Конструкты, связывающиеся с ron, и способы их использования

В описании представлены иммуноглобулиновые связывающие молекулы, специфически связывающиеся с макрофагстимулирующим рецептором человека (MST1R, также называемый здесь рецептором Нантского происхождения или RON), включая антитела и моноспецифичные и мультиспецифичные одноцепочечные связывающие белки, содержащие один или более других доменов, например один или более доменов константной области антител. Кроме того, представлены варианты терапевтического применения таких связывающих белков, например, для лечения рака и воспалительных расстройств.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭМЕРДЖЕНТ ПРОДАКТ ДИВЕЛОПМЕНТ СИЭТЛ, ЛЛС (US) Перекрестная ссылка на родственную заявку Настоящая заявка претендует на приоритет согласно 35 U.S.С. 119(е) предварительной патентной заявки США 61/290840, поданной 29 декабря 2009 года; предварительной патентной заявки США 61/365266, поданной 16 июля 2010 года; и предварительной патентной заявки США 61/366743, поданной 22 июля 2010 года, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки во всех отношениях. Положение, касающееся перечня последовательности Перечень последовательностей, связанный с настоящей заявкой, представлен в текстовом формате взамен бумажной копии и включен в патентное описание посредством ссылки. Имя текстового файла,содержащего перечень последовательности, 910180424PCSEQUENCELISTING.txt. Этот текстовый файл имеет размер 746 KB, создан 29 декабря 2010 года и представлен в электронном виде через систему подачи электронных документов EFS-Web одновременно с подачей патентной заявки. Уровень техники Область техники Описание в целом относится к области связывающих молекул и их терапевтическому применению и, в частности, к связывающему полипептиду, содержащему связывающий домен, связывающийся сRON (рецептором Нантского происхождения, recepteur d'origine Nantaise), также называемым здесь макрофагстимулирующим рецептором 1 или MST1R, и один или более других доменов, например один или более доменов константных областей антител. Описание уровня техники в данной областиRON (recepteur d'origine Nantaise, также известный как MST1R) представляет собой рецепторную тирозинкиназу, необходимую для эмбрионального развития, а также играющую важную роль в воспалительных ответных реакциях (Camp et al. Ann. Surg. Oncol. 12:273-281 (2005. RON может участвовать в контроле ответов макрофагов во время воспаления (Cornell, P.H. et al., Genes Funct. 1997 Feb;1(1):69-83).RON главным образом экспрессируется в клетках-производных эпителия и предполагают, что RON, как и ряд других рецепторных тирозинкиназ, может участвовать в развитии эпителиальных злокачественных опухолей (Wang et al. Carcinogensis 23:1291-1297 (2003. Рецепторные тирозинкиназы обычно состоят из внеклеточного домена, связывающегося с внеклеточными лигандами, например, факторами роста и гормонами, а также внутриклеточного домена, включающего функциональный киназный домен. Рецепторные тирозинкиназы делятся на ряд классов, и RON является членом семейства рецепторных тирозинкиназ МЕТ, которое также включает Stk, c-Met и c-Sea(Camp et al. Ann. Surg. Oncol. 12:273-281 (2005. RON и c-Met являются единственными членами этого семейства, присутствующими у человека, и гомологичны друг другу в целом приблизительно на 65%. CMet представляет собой рецептор фактора роста гепатоцитов/рассеивающего фактора (HGF/SF) и достаточно хорошо охарактеризован как протоонкоген.RON представляет собой трансмембранный гетеродимер, состоящий из одной цепи, происходящей от одноцепочечного предшественника, соединенной воедино несколькими дисульфидными связями. Внутриклеточный фрагмент RON содержит киназный домен и регуляторные элементы. Внеклеточная область характеризуется присутствием домена семафорина (sema) (фрагмент размером приблизительно 500 аминокислот с несколькими высококонсервативными остатками цистеина), PSI-домена (плексин,семафорины, интегрины) и четырех иммуноглобулиноподобных структур. Кроме того, идентифицирован лиганд RON, макрофагстимулирующий белок (MSP), на 40% гомологичный лиганду c-Met-HGF/SF. MSP и HGF принадлежат к семейству плазминогена-протромбина, характеризующемуся доменами типа "двойная петля". MSP также связан со злокачественными опухолями. Например, Welm et al. наблюдали связь между MSP и метастазированием и плохим прогнозом при раке молочной железы (PNAS 104:7507-7575(2007.RON и c-Met являются единственными рецепторными тирозинкиназами, несущими внеклеточныеsema-домены, и продемонстрировано, что sema-домен RON включает сайт связывания с лигандом. Связывание MSP с RON вызывает фосфорилирование в пределах киназного домена RON, приводящее к повышению киназной активности RON. В альтернативном случае 1-интегрины могут фосфорилировать и активировать RON по Src-зависимому пути (Camp et al. Ann. Surg. Oncol. 12:273-281 (2005. АктивацияRON инициирует ряд сигнальных путей, включая сигнальные пути PI3-K, Ras, src, -катениновый и Fak. Многие из сигнальных путей, активируемых RON, вовлечены в процессы, связанные с раком, например,в пролиферацию и ингибирование апоптоза.RON сам по себе также вовлечен в развитие рака по ряду причин. Например, RON экспрессируется в ряде опухолей человека, включая опухоли молочной железы, мочевого пузыря, ободочной кишки, яичников и поджелудочной железы. Кроме того, in vitro показано, что RON усиливает пролиферацию и подвижность клеток. Кроме того, RON индуцирует рост опухолей и метастазирование у мышей, трансгенных по RON (Waltz et al. Cancer Research 66:11967-11974 (2006. Таким образом, существует необходимость в веществах, ингибирующих сигнальные пути RON. Сущность изобретения Один из аспектов настоящего описания представляет собой иммуноглобулиновый связывающий полипептид, специфически связывающийся с RON человека, причем указанный иммуноглобулиновый связывающий полипептид включает (а) VL-домен, включающий i. аминокислотную последовательностьNO:144, аминокислотную последовательность CDR2 SEQ ID NO:145 и аминокислотную последовательность CDR3 SEQ ID NO:146; или (с) VL согласно (а) и VH согласно (b). В одном из вариантов воплощения VL-домен включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:80 или 152, а VHдомен включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOS:81, 153 и 176. В еще одном варианте воплощения VL и VH-домены являются гуманизированными. В некоторых вариантах воплощения гуманизированный VL-домен включает аминокислотную последовательность любой из SEQ IDNOS:82, 83 и 154, а гуманизированный VH-домен включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOS:84-86, 155 и 156. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый связывающий полипептид представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела. При этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела имеет нечеловеческое происхождение, является химерным, гуманизированным, или антителом, или антигенсвязывающим фрагментом антитела человека. В одном из вариантов воплощения иммуноглобулинового связывающего полипептида согласно настоящему описанию антитело, или антигенсвязывающий фрагмент антитела нечеловеческого происхождения, или химерное антитело, или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит VL-домен, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:80 или 152, и VH-домен, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOS:81, 153 и 176. В одном из вариантов воплощения иммуноглобулинового связывающего полипептида согласно настоящему описанию гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент гуманизированного антитела содержит VL-домен, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ IDNOS:82, 83 или 154, и VH-домен, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ IDNOS:84-86, 155 и 156. В другом варианте воплощения иммуноглобулинового связывающего полипептида согласно настоящему описанию антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит VL-домен, по меньшей мере на 90% идентичный любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOS:80, 82,83, 152 или 154, и VH-домен, по меньшей мере на 90% идентичный любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOS:81, 84-86, 153, 155, 156 и 176. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулинового связывающего полипептида согласно настоящему описанию связывающий полипептид выбирают из группы, состоящей из Fab-фрагмента,F(ab')2-фрагмента, scFv-, dAb- и Fv-фрагмента. В некоторых вариантах воплощения scFv содержит VLдомен, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:80 и 152, и VH-домен,включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOS:81, 153 и 176. В другом варианте воплощения scFv является гуманизированным и содержит VL-домен, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOS:82, 83 и 154, и VH-домен, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOS:84-86, 155 и 156. В одном из вариантов воплощения иммуноглобулинового связывающего полипептида согласно настоящему описанию иммуноглобулиновый связывающий полипептид представляет собой иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера (SMIP). В некоторых вариантах белок SMIP имеет человеческое или нечеловеческое происхождение, или является химерным или гуманизированным. В некоторых вариантах воплощения белок SMIP нечеловеческого происхождения или химерный белок SMIP содержит VL-домен, включающий аминокислотную последовательность любой изSEQ ID NOS:80 и 152, и VH-домен, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ IDNOS:81, 153 и 176. В некоторых других вариантах воплощения гуманизированный белок SMIP содержитVL-домен, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOS:82, 83 и 154, и VHдомен, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOS:84-86, 155 и 156. В других вариантах воплощения иммуноглобулиновые связывающие полипептиды согласно настоящему описанию включают шарнирный домен, имеющий аминокислотную последовательность любой из SEQID NOS:349-366 и 420-475. В других вариантах воплощения иммуноглобулиновые связывающие полипептиды согласно настоящему описанию включают подобласть константного домена иммуноглобулина,включающую СН 2 СН 3-домен lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2 или IgD. В одном из других вариантов воплощения подобласть константного домена иммуноглобулина включает СН 2 СН 3 lgG1 человека. В одном из вариантов воплощения СН 2 lgG1 человека включает аминокислотную последовательность SEQID NO:241, а СН 3 lgG1 человека включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:319. В некоторых вариантах воплощения белок SMIP включает последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности любой из аминокислотных последовательностейSEQ ID NOS:94-114 и 160-168. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулинового связывающего полипептида согласно настоящему описанию иммуноглобулиновый связывающий полипептид содержится в первом одноцепочечном полипептиде, включающем первый домен гетеродимеризации, способный к ассоциации со вторым одноцепочечным полипептидом, включающим второй домен гетеродимеризации, не идентичный первому домену гетеродимеризации, причем ассоциированные первый и второй одноцепочечные полипептиды образуют полипептидный гетеродимер. В некоторых вариантах реализации полипептидный гетеродимер включает: первый одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:170, и второй одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35; первый одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:172, и второй одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27; первый одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:174, и второй одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29; первый одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:174, и второй одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32; первый одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:116, и второй одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35; первый одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:118, и второй одноцепочечный полипептид,включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27; первый одноцепочечный полипептид,включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:120, и второй одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29; или первый одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:120, и второй одноцепочечный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32. В одном из вариантов воплощения иммуноглобулинового связывающего полипептида согласно настоящему описанию иммуноглобулиновый связывающий полипептид содержится в одноцепочечном мультиспецифичном связывающем белке, включающем подобласть константного домена иммуноглобулина между первым связывающим доменом и вторым связывающим доменом, причем первый связывающий домен представляет собой домен, связывающий RON человека, согласно описанию здесь, а второй связывающий домен представляет собой домен, связывающий RON человека, согласно описанию здесь, или является специфичным по отношению к молекуле-мишени, отличающейся от RON человека. В некоторых вариантах воплощения константная подобласть иммуноглобулина представляет собой СН 2 СН 3 lgG1. В другом варианте воплощения константная подобласть иммуноглобулина расположена между первым линкерным пептидом и вторым линкерным пептидом. В другом варианте воплощения первый и второй линкерные пептиды независимо выбирают из линкеров, представленных в SEQ IDNOS:610-777. В другом варианте воплощения первый линкерный пептид включает шарнирный домен иммуноглобулина, а второй линкерный пептид включает область ножки пектина типа С II. В одном варианте воплощения иммуноглобулиновый связывающий полипептид включает следующую структуру: N-BD1-X-L2-BD2-C, где BD1 включает scFv, специфичный к RON человека; -Х- представляет собой -L1-СН 2 СН 3-, где L1 представляет собой шарнир иммуноглобулина lgG1, обладающий аминокислотной последовательностью, включающей любую из SEQ ID NOS:349-366, 420-475, и где-СН 2 СН 3- представляет собой область СН 2 СН 3 lgG1 человека или его вариант с отсутствием одной или более эффекторных функций; L2 представляет собой линкерный пептид, обладающий аминокислотной последовательностью, включающей любую из SEQ ID NOS:610-777; a BD2 представляет собой связывающий домен, специфичный к RON человека или к молекуле-мишени, отличающейся от RON человека. Один из аспектов настоящего описания представляет композицию, включающую один или более иммуноглобулиновых связывающих полипептидов согласно описанию здесь и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Еще один из аспектов настоящего описания представляет экспрессирующий вектор, способный к экспрессии иммуноглобулиновых связывающих полипептидов, согласно описанию здесь. Другой аспект настоящего описания представляет клетку-хозяина, включающую экспрессирующие векторы, способные к экспрессии иммуноглобулиновых связывающих полипептидов согласно описанию здесь. Еще один из аспектов настоящего описания представляет способ лечения рака, включающий введение в организм субъекта, нуждающегося в этом, терапевтически эффективного количества композиции,включающей один или более иммуноглобулиновых связывающих полипептидов согласно описанию здесь и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. При этом рак выбирают из группы,включающей рак поджелудочной железы, рак легких, рак ободочной кишки и рак молочной железы, или других видов рака согласно описанию здесь. Еще один из аспектов настоящего описания представляет способ лечения воспалительного рас-3 022984 стройства, включающий введение в организм субъекта, нуждающегося в этом, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей один или более иммуноглобулиновых связывающих полипептидов согласно описанию здесь и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Антитела мыши RON-e01 и RON-f01 специфически связывают RON человека и перекрестно реагируют с RON Macaca mulatta. Клетки NIH/3T3, трансфицированные пустым вектором (пунктир),RON человека (точечная линия) или RON Macaca mulatta (сплошная линия) обрабатывали вторичными антителами в чистом виде (А), 1 мг/мл IgG мыши (В), 1 мг/мл антител DX07 против RON (С), надосадочной жидкостью гибридомы RON-e01 против RON (D) или надосадочной жидкостью гибридомы RON-f01 против RON (E). Фиг. 2. SMIP мыши RON-e02 и RON-f02 связывают нативный RON Macaca mulatta на поверхности клеток 4MBr-5. Клетки 4MBr-5 обрабатывали вторичными антителами в чистом виде (пунктир), SMIPM0077 против CD79b (точечная линия) или SMIP против RON (сплошная линия). Фиг. 3. SMIP мыши RON-e и RON-f и молекулы Интерцепторы связывают нативный RON человека на поверхности клеток ВхРС-3. Клетки ВхРС-3 обрабатывали различными концентрациями молекулRON-e (А) или RON-f (В). Описание молекул SMIP и Интерцепторов и связанных с ними SEQ ID NOs см. в табл. 3 и 4. Фиг. 4. Антитела мыши RON-e01 и RON-f01 связывают различные эпитопы в пределах внеклеточного домена RON. Антитела RON-e01 из образцов надосадочной жидкости клонов гибридом (1-5) не связывают рекомбинантный белок Sema-PSI RON, что указывает на то, что эпитопы, распознаваемые RONе 01, частично или полностью находятся вне доменов Sema и PSI. Связывание рекомбинантного белкаSema-PSI RON наблюдали во всех образцах надосадочной жидкости клонов гибридом RON-f01 (A-M),содержавших измеряемые концентрации IgG. Образцы "только разбавитель" в каждом анализе представляли фоновое связывание, при котором в качестве образца использовали только разбавитель сыворотки. В качестве положительного контроля в обоих вариантах твердофазного ИФА при измерении IgG и связывании рекомбинантного Sema-PSI RON использовали 250 нг/мл антител против RON человека (RDSystems МАВ 691, Миннеаполис, штат Миннесота, США). Фиг. 5. Молекулы RON-e и RON-f связываются с различными эпитопами RON. RON-e01: антитела мыши; RON-f02: SMIP против RON; DX07: -цепь антитела против RON (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Kpyc, штат Калифорния, США). Фиг. 6 А. Антитела RON-e01 и YAE-Интерцепторы RON-e05 могут ингибировать MSPиндуцированное фосфорилирование RON, Akt и MAPK. Фиг. 6 В. Антитела RON-f01, SMIP RON-f02 и Интерцепторы второго поколения RON-f03 могут ингибировать MSP-индуцированное фосфорилирование RON, Akt и MAPK. Фиг. 7. Гуманизированные SMIP RON-e и RON-f связывают нативный RON человека на поверхности клеток MDA-MB-453. Клетки MDA-MB-453 обрабатывали различными концентрациями молекулRON-e (А) или RON-f (В). Гуманизированные SMIP обладали сопоставимой связывающей активностью по сравнению с эквивалентными им антителами мыши. Фиг. 8 А. Гуманизированные SMIP RON-f могут ингибировать MSP-индуцированное фосфорилирование RON, Akt и MAPK в клетках MDA-MB-453. Гуманизированные SMIP RON-f при применении во время стадии блокирования (1 ч) с последующей имитационной стимуляцией вызывают минимальное фосфорилирование RON, но не Akt или MAPK. Фиг. 8 В. Гуманизация SMIP мыши RON-f02 снижает фосфорилирование рецептора в ответ на применение SMIP во время этапа стимуляции (20 мин). SMIP мыши RON-f02 стимулируют фосфорилирование RON, но не следующее по ходу каскада фосфорилирование Akt или МАРК. Гуманизированные SMIPRON-f07h24 и RON-f08h25 вызывают пониженное фосфорилирование RON по сравнению с SMIP мыши. Вызывал интерес высокий уровень фосфорилирования следующего по ходу каскада эффекторного белка,наблюдавшегося в ответ на MSP-индуцированную активацию RON и не наблюдавшегося после SMIPиндуцированного фосфорилирования рецептора RON. Фиг. 9. Биспецифические белки, попарно соединяющие связывающий домен гуманизированногоRON-f со связывающим доменом антител против CD3, специфически направляют лизис клетокмишеней, экспрессирующих антиген RON, опосредуемый цитотоксическими Т-клетками. Клеткимишени MDA-MB-453 (А) или Дауди (В) насыщали хромом-51 и инкубировали с повышающимися концентрациями биспецифичных белков в присутствии очищенных Т-клеток человека в соотношении 10:1 к клеткам-мишеням. После инкубирования в течение 4 ч при 37 С оценивали лизис клеток-мишеней по высвобождению хрома-51 в надосадочную жидкость. Клетки MDA-MB-453, линии метастазирующей карциномы молочной железы человека экспрессируют RON, но не CD19, в то время как клетки Дауди,линии лимфомы Беркитта человека экспрессируют CD19, но не RON. Лизис клеток-мишеней обеих линий происходил только при инкубировании вместе с Т-клетками и биспецифичным белком, связывающим антиген, экспрессируемый клетками-мишенями. Если биспецифичный белок не связывался с клетками-мишенями (т.е., биспецифичный белок против RONпротив CD3 с клетками Дауди), цитотоксич-4 022984 ности по отношению к клеткам-мишеням не наблюдали. Данные представляют собой среднее значение для повторов +/- стандартная ошибка среднего (СОС, SEM). На фиг. 10 А и 10 В показано связывание биспецифичных конструктов против RON и против CD3(полипептидный гетеродимер S0268 и белок Scorpion S0266) с клетками MDA-MB-453 (А) и с выделенными Т-клетками (В). На фиг. 11 А и 11 В показана направленная Т-клеточная цитотоксичность, индуцированная биспецифичными полипептидными гетеродимерами TSC054, TSC078, TSC079 и S0268 в ходе анализа с высвобождением хрома (51Cr) с (А) клетками Дауди (RON-, CD19+) или (В) клетками ВхРС-3 (RON+, CD19-). Подробное описание Заголовки разделов, использованные здесь, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие описанный объект изобретения. Все документы или части документов, цитируемые здесь, включая патенты, патентные заявки, статьи, книги и монографии, но не ограничиваясь ими, недвусмысленным образом полностью включены в настоящую заявку для всех целей. В случае если один или несколько включенных документов или частей документов содержат определение термина, противоречащее определению этого термина в настоящей заявке, преимущественную силу имеет определение, содержащееся в настоящей заявке. Настоящее описание в целом относится к области связывающих молекул и их терапевтическому применению и, в частности, к иммуноглобулиновому связывающему полипептиду, состоящему из связывающего домена, связывающегося с макрофагстимулирующим рецептором 1 (MST1R, также называемым здесь (рецептором Нантского происхождения или RON) и одного или нескольких других доменов,например, одного или нескольких доменов константных областей антител. В соответствии с подробным описанием, приведенным ниже, связывающие белки могут представлять собой любой белок из ряда различных структур, например, антител и их антиген-связывающих фрагментов, SMIP (SMIP), PIMS, гибридных белковых структур Xceptor, SCORPION и Интерцептор. Следует понимать, что в настоящем описании любой диапазон концентраций, процентный диапазон, диапазон соотношений или диапазон целых чисел включает любое целое число в пределах указанного диапазона и, если это целесообразно, его дробные части (например, одну десятую и одну сотую целого), если не указано иное. Кроме того, следует понимать, что любой численный диапазон, указанный здесь по отношению к любому физическому параметру, например, размеру или толщине субъединиц полимера, включает любое целое число в пределах указанного диапазона, если не указано иное. Как используется здесь, "приблизительно" означает 20% от указанного диапазона, значения или структуры,если не указано иное. Следует понимать, что термины "один", "тот или иной" здесь означают "один или несколько" указанных компонентов, если не указано иное. Следует понимать, что использование выбора из нескольких возможностей (например, "или") означает один из вариантов, оба варианта или любую их комбинацию. Как используется здесь, термины "включать" и "содержать" используются на равных основаниях. Кроме того, следует понимать, что отдельные гибридные белки, являющиеся производными различных комбинаций компонентов (например, доменов) и заместителей, описанных здесь, описываются в настоящей заявке в той же степени, как если бы каждый гибридный белок описывали отдельно. Таким образом, выбор конкретных компонентов отдельных гибридных белков находится в рамках настоящего изобретения. Как используется здесь, полипептид или белок "состоит главным образом из" нескольких доменов(например, связывающего домена, который специфически связывает мишень, шарнира, домена димеризации или гетеродимеризации и фрагмента области константного Fc-домена), если другие фрагменты полипептида или белка (например, аминокислоты, находящиеся на N-или С-конце или между двумя доменами) совместно составляют не более 20% (например, не более 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%) длины полипептида или белка и не оказывает существенного влияния (т.е. не снижает активность более чем на 50%, например, более чем на 40, 30, 25, 20, 15, 10 или 5%) на активность различных доменов (например,активность связывания связывающего домена с мишенью, активность фрагмента Fc-области и способности домена гетеродимеризации способствовать гетеродимеризации). В некоторых вариантах воплощения полипептид или белок (например, гибридный полипептид или одноцепочечный гибридный полипептид) состоит главным образом из связывающего домена, специфически связывающегося с мишенью, домена гетеродимеризации, шарнира и фрагмента Fc-области, и может включать соединяющие аминокислоты,расположенные на N- и/или С-конце белка или между двумя различными доменами (например, между связывающим доменом и доменом гетеродимеризации, между доменом гетеродимеризации и шарниром и/или между шарниром и фрагментом Fc-области)."Связывающий домен" или "связывающая область", как используется здесь, относится к белку, полипептиду, олигопептиду или пептиду, обладающему способностью специфически распознавать и связываться с мишенью (например, RON). Связывающий домен включает любой природный, синтетический, полусинтетический или рекомбинантный партнер по связыванию для биологической молекулы или другой интересующей мишени. Типичные связывающие домены включают одноцепочечные вариабельные области антител (например, домены антител sFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), внеклеточные домены рецепторов (например, RON) или лиганды (например, цитокины, хемокины). Известно большое количество аналитических методик для идентификации связывающих доменов согласно настоящему описанию,специфически связывающих конкретную мишень, включая вестерн-блот, твердофазный ИФА и анализ с использованием устройств Biacore. Связывающий домен (или полипептид, включающий связывающий домен) "специфически связывает" мишень, если он связывает мишень со сродством или Ka (т.е. равновесной константой ассоциации определенного связывающего взаимодействия, измеряемой в 1/М), равным или превышающим 105 М-1, и при этом не связывает в значительной степени другие компоненты, присутствующие в тестируемом образце. Связывающие домены (или полипептиды, включающие связывающие домены) можно классифицировать как связывающие домены "с высоким сродством" и связывающие домены "с низким сродством". Связывающие домены "с высоким сродством" (или полипептиды, включающие связывающие домены) относятся к связывающим доменам с Ka, равным по меньшей мере 107 М-1, по меньшей мере 108 М-1, по меньшей мере 109 М-1, по меньшей мере 1010 М-1, по меньшей мере 1011 М-1, по меньшей мере 1012 М-1 или по меньшей мере 1013 М-1. Связывающие домены "с низким сродством" (или полипептиды,включающие связывающие домены) относятся к связывающим доменам с Ka до 107 М-1, до 106 М-1, до 105 М-1. В качестве альтернативы сродство можно определить как равновесную константу диссоциации(Kd) определенного связывающего взаимодействия, измеряемой в М (например, от 10-5 М до 10-13 М). Сродство связывающих доменов полипептидов и гибридных белков согласно настоящему описанию можно легко определить с помощью общепринятых методик (см., например, Scatchard et al. (1949) Ann."Иммуноглобулиновый связывающий полипептид" или "иммуноглобулиновый связывающий белок" согласно описанию здесь относится к полипептиду, включающему, по меньшей мере, одну область иммуноглобулина, например, домен VL, VH, CL, CH1, СН 2, СН 3 и СН 4. Область иммуноглобулина может представлять собой область иммуноглобулина дикого типа или модифицированную область иммуноглобулина. Типичные иммуноглобулиновые связывающие полипептиды включают одноцепочечные вариабельные фрагменты антител (scFv) (см., например, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 587983, 1988), иммунофармацевтические средства на основе модульных белков малого размера (SMIP) (см. публикации патентов США 2003/0133939, 2003/0118592 и 2005/0136049), PIMS-белки (см. публикацию РСТ-заявкиWO 2009/023386) и многофункциональные связывающие белки (например, гибридные белки SCORPION и Xceptor) (см., например, публикацию РСТ-заявкиWO 2007/146968, публикацию патентной заявки США 2006/0051844 и патент США 7166707). Иммуноглобулиновые связывающие полипептиды согласно изобретению включают по меньшей мере один RON-связывающий домен. Здесь описаны множественные иммуноглобулиновые связывающие полипептидные конструкты, включая, например, конструкт на основе антител, белковый конструктSMIP , конструкт SCORPION/Xceptor и гетеродимерный конструкт. Если иное не указано определенным образом, термины "иммуноглобулиновый связывающий полипептид", "связывающий полипептид","полипептид со связывающим доменом", "гибридный белок", "гибридный полипептид", "гибридный белок, производный от иммуноглобулина" и "RON-связывающий полипептид" следует рассматривать, как взаимозаменяемые. Каждый из терминов, понятных специалистам в области технологии антител, приведен в значении,принятом в данной области техники, если здесь недвусмысленным образом не приведено отличающееся определение. Известно, что антитела содержат вариабельные области, шарнирную область и константные домены. Обзор структуры и функций иммуноглобулинов приведен, например, в Harlow et al., Eds.,Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988). Например, термины "VL" и "VH" относятся к вариабельной связывающей области легкой и тяжелой цепи антитела, соответственно. Вариабельные связывающие области состоят из дискретных четко определенных подобластей, называемых "гипервариабельными областями" (CDR) и "каркасными областями"(FR).Термин "CL" относится к "константной области легкой цепи иммуноглобулина" или к "константной области легкой цепи", т.е., к константной области из легкой цепи иммуноглобулина. Термин "СН" относится к "константной области тяжелой цепи иммуноглобулина" или к "константной области тяжелой цепи", которая, в свою очередь, делится, в зависимости от изотипа антител, на домены СН 1, СН 2 и СН 3(IgA, IgD, IgG) или СН 1, СН 2, СН 3 и СН 4 (IgE, IgM). "Fab" (антигенсвязывающий фрагмент) представляет собой часть антитела, связывающуюся с антигеном, и включает вариабельную область и СН 1 тяжелой цепи, присоединенные к легкой цепи через дисульфидную связь, расположенную между цепями. Как используют здесь, "фрагмент константного домена Fc-области" или "фрагмент Fc-области" относится к сегменту константной области тяжелой цепи Fc-фрагмента (области "кристаллизуемого фрагмента" или Fc-области) антитела, который может включать один или более константных доменов, например, СН 2, СН 3, СН 4 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах воплощения фрагмент Fcобласти включает домены СН 2 и СН 3 антител IgG, IgA или IgD или любую их комбинацию, или домены СН 3 и СН 4 антител IgM или IgE или любую их комбинацию. В одном варианте воплощения структуры СН 2 СН 3 или СН 3 СН 4 получены из антител одного и того же изотипа, например, IgG, IgA, IgD, IgE илиIgM. Теоретически Fc-область отвечает за эффекторные функции иммуноглобулина, например, АКЦ (антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность), АКФ (антителозависимый клеточный фагоцитоз), КЗЦ (комплемент-зависимую цитотоксичность) и фиксацию комплемента, связывание с Fcрецепторами (например, CD16, CD32, FcRn), повышенный период полужизни in vivo по сравнению с полипептидами, не содержащими Fc-области, связывание белка А и, возможно, даже плацентарный перенос (см. Capon et al., Nature, 337:525 (1989. В некоторых вариантах воплощения фрагмент Fc-области,присутствующий в полипептидных гетеродимерах, согласно настоящему описанию способен опосредовать одну или более эффекторных функций. Кроме того, антитела содержат шарнирную последовательность, обычно расположенную между Fab и Fc-областью (однако нижняя секция шарнира может включать N-концевой фрагмент Fc-области). Теоретически, шарнир иммуноглобулина действует как гибкий спейсер, позволяющий Fab-фрагменту свободно двигаться в пространстве. В отличие от константных областей, шарниры структурно разнородны и различаются между различными классами и даже подклассами иммуноглобулинов как по последовательности, так и по размеру. Например, шарнирная область lgG1 человека свободно гнется, что позволяет Fab-фрагментам вращаться вокруг осей симметрии и двигаться в пределах шара, центр которого находится в области первого из двух дисульфидных мостиков, расположенных между тяжелыми цепями. По сравнению с этим шарнир lgG2 человека является относительно коротким и содержит жесткую полипролиновую двойную спираль, стабилизированную четырьмя дисульфидными мостиками, соединяющими тяжелые цепи, что ограничивает подвижность. Шарнир lgG3 человека отличается от других подклассов наличием уникальной удлиненной шарнирной области (приблизительно в четыре раза длиннее шарнираlgG1), содержащей 62 аминокислоты (включая 21 пролин и 11 цистеинов), образующей негибкую полипролиновую двойную спираль и обеспечивающей повышенную подвижность ввиду относительной удаленности Fab-фрагментов от Fc-фрагмента. Шарнир lgG4 человека короче, чем шарнир lgG1, но равен по размеру шарниру lgG2, а его гибкость является промежуточной по сравнению с гибкостью шарнировlgG1 и lgG2. Согласно кристаллографическим исследованиям шарнирный домен IgG можно функционально и структурно разделить на три области: верхнюю, сердцевинную или среднюю и нижнюю шарнирные области (Shin et al., Immunological Reviews 130:87 (1992. Типичные верхние шарнирные области включают EPKSCDKTHT (SEQ ID NO:194) в lgG1, ERKCCVE (SEQ ID NO:195) в lgG2, ELKTPLGDTT HT (SEQID NO:196) или EPKSCDTPPP (SEQ ID NO:197) в lgG3 и ESKYGPP (SEQ ID NO:198) в lgG4. Типичные средние или сердцевинные шарнирные области включают СРРСР (SEQ ID NO:199) в lgG1 и lgG2,CPRCP (SEQ ID NO:200) в lgG3 и CPSCP (SEQ ID NO:201) в lgG4. В то время как оказалось, что антитела lgG1, lgG2 и lgG4 содержат одиночную верхнюю и среднюю шарнирную область, lgG3 содержит четыре области одну за другой, одна из которых представляет собой ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ IDNO:202), а три представляют собой EPKSCDTPPP CPRCP (SEQ ID NO:203). Оказалось, что антитела IgA и IgD не содержат lgG-подобной сердцевинной области, и IgD содержит две верхних шарнирных области одну за другой (см. SEQ ID NOS:204 и 205). Типичные верхние шарнирные области антител lgA1 и lgA2 дикого типа приведены в SEQ ID NOS:206 и 207. В отличие от вышеприведенного, антитела IgE и IgM не содержат типичной шарнирной области и вместо этого содержат домен СН 2, обладающий свойствами, подобными свойствам шарнира. Типичные последовательности СН 2 IgE и IgM дикого типа, подобные верхней шарнирной области, приведены вVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP), соответственно. Как используют здесь, "шарнирная область" или "шарнир" относится к (а) шарнирной области иммуноглобулина (состоящей, например, из верхней и сердцевинной областей) или ее функциональному варианту, включающему шарниры иммуноглобулинов дикого типа и модифицированные шарниры иммуноглобулинов, (b) междоменной области лектина или ее функциональному варианту, (с) области ножки молекулы кластера дифференцировки (КД, CD) или ее функциональному варианту или (d) фрагменту рецептора поверхности клетки (междоменной области), соединяющему домены иммуноглобулинов типаV или С. Как используют здесь, "шарнирная область иммуноглобулина дикого типа" относится к природным аминокислотным последовательностям верхней и средней шарнирной области, находящимся между доменами СН 1 и СН 2 и соединяющим эти домены (для IgG, IgA и IgD) или находящимся между доменами СН 1 и СН 3 и соединяющим эти домены (для IgE и IgM), обнаруженным в тяжелой цепи антитела. В некоторых вариантах воплощения последовательность шарнирной области иммуноглобулина дикого типа является шарнирной областью иммуноглобулина человека, а в некоторых вариантах воплощения - включает шарнирную область IgG человека. Типичные шарнирные области иммуноглобулинов человека дикого типа приведены в SEQ ID NOS:206 (шарнир lgA1), 207 (шарнир lgA2), 210 (шарнир IgD), 211 (шарнир lgG1), 212 (шарнир lgG2), 213 (шарнир lgG3) и 214 (шарнир lgG4)."Модифицированная шарнирная область иммуноглобулина дикого типа" или "модифицированная шарнирная область иммуноглобулина" относится к (а) шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, в которой изменения аминокислотной последовательности составляют до 30% (например, до 25, 20,15, 10 или 5% аминокислотных замен или делеций), или (b) к фрагменту шарнирной области иммуноглобулина дикого типа длиной от приблизительно 5 аминокислот (например, приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот) до приблизительно 120 аминокислот (например,длиной от приблизительно 10 до приблизительно 40 аминокислот или от приблизительно 15 до приблизительно 30 аминокислот, или от приблизительно 15 до приблизительно 20 аминокислот, или от приблизительно 20 до приблизительно 25 аминокислот), в котором изменения аминокислотной последовательности составляют приблизительно до 30% (например, приблизительно до 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1% аминокислотных замен или делеций или их комбинаций), и который содержит сердцевинную шарнирную область IgG согласно SEQ ID NOS:199-201. В некоторых вариантах воплощения один или более остатков цистеина в шарнирной области иммуноглобулина дикого типа или модифицированной шарнирной области иммуноглобулина можно заменить одним или более остатками других аминокислот (например, серина, аланина). В других вариантах воплощения модифицированная шарнирная область иммуноглобулина может, в качестве альтернативы или дополнения, содержать остаток пролина, замещенный остатком другой аминокислоты (например, серина, аланина). Типичные модифицированные шарнирные области антител дикого типа, включающие такие модификации, приведены в SEQ ID NOS:215-227. В некоторых вариантах воплощения между шарниром и фрагментом Fc-области вследствие особенностей конструкции гибридных полипептидов могут располагаться одна или несколько (например,приблизительно 2-8) аминокислот (например, аминокислотных остатков, образованных за счет использования сайта фермента рестрикции во время конструирования молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридные белки). Как описано здесь, такие аминокислотные остатки можно называть "соединительными аминокислотами" или "соединительными аминокислотными остатками". Типичные соединительные аминокислоты показаны в последовательностях вариантов шарнира, приведенных в SEQ IDNOS:14-17 (например, в SEQ ID NO:14 С-концевые остатки SG представляют собой рассматриваемые соединительные аминокислоты; в SEQ ID NO:15 N-концевые остатки SS представляют собой рассматриваемые соединительные остатки; в SEQ ID NO:16 N-концевые остатки SS и С-концевые остатки SG представляют собой рассматриваемые соединительные аминокислоты; в SEQ ID NO:17 N-концевые остатки RT и С-концевые остатки SG представляют собой рассматриваемые соединительные аминокислоты). В некоторых вариантах воплощения соединительные аминокислоты расположены между фрагментом Fc-области, включающим домены СН 2 и СН 3, и доменом гетеродимеризации (СН 1 или CL). Эти соединительные аминокислоты также называют "линкером между СН 3 и СН 1 или CL", если они расположены между С-концом СН 3 и N-концом СН 1 или CL. Такой линкер может иметь длину, например,приблизительно 2-1012 аминокислот. В некоторых вариантах воплощения фрагмент Fc-области включает домены СН 2 и СН 3 lgG1 человека, в которых удален С-концевой остаток лизина СН 3 lgG1 человека. Типичные линкеры между СН 3 и СН 1 включают линкеры, приведенные в SEQ ID NO:799-801. Типичные линкеры между СН 3 и С включают линкеры, приведенные в SEQ ID NOS:802-804 (в которых Сконцевой аргинин линкеров в качестве альтернативы можно рассматривать как первый аргинин Ск). В некоторых вариантах воплощения присутствие таких линкеров или пар линкеров (например, SEQ IDNO:799 в качестве СН 3-СН 1-линкера в одном одноцепочечном полипептиде гетеродимера и SEQ IDNO:802 в качестве СН 3-С-линкера в другом одноцепочечном полипептиде гетеродимера; SEQ IDNO:800 в качестве СН 3-СН 1-линкера и SEQ ID NO:803 в качестве СН 3-С-линкера; и SEQ ID NO:801 в качестве СН 3-СН 1-линкера и SEQ ID NO:804 в качестве СН 3-С -линкера) стимулирует продукцию гетеродимера по сравнению с присутствием эталонного линкера, например, эталонной последовательностиKSR согласно SEQ ID NO:798 в обоих одноцепочечных полипептидах гетеродимера."Пептидный линкер" или "линкер вариабельного домена" относится к аминокислотной последовательности, соединяющей вариабельную область тяжелой цепи с вариабельной областью легкой цепи и выполняющей спейсерную функцию, совместимую со взаимодействием этих двух связывающих доменов, так, что полученный полипептид сохраняет сродство специфического связывания к той же молекуле-мишени, которая является мишенью антитела, содержащего те же вариабельные области легкой и тяжелой цепей. В некоторых вариантах воплощения линкер вариабельного домена состоит из приблизительно от пяти приблизительно до 35 аминокислот, и в некоторых вариантах воплощения - из приблизительно от 15 приблизительно до 25 аминокислот."Иммуноглобулиновая область дикого типа" или "иммуноглобулиновый домен дикого типа" относится к природной области или домену иммуноглобулина (например, природному VL, VH, шарниру, CL,CH1, СН 2, СН 3 или СН 4) различных классов или подклассов иммуноглобулинов (включая, например,lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE и IgM) и различных видов (включая, например, человека, овцу, мышь, крысу и других млекопитающих). Типичные СН 1-области человека дикого типа приведены вSEQ ID NOS:20, 228-235, Ск-область человека дикого типа - в SEQ ID NO:236, С-области человека дикого типа - в SEQ ID NO:237-240, СН 2-домены человека дикого типа - в SEQ ID NOS:241-249, СН 3-8 022984 домены человека дикого типа - в SEQ ID NOS:250-258, а СН 4-домены человека дикого типа - в SEQ ID"Модифицированная иммуноглобулиновая область" или "модифицированный иммуноглобулиновый домен" относится к области иммуноглобулина, последовательность которой идентична области или домену иммуноглобулина дикого типа (например, VL, VH, шарниру, CL, CH1, СН 2, СН 3 или СН 4 дикого типа) по меньшей мере, приблизительно на 75% (например, приблизительно на 80, 82, 84, 86, 88, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5%). Например, "модифицированная иммуноглобулиновая СН 1 область" или "модифицированная СН 1-область" относится к СН 1-области, последовательность которой идентична СН 1-области иммуноглобулина дикого типа (например, СН 1 человека) по меньшей мере приблизительно на 75% (например, приблизительно на 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5%). Аналогично, "модифицированный иммуноглобулиновый СН 2-домен" или "модифицированный СН 2-домен" относится к СН 2-домену, последовательность которого идентична СН 1-области иммуноглобулина дикого типа (например, СН 2 человека) по меньшей мере приблизительно на 75% (например, приблизительно на 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5%)."Идентичность последовательности", как используется здесь, относится к процентному соотношению аминокислотных остатков в одной из последовательностей, идентичных аминокислотным остаткам в другой последовательности эталонного полипептида после выравнивания последовательностей и, при необходимости, внедрения разрывов для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, без учета консервативных замен как части идентичности последовательностей. Значения процентной идентичности последовательностей получены с помощью программного обеспечения NCBIBLAST2,0, согласно определению в Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, при установленных по умолчанию значениях параметров. В некоторых вариантах воплощения модифицированный домен иммуноглобулина содержит только консервативные аминокислотные замены по сравнению с доменом иммуноглобулина дикого типа. В некоторых других вариантах воплощения модифицированный домен иммуноглобулина содержит только неконсервативные аминокислотные замены по сравнению с доменом иммуноглобулина дикого типа. В других вариантах воплощения модифицированный домен иммуноглобулина содержит как консервативные, так и неконсервативные аминокислотные замены."Консервативной заменой" в данной области техники называют замену аминокислоты на другую аминокислоту с аналогичными свойствами. Типичные консервативные замены хорошо известны в данной области техники (см., например, WO 97/09433, page 10, опубликованный 13 марта 1997 года;Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp,71-77; Lewin, Genes IV,Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8). В некоторых вариантах воплощения консервативная замена включает замену лейцина на серии. Как используют здесь, термин "производное" относится к модификации одного или более аминокислотных остатков пептида химическим или биологическим путем, с участием или без участия фермента, например, путем гликозилирования, алкилирования, ацилирования, образования эфира или амида. В целом, "производное" отличается от "аналога" тем, что исходный полипептид может являться начальным продуктом при получении "производного", в то время как при получении "аналога" исходный полипептид не обязательно используется в качестве начального материала. Химические, биологические или физические свойства производного могут отличаться от свойств исходного полипептида. Например, производное может быть более гидрофильным или обладать модифицированной реакционной способностью(например, CDR, несущий аминокислотную замену, изменяющую его сродство к мишени) по сравнению с исходным полипептидом. Как используется здесь, если не приведено иное, положение аминокислотного остатка в вариабельной области молекулы иммуноглобулина нумеруют согласно правилу нумерации Кабата (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutesof Health (1991, а положение аминокислотного остатка в константной области молекулы иммуноглобулина нумеруют согласно номенклатуре ЕС (Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94)."Рецептор" представляет собой молекулу белка, присутствующую в цитоплазматической мембране или в цитоплазме клетки, с которой может связываться сигнальная молекула (т.е. лиганд, например, гормон, нейромедиатор, токсин, цитокин). Связывание одиночной молекулы с рецептором приводит к конформационным изменениям рецептора, что обычно инициирует ответ клетки. Однако некоторые лиганды всего лишь блокируют рецептор, не индуцируя ответа (например, антагонисты). Некоторые рецепторные белки представляют собой периферические мембранные белки, рецепторы многих гормонов и нейромедиаторов представляют собой трансмембранные белки, внедренные в фосфолипидный бислой клеточных мембран, и еще один из основных классов рецепторов представляет собой внутриклеточные белки, например, рецепторы стероидных и интракринных пептидных гормонов. Термин "биологический образец" включает образец крови, биоптат, тканевый эксплантат, культуру органа, биологическую жидкость (например, сыворотку, мочу, ЦСЖ) или любую другую ткань или клетку или другой препарат, полученный у субъекта или из биологического источника. Субъект или биоло-9 022984 гический источник могут представлять собой, например, человека или животное, не являющееся человеком, первичную культуру клеток или адаптированную в культуре линию клеток, включая рекомбинантные клеточные линии, которые могут содержать интегрированные в хромосому или эписомные рекомбинантные нуклеотидные последовательности, гибридные линии соматических клеток, иммортализованные или иммортализуемые клеточные линии, дифференцированные или дифференцируемые клеточные линии, трансформированные клеточные линии и т.п. В других вариантах воплощения согласно настоящему описанию можно предполагать, что субъект или биологический источник страдают или подвержены риску заболевания, расстройства или состояния, включая злокачественное заболевание, расстройство или состояние или В-клеточное расстройство. В некоторых вариантах воплощения можно предполагать,что субъект или биологический источник страдают или подвержены риску гиперпролиферативного, воспалительного или аутоиммунного заболевания, а в некоторых вариантах воплощения согласно настоящему описанию может быть известно, что субъект или биологический источник не подвержены риску или наличию такого заболевания, расстройства или состояния."Лечение" или "улучшение" относится либо к терапевтическому лечению, либо к профилактическому/предохранительному лечению. Лечение является терапевтическим, если по меньшей мере один симптом заболевания у лица, получающего лечение, улучшается, или лечение может задержать ухудшение прогрессирующего заболевания, или предотвратить начало дополнительных ассоциированных заболеваний."Терапевтически эффективное количество (или доза)" или "эффективное количество (или доза)" специфически связывающего вещества или соединения относится к количеству вещества, достаточному для статистически значимого улучшения одного или более симптомов заболевания, подвергаемого лечению. Если речь идет об отдельном активном ингредиенте, вводимом в чистом виде, терапевтически эффективная доза относится к этому ингредиенту в чистом виде. Если речь идет о комбинации, терапевтически эффективная доза относится к объединенному количеству активных ингредиентов, приводящему к терапевтическому эффекту, независимо от того, вводятся ли они последовательно или одновременно (в одном и том же составе или одновременно в раздельных составах). Термин "фармацевтически приемлемый" относится к молекулярным структурам и композициям, не приводящим к аллергическим или другим серьезным нежелательным реакциям при введении общепринятым путем."Пациент, нуждающийся в" относится к пациенту, подвергающемуся риску или страдающему заболеванием, расстройством или состоянием, поддающимся лечению или улучшению с помощью иммуноглобулинового связывающего полипептида или его композиции, представленной здесь."Производный от иммуноглобулина гибридный белок", как используется здесь, относится к гибридному белку, включающему по меньшей мере одну область иммуноглобулина, например, домен VL,VH, CL, CH1, СН 2, СН 3 и СН 4. Область иммуноглобулина может представлять собой область иммуноглобулина дикого типа или модифицированную область иммуноглобулина. Дополнительные определения представлены в пределах настоящего описания. Конструкты, включающие связывающие домены В настоящем описании представлены полипептиды, включающие связывающие домены, в частности связывающие домены, специфически связывающие RON. Полипептиды, включающие связывающие домены согласно описанию могут представлять собой гибридные белки, включающие связывающие домены, как описано здесь, а также включающие любые из других разнообразных компонентов/доменов,например, домены Fc-области, линкеры, шарниры, домены димеризации/гетеродимеризации, соединительные аминокислоты, маркеры и т.д. Эти компоненты иммуноглобулиновых полипептидов подробно описаны ниже. Кроме того, иммуноглобулиновые связывающие полипептиды, описанные здесь, могут быть представлены в форме антитела или гибридного белка любой структуры (например, гибридный белок может быть в форме SMIP , PIMS, белка Scorpion /Xceptor или белка Интерцептора). Связывающие домены Как указано выше, иммуноглобулиновый связывающий полипептид согласно настоящему описанию включает связывающий домен, специфически связывающий мишень (например, RON). Связывание мишени связывающим доменом может блокировать взаимодействие между мишенью (например, таким рецептором, как RON, или лигандом) и другой молекулой, и таким образом мешать, ограничивать или устранять некоторые функции мишени (например, передачу сигнала). Следует отметить, что основной целью иммуноглобулиновых связывающих полипептидов согласно настоящему описанию является белок RON. Вместе с тем, в некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновые связывающие полипептиды могут включать один или более дополнительных связывающих доменов, которые связывают RON или мишень, не являющуюся RON (например, гетерологичную мишень). Указанные гетерологичные молекулы-мишени могут включать, например, определенный цитокин или молекулу, которая стимулирует адресное воздействие полипептида со связывающим доменом на клетку определенного типа, токсин, дополнительный клеточный рецептор, антитело и т.д. В некоторых вариантах воплощения связывающий домен, например, в качестве части молекулы Интерцепторы может включать TCR-связывающий домен для рекрутинга Т-клеток для адресного воздействия на клетки-мишени, экспрессирующие RON (см., например, пример 8). В некоторых вариантах воплощения полипептидный гетеродимер согласно описанию здесь может включать связывающий домен, специфически связывающийся с TCR-комплексом или его компонентами (например, TCR, TCR,CD3, CD3 и CD3), и еще один связывающий домен, специфически связывающийся с RON. Таким образом, связывающий домен может представлять собой любой пептид, специфически связывающийся с интересующей мишенью (например, RON). Источники связывающих доменов включают вариабельные области антител различных видов (которые могут быть скомпонованы в виде антител, sFv,scFv, Fab или растворимого домена VH или доменных антител), включая человека, грызунов, птиц и овец. Доменные антитела (dAb) включают вариабельную область тяжелой или легкой цепи иммуноглобулинов(VH И VL, соответственно) (Holt et al., (2003) Trends Biotechnol. 21:484-490). Дополнительные источники связывающих доменов включают вариабельные области антител других видов, например, верблюдовыхNguyen et al. (1998) J. Mol. Biol., 275:413), акул-нянек (Roux et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804), американского гидролага (Nguyen et al. (2002) Immunogenetics, 54:39) или миноги (Herrin et al.,(2008) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 105:2040-2045 и Alder et al. (2008) Nature Immunology 9:319-327). Эти антитела, по-видимому, могут образовывать антигенсвязывающие области только с помощью вариабельной области тяжелой цепи, т.е. эти функциональные антитела являются гомодимерами только тяжелых цепей (их называют "антителами тяжелых цепей") (Jespers et al. (2004) Nature Biotechnology 22:11611165; Cortez-Retamozo et al. (2004) Cancer Research 64:2853-2857; Baral et al. (2006) Nature Medicine 12:580-584 и Barthelemy et al. (2008) Journal of Biological Chemistry 283:3639-3654). Альтернативный источник связывающих доменов согласно настоящему описанию включает последовательности, кодирующие библиотеки случайных пептидов, или последовательности, кодирующие сконструированное многообразие аминокислот в областях петель каркасов, не являющихся фрагментами антител, например, доменов фибриногена (см., например, Weisel et al. (1985) Science 230:1388), доменов Кунитца (см., например, патент США 6423498), белков с акириновым повтором (Binz et al. (2003)Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 96:1898-1903 и Schonfeld et al. (2009) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 106:81988203), доменов V-типа (см., например, публикацию патентной заявки США 2007/0065431), доменов лектинов типа С (Zelensky and Gready (2005) FEBS J. 272:6179; Beavil et al. (1992) Proc. Nat'l. Acad. Sci.(USA) 89:753-757 и Sato et al. (2003) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 100:7779-7784), mAb2 или Fcab (см.,например, публикации патентных заявок РСТWO 2007/098934; WO 2006/072620) и т.п. (Nord et al.(2001) European Journal of Biochemistry 268(15):4269-4277 и Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 23:1257-1268). Связывающие домены согласно настоящему описанию можно получить, как описано здесь, или с помощью различных способов, известных в данной области техники (см., например, патенты США 6291161 и 6291158). Например, связывающие домены согласно настоящему описанию можно идентифицировать путем скрининга фаговой библиотеки Fab с целью поиска Fab-фрагментов, специфически связывающихся с интересующей мишенью (см. Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:344). Кроме того, для разработки связывающих доменов согласно настоящему описанию можно использовать традиционные стратегии разработки гибридом с помощью интересующей мишени в качестве иммуногена в подходящих системах(например, мышах, HUMAb MOUSE, TC MOUSE , KM-MOUSE, ламах, цыплятах, крысах, хомячках, кроликах и т.д.). В некоторых вариантах воплощения связывающий домен представляет собой одноцепочечный Fvфрагмент (scFv), включающий области VH и VL, специфичные по отношению к интересующей мишени. В некоторых вариантах воплощения VL и VH-домены являются доменами человека. Типичные области VL иVH включают области VL и VH антител 4 С 04 и 11 Н 09 согласно описанию здесь. Аминокислотная последовательность легкой цепи 4 С 04 приведена в SEQ ID NO:152, а ее CDR1, CDR2 и CDR3 приведены вSEQ ID NOS:141-143, соответственно. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи 4 С 04 приведена в SEQ ID NO:153, а ее CDR1, CDR2 и CDR3 приведены в SEQ ID NOS:144-146, соответственно. Аминокислотная последовательность легкой цепи scFv 11H09 приведена в SEQ ID NO:80, а ее CDR1,- 11022984CDR2 и CDR3 приведены в SEQ ID NOS:67-69, соответственно. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи scFv 11H09 приведена в SEQ ID NO:81, а ее CDR1, CDR2 и CDR3 приведены в SEQ IDNOS:70-72, соответственно. В некоторых вариантах воплощения связывающий домен включает или представляет собой последовательность, по меньшей мере, приблизительно на 90%, по меньшей мере, приблизительно на 91%, по меньшей мере, приблизительно на 92%, по меньшей мере, приблизительно на 93%, по меньшей мере,приблизительно на 94%, по меньшей мере, приблизительно на 95%, по меньшей мере, приблизительно на 96%, по меньшей мере, приблизительно на 97%, по меньшей мере, приблизительно на 98%, по меньшей мере, приблизительно на 99%, по меньшей мере, приблизительно на 99,5% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) (например, SEQ ID NOS: 80 и 152) или вариабельной области тяжелой цепи (VH) (например, SEQ ID N0S:81 и 153), или им обеим. В некоторых вариантах воплощения каждый CDR включает не более одной, двух или трех замен, инсерций или делеций по сравнению с CDR моноклонального антитела или его фрагментом или производным,специфически связывающимся с интересующей мишенью (например, RON). В других вариантах воплощения связывающий домен включает CDR1, CDR2 и CDR3 (например, CDR1, CDR2 и CDR3 антител 4 С 04 и 11 Н 09, как описано здесь), в которых один, два или три CDR включают фрагмент CDR согласно описанию здесь, например, фрагмент CDR, содержащий 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 аминокислот CDR, описанного здесь. В некоторых вариантах воплощения связывающий домен включает или представляет собой последовательность, являющуюся гуманизированной версией вариабельной области легкой цепи (VL) (например, SEQ ID NOS: 80 и 152) или вариабельной области тяжелой цепи (VH) (например, SEQ ID NOS:81 и 153), или их обеих. Типичные гуманизированные вариабельные области легкой цепи (VL) приведены вSEQ ID NOS:82, 83 и 154. Типичные гуманизированные вариабельные области тяжелой цепи (VH) приведены в SEQ ID NOS:84-86 и 155-156. В некоторых вариантах воплощения связывающий домен области VH согласно настоящему описанию может являться производным или основываться на VH известного моноклонального антитела (например, антитела DX07 против RON) и содержать приблизительно одну или более (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) инсерций, приблизительно одну или более (например, приблизительно 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) делеций, приблизительно одну или более (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10) аминокислотных замен (например, консервативных аминокислотных замен или неконсервативных аминокислотных замен) или комбинацию вышеупомянутых модификаций по сравнению с VH известного моноклонального антитела. Инсерция(и), делеция(и) или замена(ы) могут присутствовать в любом положении VH-области, включая N-или С-конец или оба конца этой области, при условии, что каждый CDR не содержит модификаций или не более одной, двух или трех модификаций, и что связывающий домен,содержащий модифицированную VH-область, сохраняет способность специфически связывать свою мишень со сродством, аналогичным сродству связывающего домена дикого типа. В других вариантах воплощения VL-область связывающего домена согласно настоящему описанию может являться производным или основываться на VL известного моноклонального антитела и содержать одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) инсерций, одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10) делеций, одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) аминокислотных замен (например,консервативных аминокислотных замен) или комбинацию вышеупомянутых модификаций по сравнению с VL известного моноклонального антитела. Инсерция(и), делеция(и) или замена(ы) могут присутствовать в любом положении VL-области, включая N- или С-конец или оба конца этой области, при условии,что каждый CDR не содержит модификаций или не более одной, двух или трех модификаций, и что связывающий домен, содержащий модифицированную VL-область, сохраняет способность специфически связывать свою мишень со сродством, аналогичным сродству связывающего домена дикого типа. Домены VH и VL можно расположить в любой ориентации (т.е., от N-конца к С-концу, VH-VL илиVL-VH) и необязательно можно объединить с линкером вариабельного домена, например, аминокислотной последовательностью (например, длиной от приблизительно пяти до приблизительно 35 аминокислот), способной выполнять функцию спейсера, обеспечивая взаимодействие двух связывающих субдоменов с образованием функционального связывающего домена. В некоторых вариантах воплощения аминокислотная последовательность, соединяющая домены VH и VL (также называемая "линкером вариабельного домена"), включает последовательности, принадлежащие к семейству (GlynSer), например,(Gly3Ser)n(Gly4Ser)1, (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n или (Gly4Ser)n, где n - целое число от 1 до 5. В некоторых вариантах воплощения линкер представляет собой GGGGSGGGGS GGGGS (SEQ IDNO:179) или GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:180). В некоторых вариантах воплощения эти линкеры на основе (GlynSer) используются для соединения доменов VH и VL в составе связывающего домена, но не используются для соединения связывающего домена с любым другим доменом, например,доменом гетеродимеризации или фрагментом Fc-области. Типичные связывающие RON-специфичные домены включают scFv 4C04, приведенный в SEQ IDNO:157 или его гуманизированные версии, приведенные в SEQ ID NOS:158 и 159, и scFv 11H09, приведенный в SEQ ID NO:87 или его гуманизированные версии, приведенные в SEQ ID NO:88-93. Аминокислотная последовательность легкой цепи scFv 4C04 приведена в SEQ ID NO:152, а ееCDR1, CDR2 и CDR3 приведены в SEQ ID NOS:141-143, соответственно. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи scFv 4C04 приведена в SEQ ID NO:153, а ее CDR1, CDR2 и CDR3 приведены вSEQ ID NOS: 144-146, соответственно. Аминокислотная последовательность легкой цепи scFv 11H09 приведена в SEQ ID NO:80, а ееCDR1, CDR2 и CDR3 приведены в SEQ ID NOS:67-69, соответственно. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи scFv 11H09 приведена в SEQ ID NO:81, а ее CDR1, CDR2 и CDR3 приведены в SEQID NOS:70-72, соответственно. В некоторых вариантах воплощения RON-связывающий домен включает лиганд RON макрофагстимулирующий белок (MSP), или его RON-связывающий фрагмент. Последовательности белка MSP известны в данной области техники и доступны в базах данных общего пользования, например, GENBANK. Показательные аминокислотные последовательности MSP находятся в GENBANK под номером доступа ААА 59872 gi398038 (SEQ ID NO:785) и эталонной последовательности NCBI NP066278, как представлено в SEQ ID NO:809. (см. также J. Biol. Chem. 268 (21), 15461-15468 (1993. Молекула-мишень, специфически связываемая связывающим доменом, содержащимся в связывающем полипептиде или его полипептидном гетеродимере согласно настоящему описанию, может присутствовать на поверхности или быть ассоциированной с интересующей клеткой ("клеткой-мишенью"). Типичные клетки-мишени включают раковые клетки, клетку, ассоциированную с аутоиммунным заболеванием или расстройством, или с воспалительным заболеванием или расстройством, и инфекционную клетку (например, бактерию-возбудителя инфекционного заболевания). Клетка организма-возбудителя инфекционного заболевания, например, паразита млекопитающих, также рассматривается в качестве клетки-мишени. Молекула-мишень, кроме того, может быть не ассоциирована с клеткой. Типичные молекулы-мишени, не ассоциированные с клеткой, включают растворимые белки, секретируемые белки,откладывающиеся белки и внеклеточные структурные белки (белки матрикса). В некоторых вариантах воплощения связывающие домены иммуноглобулиновых связывающих белков согласно настоящему описанию распознают мишень, выбранную из опухолевой клетки, клеткимишени моноцита/макрофага и эпителиальной клетки. В других вариантах воплощения связывающие домены связывающих полипептидов согласно настоящему описанию связывают рецепторный белок,например, рецепторные белки периферической мембраны или трансмембранные рецепторные белки. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновые связывающие полипептиды согласно настоящему описанию специфически связывают RON. Иммуноглобулиновые связывающие полипептиды с доменами димеризации/гетеродимеризаиии В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый связывающий полипептид согласно изобретению может содержать домен димеризации или гетеродимеризации. "Полипептидный гетеродимер" или "гетеродимер", как используют здесь, относится к димеру, образованному из двух различных одноцепочечных полипептидов. Домены димеризации/гетеродимеризации при необходимости можно использовать для формирования гомо- или гетеродимеров из двух одноцепочечных полипептидов, где один или оба одноцепочечных полипептидов включают связывающий домен. Следует отметить, что в некоторых вариантах воплощения один одноцепочечный полипептидный член некоторых гетеродимеров, описанных здесь, может не содержать связывающего домена. См., например, краткие сведения о молекулах RON-f03-f06 Интерцепторах в табл. 4. Эти одноцепочечные полипептидные члены, не содержащие связывающий домен, могут содержать любые компоненты иммуноглобулиновых связывающих полипептидов, как описано здесь(например, Fc-области, шарниры, линкеры, домены димеризации/гетеродимеризации, соединительные аминокислоты и т.д.). В некоторых вариантах воплощения связывающие полипептиды включают "домен димеризации",относящийся к аминокислотной последовательности, способной стимулировать ассоциацию по меньшей мере двух одноцепочечных полипептидов или белков за счет нековалентных или ковалентных взаимодействий, например, водородных связей, электростатических взаимодействий, ионных связей, сил Вандер-Ваальса, дисульфидных связей, гидрофобных взаимодействий и т.п., или любой их комбинации. Типичные домены димеризации включают константные области или подобласти тяжелой цепи иммуноглобулина. Следует понимать, что домен димеризации может стимулировать образование димеров или мультимерных комплексов более высокого порядка (например, тримеров, тетрамеров, пентамеров, гексамеров, септамеров, октамеров и т.д.) При желательности гетеродимеризации домены гетеродимеризации полипептидного гетеродимера отличаются друг от друга и, таким образом, могут быть по-разному модифицированы для облегчения гетеродимеризации обеих цепей и сведения к минимуму гомодимеризации каждой цепи. Домены гетеродимеризации, представленные здесь, позволяют эффективно осуществлять гетеродимеризацию различных полипептидов и облегчать очистку полученных полипептидных гетеродимеров. Как представлено здесь, домены гетеродимеризации, пригодные для стимуляции гетеродимеризации двух различных одноцепочечных полипептидов (например, короткого и длинного) согласно настоящему описанию, включают домены СН 1 и CL иммуноглобулинов, например, домены СН 1 и CL челове- 13022984 ка. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой СН 1-область дикого типа, например, CH1-область lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE илиIgM дикого типа. В других вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой СН 1-область lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE или IgM дикого типа человека, приведенную в SEQ ID NOS:181-189, соответственно. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой СН 1-область lgG1 дикого типа человека,приведенную в SEQ ID NO:20, которую в некоторых вариантах воплощения можно использовать в представленных здесь конструктах без концевых остатков "RT". В других вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой модифицированную иммуноглобулиновую СН 1-область, например, модифицированную СН 1 область lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE или IgM. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой модифицированную СН 1-область lgG1,lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE или IgM человека. В других вариантах воплощения остаток цистеина в СН 1-области дикого типа (например, СН 1 человека), участвующий в образовании дисульфидной связи с иммуноглобулиновым CL-доменом дикого типа (например, CL человека), делетирован или замещен в модифицированной иммуноглобулиновой СН 1-области, так что дисульфидная связь между модифицированной СН 1-областью и CL-доменом дикого типа не образуется. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой CL-домен дикого типа, например С-домен дикого типа или С-домен дикого типа. В определенных вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой Сдомен дикого типа человека или С-домен дикого типа человека, как приведено в SEQ ID NOS:190 и 191,соответственно. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой модифицированный иммуноглобулиновый CL-домен, например модифицированный С-или С-домен, например, модифицированный С- или С-домен человека. В некоторых вариантах воплощения остаток цистеина в CL-домене дикого типа (например, CL человека), участвующий в образовании дисульфидной связи с иммуноглобулиновой СН 1-областью дикого типа (например, СН 1 человека), делетирован или замещен в модифицированном иммуноглобулиновомCL-домене. Такие модифицированные CL-домены, кроме того, могут содержать аминокислотную делецию на N-конце. В SEQ ID NO:21 приведен типичный С-домен, в котором делетированы как первый аргинин, так и последний цистеин Сk-домена дикого типа человека. В SEQ ID NO:192 приведен типичный С-домен, в котором делетирован первый аргинин С-домена дикого типа человека, а цистеин, участвующий в образовании дисульфидной связи с цистеином в СН 1-области, замещен серином. В других вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой модифицированный С-домен, содержащий одну или более аминокислотных замен по сравнению с С-доменом дикого типа в положениях, которые могут участвовать в образовании сети водородных связей между цепями в области взаимодействия С-С. Например, в некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой модифицированный С-домен человека, содержащий одну или более аминокислот в положениях N29, N30, Q52, V55, Т 56, S68 или Т 70, замещенных другими аминокислотами. Нумерация аминокислот основана на их положениях в модифицированной последовательности С человека, приведенной в SEQ ID NO:21. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации представляет собой модифицированный Сдомен человека, содержащий одну, две, три или четыре аминокислотные замены в положениях N29, N30,V55 или Т 70. Аминокислота, используемая для замещения по вышеупомянутым положениям, может представлять собой аланин или аминокислотный остаток с боковой цепью большого размера, например,аргинин, триптофан, тирозин, глутамат, глутамин или лизин. Типичные модифицированные С-домены человека приведены в SEQ ID NOS: 261-297. Примеры модифицированных Ck-доменов человека представлены в SEQ ID NOS:22 и 23, в которых модифицированы аминокислотные остатки 30, 55 и 70. Эти два варианта Сk известны как Ck (YAE) и Ck (EAE), соответственно, что относится к указанным трем замещенным остаткам. Некоторые модифицированные С-домены человека могут облегчать гетеродимеризацию с областью СН 1 при минимальной гомодимеризации с другим С-доменом. Типичные модифицированные С-домены человека приведены в SEQ ID NOS:298 (N29W V55A Т 70 А), 299 (N29Y V55A Т 70 А), 300 (Т 70 Е N29A N30A V55A), 301 (N30R V55A Т 70 А), 302 (N30K V55A Т 70 А), 303 (N30E V55A Т 70 А), 304 (V55R N29A N30A), 305 (N29W N30Y V55A Т 70 Е), 306 (N29Y N30Y V55A Т 70 Е), 23 (N30EV55A Т 70 Е) и 22 (N30Y V55A Т 70 Е). В других вариантах воплощения другие модифицированные С-домены человека включают N30DV55A Т 70 Е (DAE); N30M V55A Т 70 Е (МАЕ); N30S V55A Т 70 Е (SAE); и N30F V55A Т 70 Е (FAE). В других вариантах воплощения для дестабилизации гомодимеризации можно соответствующим образом осуществлять сопряжение специфических модифицированных СН 1-доменов с определенными модифицированными С-доменами. В этой связи типичные пары модифицированных доменов включают С L29E + СН 1 V68K и С L29K + СН 1 V68E. В некоторых вариантах воплощения в качестве дополнения или альтернативы описанным здесь мутациям в Ck-доменах оба иммуноглобулиновых домена гетеродимеризации (т.е. СН 1- и CL-домены) полипептидного гетеродимера содержат мутации, так что полученные иммуноглобулиновые домены гетеродимеризации образуют ионные связи (т.е. ионные взаимодействия) между аминокислотными остатками в мутированных сайтах. Например, иммуноглобулиновые домены гетеродимеризации полипептидного гетеродимера могут представлять собой мутированный СН 1-домен в комбинации с мутированным Ckдоменом. В мутированном СН 1-домене валин в положении 68 (V68) СН 1-домена дикого типа человека замещен отрицательно заряженным аминокислотным остатком (например, аспартатом или глутаматом),в то время как лейцин в положении 29 (L29) мутированного Ck-домена человека, в котором делетированы первый аргинин и последний цистеин, замещен положительно заряженным аминокислотным остатком (например, лизином, аргинином или гистидином). Взаимодействие заряд-заряд между отрицательно заряженным аминокислотным остатком полученного мутированного СН 1-домена и положительно заряженным аминокислотным остатком полученного мутированного Ck-домена образует ионную связь, стабилизирующую область гетеродимерного взаимодействия между мутированными СН 1- и Ck-доменами. В качестве альтернативы V68 СН 1 дикого типа может быть замещен положительно заряженным аминокислотным остатком, в то время как L29 мутированного Ck-домена человека, в котором делетированы первый аргинин и последний цистеин, может быть замещен отрицательно заряженным аминокислотным остатком. Типичные мутированные СН 1-домены, в которых V68 замещен отрицательно или положительно заряженной аминокислотой, включают V68K- и V68 Е-замещенные СН 1-домены. Типичные мутированные С-домены, в которых L29 замещен отрицательно или положительно заряженной аминокислотой, включают L29E- и L29K-замещенные С-домены. В некоторых вариантах воплощения концевой остаток цистеина, присутствующий в С дикого типа, делетирован. Другие положения, кроме V68 СН 1-домена человека и L29 Ck-домена человека, могут быть замещены аминокислотами, несущими противоположный заряд, для обеспечения ионных взаимодействий между аминокислотами в дополнение или вместо мутаций в V68 СН 1-домена и L29 Ck-домена. Такие положения можно идентифицировать с помощью любой подходящей методики, включая случайный мутагенез, анализ кристаллической структуры пары СН 1-Ck для идентификации аминокислотных остатков в области взаимодействия СН 1-Ck, а также идентификации подходящих положений среди аминокислотных остатков в области взаимодействия СН 1-Ck согласно набору критериев (например, склонности вступать в ионные взаимодействия, близости к остатку-потенциальному партнеру и т. д.). В некоторых вариантах воплощения при желательности образования полипептидных гетеродимеров одноцепочечные полипептиды могут содержать только одну пару доменов гетеродимеризации. Например, первая цепь полипептидного гетеродимера в качестве домена гетеродимеризации может включать СН 1-область, в то время как вторая цепь в качестве домена гетеродимеризации может включать CLдомен (например, С или С ). В качестве альтернативы, первая цепь в качестве домена гетеродимеризации может включать CL-область (например, С или С ), в то время как вторая цепь в качестве домена гетеродимеризации может включать СН 1-область. Как установлено здесь, домены гетеродимеризации первой и второй цепи способны ассоциировать, образуя полипептидный гетеродимер согласно настоящему описанию. В некоторых других вариантах воплощения иммуноглобулиновые связывающие полипептиды могут содержать две пары доменов гетеродимеризации. Например, первая цепь полипептидного гетеродимера может включать две СН 1-области, в то время как вторая цепь может содержать два CL-домена, ассоциирующих с двумя СН 1-областями первой цепи. В качестве альтернативы, первая цепь может включать два CL-домена, в то время как вторая цепь может содержать две СН 1-области, ассоциирующие с двумя CL-доменами первой цепи. В некоторых вариантах воплощения полипептид первой цепи включает СН 1-область и CL-домен, в то время как полипептид второй цепи включает CL-домен и СН 1-область,ассоциирующие с СН 1-областью и CL-доменом полипептида первой цепи, соответственно. В вариантах воплощения, где полипептидный гетеродимер содержит только одну пару гетеродимеризации (т.е. один домен гетеродимеризации в каждой цепи), домен гетеродимеризации каждой цепи может располагаться в N-направлении по отношению к фрагменту Fc-области этой цепи. В качестве альтернативы, домен гетеродимеризации каждой цепи может располагаться в С-направлении по отношению к фрагменту Fc-области этой цепи. В вариантах воплощения, где полипептидный гетеродимер содержит две пары гетеродимеризации(т.е. два домена гетеродимеризации в каждой цепи), оба домена гетеродимеризации каждой цепи могут располагаться в N-направлении по отношению к фрагменту Fc-области этой цепи. В качестве альтернативы, оба домена гетеродимеризации каждой цепи могут располагаться в С-направлении по отношению к фрагменту Fc-области этой цепи. В других вариантах воплощения один домен гетеродимеризации в каждой цепи может располагаться в N-направлении по отношению к фрагменту Fc-области этой цепи, в то время как другой домен гетеродимеризации каждой цепи может располагаться в С-направлении по отношению к фрагменту Fc-области этой цепи. Другими словами, в указанных вариантах воплощения фрагмент Fc-области располагается между двумя доменами гетеродимеризации в каждой цепи. Фрагмент Fc-области Как указано здесь, связывающие конструкты согласно настоящему описанию, независимо от того,содержат ли они связывающий домен или нет, могут включать фрагмент константного домена Fcобласти (также известный как фрагмент Fc-области). Включение фрагмента Fc-области замедляет выведение связывающих белков из циркуляторного русла после введения субъекту. С помощью мутаций или других модификаций фрагмент Fc-области также позволяет относительно легко регулировать эффекторные функции связывающего полипептида или его димеров, или гетеродимеров (например, АКЦ, АКФ,КЗЦ, фиксацию комплемента и связывание с Fc-рецепторами), которые можно усиливать или ослаблять в зависимости от заболевания, подвергаемого лечению, как известно в данной области техники и описано здесь. В некоторых вариантах воплощения фрагмент Fc-области связывающих полипептидов согласно настоящему описанию способен опосредовать одну или более эффекторных функций. Фрагмент Fc-области, присутствующий в одноцепочечных полипептидах, может включать СН 2 домен, СН 3-домен, СН 4-домен или любую их комбинацию. Например, фрагмент Fc-области может включать СН 2-домен, СН 3-домен, СН 2- и СН 3-домены, СН 3- и СН 4-домены, два СН 3-домена, СН 4 домен или два СН 4-домена. СН 2-домен, который может образовывать фрагмент Fc-области одноцепочечного полипептида согласно настоящему описанию, может представлять собой иммуноглобулиновый СН 2-домен дикого типа или модифицированный иммуноглобулиновый СН 2-домен некоторых классов или подклассов иммуноглобулинов (например, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2 и IgD) различных видов (включая человека,мышь, крысу и других млекопитающих). В некоторых вариантах воплощения СН 2-домен представляет собой иммуноглобулиновый СН 2 домен дикого типа человека, например, СН 2-домены дикого типа lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2 илиIgD человека, приведенные в SEQ ID NOS:241, 246-248 и 242-244, соответственно. В некоторых вариантах воплощения СН 2-домен представляет собой СН 2-домен lgG1 дикого типа человека, приведенный вSEQ ID NO:241. В некоторых вариантах воплощения СН 2-домен представляет собой модифицированную иммуноглобулиновую СН 2-область (например, модифицированный СН 2-домен lgG1 человека), включающий аминокислотную замену по аспарагину в положении 297 (например, аспарагина на аланин). Такая аминокислотная замена ослабляет или устраняет гликозилирование по этому сайту и аннулирует эффективное связывание Fc с FcR и C1q. Последовательность модифицированного СН 2-домена lgG1 человека,содержащего замену Asn на Ala в положении 297, приведена в SEQ ID NO:307. В некоторых вариантах воплощения СН 2-домен представляет собой модифицированную иммуноглобулиновую СН 2-область (например, модифицированный СН 2-домен lgG1 человека), включающий по меньшей мере одну замену или делецию в положениях с 234 по 238. Например, иммуноглобулиновая СН 2-область может включать замену в положении 234, 235, 236, 237 или 238, положениях 234 и 235, положениях 234 и 236, положениях 234 и 237, положениях 234 и 238, положениях 234-236, положениях 234, 235 и 237, положениях 234, 236 и 238, положениях 234, 235, 237 и 238, положениях 236-238 или любую другую комбинацию двух, трех, четырех или пяти аминокислот в положениях 234-238. В качестве дополнения или альтернативы, модифицированная СН 2-область может содержать одну или более (например, две, три, четыре или пять) делеций аминокислот в положениях 234-238, например, делецию в одном из положений 236 или 237, в то время как в других положениях имеют место замены. Вышеупомянутая(ые) мутация(и) снижает(ют) или устраняет(ют) антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АКЦ) полипептидного гетеродимера, включающего модифицированный СН 2-домен,или его способность связываться с Fc-рецептором. В некоторых вариантах воплощения аминокислотные остатки в одном или более положений 234-238 замещены одним или более остатками аланина. В других вариантах воплощения делетирован только один из аминокислотных остатков в положениях 234-238, в то время как одна или более из оставшихся аминокислот в положениях 234-238 может быть замещена другой аминокислотой (например, аланином или серином). В некоторых других вариантах воплощения СН 2-домен представляет собой модифицированную иммуноглобулиновую СН 2-область (например, модифицированный СН 2-домен lgG1 человека), включающий одну или более аминокислотных замен в положениях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Например,иммуноглобулиновая СН 2-область может включать замену в положениях 253, 310, 318, 320, 322 или 331,положениях 318 и 320, положениях 318 и 322, положениях 318, 320 и 322 или любую другую комбинацию двух, трех, четырех, пяти или шести аминокислот в положениях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Вышеупомянутая(ые) мутация(и) снижает(ют) или устраняет(ют) комплементзависимую цитотоксичность(КЗЦ) полипептидного гетеродимера, включающего модифицированный СН 2-домен. В некоторых других вариантах воплощения при внесении аминокислотной замены в положении 297 модифицированная СН 2-область (например, модифицированный СН 2-домен lgG1 человека), может,кроме того, включать одну или более (например, две, три, четыре или пять) дополнительных аминокислотных замен в положениях 234-238. Например, иммуноглобулиновая СН 2-область может включать замену в положении 234 и 297, положениях 234, 235 и 297, положениях 234, 236 и 297, положениях 234236 и 297, положениях 234, 235, 237 и 297, положениях 234, 236, 238 и 297, положениях 234, 235, 237,- 16022984 238 и 297, положениях 236-238 и 297 или любую другую комбинацию двух, трех, четырех или пяти аминокислот в положениях 234-238 в дополнение к положению 297. В качестве дополнения или альтернативы, модифицированная СН 2-область может содержать одну или более (например, две, три, четыре или пять) делеций аминокислот в положениях 234-238, например, в положении 236 или 237. Указанная(ые) дополнительная(ые) мутация(и) снижает(ют) или устраняет(ют) антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АКЦ) полипептидного гетеродимера, включающего модифицированный СН 2 домен, или его способность связываться с Fc-рецептором. В некоторых вариантах воплощения аминокислотные остатки в одном или более положений 234-238 замещены одним или более остатками аланина. В других вариантах воплощения делетирован только один из аминокислотных остатков в положениях 234-238, в то время как одна или более из оставшихся аминокислот в положениях 234-238 может быть замещена другой аминокислотой (например, аланином или серином). В некоторых вариантах воплощения в дополнение к одной или более (например, 2, 3, 4 или 5) аминокислотных замен в положениях 234-238 мутированная СН 2-область (например, модифицированный СН 2-домен lgG1 человека) в гибридном белке согласно настоящему описанию может содержать одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или 6) дополнительных аминокислотных замен (например, аланином) в одном или более положениях, вовлеченных в фиксацию комплемента (например, в положениях I253,Н 310, Е 318, K320, K322 или Р 331). Примеры мутированных иммуноглобулиновых СН 2-областей включают СН 2-области lgG1, lgG2, lgG4 человека и lgG2a мыши, содержащие замены на аланин в положениях 234, 235, 237 (при наличии), 318, 320 и 322. Типичная мутированная иммуноглобулиновая СН 2 область представляет собой СН 2-область IGHG2c мыши, содержащую замены на аланин в L234, L235,G237, Е 318, K320 и K322 (SEQ ID NO:308). В других вариантах воплощения при внесении аминокислотной замены в положении 297 и дополнительных(ой) делеций(и) или замен(ы) в положениях 234-238 модифицированная СН 2-область (например, модифицированный СН 2-домен lgG1 человека), может, кроме того, включать одну или более (например, две, три, четыре, пять или шесть) аминокислотных замен в положениях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Например, иммуноглобулиновая СН 2-область может включать (1) замену в положении 297, (2) одну или более замен или делеций или их комбинаций в положениях 234-238, и одну или более (например, 2,3, 4, 5 или 6) аминокислотных замен в положениях I253, Н 310, Е 318, K320, K322 и Р 331, например, одну,две, три замены в положениях Е 318, K320 и K322. В одном из вариантов воплощения аминокислоты в вышеупомянутых положениях замещены аланином или серином. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновая СН 2-область в составе полипептида включает: (i) аминокислотную замену по аспарагину в положении 297 и одну аминокислотную замену в положении 234, 235, 236 или 237; (ii) аминокислотную замену по аспарагину в положении 297 и аминокислотные замены в двух из положений 234-237; (iii) аминокислотную замену по аспарагину в положении 297 и аминокислотные замены в трех из положений 234-237; (iv) аминокислотную замену по аспарагину в положении 297, аминокислотные замены в положениях 234, 235 и 237 и делецию аминокислоты в положении 236; (v) аминокислотные замены в трех из положений 234-237 и аминокислотные замены в положениях 318, 320 и 322; или (vi) аминокислотные замены в трех из положений 234-237, делецию аминокислоты в положении 236 и аминокислотные замены в положениях 318, 320 и 322. Типичные модифицированные СН 2-области иммуноглобулинов, содержащие аминокислотные замены по аспарагину в положении 297, включают: СН 2-область lgG1 человека, содержащую замены на аланин в L234, L235, G237 и N297 и делецией G236 (SEQ ID NO:309), СН 2-область lgG2 человека, содержащую замены на аланин в V234, G236 и N297 (SEQ ID NO:310), СН 2-область lgG4 человека, содержащую замены на аланин в F234, L235, G237 и N297 и делецию G236 (SEQ ID NO:311), СН 2-областьlgG4 человека, содержащую замены на аланин в F234 и N297 (SEQ ID NO:312), СН 2-область lgG4 человека, содержащую замены на аланин в L235 и N297 (SEQ ID NO:313), СН 2-область lgG4 человека, содержащую замены на аланин в G236 и N297 (SEQ ID NO:314) и СН 2-область lgG4 человека, содержащую замены на аланин в G237 и N297 (SEQ ID NO:315). В некоторых вариантах воплощения в дополнение к вышеописанным аминокислотным заменам модифицированная СН 2-область (например, модифицированный СН 2-домен lgG1 человека), может включать одну или более дополнительных аминокислотных замен в одном или более положений, не совпадающих с вышеотмеченными положениями. Такие аминокислотные замены могут быть консервативными или неконсервативными. Например, в некоторых вариантах воплощения в модифицированной СН 2 области lgG2 P233 можно заменить на Е 233 (см., например, SEQ ID NO:310). В качестве дополнения или альтернативы, в некоторых вариантах воплощения модифицированная СН 2-область может содержать одну или более инсерций и/или делеций аминокислот. Инсерция(и), делеция(и) или замена(ы) могут располагаться в любом положении иммуноглобулиновой СН 2-области, например, на N- или С-конце иммуноглобулиновой СН 2-области дикого типа, в результате присоединения СН 2-области к другой области(например, связывающему домену или домену гетеродимеризации) через шарнир. В некоторых вариантах воплощения модифицированная СН 2-область в составе полипептидного гетеродимера согласно настоящему описанию включает или представляет собой последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% идентичную иммуноглобулиновой СН 2-области дикого типа, например, СН 2-области дикого типа lgG1, lgG2 или lgG4 человека или lgG2a мыши (например,IGHG2C). Модифицированная иммуноглобулиновая СН 2-область в составе полипептидного гетеродимера согласно настоящему описанию может являться производной СН 2-области различных изотипов иммуноглобулинов, например, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2 и IgD различных видов (включая человека,мышь, крысу и других млекопитающих). В некоторых вариантах воплощения модифицированная иммуноглобулиновая СН 2-область в составе гибридного белка согласно настоящему описанию может являться производной СН 2-области lgG1, lgG2 или lgG4 человека или lgG2a мыши (например, IGHG2c), последовательности которых приведены в SEQ ID NOS:241, 246, 248 и 316. В некоторых вариантах воплощения модифицированный СН 2-домен представляет собой СН 2 домен lgG1, содержащий замены на аланин в положениях 235, 318, 320 и 322 (т.е. СН 2-домен lgG1 человека, содержащий замены L235A, Е 318 А, К 320 А и К 322 А) (SEQ ID NO:317), и, необязательно, мутациюN297 (например, на аланин). В некоторых других вариантах воплощения модифицированный СН 2-домен представляет собой СН 2-домен lgG1 человека, содержащий замены на аланин в положениях 234, 235,237, 318, 320 и 322 (т.е. СН 2-домен lgG1 человека, содержащий замены L234A, L235A, G237A, Е 318 А,К 320 А и К 322 А) (SEQ ID NO:318), и, необязательно, мутацию N297 (например, на аланин). В некоторых вариантах воплощения модифицированный СН 2-домен представляет собой модифицированный СН 2-домен lgG1 человека, содержащий мутации, известные в данной области техники и усиливающие иммунологическую активность, например, АКЦ, АКФ, КЗЦ, фиксацию комплемента, связывание с Fc-рецептором или любую их комбинацию. СН 3-домен, который может образовывать фрагмент Fc-области связывающего полипептида согласно настоящему описанию, может представлять собой иммуноглобулиновый СН 3-домен дикого типа или модифицированный иммуноглобулиновый СН 3-домен некоторых классов или подклассов иммуноглобулинов (например, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE, IgM) различных видов (включая человека,мышь, крысу и других млекопитающих). В некоторых вариантах воплощения СН 3-домен представляет собой иммуноглобулиновый СН 3-домен дикого типа человека, например, СН 3-домены дикого типа lgG1,lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE или IgM человека, приведенные в SEQ ID NOS: 319-328, соответственно. В некоторых вариантах воплощения СН 3-домен представляет собой СН 3-домен lgG1 дикого типа человека, приведенный в SEQ ID NO:319. В некоторых вариантах воплощения СН 3-домен представляет собой модифицированный СН 3-домен иммуноглобулина человека, например, модифицированный СН 3 домен, основанный на или производный от СН 3-домена дикого типа антител lgG1, lgG2, lgG3, lgG4,lgA1, lgA2, IgD, IgE или IgM человека. Например, модифицированный СН 3-домен может представлять собой СН 3-домен lgG1 человека, содержащий одну или две мутации в положениях Н 433 и N434 (положения пронумерованы согласно нумерации ЕС). Мутации в таких положениях могут быть вовлечены в фиксацию комплемента. В некоторых вариантах воплощения модифицированный СН 3-домен может представлять собой СН 3-домен lgG1 человека, но содержащий одну или две аминокислотные замены в положениях F405 или Y407. Аминокислоты в таких положениях вовлечены во взаимодействие с другим СН 3-доменом. В некоторых вариантах воплощения модифицированный СН 3-домен может представлять собой модифицированный СН 3-домен lgG1 человека, в котором делетирован последний лизин. Последовательность указанного модифицированного СН 3-домена приведена в SEQ ID NO:329. В некоторых вариантах воплощения, особенно при желательности полипептидного гетеродимера,полипептиды гетеродимера включают пару СН 3, включающих так называемые мутации типа "выступво-впадину" (см. Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26:649-58, 2005; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-21, 1966). Конкретнее, в каждый из двух СН 3-доменов можно внедрить мутации так, что стерическая комплементарность, необходимая для ассоциации СН 3/СН 3, принуждает эти два СН 3 домена образовывать пару друг с другом. Например, СН 3-домен в одном одноцепочечном полипептиде полипептидного гетеродимера может содержать мутацию T366W (мутацию типа "выступ", представляющую собой замену небольшой аминокислоты на более крупную), а СН 3-домен в другом одноцепочечном полипептиде полипептидного гетеродимера может содержать мутацию Y407A (мутацию типа"впадина", представляющую собой замену крупной аминокислоты на более мелкую). Другие типичные мутации типа "выступ-во-впадину" включают (1) мутацию T366Y в одном СН 3-домене и Y407T - в другом СН 3-домене и (2) мутацию T366W в одном СН 3-домене и мутации T366S, L368A и Y407V - в другом СН 3-домене. СН 4-домен, который может образовывать фрагмент Fc-области одноцепочечного полипептида, который может содержать или не содержать связывающий домен, может представлять собой иммуноглобулиновый СН 4-домен дикого типа или модифицированный иммуноглобулиновый СН 4-домен из молекул IgE или IgM. В некоторых вариантах воплощения СН 4-домен представляет собой иммуноглобулиновый СН 4-домен дикого типа человека, например, СН 4-домены дикого типа молекул IgE и IgM человека,приведенные в SEQ ID NOS:330 и 331, соответственно. В некоторых вариантах воплощения СН 4-домен представляет собой модифицированный СН 4-домен иммуноглобулина человека, например, модифици- 18022984 рованный СН 4-домен, основанный на или производный от СН 4-домена молекул IgE или IgM человека,содержащих мутации, усиливающие или ослабляющие иммунологическую активность, ассоциированную с Fc-областью IgE или IgM. В некоторых вариантах воплощения фрагмент константного домена Fc-области включает комбинацию СН 2-, СН 3- или СН 4-доменов (т.е. более одного константного субдомена, выбранных из СН 2, СН 3 и СН 4). Например, фрагмент Fc-области может включать СН 2- и СН 3-домены или СН 3- и СН 4-домены. В некоторых вариантах воплощения фрагмент Fc-области может включать два СН 3-домена и не содержать СН 2- или СН 4-доменов (т.е. только два или более СН 3). Множественные константные субдомены, образующие фрагмент Fc-области, могут быть основаны на или являться производными от одной и той же молекулы иммуноглобулина или молекул одного и того же класса или подкласса иммуноглобулинов. В некоторых вариантах воплощения фрагмент Fc-области представляет собой СН 2 СН 3 IgG (например,СН 2 СН 3 lgG1, CH2CH3 lgG2 и СН 2 СН 3 lgG4), а в некоторых вариантах реализации - СН 2 СН 3 человека(например, lgG1, lgG2 и lgG4 человека). Например, в некоторых вариантах воплощения фрагмент Fcобласти включает (1) СН 2- и СН 3-домены lgG1 дикого типа человека, (2) СН 2 lgG1 человека, содержащий замену N297A (т.е. CH2(N297A и СН 3 lgG1 человека дикого типа, или (3) CH2(N297A) lgG1 человека и модифицированный СН 3 lgG1 человека, в котором делетирован последний лизин. В качестве альтернативы множественные константные субдомены могут быть основаны на или являться производными от различных молекул иммуноглобулинов или молекул различных классов или подклассов иммуноглобулинов. Например, в некоторых вариантах воплощения фрагмент Fc-области включает как СН 3-домен IgM человека, так и СН 3-домен lgG1 человека. Множественные константные субдомены, образующие фрагмент Fc-области, могут быть соединены друг с другом непосредственно или через одну или более (например, 2-8) аминокислот. Типичные фрагменты Fc-областей приведены в SEQ ID NOS:18-19, 332-341. В отношении гетеродимеров, описанных здесь, в некоторых вариантах воплощения фрагменты Fcобластей обоих одноцепочечных полипептидов полипептидного гетеродимера идентичны друг другу. В некоторых других вариантах воплощения фрагмент Fc-области одного одноцепочечного полипептида полипептидного гетеродимера отличается от фрагмента Fc-области другого одноцепочечного полипептида этого гетеродимера. Например, один фрагмент Fc-области может содержать СН 3-домен, несущий мутацию типа "выступ", в то время как другой фрагмент Fc-области может содержать СН 3-домен, несущий мутацию типа "впадина". Шарниры Шарнирная область, содержащаяся в любом из иммуноглобулиновых связывающих полипептидов,описанных здесь, например, одноцепочечных полипептидах, содержащих или не содержащих связывающие домены, согласно настоящему описанию, может располагаться (а) непосредственно в Nнаправлении от фрагмента Fc-области (например, в зависимости от изотипа, в N-направлении от СН 2 домена, если фрагмент Fc-области представляет собой СН 2 СН 3, или в N-направлении от СН 3-домена,если фрагмент Fc-области представляет собой СН 3 СН 4), (b) между связывающим доменом (например,scFv) и доменом гетеродимеризации, связывая их, (с) между доменом гетеродимеризации и фрагментомFc-области, связывая их (например, если фрагмент Fc-области представляет собой СН 2 СН 3 или СН 3 СН 4, в зависимости от изотипа или изотипов), (d) между фрагментом Fc-области и связывающим доменом, связывая их, (е) на N-конце одноцепочечного полипептида или (f) на С-конце одноцепочечного полипептида. В некоторых вариантах воплощения шарнир представляет собой шарнирную область иммуноглобулина дикого типа человека (например, шарнирные области иммуноглобулинов человека приведены вSEQ ID NOS:342-348). В некоторых других вариантах воплощения к N- или С-концу шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, как части конструкта гибридного белка, можно добавить один или более аминокислотных остатков. Например, допонительные соединительные аминокислотные остатки на Nконце шарнира могут представлять собой "RT", "RSS", "SS", "TG", или "Т" или дополнительные остатки на С-конце шарнира могут представлять собой "SG", или с добавлением можно комбинировать делецию в составе шарнира, например, АР с добавлением "SG" на С-конце. Типичные варианты шарниров приведены в SEQIDNOS: 14-17. В некоторых вариантах воплощения шарнир представляет собой модифицированный иммуноглобулиновый шарнир, в котором один или более остатков цистеина в шарнирной области иммуноглобулина дикого типа можно заменить одним или более остатками других аминокислот (например, серина или аланина). Например, шарнир может представлять собой модифицированный иммуноглобулированный шарнир, основанный на или производный от шарнира lgG1 человека дикого типа, представленного вSEQ ID NO:349, который от N-конца до С-конца включает верхнюю шарнирную область(EPKSCDKTHT, SEQ ID NO:194) и сердцевинную шарнирную область (СРРСР, SEQ ID NO:199). Типичные модифицированные иммуноглобулиновые шарниры включают иммуноглобулиновую шарнирную область lgG1 человека, содержащую один, два или три остатка цистеина шарнира lgG1 человека дикого типа, замещенные одним, двумя или тремя различными аминокислотными остатками (например, серином или аланином). Модифицированная шарнирная область иммуноглобулина может, кроме того, со- 19022984 держать пролин, замещенный другой аминокислотой (например, серином или аланином). Например, вышеописанный модифицированный шарнир lgG1 человека может, кроме того, содержать пролин, расположенный в С-направлении от трех остатков цистеина шарнирной области lgG1 человека дикого типа и замещенный другим аминокислотным остатком (например, серином, аланином). В одном из вариантов воплощения остатки пролина сердцевинной шарнирной области не замещены. Типичные модифицированные иммуноглобулиновые шарниры приведены в SEQ ID NOS: 350-377. В одном из вариантов воплощения модифицированный шарнир lgG1 представляет собой модифицированный шарнир lgG1 человека, в котором первый остаток цистеина замещен серином. Последовательность этого типичного модифицированного шарнира lgG1 приведена в SEQ ID NO:354 и известна как "SCC-P-шарнир lgG1" или"SCC-P-шарнир". В некоторых других вариантах воплощения к N- или С-концу мутированной иммуноглобулиновой шарнирной области, как части конструкта гибридного белка, можно добавить один или более аминокислотных остатков (например, "RT", "RSS" или "Т"). В некоторых вариантах воплощения шарнирный полипептид включает или представляет собой последовательность, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 81%,по меньшей мере приблизительно на 82%, по меньшей мере приблизительно на 83%, по меньшей мере приблизительно на 84%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 86%, по меньшей мере приблизительно на 87%, по меньшей мере приблизительно на 88%, по меньшей мере приблизительно на 89%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98%, по меньшей мере приблизительно на 99% идентичную аминокислотной последовательности иммуноглобулиновой шарнирной области дикого типа, например, шарниру lgG1 человека дикого типа, шарниру lgG2 человека дикого типа или шарниру lgG4 человека дикого типа. В других вариантах воплощения шарнир может представлять собой шарнир, не основанный на или не являющийся производным шарнира иммуноглобулина (т.е. не являющийся шарниром иммуноглобулина дикого типа или модифицированным шарниром иммуноглобулина). В одном из вариантов воплощения эти типы шарниров неиммуноглобулинового происхождения используют на С-конце или вблизи него (например, располагают в С-направлении от фрагментов Fc-областей) полипептидов, описанных здесь. Примеры таких шарниров включают пептиды междоменной области или области ножки пектинов типа С II или молекул КД, например, области ножек CD69, CD72, CD94, NKG2A и NKG2D, приведенные в SEQ ID NOS:378-383. Дополнительные типичные шарниры включают шарниры, приведенные в SEQ IDNOS: 384-419. Альтернативные шарниры, которые можно использовать здесь, получены из фрагментов рецепторов поверхности клеток (междоменных областей), соединяющих иммуноглобулиновые домены V-типа или С-типа. Области между доменами Ig V-типа, если рецептор поверхности клеток содержит множественные домены Ig V-типа один за другим, и между доменами Ig С-типа, если рецептор поверхности клеток содержит множественные области Ig С-типа один за другим, также рассматриваются как шарниры,пригодные для использования в одноцепочечных полипептидах или полипептидных гетеродимерах. В некоторых вариантах воплощения последовательности шаблонов, включающих междоменные области рецепторов поверхности клеток, могут, кроме того, содержать природный или внедренный мотив, например, последовательность сердцевинной шарнирной области IgG, обеспечивающую одну или более дисульфидных связей, стабилизирующих образование полипептидного гетеродимера. Примеры шарниров включают междоменные области между областями Ig V-типа и С-типа CD2, CD4, CD22, CD33,CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD150, CD166 и CD244. В некоторых вариантах воплощения последовательности шарнира содержат приблизительно от 5 до 150 аминокислот, приблизительно от 5 до 10 аминокислот, приблизительно от 10 до 20 аминокислот,приблизительно от 20 до 30 аминокислот, приблизительно от 30 до 40 аминокислот, приблизительно от 40 до 50 аминокислот, приблизительно от 50 до 60 аминокислот, приблизительно от 5 до 60 аминокислот, приблизительно от 5 до 40 аминокислот, например, приблизительно от 8 до 20 аминокислот, или приблизительно от 12 до 15 аминокислот. В общем случае шарниры могут быть гибкими, но они также могут обеспечивать повышенную жесткость или содержать в основном -спиральную структуру с минимальным количеством структур типа -листа. Длина последовательностей шарниров может влиять на сродство связывания связывающих доменов, к которым шарниры присоединяются напрямую или непрямым образом (через еще одну область или домен, например, домен гетеродимеризации), а также на одну или более активностей фрагментов Fc-областей, к которым шарниры присоединяются напрямую или непрямым образом. В некоторых вариантах воплощения последовательности шарниров стабильны в плазме и сыворотке и устойчивы к протеолитическому расщеплению. Для минимизации протеолитического расщепления можно мутировать первый остаток лизина верхней шарнирной области lgG1. Например, этот остаток лизина можно заменить метионином, треонином, аланином или глицином или делетировать (см, напри- 20022984 мер, SEQ ID NOS:420-475, которая может включать соединительные аминокислоты на N-конце, например, RT). В некоторых вариантах воплощения последовательности шарнира могут содержать природный или внедренный мотив, например, иммуноглобулиновую сердцевинную шарнирную структуру СРРС (SEQID NO:476), придающую способность образовывать дисульфидную связь или множественные дисульфидные связи, стабилизирующие С-концевую часть молекулы. В других вариантах реализации последовательности шарниров могут содержать один или более сайтов гликозилирования. Типичные шарниры, включая модифицированные иммуноглобулиновые шарниры, приведены вSEQ ID NOS: 389-475 и 477-606. Дополнительные иллюстративные шарниры, включая варианты шарниров, приведены в SEQ ID NOS: 790-797 и 805-506. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновые связывающие полипептиды включают более одного шарнира. Например, одноцепочечный полипептид, содержащий два связывающих домена,один из которых расположен на N-конце, а другой - на С-конце, может содержать два шарнира. Один шарнир может быть напрямую или непрямым образом (например, через домен гетеродимеризации) быть соединен со связывающим доменом на или вблизи N-конца, а другой шарнир может быть соединен (например, напрямую соединен) с другим связывающим доменом на С-конце или вблизи него. В некоторых вариантах воплощения, даже если одноцепочечный полипептид содержит только один связывающий домен, он может содержать более одного шарнира, например, на N- или С-конце. В некоторых вариантах воплощения, например, при желательности гетеродимеризации, такой шарнир может взаимодействовать с соответствующим шарниром другой цепи гетеродимера, образуя одну или более дисульфидных связей,соединяющих цепи, для облегчения или усиления гетеродимеризации этих двух цепей. Шарнир (Ш-I) ОЦП-I полипептидного гетеродимера "соответствует" шарниру (Ш-II) ОЦП-II гетеродимера, если Н-I и Н-II располагаются на одном и том же конце фрагмента Fc-области соответствующего им одноцепочечного полипептида. Например, полипептидный гетеродимер может включать два следующих одноцепочечных полипептида: Первый одноцепочечный полипептид, от N- до С-конца, включает первый связывающий домен, СН 1, шарнир, СН 2 и СН 3, а второй одноцепочечный полипептид, от N- до С-конца,включает CK, первый шарнир, СН 2, СН 3, второй шарнир и второй связывающий домен. Шарнир первой цепи следует рассматривать как "соответствующий" первому шарниру второй цепи, поскольку оба они располагаются в N-направлении по отношению к фрагментам Fc-областей, с которыми они соединены. В некоторых вариантах воплощения, в частности, если иммуноглобулиновый связывающий полипептид включает связывающий домен на своем С-конце или вблизи него, шарнир может соединять связывающий домен с другим фрагментом полипептида (например, фрагментом Fc-области или доменом гетеродимеризации). В некоторых вариантах воплощения такой шарнир представляет собой неиммуноглобулиновый шарнир (т.е., шарнир, не основанный на или не являющийся производным шарнира иммуноглобулина дикого типа) и может представлять собой область ножки лектина типа СII или молекулыKД, междоменную область, соединяющую домены lgV-типа или lgC-типа рецептора поверхности клетки или их производное или функциональный вариант. Типичные С-концевые шарниры, иногда называемые шарнирами "нижнего конца", включают шарниры, приведенные в SEQ ID NOS: 384, 389-419, 593-596. Другие компоненты или модификации В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновые связывающие полипептиды согласно изобретению могут содержать дополнительные домены или области. Такие дополнительные области могут представлять собой лидерную последовательность (также называемую "сигнальным пептидом") наN-конце для секреции экспрессированного полипептида. Типичные лидерные пептиды согласно настоящему описанию включают природные лидерные последовательности или другие, например, последовательности, приведенные в SEQ ID NOS:193 и 13. В одном из вариантов воплощения полипептиды согласно настоящему изобретению используют зрелый белок, не включающий лидерный пептид (сигнальный пептид). Соответственно, хотя некоторые последовательности, представленные здесь для белков со связывающим доменом (например, для RON), включают лидерный пептид, специалист должен понимать,как отличить последовательность зрелого белка от последовательностей, включающих сигнальный пептид. В некоторых вариантах воплощения включение лидерной последовательности может быть полезным. Дополнительные области также могут представлять собой последовательности на С-конце для идентификации или очистки одноцепочечных полипептидов (например, такие эпитопы-маркеры для обнаружения или очистки, как гистидиновый маркер, биотин, эпитоп FLAG или любую их комбинацию). Другие необязательные области могут представлять собой дополнительные аминокислотные остатки (называемые "соединительными аминокислотами" или "соединительными аминокислотными остатками") длиной от 1 до приблизительно 8 аминокислот (например, от приблизительно 2 до 5 аминокислот), которые могут образоваться при использовании специфических систем экспрессии или конструировании полипептидов согласно настоящему описанию. Такие дополнительные аминокислотные остатки(например, приблизительно одна, две, три, четыре или пять дополнительных аминокислот) могут присутствовать на N-или С-конце или между различными областями или доменами, например, между связывающим доменом и доменом гетеродимеризации, между доменом гетеродимеризации и шарниром, меж- 21022984 ду шарниром и фрагментом Fc-области, между доменами фрагмента Fc-области (например, между СН 2 и СН 3-доменами или между двумя СН 3-доменами), между связывающим доменом и шарниром или между вариабельным доменом и линкером. Типичные соединительные аминокислоты, расположенные в Nнаправлении от шарнира, включают RDQ (SEQ ID NO:607), RT, SS, SASS (SEQ ID NO:608) и SSS (SEQID NO:609). Типичные соединительные аминокислоты, расположенные в С-направлении от шарнира,включают аминокислоты SG. Дополнительные типичные соединительные аминокислоты включают SR. Полипептиды согласно настоящему описанию также могут включать линкеры, расположенные между различными доменами, как описано здесь. Типичные линкеры могут включать любые линкеры, приведенные в SEQ ID NOS:610-777. Иллюстративные линкеры, пригодные для соединения С-конца СН 3 домена с N-концом СН 1- или С-домена, приведены в 798-805. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновая Fc-область (например, СН 2-, СН 3- и/или СН 4-области) может обладать модифицированной картиной гликозилирования по сравнению с эталонной иммуноглобулиновой последовательностью. Например, для модификации одного или более определенных аминокислотных остатков, образующих сайт гликозилирования, например, N297 СН 2-домена(согласно нумерации ЕС), можно использовать любую из разнообразных генетических методик (см. Со etCancer Res. 65:7934; Warnock et al. (2005) Biotechnol. Bioeng. 92:831). В качестве альтернативы, можно сконструировать клетку-хозяина, продуцирующую иммуноглобулиновые связывающие полипептиды с модифицированной картиной гликозилирования. Один из способов, известных в данной области техники, например, обеспечивает модифицированное гликозилирование в виде разделенных пополам нефукозилированных вариантов, повышающих АКЦ. Эти варианты получают при экспрессии в клетке-хозяине,содержащей олигосахарид-модифицирующий фермент. В качестве альтернативы для снижения содержания фукозы в гликозилированных молекулах согласно настоящему описанию рассматривают технологиюPotelligent от BioWa/Kyowa Hakko. Согласно одному из известных способов, представлены клеткихозяева СНО для продукции рекомбинантных иммуноглобулинов, модифицирующие картину гликозилирования Fc-области иммуноглобулина за счет продукции GDP-фукозы. В качестве альтернативы для изменения картины гликозилирования гибридных полипептидов согласно настоящему описанию используют химические методики. Например, разнообразные ингибиторы гликозидазы и/или маннозидазы обеспечивают один или более желательных эффектов повышения АКЦактивности, повышения связывания с Fc-рецептором и модификации картины гликозилирования. В некоторых вариантах воплощения клетки экспрессирующие гибридные полипептиды согласно настоящему описанию выращивают в культуральной среде, включающей углеводный модификатор в концентрации,усиливающей АКЦ молекул иммуногликопротеина, продуцируемых указанной клеткой-хозяином, причем концентрация указанного углеводного модификатора составляет менее 800 мкМ. В одном из вариантов воплощения клетки, экспрессирующие эти полипептиды, выращивают в культуральной среде, включающей кастаноспермин или кифунензин, например, кастаноспермин в концентрации 100-800 мкМ, например, 100 мкМ, 200 мкМ, 300 мкМ, 400 мкМ, 500 мкМ, 600 мкМ, 700 мкМ или 800 мкМ. Способы модификации гликозилирования с помощью углеводного модификатора, например, кастаноспермина, представлены в патенте США 7846434 или публикации РСТWO 2008/052030. Структурные конфигурации/структуры иммуноглобулиновых связывающих полипептидов Иммуноглобулиновые связывающие полипептиды: антитела В настоящем описании представлены белки со связывающим доменом в форме антител или их антигенсвязывающих фрагментов, например, F(ab), F(ab')2, Fv, sFv и scFv. Моноклональные антитела, специфичные по отношению к RON или другой интересующей мишени, можно выделить, например, с помощью общеизвестных в данной области методик, например, методик, опубликованных в Kohler andBG. 2007. Methods Enzymol 426: 117-153; и Lane RD. 1985. J Immunol Methods 81: 223-228. Эти способы включают получение иммортализованных клеточных линий, способных продуцировать антитела с желательной специфичностью (т.е. способностью реагировать с интересующими полипептидами). Такие клеточные линии можно получить, например, из клеток селезенки, полученных от животного, иммунизированного согласно вышеприведенному описанию. Затем клетки селезенки иммортализуют путем, например, слияния с клетками миеломы, предпочтительно, изогенными иммунизированному животному. Можно использовать разнообразные методики слияния. Например, клетки селезенки и клетки миеломы можно объединять с неионогенным ПАВ в течение нескольких минут и затем высеять при низкой плотности на чашки с селективной средой, поддерживающей рост гибридных клеток,но не клеток миеломы. Одна из методик селекции использует селекцию по ГАТ (HAT; гипоксантину,аминоптерину, тимидину). По истечении достаточного времени, обычно приблизительно от 1 до 2 недель, выполняют наблюдение колоний гибридов. Отбирают одиночные колонии и проверяют связывающую активность их надосадочных жидкостей по отношению к полипептиду. Предпочтительными являются гибридомы, обладающие высокой реакционной способностью и специфичностью. Из надосадочных жидкостей растущих колоний гибридом можно выделить моноклональные антитела. Кроме того, можно использовать различные методики для повышения выхода, например, введение гибридомной клеточной линии в брюшную полость подходящего позвоночного-хозяина, например, мыши. Затем из асцитной жидкости или крови можно собрать моноклональные антитела. Загрязняющие компоненты из препарата антител можно удалить с помощью общепринятых методик, например, хроматографии, гель-фильтрации, осаждения и экстракции. Иммуноглобулиновые связывающие полипептиды: молекулы SMIP/PIMS В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый связывающий полипептид может включать "иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера" (SMIP). При этом термин SMIP относится к классу высокомодульных соединений, обладающих улучшенными лекарственными свойствами по сравнению с моноклональными и рекомбинантными антителами. SMIP включают одну полипептидную цепь, включающую специфичный по отношению к мишени связывающий домен на основе, например, вариабельного домена антитела, в комбинации с вариабельной Fcобластью, что позволяет осуществлять специфический рекрутинг эффекторных клеток желательного класса (например, макрофагов и естественных киллеров (NK-клеток и/или рекрутинг комплементопосредованного цитолиза. В зависимости от выбора мишени и шарнирных областей, SMIP могут стимулировать или блокировать сигнальные пути через рецепторы поверхности клеток. Таким образом, в общем случае, белки SMIP представляют собой гибридные белки "связывающий домениммуноглобулин", обычно включающие от N-конца к С-концу: связывающий домен, являющийся производным иммуноглобулина (например, scFv), шарнирную область и эффекторный домен (например, СН 2 и СН 3-области lgG). Как используется здесь, "иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера" или "продукты SMIP " соответствуют описанию в публикациях патентов США 2003/133939, 2003/0118592 и 2005/0136049 и публикациях международных патентов WO02/056910,WO2005/037989 и WO2005/017148. Два идентичных SMIP могут образовывать друг с другом гомодимер. В некоторых вариантах воплощения гибридный белок согласно изобретению, включающий RONсвязывающий домен, может включать SMIP в обратной ориентации, также называемый молекулойPIMS, например, согласно описанию в публикации патента США 2009/0148447 и публикации международного патента WO 2009/023386. Иммуноглобулиновые связывающие полипептиды: молекулы Scorpion/Xceptor В некоторых вариантах воплощения RON-связывающие домены согласно изобретению могут присутствовать в составе иммуноглобулинового связывающего полипептида, например, соответствующего описанию в заявках РСТWO 2007/146968 и US 2009/059446. В этом варианте воплощения иммуноглобулиновые связывающие полипептиды, также известные как полипептиды Scorpion/Xceptor и мультиспецифичные гибридные белки в настоящем документе, могут содержать RON-связывающий домен и домен, связывающий молекулу, не являющуюся RON ("гетерологичный связывающий домен"). В некоторых вариантах воплощения гетерологичный связывающий домен специфически связывается с молекулой-мишенью, включая Her1, Her2, Her3, CD3, рецептор эпидермального фактора роста (рЭФР,EGFR), c-Met, гликопротеин, богатый гистидином (HRG), ИФР-1, ИФР-2, ИФР-Р 1, ИФР-Р 2, CD72, EGF,ERBB3, HGF, CD44, CD151, СЕАСАМ 6, TROP2, DR5, cKIT, CD27, IL6, CD40, VEGF-R, PDGF-R, ТРФбета, CD44v6, CD151, Wnt и соматотропин-рилизинг-гормон (СРГ), но не ограничиваясь ими. Предполагают, что RON-связывающий домен может располагаться на N-конце, а гетерологичный связывающий домен - на С-конце мультиспецифичного гибридного белка. Кроме того, предполагают,что гетерологичный связывающий домен может располагаться на N-конце, а RON-связывающий домен может располагаться на С-конце. Как установлено выше, связывающие домены согласно настоящему изобретению с каждого конца можно объединить с промежуточным доменом (например, константной областью иммуноглобулина или ее подобластью). Кроме того, каждый из двух или более связывающих доменов можно соединить с промежуточным доменом через линкер, как описано здесь. Как используют здесь, "промежуточный домен" относится к аминокислотной последовательности,действующей попросту в качестве каркаса для одного или более связывающих доменов, так что гибридный белок существует преимущественно (например, приблизительно на 50% или более от количества гибридных белков) или в значительной степени (например, приблизительно на 90% или более от количества гибридных белков) в виде композиции одноцепочечного полипептида. Например, некоторые промежуточные домены могут выполнять структурную функцию (например, спейсерную, придание гибкости, жесткости) или биологическую функцию (например, повышенное время полужизни в плазме, например, в крови человека). Типичные промежуточные домены, способные повысить время полужизни гибридных белков согласно настоящему описанию в плазме, включают альбумин, трансферрин, каркасный домен, связывающий белок сыворотки и т.п. или их фрагменты. В некоторых вариантах воплощения промежуточный домен, входящий в состав мультиспецифического гибридного белка согласно настоящему описанию, представляет собой домен димеризации согласно описанию здесь. В некоторых вариантах воплощения два идентичных мультиспецифичных гибридных белка могут образовывать друг с другом гомодимер. Типичные структуры полипептидов, включающих RON-связывающий домен и называемых здесь молекулами Xceptor, включают N-BD1-X-BD2-C, N-BD2-X-BD1-C, где N и С представляют собой N- 23022984 конец и С-конец, соответственно; BD1 представляет собой RON-связывающий домен, например иммуноглобулин-подобный или иммуноглобулиновый связывающий домен вариабельной области, или внеклеточный домен; X представляет собой промежуточный домен, a BD2 представляет собой связывающий домен, являющийся гетерологичным связывающим доменом, т.е., связывающим доменом, связывающим белок, не являющийся RON, например, Her1, Her2, Her3, CD3, рецептор эпидермального фактора роста(рЭФР), c-Met, гликопротеин, богатый гистидоном (HRG), ИФР-1, ИФР-2, ИФР-Р 1, ИФР-Р 2, CD72, EGF,ERBB3, HGF, CD44, CD151, СЕАСАМ 6, TROP2, DR5, cKIT, CD27, IL6, IL6-R, hyperlL6, CD40, VEGF-R,PDGF-R, ТГФ-бета, CD44v6, CD151, Wnt и соматотропин-рилизинг-гормон (СРГ), но не ограничиваясь ими. В некоторых вариантах воплощения и BD1, и BD2 являются иммуноглобулин-подобными или иммуноглобулиновыми связывающими доменами вариабельной области, и такие полипептиды также можно называть белками "Scorpion". В некоторых конструктах X может включать константную область или подобласть иммуноглобулина, расположенную между первым и вторым связывающими доменами. В некоторых вариантах воплощения иммуноглобулиновый связывающий полипептид содержит промежуточный домен (X), включающий, от N-конца к С-концу, следующую структуру: -L1-X-L2-, где каждый из L1 и L2 независимо представляет собой линкер, включающий от приблизительно двух до приблизительно 150 аминокислот; а X представляет собой константную область или подобласть иммуноглобулина. В других вариантах воплощения иммуноглобулиновый связывающий полипептид содержит промежуточный домен, представляющий собой альбумин, трансферрин или белок, связывающий другой белок сыворотки, причем гибридный белок преимущественно или в значительной степени остается в виде композиции одноцепочечного полипептида. В других вариантах воплощения иммуноглобулиновый связывающий полипептид согласно настоящему описанию включает следующую структуру: N-BD1-X-L2-BD2-C, где BD1 представляет собойRON-связывающий домен, например, связывающий домен, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичный RON-связывающему домену, например, приведенному в SEQ ID NOS:87-93 и 157-159; -Хпредставляет собой -L1-CH2CH3-, где L1 представляет собой первый шарнир lgG1, необязательно мутированный путем замены первого или второго остатка цистеина, и где СН 2 СН 3- представляет собой СН 2 СН 3-область Fc-домена lgG1; L2 представляет собой линкер, выбранный из SEQ ID NOS:610-777; aBD2 представляет собой гетерологичный связывающий домен, связывающий молекулу, не являющуюсяRON. В некоторых вариантах воплощения в настоящем описании представлен Scorpion/Xceptor, включающий множественные RON-связывающие домены. В одном из вариантов воплощения множественныеRON-связывающие домены могут быть соединены один за другим и действовать аналогично BD1 илиBD2 структурам, описанным выше. В еще одном из вариантов воплощения оба связывающих домена молекулы Scorpion или Xceptor могут представлять собой RON-связывающие домены (например, и BD1,и BD2 представляют собой RON-связывающие домены). Иммуноглобулиновые связывающие полипептиды: гетеродимерные молекулы Иммуноглобулиновые связывающие полипептиды согласно изобретению также включают полипептидные гетеродимеры, образованные между двумя различными одноцепочечными полипептидами путем естественной гетеродимеризации СН 1-области иммуноглобулина и константной области легкой цепи иммуноглобулина (CL), соответствующих описанию в разделе Примеры настоящего документа и предварительных заявок США 61/290840, 61/365266 и 61/366743; международной заявки, озаглавленной"Полипептидный гетеродимер", "гетеродимер" или "Интерцептор", как используют здесь, относится к димеру, образованному из двух различных одноцепочечных гибридных полипептидов. В некоторых вариантах воплощения полипептидный гетеродимер включает по меньшей мере одну цепь (длинную цепь), более длинную, чем другая (короткая цепь). Этот термин не включает антитела, образованные из четырех одноцепочечных полипептидов (т.е. двух легких и двух тяжелых цепей). "Димер" относится к биологической структуре, состоящей из двух субъединиц, связанных друг с другом за счет внутримолекулярных сил одного или более типов, включая ковалентные связи (например, дисульфидные связи) и другие взаимодействия (например, электростатические взаимодействия, ионные связи, водородные связи и гидрофобные взаимодействия), и являющейся стабильной при соответствующих условиях (например,при физиологических условиях, в водном растворе, подходящем для экспрессии, очистки и/или хранения рекомбинантных белков, или при условиях неденатурирующего и/или невосстанавливающего электрофореза)."Одноцепочечный полипептид" или "одноцепочечный гибридный полипептид" представляет собой одиночную, линейную и непрерывную упорядоченную структуру из ковалентно соединенных аминокислот. Этот термин не включает две полипептидные цепи, соединенные друг с другом нелинейным образом, например, через дисульфидную связь между цепями (например, половину молекулы иммуноглобу- 24022984 лина, в которой легкая цепь соединяется с тяжелой цепью через дисульфидную связь). В некоторых вариантах воплощения одноцепочечный полипептид может содержать или образовывать одну или более дисульфидных связей внутри цепи. Одноцепочечный полипептид может содержать или не содержать связывающий домен, как описано выше. Например, в некоторых вариантах воплощения, два одноцепочечных полипептида конструируют таким образом, что они образуют гетеродимер, в котором один одноцепочечный полипептидный член гетеродимерной пары содержит, а другой член пары - не содержит связывающий домен. Таким образом, в этом варианте воплощения образованный гетеродимер действует как связывающая молекула за счет связывающего домена в одной из полипептидных цепей гетеродимерной пары."Иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации", как используют здесь, относится к иммуноглобулиновому домену ("первому иммуноглобулиновому домену гетеродимеризации"), который предпочтительно взаимодействует или ассоцииррует с другим доменом иммуноглобулина ("вторым иммуноглобулиновым доменом гетеродимеризации"), причем взаимодействие различных доменов гетеродимеризации вносит существенный вклад в гетеродимеризацию (т.е. образование димера из двух различных полипептидов, также называемого гетеродимером) или эффективно стимулирует ее. Типичные иммуноглобулиновые домены гетеродимеризации согласно настоящему описанию включают СН 1-область иммуноглобулина, CL-область иммуноглобулина (например, С- или С -изотипы) или их производные, как представлено здесь. В некоторых вариантах воплощения полипептидный гетеродимер согласно настоящему описанию включает (i) одноцепочечный полипептид ("первый одноцепочечный полипептид"), содержащий первый иммуноглобулиновый домен гетеродимеризации, и (ii) еще один одноцепочечный полипептид ("второй одноцепочечный полипептид"), содержащий второй домен гетеродимеризации, не идентичный первому домену гетеродимеризации, причем первый и второй домены гетеродимеризации вносят существенный вклад в образование полипептидного гетеродимера или эффективно стимулируют его. Взаимодействие(я) между первым и вторым доменами гетеродимеризации вносит существенный вклад или эффективно стимулирует гетеродимеризацию первого и второго одноцепочечных полипептидов, если имеет место статистически достоверное ослабление димеризации между первым и вторым одноцепочечными полипептидами при отсутствии первого домена гетеродимеризации и/или второго домена гетеродимеризации. В некоторых вариантах воплощения при совместной экспрессии первого и второго одноцепочечных полипептидов по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере от приблизительно 60 до приблизительно 70%, по меньшей мере от приблизительно 70 до приблизительно 80%, от приблизительно 80 до приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% и по меньшей мере от приблизительно 90 до приблизительно 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% молекул первых и вторых одноцепочечных полипептидов образуют друг с другом гетеродимеры. Технология гетеродимеризации, описанная здесь, обладает одним или более из следующих преимуществ: (1) минимальная иммуногенность полипептидных гетеродимеров ввиду того, что димеры образуются путем естественной гетеродимеризации СН 1-области иммуноглобулина и CL-области иммуноглобулина; (2) возможность эффективной продукции и очистки полипептидных гетеродимеров согласно настоящему описанию путем совместной экспрессии двух различных одноцепочечных полипептидов, как показано в примерах; (3) возможность опосредования Fc-эффекторных функций (например,КЗЦ, АКЦ, АКФ), которые можно усиливать или ослаблять с помощью мутагенеза, и увеличенное время полужизни в сыворотке ввиду того, что каждая цепь полипептидного гетеродимера согласно настоящему описанию содержит фрагмент Fc-области (например, СН 2- и СН 3-домены иммуноглобулина); и (4) размер полипептидных гетеродимеров согласно настоящему описанию обычно меньше молекулы антитела,что может дать возможность лучшего проникновения в ткани, например в солидные злокачественные опухоли. В одном аспекте в настоящем описании представлен гетеродимер, включающий только один связывающий домен, т.е. RON-связывающий домен. Этот гетеродимер состоит из более длинного одноцепочечного полипептида (содержащего RON-связывающий домен) и более короткого одноцепочечного полипептида (не содержащего связывающих доменов). Кроме того, каждая из обеих цепей гетеродимера также включает фрагмент Fc-области (например, СН 2-и/или СН 3-домены иммуноглобулина). В частности, в настоящем описании представлены одноцепочечные полипептиды и их полипептидные гетеродимеры, содержащие одиночный RON-связывающий домен и пары доменов гетеродимеризации С-СН 1 или С-СН 1 или комбинацию этих пар. В наиболее простой форме полипептидные гетеродимеры (также известные как Интерцепторы) получают путем совместной экспрессии двух неравных цепей, одна из которых содержит С- или С -домен, а другая цепь содержит СН 1-область. Например,первая полипептидная цепь, обозначаемая как длинная цепь, содержит RON-связывающий домен в форме scFv, и СН 1-домен гетеродимеризации, в то время как в другой цепи, обозначаемой как короткая цепь, связывающий домен отсутствует, но присутствует С-домен гетеродимеризации. Полипептидные гетеродимеры (Интерцепторы) обычно одновалентно связываются с мишенью - белком RON, и идеально подходят для блокирования взаимодействия рецептор/лиганд или рецептор/рецептор и предотвращения активации клеток за счет поперечного сшивания рецептора. Другие преимущества перед, например, Fab,включают увеличенное время полужизни в сыворотке и простоту очистки вследствие наличия Fcдоменов. Молекулы Интерцепторы могут содержать RON-связывающий домен на N-конце или на Сконце. В еще одном аспекте в настоящем описании представлен полипептидный гетеродимер ("мультиспецифичный гетеродимер"), образованный путем ассоциации двух различных одноцепочечных полипептидов, в котором содержится более одного связывающего домена, в частности, по меньшей мере одинRON-связывающий домен и по меньшей мере один связывающий домен, связывающий мишень, не являющуюся RON. В некоторых вариантах воплощения гетеродимер может быть биспецифичным или мультиспецифичным. В этом аспекте в настоящем описании представлен полипептидный гетеродимер, в котором первый одноцепочечный полипептид (ОЦП-I, SCP-I) включает, состоит главным образом из или состоит из одного-четырех связывающих доменов, специфически связывающихся с одной-четырьмя мишенями, шарнира (Ш-1, Н-1), иммуноглобулинового домена гетеродимеризации (ДГ-1, HD-I) и фрагмента Fc-области (OFO-I, FRP-I), в то время как второй одноцепочечный полипептид (ОЦП-II, SCP-II) включает, состоит главным образом из или состоит из нуля-четырех связывающих доменов, специфически связывающихся с нулем-четырьмя мишенями, шарнира (Ш-II, H-II), иммуноглобулинового домена гетеродимеризации (ДГ-11, HD-II) и фрагмента Fc-области (ФFO-II, FRP-II), при условии, что полипептидный гетеродимер включает по меньшей мере два связывающих домена, специфически связывающиеся по меньшей мере с двумя различными мишенями. Ш-I и Ш-II могут иметь одну и ту же последовательность,но могут различаться. ФFO-I и ФFO-II могут иметь одну и ту же последовательность, но могут различаться. Отдельные компоненты полипептидных гетеродимеров согласно настоящему описанию подробно описаны здесь. Если одноцепочечный полипептид мультиспецифичного гетеродимера включает одиночный связывающий домен, этот связывающий домен может быть расположен в N-направлении или в С-направлении от Fc-области одноцепочечного полипептида. Например, одноцепочечный полипептид, включающий два связывающих домена, может содержать один связывающий домен, расположенный в N-направлении, а другой - в С-направлении от фрагмента Fc-области одноцепочечного полипептида, или оба связывающих домена могут быть расположены в N-направлении или в С-направлении от фрагмента Fc-области. В другом примере одноцепочечный полипептид может включать три связывающих домена, причем (а) два связывающих домена расположены на различных белковых цепях в N-направлении, а третий связывающий домен - в С-направлении от фрагмента Fc-области на ОЦП-I или ОЦП-II, (b) два связывающих домена расположены на различных белковых цепях в С-направлении, а третий связывающий домен - в Nнаправлении от фрагмента Fc-области на ОЦП-I или ОЦП-II. В другом примере полипептидный гетеродимер может включать четыре связывающих домена, причем два связывающих домена располагаются вN-направлении от фрагмента Fc-области на разных одноцепочечных полипептидах, а другие два связывающих домена располагаются в С-направлении от фрагмента Fc-области на разных цепях. В качестве альтернативы, в любых из указанных вариантов воплощения два связывающих домена могут быть соединены один за другим и расположены на ОЦП-I и/или ОЦП-II, в зависимости от количества присутствующих связывающих доменов многоуровневый тандем используется, если в ОЦП-I и ОЦП-II присутствуют от пяти до восьми объединенных связывающих доменов. Таким образом, в некоторых вариантах воплощения гетеродимер включает по меньшей мере одинRON-связывающий домен, и может включать один или более дополнительных связывающих доменов,связывающихся с гетерологичным белком-мишенью, включая TCR, CD3, Her1, Her2, Her3, рецептор эпидермального фактора роста (рЭФР, EGFR), c-Met, гликопротеин, богатый гистидином (HRG), ИФР-1,ИФР-2, ИФР-Р 1, ИФР-Р 2, CD72, EGF, ERBB3, HGF, CD44, CD151, СЕАСАМ 6, TROP2, DR5, cKIT,CD27, IL6, IL6-R, hyperlL6, CD40, VEGF-R, PDGF-R, ТРФ-бета, CD44v6, CD151, Wnt и соматотропинрилизинг-гормон (СРГ), но не ограничиваясь ими. В одном частном варианте воплощения первый одноцепочечный полипептид включает анти-RON-связывающий домен, а второй одноцепочечный полипептид включает TCR-связывающий домен, например, CD3-связывающий домен. В дополнительном варианте воплощения первый одноцепочечный полипептид включает анти-RON-связывающий домен, а второй одноцепочечный полипептид включает анти-с-Met-связывающий домен. В другом варианте воплощения первый одноцепочечный полипептид включает анти-RON-связывающий домен, а второй одноцепочечный полипептид включает анти-CD19-связывающий домен. Связывание мишени связывающим доменом регулирует взаимодействие между мишенью (например, антигеном, рецептором или лигандом) и другой молекулой. В некоторых вариантах воплощения связывание мишени (например, рецептора) связывающим доменом стимулирует некоторые функции мишени (например, передачу сигнала) или сближает различные мишени, делая возможным биологический эффект (например, направление Т-клеток к опухоли, которая, в свою очередь, активирует Т-кпетки). В некоторых других вариантах воплощения связывание мишени связывающим доменом блокирует взаимодействие между мишенью и другой молекулой и, таким образом, мешает, ограничивает или устраняет некоторые функции мишени. В похожем аспекте в настоящем описании представлен полипептидный гетеродимер, образованный путем ассоциации двух различных одноцепочечных полипептидов, включающих два или более связывающих домена, каждый из которых связывает RON. Такой полипептидный гетеродимер может быть аналогичен мультиспецифичному гетеродимеру, описанному здесь, за исключением того, что его связывающие домены связываются только с RON, в отличие от связывающих доменов мультиспецифичного гетеродимера, которые связывают, по меньшей мере, две различных мишени. Изготовление иммуноглобулиновых связывающих полипептидов С целью эффективной продукции любого из описанных здесь связывающих полипептидов можно использовать лидерный пептид для облегчения секреции экспрессированных полипептидов. Ожидается,что использование любого из общепринятых лидерных пептидов (сигнальных последовательностей) направляет вновь экспрессированные полипептиды по секреторному пути и приводит к отщеплению лидерного пептида от зрелого полипептида по сайту соединения лидерного пептида и полипептида или вблизи него. Конкретный лидерный пептид выбирают, основываясь на известных в данной области техники соображениях, например использовании последовательностей, кодируемых полинуклеотидами,дающими возможность легкого внедрения сайта расщепления эндонуклеазами рестрикции в начале или в конце кодирующей последовательности лидерного пептида для облегчения молекулярной инженерии,при условии, что внедренные последовательности обозначают аминокислоты, не вносящие неприемлемых помех в желательный процессинг лидерного пептида во вновь экспрессированном белке или в желательную функцию полипептида, если лидерный пептид не отщепляется во время созревания полипептидов. Типичные лидерные пептиды согласно настоящему описанию включают естественные лидерные последовательности (т.е. экспрессирующиеся с нативным белком) или гетерологичные лидерные последовательности, например, H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG(X)n-CO2H, где X представляет собой любую аминокислоту, а n равно от нуля до трех (SEQ ID NOS:778-781), или H3N-MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG-CO2H (SEQ ID NO:782). Как отмечено здесь, рассматриваются варианты и производные связывающих доменов, например,внеклеточные домены, вариабельные области легкой и тяжелой цепей и CDR, описанные здесь. В одном из примеров представлены варианты инсерций, в которых один или более аминокислотных остатков дополняет аминокислотную последовательность специфического связывающего агента. Инсерций могут располагаться на любом или обоих концах белка или во внутренних областях аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Варианты продуктов согласно настоящему описанию также включают зрелые продукты специфических связывающих агентов, т.е. продукты специфических связывающих агентов, в которых удален лидер или сигнальная последовательность, и полученный белок содержит дополнительные N-концевые остатки. Дополнительные N-концевые остатки могут являться производными другого белка или могут включать один или более остатков, не идентифицируемых как производные определенного белка. Полипептиды с дополнительным остатком метионина в положении -1 рассматривают как полипептиды согласно настоящему описанию с дополнительными остатками метионина и лизина в положениях -2 и -1. Варианты, содержащие дополнительные остатки Met, Met-Lys илиLys (или один или более основных остатков в целом) являются особенно полезными для усиленной продукции рекомбинантного белка в бактериальных клетках-хозяевах. Как используют здесь, термин "аминокислоты" относится к природной (встречающейся в природе) аминокислоте, замещенной природной аминокислоте, неприродной аминокислоте, замещенной неприродной аминокислоте или любой их комбинации. Обозначения природных аминокислот установлены здесь согласно стандартному одно- или трехбуквенному коду. Природные полярные аминокислоты включают аспарагин (Asp или N) и глутамин (Gin или Q); а также основные аминокислоты, например,аргинин (Arg или R), лизин (Lys или K), гистидин (His или Н) и их производные, и кислые аминокислоты, например, аспарагиновую кислоту (Asp или D) и глутаминовую кислоту (Glu или Е) и их производные. Природные гидрофобные аминокислоты включают триптофан (Trp или W), фенилаланин (Phe илиF), изолейцин (Ilе или I), лейцин (Leu или L), метионин (Met или М), валин (Val или V) и их производные; а также другие неполярные аминокислоты, например, глицин (Gly или G), аланин (Ala или А), пролин (Pro или Р) и их производные. Природные аминокислоты с промежуточной полярностью включают серии (Ser или S), треонин (Thr или Т), тирозин (Tyr или Y), цистеин (Cys или С) и их производные. Если не указано иное, любая аминокислота, описанная здесь, может быть в D - или L-конфигурации. Замещенные варианты включают полипептиды, в аминокислотной последовательности которых один или более аминокислотных остатков удалены и замещены альтернативными остатками. В некоторых вариантах воплощения замены являются консервативными по природе; вместе с тем, настоящее описание охватывает и замены, являющиеся неконсервативными. Аминокислоты можно классифицировать по физическим свойствам и их вкладу во вторичную и третичную структуру белка. Консервативную замену в данной области техники понимают как замену аминокислоты на другую аминокислоту с аналогичными свойствами. Типичные консервативные замены приведены непосредственно ниже в табл. 1 (см. В качестве альтернативы консервативные аминокислоты можно группировать согласно описанию вLehninger (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp,71-77), как приведено непосредственно ниже в табл. 2. Таблица 2. Консервативные замены II Варианты и производные также могут содержать дополнительные аминокислотные остатки, являющиеся следствием использования специфических систем экспрессии. Например, использование доступных для приобретения векторов, экспрессирующих желательный полипептид как часть гибридного продукта с глутатион-S-трансферазой (GST), обеспечивает получение желательного полипептида, содержащего дополнительный остаток глицина в положении -1 после отщепления GST-компонента от желательного полипептида. Кроме того, рассматриваются варианты, являющиеся результатом экспрессии в других векторных системах, включая варианты, аминокислотная последовательность которых содержит встроенные гистидиновые маркеры, обычно на С- и/или N-конце. Кроме того, рассматриваются варианты делеций, в которых один или более аминокислотных остатков удалены из связывающего агента согласно настоящему описанию. Делеций могут иметь место на одном или обоих концах гибридного белка или вследствие удаления одного или более остатков в пределах аминокислотной последовательности. В некоторых иллюстративных вариантах воплощения иммуноглобулиновые связывающие полипептиды согласно изобретению являются гликозилированными, причем картина гликозилирования зависит от разнообразных факторов, включая клетку-хозяина, в которой происходит экспрессия белка (если его получают в рекомбинантных клетках-хозяевах) и условия культивирования. В этом описании также представлены производные иммуноглобулиновых связывающих полипептидов. В некоторых вариантах воплощения модификации являются ковалентными по природе и включают, например, химическое связывание с полимерами, липидами, другими органическими соединениями и неорганическими группами. Производные согласно настоящему описанию можно получить с целью увеличения времени полужизни специфического полипептида со связывающим доменом в циркуляторном русле или для улучшения способности к адресному воздействию полипептида на желательные клетки, ткани или органы. Настоящее описание также охватывает связывающие полипептиды, являющиеся ковалентно модифицированными или образующие производные, включающие одну или более водорастворимых полимерных групп, например, полиэтиленгликоль, полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, как описано в патентах США 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 и 4179337. Другие полезные полимеры, известные в данной области техники, включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран,целлюлозу и другие полимеры на основе углеводов, поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные многоатомные спирты (например, глицерин) и поливиниловый спирт, а также смеси этих полимеров. Особенно предпочтительными являются полиэтиленгликоль(ПЭГ)-модифицированные белки. Водорас- 28022984 творимые полимеры можно связывать со специфическими положениями, например с N-концом белков и полипептидов согласно настоящему описанию, или присоединять случайным образом к одной или более боковых цепей полипептида. Использование ПЭГ для улучшения терапевтических свойств описано в патенте США 6133426. В одном из вариантов воплощения иммуноглобулиновый связывающий полипептид представляет собой гибридный белок, включающий иммуноглобулин или Fc-гибридный белок. Такой гибридный белок может обладать длительным временем полужизни, например, несколько часов, сутки или более или даже неделю или более, особенно если Fc-домен способен взаимодействовать с FcRn, неонатальным Fcрецептором. Сайт связывания с FcRn в Fc-домене также представляет собой сайт, с которым связываются бактериальные белки А и G. Прочное связывание с этими белками можно использовать в качестве средства очистки антител или гибридных белков согласно настоящему описанию, например, путем использования аффинной хроматографии с белком А или белком G во время очистки белка. В некоторых вариантах воплощения Fc-домен гибридного белка необязательно является мутированным для устранения взаимодействия с FcyRI-III при сохранении взаимодействия с FcRn. Специалистам хорошо известны методики очистки белков. Эти методики включают на одном уровне грубое фракционирование полипептидных и неполипептидных фракций. Часто для достижения частичной или полной очистки (или очистки до гомогенного состояния) желательна дальнейшая очистка с помощью методик хроматографии и электрофореза. Аналитические методики в особенности подходящие для получения чистого полипептида, представляют собой ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, электрофорез в полиакриламидном геле и изоэлектрическое фокусирование. Особенно эффективные способы очистки пептидов представляют собой быструю жидкостную хроматографию белков и ВЭЖХ. Некоторые аспекты настоящего описания касаются очистки и, в определенных вариантах воплощения, усиленной очистки полипептида. Термины "очищенный полипептид" и "очищенный гибридный белок" используются здесь на равных основаниях и относятся к композиции, отделяемой от других компонентов и очищенной до любой степени, сопоставимой с состоянием, получаемым в естественных условиях. По этой причине очищенный полипептид также относится к полипептиду, свободному от своего естественного окружения. В общем случае "очищенный" относится к полипептидной композиции, подвергнутой фракционированию с целью удаления других различных компонентов и в значительной степени сохраняющей проявляемую биологическую активность. При использовании термина "практически очищенный" это определение относится к полипептидной композиции, в которой полипептид является главным компонентом,составляя приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99% или более от массы полипептидов в композиции. В свете настоящего описания специалистам известны различные способы количественной оценки степени очистки. Они включают, например, определение специфической связывающей активности активной фракции или оценку количества полипептида во фракции путем электрофореза в ДСН-ПААГ. Предпочтительным способом оценки чистоты белковой фракции является расчет связывающей активности этой фракции для ее сравнения со связывающей активностью исходного экстракта и, таким образом,расчета степени очистки, оцениваемой здесь по "кратному числу очистки". Фактические единицы, используемые для количественного представления связывающей активности, несомненно, зависят от конкретной методики анализа, выбранной для отслеживания очистки, и от того, проявляет ли экспрессированный гибридный белок обнаруживаемую связывающую активность или нет. Специалистам хорошо известны различные методики, подходящие для использования при очистке белков. Они включают, например, осаждение с сульфатом аммония, ПЭГ, антителами и т.п. или за счет термической денатурации с последующим центрифугированием; хроматографические этапы, например,ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, обращенно-фазную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите и аффинную хроматографию; изоэлектрическое фокусирование; гель-электрофорез; и комбинации этих и других методик. Как известно в данной области техники, считается, что при изменении порядка выполнения различных этапов очистки и пропуске некоторых этапов способ может оставаться пригодным для получения практически очищенного белка. В общем случае требования о том, чтобы связывающий полипептид всегда был представлен в наиболее очищенном состоянии, отсутствуют. Фактически предполагается, что белок, очищенный в меньшей степени, найдет применение в некоторых вариантах воплощения. Частичную очистку можно выполнить, используя комбинацию из меньшего количества этапов очистки, или используя различные формы одной и той же общей схемы очистки. Например, принимают во внимание, что катионообменная колоночная хроматография, выполняемая на аппаратуре ВЭЖХ, обычно приводит к большей степени очистки по сравнению с этой же методикой, выполняемой с помощью системы хроматографии низкого давления. Способы, позволяющие добиться меньшей степени относительной очистки, могут обладать преимуществами в общем восстановлении белкового продукта или в поддержании связывающей активности экспрессированного белка.