействия с рецепторамиTRAIL, присутствующими в клетках-мишенях. Сильная противоопухолевая активность и очень низкая системная токсичность растворимой части молекулы TRAIL были продемонстрированы в результате использования тестовых клеточных линий. Также проведенные на людях клинические испытания рекомбинантного растворимого TRAIL человека (rhTRAIL), имеющего аминокислотную последовательность,соответствующую аминокислотам 114-281 молекулы hTRAIL, известного под международным непатентованным названием Дуланермин (dulanermin), показали его хорошую переносимость и отсутствие дозолимитирующей токсичности. Недавние исследования показали, что белок TRAIL может иметь более короткую форму, чем аминокислоты 114-281, и что в такой форме он способен связываться с мембранными рецепторами семейства DR (рецепторы смерти, DR1, DR2, DcR1, DcR2 и OPG) и индуцировать апоптоз через эти рецепторы(F. Fang, A. Wang, S.F. Yang, Antitumor activity of a novel recombinant mutant human tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand, Acta Pharmacologica Sinica 2005 Nov; 26 (11): 1373-1381). Подтвержденные в настоящее время токсические эффекты рекомбинантного белка TRAIL на клетки печени, по-видимому, связаны с наличием модификации, а именно полигистидиновых меток, немеченный TRAIL не проявляет системную токсичность. Тем не менее, в ходе дальнейших научных исследований и разработок оказалось, что многие опухолевые клетки также демонстрируют первичную или приобретенную устойчивость к TRAIL (см., на-1 023005 пример, WO 2007/022214). Несмотря на то что механизм устойчивости к TRAIL до конца неясен, считается, что она может проявляться на различных уровнях пути апоптоза, индуцированного TRAIL, начиная от уровня рецепторов на клеточной поверхности до исполнительных каспаз в пределах сигнального пути. Эта устойчивость ограничивает применимость TRAIL в качестве противоопухолевого средства. Более того, в клинических испытаниях на пациентах фактическая эффективность монотерапии с помощью TRAIL оказалась низкой. Для того чтобы преодолеть эту низкую эффективность и невосприимчивость опухолей к TRAIL, были разработаны различные комбинированные методы терапии с радиои химиотерапевтическими средствами, что в результате привело к синергическому апоптотическому эффекту (WO 2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348;(2010), p. 1527-1533). Применение rhTRAIL в лечении злокачественных новообразований в сочетании с отобранными стандартными химиотерапевтическими средствами (паклитаксел, карбоплатин) и моноклональными анти-VEGF антителами описано в WO 2009/140469. Тем не менее, такое сочетание обязательно включает хорошо известные недостатки стандартной химиотерапии или радиотерапии. Сконструированный слитый белок, содержащий последовательности вазостатина, ингибитора ангиогенеза, и TRAIL, соединенные с линкером участка расщепления металлопротеазы, был описан как проявляющий апоптоз-индуцирующее действие в опухолевых клетках (A.I. Guo et al. в Chinese Journal ofBiochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-930). Сконструированный слитый белок, содержащий последовательности Tumstatin183-230 тумстатина,ингибитора ангиогенеза, и TRAIL114-281, был описан как демонстрирующий индукцию апоптоза в опухолевых клетках поджелудочной железы (N. Ren et al. в Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28(5), 676-478). В US 2005/244370 и соответствующей WO 2004/035794 описана конструкция TRAIL95-281 в виде эффекторного домена, связанного пептидным линкером с внеклеточной областью другого представителя семейства лигандов TNF CD40 в качестве связывающего домена клеточной поверхности. Заявлено, что активация этой конструкции происходит посредством связывания ее CD40 области. Более того, проблемой, связанной с терапией TRAIL, оказалась его низкая стабильность и быстрое выведение из организма после применения. Несмотря на то что в настоящее время доступны многие клинические способы лечения злокачественных новообразований, они зачастую являются в недостаточной степени эффективными и имеют большое число хорошо известных недостатков, из которых наиболее опасными и ограничивающими лечение являются отсутствие селективности относительно опухолевых клеток, тяжелые побочные эффекты и невосприимчивость - первичная или приобретенная во время лечения. В настоящее время известно ограниченное количество средств против злокачественных новообразований, которые как эффективны, так и селективны в отношении опухолевых клеток. В связи с этим сохраняется огромная актуальная и неудовлетворенная потребность в новых средствах против злокачественных новообразований, которые позволят не только расширить спектр доступных средств, но и найти средства, которые являются более эффективными (цитотоксичными) и селективными. Также существует потребность в новых селективных средствах с повышенной стабильностью и улучшенной фармокинетикой. Настоящее изобретение предлагает решение этой проблемы и относится к новым слитым белкам,которые содержат домен, полученный из TRAIL, и домен короткого эффекторного пептида, не включающий фрагменты TRAIL, обладающие внутренней (внутриклеточной) или внешней (внеклеточной) проапоптотической активностью, который усиливает или дополняет действие TRAIL. Более того, выяснилось, что во многих случаях слитые белки по настоящему изобретению проявляют более высокую активность, чем растворимый TRAIL и его варианты, в том числе фрагмент этой последовательности, и во многих случаях также преодолевают невосприимчивость к TRAIL. Более того, добавление эффекторного пептида приводит в результате к пролонгированному времени полужизни и увеличенному удержанию белка в опухоли, и, наконец, к повышению его эффективности. Описание чертежей Настоящее изобретение ниже описано более подробно со ссылкой на фигуры чертежей. На фиг. 1 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 1, 2, 3, 4 и 5. На фиг. 2 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 6, 7, 8, 9 и 10. На фиг. 3 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 11, 12, 13, 14 и 15. На фиг. 4 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 16, 17, 18, 19 и 20. На фиг. 5 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 21, 22, и 23, а также сравнительных слитых белков из примеров 24, 25 и 26. На фиг. 6 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 27, 28, 29, 30 и 31. На фиг. 7 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 32, 33, 34, 35 и 36. На фиг. 8 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 37, 38, 39, 40 и 41. На фиг. 9 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 42, 43, 44, 45 и 46. На фиг. 10 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 47, 48, 49, 50 и 51. На фиг. 11 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 52, 53, 54 и 55. На фиг. 12 изображены изменения объема опухоли во времени у мышей SCID/NOD, страдающих раком прямой кишки Colo205, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, по сравнению с hTRAIL114-281. На фиг. 13 представлены значения ингибирования роста опухоли у мышей, страдающих раком прямой кишки Colo205, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, на 29 день эксперимента, по сравнению с hTRAIL114-281. На фиг. 14 изображены изменения объема опухоли во времени у мышей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, страдающих раком легких человека NCI-H460, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, по сравнению с hTRAIL114-281. На фиг. 15 представлены значения ингибирования роста опухоли у мышей, страдающих раком легких человека NCI-H460, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, на 29 день эксперимента, по сравнению с hTRAIL114-281. На фиг. 16 изображены изменения объема опухоли во времени у мышей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, страдающих мелкоклеточным раком легких человека А 549, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, по сравнению с hTRAIL114-281. На фиг. 17 представлены значения ингибирования роста опухоли у мышей, страдающих мелкоклеточным раком легких человека А 549, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, на 34 день эксперимента, по сравнению с hTRAIL114-281. На фиг. 18 изображены изменения объема опухоли во времени у мышей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, страдающих карциномой поджелудочной железы человека, эпителиоподобная клеточная линия PANC-1, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, по сравнению с hTRAIL114-281. На фиг. 19 представлены значения ингибирования роста опухоли у мышей, страдающих карциномой поджелудочной железы человека, эпителиоподобная клеточная линия PANC-1, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, на 43 день эксперимента, по сравнению с hTRAIL114281. На фиг. 20 представлены спектральные характеристики слитых белков по примерам 1, 2, 14, 24, 51 и 42 и для rhTRAIL14-281, выраженные в удельной эллиптичности. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент последовательности растворимого белка hTRAIL, где фрагмент начинается с аминокислоты в положении не ниже чем hTRAIL95, или последовательности, которая по меньшей мере гомологична на 70% ей, и домен (b), который представляет собой последовательность проапоптотического эффекторного пептида, который осуществляет свое проапоптотическое действие через внутренний путь апоптоза, где последовательность домена (b) присоединена к С-концу и/или N-концу домена (а). Термин "функциональный растворимый фрагмент последовательности растворимого hTRAIL" следует понимать как обозначающий любой фрагмент растворимого hTRAIL, который способен индуцировать апоптотический сигнал. Также специалист должен оценить, что существование 70% гомологии белка TRAIL известно в данной области. Под термином "пептид" согласно настоящему изобретению следует понимать молекулу, сформированную из множества аминокислот, связанных друг с другом посредством пептидной связи. Таким образом, термин "пептид" в соответствии с настоящим изобретением включает олигонуклеотиды, полипептиды и белки. Следует понимать, что домен (b) эффекторного пептида в слитом белке по настоящему изобретению не является ни белком hTRAIL, ни частью белка hTRAIL. В настоящем изобретении аминокислотные последовательности пептидов будут представлены в общеупотребительном виде, принятом в данной области, в направлении от N-конца (N-конец) пептида к его С-концу (С-конец). Таким образом, любая последовательность имеет свой N-конец слева, а С-конец справа. Слитый белок по настоящему изобретению может содержать единственный домен (b) эффекторного пептида, присоединенный к С-концу или N-концу домена (а). Слитый белок по настоящему изобретению также может содержать два домена (b) эффекторного пептида, в этом случае один из доменов (b) присоединен к С-концу домена (а), а второй присоединен кN-концу домена (а). В случае, когда слитый белок по настоящему изобретению содержит два домена (b) этого эффекторного пептида, то эти домены могут быть одинаковыми или разными. Предпочтительно в этом случае,чтобы домены (b) были разными. В конкретном варианте осуществления домен (а) представляет собой фрагмент последовательностиhTRAIL, начинающийся с аминокислоты в диапазоне от hTRAIL114 до hTRAIL121 включительно и заканчивающийся на аминокислоте hTRAIL281, или другие функциональные фрагменты последовательности hTRAIL, опубликованной в базе данных GenBank под входящимР 50591. В частности, домен (а) может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей, соответствующих hTRAIL114-281 (SEQ ID NO:27), hTRAIL119-281 (SEQ ID NO:28) и hTRAIL121-281 (SEQ IDNO:29), hTRAIL116-281 и hTRAIL120-281. В другом варианте осуществления домен (а) может представлять собой последовательностьhTRAIL95-281. Проапоптотический эффекторный пептид домена (b), который проявляет свою апоптотическую активность через внутренний апоптотический путь (внутриклеточно), может индуцировать апоптоз напрямую посредством активации компонентов сигнального каскада митохондриального пути апоптоза или через непосредственную индукцию митохондриального апоптоза в клетках. В одном из вариантов осуществления слитого белка по настоящему изобретению этот эффекторный пептид представляет собой пептид, действующий через внутренний апоптотический путь, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQNO:163, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:165 и SEQ ID NO:166. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:30 из вышеприведенной группы представляет собой пептид, полученный из домена ВН 3 белка Вах, который ингибирует антиапоптотические факторы, и, в частности, 16-аминокислотный пептид, представленный последовательностьюKKLSECLKRI GDELDS (SEQ ID NO:30). Считается, что пептиды, основанные на последовательностях доменов ВН 2 белка Вах, способны эффективно связывать антиапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-XL. Антиапоптотическая активность белков Bcl-2 и Bcl-XL основана на их взаимодействии с доменами ВН 3, присутствующими в факторах, ответственных за инициацию апоптоза (Вах, Bak, Bad). Связывание домена ВН 3 в результате приводит к предотвращению взаимодействия белков Bcl-2 и Bel-XL с их природными лигандами и ингибированию их активности, и тем самым вносит вклад в инициацию активации апоптоза. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:31 из вышеприведенной группы представляет собой 15-аминокислотный пептид, содержащий домен ВН 3 белка Bid, представленный последовательностьюRNIARHLAQV GDSMD (SEQ ID NO:31). Белок Bid принадлежит к семейству Bcl-2 и отвечает, в числе прочего, за активацию проапоптотического фактора Вах. Полагают, что этот 16-аминокислотный пептид, содержащий домен ВН 3 белка Bid,встроенный в слитый белок по настоящему изобретению, будет эффективно индуцировать апоптоз. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:32 из вышеприведенной группы представляет собой пептидный гомолог рибонуклеазы A (RNase A), представленный последовательностью:VPVHFDASV (SEQ ID NO:32). Рибонуклеазы представляют собой малые белки с потенциальными противоопухолевыми свойствами, которые после связывания с отрицательно заряженными клеточными мембранами входят в клетку посредством эндоцитоза и затем протекают в цитозоль, где они действуют как ферменты, вызывая деградацию РНК. Начиная с концентрации 10 нМ, они блокируют клеточный цикл и вызывают апоптоз. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:33 из вышеприведенной группы представляет собой молекулу цитохрома С, представленную последовательностьюGDVEK GKKIFIMKCS QCHTVEKGGK HKTGPNLHGL FGRKTGQAPG YSYTAANKNK GIIWGEDTLM EYLENPKKYI PGTKMIFVGI KKKEERADLI AYLKKATNE (SEQ ID NO:33). Высвобождение цитохрома С из митохондрии в цитоплазму является одним из главных сигналов,индуцирующих апоптоз через так называемый митохондриальный путь. Этот белок является частью апоптосомного комплекса, который активирует каспазу 9. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:34 из вышеприведенной группы представляет собой гранзим В, представленный последовательностьюTCSVAGWGQT APLGKHSHTL QEVKMTVQED RKCESDLRHY YDSTIELCVG DPEIKKTSFK GDSGGPLVCN KVAQGIVSYG RNNGMPPRAC TKVSSFVHWI KKTMKRY (SEQ ID NO:34). Гранзимы, также называемые в литературе фрагментины, представляют собой сериновые протеазы,характерные для клеточной зернистости Тс-лимфоцитов и NK-клеток. В настоящее время у человека идентифицированы 5 различных гранзимов: А, В, Н, K (триптаза) и M (метиониназа). Исследования подтвердили, что эти ферменты представляют собой элементы цитотоксической реакции, проявляемой лимфоцитами против клеток-мишеней. Было показано, что эти ферменты активируют перфорин - белок, образующий поры в клеточных мембранах и тем самым опосредующий цитотоксическую реакцию. Более того, полагают, что эти ферменты напрямую вовлечены в индукцию апоптоза в клетках-мишенях. Гранзим В активирует отобранные прокаспазы в их активные формы (например, каспаза 3) и так же высвобождает посредством протеолиза активную форму белка Bid (белок, принадлежащий к семейству белкаBcl-2), который инициирует внутриклеточный путь апоптоза путем инкорпорирования в митохондриальные мембраны и образования пор в мембранах, с последующим высвобождением факторов, индуцирующих апоптоз (цитохром С, каспаза 9, Apaf). Связываясь с гистонами, гранзим В также может принимать участие в разрыхлении структуры хроматина, что приводит к его разрыхлению и повышенному доступу к ДНК для эндонуклеаз. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:35 из вышеприведенной группы представляет собой фрагмент белка Nur77, представленный последовательностьюFSRSLHSLL (SEQ ID NO:35). Ядерный рецептор Nur77 представляет собой очень сильный индуктор апоптоза. Один из механизмов его действия заключается в способности связываться с белком Bcl-2, важным противоапоптотическим фактором. Это взаимодействие вызывает конформационные изменения в структуре Bcl-2, что превращает его в индуктор апоптоза. Фрагмент, представленный выше, является 9-аминокислотным участком последовательности Nur77, распознаваемым как отвечающий за связывание и превращение Bcl-2 и индукцию апоптоза в клетках (Kolluri et al., Cancer Cell 14: 285-298, 2008). Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:36 из вышеприведенной группы представляет собой 15-аминокислотный пептид, содержащий домен ВН 3 белка Bak, представленный последовательностьюGQVGRQLAII GDDIN (SEQ ID NO:36). Полагают, что этот короткий пептид, инкорпорированный в слитый белок по настоящему изобретению, будет эффективно индуцировать апоптотический сигнал. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:37 из вышеприведенной группы представляет собой домен ВН 3 белка PUMA/BBC3, представленный последовательностьюPUMA/BBC3 (р 53 активированный модулятор апоптоза/Bcl-2-связывающий компонент 3) является представителем семейства белков Bcl-2 (подсемейство исключительно ВН 3). Он опосредует апоптоз как зависимо, так и независимо от р 53. Непосредственное взаимодействие PUMA/BBC3 со всеми известными белками-предшественниками выживаемости Bcl-2 вызывает их инактивацию, митохондриальную дисфункцию и, следовательно, активацию каспаз и клеточную гибель. PUMA также влияет косвенно на восстановление проапоптотической активности молекул, таких как Bak и Вах. Домен ВН 3 является ответственным за связывание PUMA с белками-предшественниками выживаемости. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:38 из вышеприведенной группы представляет собой белок PUMA/BBC3, представленный последовательностью(SEQ ID NO:38). Полагают, что и белок PUMA/BBC3, и его домен ВН 3, когда встроены в слитый белок по настоящему изобретению, будут эффективно индуцировать апоптотический сигнал. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:39 из вышеприведенной группы представляет собой 8-аминокислотный фрагмент белка SMAC/Diablo, представленный последовательностьюSMAC/DIABLO (второй митохондриального происхождения активатор каспазы/напрямую связывающий белок IAP, с низким IP) представляет собой активатор каспаз, высвобожденный из митохондрий. Его N-концевой мотив конкурентно связывается с белками IAP, предотвращая их домены BIR 2 и BIR 3 от инактивации каспаз. Полагают, что короткий пептид, который встроен в слитый белок по настоящему изобретению, будет эффективно индуцировать апоптотический сигнал. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:40 из вышеприведенной группы представляет собой буфорин IIb, представленный последовательностьюRAGLQFPVGR LLRRLLRRLL (SEQ ID NO:40). Буфорин IIb представляет собой пептид, полученный из гистона Н 2 А, который способен к независимой пенетрации в клеточную мембрану и имеет антибактериальные свойства (Park et al., BiochemBiophys. Res. Commun., 244: 253-257, 1998). Исследования возможности его применения в качестве средства против злокачественных новообразований показали, что он способен выборочно связываться с многочисленными опухолевыми клетками, проникать в клетки и накапливаться в ядрах, индуцируя апоптоз через митохондриальный путь (Lee et al., Cancer Letters, 271: 47-55, 2008). Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:41 из вышеприведенной группы представляет собой пептид онконазу, представленный последовательностьюQDWLT FQKKHITNTR DVDCDNIMST NLFHCKDKNT FIYSRPEPVK AICKGIIASK NVLTTSEFYL SDCNVTSRPC KYKLKKSTNK FCVTCENQAP VHFVGVGSC (SEQ ID NO:41). Онконаза, или Р-30, представляет собой белок, изначально полученный из лизатов яйцеклеток лягушки Rana pipiens. Это одноцепочечный белок с массой 12 кДа, структурный гомолог RNase А. Исследование этого белка показало, что он обладает исключительной цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток (Y. Wu, S.M. Mikulski, W. Ardelt, S.M. Rybak and R.J. Youle, The Journal of Biological Chemistry 268, 10686-10693). Исследование механизма действия онконазы показало, что после процесса интернализации она входит в клетку, где осуществляется процесс деградации 28S и 18S рибосомальной рРНК, что приводит к ингибированию синтеза белка и клеточной гибели. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:42 из вышеприведенной группы представляет собой 20-аминокислотный N-концевой фрагмент белка p14ARF, который является ингибитором белка-предшественника выживаемости Mdm2, представленный последовательностьюP14ARF представляет собой белок, регулирующий активность белка Mdm2, который связывается с супрессором опухоли р 53 и несет ответственность за его деградацию и, вследствие этого, вероятность выживания трансформированных клеток. Белок P14ARF, связываясь с Mdm2, предотвращает его взаимодействие с р 53. Сообщалось, что короткий пептид, полученный из p14ARF, достаточен для блокирования взаимодействия между Mdm2 и р 53 и предотвращения деградации второго (Midgley et al., Oncogene 19: 2312-2323, 2000). Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:43 из вышеприведенной группы представляет собой 11-аминокислотный пептид, связывающийся с Mdm2, представленный последовательностьюPRFMDTWEGL N (SEQ ID NO:43). Вышеприведенный пептид демонстрирует гомологичность последовательности с последовательностью р 53 и значительную эффективность ингибирования взаимодействий Mdm2-p53 (Bottger et al., Oncogene 13: 2141-2147, 1996), таким образом, предотвращая деградацию р 53. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:44 из вышеприведенной группы представляет собой 17-аминокислотный фрагмент пептида луназин, представленный последовательностьюCEKHIMEKIQ GRGDDDD (SEQ ID NO:44). Луназин представляет собой 43-аминокислотный пептид, полученный из соевых бобов (Glycinemax), с доказанным потенциалом против злокачественных новообразований. Общий механизм действия этой молекулы включает ингибирование ацетилирования гистона. Известно, что молекулы, обладающие деацетилазной активностью, также действуют как ко-супрессоры транскрипционного процесса (Leong etal., Cancer Lett, 18: 42-48, 2007). Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:45 из вышеприведенной группы представляет собой домен ВН 3 белка Bik, представленный последовательностьюLALRLAC IGDEMDVS (SEQ ID NO:45). Белок Bik взаимодействует с клеточными и вирусными факторами, инициирующими сигналы выживания (например, Bcl-2), тем самым стимулируя апоптоз. Подобно многим другим проапоптотическим белкам он содержит домен ВН 3, необходимый для взаимодействия с Bcl-2. Пептид, полученный из этого белка, содержащий домен ВН 3, может инициировать апоптоз, активируя другие проапоптотические белки или ингибируя противоапоптотические белки (Del Gaizo Moore, V., et al., Blond, 111: 2300-2309, 2008). Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:46 из вышеприведенной группы представляет собой синтетический пептид - ингибитор протеасом, представленный последовательностьюAGAGGGAGG AGAGGGAGGA G (SEQ ID NO:46). Этот пептид состоит из серий повторов остатков Gly и Ala и является ингибитором протеасом, способным к потенциированию TRAIL-индуцированного апоптоза, индуцируя сверхэкспрессию рецептораDR5 данного TRAIL. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:47 из вышеприведенной группы представляет собой домен С-концевого фрагмента протеасомы S5a, представленный последовательностью Этот домен из фрагмента протеасомы S5 а содержит мотивы UIM, которые принимают непосредственное участие в связывании убиквитина, и, таким образом, обладает способностью индуцировать апоптоз. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:151 из вышеприведенной группы представляет собой пептид, полученный из азурина. Азурин, медьсодержащий редокс-белок, выделяемый патогенной бактерией Pseudomonasaeruginosa, является высокотоксичным для многих линий опухолевых клеток. Он входит в цитозоль и продвигается к ядру. Его активность строго зависит от присутствия активной формы р 53 в опухолевых клетках. Показано, что азурин связывает р 53 и посттрансляционно повышает уровень р 53 и Вах. Это явное антагонистическое действие относительно функционального взаимодействия Mdm2-p53 указывает на то, что связывание Азурина с р 53 может помешать связи Mdm2-p53 и, таким образом, препятствовать деградации р 53. После связывания он провоцирует выделение митохондриального цитохрома С в цитозоль. Этот процесс активирует каспазный каскад (в том числе, каспазу-9 и каспазу-7), тем самым инициируя апоптотический процесс (Punj V., et al. Oncogene. 2004 Mar 25; 23(13): 2367-78, Funari G. et al. JMol Recognit. 2010 Jul Aug; 23(4): 343-51). Подробный анализ активности пептидов, полученных из последовательности азурина, выявил область из 28 аминокислот, ответственную за эффективную клеточную пенетрацию и запуск апоптоза (Yamada i wsp., Cell Microbiol, 7: 1418-1431, 2005). Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:152 из вышеприведенной группы представляет собой полноразмерный пептид азурин. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:153 из вышеприведенной группы представляет собой пептид, сконструированный из белка аРР и домена BH3 белка Bax. Химеры белка аРР и реконструированного проапоптотического белка Bak были описаны в ЕР 1309680 как высоко потенциальные и специфические лиганды для Bcl-2 и Bcl-Х человека (также см. ChinOct 15; 40(20): 3806-3809). Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:154 из вышеприведенной группы представляет собой другой пептид, сконструированный из белка аРР и домена BH3 белка Вах. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:155 из вышеприведенной группы представляет собой пептид, полученный из ретикулона RTN1-C. Белок RTN1-C представляет собой мембранный белок, локализирующийся в ЭР и экспрессируемый в нервной системе, и его биологическая роль понятна не до конца. С-концевая область RTN1-C, соответствующая фрагменту от остатка 186 до остатка 208, способна связывать нуклеиновые кислоты и взаимодействовать с ферментами гистонными дезацетилазами (HDAC), повышая их активность. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:156 из вышеприведенной группы представляет собой полноразмерный Ретикулон 3 человека (изоформа а). Ретикулоны (RTN) формируют группу интегральных белков мембраны, которые не имеют гомологии с другими известными доменами,связанными с апоптозом. Ретикулон 3 изоформа а сверхэкспрессируется в опухолевых клеточных линиях, делая их чувствительными к TRAIL-опосредованному апоптозу. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:157 из вышеприведенной группы представляет собой модифицированную конститутивно активную каспазу-3 (одиночная цепь) (SrinivasulaS.M., Ahmad M., MacFarlane M. Luo Z., Huang Z., Fernandes-Alnemri T., Alnemri E.S. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 1998 Apr 24; 273(17): 10107-11). Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:158 из вышеприведенной группы представляет собой домен SAC из белка Par-4 (белок апоптозного ответа простаты par-4).Par-4 представляет собой белок-супрессор опухолевого роста с проапоптотической функцией. Опухолеспецифическое проапоптотическое действие Par-4 присуще его, расположенному в центре, доменуSAC. Функция молекулы обеспечивается двумя различными способами: активацией молекулярных компонентов аппарата некроза клеток (перемещение Fas и FasL на цитоплазматическую мембрану) и ингибированием фактора-предшественника выживаемости (путь NF-кВ) (Zhao Y., Rangnekar V.M. Apoptosisand tumor resistance conferred by Par-4. Cancer Biol Ther. 2008 Dec; 7(12): 1867-74. Epub 2008 Dec 8. Review). Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:159 из вышеприведенной группы представляет собой белок Noxa. Noxa кодирует представителя семейства белков Bcl-2 "только с доменом Bcl2 гомологичностью 3 (ВН 3)"; этот представитель содержит область ВН 3, но не другие домены ВН. Noxa является медиатором р 53-зависимого апоптоза и подвержен ВН 3 мотив-зависимой локализации в митохондриях, и взаимодействует с противоапоптотическими представителями семейства Bcl-2, что в результате приводит к активации каспазы-9. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:160 из вышеприведенной группы представляет собой 10 AA(KLLNLISKLF)-фрагмент белка Noxa, необходимый для митохондриальной локализации (MTD-митохондриальный нацеливающий домен, или CKP - Cell Killing Peptide). Он был описан в WO 2006/001582 и у Young-Woo Seo et al. в The Journal of Biological Chemistry. Vol. 278, No. 48, Issue ofNovember 28, pp. 48292-48299, 2003. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:161 из вышеприведенной группы представляет собой короткий гибридный пептид Antp-TPR, описанный в WO 2010055929. Antp-TPR представляет собой сконструированный гибридный пептид, нацеленный на Hsp90, который имеет селективную цитотоксическую активность против опухолевых клеток, обусловленную ингибированием взаимодействия Hsp90 с доменом TPR2A белка Нор. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:162 из вышеприведенной группы представляет собой пептидный ингибитор домена SH2 белка Stat3. Домен SH2 белков Stat отвечает за серию событий, которые приводят к ускорению клеточного роста и дифференциации через нормальный сигнальный путь STAT в ответ на факторы роста и цитокины. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:163 из вышеприведенной группы представляет собой пептид GQVGRQLAIIGDDINR, происходящий из домена ВН 3 белка Bak (семейство Bcl2) (Castelli M., Reiners J.J., Kessel D. A mechanism for the proapoptotic activity of ursodeoxycholic acid: effects on Bcl-2 conformation. Cell Death Differ. 2004 Aug; 11(8): 906-14). Белок Bak является проапоптотическим представителем семейства Bcl-2, который вовлечен в инициацию апоптоза. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:164 из вышеприведенной группы представляет собой пептид KNLWAAQRYGRELRRMSDEFEGSFKGL, происходящий из домена ВН 3 белкаCancer Res. 2000 Mar 15; 60(6): 1498-502). Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:165 из вышеприведенной группы представляет собой пептид АТАР из белка Bf11. АТАР (амфипатический пептид с заякоренным хвостом) (остатки 147-175 из Bfl1, бифункциональный белок семейства Bcl-2) нацелен специфически на митохондрии и индуцирует каспаза-зависимый апоптоз, для которого не требуется Вах или Bak. Эффекторный пептид с последовательностью SEQ ID NO:166 из вышеприведенной группы представляет собой другой пептид АТАР из белка Bfl1. Белок АТАР слит с доменом MTS из HCCS1 (Ko J.K.,Choi K.H., Pan Z., Lin P., Weisleder N., Kim C.W., Ma J. The tail-anchoring domain of Bfl1 and HCCS1 targetsmitochondrial membrane permeability to induce apoptosis. J Cell Sci. 2007 Aug 15; 120 (Pt 16): 2912-23. Epub 2007 Jul 31). Как описано выше, первый вариант проапоптотического эффекторного пептида домена (b) может представлять собой пептид, проявляющий свою апоптотическую активность через внутренний путь апоптоза (внутриклеточный), который индуцирует апоптоз непосредственно путем активации сигнального каскада компонентов митохондриального пути апоптоза, или непосредственно индуцируя митохондриальный апоптоз в клетках. В одном из примеров осуществления первого варианта одна группа проапоптотических эффекторных пептидов домена (b), проявляющая свою активность через внутренний путь, может представлять собой пептиды, которые ингибируют и/или модулируют внутриклеточные противоапоптотические факторы или факторы-предшественники выживаемости, такие как противоапоптотические белки Bcl-2 и BclXL, после их связывания. Примерами эффекторных пептидов из вышеприведенной группы являются пептиды, представленные последовательностью SEQ ID NO:30, описанной в слитых белках по примеру 1, SEQ ID NO:37, описанной в слитых белках по примерам 11 и 47, SEQ ID NO:45, встроенной в слитый белок по примеру 21,SEQ ID NO:158, описанной в слитых белках по примерам 42 и 43, и SEQ ID NO:159, встроенной в слитый белок по примеру 44. В других примерах осуществления этого первого варианта группа проапоптотических эффекторных пептидов домена (b), проявляющая свою активность через внутренний путь, может представлять собой пептиды, оказывающие прямой разрушительный эффект внутри клетки для блокировки клеточного цикла. Указанный прямой разрушительный эффект внутри клетки в митохондриальном внутреннем пути может быть инициирован этим эффекторным пептидом на любом уровне каспазного каскада, приводя к гибели клетки. Примерами указанного прямого разрушительного действия эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути являются деградация нуклеиновых кислот, в частности целых клеточных РНК или ДНК, и индукция деструкционных нуклеаз. Такой эффект может оказываться, например, рибонуклеазами, такими как рибонуклеазы суперсемейства панкреатической RNAse A, в том числе панкреатической RNAse человека, ангиогенин человека (рибонуклеаза 5, hAng), нейротоксин эозинофилов человека(EDN) и бычья рибонуклеаза, а так же их гомологи и варианты. Примерами гомологов RNAse являются онконаза, рибонуклеазы, выделенные из Rana catesbiana и Rana japonica. Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, действующими путем деградации нуклеиновых кислот, являются пептиды, представленные последовательностями SEQ IDNO:32, описанной в слитых белках по примерам 3, 4 и 27, SEQ ID NO:41, описанной в слитых белках из примеров 16, 17 и 46, и SEQ ID NO:157, описанной в слитом белке из примера 41. Другим примером указанного прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является активация каспазы. Такой эффект может оказывать, например,цитохром С (SEQ ID NO:33), представленный в слитых белках по примерам 5 и 6, гранзим В (SEQ IDNO:34), представленный в слитых белках по примерам 7 и 8, или пептид, полученный из белкаSmac/DIABLO (SEQ ID NO:39), представленный в слитых белках по примерам 14, 21, 33, 34 и 35. Другим примером указанного прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является ингибирование протеасом, обусловленное влиянием стабилизации проапоптотических белков на восстановление функций р 53. Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, действующими посредством ингибирования протеасом, являются пептиды, представленные последовательностью SEQ ID NO:4 6,встроенной в слитый белок по примеру 22, и SEQ ID NO:47, встроенной в слитый белок по примеру 23. Другим примером указанного прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является модуляция гистоновых белков через усиление влияния экспрессии проапоптотических белков на восстановление функций р 53. Примерами эффекторных пептидов из вышеприведенной группы, действующих через модуляцию гистоновых белков, являются буфорин IIb, представленный последовательностью SEQ ID NO:40, встроенной в слитый белок по примеру 15, и луназин, представленный последовательностью SEQ ID NO:44,встроенной в слитый белок по примеру 20. Другим примером указанного прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является восстановление функций р-53, например, посредством ингибирования его деградации. Предотвращение деградации р-53 может быть достигнуто посредством ингибирования негативной регуляции р-53, например, посредством MDM2 (murine double minute 2), для прекращения его негативной регуляции. Это может быть достигнуто с помощью пептидов, связывающихMDM2, которые конкурируют с MDM2 за связывание с р-53, таких как Азурин, медьсодержащий редоксбелок, регулятор клеточного цикла p14ARF, или SuperTIP (белок Thioredoxinlnsert, mdm-2-связывающий пептид с активным петлевым участком бактериального белка тиоредоксин), или их фрагменты. Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, действующими посредством восстановления функций р-53, являются пептиды, представленные последовательностью SEQ IDNO:42, встроенной в слитый белок из примера 18, SEQ ID NO:43, встроенной в слитый белок из примера 19, SEQ ID NO:151, представленной в слитом белке из примеров 29, 30 и 31, и SEQ ID NO:152, встроенной в слитый белок из примера 32. Другим примером указанного прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является влияние, а именно активация, ингибирование или модуляция,семейства белков Bcl-2, таких как белки Вах, Bak, Bok, Bid, Bim, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma, Bik, BNIP3 и Spike, конкретнее, семейство белков только BH3, в том числе Bid, Bim, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma, Bik,BNIP3 и Spike. В частности, фрагменты доменов BH3 представителей семейства Bcl-2 будут предпочтительными эффекторными пептидами. Другая группа эффекторных пептидов представляет собой фрагменты семейства ядерных рецепторов RXR (рецептор Retinoid X), такой как, например, ядерный рецептор Nur77. Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, оказывающими влияние на белки семейства Bcl-2, являются пептиды, представленные последовательностью SEQ ID NO:30, встроенной в слитый белок из примера 1, SEQ ID NO:31, представленной в слитых белках из примеров 2, 4 и 8, SEQ ID NO:32, встроенной в слитый белок из примера 3, SEQ ID NO:35, встроенной в слитый белок из примера 9, SEQ ID NO:36, встроенной в слитый белок из примера 10, SEQ ID NO:37, представленной в слитых белках из примеров 11 и 47, SEQ ID NO:38, представленной в слитых белках из примеров 12 и 13,SEQ ID NO:159, встроенной в слитый белок из примера 44, SEQ ID NO:160, встроенной в слитый белок из примера 45, SEQ ID NO:163, встроенной в слитый белок из примера 51, SEQ ID NO:164, представленной в слитых белках из примеров 52 и 53, SEQ ID NO:165, встроенной в слитый белок из примера 54, иSEQ ID NO:166, встроенной в слитый белок из примера 55. Другим примером прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является конвергирование апоптотического сигнала, индуцированного связываниемTRAIL с рецепторами TRAIL, в частности, посредством активации каспаз. Другим примером прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является стимулирование образования апоптосом. Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, стимулирующими формирование апоптосом, являются пептиды, представленные последовательностью SEQ ID NO:30, встроенной в слитый белок из примера 1, SEQ ID NO:31, встроенной в слитый белок из примера 2, SEQ IDNO:33, представленной в слитых белках из примеров 5 и 6, SEQ ID NO:35, встроенной в слитый белок из примера 9, SEQ ID NO:36, встроенной в слитый белок из примера 10, SEQ ID NO:37, встроенной в слитый белок из примера 47, SEQ ID NO:39, представленной в слитых белках из примеров 33, 34 и 35, SEQID NO:40, встроенной в слитый белок из примера 14, SEQ ID NO:45, встроенной в слитый белок из при-9 023005 мера 21, SEQ ID NO:153, представленной в слитых белках из примеров 36 и 37, SEQ ID NO:154, встроенной в слитый белок из примера 38, SEQ ID NO:157, встроенной в слитый белок из примера 41, SEQ IDNO:158, представленной в слитых белках из примеров 42 и 43, SEQ ID NO:159, встроенной в слитый белок из примера 44, SEQ ID NO:160, встроенной в слитый белок из примера 45, SEQ ID NO:163, встроенной в слитый белок из примера 51, и SEQ ID NO:164, представленной в слитых белках из примеров 52 и 53. Другим примером прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является стимулирование проницаемости наружной мембраны митохондрий (MOMP),вследствие чего белки, выделяемые митохондриями, могут действовать на уровне активации каспазы. Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, стимулирующими проницаемость МОМР, являются пептиды, представленные последовательностью SEQ ID NO:30, встроенной в слитый белок из примера 1, SEQ ID NO:31, представленной в слитых белках из примеров 2 и 48, SEQ IDNO:33, представленной в слитых белках из примеров 5 и 6, SEQ ID NO:39, представленной в слитых белках из примеров 14, 33, 34 и 35, SEQ ID NO:40, встроенной в слитый белок из примера 15, SEQ ID NO:41,встроенной в слитый белок из примера 46, и SEQ ID NO:45, встроенной в слитый белок из примера 21. Как описано выше, второй вариант проапоптотического эффекторного пептида домена (b) по настоящему изобретению представляет собой группу проапоптотических эффекторных пептидов, действующих через внешний путь (внеклеточно), в котором для их действия требуется связывание с рецепторами, присутствующими на поверхности опухолевой клетки. Следующие TNF-лиганды (TNF - фактор некроза опухоли) или TNF-аналоги в качестве внеклеточно действующих пептидов использовали как сравнительные эффекторные пептиды: Декапептид VANPQAEGQL (SEQ ID NO:48); Гексапептид LANGVE (SEQ ID NO:49), или Септапептид CPSEGLC (SEQ ID NO:50). Декапептид, представленный последовательностью SEQ ID NO:48, описан как аналог/агонист TNF в JP 60226816. Гексапептид, представленный последовательностью SEQ ID NO:49, происходит из TNF и описан вDE 3841768. Септапептид, представленный последовательностью SEQ ID NO:50, представляет собой пятиаминокислотный пептид, который является частью цитокина TNF, полученный из поверхности взаимодействия этого цитокина с его клеточными рецепторами: TNFR55 и TNFR75, который фланкируется с Сконца и N-конца двумя остатками цистеина. Остатки цистеина стабилизируют циклизацию пептида через формирование сульфидного мостика между аминокислотами. Целью циклизации является стабилизация пептида и повышение его активности. После связывания с рецепторами TRAIL, представленными на поверхности опухолевых клеток,слитый белок будет проявлять двойное действие. Домен (а), который является функциональным фрагментом TRAIL, будет проявлять свою известную агонистическую активность, а именно связывание с рецепторами смерти на клеточной поверхности и активация внешнего пути апоптоза. После интернализации путем эндоцитоза слитого белка, содержащего проапоптотический пептид, действующий внутриклеточно, домен (b) будет способен потенциально оказывать свое действие внутриклеточно одновременно с действием домена TRAIL. В этом случае противоопухолевая активность TRAIL может быть потенциирована посредством активации других элементов и механизмов апоптоза. Сравнительный слитый белок, включающий проапоптотический пептид, действующий внеклеточно, должен потенциально дополнительно инициировать путь апоптоза посредством связывания с и активации проапоптотических рецепторов, отличных от рецепторов TRAIL. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домены (а) и (b) слитого белка могут быть присоединены непосредственно друг к другу. В другом варианте осуществления домен (а) и домен (b) соединены доменом (с), содержащим последовательность участка расщепления, распознаваемую протеазами, представленными в клеточном окружении, главным образом, в окружении опухолевой клетки. Участок расщепления протеаз может быть выбран из последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, в частности последовательностиNO:53) или последовательность RKKRVKR (SEQ ID NO:172),и их сочетаний. В частности, участок расщепления протеаз представляет собой комбинацию последовательности,распознаваемой металлопротеазой ММР, и последовательности, распознаваемой урокиназой uPA, расположенных рядом друг с другом в любом порядке. В одном из вариантов осуществления домен (с) представляет собой комбинацию MMP/uPA SEQ IDNO:51/SEQ ID NO:52, которая представляет собой последовательность PLGLAGRWR, или комбинациюuPA/MMP SEQ ID NO:52/SEQ ID NO:51, которая представляет собой последовательность RWRPLGLAG. Протеазы металлопротеаза ММР, урокиназа и/или фурин, сверхэкспрессируются в опухолевом окружении. Присутствие последовательности, распознаваемой протеазами, делает возможным отщепление домена (а) от домена (b) после интернализации конструкции, то есть высвобождение функционального домена (b) и, следовательно, его активацию. Наличие участка расщепления протеаз, обеспечивая быстрое высвобождение эффекторного пептида, повышает шансы переноса пептида в место его действия, до того, как произойдет случайная деградация слитого белка протеазами, присутствующими в данной клетке. Кроме того, к домену (b) эффекторного пептида слитого белка по настоящему изобретению может быть присоединен транспортирующий домен (d), выбранный из группы, состоящей из:(d1) последовательности, направленной на эндоплазматический ретикулум,(d2) полиаргининовой последовательности, переносимой через клеточную мембрану, содержащую 6, 7, 8 или 9 остатков Arg,(d3) транслокационного домена Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:54),(d4) мембранного транспортного домена,(d5) ядерного домена локализации, и(d1)/(d2), (d1)/(d3), (d1)/(d4), (d1)/(d5) и (d1)/(d2)/(d3), (d3)/(d5), (d2)/(d5), (d1)/(d3)/(d5), (d2)/(d3)/(d6). Более того, сочетание доменов (d1), (d2), (d3), (d4) и (d5) может включать домены, расположенные рядом друг с другом и соединенные с одним концом домена (b), и/или домены, присоединенные к разным концам домена (b). Следует понимать, что в случае, когда слитый белок содержит и транспортный домен (d), присоединенный к домену (b), и домен (с) участка расщепления между доменами (а) и (b), домен (с) расположен таким образом, чтобы после отщепления данной конструкции транспортный домен (d) оставался прикрепленным к домену (b). Другими словами, если слитый белок содержит и транспортный домен (d), и домен участка расщепления (с), то домен (d) расположен между доменом (b) и доменом (с), или расположен на конце домена (b), противоположном месту присоединения домена (d). Настоящее изобретение не включает вариант, в котором домен (d) расположен между доменом (с) и доменом (а), а именно случай,когда после расщепления конструкции транспортный домен остается присоединенным к домену TRAIL. Транспортная последовательность может быть присоединена к N-концу или С-концу домена (b). В некоторых вариантах осуществления транспортная последовательность может быть также терминальной частью всей конструкции, например С-концевая часть или N-концевая часть, в зависимости от способа присоединения доменов (а) и (b). Домен транслокации микроорганизма Pseudomonas aeruginosa способен перемещаться через лизосомальную мембрану в цитоплазму и может быть использован для введения эффекторного пептида в компартменты опухолевых клеток. Последовательность домена транслокации из Pseudomonas aeruginosa хорошо известна и представлена последовательностьюID NO:54). Последовательность (d1), направленная на эндоплазматический ретикулум, может представлять собой любую сигнальную последовательность, направленную на эндоплазматический ретикулум, известную в данной области, такую как, но ими не ограничиваясь, KDEL, HDEL, RDEL, DDEL, ADEL, SDEL,KEDL. Последовательность (d1) предпочтительно выбрана из последовательностей KDEL (SEQ IDNO:55) и KEDL (SEQ ID NO:56). Предпочтительно направляющая последовательность (d1) расположена на С-конце слитого белка по настоящему изобретению и образует его С-концевую область. Мембранный транспортный домен (d4) может представлять собой любую известную в данной области сигнальную последовательность, транспортирующую через плазматическую мембрану, такую как,например, но ими не ограничиваясь, KPRRPY или K PRRPYR. Ядерной последовательностью локализации (d5) может быть любая известная в данной области сигнальная последовательность, направленная на ядро, такая как, например, но не ограничивающаяся ими, EEEAAGRKRKKRT (SEQ ID NO:168), FFFA7AGRKRKKRT, NNNAAGRKRKKRT, YYYAAGRKRKKRT, AAKKK или GR KRKKRT. Митохондриальным направляющим доменом (d6) может быть любая известная в области сигнальная последовательность, направленная на митохондрии, такая как, например, но не ограничиваясь ими,RVSFCRPGWSAMARSRLTATSVSQVQENGFVK (SEQ ID NO:166), фрагмент MLATRVFSLVGKRA- 11023005ISTSVCVR субъединицы IV цитохром оксидазы человека (hCOXIV1) или лидерный пептид орнитинтранскарбамилазы. Кроме основных функциональных элементов слитого белка, транспортных доменов и доменов участка расщепления слитые белки по настоящему изобретению могут содержать домен (е), а именно полицистеиновый мотив, облегчающий стабилизацию тримера, как, например, но ими не ограничиваясь, последовательность CAACAAAC (SEQ ID NO:177) или СААЕСАААС (SEQ ID NO:178). Более того, данный полицистеиновый домен (е) может быть соединен с одним концом домена (b) и/или соединен с разными концами домена (b). Следует понимать, что в случае, когда слитый белок имеет и полицистеиновый домен (е), прикрепленный к домену (b), и домен (с) участка расщепления между доменами (а) и (b), домен (с) расположен таким образом, что после расщепления конструкции полицистеиновый домен (е) остается прикрепленным к домену (а). Другими словами, если слитый белок содержит и полицистеиновый домен (е), и домен(с) участка расщепления, то домен (е) расположен между доменом (а) и доменом (с) или расположен на конце домена (а), противоположном месту прикрепления домена (d). Настоящее изобретение не включает такой вариант, при котором домен (е) будет расположен между доменом (с) и доменом (b), то есть в случае, когда после расщепления конструкции полицистеиновый домен оставался прикрепленным к домену эффекторного пептида. Кроме основных функциональных элементов слитого белка, транспортных доменов и домена (доменов) участка расщепления слитый белок по настоящему изобретению может содержать нейтральную последовательность/последовательности гибкого стерического линкера (спейсера), содержащего остатки аланина, глицина, глутамина, цистеина, гистидина и серина. Такие линкеры/спейсеры хорошо известны и описаны в литературе. Их включение в последовательность слитого белка предназначено для обеспечения корректного сворачивания белков, продуцируемых в процессе сверхэкспрессии в клетках-хозяевах. В частности, гибкий стерический линкер может быть выбран из группы, состоящей из GGSG (SEQNO:180), GGSHG (SEQ ID NO:182), SGGCGGS (SEQ ID NO:183) и ААСАА (SEQ ID NO:184). В одном из вариантов осуществления между доменом (а) и доменом (b) находится дополнительный домен (f) с последовательностью, подходящей для прикрепления к слитому белку по настоящему изобретению молекулы PEG (PEG-линкер). Такой линкер может быть известной последовательностью AlaSerGlyCysGlyProGlu (в однобуквенной кодировке ASGCGPE), указанной в прикрепленном списке последовательностей как SEQ ID NO:170.PEG-линкер также может быть выбран среди последовательностей AlaAlaCysAlaAla (AACAA), SerGlyGlyCysGlyGlySer (SGGCGGS) и (SGCGS), указанных в прикрепленном списке последовательностей соответственно SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:177 и SEQ ID NO:179. В другом варианте осуществления домены (а), (b), (с), (d), (e) и (f) могут быть дополнительно отделены с помощью до трех аминокислотных остатков, образованных из аминокислотных остатков, выбранных из группы, содержащей Глицин и Глутамин. Более того, в некоторых вариантах осуществления слитый белок может содержать в качестве Сконцевой области цельную конструкцию нефункционального фрагмента hTRAIL, такую как последовательность hTRAIL95-121, с предшествующей последовательностью, обеспечивающей ее отщепление от конструкции, выигрышным является участок расщепления протеаз, предпочтительна последовательность, распознаваемая тромбином. Включение такого небольшого нефункционального фрагментаhTRAIL наделяет более высокой гидрофильностью всю конструкцию, таким образом, повышая растворимость белка в процессе экспрессии. После этапов очистки фрагмент hTRAIL95-121 будет отщеплен тромбином. В таком случае, hTRAIL95-121 не будет присутствовать в слитом белке, используемом для приготовления фармацевтической композиции. Можно использовать любую известную последовательность, распознаваемую тромбином, в частности последовательность LVPRGS (SEQ ID NO:174). Такая дополнительная последовательность hTRAIL95-121 является особенно эффективной в случае липофильных эффекторных пептидов и когда домен (а) начинается с аминокислоты 114 и выше в последовательности цельного TRAIL. Конкретными вариантами осуществления слитого белка по настоящему изобретению являются слитые белки, содержащие проапоптотические пептиды, действующие внутриклеточно, выбранные из группы, состоящей из белков, представленных последовательностями: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 и SEQ ID NO:121. Другие специфические варианты осуществления слитого белка по настоящему изобретению представляют собой слитые белки, содержащие проапоптотические пептиды, действующие внеклеточно, выбранные из группы, состоящей из белков, представленных последовательностями SEQ ID NO:24, SEQ IDNO:25 и SEQ ID NO:26. Подробное описание структуры характерных слитых белков, упомянутых выше, показано на фиг. 15 и 9-13 и в примерах, представленных ниже. В соответствии с настоящим изобретением под слитым белком понимают одну белковую молекулу,содержащую два или несколько белков или их фрагментов, ковалентно связанных посредством пептидных связей между их соответствующими пептидными цепями, без дополнительных химических линкеров. Слитый белок также альтернативно может быть описан как белковая конструкция или химерный белок. В соответствии с настоящим изобретением термины "конструкция" или "химерный белок", если используются, должны пониматься как относящиеся к слитому белку, как определено выше. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что слитый белок, определенный таким образом, может быть синтезирован с помощью известных способов химического синтеза пептидов и белков. Слитый белок может быть синтезирован способами химического синтеза пептидов, в частности, с помощью технологий пептидного синтеза на твердой фазе с использованием подходящих смол и носителей. Такие технологии общеупотребимы и известны в уровне техники, и описаны среди прочего в монографиях (см., например, Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag,New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company). Слитый белок может быть синтезирован способами химического синтеза пептидов в виде непрерывного белка (неразрезанного белка). Альтернативно, отдельные фрагменты (домены) белка могут быть синтезированы по отдельности и затем соединены друг с другом в один непрерывный белок с помощью пептидной связи, посредством конденсации аминоконца одного пептидного фрагмента карбоксильным концом второго пептида. Такие технологии являются повсеместно принятыми и хорошо известными. Для подтверждения правильности структуры полученного пептида можно использовать известные способы анализа аминокислотного состава пептидов, такие как технология масс-спектрометрии с высоким разрешением для определения молекулярного веса пептида. Для подтверждения пептидной последовательности белка также можно использовать секвенаторы, в которых пептид последовательно разрушается для выявления последовательности аминокислот. Тем не менее предпочтительно слитый белок по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный белок, созданный способами генной экспрессии полинуклеотидной последовательности,кодирующей слитый белок в клетках-хозяевах. Следующий аспект настоящего изобретения представляет собой полинуклеотидную последовательность, в частности последовательность ДНК, кодирующую слитый белок, как определено выше. Предпочтительно полинуклеотидная последовательность, в частности ДНК, в соответствии с настоящим изобретением кодирующая слитый белок, как определено выше, представляет собой последовательность, оптимизированную для экспрессии в Е. coli. Другой аспект настоящего изобретения представляет собой также вектор экспрессии, содержащий полинуклеотидную последовательность, в частности последовательность ДНК по настоящему изобретению, как определено выше. Другой аспект настоящего изобретения представляет собой также клетку-хозяина, содержащую вектор экспрессии, как определено выше. Предпочтительной клеткой-хозяином для экспрессии слитых белков по настоящему изобретению является клетка Е. Coli. Способы создания рекомбинантных белков, в том числе слитых белков, хорошо известны. Вкратце,эта технология включает генерирование полинуклеотидной молекулы, например молекулы ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность белка-мишени, и контроль экспрессии белка-мишени в данном хозяине. Затем данную полинуклеотидную молекулу, кодирующую белок-мишень, встраивают в соответствующий вектор экспрессии, который обеспечивает эффективную экспрессию полипептида. Рекомбинантный вектор экспрессии затем встраивают в клетки-хозяев для трансфекции/трансформации и в результате получают трансформированную клетку-хозяина. Затем следует культивирование трансформированных клеток для сверхэкспрессии белка-мишени, очистка полученных белков и, необязательно,отрезание посредством расщепления маркерных последовательностей, использовавшихся для экспрессии или очистки белка. Пригодные способы экспрессии и очистки описаны (см., например, в монографии Goeddel, Geneal., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995). В качестве векторов экспрессии для введения и репликации последовательностей ДНК в клетках- 13023005 хозяевах можно использовать космиды, плазмиды или модифицированные вирусы. Обычно плазмиды применяются в качестве векторов экспрессии. Подходящие плазмиды хорошо известны и доступны на коммерческой основе. Вектор экспрессии по настоящему изобретению содержит полинуклеотидную молекулу, кодирующую слитый белок по настоящему изобретению, и необходимые регуляторные последовательности для транскрипции и трансляции данной кодирующей последовательности, встроенной в соответствующую клетку-хозяина. Выбор регуляторных последовательностей зависит от типа клеток-хозяев и может быть без труда осуществлен специалистом в данной области. Примерами таких регуляторных последовательностей являются транскрипционный протомер и энхансер или последовательность связывания РНКполимеразы, последовательность связывания рибосом, содержащая сигнал инициации транскрипции,встроенный перед кодирующей последовательностью, и последовательность терминации транскрипции,встроенная после кодирующей последовательности. Более того, в зависимости от применяемой клеткихозяина и вектора экспрессии другие последовательности могут быть встроены в вектор экспрессии, такие как ориджин репликации, дополнительные сайты рестрикции ДНК, энхансеры и последовательности,обеспечивающие индукцию транскрипции. Вектор экспрессии также будет содержать последовательность гена-маркера, который наделяет определенным фенотипом трансформированную клетку и делает возможной специфическую селекцию трансформированных клеток. Кроме того, вектор может также содержать вторую маркерную последовательность, которая обеспечивает отличие клеток, трансформированных рекомбинантной плазмидой, содержащей встроенную кодирующую последовательность белка-мишени, от тех клеток, которые поглотили плазмиду без вставки. Чаще всего используют характерные маркеры устойчивости к антибиотикам,однако могут быть использованы любые другие репортерные гены, известные в данной области, чье присутствие в клетке (in vivo) может быть без труда определено с использованием технологий авторадиографии, спектрометрии или био- и хемилюминесценции. Например, в зависимости от клетки-хозяина могут быть использованы такие репортерные гены, как ген -галактозидазы, -глюкуронидазы, люциферазы, хлорамфеникол ацетилтрансферазы или зеленого флуоресцентного белка. Кроме того, вектор экспрессии может содержать сигнальную последовательность, транспортирующую белки в соответствующий клеточный компартмент, например периплазму, где сворачивание облегчено. Дополнительно, может присутствовать последовательность, кодирующая маркер/метку, такую какHisTag, присоединенная к N-концу, или GST, присоединенная к С-концу, которая облегчает последующую очистку полученного белка, с использованием принципа аффинности, с помощью аффинной хроматографии на никелевой колонке. Также могут присутствовать дополнительные последовательности, которые защищают белок от протеолитической деградации в клетках-хозяевах, а так же последовательности, которые повышают его растворимость. Вспомогательный элемент, прикрепленный к последовательности белка-мишени, может блокировать его активность, или быть вредным по другой причине, например вследствие токсичности. Такой элемент должен быть удален, что может быть осуществлено посредством ферментативного или химического расщепления. В частности, шестигистидиновая метка HisTag, или другие маркеры такого типа, прикрепленные для обеспечения очистки белка путем аффинной хроматографии, должны быть удалены по причине описанного эффекта растворимого белка TRAIL на печеночную токсичность. Можно использовать гетерологичные экспрессирующие системы, основанные на различных хорошо известных клетках-хозяевах, включающие прокариотические клетки: бактериальные, такие как Escherichia coli или Bacillus subtilis, дрожжевые, такие как Saccharomyces cervisiae или Pichia pastoris, эукариотические клеточные линии (насекомых, млекопитающих, растений). Предпочтительно использовать экспрессирующую систему Е. coli в связи с простотой культивирования и генетического манипулирования с ней и большого количества получаемого продукта. Соответственно полинуклеотидная последовательность, содержащая мишеневую последовательность, кодирующую слитый белок по настоящему изобретению, будет оптимизирована для экспрессии в Е. coli, a именно она будет содержать в кодирующей последовательности кодоны, оптимальные для экспрессии в Е.coli, выбранные из возможных вариантов последовательностей, известных в данной области. Кроме того,вектор экспрессии будет содержать вышеописанные элементы, подходящие для Е. coli, прикрепленные к данной кодирующей последовательности. Соответственно предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения, полинуклеотидная последовательность, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок по настоящему изобретению, оптимизированную для экспрессии в Е. coli, выбран из группы полинуклеотидных последовательностей, состоящей из SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ IDNO:150; которая кодирует слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, содержащей аминокислотные последовательности соответственно: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQNO:120 и SEQ ID NO:121. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к вектору экспрессии, подходящему для трансформации Е. coli, содержащему полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:67 - SEQ ID NO:92 иSEQ ID NO:122 - SEQ ID NO:150, указанных выше, а также клетки E. coli трансформированы с использованием такого вектора экспрессии. Трансформацию, то есть внедрение последовательности ДНК в бактериальные клетки-хозяева, в частности E. coli, обычно осуществляют в компетентных клетках, подготовленных для поглощения ДНК,например, посредством обработки ионами кальция при низкой температуре (4 С), и затем подвергающихся хит-шоку (при 37-42 С), или посредством электропорации. Такие способы хорошо известны и обычно определены производителем данной экспрессирующей системы. Процедура сверхэкспрессии слитых белков по настоящему изобретению в экспрессионной системеE. coli будет дополнительно описана ниже. Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую слитый белок по настоящему изобретению, как определено выше, в качестве активного вещества, и подходящий фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и стандартные дополнительные компоненты. Данная фармацевтическая композиция будет содержать эффективное количество слитого белка по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемые дополнительные компоненты, растворенные или диспергированные в носителе или разбавителе, и предпочтительно будет в форме фармацевтической композиции, сформулированной в виде стандартной лекарственной формы или композиции, содержащей многократные дозы. Фармацевтические препараты и способы их приготовления, так же как и другие компоненты, носители и разбавители, известны специалисту в данной области и описаны в литературе (см., например, в монографии Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA). Термины "фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и дополнительный ингредиент" включают любые растворители, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, стабилизаторы, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), изотонические средства, известные в данной области. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать различные типы носителей, разбавителей и инертных наполнителей в зависимости от выбранного пути введения и необходимой лекарственной формы, такой как жидкость, твердые и аэрозольные формы для перорального, парентерального, ингаляционного, местного применения, и того,должна ли эта лекарственная форма быть стерильной для пути введения, такого как инъекция. Предпочтительным путем введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению является парентеральный, в том числе такие пути инъекции, как внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, внутриопухолевый, или путем единичного или продолжительного внутривенного вливания. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена путем инъекции непосредственно в опухоль. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена внутривенно. В еще одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена подкожно или внутрибрюшинно. Фармацевтическая композиция для парентерального введения может представлять собой раствор или дисперсию в фармацевтически приемлемой водной или неводной среде, забуференный до соответствующего значения рН и изоосмотическую с жидкостями организма, если необходимо, и также может содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и растворимые вещества, которые делают композицию совместимой с тканями или кровью реципиента. Другими компонентами, которые могут быть включены в данную композицию, являются, например, вода, спирты, такие как этанол, полиолы, такие как глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль, липиды, такие как триглицериды, растительные масла, липосомы. Соответствующая текучесть и размер частиц данного вещества могут быть обеспечены посредством покрывающих веществ, таких как лецитин, и поверхностноактивных веществ, таких как полисорбаты гидроксипропилцеллюлозы, и тому подобного. Подходящими изотонирующими веществами для жидких парентеральных композиций являются, например, сахара, такие как глюкоза, и хлорид натрия, и их сочетания. Альтернативно, данная фармацевтическая композиция, предназначенная для введения посредством инъекции или вливания, может быть в порошкообразной форме, такой как, например, лиофилизированный порошок для разведения непосредственно перед использованием в соответствующем носителе, таком как, например, стерильная апирогенная вода. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, предназначенная для парентерального введения, также может иметь форму для назального применения, в том числе, растворы, спреи или аэрозоли. Предпочтительно данная форма, предназначенная для назального применения, будет представлять собой водный раствор и будет изотоничной или забуференной с поддержанием значения рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5, с тем, чтобы поддерживать характеристики, аналогичные назальной секреции. Более того, она будет содержать консерванты или стабилизаторы, например, как в хорошо известных интраназальных препаратах. Данная композиция может содержать различные антиоксиданты, которые замедляют окисление одного или нескольких компонентов. Кроме того, с целью предотвращения действия микроорганизмов композиция может содержать различные антибактериальные и противогрибковые средства, в том числе,например, но ими не ограничиваясь, парабены, хлорбутанол, тимеросал, сорбиновая кислота, и аналогичные известные вещества этого типа. В основном, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать, например, по меньшей мере приблизительно 0,01 мас.% активного вещества. Более конкретно, композиция может содержать данное активное вещество в количестве приблизительно от 1 до 75 мас.% данной композиционной единицы, или, например, от 25 до 60 мас.%, но без ограничения указанными значениями. Фактическая величина дозы композиции в соответствии с настоящим изобретением, вводимой пациентам, в том числе человеку, будет определена с учетом физических и физиологических факторов,таких как масса тела, тяжесть состояния, тип заболевания, подвергающегося лечению, предшествующие или сопутствующие терапевтические мероприятия, конкретный пациент и путь введения. Подходящая однократная доза, общая доза и концентрация активного вещества в данной композиции должны быть определены лечащим врачом. Данная композиция, например, может быть введена в дозе от приблизительно 1 мг/кг массы тела до приблизительно 1000 мг/кг массы тела пациента, например, в диапазоне от 5 до 100 мг/кг массы тела или в диапазоне от 5 до 500 мг/кг массы тела. Слитый белок и содержащая его композиция проявляет противораковую или противоопухолевую активность и может применяться при лечении онкологических заболеваний. Настоящее изобретение также относится к применению слитого белка по настоящему изобретению,как определено выше, для лечения онкологических заболеваний у млекопитающих, в том числе, человека. Настоящее изобретение также относится к способу лечения онкологического заболевания у млекопитающих, включая человека, предусматривающему введение в организм индивида, при необходимости,количества, эффективного против злокачественных новообразований, слитого белка по настоящему изобретению, как определено выше, при желании в форме, соответствующей фармацевтической композиции. Слитый белок по настоящему изобретению можно использовать для лечения гематологических злокачественных новообразований, таких как лейкемия, грануломатоз, миелома и другие гематологические злокачественные новообразования. Слитый белок также можно использовать для лечения солидных опухолей, таких как рак молочной железы, рак легких, в том числе немелкоклеточный рак легких, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак мозга и т.п. Подходящим путем введения слитого белка при лечении злокачественных новообразований может быть, в особенности, парентеральный путь, который включает введение слитого белка по настоящему изобретению в форме инъекций или вливаний, в данной композиции и в форме, подходящей для данного пути введения. Настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью последующих общих процедур и примеров специфических слитых белков. Общие процедуры для сверхэкспрессии слитого белка Получение плазмиды Аминокислотную последовательность мишеневого слитого белка использовали в качестве матрицы для создания последовательности ДНК, кодирующей ее, содержащей кодоны, оптимизированные для экспрессии в Escherichia coli. Такая процедура позволяет повысить эффективность следующего этапа синтеза мишеневого белка в Escherichia coli. Полученную нуклеотидную последовательность затем синтезировали автоматически. Кроме того, в полученный ген, кодирующий мишеневый белок, были добавлены сайты расщепления для рестрикционных ферментов NdeI (на 5'-конце лидирующей нити) и XhoI (на 3'-конце лидирующей нити). Их использовали для клонирования гена в вектор рЕТ 28 а (Novagen). Их также можно использовать для клонирования гена, кодирующего белок, в другие векторы. У мишеневого белка, экспрессируемого из конструкции,на N-конце присутствовала полигистидиновая метка (шесть гистидинов), которой предшествовал участок, распознаваемый тромбином, который, в свою очередь, способствует его очистке путем аффинной хроматографии. Точность полученной конструкции подтверждали сначала посредством рестрикционного анализа изолированных плазмид с использованием ферментов NdeI и XhoI, с последующим автоматическим секвенированием всей рамки считывания мишеневого белка. Праймеры, использованные для секвенирования, были комплементарны последовательностям промотора Т 7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') и терминатора Т 7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'), представленных в векторе. Полученную плазмиду использовали для сверхэкспрессии мишеневого слитого белка в коммерческом штамме Е. coli, который был трансформирован с учетом рекомендаций изготовителя. Колонии, полученные на селекционной среде (агар LB, канамицин 50 мкг/мл, глюкоза 1%), использовали для подготовки к культивированию в течение ночи в жидкой питательной среде LB, дополненной канамицином(50 мкг/мл) и 1% глюкозой. После приблизительно 15 ч роста в инкубаторе-шейкере данные культуры использовали для инокуляции соответствующей культуры. Сперхэкспрессия и очистка слитых белков - общая процедура А Среда LB с канамицином (30 мкг/мл) и 100 мкМ сульфата цинка была инокулирована культурой,культивированной в течение ночи. Культуру инкубировали при 37 С до достижения значения оптической плотности (OD) 0,60-0,80 при 600 нм. Затем добавляли IPTG до конечной концентрации в диапазоне 0,25-1 мМ. После инкубирования (3,5-20 ч) со встряхиванием при 25 С культуру центрифугировали в течение 25 мин при 6000 g. Бактериальные осадки ресуспендировали в буфере, содержащем KH2PO4 50 мМ, NaCl 0,5 M, имидазол 10 мМ, рН 7,4. Суспензию разрушали с помощью ультразвука на льду в течение 8 мин (амплитуда 40%, импульс 15 с, интервал 10 с). Полученный экстракт очищали от примесей с помощью центрифугирования в течение 40 мин при 20000 g, 4 С. Смола Ni-Сефароза (GE Healthcare) была предварительно обработана посредством уравновешивания буфером, который использовали для получения экстракта бактериальных клеток. Смолу затем инкубировали в течение ночи при 4 С с супернатантом, полученным после центрифугирования экстракта. Затем нагружали на колонку и отмывали с использованием 15-50 объемов буфера 50 мМ KH2PO4, 0,5 M NaCl, 20 мМ имидазол, рН 7,4. Полученный белок элюировали с колонки, используя имидазольный градиент в буфере 50 мМ KH2PO4 с 0,5 M NaCl, pH 7,4. Полученные фракции анализировали посредством электрофореза в SDS-ПТААГ. Соответствующие фракции объединяли и проводили диализ в течение ночи при 4 С против 50 мМ буфера Tris, рН 7,2, 150 мМ NaCl, 500 мМ L-аргинин, 0,1 мМ ZnSO4, 0,01% Tween 20, и в то же самое время метку Histag отщепляли с помощью тромбина (1:50). После отщепления тромбин отделяли от мишеневого слитого белка, используя смолу Benzamidine Sepharose. Чистоту данного продукта анализировали посредством электрофореза вSDS-ПААГ (Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982). Сперхэкспрессия и очистка слитых белков - общая процедура В Среда LB с канамицином (30 мкг/мл) и 100 мкМ сульфата цинка была инокулирована культурой,культивированной в течение ночи. Культуры инкубировали при 37 С до достижения значения оптической плотности (OD) 0,60-0,80 при 600 нм. Затем добавляли IPTG до конечной концентрации в диапазоне 0,5-1 мМ. После 20 ч инкубирования со встряхиванием при 25 С данную культуру центрифугировали в течение 25 мин при 6000 g. Бактериальные клетки после сверхэкспрессии были разрушены при помощи Френч-пресса в буфере, содержащем 50 мМ KH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 мМ имидазола, 5 мМ бета-меркаптоэтанола, 0,5 мМPMSF (фенилметилсульфонилфторид), рН 7,8. Полученный экстракт очищали от примесей посредством центрифугирования в течение 50 мин при 8000 g. Смолу Ni-Сефароза инкубировали в течение ночи с полученным супернатантом. Затем смолу с присоединенным белком загружали в хроматографическую колонку. Для вымывания фракций, содержащих несвязанные белки, данную колонку отмывали с использованием 15-50 объемов буфера, содержащего 50 мМ KH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 мМ имидазола, 5 мМ бетамеркаптоэтанола, 0,5 мМ PMSF (фенилметилсульфонил фторид), рН 7,8. Затем для вымывания большинства белков, специфически связанных с носителем, колонку отмывали с помощью буфера, содержащего 50 мМ KH2PO4, 0,5 M NaCl, 500 мМ имидазола, 10% глицерина, 0,5 мМ PMSF, рН 7,5. Полученные фракции анализировали посредством электрофореза в SDS-ПААГ (Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982). Фракции, содержащие мишеневый белок, объединяли и расщепляли тромбином (1 Ед на 4 мг белка, 8 ч при 16 С) для удаления полигистидиновой метки. Затем проводили диализ фракций против буферной смеси (500 мМ L-аргинина, 50 мМ Tris, 2,5 мМ ZnSO4, pH 7,4). Определение характеристик слитых белков посредством двухмерного (2-D) электрофореза Для получения дополнительных характеристик полученных белков и для выбора точных хроматографических условий были определены изоэлектрические точки белков. С этой целью использовали способ двухмерного (2-D) электрофореза в два этапа в соответствии со следующей схемой. Этап 1. Изоэлектрофокусирование белков в градиенте рН и денатурирующих условиях. Препараты белков в концентрациях 1-2 мг/мл осаждали посредством смешивания в соотношении 1:1 с осаждающим раствором, содержащим 10% трихлоруксусную кислоту и 0,07% бета-меркаптоэтанол в ацетоне. Данную смесь инкубировали в течение 30 мин при -20 С, а затем центрифугировали в течение 25 мин при 15000 g и 4 С. Супернатант удаляли и полученный осадок отмывали два раза с помощью холодного ацетона с 0,07% бета-меркаптоэтанолом. Затем остатки ацетона испаряли до отсутствия обнаруживаемого запаха. Белковый осадок суспендировали в 250 мл регидратационного буфера, содержащего 8M мочевину, 1% CHAPS, 15 мМ DTT, 0,5% амфолита (GE Healthcare) с профилем значений рН 3-11 или 6-11, в зависимости от используемого в дальнейшем стрипа. Белковый раствор помещали в керамическую камеру для изоэлектрофокусирования с последующим 13 см DryStrip (GE Healthcare) с соответствующим профилем (3-11 или 6-11). Все было покрыто слоем минерального масла. Все камеры были помещены в аппарат Ettan IPGphor III, в котором проводили изоэлектрофокусирование в соответствии со следующей программой, предназначенной для размеров данного стрипа и данного профиля рН: 16 ч дегидрирования при 20 С. Фокусирование в электрическом поле при фиксированном градиенте рН Затем данный стрип, содержащий сконцентрированные белки, отмывали в течение 1 мин в деионизированной воде, окрашивали с помощью кумасси бриллиантового и затем обесцвечивали и архивировали в виде изображения для маркировки положения белков. Обесцвеченный стрип уравновешивали 215 мин с помощью буфера со следующим составом: 50 мМ Tris-HCl рН 8,8, 6 M мочевина, 1% DTT, 2%SDS, 30% глицерин. Этап 2. Разделение во втором направлении посредством SDS-ПААГ. Данный стрип помещали на 12,5% полиакриламидный гель, содержащий одну лунку на стандартный размер, и затем разделение осуществляли в аппарате для SDS-ПААГ, при напряжении 200 V в течение 3 ч. Гель окрашивали с использованием кумасси бриллиантового, затем архивировали с использованием применяемой шкалы. Белки были идентифицированы посредством определения их веса, исходя из стандарта размеров, и их IPI была прочитана в шкале 6-11, на основании кривых, предоставленных изготовителем (GE Healthcare) (соотношение рН к % длины стрипа от конца, обозначенного как анод) или в шкале 3-11, на основании кривой, полученной экспериментально с помощью калибровочного набора для изоэлектрофокусирования (GE Healthcare). Характерные примеры слитых белков по настоящему изобретению описаны ниже. Пример 1. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:1 Белок с последовательностью SEQ ID NO:1 представляет собой слитый белок, имеющий длину 194 аминокислоты и массу 22,7 кДа, в котором на N-конце последовательности TRAIL121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен 16-аминокислотный белок, происходящий из домена ВН 3 белка Вах(SEQ ID NO:30). На С-конце данной 16-аминокислотной последовательности эффекторного пептида прикреплена полиаргининовая последовательность, состоящая из 7 остатков Arg/R. Полиаргининовая последовательность содействует пенетрации клеточной мембраны и транспорту слитого белка внутрь данной клетки. Между полиаргининовой последовательностью и доменом TRAIL встроены последовательно друг за другом последовательности, распознаваемые урокиназой uPA (SEQ ID NO:52) и металлопротеазой ММР (SEQ ID NO:51), вследствие чего эффекторный пептид после интернализации слитого белка будет отщеплен в опухолевом окружении. Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:67, как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:1 Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК. Создавали плазмиду, содержащую данную кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штаммы E. coli BL21 (DE3) и Tuner (DE3) pLysS, оба приобретены в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 2. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:2 Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:2 представляет собой белок, имеющий длину 193 аминокислоты и массу 22,5 кДа, в котором на N-конце последовательности TRAIL121-2 81 в качестве эффекторного пептида прикреплен 16-аминокислотный пептид, происходящий из белка Bid (SEQ IDNO:31). Дополнительно, к С-концу эффекторного белка прикреплена полиаргининовая последовательность, состоящая из семи остатков Arg. Полиаргининовая последовательность содействует пенетрации клеточной мембраны и транспорту слитого белка внутрь клетки. Между полиаргининовой последовательностью и последовательностью TRAIL встроены последовательно друг за другом последовательности, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ ID NO:51) и урокиназой uPA (SEQ ID NO:52), вследствие чего эффекторный пептид после интернализации слитого белка будет отщеплен в опухолевом окружении. Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:68, как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2 Аминокислотную последовательность структуры, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. coli BL21 (DE3), приобретенный в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 3. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:3 Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:3 представляет собой белок, имеющий длину 303 аминокислоты и массу 34,2 кДа, в котором на С-конце последовательности TRAIL121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен гомолог рибонуклеазы RNase A (SEQ ID NO:32). Между полиаргининовой последовательностью и последовательностью TRAIL встроены последовательно друг за другом последовательности, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ ID NO:51) и урокиназой uPA (SEQID NO:52), вследствие чего эффекторный пептид после интернализации слитого белка будет отщеплен в опухолевом окружении. Белок также содержит между последовательностью домена TRAIL и последовательностью участков расщепления гибкий глицин-сериновый линкер GGSG (SEQ ID NO:57). Более того, на С-конце эффекторного пептида белок содержит последовательность KEDL (SEQ ID NO:56), нацеленную на эндоплазматический ретикулум, будучи также С-концевой областью всей конструкции. Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:69, как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3 Аминокислотную последовательность структуры, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штамм Е. coli BL21 (DE3), приобретенный в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 4. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:4 Белок с последовательностью SEQ ID NO:4 представляет собой слитый белок, имеющий длину 293 аминокислоты и массу 33,2 кДа, в котором на С-конце последовательности TRAIL121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен гомолог рибонуклеазы RNase A (SEQ ID NO:32). Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL присутствует гибкий глицин-сериновый линкерGGGSGGGS (SEQ ID NO:63). Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:70, как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:4 Аминокислотную последовательность структуры, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду,содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы Е. coli BL21DE3pLysSRIL, приобретенный в Stratagene, и Turner (DE3),приобретенный в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой,описанной выше. Пример 5. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:5 Белок с последовательностью SEQ ID NO:5 представляет собой слитый белок, имеющий длину 283 аминокислоты и массу 31 кДа, в котором на С-конце последовательности TRAIL121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплена последовательность цитохрома С (SEQ ID NO:33). Между последовательностью домена TRAIL и последовательностью эффекторного белка встроены последовательно друг за другом последовательности, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ ID NO:51) и урокиназой uPA (SEQ IDNO:52), вследствие чего эффекторный пептид после интернализации слитого белка будет отщеплен в опухолевом окружении. Белок также содержит между последовательностью домена TRAIL и последовательностью участков расщепления гибкий глицин-сериновый линкер GGSG (SEQ ID NO:57). Более того, на С-конце эффекторного пептида белок содержит последовательность KEDL (SEQ ID NO:56), нацеленную на эндоплазматический ретикулум, будучи также С-концевой областью всей конструкции. Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E.coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:71, как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:5 для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. coliTurner (DE3), приобретенный в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 6. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:6 Белок с последовательностью SEQ ID NO:6 представляет собой слитый белок, имеющий длину 407 аминокислоты и массу 45,2 кДа, в котором на С-конце последовательности TRAIL121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплена последовательность цитохрома С (SEQ ID NO:33). Между последовательностью домена TRAIL и последовательностью эффекторного белка присутствует последовательность, распознаваемая фурином (SEQ ID NO:53), и домен транслокации из Pseudomonas aeruginosa (SEQID NO:54). Белок также содержит гибкие линкеры: между последовательностью TRAIL и последовательностью участка расщепления, распознаваемого фурином, присутствует гибкий глицин-сериновый линкерGGGS (SEQ ID NO:58), между последовательностью участка расщепления, распознаваемого фурином, и транслокационным доменом из Pseudomonas aeruginosa присутствует гибкий серин-глициновый линкерASGG (SEQ ID NO:65) и между последовательностью транслокационного домена и последовательностью цитохрома С присутствует гибкий глицин-сериновый линкер GGGSGGG (SEQ ID NO:62). Кроме того, на С-конце домена эффекторного пептида белок содержит последовательность KEDL (SEQ IDNO:56), направленную на эндоплазматический ретикулум, которая представляет собой С-концевую область всей целой конструкции. Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:72, как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:6 Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую данную кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. coli Turner (DE3), приобретенный в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 7. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:7 Белок с последовательностью SEQ ID NO:7 представляет собой слитый белок, имеющий длину 409 аминокислот и массу 46,1 кДа, в котором на N-конце последовательности TRAIL114-281 в качестве эф- 22023005 фекторного пептида прикреплена последовательность гранзима В (SEQ ID NO:34). Между последовательностью домена TRAIL и последовательностью эффекторного пептида гранзима В присутствует последовательность участка расщепления фурина (SEQ ID NO:53), дополнительно фланкированная гибкими глицин-сериновыми линкерами GGGGS (SEQ ID NO:59). Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:73, как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:7 Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую данную кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм E. coli Turner (DE3), приобретенный в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 8. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:8 Белок с последовательностью SEQ ID NO:8 представляет собой слитый белок, имеющий длину 405 аминокислот и массу 45,7 кДа, в котором на С-конце последовательности TRAIL114-281 в качестве эффекторного пептида прикреплена последовательность гранзима В (SEQ ID NO:34). Между последовательностью домена TRAIL и последовательностью эффекторного пептида присутствует последовательность участка расщепления фурина (SEQ ID NO:53), дополнительно отделенная от последовательностей гранзима В и TRAIL с помощью гибких глицин-сериновых линкеров GGGS (SEQ ID NO:58) и GGGGS(SEQ ID NO:59) соответственно. Кроме того, на С-конце эффекторного пептида белок содержит последовательность KDEL, направленную на эндоплазматический ретикулум, которая представляет собой Сконцевую область всей цельной конструкции. Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экс- 23023005 прессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:74, как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:8 Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. coliTurner (DE3) pLysS, приобретенный в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 9. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:9 Белок с последовательностью SEQ ID NO:9 представляет собой слитый белок, имеющий длину 187 аминокислот и массу 21,9 кДа, в котором на N-конце последовательности TRAIL121-281 9-аминокислотный пептид, полученный из белка Nur77 (SEQ ID NO:35), прикреплен в качестве эффекторного пептида, полиаргининовая последовательность, состоящая из семи остатков Arg, дополнительно присоединена к С-концу эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL присутствует последовательность участков расщепления металлопротеазы ММР (SEQ ID NO:51) и урокиназы uPA (SEQ ID NO:52). Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:75, как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:9 Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм E. coliRosetta (DE3), приобретенный в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 10. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:10 Белок с последовательностью SEQ ID NO:10 представляет собой слитый белок, имеющий длину 193 аминокислоты и массу 22,4 кДа, в котором на N-конце последовательности TRAIL121-281 16 аминокислотный пептид, содержащий домен ВН 3 белка Bak (SEQ ID NO:36), прикреплен в качестве эффекторного пептида, проникающая через мембрану полиаргининовая последовательность, состоящая из семи остатков Arg, дополнительно присоединена к С-концу эффекторного пептида. Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью TRAIL присутствуют последовательности участков расщепления для металлопротеазы ММР (SEQ ID NO:51) и урокиназы uPA (SEQ ID NO:52). Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:76,как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:10 Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штаммы E. coliBL21 (DE3) и Tuner (DE3) pLysS, приобретенные в Novagen. Белок отделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 11. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:11 Белок с последовательностью SEQ ID NO:11 представляет собой слитый белок, имеющий длину 204 аминокислоты и массу 24,3 кДа, в котором на N-конце последовательности TRAIL 121-281 домен ВН 3 молекулы PUMA/BBC3 (SEQ ID NO:37) прикреплен в качестве эффекторного пептида, полиаргининовая последовательность, состоящая из 9 остатков Arg, присоединена к С-концу эффекторного пептида. Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью TRAIL конструкция содержит также последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами uPA (SEQ ID NO:52) и ММР (SEQ ID NO:51). Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 3, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:77,как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:11 Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штаммы E. coliBL21 (DE3) и Tuner (DE3) pLysS, приобретенные в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 12. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:12 Белок с последовательностью SEQ ID NO:12 представляет собой слитый белок, имеющий длину 372 аминокислоты и массу 41 кДа, в котором на С-конце последовательности TRAIL121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен белок PUMA (SEQ ID NO:38). Между последовательностью TRAIL и последовательностью эффекторного пептида присутствует последовательность участков расщепления,распознаваемая металлопротеазой ММР (SEQ ID NO:51) и урокиназой uPA (SEQ ID NO:52), которые дополнительно отделены от последовательности TRAIL гибким глицин-сериновым линкером GGSGG(SEQ ID NO:60). Кроме того, на С-конце эффекторный пептид содержит последовательность KEDL (SEQID NO:56), направленную на эндоплазматический ретикулум и образующую С-концевую область всей конструкции. Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 3, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:78,как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:12 Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы Е. coli В.21 (DE3), приобретенный в Novagen, и BL21DE3pLysSRIL, приобретенный в Stratagene. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 13. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:13 Белок с последовательностью SEQ ID NO:13 представляет собой слитый белок, имеющий длину 493 аминокислоты и массу 53,4 кДа, в котором на С-конце последовательности 121-281 TRAIL последовательность белка PUMA (SEQ ID NO:38) прикреплена в качестве эффекторного пептида. Кроме того,между последовательностью TRAIL и последовательностью белка PUMA присутствует последовательность домена транслокации из Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:54), который дополнительно отделен от последовательности TRAIL идущими подряд последовательностями: гибкого глицин-серинового линкера GGGGS (SEQ ID NO:59), участка расщепления фурина (SEQ ID NO:53) и гибкого аланин-глицинсеринового линкера ASGG (SEQ ID NO:65), а от белка PUMA - гибким глицин-сериновым линкеромGGSGG (SEQ ID NO:60). Кроме того, на С-конце эффекторного пептида слитый белок содержит последовательность KEDL (SEQ ID NO:56), направленную на эндоплазматический ретикулум, которая является С-концевой областью всей конструкции. Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 3, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:79,как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:13 Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы E. coli В.21 (DE3), приобретенный в Novagen, и BL21DE3pLysSRIL, приобретенный в Stratagene. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 14. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:14 Белок с последовательностью SEQ ID NO:14 представляет собой слитый белок, имеющий длину 186 аминокислот и массу 21,5 кДа, в котором на N-конце последовательности TRAIL 121-281 8 аминокислотный фрагмент белка SMAC/Diablo (SEQ ID NO:39) прикреплен в качестве эффекторного пептида, полиаргининовая последовательность, состоящая из семи остатков Arg, дополнительно присоединена к С-концу эффекторного пептида. Кроме того, между полиаргининовой последовательностью и последовательностью TRAIL белок содержит последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами uPA (SEQ ID NO:52) и ММР (SEQ ID NO:51). Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 3, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:80,как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:14 Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы E. coliBL21 (DE3) или Tuner (DE3), приобретенные в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 15. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:15 Белок с последовательностью SEQ ID NO:15 представляет собой слитый белок, имеющий длину 191 аминокислоту и массу 22,2 кДа, в котором на N-конце последовательности TRAIL121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен буфорин IIb (SEQ ID NO:40). Кроме того, между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL белок содержит последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами uPA (SEQ ID NO:52) и ММР (SEQ ID NO:51). Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 3, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, представлены соответственно последовательностями SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:81,как показано ниже. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:15 Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм E. coliTuner (DE3), приобретенный в Novagen. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше. Пример 16. Слитый белок с последовательностью SEQ ID NO:16 Белок с последовательностью SEQ ID NO:16 представляет собой слитый белок, имеющий длину 279 аминокислот и массу 31,7 кДа, в котором на С-конце последовательности TRAIL121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен белок онконаза (SEQ ID NO:41). Между последовательностью TRAIL и последовательностью эффекторного пептида присутствуют последовательности участков расщепления,- 29