Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их производства и применения

ФОСФОЛИПАЗЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРОИЗВОДСТВА И ПРИМЕНЕНИЯ Раскрываются ферменты с активностью фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PIPLC), кодирующие их нуклеиновые кислоты; антитела, специфически связывающиеся с ними; и способы их изготовления и применения; также обеспечиваются промышленные способы и продукты, включающие применение этих фосфолипаз. Кроме того, приводятся способы гидратации для негидрируемых фосфолипидов (НГФ) в липидном матриксе для обеспечения миграции НГФ на границу раздела масло-вода для осуществления реакции и/или удаления НГФ из липидов. Кроме того, приведен способ удаления НГФ, гидрируемых фосфолипидов и лецитинов из растительных масел для получения дегумированного масла или жирового продукта, которые можно применять для производства продуктов питания и/или непищевых приложений.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Ссылка на список последовательностей, представленных через EFS-WEB Данная заявка была подана в электронной форме через сервер USPTO EFS-WEB, что разрешено и указано в МРЕР 502.05 (IX), и эти поданные в электронной форме документы включают представленный в электронной форме список последовательностей (SEQ ID); полное содержание этого списка последовательностей включено в настоящий документ в качестве ссылки для любых целей. Список последовательностей обозначен на поданном в электронном виде файле .txt следующим образом: Область изобретения Настоящее изобретение относится, главным образом, к ферментам фосфолипазам, полинуклеотидам, кодирующим эти ферменты, способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к ферментам фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), нуклеиновым кислотам, кодирующим их, антителам,которые специфично связываются с ними, и способам их получения и применения. Предусматриваются промышленные способы и продукты, включающие применение этих фосфолипаз. Также в настоящем документе предусматриваются способы гидратации негидратируемых фосфолипидов (NHP) в липидной матрице. Способы обеспечивают миграцию NHP к поверхности контакта масло-вода, тем самым позволяя проведение реакции или удаление NHP из липидов. В определенных вариантах осуществления предусматриваются способы удаления NHP, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности известных как "камеди") из растительных масел с получением продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства продуктов питания и/или непищевых применений. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусмотрены способы гидратацииNHP с последующей ферментативной обработкой и удалением различных фосфолипидов и лецитинов. Способы, представленные в настоящем документе, можно применять на практике либо для неочищенных, либо для рафинированных гидратацией масел. В определенном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены способы получения фосфолипидов из пищевого масла. Уровень техники Неочищенные растительные масла, получаемые способами либо прессования, либо экстракции растворителем, представляют собой комплексную смесь триацилглицеринов, фосфолипидов, стеринов, токоферолов, свободных жирных кислот, металлических микроэлементов и других менее значительных соединений. Является желательным удаление фосфолипидов, свободных жирных кислот и металлических микроэлементов для получения качественного салатного масла с мягким вкусом, светлым цветом и длительным сроком годности или масла, пригодного для преобразования в сырье, готовое для химической или ферментативной конверсии в биотопливо (метиловые или этиловые сложные эфиры), биопластик (эпоксидированное масло) и другие традиционные материалы на основе нефти. Удаление фосфолипидов обуславливает практически все потери, связанные с очисткой растительных масел. Большинство молекул фосфолипидов обладают как гидрофильной функциональной группой,так и липофильными цепями жирных кислот, они обычно являются превосходными природными эмульгаторами. Функциональная группа в фосфолипидах может представлять собой любую или несколько из множества известных типов, некоторые из которых проиллюстрированы на схеме 1 ниже. Схема 1 Функциональные группы в фосфолипидах Фосфолипиды, содержащие функциональные группы -холин, -инозитол и -этаноламин, обладают наилучшей аффинностью к воде, в то время как кислоты, соли кислот (с кальцием (Са), магнием (Mg) и железом (Fe и соли -этаноламина (Са, Mg и Fe) обладают значительно более низкой аффинностью к воде. Фосфатидная кислота и соли фосфатидной кислоты широко известны как "негидратируемые фосфолипиды" или NHP. Табл. 1 содержит относительные степени гидратации различных фосфолипидов,как описано в Sen Gupta, А.K., Fette Seifen Anstrichmittel 88, pages 79-86 (1986), и позднее в Segers, J.С, et Соли фосфолипидов с кальцием, магнием и железом образуются ферментом, присутствующим в масличных семенах, фосфолипазой D (PLD). Фермент остается бездействующим в зрелом семени до тех пор, пока не повреждается защитное покрытие семени в ходе хранения или "подготовки" семян перед извлечением масла. Реакция PLD в семени приводит к отщеплению -холина, -инозитола, -серина или-этаноламина от фосфатной группы с образованием фосфатидной кислоты (РА). Кроме того, поскольку отщепление происходит в присутствии избытка двухвалентных металлов (Са, Mg и Fe), образуются NHP. Комплекс фосфатидной кислоты с ионами кальция представлен ниже Фосфолипиды обычно измеряют в масле в качестве "содержания фосфора" в миллионных долях. В табл. 2 представлены типичные количества фосфолипидов, присутствующих в основных масличных культурах, и распределение различных функциональных групп в качестве процента фосфолипидов, присутствующих в масле. Таблица 2 Типичные уровни и распределение фосфолипидов для основных масличных семян В табл. 3 ниже представлены типичные количества и распределения фосфолипидов для соевых камедей. В табл. 3, "как есть" означает типичную композицию фосфолипидов, удаленных из растительного масла, с удерживаемым маслом (2 молекулы фосфолипидов и 1 молекула масла), дающую содержание не растворимых в ацетоне веществ, равное 67%. "Нормализованная" означает композицию фосфолипидов без какого-либо присутствующего масла, дающую содержание не растворимых в ацетоне веществ, равное 100%. Таблица 3 Типичные количества фосфолипидов и распределения для соевых камедей Конверсия фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола и фосфатидной кислоты в их лизо- или фосфоформы значительно изменяет экономические показатели рафинирования в современном промышленном процессе очистки. Конверсия всех фосфолипидов в их лизоформы, устраняющая потерю нейтральных масел, соответствует увеличению выхода вплоть до 1,4%,в то время как конверсия всех фосфолипидов в их фосфоформы соответствует увеличению выхода масла вплоть до 3,0% для неочищенного масла с содержанием фосфора 1000 м.д. на протяжении рафинирования гидратацией. Фосфолипиды можно частично или полностью удалять из растительных масел несколькими различными известными способами. Наиболее широко используемыми процессами в промышленности является рафинирование гидратацией, рафинирование кислотой, очистка щелочью и ферментативное рафинирование. Иллюстративные способы описаны в патентах США 4049686; 4698185; 5239096; 5264367; 5286886; 5532163; 6001640; 6103505; 6127137; 6143545; 6172248; 6548633; 7494676 и 7226771 и публикациях США 2007/0134777, 2005/0059130, 2008/0182322 и 2009/0069587. Существующие способы не являются достаточными для удаления или реакции негидратируемых фосфолипидов, присутствующих в масле, поскольку NHP не доступны для гидратации или реакции для обеспечения их удаления. Существует потребность в экономичных и эффективных способах удаления NHP, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности известных как "камеди") из растительных масел для получения продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства продуктов питания и/или непищевых применений. Фосфолипазы представляют собой ферменты, которые гидролизуют сложноэфирные связи фосфолипидов. В соответствии с их значением в метаболизме фосфолипидов эти ферменты широко распространены среди прокариот и эукариот. Фосфолипазы влияют на метаболизм, конструирование и реорганизацию биологических мембран и вовлечены в каскады передачи сигнала. Известно несколько типов фосфолипаз, которые отличаются их специфичностью в зависимости от положения связи, на которую осуществляется воздействие в молекуле фосфолипида. Ферменты фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC) представляют собой семейство эукариотических внутриклеточных ферментов, которые играют важную роль в процессах передачи сигнала. Катализируемая PI-PLC реакция представляет собой 1-фосфатидил-1D-миоинозитол 4,5-бифосфат (также называемый PIP2, фосфатидилинозитолбифосфатом) + Н 2 О 1D-миоинозитол 1,4,5-трифосфат (также называемый IP3, инозитолтрифосфатом) + диацилглицерин. Семейства ферментов фосфолипазы С (PLC) идентифицированы в бактериях и в эукариотических трипаносомах. Ферменты PLC относятся к семейству гидролаз и фосфодиэстераз. PLC участвуют в метаболизме фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата (PIP2) и каскадах липидной передачи сигнала зависимым от кальция образом. Изоформы PLC могут отличаться их способом активации, уровнями экспрессии, каталитической регуляцией, локализацией в клетке, авидностью связывания с мембранами и распределением в тканях. Все они способны катализировать гидролиз PIP2 на две важных молекулы вторичных посредников, которые продолжают каскад для изменения клеточных ответов, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, ремоделирование цитоскелета, везикулярный транспорт, проводимость ионных каналов, эндокринная функция и нейротрансмиссия. PLC описаны, например, в Carmen G., J. Biol. Chem. 270 (1995) 18711-18714, Jianag Y., J. Biol. Chem, 271 (1996) 29528-29532, Waggoner D., J. Biol. Chem. 270(1995) 19422-19429, Molecular Probes Product Sheet 2001, и Sano et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281: 844-851, 2001. Ферменты фосфолипазы A1 (PLA1) удаляют жирную кислоту в 1 положении с образованием свободной жирной кислоты и 1-лизо-2-ацилфосфолипида. Ферменты фосфолипазы А 2 (PLA2) удаляют жирную кислоту во 2 положении с образованием свободной жирной кислоты и 1-ацил-2 лизофосфолипида. Ферменты PLA1 и PLA2 могут быть внутри- или внеклеточными, мембраносвязан-3 022979 ными или растворимыми. Внутриклеточная PLA2 встречается практически в каждой клетке млекопитающих. Ферменты фосфолипазы С (PLC) удаляют фосфатную группу с образованием 1,2 диацилглицерина и фосфатного сложного эфира. Ферменты фосфолипазы D (PLD) образуют 1,2 диацилглицерофосфат и основную группу. Сущность изобретения В настоящем документе предусматриваются полипептиды и полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, имеющие активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC) или эквивалентного фермента и/или активность другой фосфолипазы, включая активность фосфолипазы А, В, С,D, пататина, фосфатазы фосфатидной кислоты (РАР) и/или ацилгидролазы липидов (LAH) или эквивалентного фермента, и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В одном аспекте в настоящем документе предусматриваются полипептиды, например ферменты, обладающие активностью фосфолипазы, например активностью фосфолипазы А, В, D или С, например активностью фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC). Ферментативная активность полипептидов и пептидов, представленных в настоящем документе, включает (содержит или состоит из) активность фосфолипазы, активность фосфолипазы С или активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), включая гидролиз липидов, реакции ацидолиза (например, замена этерифицированной жирной кислоты свободной кислотой), реакции транс-этерификации (например, обмен жирными кислотами между триацилглицеридами), синтез сложных эфиров, реакции переэтерификации и активность ацилгидролазы липидов (LAH). В другом аспекте полипептиды, представленные в настоящем документе, используют для синтеза энантиомерно чистых хиральных продуктов. Полипептиды, представленные в настоящем документе, можно использовать в различных фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных контекстах, включая производство косметических средств и нутрицевтиков. Кроме того, полипептиды, представленные в настоящем документе, можно использовать в пищевой промышленности, пивоварении, добавках для ванн, производстве спирта, синтезе пептидов, энантиоселективности, получении шкур в кожевенной промышленности, обработке отходов и деградации животных отходов, регенерации серебра в фотопромышленности, медицинском обслуживании, обесклеивании шелка, деградации биопленки, конверсии биомассы в этанол, биологической защите, противомикробных средствах и дезинфицирующих средствах, средствах для персонального ухода и косметических средствах, биотехнологических реагентах, в увеличении выхода крахмала в процессе влажного измельчения кукурузы и в качестве фармацевтических средств, таких как способствующие пищеварению средства и противовоспалительные (антифлогистонные) средства. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусматриваются композиции(например, фосфолипаза, фосфолипаза С, фосфатидилинозитол-специфическая фосфолипаза С (PI-PLC и способы получения масел с низким содержанием фосфолипидов, например масел с более низким содержанием фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола и/или фосфатидной кислоты. Композицией или способом, предусмотренными в настоящем документе,можно обрабатывать любое масло, например растительное масло, например масло канолы, соевое масло или животное масло, или жир, например сало. Любые продукты питания, готовые в пищу продукты или продукты выпекания, жарки или варки (например, соусы, маринады, приправы, распыляемые масла, маргарины, масла для выпекания, майонез, кулинарные жиры, салатные масла, черпаемые ложкой и наливаемые приправы и т.п. и продукты, изготовленные с ними) могут содержать растительное масло или животный жир, обработанные композицией или способом, предусмотренными в настоящем документе. Растительные масла, модифицированные масла с более низким содержанием фосфолипидов можно применять в любых продуктах питания, годных в пищу продуктах или продуктах выпекания или варки, например соусах, маринадах, приправах, распыляемых маслах, маргаринах, маслах для выпекания, майонезе, кулинарных жирах, салатных маслах, черпаемых ложкой и наливаемых приправах и т.п. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены масла, такие как растительные масла, например масло канолы или соевое масло, и продукты питания или продукты выпекания или варки, включая соусы, маринады, приправы, распыляемые масла, маргарины, масла для выпекания, майонез, кулинарные жиры, салатные масла, черпаемые ложкой и наливаемые приправы и т.п., где масло или продукт питания, продукт выпекания или варки модифицированы с использованием фермента, представленного в настоящем документе. В одном аспекте эти растительные масла, например масло канолы, касторовое масло, кокосовое масло, кориандровое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло лесного ореха,конопляное масло, льняное масло, масло пенника лугового, оливковое масло, пальмовое масло, пальмоядровое масло, арахисовое масло, рапсовое масло, рисовое масло, сафлоровое масло, масло сасанквы,соевое масло, подсолнечное масло, таловое масло, масло камелии, различные виды "природных" масел,имеющих измененный состав жирных кислот, полученных с помощью генетически модифицированных организмов (GMO) или традиционной "селекции", такие как высокоолеиновое, низколиноленовое или низконасыщенное масло (высокоолеиновое масло канолы, низколиноленовое соевое масло или высокостеариновые подсолнечные масла), животные жиры (таловый жир, сало, жир масла и куриный жир), рыбий жир (жир тихоокеанской корюшки, жир печени трески, жир хоплостета, жир сардин, жир сельди и жир менхадена) или смеси любых из указанных выше, и продукты питания или продукты выпекания,-4 022979 жарки или варки, содержат масла с более низким содержанием жирных кислот, включая масла с низким содержанием пальмитиновой кислоты, миристиновой кислоты, лауриновой кислоты, стеариновой кислоты, каприловой кислоты (октановая кислота) и т.д., переработанные с использованием композиции или способа, представленных в настоящем документе. В одном аспекте в настоящем документе предусмотрены полипептиды, например ферменты и каталитические антитела, обладающие активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), термостабильными и термоустойчивыми видами ферментативной активности, и специфическими к жирным кислотам или селективными к жирным кислотам видами активности, и видами ферментативной активности, устойчивыми к низким или высоким значениям рН, и полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, включая векторы, клеткихозяева, трансгенные растения и не являющиеся человеком животные, и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В другом аспекте в настоящем документе предусматриваются выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты (а), кодирующие полипептид, обладающий ферментативной активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), и(i) обладающие по меньшей мере приблизительно 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичностью последовательности с SEQID NO: 5 и кодирующие полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть,семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три,двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в табл. 12, 13, 14 и/или 15, или эквивалентных аминокислотных замен или мутаций, или любую их комбинацию,и необязательно идентичность последовательностей определяют с помощью анализа с алгоритмом сравнения последовательностей или визуальным исследованием,и необязательно алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм BLAST версии 2.2.2, где установлены параметры фильтрования blastall-p blastp-d "nr pataa" -F F, и все другие параметры установлены как параметры по умолчанию;SEQ ID NO: 6 и имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять,десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в табл. 12, 13, 14 и/или 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию.(iii) гибридизующиеся в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 5 и кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь,девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в табл. 12,13, 14 и/или 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию,где жесткие условия включают стадию промывания, включающую промывание в 0,2 Х SSC при температуре приблизительно 65 С в течение приблизительно 15 мин;(iv) представляющие собой нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или состоящую из них; или(v) имеющие по меньшей мере приблизительно 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10;(b) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (а), кодирующая полипептид, имеющий ферментативную активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (PI-PLC), но лишенная нативной сигнальной последовательности или аминокислотной последовательности пробелка;(c) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (а) или (b), кодирующая полипептид, обладающий ферментативной активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), но лишенная нативной промоторной последовательности;(d) нуклеиновая кислота согласно (с), кроме того, содержащая гетерологичную промоторную по-5 022979 следовательность или другую последовательность регуляции транскрипции;(e) последовательность нуклеиновой кислоты по любому из (a)-(d), кроме того, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичную аминокислотную последовательность, или, кроме того,содержащую гетерологичную нуклеотидную последовательность;(f) нуклеиновая кислота согласно (е), где нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичную аминокислотную последовательность, содержит или состоит из последовательности, кодирующей гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, или метку, или эпитоп, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность;(g) нуклеиновая кислота согласно (d), (е) или (f), где гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, содержащую или состоящую из N-концевого и/или С-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембрану или в растительную эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембранную систему,или гетерологичная последовательность кодирует участок рестрикции;(h) нуклеиновая кислота согласно (d), (е) или (f), где гетерологичная промоторная последовательность содержит или состоит из конститутивного или индуцибельного промотора, или специфического для типа клеток промотора, или специфического для растения промотора, или специфического для бактерий промотора;(i) нуклеиновая кислота согласно любому из (a)-(h), где активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), является термостабильной;(j) нуклеиновая кислота согласно любому из (a)-(h), где активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), является термоустойчивой;(k) последовательность нуклеиновой кислоты, полностью комплементарная нуклеотидной последовательности согласно любому из (a)-(j). В одном аспекте выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид или пептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), которая является термостабильной. Полипептиды и пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, представленными в настоящем документе,или любой полипептид или пептид, представленный в настоящем документе, могут сохранять ферментативную или связывающую активность (например, связывание субстрата) в условиях, включающий диапазон температур от приблизительно -100 до приблизительно -80 С, от приблизительно -80 до приблизительно -40 С, от приблизительно -40 до приблизительно -20 С, от приблизительно -20 до приблизительно 0 С, от приблизительно 0 до приблизительно 5 С, от приблизительно 5 до приблизительно 15 С, от приблизительно 15 до приблизительно 25 С, от приблизительно 25 до приблизительно 37 С, от приблизительно 37 до приблизительно 45 С, от приблизительно 45 до приблизительно 55 С, от приблизительно 55 до приблизительно 70 С, от приблизительно 70 до приблизительно 75 С, от приблизительно 75 до приблизительно 85 С, от приблизительно 85 до приблизительно 90 С, от приблизительно 90 до приблизительно 95 С, от приблизительно 95 до приблизительно 100 С, от приблизительно 100 до приблизительно 105 С, от приблизительно 105 до приблизительно 110 С, от приблизительно 110 до приблизительно 120 С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,115C или более. В настоящем документе предусмотрены термостабильные полипептиды, которые сохраняют активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (PI-PLC), при температуре в диапазонах, описанных выше, при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0,приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более. В одном аспекте полипептиды, представленные в настоящем документе, могут быть термоустойчивыми и могут сохранять активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC) после воздействия температуры в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80 С, от приблизительно -80 до приблизительно -40 С, от приблизительно -40 до приблизительно -20 С, от приблизительно -20 до приблизительно 0 С, от приблизительно 0 до приблизительно 5 С, от приблизительно 5 до приблизительно 15 С, от приблизительно 15 до приблизительно 25 С, от приблизительно 25 до приблизительно 37 С, от приблизительно 37 до приблизительно 45 С, от приблизительно 45 до приблизительно 55 С, от приблизительно 55 до приблизительно 70 С, от приблизительно 70 до приблизительно 75 С, от приблизительно 75 до приблизительно 85 С, от приблизительно 85 до приблизительно 90 С, от приблизительно 90 до приблизительно 95 С, от приблизительно 95 до приблизительно 100 С, от приблизительно 100 до приблизительно 105 С, от приблизительно 105 до приблизительно 110 С, от приблизительно 110 до приблизительно 120 С или 95, 96, 97, 98, 99, 100,101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 С или более. В некоторых вариантах осуществления термоустойчивые полипептиды сохраняют активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С(PI-PLC) после воздействия температуры в диапазонах, описанных выше, при приблизительно рН 3,0,приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительноpH 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5,приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5,приблизительно рН 12,0 или более. В другом аспекте в настоящем документе предусмотрены зонды нуклеиновой кислоты или праймеры для амплификации для выделения, получения и/или идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC). В одном варианте осуществления зонд нуклеиновой кислоты, например зонд для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (PI-PLC), включает зонд, содержащий или состоящий по меньшей мере из приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300,350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательно расположенных оснований последовательности, представленной в настоящем документе, или ее фрагментов или подпоследовательностей, где зонд идентифицирует нуклеиновую кислоту путем связывания или гибридизации. Зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 последовательно расположенных оснований последовательности, содержащей последовательность, представленную в настоящем документе, или ее фрагменты или подпоследовательности. Зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50,приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 последовательно расположенных оснований последовательности нуклеиновой кислоты,представленной в настоящем документе, или ее подпоследовательности. В одном варианте осуществления последовательности пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), содержат пару праймеров, содержащую или состоящую из пары праймеров, способной амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, представленную в настоящем документе, или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый представитель последовательностей пары праймеров для амплификации может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 последовательно расположенных оснований последовательности. В одном варианте осуществления способы амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), включают амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с помощью последовательностей пары праймеров для амплификации, способной амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, или ее фрагменты или подпоследовательности. В одном варианте осуществления векторы, экспрессирующие кассеты, экспрессирующие векторы,плазмиды, или носители для клонирования содержат нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, или ее подпоследовательность. В одном аспекте вектор, экспрессирующая кассета, экспрессирующий вектор, плазмида или носитель для клонирования могут содержать или содержатся в вирусном векторе, фаге, фагмиде, космиде, фосмиде, бактериофаге, искусственной хромосоме, аденовирусном векторе, ретровирусном векторе или аденоассоциированном вирусном векторе; или бактериальной искусственной хромосоме (ВАС), происходящем из бактериофага PI векторе (РАС), искусственной хромосоме дрожжей (YAC), или искусственной хромосоме млекопитающих (MAC). В одном аспекте экспрессирующая кассета содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, которая функционально связана с промотором. Промотор может представлять собой вирусный, бактериальный промотор, промотор млекопитающих или растений. В одном аспекте промотор растений может представлять собой промотор картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конститутивный промотор. Конститутивный промотор может включать CaMV35S. В другом аспекте промотор может представлять собой индуцибельный промотор. В одном аспекте промотор может представлять собой тканеспецифичный промотор или промотор, регулируемый окружающей средой, или промотор, регулируемый в зависимости от стадии развития. Таким образом, промотор может представлять собой, например, промотор, специфичный для семян, специфичный для листьев, специфичный для корней, специфичный для стебля, или промотор, индуцируемый опаданием листвы. В одном аспекте экспрессирующая кассета может дополнительно содержать экспрессирующий вектор растений или вирусов растений. В одном варианте осуществления клетка-хозяин или трансформированная клетка содержит нуклеи-7 022979 новую кислоту, представленную в настоящем документе. В одном аспекте клетка-хозяин или трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, клетку гриба, дрожжевую клетку, клетку насекомых или клетку растений. В одном аспекте клетка растений может представлять собой клетку картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя. Трансформированная клетка может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как бактериальные клетки,клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Иллюстративные клетки бактерий включают клетки любого вида из рода Escherichia, Bacillus, Streptomyces,Salmonella, Pseudomonas и Staphylococcus, включая, например, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillussubtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens. Иллюстративные клетки грибов включают клетки любого вида Aspergillus, иллюстративные клетки дрожжей включают клетки любого вида из Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Schwanniomyces, включая Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe. Иллюстративные клетки насекомых включают любой видSpodoptera или Drosophila, включая Drosophila S2 и Spodoptera Sf9. Иллюстративные клетки животных включают клетки СНО, COS или меланомы Bowes или любую клеточную линию мыши или человека. В другом варианте осуществления трансгенные не являющиеся человеком животные содержат нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, или вектор, экспрессирующую кассету, экспрессирующий вектор, плазмиду или носитель для клонирования, представленные в настоящем документе. Трансгенным не являющимся человеком животным может быть мышь, крыса, коза, кролик, овца,свинья или корова. В одном варианте осуществления трансгенное растение или семя содержит нуклеиновую кислоту,представленную в настоящем документе, или вектор, экспрессирующую кассету, экспрессирующий вектор, плазмиду или носитель для клонирования, представленные в настоящем документе. В одном варианте осуществления растение представляет собой растение кукурузы, растение сорго, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, масличное растение, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя, траву, семя хлопчатника, пальму, растение кунжута, растение арахиса, растение подсолнуха или растение табака; трансгенное семя. В одном варианте осуществления семя представляет собой кукурузное семя, пшеничное зерно, масличное семя, семя рапса, семя сои, ядро кокосового ореха,семя подсолнуха, семя кунжута, рис, ячмень, арахис, семя хлопчатника, семя пальмы, арахис, семя кунжута, семя подсолнуха или семя растения табака. В одном аспекте в настоящем документе предусмотрены антисмысловой олигонуклеотид или ингибиторная РНК, содержащие нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе или состоящие из них. В другом аспекте в настоящем документе предусмотрен способ ингибирования трансляции последовательности фосфолипазы (транскрипт, мРНК) в клетке, включающий введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида или ингибиторной РНК, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в настоящем документе, или состоящих из них. В одном варианте осуществления выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды обладают активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (PI-PLC), или представляют собой полипептиды, способные индуцировать иммунный ответ, специфичный для фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC) (например, эпитоп); и в альтернативных аспектах пептиды и полипептиды, представленные в настоящем документе, содержат последовательность(i) обладающую по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, и имеющую по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать,двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в табл. 12, 13, 14 и/или 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию,где необязательно идентичность последовательностей определяют с помощью анализа с алгоритмом сравнения последовательностей или визуальным исследованием;(iii) имеющую по меньшей мере приблизительно 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичность последовательности с SEQ ID(b) полипептид согласно (а), но лишенный нативной сигнальной последовательности и/или последовательности пробелка;(c) полипептид согласно (а) или (b), кроме того, содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность или гетерологичную часть;(d) полипептид согласно (с), где гетерологичная аминокислотная последовательность или гетерологичная часть содержит гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, маркер, поддающуюся детекции метку или эпитоп, или состоит из них;(e) полипептид согласно (d), где гетерологичная (лидерная) сигнальная последовательность содержит N-концевое и/или С-концевое удлинение для нацеливания на эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембрану, или на растительную эндоплазматическую сеть (ER), или систему эндомембран, или состоит из них;(f) полипептид по любому из (а)-(е), где фосфолипаза, например фосфолипаза С, например фосфатидилинозитол-специфическая фосфолипаза С (PI-PLC), катализирует реакцию, включающую 1-фосфатидил-1D-миоинозитол 4,5-бифосфат (также называемый PIP2, фосфатидилинозитолбифосфатом)+H2O1D-миоинозитол 1,4,5-трифосфат (также называемый IP3, инозитолтрифосфатом) + диацилглицерин;(i) полипептид согласно любому из (a)-(h), где (i) полипептид является гликозилированным или полипептид содержит по меньшей мере один участок гликозилирования, (ii) полипептид согласно (i), где гликозилирование представляет собой N-связанное гликозилирование или О-связанное гликозилирование; (iii) полипептид согласно (i) или (ii), где полипептид является гликозилированным после экспрессии в клетках дрожжей; или (iv) полипептид согласно (iii), где клетка дрожжей представляет собой P. pastoris или S. pombe;(j) полипептид согласно любому из (a)-(i), кроме того, содержащий композицию, содержащую по меньшей мере один второй фермент, или по меньшей мере один второй фермент фосфолипазы, или содержащийся в ней; или(k) полипептид согласно (j), где по меньшей мере один второй фермент фосфолипазы содержит полипептид, имеющий последовательность, как указано в SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 4, или по меньшей мере один из их вариантных ферментов, как описано в табл. 8 и 9. В одном аспекте выделенный, синтетический или рекомбинантный полипептид может содержать полипептид, представленный в настоящем документе, который лишен сигнальной (пептидной) последовательности, например лишен его гомологичной сигнальной последовательности, и в одном аспекте содержит гетерологичную сигнальную (пептидную) последовательность. В одном аспекте выделенный,синтетический или рекомбинантный полипептид может содержать полипептид, представленный в настоящем документе, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как гетерологичная сигнальная последовательность фосфолипазы или не фосфолипазы (например, не фосфолипазы,не фосфолипазы С или не фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC. В одном аспекте химерные белки содержат первый домен, содержащий сигнальную последовательность, представленную в настоящем документе, и по меньшей мере второй домен. Белок может представлять собой слитый белок. Второй домен может содержать фермент. Фермент может представлять собой фосфолипазу,например фосфолипазу С, например фосфатидилинозитол-специфическую фосфолипазу С (PI-PLC),представленную в настоящем документе, или другой фермент. В одном аспекте активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), включает удельную активность при приблизительно 37 С в диапазоне от приблизительно 100 до приблизительно 1000 единиц на 1 мг белка. В другом аспекте активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), включает удельную активность от приблизительно 500 до приблизительно 750 единиц на 1 мг белка. Альтернативно активность фосфолипазы включает удельную активность при 37 С в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 1200 единиц на 1 мг белка. В одном аспекте активность фосфолипазы включает удельную активность при 37 С в диапазоне от приблизительно 750 до приблизительно 1000 единиц на 1 мг белка. В другом аспекте термоустойчивость включает сохранение по меньшей мере половины удельной активности фосфолипазы при 37 С после нагревания до повышенной температуры. Альтернативно, термоустойчивость может включать сохранение удельной активности при 37 С в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 1200 единиц на 1 мг белка после нагревания до повышенной температуры. В одном варианте осуществления выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды,представленные в настоящем документе, содержат по меньшей мере один участок гликозилирования. В одном аспекте гликозилирование может представлять собой N-связанное гликозилирование. В одном аспекте полипептид может быть гликозилированным после экспрессии в P. pastoris или S. pombe или в растениях, таких как продуцирующие масло растения, например соя, канола, рис, подсолнух или генетически модифицированные (GMO) варианты этих растений. В одном аспекте полипептид может сохранять активность фосфолипазы, например фосфолипазы С,например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC) ,в условиях, включающих при-9 022979 близительно рН 6,5, рН 6, рН 5,5, рН 5, рН 4,5 или рН 4,0 или ниже. В другом аспекте полипептид может сохранять активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (PI-PLC), в условиях, включающих приблизительно рН 7, рН 7,5, рН 8,0,рН 8,5, рН 9, рН 9,5, рН 10, рН 10,5, рН 11, рН 11,5, рН 12,0 или более. В одном варианте осуществления препараты белка содержат полипептид, представленный в настоящем документе, где препарат белка содержит жидкость, твердое вещество или гель. В одном аспекте гетеродимеры, представленные в настоящем документе, содержат полипептид и второй домен. В одном аспекте второй домен может представлять собой полипептид, и гетеродимер может представлять собой слитый белок. В одном аспекте второй домен может представлять собой эпитоп или метку. В одном аспекте гомодимеры, представленные в настоящем документе, содержат полипептид,представленный в настоящем документе. В одном варианте осуществления иммобилизованные полипептиды, представленные в настоящем документе, обладают активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), где полипептид содержит полипептид, представленный в настоящем документе, полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или полипептид, содержащий полипептид, представленный в настоящем документе, и второй домен. В одном аспекте полипептид, представленный в настоящем документе, может быть иммобилизован на клетке, везикуле, липосоме, пленке, мембране, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, грануле, геле, пластине, кристалле, таблетке, пилюле, капсуле, порошке, агломерате, поверхности, пористой структуре, чипе или капиллярной трубке, или материалах, таких как зерна, шелуха, кора, кожа, волосы, эмаль, кость, скорлупа и материалы, происходящие из них. Полинуклеотиды, полипептиды и ферменты, представленные в настоящем документе, можно изготавливать в твердой форме, такой как порошок, лиофилизированный препарат, гранулы, таблетка, плитка, кристалл,капсула, пилюля, драже, или в жидкой форме, такой как водный раствор, аэрозоль, гель, паста, взвесь,водная/масляная эмульсия, крем, капсула или суспензия везикул или мицелл. В одном аспекте в настоящем документе предусмотрены выделенные, синтетические или рекомбинантные антитела, которые специфично связываются с полипептидом, представленным в настоящем документе. В другом аспекте выделенные, синтетические или рекомбинантные антитела представляют собой моноклональные или поликлональные антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты. В одном аспекте в настоящем документе предусмотрена гибридома, содержащая антитело, представленное в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен чип, содержащий иммобилизованный полипептид, иммобилизованную нуклеиновую кислоту или антитело, представленные в настоящем документе, или их комбинацию. В одном варианте осуществления добавки в корм для животного содержат полипептид, представленный в настоящем документе, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе. В одном аспекте полипептид в пищевой добавке может быть гликозилированным. В одном варианте осуществления съедобные матрицы для доставки фермента содержат полипептид, представленный в настоящем документе, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе. В одном аспекте матрица для доставки включает драже. В одном аспекте полипептид может быть гликозилированным. В одном аспекте активность фосфолипазы является термоустойчивой. В другом аспекте активность фосфолипазы является термостабильной. В одном варианте осуществления способы выделения или идентификации полипептида, имеющего активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), включают стадии: (а) предоставления антитела, представленного в настоящем документе; (b) предоставления образца, содержащего полипептиды; и (с) контактирования образца стадии (b) с антителом стадии (а) в условиях, где антитело может специфично связываться с полипептидом,тем самым выделяя или идентифицируя полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC). В одном варианте осуществления способы получения антител против фосфолипазы включают введение не являющемуся человеком животному нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, или полипептида, представленного в настоящем документе, или их подпоследовательности в количестве, достаточном для индуцирования гуморального иммунного ответа, тем самым получая антитело против фосфолипазы. В настоящем документе предусмотрены способы получения антитела против фосфолипазы, включающие введение не являющемуся человеком животному нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, или полипептида, представленного в настоящем документе, или их подпоследовательностей в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа. В одном варианте осуществления способы получения рекомбинантного полипептида включают стадию: (А) (а) предоставления нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, где нуклеиновая кислота необязательно связана с промотором, где нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; и (b) экспрессии нуклеиновой кислоты стадии (а) в условиях, которые позволяют экспрессию полипептида, тем самым получая рекомбинантный полипеп- 10022979 тид; или (В) способ согласно (А), кроме того, включающий трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты стадии (а), тем самым получая рекомбинантный полипептид в трансформированной клетке. В одном варианте осуществления способы идентификации полипептида, обладающего активностью фосфолипазы, включают стадии: (а) предоставления полипептида, представленного в настоящем документе; (b) предоставления субстрата фосфолипазы и (с) контактирования полипептида с субстратом стадии (b) и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где снижение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции выявляет полипептид, обладающий активностью фосфолипазы. В другом варианте осуществления способы идентификации субстрата фосфолипазы включают стадии: (а) предоставления полипептида, представленного в настоящем документе; (b) предоставления тестируемого субстрата и (с) контактирования полипептида стадии (а) с тестируемым субстратом стадии (b) и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции идентифицирует тестируемый субстрат в качестве субстрата фосфолипазы. В другом аспекте способы определения того, связывается ли специфично тестируемое соединение с полипептидом, включают стадии: (а) экспрессии нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, позволяющих трансляцию нуклеиновой кислоты в полипептид, где нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; (b) предоставления тестируемого соединения; (с) контактирования полипептида с тестируемым соединением и (d) определения того, связывается ли специфично тестируемое соединение стадии (b) с полипептидом. В другом аспекте способы определения того, связывается ли специфично тестируемое соединение с полипептидом, включают стадии: (а) предоставления полипептида, представленного в настоящем документе; (b) предоставления тестируемого соединения; (с) контактирования полипептида с тестируемым соединением и (d) определения того, связывается ли специфично тестируемое соединение стадии (b) с полипептидом. В одном варианте осуществления способы идентификации модулятора активности фосфолипазы включают стадии: (А) (а) предоставления полипептида, представленного в настоящем документе; (b) предоставления тестируемого соединения; (с) контактирования полипептида стадии (а) с тестируемым соединением стадии (b) и измерения активности фосфолипазы, где изменение активности фосфолипазы,измеренной в присутствии тестируемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствие тестируемого соединения обеспечивает определение того, что тестируемое соединение модулирует активность фосфолипазы; (В) способ согласно (А), где активность фосфолипазы измеряют путем предоставления субстрата фосфолипазы и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции или увеличения количества субстрата или уменьшения количества продукта реакции;(с) способ согласно (В), где снижение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции с тестируемым соединением по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение в качестве активатора активности фосфолипазы; или (d) способ согласно (В), где увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции с тестируемым соединением по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение в качестве ингибитора активности фосфолипазы. В одном аспекте способы выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью фосфолипазы, из образца, включают стадии: (А) (а) предоставления полинуклеотидного зонда, содержащего нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца или обработку образца так, чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридизации с полинуклеотидным зондом стадии (а); (с) комбинирования выделенной нуклеиновой кислоты или обработанного образца стадии (b) с полинуклеотидным зондом стадии (а) и (d) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизуется с полинуклеотидным зондом стадии (а), тем самым выделяя или извлекая из образца нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид с активностью фосфолипазы; (В) способ согласно (А), где образец представляет собой или содержит образец из окружающей среды; (С) способ согласно (В), где образец из окружающей среды представляет собой или содержит образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец; или (D) способ согласно (С), где биологический образец получен из бактериальной клетки,клетки простейших, клетки насекомых, клетки дрожжей, клетки растений, клетки грибов или клетки млекопитающих. В одном варианте осуществления способы выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы из образца, включают стадии: (а) предоставления последовательностей пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца или обработку образца так, чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридиза- 11022979 ции с парой праймеров для амплификации; и (с) объединения нуклеиновой кислоты стадии (b) с парой праймеров для амплификации стадии (а) и амплификация нуклеиновой кислоты из образца, тем самым,выделяя или извлекая нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, из образца. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец из окружающей среды, например образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец, например бактериальную клетку, клетку простейших, клетку насекомых, клетку дрожжей, клетку растений, клетку грибов или клетку млекопитающих. Один или каждый член пары праймеров для амплификации может включать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 или более последовательно расположенных оснований последовательности, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления способы увеличения термоустойчивости или термостабильности полипептида фосфолипазы включают гликозилирование полипептида фосфолипазы, где полипептид содержит по меньшей мере тридцать последовательно расположенных аминокислот полипептида, представленного в настоящем документе; или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, тем самым увеличивая термоустойчивость или термостабильность полипептида фосфолипазы. В одном аспекте специфическая активность фосфолипазы может быть термостабильной или термоустойчивой при температуре в диапазоне от более чем приблизительно 37 до приблизительно 95 С. В одном варианте осуществления способы сверхэкспрессии рекомбинантного полипептида фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PIPLC), в клетке включают экспрессию вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, или последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в настоящем документе, где идентичность последовательностей определяют с помощью анализа с алгоритмом сравнения последовательностей или визуальным исследованием, где сверхэкспрессию обеспечивают с использованием высокоактивного промотора, бицистронного вектора или амплификации гена в векторе. В одном варианте осуществления способы получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью фосфолипазы, включают стадии: (А) (а) предоставления матричной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; и (b) модификации, делеции или вставки одного или нескольких нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты; (В) способ согласно (А), кроме того, включающий экспрессию варианта нуклеиновой кислоты с получением варианта полипептида фосфолипазы; (С) способ согласно (А) или (В), где модификации, вставки или делеции вносят способом,включающим ПЦР с пониженной точностью, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, объединяющую ПЦР, мутагенез с помощью половой ПЦР, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, повторную сборку гена, мутагенез с насыщением сайтов гена (GSSM), синтетическую повторную сборку лигированием (SLR) или их комбинацию; (D) способ согласно любому из (А)-(С), где модификации, вставки или делеции вносят способом, включающим рекомбинацию, рекомбинацию возвратной последовательности, мутагенез с модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенез с содержащей урацил матрицей, мутагенез с содержащими разрывы дуплексами, мутагенез с репарацией точек несоответствия,мутагенез с дефектом репарации штамма-хозяина, химический мутагенез, мутагенез радиогенного происхождения, мутагенез с делецией, мутагенез с рестрикцией и селекцией, мутагенез с рестрикцией и исправлением ошибок, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, получение химерного мультимера нуклеиновой кислоты и их комбинацию; (Е) способ согласно любому из (A)-(D), где способ многократно повторяют до тех пор, пока не получают (вариантную) фосфолипазу, обладающую измененной или отличающейся (вариантной) активностью, или измененной или отличающейся (вариантной) стабильностью по сравнению с полипептидом, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой, или измененной или отличающейся (вариантной) вторичной структурой по сравнению с полипептидом, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой, или с измененной или отличающейся (вариантной) посттрансляционной модификаций по сравнению с полипептидом, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой;(F) способ согласно (Е), где вариант полипептида фосфолипазы является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после воздействия увеличенной температуры; (G) способ согласно (Е), где полипептид варианта фосфолипазы обладает увеличенным гликозилированием относительно гликозилирования фосфолипазы, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой; (Н) способ согласно (Е), где полипептид варианта фосфолипазы обладает активностью фосфолипазы при высокой температуре, где фосфолипаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не является активной при высокой температуре; (I) способ согласно любому из (А)-(Н), где способ многократно повторяют до тех пор, пока не получат фосфолипазу, кодирующую последовательность, в которой используются кодоны, измененные по сравнению с кодонами матричной нуклеиновой кислоты; или (J) способ согласно любому (А)-(Н), где способ многократно повторяют до тех пор, пока не получают ген фосфолипазы, обладающий повышенным или пониженным уровнем экспрессии транскрипта или повышенной или пониженной стабильностью относительно уровня экспрессии и стабильности матричной нуклеиновой кислоты. В одном аспекте предусмотрены способы модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид фосфолипазы, причем способы включают стадии: (а) предоставления нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью фосфолипазы, содержащей нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; и, (b) идентификации кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замены его отличающимся кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, тем самым модифицируя нуклеиновую кислоту, кодирующую фосфолипазу. В одном варианте осуществления предусмотрены способы получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных центров фосфолипазы или участков связывания субстрата, где модифицированные активные центры или участки связывания субстрата происходят из первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую первый активный центр или первый участок связывания субстрата, причем способ включает стадии: (А) (а) предоставления первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый активный центр или первый участок связывания субстрата, где первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, и нуклеиновая кислота кодирует активный центр фосфолипазы или участок связывания субстрата фосфолипазы; (b) предоставления набора мутагенных олигонуклеотидов, которые кодируют встречающиеся в природе варианты аминокислот во множестве из выбранных для нацеливания кодонов в первой нуклеиновой кислоте; и (с) использования набора мутагенных олигонуклеотидов для получения набора кодирующих активный центр или связывающий субстрат участок вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих ряд вариантов аминокислот в каждом кодоне аминокислоты, который был подвергнут мутагенезу, тем самым получая библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных центров фосфолипазы или участков связывания субстрата; (В) способ согласно (А), включающий мутагенез первой нуклеиновой кислоты стадии (а) способом, включающим оптимизированную систему направленных изменений, мутагенез с насыщением сайтов гена (GSSM),синтетическую повторную сборку лигированием (SLR); (С) способ согласно (А) или (В), включающий мутагенез первой нуклеиновой кислоты стадии (а) или ее вариантов способом, включающим ПЦР с пониженной точностью, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, объединяющую ПЦР, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, повторную сборку гена, мутагенез с насыщением сайтов гена (GSSM), синтетическую повторную сборку лигированием(SLR) И их комбинацию; или (D) способ согласно (А) или (В), включающий мутагенез первой нуклеиновой кислоты стадии (а) или ее вариантов способом, включающим рекомбинацию, рекомбинацию возвратной последовательности, мутагенез с модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенез с содержащей урацил матрицей, мутагенез с содержащими разрывы дуплексами, мутагенез с репарацией точек несоответствия, мутагенез с дефектом репарации штамма-хозяина, химический мутагенез, мутагенез радиогенного происхождения, мутагенез с делецией, мутагенез с рестрикцией и селекцией, мутагенез с рестрикцией и исправлением ошибок, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, получение химерного мультимера нуклеиновой кислоты и их комбинации. В одном аспекте способы получения низкомолекулярного соединения включают стадии: (а) предоставления множества биосинтетических ферментов, способных синтезировать или модифицировать низкомолекулярное соединение, где один из ферментов содержит фермент фосфолипазу, кодируемую нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе; (b) предоставления субстрата по меньшей мере для одного из ферментов стадии (а); и (с) реакции субстрата стадии (b) с ферментами в условиях,которые облегчают множество биокаталитических реакций, с получением низкомолекулярного соединения с помощью серии биокаталитических реакций. В другом аспекте способы модификации низкомолекулярного соединения включают стадии: (А) (а) предоставления фермента фосфолипазы, где фермент содержит полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе; (b) предоставления низкомолекулярного соединения и (с) реакции фермента стадии (а) с низкомолекулярным соединением стадии (b) в условиях, которые облегчают ферментативную реакцию, катализируемую ферментом фосфолипазой, тем самым, модифицируя низкомолекулярное соединение ферментативной реакцией фосфолипазы; (В) способ согласно (А), включающий множество низкомолекулярных субстратов для фермента стадии (а), тем самым получая библиотеку модифицированных низкомолекулярных соединений, получаемых с помощью по меньшей мере одной ферментативной реакции,катализируемой ферментом фосфолипазой; (С) способ согласно (А) или (В), кроме того, включающий множество дополнительных ферментов в условиях, которые облегчают множество биокаталитических реакций ферментами, с получением библиотеки модифицированных низкомолекулярных соединений,получаемых множеством ферментативных реакций; (D) способ согласно (С), кроме того, включающий стадию тестирования библиотеки для определения того, присутствует ли в библиотеке конкретное модифицированное низкомолекулярное соединение, которое проявляет желаемую активность; или (Е) способ согласно (D), где стадия тестирования библиотеки, кроме того, включает стадии систематического удаления всех, кроме одной, биокаталитических реакций, используемых для получения части из множества модифицированных низкомолекулярных соединений из библиотеки, с тестированием части модифици- 13022979 рованных низкомолекулярных соединений на наличие или отсутствие конкретного модифицированного низкомолекулярного соединения с желаемой активностью, и идентификации по меньшей мере одной конкретной биокаталитической реакции, в результате которой образуется модифицированное низкомолекулярное соединение с желаемой активностью. В другом аспекте способы определения функционального фрагмента фермента фосфолипазы включают стадии: (А) (а) предоставления фермента фосфолипазы, где фермент содержит полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе; и (b) удаления множества аминокислотных остатков из последовательности стадии (а) и тестирования оставшейся подпоследовательности в отношении активности фосфолипазы,тем самым определяя функциональный фрагмент фермента фосфолипазы; или (В) способ согласно (А),где активность фосфолипазы измеряют путем предоставления субстрата фосфолипазы и тестирования уменьшения количества субстрата или увеличения продукта реакции. В одном аспекте предусмотрен способ инженерии цельных клеток с новыми или модифицированными фенотипами с использованием анализа метаболических изменений в режиме реального времени,причем способ включает стадии: (а) получения модифицированной клетки посредством модификации генетического набора клетки, где генетический набор модифицирован добавлением в клетку нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе; (b) культивирования модифицированной клетки с получением множества модифицированных клеток; (с) измерения по меньшей мере одного параметра метаболизма клетки посредством контроля клеточной культуры стадии (b) в режиме реального времени; и (d) анализ данных стадии (с) для определения наличия отличий измеренного параметра от сравнительного измерения в немодифицированной клетке в аналогичных условиях, тем самым идентифицируя полученный с помощью способов инженерии фенотип клетки с использованием анализа метаболических изменений в режиме реального времени; (В) согласно (А), где генетический набор клетки модифицируют способом, включающим делецию последовательности или модификацию последовательности в клетке,или нокаут экспрессии гена; (С) способ согласно (А) или (В), кроме того, включающий селекцию клетки,содержащей новый полученный способами инженерии фенотип; или (D) способ согласно (С), кроме того, включающий культивирование отобранной клетки, тем самым, получая новый штамм, содержащий новый полученный способами инженерии фенотип. В одном варианте осуществления способы получения трансгенного растения включают следующие стадии: (а) введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в растительную клетку,где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в настоящем документе, тем самым получая трансформированную клетку растений; и (b) получение трансгенного растения из трансформированной клетки. В одном аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты электропорацией или микроинъекцией в протопласты клеток растений. В другом аспекте стадия(а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты непосредственно в ткань растений бомбардировкой частицами с ДНК. Альтернативно стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в ДНК клетки растения с использованием хозяина Agrobacterium tumefaciens. В одном аспекте клетка растения может представлять собой клетку картофеля, кукурузы, риса, пшеницы, табака или ячменя. В одном варианте осуществления способы экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в растительной клетке включают следующие стадии: (а) трансформация клетки растений гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором,где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; (b) выращивание растения в условиях, при которых гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в клетке растений. В одном аспекте в настоящем документе предусмотрены детергентные композиции, содержащие полипептид фосфолипазы, представленный в настоящем документе, или полипептид фосфолипазы, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе. В одном аспекте фосфолипаза представляет собой не поверхностно-активную фосфолипазу или поверхностно-активную фосфолипазу. В другом аспекте фосфолипаза включена в состав неводной жидкой композиции, отлитого твердого тела, лиофилизированного порошка, гранулированной формы, формы в виде частиц, прессованной таблетки, драже, формы геля, пасты, аэрозоля или формы взвеси. В одном аспекте способы мытья предмета включают стадии: (а) предоставления композиции, содержащей полипептид фосфолипазы, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе; (b) предоставления предмета и(с) контактирования полипептида стадии (а) и предмета стадии (b) в условиях, где композиция может отмыть предмет. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены композиции, содержащие полипептид фосфолипазы, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе. В одном аспекте способы смягчения, лечения или предупреждения опосредуемой липополисахари- 14022979 дом (LPS) токсичности включат введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе. В другом аспекте в настоящем документе предусмотрены фармацевтические препараты, предшественники фармацевтических препаратов и фармацевтические композиции, содержащие полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе. В другом аспекте в настоящем документе предусмотрены способы изготовления фармацевтического препарата, предшественника фармацевтического препарата или фармацевтической композиции, включающие добавление полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, в фармацевтический препарат, предшественник фармацевтического препарата или фармацевтическую композицию. В одном аспекте фармацевтическую композицию применяют для предупреждения, лечения или смягчения опосредуемой липополисахаридом (LPS) токсичности,или для детоксикации эндотоксина или деацилирования 2'- или 3'-цепи жирной кислоты от липида А. В одном варианте осуществления способы детоксикации эндотоксина включают контактирование эндотоксина с полипептидом, представленным в настоящем документе, или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе. В другом варианте осуществления способы получения варианта кодирующей фосфолипазу последовательности, имеющего увеличенную экспрессию в клетке-хозяине включают модификацию нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе так, чтобы один, несколько или все мотивы, кодирующие участки N-связанного гликозилирования, были модифицированы в мотив, не кодирующий участки гликозилирования. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены композиции, содержащие смесь ферментов фосфолипаз, содержащие: (a) (i) полипептид фосфолипазы, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, и (ii) по меньшей мере один второй фермент; (b) композицию согласно (а), где по меньшей мере один фермент представляет собой фермент фосфолипазу; или (с) композицию согласно (b), где по меньшей мере один второй фермент фосфолипазы содержит полипептид, как указано в SEQ ID NO: 2 и/илиSEQ ID NO: 4, или по меньшей мере один вариант ферментов PLC, как описано в табл. 8 и 9. В одном аспекте способы получения биотоплива, например биодизеля, включают стадии: (А) (а) предоставления полипептида фосфолипазы, представленного в настоящем документе, или фермента фосфолипазы, кодируемого нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композиции, содержащей полипептид, представленный в настоящем документе; (b) предоставления композиции, содержащей липид или алкиловый сложный эфир; (с) контактирования полипептида фосфолипазы согласно (а) с композицией согласно (b); (В) способ согласно (А), где композиция, содержащая липид или алкиловый сложный эфир представляет собой или содержит масло и/или жир; или (С) способ согласно (А) или (В), где композиция, содержащая липид или алкиловый сложный эфир, представляет собой или содержит водоросли, растительное масло, растительное масло прямой перегонки, растительное масло холодного прессования, отработанное растительное масло, животный жир, топленое сало, жир,сало или желтый жир. В другом аспекте в настоящем документе предусмотрены топлива, например биотоплива, например биодизель, изготовленные способами, которые включают стадии: (А) (а) предоставления полипептида фосфолипазы, представленного в настоящем документе, или фермента фосфолипазы,кодируемого нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композиции, содержащей полипептид, представленный в настоящем документе; b) предоставления композиции, содержащей липид или алкиловый сложный эфир; (с) контактирования полипептида фосфолипазы согласно (а) с композицией согласно (b); (В) способ согласно (А), где композиция, содержащая липид или алкиловый сложный эфир, представляет собой или содержит масло и/или жир; или (С) способ согласно (А) или (В),где композиция, содержащая липид или алкиловый эфир, представляет собой или содержит водоросли,растительное масло, растительное масло прямой перегонки, растительное масло холодного прессования,отработанное растительное масло, животный жир, топленое сало, жир, сало или желтый жир. В другом аспекте сухой экстракт барды (DDS), сухая барда (DDS), конденсированный экстракт барды (CDS), влажный экстракт барды (DWG) или сухая гранулированная барда (DDGS) содержат полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой,представленной в настоящем документе, или композицией, представленной в настоящем документе. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается биомасса, содержащая: (а) полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композицию, предоставленную в настоящем документе; (b) биомассу согласно (а), где биомасса представляет собой или содержит биомассу животных, водорослей и/или растений или содержащую липиды или лигноцеллюлозную биомассу или материал отходов. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен продукт на основе нефти,содержащий: (а) полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композицию, представленную в настоящем документе; (b) полученный способом, включающим применение полипептида, представленного в настоящем документе, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композиции, представленной в настоящем документе; или (с) продукт на основе нефти согласно (а) или (b), содержащий масло, биодизель, или бензин, или биоэтанол, биобутанол,биопропанол или биометанол или смесь биоэтанола, биобутанола, биопропанола, биометанола и/или биодизеля и газолина. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ гидратации негидратируемых фосфолипидов (NHP) в липидной матрице путем обеспечения миграции их к поверхности контакта масло-вода. Затем NHP подвергают реакции и/или удаляют из липидов. В одном варианте осуществления способ включает: а) смешение водной кислоты с пригодным в пищу маслом с получением кислотной смеси, имеющей рН менее чем приблизительно 4; и b) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей рН приблизительно 6-9. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или b) приводит к эмульсии, которая содержит водную фазу со средним размером капель от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкм. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или b) приводит к эмульсии, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60% водной фазы по объему с размером капель от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или b) приводит к эмульсии, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60, 70, 80, 90, 93, 95, 96, 97, 98 или 99% водной фазы по объему с размером капель от приблизительно 20 до приблизительно 45 мкм. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает рафинирование реакционной смеси водой или ферментом с получением рафинированного масла. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или b) проводят с помощью смесителя с высокими сдвиговыми усилиями со скоростью лопасти по меньшей мере приблизительно 1400, 1600, 1800, 2000, 2100, 2300, 2500, 3000 или 3500 см/с. В способах, предоставленных в настоящем документе, можно использовать любую кислоту, которую сочтет пригодной специалист в данной области. В определенных вариантах осуществления кислота выбрана из группы, состоящей из фосфорной кислоты, уксусной кислоты, лимонной кислоты, виннокаменной кислоты, янтарной кислоты и их смеси. В способах, предоставленных в настоящем документе,можно использовать любую кислоту, которую сочтет пригодной специалист в данной области. В определенных вариантах осуществления основание выбрано из группы, состоящей из гидроксида натрия, гидроксида калия, силиката натрия, карбоната натрия, карбоната кальция и их комбинации. В определенных вариантах осуществления способ гидратации негидратируемых фосфолипидов в годном в пищу масле, кроме того, включает стадию рафинирования гидратацией или ферментативного рафинирования для получения рафинированного масла. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ, где после гидратации NHP следует ферментативная обработка и удаление различных фосфолипидов и лецитинов. Такие способы можно осуществлять на практике либо на неочищенных, либо на рафинированных гидратацией, маслах. В определенных вариантах осуществления способ рафинирования масла, представленный в настоящем документе, включает: а) смешение водного раствора кислоты с пищевым маслом с получением кислотной смеси, имеющей рН приблизительно от 1 до 4, b) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей рН приблизительно 6-9, и с) рафинирование прореагировавшей смеси водой или ферментом с получением рафинированного масла. В определенных вариантах осуществления смешение на стадии а) и/или b) приводит к эмульсии, которая содержит водную фазу со средним размером капель от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкм. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или b) приводит к эмульсии, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60% водной фазы по объему с размером капель от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкм, где процент водной фазы основан на объеме водной фазы. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ удаления NHP, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности известных как "камеди") из растительных масел с получением продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства пищевых продуктов и/или непищевых применений. В определенных вариантах осуществления в способах рафинирования, предоставленных в настоящем документе, используется вода, различные кислоты и/или различные основания или их комбинация. В другом аспекте в настоящем документе предусмотрен способ увеличения скорости реакции фосфолипазы, используемой в способе ферментативного рафинирования так, чтобы ферментативная реакция имела длительность менее приблизительно одного часа. В другом аспекте в настоящем документе предусмотрен способ рафинирования композиции на основе масла, в котором как гидратируемые, так и негидратируемые фосфолипиды можно обрабатывать в едином процессе, где ферментативная реакция завершается в течение менее приблизительно одного часа. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ гидролиза, расщепления или разрушения содержащей фосфолипид композиции, включающий: фосфолипид; и (с) контактирование полипептида стадии (а) с композицией стадии (b) в условиях, где фосфолипаза гидролизует, расщепляет или разрушает содержащую фосфолипид композицию;(B) способ согласно (А), где композиция содержит содержащий фосфолипид липидный бислой или мембрану; или(C) способ согласно любому из (А) или (В), где композиция содержит клетку растения, бактериальную клетку, клетку дрожжей, клетку насекомых или клетку животных. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ разжижения или удаления содержащей фосфолипид композиции, включающий:(c) контактирование полипептида стадии (а) с композицией стадии (b) в условиях, где фосфолипаза удаляет или разжижает содержащую фосфолипид композицию. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ очистки фитостерина или тритерпена, включающий:(AIb) предоставление композиции, содержащей фитостерин или тритерпен; и(AIc) контактирование полипептида стадии (а) с композицией стадии (b) в условиях, где полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции;(BI) способ согласно (AI), где фитостерин или тритерпен содержит растительный стерин;(CI) способ согласно (BI), где растительный стерин происходит из растительного масла;(DI) способ согласно (CI), где растительное масло включает кокосовое масло, масло канолы, масло какао, кукурузное масло, хлопковое масло, льняное масло, оливковое масло, пальмовое масло, арахисовое масло, масло, полученное из рисовой шелухи, сафлоровое масло, кунжутное масло, соевое масло или подсолнечное масло;(EI) способ согласно любому из (AI)-(DI), кроме того, включающий применение неполярных растворителей для количественной экстракции свободных фитостеринов и фитостериловых эфиров жирных кислот; или(FI) способ согласно (EI), где фитостерин или тритерпен включает -ситостерин, кампестерин,стигмастерин, стигмастанол, -ситостанол, ситостанол, десмостерин, халинастерин, пориферастерин,клионастерин или брассикастерин. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ рафинирования масла или жира, включающий:(A1b) предоставление композиции, содержащей масло или жир, содержащие фосфолипид; и(A1c) контактирование полипептида стадии (A1a) с композицией стадии (A1b) в условиях, где полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции;(В 1) способ согласно (A1), где полипептид находится в водном растворе, который добавляют в композицию;(C1) способ согласно (В 1), где уровень воды составляет приблизительно от 0,5 до 5%;(D1) способ согласно любому из (А 1)-(С 1), где длительность процесса составляет менее чем приблизительно 2 ч;(E1) способ согласно любому из (А 1)-(С 1), где длительность процесса составляет менее чем приблизительно 60 мин;(F1) способ согласно любому из (А 1)-(С 1), где длительность процесса составляет менее чем приблизительно 30 мин, менее чем приблизительно 15 мин или менее чем приблизительно 5 мин;(G1) способ согласно любому из (A1)-(F1), где условия гидролиза включают температуру приблизительно от 25 до 70 С;(H1) способ согласно любому из (A1)-(G1), где условия гидролиза включают применение щелочей;(I1) способ согласно любому из (А 1)-(Н 1), где условия гидролиза включают рН приблизительно от 3 до 10;(J1) способ согласно любому из (А 1)-(I1), где условия гидролиза включают добавление эмульгаторов и/или смешение после контактирования стадии (А 1)(А 1 с);(K1) способ согласно любому из (А 1)-(J1), включающий добавление реагента для расслоения эмульсии и/или нагревание или охлаждение для обеспечения отделения водной фазы;(L1) способ согласно любому из (А 1)-(K1), включающий рафинирование перед стадией контактирования для сбора лецитина центрифугированием, а затем добавление PLC, PLC и/или PLA для удаления негидратируемых фосфолипидов;(M1) способ согласно любому из (A1)-(L1), включающий рафинирование гидратацией неочищенного масла до менее чем 10 м.д. фосфора для пищевых масел и дополнительную физическую очистку до менее чем приблизительно 50 м.д. фосфора для биодизельных масел; или(N1) способ согласно любому из (А 1)-(М 1), включающий добавление кислоты для обеспечения гидратации негидратируемых фосфолипидов. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ рафинирования масла или жира, включающий:(b1) предоставление композиции, содержащей содержащий фосфолипид жир или масло; и(c1) контактирование полипептида стадии (a1) и композиции стадии (b1) в условиях, где полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ физической очистки содержащей фосфолипид композиции, включающий:(А-1 с) контактирование полипептида стадии (А-1 а) с композицией стадии (A-1b) до, в процессе или после физической очистки;(В-1) способ согласно (А-1), где полипептид добавляют до физической очистки, и композиция, содержащая фосфолипид, содержит растение, и полипептид экспрессируется трансгенно в растении, причем полипептид добавляют в процессе дробления семян или другой части растения или полипептид добавляют после дробления или перед очисткой;(С-1) способ согласно (А-1), где полипептид добавляют в процессе физической очистки;(D-1) способ согласно (А-1), где полипептид добавляют после физической очистки в интенсивном смесителе или ретенционном смесителе; после стадии нагревания; в центрифуге; в соапсток; в смывную воду; или на стадии отбеливания или дезодорирования; или(Е-1) способ согласно любому из (A-1)-(D-1), кроме того, включающий добавление фермента фосфолипазы A (PLA), фосфолипазы В (PLB), фосфолипазы С (PLC), фосфолипазы D (PLD) или фосфатазы или их комбинации. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ щелочной очистки содержащей фосфолипид композиции, включающий:(A1 с) контактирование полипептида стадии (A1a) с композицией стадии (A1b) до, в процессе или после щелочной очистки;(В 1) способ согласно (A1), где полипептид добавляют до добавления кислоты или щелочи;(C1) способ согласно любому из (А 1)-(В 1), где полипептид добавляют в процессе щелочной очистки и различные уровни кислоты и щелочи добавляют в зависимости от уровней фосфора и уровней свободных жирных кислот; или(D1) способ согласно любому из (А 1)-(В 1), где полипептид добавляют после щелочной очистки в интенсивном смесителе или ретенционном смесителе; после стадии нагревания; в центрифуге; в соапсток; в смывную воду или на стадии отбеливания или дезодорирования; или(E1) способ согласно любому из (A1)-(D1), где условия щелочной очистки обеспечивают добавлением концентрированного раствора щелочи, или где условия щелочной очистки включают применение концентрированного раствора щелочи, более концентрированного, чем промышленный стандарт 11%,или где условия щелочной очистки включают применение концентрированного раствора щелочи, который является концентрированным на 12-50%;(F1) способ согласно любому из (А 1)-(Е 1), где композиция, содержащая фосфолипид, содержит растение;(G1) способ согласно любому из (F1), где полипептид экспрессируется в растении трансгенно;(H1) способ согласно любому из (A1)-(G1), где полипептид добавляют в процессе дробления семени или другой части растения или полипептид добавляют после дробления или перед очисткой; или(I1) способ согласно любому из (А 1)-(Н 1), включающий процесс, указанный на фиг. 10; или процесс, указанный на фиг. 10, в котором добавляют достаточное количество кислоты для обеспечения снижения содержания металлического кальция и магния. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ деацилирования 2'или 3'-цепи жирной кислоты из липида А, включающий контактирование липида А с полипептидом фосфолипазы. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ уменьшения массы камеди и увеличения содержания нейтрального масла (триглицерида) путем снижения удержания масла включающий:(A1b) предоставление композиции, содержащей фосфолипид жир или масло; и(A1 с) контактирование полипептида стадии (A1a) и композиции стадии (A1b) в условиях, где полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции в течение времени, достаточного для снижения массы камеди и увеличения количества нейтральных масел;(В 1) препарат белка согласно (A1), где препарат белка содержит состав, содержащий неводную жидкую композицию, отлитое твердое тело, порошок, лиофилизированный порошок, гранулярную форму, форму в виде частиц, прессованную таблетку, драже, пилюлю, форму геля, гидрогель, пасту, аэрозоль, спрей, лосьон, состав взвеси, водную/масляную эмульсию, крем, капсулу, везикулу, или мицеллярную суспензию; или(C1) способ согласно (A1) или (В 1), включающий применение смешения композиции с высоким сдвиговым усилием с последующим смешением без сдвигового усилия или с низким сдвиговым усилием по меньшей мере с одним полипептидом по изобретению, обладающим активностью фосфолипазы, для обеспечения надлежащего контактирования фосфолипидного субстрата с фосфолипазой. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрено масло или жир, продуцируемые способами, предоставленными в настоящем документе. Ферменты для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, включают ферменты, обладающие активностью фосфолипазы. Активность фосфолипазы включает, например, активность фосфолипазы С (PLC), активность фосфолипазы А (PLA), активность фосфолипазы A1 или активность фосфолипазы А 2, активность фосфолипазы В (PLB), включая активность фосфолипазы В 1 или фосфолипазы В 2, активность фосфолипазы D (PLD), включая активность фосфолипазы D1 или активность фосфолипазы D2. В одном варианте осуществления ферменты для применения в настоящем документе включают полипептиды, обладающие активностью фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), или эквивалентного фермента, и/или активностью другой фосфолипазы, включая активность фосфолипазы А, В, С, D, пататина, фосфатаз фосфатидной кислоты (РАР) и/или ацилгидролазы липидов (LAH) или эквивалентного фермента. В определенных вариантах осуществления фермент для применения в способах, представленных в настоящем документе, выбран из фосфолипазы А, фосфолипазы С, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С или их комбинации. В определенных вариантах осуществления фермент для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, выбран из фосфолипазы С, фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С или их комбинации. В определенных вариантах осуществления фермент для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, представляет собой фермент фосфатидилинозитол-специфическую фосфолипазу С, как описано в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления фермент для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, выбран из фосфолипазы С, и фермента, содержащего SEQ ID NO: 8. В определенных вариантах осуществления фермент для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, представляет собой фермент, содержащий SEQ ID NO: 8. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ получения фосфолипида из пищевого масла. В определенном варианте осуществления фосфолипиды, получаемые способами, предоставленными в настоящем документе, включают множество фосфолипидов, включая, но не ограничиваясь ими, фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилсерин (PS), фосфатидилинозитол (PI), фосфатидную кислоту (РА), лизофосфатидилхолин (LPC), лизофосфатидилэтаноламин (LPE), лизофосфатидилсерин (LPS), лизофосфатидилинозитол (LPI), лизофосфатидную кислоту(LPA), холин (С), этаноламин (Е), серин (S) и инозитол (I). В другом варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ получения холина(С), этаноламина (Е), серина (S) или инозитола (I) из пищевого масла. Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления данного изобретения представлено далее на прилагаемых ниже чертежах и описании. Другие свойства, цели и преимущества изобретения будут очевидны из описания, чертежей и из формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности из GenBank и материалы АТСС,цитированные в данном описании для любых целей, таким образом, полностью включены в данное описание в качестве ссылок. Краткое описание чертежей Описанные ниже чертежи иллюстрируют варианты осуществления изобретения, и не подразумевается, что они ограничивают объем изобретения, охватываемый формулой изобретения. На фиг. 1 схематично показан иллюстративный способ очистки растительного масла с использованием фосфолипаз по изобретению; на фиг. 2 - иллюстративный процесс рафинирования по изобретению для физически очищенных масел, как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 3 - гидролиз фосфатидов фосфолипазой С по изобретению, как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 4 - иллюстративный процесс щелочной очистки по изобретению и альтернативный вариант осуществления, включающий применение фосфолипазы С по изобретению в качестве "добавки для щелочной очистки" (щелочная очистка с длительным перемешиванием), как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 5 - применение фосфолипазы С по изобретению в качестве добавки для рафинирования, как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 6 - иллюстративный процесс щелочной очистки по изобретению и альтернативный вариант осуществления, включающий применение фосфолипазы С по изобретению в качестве "добавки для ще- 19022979 лочной очистки" (щелочная очистка с длительным перемешиванием), как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 7 - другой вариант способов по изобретению, где в способе используют две стадии центрифугирования, как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 8 - другой вариант способов по изобретению, где в способе используют три стадии центрифугирования, как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 9 - другой иллюстративный вариант этого процесса, в котором используется обработка кислотой и имеется стадия центрифугирования перед стадией рафинирования, как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 10 - массовая доля отдельных типов фосфолипидов (PL) фосфатидной кислоты (РА), фосфатидилэтаноламина (РЕ), фосфатидилинозитола (PI), фосфатидилхолина (PC) относительного общего содержания PL, остающегося после обработки мутантными фосфолипазами по изобретению; на фиг. 11 - улучшенные мутанты, полученные способом "мутагенеза с насыщением сайтов гена" или "GSSM", отобранные для включения в библиотеку повторной сборки генов, которая включает иллюстративные фосфолипазы по изобретению; на фиг. 12 - спиртовой процесс, который может включать ферменты по изобретению; на фиг. 13 - композиция фосфолипидов в извлеченных влажных камедях в контрольных примерах; на фиг. 14 - сравнение фосфолипидов согласно контрольным примерам против примеров с использованием способов, представленных в настоящем документе, где рН на стадии b) доводят до рН 7,0; на фиг. 15 сравнивается потеря нейтрального масла в фазу камеди в контрольных реакциях с нейтральным рН против реакций с доведенным рН при рН 7,0, параллельно; на фиг. 16 сравнивается потеря нейтрального масла в фазу камеди в условиях различных рН, где используется фосфолипаза A1; на фиг. 17 представлено распределение капель в водной фазе, полученной способом согласно примеру 17 А; на фиг. 18 - распределение капель в водной фазе, полученной способом согласно примеру 17 В; на фиг. 19 - распределение капель в водной фазе, полученной способом согласно примеру 17 С; на фиг. 20 - распределение капель в водной фазе, полученной способом согласно примеру 17D; на фиг. 21 - сравнительное распределение капель в водной фазе, полученной способами согласно примерам 17 А, 17 В, 17 С и 17D. Подобные символы на различных чертежах указывают на подобные элементы. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC) или эквивалентного фермента и/или активностью другой фосфолипазы, включая активность фосфолипазы А, В, С, D, пататина, фосфатаз фосфатидной кислоты(РАР) и/или ацилгидролаз липидов (LAH), или активностью эквивалентного фермента, к полинуклеотидам, кодирующим их, антителам, которые специфично связываются с ними, и способам их получения и применения. В одном варианте осуществления активность фермента фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC) y полипептидов по изобретению включает 1-фосфатидил-1D-миоинозитол 4,5-бифосфат (также называемый PIP2, фосфатидилинозитолбифосфатом)+H2O1D-миоинозитол 1,4,5-трифосфат (также называемый IP3, инозитолтрифосфатом) + диацилглицерин. В альтернативных вариантах осуществления ферменты по изобретению могут эффективно расщеплять глицеринфосфатную сложноэфирную связь в маслах, таких как растительные масла, например фосфолипиды масличных семян, с образованием экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. В альтернативных вариантах осуществления фосфолипазы по изобретению обладают активностью ацилгидролазы липидов (LAH); или могут расщеплять глицеринфосфатные сложноэфирные связи в фосфатидилхолине (PC), фосфатидилэтаноламине (РЕ), фосфатидилсерине (PS), фосфатидилинозитоле (PI),фосфатидной кислоте и/или сфингомиелине, или они обладают комбинацией этих видов активности. Например, в одном аспекте фосфолипаза по изобретению является специфичной к одному или нескольким специфическим субстратам, например, фермент по изобретению может обладать специфичностью действия в отношении РЕ и PC; РЕ и PI; РЕ и PS; PS и PC; PS и PI; PI и PC; PS, PI и PC; РЕ, PI и PC; PC, РЕ иPS; PE, PS и PI или РЕ, PS, PI и PC. В альтернативных вариантах осуществления фосфолипазу по изобретению (например, фермент фосфатидилинозитол-специфическую фосфолипазу С (PI-PLC) или фермент с эквивалентной активностью) можно использовать для ферментативного рафинирования масел, например неочищенных масел,поскольку фосфатная группа растворима в воде и ее легко удалять. Диглицеридный продукт остается в масле, и, таким образом, потери снижаются. PLC по изобретению можно применять в дополнение к или вместо PLA1 и PLA2 в коммерческом рафинировании масла, таком как способ ENZYMAX, где фосфолипиды гидролизуют с помощью PLA1 и PLA2. В альтернативных вариантах осуществления фосфолипазы по изобретению являются активными при высокой и/или при низкой температуре или на протяжении широкого диапазона температур, например они могут быть активными при температурах в диапазоне от 20 до 90 С, от 30 до 80 С или от 40 до 70 С. Также изобретение относится к фосфолипазам, которые обладают активностью при щелочных рН или кислых рН, например при низкой кислотности воды. В альтернативных аспектах фосфолипазы по изобретению могут обладать активностью в кислых рН, таких как рН 6,5, рН 6,0, рН 5,5, рН 5,0, рН 4,5,рН 4,0, рН 3,5, рН 3,0, рН 2,5, рН 2,0 или при более кислых рН (т.е. рН 2,0). В альтернативных аспектах фосфолипазы по изобретению могут обладать активностью при щелочных рН, таких как рН 7,5, рН 8,0,рН 8,5, рН 9,0, рН 9,5, рН 10,0 или более щелочные рН (т.е. рН 10,0). В одном аспекте фосфолипазы по изобретению являются активными в диапазоне температур от приблизительно 40 до приблизительно 70,75 или 80 С или более, в условиях низкой водной активности (низкого содержания воды). Также изобретение относится к способам получения PLC и/или модификации активности иллюстративных фосфолипаз по изобретению для получения ферментов с альтернативными желаемыми свойствами, например с активностью фермента фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC),имеющего альтернативные субстраты, или с видами активности в различных условиях окружающей среды, например при различных температурах, рН и т.п. Например, фосфолипазы, полученные способами по изобретению, могут обладать измененной субстратной специфичностью, специфичностью связывания субстрата, характером расщепления субстрата, термической стабильностью, рН/профилем активности,рН/профилем стабильности (таким как увеличенная стабильность при низких, например рН 6 или рН 5,или высоких, например рН 9, значениях рН), устойчивостью к окислению, зависимостью от Са 2+, удельной активностью и т.п. Изобретение относится к изменению любого представляющего интерес свойства. Например, изменение может приводить к варианту, который по сравнению с исходной фосфолипазой обладает измененным рН и температурным профилем активности. В альтернативных вариантах осуществления фосфолипазы по изобретению применяют на различных стадиях переработки масел, таких как экстракция масла, например, при удалении "фосфолипидных камедей", в процессе, называемом "рафинирование масла", как описано в настоящем документе. Изобретение относится к композициям (например, содержащим ферменты по изобретению) и способам обработки масел, например неочищенных масел, и производства масел, например растительных масел, из различных источников, таких как масло из рисовой шелухи, сои, рапса, арахиса, кунжута, подсолнуха и кукурузы. Ферменты фосфолипазы по изобретению можно применять вместо PLA, например фосфолипазы А 2, на любой стадии переработки растительного масла. В определенных вариантах осуществления пригодные ферменты для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, включают один или несколько ферментов фосфолипазы A (PLA),ферментов фосфолипазы С (PLC), ферментов фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PIPLC) или их комбинации. Ферменты PLA включают фосфолипазу A1 (PLA1) и/или фосфолипазу А 2(PLA2). Как используют в настоящем документе, "неочищенное масло" относится к (также называемому нерафинированным маслом) прессованному или экстрагированному маслу или их смеси, например, из растительных источников, включая, но не ограничиваясь ими, масло асаи, миндальное масло, масло бабассу, масло семян черной смородины, масло семян огуречника, масло канолы, масло кешью, касторовое масло, кокосовое масло, кориандровое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло крамбе, масло льняного семени, масло виноградных зерен, масло из лесного ореха, конопляное масло, масло ятрофы,масло хохобы, льняное масло, масло ореха макадамия, масло ядра манго, масло пенника лугового, горчичное масло, костяное масло, оливковое масло, пальмовое масло, пальмоядровое масло, пальмовый олеин, арахисовое масло, масло американского ореха, кедровое масло, фисташковое масло, маковое масло, рапсовое масло, рисовое масло, сафлоровое масло, масло камелии, кунжутное масло, масло из семян ши, соевое масло, подсолнечное масло, таловое масло, масло тсубаки, ореховое масло, типы "природных" масел, обладающих измененным составом жирных кислот, полученных с помощью генетически модифицированных организмов (GMO) или традиционной "селекции", такие как высокоолеиновое, низколиноленовое или низконасыщенное масло (высокоолеиновое масло канолы, низколиноленовое соевое масло или высокостеариновые подсолнечные масла). Дополнительные иллюстративные масла, пригодные для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, описаны в настоящем документе. В определенном варианте осуществления общее содержание фосфатидов в неочищенном масле может варьировать в пределах 0,5-3% мас./мас., что соответствует содержанию фосфора в диапазоне 2001200 м.д. или 250-1200 м.д. Как используют в настоящем документе, "рафинированное масло" относится к маслу, полученному после удаления NHP, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности известных как "камеди") из масла с получением продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства пищи и/или непищевых применений. Различные способы рафинирования известны в данной области и описаны выше. В определенных вариантах осуществления рафинированное масло обладает содержанием фосфолипидов менее чем приблизительно 200 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 150 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 100 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 50 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 40 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 30 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 20 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 15 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 10 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 7 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 5 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 3 м.д. фосфора или менее чем приблизительно 1 м.д. фосфора. Как используют в настоящем документе, термин "негидратируемые фосфолипиды" или "NHP" относится к фосфатидной кислоте и солям фосфатидной кислоты, например солям фосфатидной кислоты с кальцием, магнием и железом; и солям этаноламина с кальцием, магнием и железом. Как используют в настоящем документе, "рафинированное гидратацией масло" относится к маслу,полученному после процесса рафинирования гидратацией. В определенных вариантах осуществления рафинированное гидратацией масло получают перемешиванием 1-3% мас./мас. горячей воды с теплым(60-90 С) неочищенным маслом в течение 30-60 мин. В определенных вариантах осуществления стадия рафинирования гидратацией удаляет фосфатиды и клейкие камеди, которые становятся не растворимыми в масле после гидратации. Гидратированные фосфатиды и камеди можно отделять от масла осаждением,фильтрацией или центрифугированием. Получение нуклеиновых кислот и манипулирование ими Изобретение относится к выделенным, синтетическим и рекомбинантным нуклеиновым кислотамSEQ ID NO: 6), содержащим (и имеющим) одно или несколько изменений аминокислотных остатков (например, мутаций), как указано в табл. 12-15, включая экспрессирующие кассеты, такие как экспрессирующие векторы, кодирующие полипептиды и фосфолипазы по изобретению. Также изобретение включает способы выявления новых последовательностей фосфолипазы с использованием нуклеиновых кислот по изобретению. Также предусмотрены способы модификации нуклеиновых кислот по изобретению, например, посредством синтетической повторной сборки лигированием, оптимизированной системы направленных изменений и/или мутагенеза с насыщением. Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены, выделены и/или обработаны, например, посредством клонирования и экспрессии библиотек кДНК, амплификации транскрипта или геномной ДНК посредством ПЦР и т.п. Для применения на практике способов по изобретению гомологичные гены могут быть модифицированы воздействием на матричную нуклеиновую кислоту, как описано в данном описании. Изобретение можно применять на практике совместно с любым способом или протоколомили устройством, известными в данной области, которые полностью описаны в научной и патентной литературе. В альтернативных вариантах осуществления последовательности генов по изобретению или гены,используемые для применения на практике изобретения, включают сегмент ДНК, вовлеченный в образование полипептидной цепи, включая, среди прочего, области, предшествующие и следующие после кодирующей области, такие как лидерная и концевая часть, промоторы и энхансеры, а также, где это применимо, последовательности (интроны), встроенные между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты или последовательности нуклеиновых кислот по изобретению или используемые для применения изобретения на практике могут содержать олигонуклеотид, нуклеотид, полинуклеотид или фрагмент любого из них, ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, иРНК) геномного или синтетического происхождения, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может быть представлена смысловой или антисмысловой (комплементарной) цепью, пептидно-нуклеиновую кислоту (PNA) или любое ДНК-подобное или РНКподобное вещество природного или синтетического происхождения, включая, например, иРНК, рибонуклеопротеины (например, двухцепочечные иРНК, например, иРНП). Термин охватывает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты или последовательности нуклеиновых кислот по изобретению или используемые для применения на практике изобретения, также охватывают подобные нуклеиновым кислотам структуры с синтетическими каркасами, см., например, Mata (1997) Toxicol.Nucleic Acid Drug Dev 6: 153-156. Общие способы Нуклеиновые кислоты, используемые для осуществления данного изобретения, любые из РНК,iPHK, антисмысловой нуклеиновой кислоты, кДНК, геномной ДНК, векторов, вирусов или их гибридов,можно выделять из множества источников, можно получать способами генной инженерии, можно амплифицировать и/или экспрессировать/получать рекомбинантными способами. Рекомбинантные полипептиды, полученные из этих нуклеиновых кислот, можно индивидуально выделять или клонировать и можно тестировать в отношении желаемой активности. Можно использовать любые рекомбинантные экспрессирующие системы, включая экспрессирующие системы клеток бактерий, млекопитающих,дрожжей, насекомых или растений. Альтернативно, такие нуклеиновые кислоты можно синтезировать in vitro хорошо известными способами химического синтеза, как описано, например, в Adams (1983) J. Am. Chem. Soc, 105:661; Belousov(1994) Biochemistry, 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol, 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol.,68:109; Beaucage (1981) Terra. Lett., 22:1859; в патенте США 4458066. Способы для манипулирования с нуклеиновыми кислотами, такие как, например, субклонирование,введение зонда (например, мечение со случайными праймерами с использованием полимеразы Кленова,ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и т.п. полностью описаны в научной и патентной литературе, см., например, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), v. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARI. Theory and Nucleic acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993). Другими подходящими способами получения и манипулирования с нуклеиновыми кислотами, используемыми для осуществления способов по изобретению, являются клонирование из геномных образцов и, если желательно, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например, из геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемой в способах по изобретению, включают геномные библиотеки или библиотеки кДНК, содержащиеся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (MAC), см., например, патенты США 5721118; 6025155; искусственных хромосомах человека, см., например, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335; искусственных хромосомах дрожжей (YAC); искусственных хромосомах бактерий (ВАС); искусственных хромосомах Р 1, см., например, Woon (1998) Genomics, 50:306-316; векторах, полученных на основе P1 (PACs), см., например, Kern (1997) Biotechniques, 23:120-124; космидах, рекомбинантных вирусах, фагах или плазмидах. В одном аспекте нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по изобретению, соединена в соответствующем участке с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслируемого полипептида или его фрагмента. Изобретение относится к слитым белкам и нуклеиновым кислотам, кодирующим их. Полипептид по изобретению можно подвергать слиянию с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким какN-концевые идентификационные пептиды, которые придают желаемые свойства, такие как повышение стабильности или упрощение очистки. Пептиды и полипептиды по изобретению также можно синтезировать и экспрессировать в качестве слитых белков с одним или несколькими дополнительными доменами, связанными с ними, например, для получения более иммуногенного пептида, для упрощения выделения рекомбинантного синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и экспрессирующих антитела В-клеток и т.п. Облегчающие определение и очистку домены включают, например, пептиды, хелатирующие металлы, такие как полигистидиновые участки и молекулы гистидинтриптофана, которые делают возможной очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые делают возможной очистку на иммобилизованных иммуноглобулинах, и домен, используемый в системе очистки удлинения/аффинности FLAGS (Immunex Corp., Seattle WA). Добавление расщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор Ха или энтерокиназа (Invitrogen, San Diego CA),между доменом для очистки и пептидом или полипептидом, содержащим мотив, облегчает очистку. Например, экспрессирующий вектор может включать кодирующую эпитоп последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с шестью остатками гистидина с последующим тиоредоксином и участком расщепления энтерокиназой (см., например, Williams (1995) Biochemistry, 34:1787-1797; Dobeli (1998) ProteinExpr. Purif., 12:404-414). Остатки гистидина облегчают определение и очистку, в то время как участок расщепления энтерокиназой обеспечивает средство очистки эпитопа от остального слитого белка. Технология,относящаяся к векторам, кодирующим слитые белки, и применение слитых белков полностью описаны в научной и патентной литературе, см., например, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53. Последовательности контроля транскрипции и трансляции Изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот (например, ДНК) по изобретению, функционально связанным с последовательностью(ями) для контроля экспрессии (например, транскрипционными или трансляционными), например с промоторами или энхансерами, для управления и модулирования синтеза/экспрессии РНК. Последовательность для контроля экспрессии может находиться в экспрессирующем векторе. Иллюстративные бактериальные промоторы включают lacI, lacZ, Т 3, Т 7,gpt, lambda PR, PL и trp. Иллюстративные эукариотические промоторы включают предранний промоторCMV, промотор HSV тимидинкиназы, ранний и поздний промотор SV40, LTR ретровирусов и промотор мышиного металлотионеина I. Промоторы, пригодные для экспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы lac или trp Е. coli, промотор lacI, промотор lacZ, промотор Т 3, промотор Т 7, промотор gpt, промотор lambda PR,промотор lambda PL, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как промотор 3-фосфоглицераткиназы (PGK) и кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают предранний промотор CMV, промотор HSV тимидинкиназы, промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор SV40, LTR ретровирусов и промотор металлотионеина-1 мыши. Также могут быть использованы другие промоторы, известные тем, что они контролируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах. Экспрессирующие кассеты, векторы и носители для клонирования Изобретение относится к экспрессирующим векторам и носителям для клонирования, содержащим нуклеиновые кислоты по изобретению, например последовательности, кодирующие фосфолипазы по изобретению. Экспрессирующие векторы и носители для клонирования по изобретению могут содержать частицы вирусов, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, искусственные бактериальные хромосомы, вирусную ДНК (например, ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц,вируса псевдобешенства и производных SV40), искусственные хромосомы на основе Р 1, дрожжевые плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфические для конкретных представляющих интерес хозяев (таких как Bacillus, Aspergillus и дрожжи). Векторы по изобретению могут включать хромосомные, нехромосомные последовательности и синтетические последовательности ДНК. Большое количество подходящих векторов известно специалистам в данной области, и они являются коммерчески доступными. Иллюстративные векторы включают бактериальные векторы pQE(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Однако можно использовать любую другую плазмиду или другой вектор при условии, что они способны реплицироваться и являются устойчивыми в хозяине. В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы векторы с низкой копийностью или с высокой копийностью. В альтернативных вариантах осуществления термин "экспрессирующая кассета" включает нуклеотидную последовательность, которая способна влиять на экспрессию структурного гена (т.е. кодирующей белок последовательности, такой как фосфолипаза по изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Экспрессирующие кассеты могут включать, по меньшей мере, промотор,функционально связанный с кодирующей полипептид последовательностью; и, необязательно, с другими последовательностями, например с сигналами терминации транскрипции. Также могут быть использованы дополнительные факторы, например энхансеры. В альтернативных вариантах осуществления "функционально связанный" относится к расположению промотора выше последовательности ДНК, так чтобы промотор опосредовал транскрипцию последовательности ДНК. В альтернативных вариантах осуществления экспрессирующие кассеты включают плазмиды, экспрессирующие векторы, рекомбинантные вирусы, любую форму рекомбинантного вектора с "депроинизированной ДНК" и т.п. В альтернативных вариантах осуществления векторы по изобретению содержат нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфицировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. В альтернативных вариантах осуществления вектор может представлять собой депротеинизированную нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор необязательно содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, и/или белки, и/или мембраны(например, клеточную мембрану, вирусную липидную оболочку и т.д.). Векторы включают, но не ограничиваются ими, репликоны (например, РНК-репликоны, бактериофаги), с которыми можно соединять фрагменты ДНК и делать их реплицирующимися. Таким образом, векторы включают, но не ограничиваются ими, РНК, автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и т.п., см., например, патент США 5217879) и включают как экспрессирующие, так и неэкспрессирующие плазмиды. Если рекомбинантный микроорганизм или клеточная культура описаны как содержащие "экспрессирующий вектор", то в этом случае включается как экстрахромосомную кольцевую, так и линейную ДНК, и ДНК, которая встраивается в хромосому(ы) хозяина. В случае,если вектор поддерживается в клетке-хозяине, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками в процессе митоза в качестве автономной структуры, либо он является встроенным в геном хозяина. В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к плазмидам, которые могут быть обозначены с помощью строчной буквы "р", которой предшествуют и/или за которой следуют прописные буквы и/или числа. В альтернативных вариантах осуществления "исходная" плазмида является коммерчески доступной, общедоступной без ограничений или она может быть сконструирована на основе доступных плазмид в соответствии с опубликованными методиками. В альтернативных вариантах осуществления плазмиды, эквивалентные описанным в данном описании плазмидам, известны в данной области и будут очевидны среднему специалисту в данной области. В альтернативных вариантах осуществления экспрессирующий вектор может содержать промотор,участок связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Также вектор может включать соответствующие последовательности для усиления экспрессии. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать ориджин репликации, любые необходимые участки связывания рибосом, участок полиаденилирования, доноры сплайсированных фрагментов и акцепторные участки,последовательности терминации транскрипции и фланкирующие 5'-конец нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов можно использовать последовательности ДНК, полученные из участков сплайсинга иполиаденилирования SV40. В одном аспекте экспрессирующие векторы содержат один или несколько генов селективных мар- 24022979 керов для обеспечения селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селективные маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину, для культур эукариотических клеток, гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. coli, и ген TRP1 S. cerevisiae. Могут быть выбраны промоторные участки из любых других желаемых генов с использованием векторов с хлорамфениколтрансферазой (CAT) или других векторов с селективными маркерами. Также для повышения уровня экспрессии векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках могут содержать энхансеры. Энхансеры представляют собой цис-регуляторные элементы ДНК длиной, как правило, приблизительно от 10 до приблизительно 300 п.о., которые воздействуют на промотор и повышают его транскрипцию. Примеры включают энхансер SV40 на поздней стороне ориджина репликации с 100-270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовирусов. Последовательность ДНК можно встраивать в вектор различными методами. Как правило, последовательность лигируют с вектором в желаемом положении после расщепления вставки и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Альтернативно, можно лигировать тупые концы вставки и вектора. В данной области известно множество технологий клонирования, например, как описано Ausubel иSambrook. Такие методики и другие входят в компетенцию специалистов в данной области. Вектор может быть в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, производные SV40; бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из комбинаций плазмидной и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц и вируса псевдобешенства. Различные векторы для клонирования и экспрессирующие векторы для использования в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны, например, Sambrook. Конкретные бактериальные векторы, которые могут быть использованы, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы хорошо известного вектора для клонированияpBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Швеция), GEM1 (Promega Biotec,Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a,pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 и рСМ 7. Конкретные эукариотические векторы включают pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene)pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL (Pharmacia). Однако можно использовать любой другой вектор при условии, что он способен реплицироваться и является устойчивым в клетке-хозяине. Клетки-хозяева и трансформированные клетки Также изобретение относится к трансформированной клетке, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению, например последовательность, кодирующую фосфолипазу по изобретению, вектор по изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев,известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки,такие как клетки бактерий, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Ферменты по изобретению можно экспрессировать в любой клетке-хозяине, например в любой клетке бактерий, любой клетке дрожжей, например Pichia pastoris, Saccharomycescerevisiae или Schizosaccharomyces pombe. Иллюстративные клетки бактерий включают любой вид родаfluorescens. Иллюстративные клетки грибов включают любой вид Aspergillus. Иллюстративные клетки дрожжей включают любой вид Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Schwanniomyces, включаяPichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe. Иллюстративные клетки насекомых включают любой вид Spodoptera или Drosophila, включая Drosophila S2 и Spodoptera Sf9. Иллюстративные клетки животных включают клетки СНО, COS или меланомы Bowes или любую клеточную линию мыши или человека. Выбор подходящего хозяина находится в пределах квалификации специалистов в данной области. Вектор может быть введен в клетку-хозяин с использованием любой из различных технологий,включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, генные пушки или Tiопосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция,трансфекцию, опосредуемую DEAE-декстраном, липофекцию или электропорацию (Davis L., Dibner M.,Battey L. Basic Methods in Molecular Biology (1986. Когда это целесообразно, клетки-хозяева, полученные способами инженерии, можно культивировать на общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов по изобретению. После трансформации подходящего штамма клеток-хозяев и выращивания штамма клеток-хозяев до приемлемой плотности клеток выбранный промотор можно индуцировать соответствующими способами (например, сменой температуры или химическим индуцированием) и клетки можно культивировать в течение дополнительного периода времени для того, чтобы получить возможность продуцировать желаемый полипептид или его фрагмент. Клетки можно собирать центрифугированием, разрушать физическими или химическими способами и полученный неочищенный экстракт можно сохранять для дальнейшей очистки. Микробные клетки,используемые для экспрессии белков, можно разрушать любым общепринятым способом, включая циклы замораживания и оттаивания, разрушение ультразвуком, механическое разрушение или использование средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент можно извлекать и очищать из культур рекомбинантных клеток методами, включающими осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотой, анионную или катионную обменную хроматографию, хроматографию с фосфоцеллюлозой, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию с гидроксилапатитом и хроматографию с лектином. Если необходимо, для завершения конфигурации полипептида можно использовать стадии рефолдинга. Если необходимо, для конечной стадии очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Также для экспрессии рекомбинантного белка можно использовать различные системы клеточных культур млекопитающих. Примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии фибробластов почки обезьяны COS-7 и другие клеточные линии, способные экспрессировать белки совместимого вектора, такие как клеточные линии C127, 3 Т 3, СНО, HeLa и BHK. Конструкции в клетках-хозяевах можно использовать общепринятым образом для продуцирования продукта гена, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от хозяина, используемого в процессе рекомбинантного продуцирования, полипептиды, продуцируемые клеткой-хозяином,содержащей вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды по изобретению также могут включать начальный аминокислотный остаток метионина или не включать его. Также для получения полипептида по изобретению можно использовать бесклеточные системы трансляции. В бесклеточных системах трансляции можно использовать мРНК, транскрибированные с конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах перед проведением реакции транскрипцииin vitro конструкция ДНК может быть линеаризована. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с соответствующим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика,с получением желаемого полипептида или его фрагмента. Экспрессирующие векторы могут содержать один или несколько генов селективных маркеров для обеспечения фенотипического признака для селекции трансформированных клеток-хозяев, такого как дигидрофолатредуктаза или устойчивость к неомицину для культур эукариотических клеток, или такого как устойчивость к тетрациклину или ампициллину в Е. coli. Иллюстративный фермент PI-PLC (обладающий последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 6,содержащий (и имеющий) одно или более изменений аминокислотных остатков (например, мутаций),как указано в табл. 12-15) был сверхэкспрессирован в активной форме в различных хозяйских системах,включая грамотрицательные бактерии, такие как Е. coli, грамположительные бактерии, такие как любыеBacillus sp. (например, Bacillus subtilis, Bacillus cereus), дрожжевые клетки-хозяева (включая, например,Pichia pastoris, Saccharomyces sp., такие как S. cerevisiae и S. pombe) и Lactococcus lactis, или клетки млекопитающих, грибов, растений или насекомых. Активный фермент экспрессируется в каждой хозяйской системе с различных конструкций. Эти экспрессирующие конструкции нуклеиновой кислоты могут содержать нуклеотиды, кодирующие полноразмерную открытую рамку считывания (состоящую из сигнальной последовательности, пропоследовательности и кодирующей зрелый белок последовательности),или они могут содержать эти генетические элементы либо отдельно, либо в комбинации с гетерологичными генетическими элементами, которые служат в качестве сигнальной последовательности и/или пропоследовательности для открытой рамки считывания зрелого белка. Каждая из этих систем может служить в качестве коммерческого продуцирующего хозяина для экспрессии PLC для применения в ранее описанных ферментативных процессах рафинирования масла. Амплификация нуклеиновых кислот При осуществлении изобретения на практике нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению, или модифицированные нуклеиновые кислоты можно воспроизводить, например, путем амплификации. Изобретение относится к последовательностям пары праймеров для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды с активностью фосфолипазы. В одном аспекте пары праймеров способны амплифицировать последовательности нуклеиновых кислот по изобретению. Специалист в данной области может конструировать последовательности пары праймеров для амплификации для любой части или для полной длины этих последовательностей. Изобретение относится к последовательностям пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по изобретению, или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый член последовательностей пары праймеров может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 последовательно расположенных оснований последовательности или приблизительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,- 26022979 20, 21, 22, 23, 24 или 25 последовательно расположенных оснований последовательности. Изобретение относится к паре праймеров для амплификации, где пара праймеров включает первый член, имеющий последовательность, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатков нуклеиновой кислоты по изобретению, и второй член, имеющий последовательность, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24 или 25 остатков цепи, комплементарной цепи для первого члена. Изобретение относится фосфолипазам, полученным амплификацией, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по изобретению. Изобретение относится к способам получения фосфолипаз амплификацией, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по изобретению. В одном аспекте пара праймеров для амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например из библиотеки генов,такой как библиотека окружающей среды. Реакции амплификации также можно использовать для определения количества нуклеиновой кислоты в образце (такого как количество транскрипта в клеточном образце), внесения метки в нуклеиновую кислоту (например, для использования на матрицах или в блотах), обнаружения нуклеиновой кислоты или определения количества конкретной нуклеиновой кислоты в образце. В одном аспекте изобретения амплифицируют транскрипт, выделенный из клетки или библиотеки кДНК. Специалист в данной области может выбрать и разработать приемлемые олигонуклеотидные праймеры для амплификации. Способы амплификации также хорошо известны в данной области и включают, например, полимеразную цепную реакцию, ПЦР (см., например, PCR protocols, A guide to methods and applications, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) и PCR strategies (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.), лигазную цепную реакцию (ЛЦР) (см., например, Wu (1989) Genomics, 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; BarringerSci., USA, 86:1173) и самоподдерживающуюся репликацию последовательности (см., например, Guatelli(1997) J. Clin. Microbiol., 35:1477-1491), автоматизированный анализ амплификацией с репликазой Q-betaBiotechnology, 13:563-564. Определение степени идентичности последовательностей Изобретение относится к выделенным и рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательности, обладающие по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полной (100%) идентичностью последовательности с иллюстративной нуклеиновой кислотой по изобретению (например, SEQ ID NO: 5 и кодирующая одну или несколько мутаций, указанных в табл. 12-15, как рассмотрено в примере 3, или ее ферментативно активный фрагмент, и нуклеиновые кислоты, кодирующие SEQ ID NO: 6 и кодирующие одну или несколько мутаций, указанных в табл. 12-15, как рассмотрено в примере 3, или ее ферментативно активный фрагмент) на протяжении области по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400,450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400,1450, 1500, 1550 или более остатков. Изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательности, обладающие по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полной (100%) идентичностью последовательности с иллюстративным полипептидом по изобретению. Степень идентичности (гомологии) последовательностей можно определять с использованием любой компьютерной программы и связанных с ней параметров, включая программы, описанные в настоящем документе, такие как BLAST 2.2.2. или FASTA версии 3.0t78, с параметрами по умолчанию. В альтернативных вариантах осуществления идентичность последовательностей может быть на протяжении области по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150,200, 250, 300, 350, 400 последовательно расположенных остатков или полной длины нуклеиновой кислоты или полипептида. Степень идентичности (гомологии) последовательностей можно определять с использованием любой компьютерной программы связанных с ней параметров, включая программы, описанные в настоящем документе, такие как BLAST 2.2.2 или FASTA версии 3.0t78, с параметрами по умолчанию. Гомологичные последовательности также включают последовательности РНК, в которых остатки уридина замещают остатки тимина в последовательности нуклеиновой кислоты. Гомологичные последовательности могут быть получены с использованием любой из методик, описанных в данном описании,или могут быть получены в результате коррекции ошибок при секвенировании. Следует понимать, что последовательности нуклеиновых кислот, указанные в настоящем документе, могут отображаться в традиционном формате отдельных символов (см., например, Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd Ed., W.H. FreemanCo., New York) или в любом другом формате, в котором записывается название нуклеотидов в последовательности. Различные программы для сравнения последовательностей, указанные в настоящем документе, используются в этом аспекте изобретения. Идентичность (гомологию) белков и/или последовательностей нуклеиновых кислот можно оценивать с использованием любого из различных алгоритмов сравнения последовательностей и программ, известных в данной области. Такие алгоритмы и программы включают, но не ограничиваются ими, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA и CLUSTALW (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85 (8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol., 215 (3):403-410, 1990;Thompson et al., Nucleic Acid. Res., 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol., 266:383-402,1996; Altschul et al., J. Mol. Biol., 215 (3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics, 3:266-272, 1993). Гомологию или идентичность можно определять с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group,University, Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Такое программное обеспечение сопоставляет сходные последовательности, присваивая степени гомологии различным делециям, заменам и другим модификациям. Термины "гомология" и "идентичность" в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или обладают точно определенным процентным количеством аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые оказываются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в пределах окна сравнения или обозначенной области, которое измеряется с использованием любого количества алгоритмов сравнения последовательностей или выравниванием вручную и визуальным исследованием. При сравнении последовательностей одна последовательность может выступать в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают анализируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей анализируемую и эталонную последовательности вносят в компьютер, координаты подпоследовательностей обозначают, если необходимо, и определяют параметры программы алгоритма для последовательностей. Можно использовать параметры по умолчанию или можно назначить альтернативные параметры. Затем на основании параметров программы алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процентную идентичность последовательностей для анализируемой последовательности относительно эталонной последовательности. Как используют в настоящем документе, "окно сравнения" относится к сегменту любого из числа последовательно расположенных остатков. Например, в альтернативных аспектах изобретения, последовательно расположенные остатки с любой длиной в диапазоне от 20 до полной длины иллюстративной последовательности по изобретению сравнивают с эталонной последовательностью из того же числа последовательно расположенных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Если эталонная последовательность обладает требуемой идентичностью последовательности с иллюстративной последовательностью по изобретению, например 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности с последовательностью по изобретению, то эта последовательность находится в объеме изобретения. В альтернативных вариантах осуществления подпоследовательности в диапазоне приблизительно от 20 до 600, приблизительно от 50 до 200 и приблизительно от 100 до 150 сравнивают с эталонной последовательностью того же числа последовательно расположенных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, посредством алгоритма локальной гомологии SmithWaterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981, посредством алгоритма выравнивания по гомологии NeedlemanWunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970, посредством поиска сходства способом PersonLipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 85:2444, 1988, посредством компьютеризованного использования этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или посредством выравнивания вручную и визуального исследования. Другие алгоритмы для определения гомологии и идентичности включают, например, помимо программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool в National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequence), AMPSAlignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison),LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment ConstructionAnalysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (PatternInduced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) и WHAT-IF. Такие программы для выравнивания также могут быть использованы для скрининга геномных баз данных для идентификации полинуклеотидных последовательностей, по существу, с идентичными последовательно- 28022979 стями. Доступным является ряд геномных баз данных, например, основная часть генома человека доступна в качестве части проекта секвенирования генома человека (Gibbs, 1995). Было отсеквенировано несколько геномов, например M. genitalium (Fraser et al., 1995), M. jannaschii (Bult et al., 1996), H. influenzae (Fleischmann et al., 1995), E. coli (Blattner et al., 1997) и дрожжи (S. cerevisiae) (Mewes et al., 1997) и D.melanogaster (Adams et al., 2000). Значительный прогресс также был достигнут в секвенировании геномов моделей организмов, таких как мышь, С. elegans и Arabadopsis sp. Базы данных, содержащие информацию геномов, снабженных некоторой функциональной информацией, поддерживаются различными организациями и являются доступными через Интернет. Также для осуществления изобретения на практике используют алгоритмы BLAST, BLAST 2.0 иBLAST 2.2.2. Они описаны, например, в Altschul (1977) Nue. Acids Res., 25: 3389-3402, и Altschul (1990),J. Mol. Biol., 215:403-410 соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализов BLAST является общедоступным через National Center for Biotechnology Information. Этот алгоритм включает первичную идентификацию пар последовательностей с максимальным сходством (HSP) посредством идентификации коротких слов с длиной W в представляющей интерес последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому оцениваемому положительно порогу значения Т при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т определяется как порог значений для соседних слов (Altschul (1990) выше). Эти изначальные совпадения соседних слов выступают в роли предшественников для начала поиска при обнаружении более длинных HSP, содержащих их. Поиск совпадений слов распространяется в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока суммарное значение для выравнивания может повышаться. Суммарные значения вычисляются с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров M (значение компенсации за пару совпавших остатков; всегда 0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления суммарного значения используется оценочная матрица. Продолжение поиска совпадений слов в каждом направлении останавливают, если суммарное значение для выравнивания снижается по величине X ниже максимально достижимого значения; суммарное значение снижается до нуля или ниже при накоплении одного или нескольких выровненных остатков с отрицательным значением или если достигнут конец любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (W) 11, ожидаемое значение (Е) 10, М = 5, N = -4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует в качестве параметров по умолчанию длину слова 3 и ожидаемые значения (Е) 10 и оценочную матрицу BLOSUM62 (см. HenikoffHenikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:10915), фрагменты для выравнивания (В) 50, ожидаемое значение (Е) 10, М = 5, N = -4 и сравнение обеих цепей. Алгоритм BLAST также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, KarlinAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:5873). Один способ определения сходства, обеспечиваемый алгоритмом BLAST, представляет собой наименьшую суммарную вероятность (P(N, которая предполагает указание вероятности, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайным образом. Например, нуклеиновая кислота рассматривается как сходная с контрольной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении анализируемой нуклеиновой кислоты с контрольной нуклеиновой кислотой составляет менее чем приблизительно 0,2, более предпочтительно менее чем приблизительно 0,01 и предпочтительно менее чем приблизительно 0,001. В одном аспекте гомологию последовательности белка и нуклеиновой кислоты оценивают с использованием Basic Local AlignmentSearch Tool ("BLAST"). Например, для осуществления следующих задач используют пять конкретных программ BLAST: (1) BLASTP и BLAST3 сравнивают представляющую интерес аминокислотную последовательность с базой данных последовательностей белков; (2) BLASTN сравнивает представляющую интерес нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей; (3)BLASTX сравнивает концептуальные продукты трансляции с шести рамок представляющей интерес нуклеотидной последовательности (обе нити) с базой данных белковых последовательностей; (4)TBLASTN сравнивает представляющую интерес белковую последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслируемых со всех шести рамок считывания (обе цепи); и (5)TBLASTX сравнивает продукты трансляции с шести рамок представляющей интерес нуклеотидной последовательности с продуктами трансляции с шести рамок базы данных нуклеотидных последовательностей. Программы BLAST идентифицируют гомологичные последовательности посредством идентификации сходных сегментов, которые в данном описании называются "парами сегментов с максимальным сходством" между представляющей интерес последовательностью аминокислоты или нуклеиновой кислоты и анализируемой последовательностью, которая предпочтительно получена из последовательности белка или нуклеиновой кислоты из базы данных. Пары сегментов с максимальным сходством предпочтительно идентифицируются (т.е. выравниваются) посредством оценочных матриц, многие из которых известны в данной области. В одном аспекте оценочная матрица представляет собой матрицу BLOSUM62 (Gonnet et al., Science, 256:1443-1445, 1992; Henikoff and Henikoff, Poteins, 17:49-61, 1993). В меньшей степени предпочтительно также могут быть использованы матрицы РАМ или РАМ 250 (см.,- 29