Димерные слитые белки vstm3 и связанные с ними композиции и способы

ДИМЕРНЫЕ СЛИТЫЕ БЕЛКИ VSTM3 И СВЯЗАННЫЕ С НИМИ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ Описаны композиции и способы, относящиеся к растворимым димерным белкам. Димерные белки содержат первую и вторую полипептидные слитые молекулы, связанные посредством димеризирующего домена, причем каждая полипептидная слитая молекула, содержащая первый и второй мономерные домены, соответствует цитокину или внеклеточному домену рецептора клеточной поверхности. Мономерные домены могут быть расположены ближе к аминоконцу и ближе к карбоксиконцу по отношению к димеризирующему домену. Альтернативно, мономерные домены могут быть расположены в тандемной конфигурации либо ближе к карбоксиконцу, либо ближе к аминоконцу по отношению к димеризирующему домену. Димерные белки применимы в способах лечения, в диагностике и для исследования. Ссылка на родственные заявки Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США 61/352873, поданной 9 июня 2010 г. Уровень техники Рецепторы клеточной поверхности опосредуют множество биологических эффектов путем связывания их когнатных лигандов. Рецепторы, как правило, состоят из одного или нескольких интегральных мембранных белков, которые связывают лиганд, такой как цитокин или противорецептор, с высокой аффинностью и преобразовывают это событие связывания в клетке через цитоплазматические части определенных субъединиц рецептора. Рецепторы клеточной поверхности были сгруппированы в несколько классов на основании сходства их внеклеточных связывающих лиганды доменов. Примером физиологического значения рецепторов клеточной поверхности является роль совместно стимулирующих рецепторов в опосредовании функции иммунных клеток. В норме Т-клетки активируются захватом Т-клеточного рецептора антигена (TCR) молекулами MHC и чужеродными пептидами,презентированными антигенпрезентирующими клетками (АРС). Профессиональные АРС также экспрессируют ряд совместно стимулирующих молекул, которые захватывают другие рецепторы на Т-клетках и участвуют в активации. Доказанным средством ингибирования активации Т-клеток является вмешательство с захватом этих совместно стимулирующих молекул. Что особенно важно, CTLA4-Ig может быть использован для предотвращения критических совместно стимулирующих сигналов через молекулуCD28, что, тем самым, мешает ответам Т-клеток. Были идентифицированы другие совместно стимулирующие молекулы, и они, как правило, важны в особых ситуациях, когда экспрессируются их противоструктуры. Одной из таких молекул, чей вклад только недавно был оценен, является совместно стимулирующий рецептор CD226. Противоструктурами для CD226 являются белки PVR из семейства нектинов (CD155) и нектин-2 (CD112), которые широко экспрессируются в тканях, обычно инфильтрованных лимфоцитами при аутоиммунных или аутовоспалительных заболеваниях, в том числе в эпителии, эндотелии, синовиоцитах и клетках ЦНС. Важно отметить, что сигналы через CD226, как было показано, являются критичными для активации Т-клеток в ситуациях, когда Т-клетки стимулируются непрофессиональными АРС (см. Gilfillan et al., J. Exp. Med. 205:2965-2973, 2008; Iguchi-Manaka et al., J. Exp. Med. 205:2959-2964, 2008), которые будут включать аутоиммунные заболевания, при которых Т-клетки активируются и причиняют вред в воспаленных тканях. Более того, полиморфизм в CD226 в последнее время связывают с риском развития ряда аутоиммунных состояний, в том числе рассеянного склероза (PC), диабета I типа, болезни Грейвса и гранулематоза Вегенера (см. International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC), Genes Immun. 10:11-14, 2009;Hafler et al., Genes Immun. 10:5-10, 2009; Maier and Hafler, Immunol. Rev. 229:322-336, 2009; Mait et al.,"Non-synonymous variant (Gly307Ser) in CD226 is associated with susceptibility to multiple autoimmune diseases," Rheumatology (Oxford) (March 24, 2010 [Epub ahead of print]. Следовательно, есть логическое основание вмешательства в опосредованные CD226 сигналы в функции иммунных клеток.VSTM3 (также упоминаемый как B7R1 в международной РСТ публикацииWO 06/124667) является ингибиторным представителем семейства CD28, которое, как было показано, также связывается сPVR и нектином-2, теми же самыми противоструктурами, что и CD226. Фактически, VSTM3 и CD226 перекрестно конкурируют за связывание с PVR и нектином-2, что указывает на то, что они связывают перекрывающиеся, если не идентичные области, хотя VSTM3, по-видимому, связывается с несколько более высокой аффинностью. Известны растворимые формы многих рецепторов клеточной поверхности. Такие растворимые рецепторы соответствуют лигандсвязывающим доменам их аналогов клеточной поверхности. Например,встречающиеся в природе растворимые рецепторы цитокина ингибируют цитокиновые ответы и действуют как транспортные белки (см., например, Aggarwal and Puri, "Common and Uncommon Features ofDisease and Therapy, Blackwell Science, 1995, 3-24). Кроме того, было обнаружено, что димеризация полипептидов растворимых рецепторов с помощью применения слитых белков может усилить связывающие свойства таких растворимых рецепторов так, что они становятся терапевтически полезными антагонистами их когнатных лигандов. Типичным примером таких димерных слитых молекул являются иммуноглобулиновые слитые молекулы (см. например, Sledziewski et al., патенты США 5155027 и 5567584; Jacobs et al., патент США 5605690; Wallner et al., патент США 5914111; а также Ashkenaziand Chamow, Curr. Opin. Immunol. 9:195-200, 1997). Например, было показано, что растворимый VSTM3 является терапевтически эффективным на животных моделях опосредованного Т-клетками заболевания. В частности, было показано, что димеры растворимого VSTM3-Fc в обычном двухвалентном формате ингибируют ответы Т-клеток in vivo, что было измерено по реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH), и что такие димеры снижают частоту встречаемости и развитие заболевания на модели коллаген-индуцированного артрита (CIA) (см. международную РСТ публикациюWO 06/124667). Также было показано, что тетрамер растворимогоVSTM3-VASP эффективен на модели CIA (см. там же). Множество биологических эффектов, в том числе рост и дифференцировка многих типов клеток,-1 022932 также опосредуются малыми растворимыми белками, собирательно названными цитокинами (см. например, Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783, 1990; Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311, 1991; Paul andSeder, Cell 76:241, 1994). Белки, которые составляют группу цитокинов, включают в себя интерлейкины,интерфероны, колониестимулирующие факторы, факторы некроза опухоли и прочие регуляторные молекулы. Продемонстрированная in vivo активность рецепторов клеточной поверхности и цитокинов иллюстрирует клинический потенциал и необходимость молекул, которые опосредуют биологическую активность рецепторов и цитокинов. Например, продемонстрированные in vivo активности провоспалительных рецепторов и цитокинов, в том числе активности совместно стимулирующих рецепторов в опосредованных иммунными клетками клеточных ответах, иллюстрирует огромный клинический потенциал антагонистов провоспалительных молекул и потребность в них. Имеется особенная потребность в растворимых слитых молекулах таких рецепторов клеточной поверхности и в цитокинах, характеризующихся улучшенной активностью по сравнению с известными форматами слитых белков. Настоящее изобретение, как указано в настоящем документе, соответствует этим и другим потребностям. Сущность изобретения Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к слитой молекуле растворимых полипептидов, содержащей от аминоконца к карбоксильному концу P1-L1-D-L2-P2 или P2-L2-P1-L1-D, в котором Р 1 представляет собой (i) внеклеточный домен первого рецептора клеточной поверхности или его функциональный вариант или фрагмент или (ii) первый цитокин или его функциональный вариант или фрагмент; L1 представляет собой первый полипептидный линкер; D представляет собой димеризирующий домен; L2 представляет собой второй полипептидный линкер; а Р 2 представляет собой (i) внеклеточный домен второго рецептора клеточной поверхности или его функциональный вариант или фрагмент или (ii) второй цитокин или его функциональный вариант или фрагмент. Согласно родственному аспекту настоящее изобретение относится к димерному белку, содержащему первую слитую молекулу растворимых полипептидов и вторую слитую молекулу растворимых полипептидов, причем каждое из первого и второго слитых молекул растворимых полипептидов характеризуется формулой P1-L1-D1-L2P2 или P2-L2-P1-L1-D выше. Согласно определенным вариантам осуществления слитые молекулы растворимых полипептидов или димерного белка, как указано выше, в которых Р 1 представляет собой внеклеточный домен первого рецептора клеточной поверхности или его функциональный вариант или фрагмент, и/или Р 2 представляет собой внеклеточный домен второго рецептора клеточной поверхности или его функциональный вариант или фрагмент, первый рецептор клеточной поверхности и/или второй рецептор клеточной поверхности индивидуально выбраны из группы, состоящей из 4-1BB; рецептора АСТН; рецепторов активина;A IL-31; BCMA; TACI; рецептора BAFF; рецептора иммунорегуляторного семафорина CD72; ассоциированного с саркомой Капоши GPCR вируса герпеса; рецептора липоксина А 4; рецептора лимфотоксина ; рецептора лизофосфолипидного фактора роста; нейрокинина 1; опиоидных рецепторов ,идля эндорфинов; рецептора онкостатина М; рецептора остеопонтина; остеопротегерина; Ох 40; рецепторов РАСАР и VIP; рецепторов PAF; поксивируса; гомологов рецепторов IFN/; гомологов рецепторов поксивирусного IFN; гомологов рецепторов поксивирусного IL-1; гомологов рецепторов, соединенных со связанным с мембраной белком G поксивируса; секретированных поксивирусом связывающих хемокин белков; гомологов рецепторов TNF поксивируса; рецептора пролактина; RANK; рецептора RON; рецептора SCF; рецепторов соматостатина; T1/ST2; рецепторов TGF-бета; рецепторов TNF (например, р 60 и р 80); TNFRSF19; рецептора ТРО; US28; XCR1; рецептора эритропоэтина; рецептора гормона роста; рецептора ингибирующего лейкоз фактора и рецептора C-kit. При этом и Р 1, и Р 2 являются внеклеточными доменами рецептора клеточной поверхности или его функциональными вариантами или фрагментами,первый и второй рецепторы клеточной поверхности могут быть одинаковыми или различными. Согласно другим вариантам осуществления, в которых Р 1 представляет собой первый цитокин или его функциональный вариант или фрагмент, и/или Р 2 представляет собой второй цитокин или его функциональный вариант или фрагмент, первый цитокин и/или второй цитокин индивидуально выбраны из группы, состоящей из -MSH; 9E3/cCAF; АСТН; активина; AK155; ангиостатина; Apo2L/TRAIL; APRIL;BAFF (BLys); лиганда BLR1/BCA-1/BLC/CXCL13; семейства BMP; BRAK; кодируемого геном кальцитонина пептида (CGRP); хемокина СС вируса контагиозного моллюска; CCL27; CCL28; CD100/Sema4D; лиганда CD27; лиганда CD30; лиганда CD40; CK8-1/MPIF-1/CCL23; CLF/CLC; CSF-1; СТ-1; СТАР-III,TG и NAP-2//CXCL7; CXCL16; дефензинов; ELC/MIP-3/Exodus-3/CCL19; ENA-78/CXCL5; эндорфинов; эндостатина; эотаксина 2/MPIF-2/CCL24; эотаксина/CCL11; эритропоэтина; Exodus-l/LARC/MIP-3(SCYA 20); лиганда Fas; лиганда Flt-3; fMLP; фракталкина/СХ 3CL1; G-CSF; GCP-2/CXCL6; GM-CSF; гормона роста; HCC-1/CCL14; HCC-4/CCL16; бокса группы белков с высокой подвижностью 1(HMGB1); противомикробного пептида кателицидина человека LL-37; I-309/CCL1; лигандов IFN, IFN и IFN; IFN; IL-1; IL-1; IL-10; IL-11; IL-12; IL-13; IL-15; IL-16; IL-17A; IL-17B; IL-17C; IL-17D; IL17E; IL-17F; IL-18; IL-1Ra; IL-2; IL-27; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8/CXCL8; IL-9; IP-10/CXCL10; IL19; IL-20; DL-21; IL-22; IL-23; IL-24; IL-26; IL-31; кератиноцитарного фактора роста; связанного с KSHV лиганда IL-6; лептина; лейкотактина 1/HCC-2/MIP-16/CCL15; лейкотриена В 4; LIGHT; липоксина; лимфотактина/XCL1; лимфотоксинаи ; лизофосфолипидных факторов роста; хемокина макрофагового происхождения; стимулирующего макрофаг белка (MSP); MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7,MCP-4/CCL13 и MCP-5/CCL12; метоксиэстрадиола; MGSA/GRO/CXCL1, CXCL2, CXCL3; MIF;PDGF-A; PDGF-B; PDGF-C; PDGF-D; фактора активации тромбоцитов; тромбоцитарного фактора 4/CXCL4; связанных с эпидермальным фактором роста факторов роста поксвируса; секретированных поксвирусом белков контроля комплемента; гомологов фактора роста эндотелия сосудов поксиврусаTNF; TSG-6; TWEAK; семафорина вируса осповакцины; vCXC-1 и vCXC-2; VEGF; VIP и РАСАР; а также вариантов вирусного IL-10. При этом и Р 1, и Р 2 являются цитокином или его функциональным вариантом или фрагментом, первый и второй цитокины могут быть одинаковыми или различными. Согласно определенным вариантам осуществления каждый из Р 1 и Р 2 представляет собой внеклеточный домен VSTM3 (B7R1) или его функциональный вариант или фрагмент. Например, согласно конкретным вариантам слитые молекулы растворимых полипептидов, характеризующихся формулой P1-L1D-L2-P2 или P2-L2-P1-L1-D, как указано выше, P1 представляет собой первый полипептид, характеризующийся по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотными остатками 25-141 из SEQ ID NO: 2,а Р 2 представляет собой второй полипептид, характеризующийся по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотными остатками 25-141 из SEQ ID NO: 2; причем полипептидная слитая молекула характеризуется способностью специфичного связывания с внеклеточным доменом CD155 (аминокислотные остатки 28-343 из SEQ ID NO: 22). Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один из Р 1 и Р 2 характеризуется 100% идентичностью с аминокислотными остатками 25-141 из SEQ IDNO: 2. Согласно другим вариантам по меньшей мере один из Р 1 и Р 2 содержит нецистеиновый остаток,такой как тирозин, в аминокислотном положении, соответствующем остатку 69 из SEQ ID NO: 2. Например, согласно конкретным вариантам осуществления по меньшей мере один из Р 1 и Р 2 содержит аминокислотную последовательность, показанную в остатках 23-139 из SEQ ID NO: 18. Особенно приемлемые димеризирующие домены для применения в соответствии с полипептидной слитой молекулой или димерным белком, как указано выше, содержат константные области тяжлой цепи иммуноглобулина. Например, согласно особым вариантам димеризирующий домен D представляет собой Fc-фрагмент, такой как Fc-фрагмент 1 человека. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептидной слитой молекулы или димерного белка, как указано выше, линкер L1 состоит из 15-32 аминокислотных остатков, причем 1-8 (например,два) из этих остатков являются цистеиновыми остатками. Согласно конкретным вариантам L1 содержит шарнирную область иммуноглобулина или ее вариант. Например, согласно конкретному варианту осуществления L1 содержит вариант шарнира иммуноглобулина (например, вариант шарнира 1 человека),в котором цистеиновый остаток, соответствующий Eu остатку 220, замещен серином. Особенно приемлемые линкеры L2 для применения в соответствии с полипептидной слитой молекулой или димерным белком, как указано выше, содержат линкеры, содержащие множество глициновых остатков и необязательно содержащие по меньшей мере один сериновый остаток. Например, согласно конкретному варианту осуществления полипептидной слитой молекулы, характеризующейся формулойP1-L1-D-L2-P2, или димерного белка, содержащего первую и вторую такие полипептидные слитые молекулы, L2 содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 25. Согласно конкретному варианту осуществления полипептидной слитой молекулы, характеризующейся формулой P2L2-P1-L1-D, или димерного белка, содержащего первую и вторую такие полипептидные слитые молекулы, L2 характеризуется формулой [Gly-Gly-Gly-Ser]n (SEQ ID NO: 26), в которой n представляет собой целое число от 3 до 5 включительно. Согласно особым вариантам полипептидной слитой молекулы, характеризующейся формулой P1-3 022932L1-D-L2-P2 или P2-L2-P1-L1-D, и в которой каждый из P1 и Р 2 представляет собой внеклеточный доменVSTM3 или его функциональный вариант или фрагмент, полипептидная слитая молекула содержит аминокислотную последовательность, выбранную из (а) аминокислотной последовательности, показанной в остатках 23-493 из SEQ ID NO: 18, и (b) аминокислотной последовательности, показанной в остатках 23508 или 23-507 из SEQ ID NO: 20. Подобным образом, согласно особым вариантам димерного белка в соответствии с настоящим изобретением каждый из первого и второго полипептидных слитых молекул содержит аминокислотную последовательность, выбранную из (а) аминокислотной последовательности,показанной в остатках 23-493 из SEQ ID NO: 18, и (b) аминокислотной последовательности, показанной в остатках 23-508 или 23-507 из SEQ ID NO: 20. Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептидную слитую молекулу, как указано выше. Согласно родственному аспекту настоящее изобретение относится к вектору, содержащему такой полинуклеотид. Например, согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипции; сегмент ДНК, кодирующий полипептидную слитую молекулу, как указано выше; и терминатор транскрипции. Согласно еще одному родственному аспекту настоящее изобретение относится к культивируемым клеткам, содержащим такие векторы, а также к способам получения полипептида или димерного белка,раскрытого выше. Например, согласно некоторым вариантам осуществления культивируемая клетка в соответствии с настоящим изобретением содержит вектор экспрессии, содержащий следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипции; сегмент ДНК, кодирующий полипептидную слитую молекулу, как указано выше; а также терминатор транскрипции; и при этом клетка экспрессирует кодированную сегментом ДНК полипептидную слитую молекулу. Согласно определенным вариантам способа создания полипептидной слитой молекулы способ предусматривает (i) культивирование клетки,содержащей вектор экспрессии, раскрытый выше, при этом клетка экспрессирует полипептидную слитую молекулу, кодированную сегментом ДНК, и получается кодированная полипептидная слитая молекула; и (ii) извлечение слитой молекулы растворимых полипептидов. Подобным образом, согласно определенным вариантам способа создания димерного белка способ предусматривает (i) культивирование клетки, содержащей вектор экспрессии, раскрытый выше, при этом клетка экспрессирует полипептидную слитую молекулу, кодированную сегментом ДНК, и кодированная полипептидная слитая молекула получается как димерный белок; и (ii) извлечение димерного белка. Настоящее изобретение, кроме того, относится к композиции, содержащей полипептидную слитую молекулу или димерный белок, как указано выше, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Согласно следующему аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения с использованием димерного белка VSTM3, раскрытого выше. Способ, как правило, предусматривает введение субъекту с опосредованным Т-клетками иммунным нарушением эффективного количества димерного белка VSTM3. Опосредованными Т-клетками иммунными нарушениями, подлежащими лечению димерным белком VSTM3, раскрытым в настоящем документе,являются, например, аутоиммунные заболевания, заболевание "трансплантат против хозяина" (GVHD) и отторжение трансплантата. Согласно особым вариантам способом является способ лечения аутоиммунного заболевания, выбранного из ревматоидного артрита, рассеянного склероза (PC) (например, спинооптического PC, первичного прогрессирующего PC (ППРС) и ремитирующего-рецидивирующего PC(РРРС, инсулинзависимого сахарного диабета (IDDM), системной красной волчанки (SLE), глютеновой болезни, неврита, полимиозита, псориаза, псориатического артрита, витилиго, синдрома Шегрена, аутоиммунного панкреатита, воспалительного заболевания кишечника (например, болезни Крона, язвенного колита), активного хронического гепатита, гломерулонефрита, склеродермии, саркоидоза, аутоиммунного заболевания щитовидной железы, тиреоидита Хашимото, болезни Грейвса, гранулематоза Вегенера,миастении гравис, астмы, болезни Эддисона, аутоиммунного увеоретинита, обыкновенной пузырчатки,первичного билиарного цирроза печени, пернициозной анемии, симпатической офтальмии, увеита, аутоиммунной гемолитической анемии, фиброза легких, хронической бериллиевой болезни и идиопатического фиброза легких. Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут понятными со ссылкой на следующее подробное описание настоящего изобретения и приложенные графические материалы. Определения Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, характеризуются тем же значением, что обычно понимается специалистом в данной области техники применительно к описанным способам и композициям. Использованные в настоящем документе следующие термины и фразы характеризуются приписываемыми им значениями, если не указано иное. Термины в единственном числе предусматривают ссылки на объекты во множественном числе, если контекст четко не предусматривает иное."Полипептид" представляет собой полимер из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, либо натуральный, либо полученный синтетически. Полипептиды из менее чем около 10 ами-4 022932 нокислотных остатков обычно называются "пептидами"."Белок" является макромолекулой, содержащей один или несколько полипептидных цепей. Белок также может содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть добавлены в белок клеткой, в которой продуцируется белок, и будут варьировать в зависимости от типа клетки. Белки определены в настоящем документе по их структурам аминокислотного скелета; заместители, такие как углеводные группы, как правило, не определены,но, тем не менее, могут присутствовать. Термины "аминоконцевой" (или "N-концевой") и "карбоксиконцевой" (или "С-концевой") используются в настоящем документе для обозначения положений в полипептидах. Если позволяет контекст,эти термины используются со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, определенная последовательность,расположенная ближе к карбоксиконцу по отношению к эталонной последовательности в полипептиде,размещается ближе к карбоксильному концу эталонной последовательности, но не обязательно на карбоксильном конце всего полипептида. Термин "соответствующий" применительно к положениям аминокислотных остатков в последовательностях означает соответствующие положения в ряде последовательностей, если последовательности оптимально выровнены."Нековалентные связывания" между полипептидами или белками предусматривают водородную связь, стерические взаимодействия, гидрофобные взаимодействия и ионные взаимодействия. Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используются в настоящем документе синонимически и означают одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считаемые от 5'- к 3'-концу. Полинуклеотиды включают в себя РНК и ДНК и могут быть выделены из природных источников, синтезированы in vitro или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражаются в парах нуклеотидов (сокращенно"п.н."), в нуклеотидах ("нт") или в тысячах пар нуклеотидов ("т.п.н."). Если позволяет контекст, последние два термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются одноцепочечными или двухцепочечными. Если термин применяется к двухцепочечным молекулам, он используется для обозначений всей длины, и его следует понимать эквивалентно термину "пары нуклеотидов". Специалисту в данной области техники будет очевидно, что две нити двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине, и что их концы могут быть ступенчатыми в результате ферментативного расщепления; таким образом, все нуклеотиды в молекуле двухцепочечного полинуклеотида могут не быть спаренными. Такие неспаренные концы в длину, как правило, не будут превышать 20 нт."Сегмент" представляет собой часть более крупной молекулы (например, полинуклеотида или полипептида), обладающую определенными свойствами. Например, сегмент ДНК, кодирующий определенный полипептид, представляет собой часть более длинной молекулы ДНК, такой как плазмида или фрагмент плазмиды, которая при считывании в направлении от 5' к 3' кодирует последовательность аминокислот определенного полипептида. Также в контексте полипептидной слитой молекулы в соответствии с настоящим изобретением полипептидный сегмент, соответствующий цитокину или внеклеточному домену рецептора клеточной поверхности, является частью более длинной полипептидной слитой молекулы, которая кроме полипептидного сегмента, соответствующего цитокину или внеклеточному домену рецептора клеточной поверхности, содержит другие полипептидные сегменты (например, линкеры, димеризирующий домен), описанные в настоящем документе. Используемый в настоящем документе "мономер" или "мономерный домен" означает полипептидный сегмент, соответствующий цитокину или внеклеточному домену рецептора клеточной поверхности. Термин "вектор экспрессии" используется для обозначения молекулы ДНК, линейной или кольцевой, которая содержит сегмент, кодирующий представляющий интерес полипептид, функционально связанный с дополнительными сегментами, которые предусмотрены для его транскрипции. Такие дополнительные сегменты содержат промоторные и терминаторные последовательности, а также могут содержать одну или несколько точек начала репликации, один или несколько селектируемых маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.п. Векторы экспрессии, как правило, походят от плазмиды или вирусной ДНК или могут содержать элементы и той и другой. Используемый в настоящем документе термин "промотор" в своем принятом в данной области техники значении означает часть гена, содержащую последовательности ДНК, которые обеспечивают связывание РНК-полимеразы и инициацию транскрипции. Промоторные последовательности обычно, но не всегда, обнаруживаются в 5' некодирующих областях генов."Секреторная сигнальная последовательность" представляет собой последовательность ДНК, которая кодирует полипептид ("секреторный пептид"), который, как компонент более крупного полипептида,направляет более крупный полипептид через секреторный путь клетки, в которой он синтезируется. Более крупный полипептид обычно расщепляется для удаления секреторного пептида во время прохождения через секреторный путь."Функционально связанный" означает, что два или более элементов соединены вместе так, что они функционируют совместно согласно намеченным целям. Если речь идет о сегментах ДНК, фраза означа-5 022932 ет, например, что кодирующие последовательности соединены в корректную рамку считывания и транскрипция инициируется в промоторе и проходит через кодирующий(ие) сегмент(ы) в терминатор. Если речь идет о полипептидах, "функционально связанный" предусматривает и ковалентно (например, с помощью дисульфидной связи), и нековалентно (например, с помощью водородной связи, гидрофобных взаимодействий или ионных взаимодействий) связанные последовательности, при этом сохраняется желательная(ые) функция(и) последовательности."Выделенным полипептидом" является полипептид, который фактически не содержит загрязняющих клеточных компонентов, таких как углевод, липид или другие белковоподобные примеси, связанные с полипептидом в природе. Типично препарат выделенного полипептида содержит полипептид в высоко очищенной форме, т.е. по меньшей мере около 80% чистоты, по меньшей мере около 90% чистоты, по меньшей мере около 95% чистоты, более 95% чистоты, например 96, 97 или 98%, или более чистоты, или более 99% чистоты. Одним из способов определения того, что конкретный белковый препарат содержит выделенный полипептид, является обнаружение одной полосы при электрофорезе в додецилсульфате натрия (SDS)-полиакриламидном геле белкового препарата и при окрашивании геля кумасси бриллиантовым голубым. Однако термин "выделенный" не предусматривает присутствие того же полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры, или альтернативно в гликозилированной или в дериватизированной формах."Иммуноглобулин" представляет собой сывороточный белок, который функционирует как антитело в организме позвоночных. У высших позвоночных идентифицировано пять классов белка "иммуноглобулина" или антитела (IgG, IgA, IgM, IgD и IgE). IgG представляет собой главный класс; он обычно существует как второй наиболее распространенный белок, обнаруженный в плазме. У людей IgG делится на четыре подкласса, обозначенных IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Константные области тяжелых цепей классаIgG обозначаются греческим символом . Например, иммуноглобулины подкласса IgG1 содержат константную область тяжелой цепи 1. Каждая тяжелая цепь иммуноглобулина обладает константной областью, которая состоит из доменов константной области белка (СН 1, шарнир, СН 2 и СН 3), которые по сути являются инвариантными для данного подкласса у видов. В уровне техники известны последовательности ДНК, кодирующие человеческие и отличные от человеческих иммуноглобулиновые цепи. См.,например, Ellison et al., DNA 1:11-18, 1981; Ellison et al., Nuc. Acids Res. 10:4071-4079, 1982; Kenten et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6661-6665, 1982; Seno et al., Nuc. Acids Res. 11:719-726, 1983; Riechmann etKindsvogel et al., DNA 1:335-343, 1982; Breiner et al., Gene 18:165-174, 1982; Kondo et al., Eur. J. Immunol. 23:245-249, 1993; andдоступа в GenBank J00228. Для обзора структуры и функции иммуноглобулина см. Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc., 49-140, 1987; и Padlan, Mol. Immunol. 31:169217, 1994."Иммуноглобулиновый шарнир" представляет собой часть тяжелой цепи иммуноглобулина, соединяющую вариабельные и СН 1 домены. В SEQ ID NO: 27 шарнир представляет собой приблизительно остатки 99-113 (Eu остатки 216-230, показанные на фиг. 1 А). Использованные в настоящем документе термины "Fc-фрагмент", "Fc-область" или "Fc-домен" являются синонимами и означают часть антитела, которая отвечает за связывание с рецепторами антитела на клетках и компонент C1q комплемента. Fc означает "фрагмент кристаллический ", фрагмент антитела,который будет легко формировать белковый кристалл. Отдельные фрагменты белка, которые первоначально были охарактеризованы с помощью протеолитического расщепления, могут определять полную общую структуру белка иммуноглобулина. Как первоначально определено в литературе, Fc-фрагмент состоит из дисульфидно связанных шарнирных областей тяжелой цепи, доменов СН 2 и СН 3. Однако в последнее время этот термин был применен к отдельной цепи, состоящей из СН 3, СН 2 и по меньшей мере части шарнира, достаточной для образования дисульфидно связанного димера со второй такой цепью. Использованный в настоящем документе термин Fc предусматривает варианты последовательностей природного происхождения. Используемый в настоящем документе термин "димеризирующий домен" относится к полипептиду,обладающему аффинностью ко второму полипептиду так, что эти два полипептида ассоциируются при физиологических условиях с формированием димера. Второй полипептид может быть тем же самым или другим полипептидом. Полипептиды могут взаимодействовать друг с другом путем ковалентной(ых) и/или нековалентной(ых) связи(ей). Примеры димеризирующих доменов включают в себя Fc-участок; шарнирный участок; СН 3-домен; СН 4-домен; СН 1- или CL-домен; домен лейциновой "молнии" (например, домен лейциновой "молнии" jun/fos, см., например, Kostelney et al., J. Immunol., 148:1547-1553, 1992; или домен лейциновой "молнии" дрожжей GCN4); домен изолейциновой "молнии"; димеризирующий участок димеризирующего рецептора клеточной поверхности (например, рецептора интерлейкина-8 (IL8R) или гетеродимер интегрина, такой как LFA-1 или GPIIIb/IIIa); димеризирующий участок секретируемого димеризирующего лиганда (например, фактора роста нервов (NGF), нейротропина-3 (NT-3),-6 022932 интерлейкина-8 (IL-8), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) или нейротрофического фактора головного мозга (BDNF); см., например., Arakawa et al., J. Biol. Chem. 269:27833-27839, 1994, и Radziejewski etal., Biochem. 32:1350, 1993) и полипептид, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина (например, от около одного, двух или трех до около десяти остатков цистеина) так, что может формироваться дисульфидная(ые) связь(и) между первым полипептидом и вторым полипептидом, содержащим по меньшей мере один остаток цистеина (в дальнейшем в настоящем документе именуемый "синтетическим шарниром"). Предпочтительным димеризирующим доменом в соответствии с настоящим изобретением является Fc-участок. Используемый в настоящем документе термин "линкер" или "полипептидный линкер" обозначает две или более аминокислоты, соединенные пептидной(ыми) связью(ями) и связывающие две дискретных отдельных полипептидных области. В типичном случае линкер конструируется так, чтобы дать возможность отдельным полипептидным областям выполнять их отдельные функции (такие как, например, ситуация, когда димеризирующий домен, связанный с другими полипептидными областями, ассоциируется еще с одним соответствующим доменом димеризации с формированием димера). Линкер может быть частью нативной последовательности, ее вариантом или синтетической последовательностью. Линкеры также упоминаются в настоящем документе под аббревиатурой "L". Нижний индекс (например, "1" или"2") с "L" используется в настоящем документе для обозначения различий между множественными линкерами в пределах одной полипептидной цепи, при этом линкеры могут быть одинаковыми или разными по своей аминокислотной последовательности. Термин "вариантный ген VSTM3" или "вариантный ген B7R1" относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид с аминокислотной последовательностью, которая является модификацией SEQ ID NO: 2. Такие варианты включают полиморфизмы природного происхождения геновVSTM3 (B7R1), а также синтетических генов, которые содержат замены консервативных аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Дополнительными вариантными формами геновVSTM3 являются молекулы нуклеиновых кислот, несущие вставки или делеции описанных в настоящем документе нуклеотидных последовательностей. Вариантный ген VSTM3 может быть идентифицирован,например, путем установления факта гибридизации гена с молекулой нуклеиновой кислоты, характеризующейся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, или комплементарной ей цепью в жестких условиях. Альтернативно, вариантный ген VSTM3 можно идентифицировать сравнением последовательностей. Две аминокислотные последовательности обладают "100% идентичностью аминокислотных последовательностей", если аминокислотные остатки данных двух аминокислотных последовательностей являются одними и теми же при выравнивании с максимальным соответствием. Подобным образом, две нукдеотидные последовательности обладают "100% идентичностью нуклеотидных последовательностей", если нуклеотидные остатки двух нуклеотидных последовательностей являются одними и теми же при выравнивании с максимальным соответствием. Сравнение последовательностей может быть выполнено с использованием стандартных компьютерных программ, таких как те, что включены в программный пакет для биоинформатики LASERGENE, который выпускается DNASTAR (Madison, Wisconsin). Другие способы сравнения двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей путем определения оптимального выравнивания остатков хорошо известны специалистам в данной области техникиHuman Genome Computing (2nd ed., Academic Press, Inc. 1998. Две нуклеотидные или аминокислотные последовательности считаются характеризующимися "существенно подобной идентичностью последовательностей" или "существенной идентичностью последовательностей", если две последовательности обладают по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей относительно друг другу. Конкретные способы определения идентичности последовательностей описаны ниже. Независимо от конкретного способа, используемого для идентификации вариантного гена VSTM3 или вариантного полипептида VSTM3, вариантный ген или полипептид, кодируемый вариантным геном,могут быть функционально охарактеризованы по способности специфично связываться с антителом против VSTM3. Вариантный ген VSTM3 или вариантный полипептид VSTM3 также может быть функционально охарактеризован по способности полипептида связываться с CD155 с помощью биологического или биохимического анализа, описанного в настоящем документе. Используемый в настоящем документе термин "аллельный вариант" означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. В природе аллельные вариации возникают в результате мутации и могут приводить к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть "молчащими" (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, характеризующиеся измененными аминокислотными последовательностями. Термин "аллельный вариант" используется в настоящем документе также для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена. Термин "ортолог" обозначает полипептид или белок, полученный от одного вида, который является функциональным аналогом полипептида или белка другого вида. Различия в последовательностях между ортологами являются результатом видообразования. Используемый в настоящем документе термин "опосредованное Т-клетками иммунное нарушение" относится к любому заболеванию или нарушению, которое характеризуется патологией, опосредованной, по меньшей мере частично, активностью Т-клеток. Опосредованные Т-клетками иммунные нарушения включают в себя, например, аутоиммунные заболевания (например, ревматоидный артрит, рассеянный склероз), реакцию трансплантата против хозяина (GVHD) и отторжение трансплантата. Кроме заболеваний, характеризуемых главным образом Т-клеточными иммунными ответами, опосредованные Тклетками иммунные нарушения далее включают, например, зависимые от Т-клеток опосредованные Вклетками признаки, такие как, например, опосредованный антителами аутоиммунитет. Такие заболевания или нарушения особенно поддаются способам лечения с использованием димерных белков VSTM3(B7R1) в соответствии с настоящим изобретением, как описано далее в настоящем документе. Термин "эффективное количество" в контексте лечения заболевания введением растворимого димерного белка субъекту, как описано в настоящем документе, относится к количеству такой молекулы,достаточному для ингибирования проявления или купирования одного или нескольких симптомов заболевания. Например, в конкретном контексте лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения введением растворимого димерного белка VSTM3 (B7R1) субъекту описанный в настоящем документе термин "эффективное количество" относится к количеству такой молекул, достаточному для модулирования опосредованного Т-клетками ответа у субъекта, с тем, чтобы ингибировать проявления или купировать один или несколько симптомов опосредованного Т-клетками иммунного нарушения. Эффективное количество средства вводится в соответствии со способами настоящего изобретения в "эффективном режиме." Термин "эффективный режим" относится к комбинации количества подлежащего введению средства и частоте применения, адекватным для завершения лечения или предупреждения заболевания. Вследствие неточности стандартных аналитических способов понятно, что молекулярные массы и длины полимеров имеют приблизительные значения. Если такое значение выражается как "около" X или"приблизительно" X, то указанное значение X следует понимать с точностью до 10%. Краткое описание чертежей На фиг. 1 А-1 В приведена аминокислотная последовательность части типичной тяжелой цепи иммуноглобулина 1 человека (SEQ ID NO: 27) (на основе Ellison et al., Nucl. Acids Res. 10:4071, 1982). Номера аминокислотных последовательностей основаны на индексе Eu (Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci.and Human Services, NIH, Bethesda, MD, 1991). Обозначены остатки Cys, обычно вовлеченные в дисульфидную связь с константной областью легкой цепи (LC) и константной областью тяжелой цепи (НС). Показаны границы доменов СН 1, шарнира, СН 2 и СН 3; на фиг. 2 А-2 С приведены аминокислотные последовательности определенных полипептидов Fc иммуноглобулина. Номера аминокислотных последовательностей основаны на индексе Eu (Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NTH, Bethesda, 1991). Иллюстрированные последовательности включают в себя человеческую последовательность дикого типа ("wt"; SEQ ID NO: 28) и пять вариантных последовательностей, обозначенных Fc-488(SEQ ID NO: 29), Fc4 (SEQ ID NO: 30), Fc5 (SEQ ID NO: 31), Fc6 (SEQ ID NO: 32) и Fc7 (SEQ ID NO: 33). Обозначены остатки Cys, обычно вовлеченные в дисульфидную связь с константной областью легкой цепи (LC) и константной областью тяжелой цепи (НС). "." означает идентичность дикому типу в этом положении.означает стоп-кодон; С-концевой остаток Lys был удален из Fc6. Показаны границы доменов шарнира, CH2 и CH3; на фиг 3A-3F проиллюстрировано ингибирование Т-клеток, индуцированное растворимыми белками B7R1 (VSTM3), как измерено с помощью пониженной пролиферативной активности in vitro. Инкубировали человеческие Т-клетки от трех доноров в присутствии антитела против CD3 и клетки Р 815, экспрессирующие PVR, либо в отсутствие, либо в присутствии растворимого B7R1 (VSTM3), как описано в примере 13. Три различных растворимых белка B7R1 тестировали по их способности ингибировать пролиферацию CD4+ (фиг. 3 А-3 С) или CD8+ (фиг. 3D-3F) Т-клеток. Тестировали три различных растворимых белка B7R1: конфигурации "восьмерка" Fc5 C69YB7r1 (G25-P141), тандемной конфигурации Fc5C69YB7r1(G25-P141) и B7r1-Fc5; на фиг. 4 проиллюстрировано снижение баллов экспериментального заболевания аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) при лечении конфигурацией "восьмерка" mB7R1. ЕАЕ устанавливали у мышей,как описано в примере 14 ниже. Мышей обрабатывали либо только средой (PBS), либо средой, содержащей конструкцию растворимой конфигурации "восьмерка" B7R1 (конфигурации "восьмерка" mB7Rl),конструкцию димерного мышиного Fc2 (mB7Rl-Fc2) или конструкцию VASP (mB7R1-VASP) (см. пример 14). Каждая точка представляет среднееSEM для n= 10-12 мышей на группу. Баллы заболевания для обработанной конфигурацией "восьмерка" B7R1 группы отличались от таковых для обработаннойPBS контрольной группы,р 0,05 при повторных измерениях ANOVA; на фиг. 5 проиллюстрировано снижение баллов заболевания артрита при лечении конфигурацией"восьмерка" mB7R1 и тандемной конфигурацией mB7R1. Индуцированный коллагеном артрит (CIA) устанавливали у мышей, как описано в примере 17 ниже. Мышей обрабатывали либо только средой(PBS), либо средой, содержащей растворимую конструкцию конфигурации "восьмерка" B7R1 (конфигурации "восьмерка" mB7R1), конструкцию тандемной конфигурации (тандемной конфигурации mB7Rl) или конструкцию VASP (mB7R1-VASP) (см. пример 17). Каждая точка представляет среднее SEM для n= 15 мышей на группу. Баллы заболевания (толщина лапы) для обработанных конфигурацией "восьмерка" B7R1 и тандемной конфигурацией B7R1 групп отличались от таковых для обработанной PBS контрольной группы,р 0,05 при двухфакторном ANOVA. Подробное описание изобретенияI. Обзор. Настоящее изобретение относится к композициям и способам, касающимся растворимых димерных слитых белков. Как правило, димерные слитые белки в соответствии с настоящим изобретением содержат первую и вторую полипептидные цепи, связанные через димеризирующий домен, причем каждая полипептидная цепь содержит первый и второй полипептидные сегменты, соответствующие цитокину или внеклеточному домену рецептора клеточной поверхности (также названные в настоящем документе"мономерами" или "мономерными доменами"). Поэтому димерные слитые белки, как правило, являются четырехвалентными по отношению к мономерным доменам. Первый и второй мономерные домены каждой полипептидной цепи могут быть одинаковыми или разными. Согласно определенным вариантам осуществления мономерные домены димерного слитого белка являются одинаковыми, представляя молекулу, которая является четырехвалентной по отношению к конкретному мономерному домену. Первый и второй мономерные домены могут быть расположены, соответственно, ближе к аминоконцу и ближе к карбоксиконцу по отношению к димеризирующему домену (что также называется в настоящем документе формой "конфигурации "восьмерка"). Альтернативно, первый и второй мономерные домены оба могут быть расположены в тандемной конфигурации, либо ближе по отношению к карбоксиконцу, либо ближе к аминоконцу по отношению к димеризирующему домену (что также называется в настоящем документе формой "тандемной конфигурации"). Согласно конкретным аспектам настоящее изобретение относится к композициям и способам, касающимся растворимых димерных слитых белков VSTM3 (B7R1), и к их применению для лечения опосредованных Т-клетками иммунных нарушений, особенно опосредованных Т-клетками аутоиммунных заболеваний. В соответствии с настоящим изобретением слитые молекулы димерных VSTM3 содержат первую и вторую полипептидные цепи, связанные через димеризирующий домен, причем каждая полипептидная цепь содержит первый и второй мономерные домены, соответствующие внеклеточному домену VSTM3. Поэтому слитые молекулы димерных VSTM3, как правило, являются четырехвалентными по отношению к сайтам связывания для противорецептора VSTM3, CD155. Первый и второй мономерные домены, соответствующие внеклеточному домену VSTM3, могут быть расположены либо в форме конфигурации "восьмерка", либо в форме тандемной конфигурации, как охарактеризовано выше. Как далее описано в настоящем документе, димерные слитые белки VSTM3 в соответствии с настоящим изобретением являются особенно эффективными для супрессии опосредованных Т-клетками реакций in vivo.II. Полипептидные слитые молекулы и димерные белки. Таким образом, согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к слитой молекуле растворимых полипептидов, характеризующейся, от аминоконца к карбоксильному концу, формулой, выбранной из P1-L1-D-L2-P2 и P2-L2-P1-L1-D, в которой Р 1 представляет собой (i) внеклеточный домен первого рецептора клеточной поверхности или его функциональный вариант или фрагмент, или (ii) первый цитокин или его функциональный вариант или фрагмент; L1 представляет собой первый полипептидный линкер; D представляет собой димеризирующий домен; L2 представляет собой второй полипептидный линкер; а Р 2 представляет собой (i) внеклеточный домен второго рецептора клеточной поверхности или его функциональный вариант или фрагмент, или (ii) второй цитокин или его функциональный вариант или фрагмент. Согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения Р 1 и Р 2 являются одинаковыми (или происходят от одного и того же рецептора клеточной поверхности или цитокина) так, что при гомодимеризации полипептидной слитой молекулы получается белок, который является тетрамерным по отношению к мономеру Р 1/Р 2. Согласно некоторым альтернативным вариантам осуществления Р 1 и Р 2 происходят от различных рецепторов клеточной поверхности и/или цитокинов так, что при гомодимеризации полипептидной слитой молекулы получается белок, который является димерным по отношению к двум различным мономерным доменам (Р 1 и Р 2). Например, согласно некоторым вариантам Р 1 соответствует внеклеточному домену первого рецептора клеточной поверхности, а Р 2 соответствует внеклеточному домену второго рецептора клеточной поверхности, который отличается от первого так, что гомодимеризация слитой молекулы дает белок, который является гомодимерным по отношению к двум различным рецепторам клеточной поверхности или их вариантам или фрагментам. Подобным образом, согласно другим вариантам Р 1 соответствует первому цитокину, а Р 2 соответствует второму цитокину, который отличается от первого так, что гомодимеризация слитой молекулы дает белок, который является гомодимерным по отношению к двум различным цитокинам или их вариантам или фрагментам. В следующих вариантах Р 1 соответствует внеклеточному домену рецептора клеточной поверхности, а Р 2 соответствует цитокину, или наоборот, так, что гомодимеризация слитой молекулы дает белок, который является гомодимерным по отношению и к рецептору клеточной поверхности, и к цитокину или к их вариантам или фрагментам. Согласно следующим вариантам осуществления Р 1 и Р 2 соответствуют внеклеточным доменам из двух различных субъединиц гетеродимерного рецептора клеточной поверхности или, альтернативно,двум различным субъединицам гетеродимерного цитокина. Согласно таким вариантам осуществления полипептидные линкеры L1 и L2 предназначены для обеспечения достаточного пространства и гибкости между мономерными доменами Р 1 и Р 2 в отдельной полипептидной слитой молекуле, что позволяет этим мономерным доменам связываться друг с другом нековалентно с образованием отдельной функциональной гетеродимерной единицы так, что гомодимеризация слитой молекулы дает белок, обладающий двумя такими функциональными гетеродимерными единицами. Примеры рецепторов клеточной поверхности, из которых могут происходить Р 1 и/или Р 2, включают в себя, например, 4-1 ВВ; рецептор АСТН; рецепторы активина; BLTR (рецептор лейкотриена В 4); рецептор BMP; рецептор С 3 а; рецептор С 5 а; CCR1; CCR2; CCR3; CCR4; CCR5; CCR6; CCR7; CCR8;A IL-20; рецептор В IL-20; рецептор IL-21; рецептор A IL-22; рецептор В IL-22; рецептор A IL-28; рецептор A IL-27; рецептор A IL-31; ВСМА; TACI; рецептор BAFF; рецептор иммунорегуляторного семафорина CD72; ассоциированный с саркомой Капоши GPCR вируса герпеса; рецептор липоксина А 4; рецептор лимфотоксина ; рецептор лизофосфолипидного фактора роста; нейрокинин 1; опиоидные рецепторы ,идля эндорфинов; рецептор онкостатина М; рецептор остеопонтина; остеопротегерин; Ох 40; рецепторы РАСАР и VDP; рецепторы PAF; поксивирус; гомологи рецепторов IFN/; гомологи рецепторов поксивирусного IFN; гомологи рецепторов поксивирусного IL-1; гомологи рецепторов, соединенных со связанным с мембраной белком G поксивируса; секретированные поксивирусом связывающие хемокин белки; гомологи рецепторов TNF поксивируса; рецептор пролактина; RANK; рецептор RON; рецептор SCF; рецепторы соматостатина; T1/ST2; рецепторы TGF-бета; рецепторы TNF (например, р 60 и р 80); TNFRSF19; рецептор ТРО; US28; XCR1; рецептор эритропоэтина; рецептор гормона роста; рецептор ингибирующего лейкоз фактора и рецептор C-kit. Примеры цитокинов, из которых могут происходить P1 и/или Р 2, включают в себя, например, MSH; 9E3/cCAF; АСТН; активин; AK155; ангиостатин; Apo2L/TRAIL; APRIL; BAFF (BLys); лигандBLR1/BCA-1/BLC/CXCL13; семейство BMP; BRAK; кодируемый геном кальцитонина пептид (CGRP); хемокин СС вируса контагиозного моллюска; CCL27; CCL28; CD100/Sema4D; лиганд CD27; лигандFlt-3; fMLP; фракталкин/СХ 3CL1; G-CSF; GCP-2/CXCL6; GM-CSF; гормон роста; HCC-1/CCL14; HCC4/CCL16; бокс группы белков с высокой подвижностью 1 (HMGB1); противомикробный пептид кателицидина человека LL-37; I-309/CCL1; лиганды IFN, IFN и IFN; IFN; IL-1; IL-1; IL-10; IL-11; IL-12;IL-5; IL-6; IL-7; IL-8/CXCL8; IL-9; IP-10/CXCL10; IL-19; IL-20; IL-21; IL-22; IL-23; IL-24; IL-26; IL-31; кератиноцитарный фактор роста; связанный с KSHV лиганд IL-6; лептин; лейкотактин 1/HCC-2/MIP16/CCL15; лейкотриен В 4; LIGHT; липоксин; лимфотактин/XCL1; лимфотоксини ; лизофосфолипидные факторы роста; хемокин макрофагового происхождения; стимулирующий макрофаг белок (MSP);MGSA/GRO/CXCL1, CXCL2, CXCL3; MIF; MIG/CXCL9; MIP-1/CCL3, MIP-1/CCL4; MIP-1/MRP2/CCF18/CCL9/10; Mu C10/CCL6; онкостатин М; остеопонтин; гомолог IL-10 парапоксвируса (орфвируса); PARC/DC-CCK1/AMAC-1/CCL18; PDGF-A; PDGF-B; PDGF-C; PDGF-D; фактор активации тромбоцитов; тромбоцитарный фактор 4/CXCL4; связанные с эпидермальным фактором роста факторы роста поксвируса; секретированные поксвирусом белки контроля комплемента; гомологи фактора роста эндотелия сосудов поксивруса (VEGF) орф-вируса; пролактин; лиганд RANK; RANTES/CCL5; S100A12;VEGF; VIP и РАСАР; а также варианты вирусного IL-10. Функциональные варианты или фрагменты конкретного внеклеточного домена рецептора клеточной поверхности могут быть легко идентифицированы с использованием рутинных биологических или биохимических анализов для оценивания способности варианта или фрагмента специфично связываться с когнатным лигандом или противорецептором рецептора клеточной поверхности. Подобным образом,функциональные варианты или фрагменты конкретного цитокина могут быть легко идентифицированы с использованием рутинных биологических или биохимических анализов для оценивания способности варианта или фрагмента специфично связываться с когнатным рецептором цитокина. Функциональные варианты конкретного эталонного полипептида (например, цитокина дикого типа или внеклеточного домена рецептора клеточной поверхности дикого типа, такого как, например, внеклеточный домен VSTM3 (B7R1, как правило, характеризуются как имеющие одну или несколько аминокислотных замен, делеций или добавлений относительно эталонного полипептида. Эти изменения предпочтительно являются незначительными, то есть консервативными аминокислотными заменами (см.,например, табл. 1 ниже, в которой приводятся некоторые типичные консервативные аминокислотные замены) и другими заменами, которые не существенно влияют на фолдинг или активность белка или полипептида; небольшими делециями, типично от одной до около 30 аминокислот; и небольшими аминоили карбоксиконцевыми удлинениями, такими как аминоконцевой метиониновый остаток, небольшим линкерным пептидом до около 20-25 остатков или небольшим удлинением, которое облегчает очистку(аффинной меткой), такой как полигистидиновый тракт, белок A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985;Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), глутатион-S-трансфераза (Smith and Johnson, Gene 67:31,1988) или другой антигенный эпитоп или связывающий домен (в основном см. Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991). ДНК, кодирующие аффинные метки, доступны от коммерческих поставщиков (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Таблица 1. Консервативные аминокислотные замены Важнейшие аминокислоты в полипептиде рецептора или цитокина можно идентифицировать, следуя известным в уровне техники процедурам, таким как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88:4498-4502, 1991). При последнем методе одиночные аланиновые мутации вводятся в каждый остаток в молекуле, а получившиеся в результате мутантные молекулы тестируются на биологическую активность (например, связывание лиганда и передача сигнала) с целью идентификации аминокислотных остатков, которые играют важную роль в активности молекулы. Сайты взаимодействия лиганда с рецептором также можно определить, анализируя кристаллическую структуру, определяемую такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография или фотоаффинное мечение (см., например, deLett. 309:59-64, 1992). Об идентичности незаменимых аминокислот также можно судить по данным анализа гомологий с родственными рецепторами или цитокинами. Можно осуществить множественные аминокислотные замены и протестировать их с использованием известных способов мутагенеза и скрининга, таких как раскрытые Reidhaar-Olson и Sauer, Science 241:53-57, 1988, или Bowie и Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989. Вкратце, эти авторы раскрывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбора функционального полипептида и последующего секвенирования мутированных полипептидов с целью определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, предусматривают фаговый дисплей (см., например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837,1991; Ladner et al., патент США 5223409; Huse, публикация WIPOWO 92/06204) и направленный на участок мутагенез (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988). Вариантные нуклеотидные и полипептидные последовательности могут также быть созданы путем перестановки в ДНК (см., например, Stemmer, Nature 370:389, 1994; Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747, 1994; международная публикацияWO 97/20078). Вкратце, вариантные молекулы ДНК создаются путем гомологичной рекомбинации in vitro с помощью случайной фрагментации исходной ДНК,после чего следует повторная сборка с использованием ПЦР, результатом чего являются случайно введенные точечные мутации. Этот метод можно модифицировать с использованием семейства исходных молекул ДНК, таких как аллельные варианты или молекулы ДНК от разных видов, с целью введения дополнительной вариабельности в этот процесс. Отбор или скрининг по желаемой активности, после которого следуют дополнительные повторения мутагенеза и анализа, обеспечивает быструю "эволюцию" последовательностей путем отбора желаемых мутаций при одновременном отборе против нежелательных изменений. Способы мутагенеза, раскрытые выше, можно комбинировать со способами скрининга с высокой пропускной способностью с целью определения активности клонированных мутированных рецепторов в клетках хозяина. Предпочтительные анализы в этом отношении предусматривают анализы пролиферации клеток и анализы связывания лигандов на основе биосенсоров, которые описаны ниже. Мутантные молекулы ДНК, которые кодируют активные варианты рецептора или цитокина, могут быть извлечены из клеток хозяина и быстро секвенированы с использованием современного оборудования. Эти способы дают возможность быстро определить важность отдельных аминокислотных остатков в представляющем интерес полипептиде и могут применяться к полипептидам с неизвестной структурой. Как обсуждалось ранее, полипептидная слитая молекула в соответствии с настоящим изобретением может содержать сегмент полипептида, соответствующий "функциональному фрагменту" конкретного цитокина или внеклеточному домену рецептора клеточной поверхности. Можно выполнить рутинные анализы делеций в молекулах нуклеиновых кислот с целью получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей данный цитокин или внеклеточный домен рецептора клеточной поверхности. В качестве иллюстрации кодирующие VSTM3 молекулы ДНК, характеризующиеся нуклеотидной последовательностью остатков 73-423 из SEQ ID NO: 1, могут быть расщеплены с помощью нуклеазы Bal31 с целью получения серии гнездовых делеций. Затем фрагменты вставляются в векторы экспрессии в подходящую рамку считывания, а экспрессируемые полипептиды выделяются и тестируются на способность связывать CD155 или CD112. Одной альтернативой расщеплению экзонуклеазой является применение направленного на олигонуклеотид мутагенеза с целью введения делеций или стоп-кодонов для специфичного продуцирования желаемого фрагмента. Альтернативно, конкретные фрагменты гена, кодирующего цитокин или рецептор, можно синтезировать с использованием полимеразной цепной реакции. Примером этого общего подхода служат исследования отсечения какого-либо или обоих концов интерферонов (см. Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507, 1995). Более того, стандартные методы для функционального анализа белков описаны, например, Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113,1993; Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5 А synthetase induced byet al., PlantMolec. Biol. 30:1, 1996. С использованием обсуждаемых выше способов рядовой специалист в данной области техники может приготовить ряд полипептидов, которые (i) в значительной степени идентичны эталонному пептиду,соответствующему растворимому цитокину или внеклеточному домену рецептора клеточной поверхности, и (ii) сохраняют функциональные связывающие свойства эталонного полипептида. Аналитические системы определения связывающих рецепторы или лиганды свойств полипептидов цитокинов или рецепторов, как правило, известны в уровне техники и легко адаптируются для применения в определении функциональных связывающих свойств слитой молекулы растворимых полипептидов формулы P1-L1-DL2-P2 и P2-L2-P1-L1-D, где Р 1 и/или Р 2 соответствует варианту цитокина или рецептора клеточной поверхности. Типичные анализы описаны далее в настоящем документе. Например, в предпочтительной аналитической системе используется коммерчески доступный биосенсорный прибор (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), в котором рецепторный полипептид иммобилизуется на поверхности рецепторного чипа. Использование такого прибора раскрыто Karlsson (J.Immunol. Methods 145:229-240, 1991), а также Cunningham и Wells (J. Mol. Biol. 234:554-563, 1993). При использовании в соответствии с настоящим изобретением слитая молекула растворимых полипептидов(например, слитая молекула растворимого полипептида VSTM3) в соответствии с настоящим изобретением ковалентно прикрепляется с использованием аминных или сульфгидрильных групп к декстрановым волокнам, которые прикрепляются к золотой пленке в проточной ячейке. Тестируемый образец пропускается через ячейку. Если лиганд (например, в случае слитой молекулы растворимого полипептидаVSTM3, растворимого CD155 или CD112) присутствует в образце, он будет связываться с иммобилизованной полипептидной слитой молекулой, вызывая изменение коэффициента преломления среды, который определяется как изменение поверхностного плазмонного резонанса золотой пленки. Эта система позволяет определить скорости ассоциации и диссоциации, по которым можно рассчитать аффинность связывания и оценить стехиометрию связывания. Слитые молекулы растворимых полипептидов могут также использоваться в других аналитических системах, известных в уровне техники. Такие системы предусматривают анализ Скэтчарда для определения аффинности связывания (см. Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949) и калориметрические анализы (см. Cunningham et al., Science 253:545-548, 1991; Cunningham et al., Science 254:821-825, 1991). Согласно определенным вариантам осуществления Р 1 и Р 2 происходят от внеклеточного домена рецептора клеточной поверхности VSTM3 (B7R1). Соответственно, согласно некоторым вариантам осу- 12022932 ществления слитая молекула растворимых полипептидов в соответствии с настоящим изобретением содержит от аминоконца до карбоксильного конца формулу, выбранную из P1-L1-D-L2-P2 и P2-L2-P1-L1D, в которой Р 1 представляет собой первый полипептид, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей с внеклеточным доменом полипептида VSTM3 или по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей с функциональным фрагментом внеклеточного доменаVSTM3; L1 представляет собой первый полипептидный линкер; D представляет собой димеризирующий домен; L2 представляет собой второй полипептидный линкер; и Р 2 представляет собой второй полипептид, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей с внеклеточным доменом полипептида VSTM3 или по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей с функциональным фрагментом внеклеточного домена VSTM3; в котором полипептидная слитая молекула способна специфично связываться с внеклеточным доменом полипептида CD155 (например, аминокислотные остатки 28-343 из SEQ ID NO: 22 или аминокислотные остатки 29-345 из SEQ ID NO: 24). Согласно определенным вариантам осуществления Р 1 и/или Р 2 обладают по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей с внеклеточным доменом полипептида VSTM3 или его функциональным фрагментом. Например, согласно некоторым вариантам Р 1 и/или Р 2 обладают 100% идентичностью последовательностей с внеклеточным доменом полипептида VSTM3 или его функциональным фрагментом. Р 1 и/или Р 2 могут происходить, например, от внеклеточного домена полипептидаVSTM3 человека или мыши (например, остатки 22-141 из SEQ ID NO: 2 или остатки 26-138 из SEQ IDNO: 4) или от его функционального фрагмента. Например, согласно определенным вариантам осуществления Р 1 и/или Р 2 обладают по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотными остатками 25-141 из SEQ ГО N0: 2; или Р 1 и/или Р 2 обладают по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотными остатками 26-138 из SEQ ID NO: 4. В некоторых таких вариантах один или оба Р 1 и Р 2 обладают 100% идентичностью с аминокислотными остатками 25-141 из SEQ ID NO: 2, или один или оба Р 1 и Р 2 обладают 100% идентичностью с аминокислотными остатками 26-138 из SEQ ID NO: 4. Согласно другим вариантам один или оба Р 1 и Р 2 содержат нецистеиновый остаток (например, тирозин) в аминокислотном положении, соответствующем остатку 69 из SEQ ID NO: 2. Особенно приемлемые полипептиды Р 1 и/или Р 2 характеризуются аминокислотной последовательностью, показанной в остатках 23-139 из SEQ ID NO: 18 (остатки 23-139 из SEQ ID NO: 20). Согласно другим вариантам осуществления Р 1 и/или Р 2 обладают по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотными остатками 23-139 из SEQID NO: 18 (остатки 23-139 из SEQ ID NO: 20). В некоторых таких вариантах Р 1 и/или Р 2 содержат нецистеиновый остаток в аминокислотном положении, соответствующем остатку 67 из SEQ ID NO: 18. Например, согласно определенным вариантам полипептид Р 1 и/или Р 2, характеризующиеся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотными остатками 23-139 из SEQ ID NO: 18, сохраняют тирозиновый остаток, соответствующий тирозину 67 из SEQID NO: 18. Процент идентичности последовательностей определяется общепринятыми способами. См., например, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603, 1986, а также Henikoff и Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1992. Например, можно выравнивать две аминокислотные последовательности с целью оптимизации оценок выравнивания с использованием штрафа за открытие гэпа, составляющего 10, штрафа за продолжение гэпа, составляющего 1, и матрицы замен "BLOSUM62" Хеникоффа и Хеникоффа выше, как показано в табл. 2 (аминокислоты обозначены стандартными однобуквенными кодами). Затем рассчитывали процент идентичности как: ([Общее число идентичных совпадений]/[длина более длинной последовательности плюс число делеций, введенных в более длинную последовательность для выравнивания этих двух последовательностей])(100). Специалистам в данной области техники очевиден тот факт, что существует множество установленных алгоритмов, пригодных для выравнивания двух аминокислотных последовательностей. Алгоритм поиска сходства Pearson и Lipman "FASTA" является подходящим способом выравнивания белков для исследования уровня идентичности между аминокислотной последовательностью, раскрытой в настоящем документе, и аминокислотной последовательностью ее предполагаемого варианта. АлгоритмEnzymol. 183:63, 1990. Вкратце, FASTA сначала характеризует сходство последовательностей посредством идентификации областей, общих для запрашиваемой последовательности (например, остатки 25-141 из SEQ ID NO: 2 или остатки 23-139 из SEQ ID NO: 18) и тестируемой последовательности, которые обладают либо высшей плотностью идентичностей (если переменная ktup равна 1), либо пары идентичностей (если ktup=2), без учета замен консервативных аминокислот, вставок или делеций. Затем десять областей с наивысшей плотностью идентичностей повторно оценивают сравнением сходства всех спаренных аминокислот с использованием матрицы аминокислотных замен, а концы областей "подравнивают" для включения только тех остатков, которые способствуют наивысшей оценке. Если имеется несколько областей с оценками большими, чем величина "отсечения" (рассчитанная по предварительно определенной формуле на основе данной последовательности и ее величины ktup), то приведенные в порядок подравниванием первоначальные области исследуют для определения, могут ли эти области быть соединены с получением приближенного выравнивания с гэпами. Наконец, области с наивысшей оценкой двух аминокислотных последовательностей выравнивают с использованием модификации алгоритма NeedlemanWunsch-Sellers (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787(1974, который обеспечивает вставки и делеций аминокислот. Типичными параметрами для анализаFASTA являются: ktup = 1, штраф за открывание гэпа = 10, штраф за удлинение гэпа = 1, и матрица замен = BLOSUM62. Эти параметры могут быть введены в программу FASTA модификацией файла оценочной матрицы ("SMATRIX"), как объясняется в приложении 2 Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). Программа FASTA может быть также использована для определения идентичности молекул нуклеиновых кислот с использованием раскрытого выше отношения. Для сравнений нуклеотидных последовательностей величина ktup может варьировать от одного до шести, предпочтительно от трех до шести,наиболее предпочтительно равняется трем, с другими установленными параметрами, как описано выше. Настоящее изобретение включает слитые молекулы растворимых полипептидов VSTM3, характеризующиеся консервативной заменой аминокислоты по сравнению с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 2, остатки 25-141, или из SEQ ID NO: 18, остатки 23-139 (SEQ ID NO: 20, остатки 23-139). Например, могут быть получены варианты VSTM3, которые содержат одну или несколько аминокислотных замен из SEQ ID NO: 2, остатки 25-141, или из SEQ ID NO: 18, остатки 23-139, в которых алкильная аминокислота заменена на алкильную аминокислоту в аминокислотной последовательностиVSTM3, ароматическая аминокислота заменена на ароматическую аминокислоту в аминокислотной последовательности VSTM3, содержащая серу аминокислота заменена на содержащую серу аминокислоту в аминокислотной последовательности VSTM3, содержащая гидроксигруппу аминокислота заменена на содержащую гидроксигруппу аминокислоту в аминокислотной последовательности VSTM3, кислая ами- 14022932 нокислота заменена на кислую аминокислоту в аминокислотной последовательности VSTM3, основная аминокислота заменена на основную аминокислоту в аминокислотной последовательности VSTM3, или двухосновная монокарбоновая кислота заменена на двухосновную монокарбоновую аминокислоту вVSTM3. Среди общих аминокислот "замена консервативной аминокислоты" иллюстрируется, например,заменой среди аминокислот внутри каждой из следующих групп: (1) глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин, (2) фенилаланин, тирозин и триптофан, (3) серин и треонин, (4) аспартат и глутамат, (5) глутамин и аспарагин, а также (6) лизин, аргинин и гистидин. Типичные группы консервативных аминокислотных изменений дополнительно показаны в табл. 1 выше. Таблица BLOSUM62 (см. табл. 2) представляет собой матрицу аминокислотных замен, полученную в результате приблизительно 2000 локальных множественных выравниваний сегментов последовательностей белков, представляющих высоко консервативные области свыше 500 групп родственных белковBLOSUM62 частоты замен могут быть использованы для определения замен консервативных аминокислот, которые могут быть введены в аминокислотные последовательности в соответствии с настоящим изобретением. Хотя можно спроектировать замены аминокислот, исходя исключительно из химических свойств (как описано выше), формулировка "консервативная замена аминокислоты" преимущественно относится к замене, представленной значением BLOSUM62 более -1. Например, замена аминокислоты является консервативной, если эта замена характеризуется значением BLOSUM62 0, 1, 2 или 3. В соответствии с этой системой предпочтительные консервативные замены аминокислот характеризуются значением BLOSUM62 по меньшей мере 1 (например, 1, 2 или 3), тогда как более предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются значением BLOSUM62 по меньшей мере 2 (например, 2 или 3). Конкретные варианты полипептидов цитокина или рецептора (например, VSTM3) характеризуются по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к соответствующей аминокислотной последовательности (например, к остаткам 25-141 из SEQ ID NO: 2 или остаткам 23-139 из SEQ ID NO: 18), в которой вариации аминокислотной последовательности обусловлены одной или несколькими заменами консервативных аминокислот. Различные домены димеризации пригодны для использования в соответствии с димерными слитыми белками, как описано в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления димеризирующий домен представляет собой константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, такую как Fc-участок. Fc-участок может быть Fc-участком с нативной последовательностью или вариантным Fc-участком. Согласно некоторым вариантам осуществления Fc-участок лишен одной или нескольких эффекторных функций (например, одной или обеих из эффекторных функций ADCC и CDC). Типичные Fc-участки с недостатком одной или нескольких эффекторных функций включают в себя, например, Fc-488, Fc4, Fc5, Fc6 и Fc7 (см. фиг. 2 А-2 С; SEQ ID NO: 29-33, соответственно, от аминокислотного остатка 16). Полипептидные линкеры для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть природного происхождения, синтетическими или комбинацией того и другого. Линкер соединяет две отдельных полипептидных области (например, димеризирующий домен и полипептид, соответствующий внеклеточному домену VSTM3 (B7R1, и сохраняет соединенные полипептидные области как отдельные и дискретные домены более длинного полипептида. Линкер может обеспечивать совместное действие отдельных дискретных доменов с сохранением при этом их индивидуальных свойств (например, в случае димеризирующего домена Fc-участка, соединенного с полипептидом, соответствующим внеклеточному домену VSTM3, связывание Fc-рецептора (например, FcRn) может быть сохранено для Fcучастка, в то время как CD155-связующие свойства внеклеточного домена VSTM3 будут сохранены). В уровне техники хорошо известно применение пептидных линкеров природного происхождения, а также искусственных пептидных линкеров для соединения полипептидов в новые соединенные слитые полипептиды (см., например, Hallewell et al., J. Biol. Chem. 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8,725-731, 1995; Robinson and Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; Khandekar et al., J. Biol. Chem. 272,32190-32197, 1997; Fares et al., Endocrinology 139, 2459-2464, 1998; Smallshaw et al., Protein Eng. 12, 623630, 1999; патент США 5856456). В типичном случае остатки в линкерном полипептиде выбираются так, чтобы обеспечить в целом гидрофильный характер, а также неиммуногенность и гибкость. Использованный в настоящем документе"гибкий" линкер представляет собой линкер, у которого в растворе по сути отсутствует стабильная конформация высшего порядка, хотя допускается наличие областей с локальной стабильностью. В целом,предпочтительными являются малые и полярные гидрофильные остатки, а крупные и гидрофобные остатки нежелательны. Следует избегать зон с локальным зарядом, если линкерный полипептид содержит заряженные остатки, обычно они будут расположены так, что будет обеспечиваться суммарный нейтральный заряд в небольшой области полипептида. Поэтому предпочтительно размещать заряженный остаток по соседству с остатком с противоположным зарядом. В целом предпочтительными остатками для включения в линкерный полипептид являются Gly, Ser, Ala, Thr, Asn и Gln; более предпочтительными остатками являются Gly, Ser, Ala и Thr; а наиболее предпочтительными остатками являются Gly и Ser. В целом, остатков Phe, Tyr, Trp, Pro, Leu, Ile, Lys и Arg следует избегать (если они не расположены в области иммуноглобулинового шарнира линкера), остатков Pro вследствие их гидрофобности и недостаточной гибкости, а также остатков Lys и Arg вследствие их потенциальной иммуногенности. Остатки Cys будут включены, как раскрыто в настоящем документе, с тем, чтобы обеспечить образование дисульфидных связей. Последовательность линкера также будет конструироваться таким образом, чтобы избежать нежелательного протеолиза. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептидный линкер L1 содержит или состоит из от 15 до 32 аминокислотных остатков, из которых от 1 до 8 указанных остатков являются цистеиновыми остатками. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения каждый линкер содержит точно два цистеиновых остатка. Линкер конструируется так, чтобы обеспечить достаточное пространство и гибкость между димеризирующим доменом и полипептидом Р 1 (например, полипептидом Р 1, соответствующим внеклеточному домену VSTM3) с тем, чтобы дать возможность доменам выполнять их предназначенные функции в полипептиде. Длина и композиция линкера выбираются так, чтобы обеспечить желаемые пространство и степень гибкости, но при этом также обеспечить образование одной или нескольких межцепочечных дисульфидных связей для стабилизации желаемой конформации. Согласно конкретным вариантам L1 представляет собой шарнирную область иммуноглобулина или фрагмент или вариант шарнирной области иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения N-концевой цистеиновый остаток (Eu остаток 220; остаток 103 из SEQ ID NO: 27), который в собранном нативном антителе образует дисульфидную связь с легкой цепью иммуноглобулина, в шарнире пропущен и либо заменен другим аминокислотным остатком (например, Ser), либо делетирован или отсечен. Также могут производиться и другие изменения в шарнирной последовательности. Например, остаток Lys (Eu 218; остаток 101 из SEQ ID NO: 27) может быть заменен на Arg. Полипептидный линкер может, таким образом, содержать шарнирную область иммуноглобулина или ее фрагмент или вариант, которая содержит по меньшей мере два цистеиновых остатка, образующих дисульфидные связи с полипептидным линкером другой цепи. Шарнирную область иммуноглобулина можно получить из тяжелой цепи любого иммуноглобулина. Шарнирные области гамма-иммуноглобулинов(IgG), такие как шарнир 1, хорошо охарактеризованы, и их удобно использовать в соответствии с настоящим изобретением. Типичные полипептидные линкеры L2 содержат множество глициновых остатков. Например, согласно некоторым вариантам осуществления полипептидный линкер L2 содержит множество остатков глицина и необязательно по меньшей мере один остаток серина. Согласно конкретным вариантам полипептида, характеризующегося формулой P1-L1-D-L2-P2, L2 характеризуется формулой Gly-Gly-Gly-SerGly (SEQ ID NO: 21). Согласно конкретным вариантам полипептида, характеризующегося формулой P2L2-P1-L1-D, полипептидный линкер L2 характеризуется формулой [Gly-Gly-Gly-Ser]n (SEQ ID NO: 22), в которой n является целым числом от 3 до 5. В конкретной вариации линкера L2, характеризующегося формулой [Gly-Gly-Gly-Ser]n, n = 4. Сегменты полипептидов, используемые в соответствии с настоящим изобретением (например, сегменты полипептида, соответствующие внеклеточному домену VSTM3, линкеры, содержащие шарнирную область иммуноглобулина, и димеризирующие домены, такие как Fc-фрагменты), могут быть получены из ряда видов. Если димерный белок предполагается использовать в терапевтических целях на людях, предпочтительно использовать полипептидные последовательности человека. Однако можно использовать отличные от человеческих последовательности, а также вариантные последовательности. Для прочих целей, в том числе для диагностики in vitro и для применения в ветеринарии, можно использовать полипептидные последовательности человека или отличных от человека животных, хотя последовательности от того же вида, к которому относится пациент, могут оказаться предпочтительными для использования в ветеринарии in vivo или при применении in vitro в тех ситуациях, когда имеет место видоспецифичность межмолекулярных реакций. Таким образом, полипептидные сегменты для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть без ограничения полипептидами человека, отличного от человека примата, представителя грызунов, собачьих, кошачьих, лошадей, крупного рогатого скота,овец, свиней, зайцеобразных и птиц, а также их вариантами. Согласно конкретным вариантам осуществления полипептидной слитой молекулы, характеризующейся формулой P1-L1-D-L2-P2, и в котором каждый из Р 1 и Р 2 происходят от внеклеточного доменаVSTM3 (B7R1), полипептидная слитая молекула содержит аминокислотную последовательность, показанную в остатках 23-493 или 1-493 из SEQ ID NO: 18; остатках 22-498 или 1-498 из SEQ ID NO: 6; остатках 26-489 или 1-489 из SEQ ID NO: 10, остатках 36-506 или 1-506 из SEQ ID NO: 14, остатках 36-506 или 1-506 из SEQ ID NO: 16 или остатках 23-493 или 1-493 из SEQ ID NO: 18. Согласно конкретным вариантам осуществления полипептидной слитой молекулы, характеризующейся формулой P2-L2-P1-L1-D, и в котором каждый из Р 1 и Р 2 происходят от внеклеточного домена VSTM3, полипептидная слитая молекула содержит аминокислотную последовательность, показанную в остатках 23-508, 23-507, 1-508 или 1-507 из SEQ IDNO: 20; остатках 22-513, 22-512, 1-513 или 1-512 из SEQ ID NO: 8; остатках 26-504, 26-503, 1-504 или 1-503 из SEQ ID NO: 12; или остатках 23-508, 23-507, 1-508 или 1-507 из SEQ ID NO: 20. Настоящее изобретение также относится к димерным белкам, содержащим первое и второе поли- 16022932 пептидные слитые молекулы, описанные выше. Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к димерному белку, содержащему первую полипептидную слитую молекулу и вторую полипептидную слитую молекулу, причем каждое из первого и второго полипептидных слитых молекул содержит от аминоконца к карбоксильному концу P1-L1-D1-L2-P2 или P2-L2-P1-L1-D, описанные в настоящем документе. Например, согласно конкретным вариантам осуществления димерный белокVSTM3 (B7R1) в соответствии с настоящим изобретением содержит первую полипептидную слитую молекулу и вторую полипептидную слитую молекулу, причем каждое из первого и второго полипептидных слитых молекул содержит от аминоконца к карбоксильному концу P1-L1-D1-L2-P2, причем каждый из Р 1 и Р 2 происходит от внеклеточного домена VSTM3, и причем димерный белок характеризуется способностью специфичного связывания с внеклеточным доменом CD155 (например, аминокислотными остатками 28-343 из SEQ ID NO: 22). Согласно другим вариантам осуществления димерный белокVSTM3 в соответствии с настоящим изобретением содержит первую полипептидную слитую молекулу и вторую полипептидную слитую молекулу, причем каждое из первого и второго полипептидных слитых молекул содержит от аминоконца к карбоксильному концу P2-L2-P1-L1-D, причем каждый из Р 1 и Р 2 происходит от внеклеточного домена VSTM3, и димерный белок характеризуется способностью специфичного связывания с внеклеточным доменом CD155.III. Материалы и способы получения полипептидных слитых молекул и димерных белков. Настоящее изобретение также относится к молекулам полинуклеотидов, в том числе к молекулам ДНК и РНК, которые кодируют раскрытые выше слитые полипептиды. Полинуклеотиды в соответствии с настоящим изобретением включают в себя и одноцепочечные, и двухцепочечные молекулы. Полинуклеотиды, кодирующие различные сегменты полипептидной слитой молекулы (например, димеризирующий домен, такой как Fc-фрагмент; полипептидные сегменты Р 1 и Р 2) можно получить и соединить вместе с образованием полинуклеотида, кодирующего полипептидную слитую молекулу, как описано в настоящем документе, с использованием известных способов рекомбинационных манипуляций с нуклеиновыми кислотами. Последовательности ДНК, кодирующие цитокины и рецепторы клеточной поверхности (например,VSTM3 (B7R1, в том числе полипептидные сегменты, соответствующие внеклеточным доменам таких рецепторов, известны в данной области техники. Также известны последовательности ДНК, кодирующие различные димеризирующие домены (например, константные области тяжелых цепей иммуноглобулинов, такие как Fc-фрагменты). Дополнительные последовательности ДНК, кодирующие цитокин, рецептор клеточной поверхности и полипептиды димеризирующих доменов могут быть легко образованы обычными специалистами в данной области техники, исходя из генетического кода. Соответствующие последовательности РНК могут быть получены посредством замены U на Т. Специалисты в данной области техники безусловно признают, что ввиду вырожденность генетического кода возможна значительная варианта последовательностей между полинуклеотидными молекулами, кодирующими данный полипептид. ДНК и РНК, кодирующие функциональные варианты и фрагменты таких полипептидов, также можно получить с использованием известных рекомбинационных способов для введения вариации в полинуклеотидную последовательность с последующей экспрессией кодированного полипептида и определением функциональной активности (например, связывания с когнатным рецептором или лигандом) с использованием соответствующего анализа для скрининга. Способы получения ДНК и РНК хорошо известны в уровне техники. Например, клонов комплементарной ДНК (cDNA) можно получить из РНК, которая выделяется из ткани или клетки, продуцирующей большие количества РНК, кодирующей представляющий интерес полипептид. Общую РНК можно получить путем экстрации с помощью гуанидина HCl с последующим выделением центрифугированием в градиенте CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). Поли(А)+ РНК получают из общей РНК способом Aviv и Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972). Комплементарную ДНК получают из поли(А)+ РНК с использованием известных способов. В качестве альтернативы можно выделять геномную ДНК. Для некоторых целей (например, экспрессия в трансгенных животных) использование геномного клона или модификация клона cDNA так, чтобы он содержал по меньшей мере один геномный интрон, может давать преимущества. Способы идентификации и выделения cDNA и геномных клонов хорошо известны, находятся в пределах квалификации рядового специалиста в данной области техники и предусматривают использование раскрытых в настоящем документе последовательностей или их частей для исследования или заполнения библиотеки. Полинуклеотиды, кодирующие представляющие интерес полипептиды, идентифицируются и выделяются, например, гибридизацией или полимеразной цепной реакцией ("ПНР", Mullis, патент США 4683202). Библиотеки экспрессии можно исследовать с помощью антител против представляющего интерес полипептида, фрагментов рецептора или других специфичных связывающихся партнеров. Полинуклеотиды в соответствии с настоящим изобретением также можно получить с помощью автоматизированного синтеза. Производство коротких двухцепочечных сегментов (от 60 до 80 п.н.) технически не сложное и может быть выполнено посредством синтеза комплементарных нитей и их последующего отжига. Более длинные сегменты (как правило, 300 п.н.) собираются в модульной форме из одноцепочечных фрагментов длиной от 20 до 100 нуклеотидов. Автоматизированный синтез полинук- 17022932 леотидов находится в пределах квалификации рядового специалиста в данной области техники, а подходящее оборудование и реактивы доступны от коммерческих поставщиков. См. в основном Glick andUSA 87:633-637, 1990. Согласно другому аспекту предоставлены материалы и способы получения полипептидных слитых молекул в соответствии с настоящим изобретением, в том числе димерных белков, содержащих полипептидные слитые молекулы. Полипептидные слитые молекулы могут продуцироваться в рекомбинантных клетках-хозяевах в соответствии с общепринятыми методами. Подходящие клетки-хозяева представляют собой клетки таких типов, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной ДНК и выращены в культуре, они предусматривают бактерии, клетки грибов и культивируемые клетки высших эукариот (в том числе культивируемые клетки многоклеточных организмов), в частности,культивируемые клетки млекопитающих. Методы для манипуляций с клонированными молекулами ДНК и для введения экзогенной ДНК в ряд клеток-хозяев раскрыты Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, а также Ausubelet al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green and Wiley and Sons, NY, 1993. В целом, последовательность ДНК, кодирующая полипептидную слитую молекулу, функционально связана с другими генетическими элементами, необходимыми для ее экспрессии, обычно включающими в себя промотор и терминатор транскрипции, в векторе экспрессии. Вектор в типичном случае будет содержать один или несколько селектируемых маркеров и один или несколько точек начала репликации,хотя специалиста в данной области техники будет понятно, что в определенных системах селектируемые маркеры могут быть обеспечены в отдельных векторах, и репликация экзогенной ДНК может быть обеспечена интеграцией в геном клетки-хозяина. Отбор промоторов, терминаторов, селектируемых маркеров,векторов и других элементов является вопросом рутинного конструирования, находящимся в пределах квалификации рядового специалиста в данной области техники. Многие такие элементы описаны в литературе и доступны от коммерческих поставщиков. С целью направления полипептидной слитой молекулы по секреторному пути клетки-хозяина в векторе экспрессии обеспечивается секреторная сигнальная последовательность. Секреторная сигнальная последовательность может происходить от нативного неиммуноглобулинового полипептида или от другого секретеруемого белка (например, t-PA; см. патент США 5641655) или синтезирована de novo. В месте соединения между секреторным пептидом и оставшейся частью полипептидной слитой молекулы может быть добавлен сконструированный сайт расщепления с целью оптимизации протеолитического процессирования в клетке-хозяине. Секреторная сигнальная последовательность функционально связана с последовательностью ДНК, кодирующей полипептидную слитую молекулу, т.е. две последовательности соединены в корректную рамку считывания и расположены таким образом, чтобы направлять вновь синтезированную полипептидную слитую молекулу по секреторному пути клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно располагаются на 5'-конце по отношению к последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя определенные сигнальные последовательности могут быть расположены по-другому в представляющей интерес последовательности ДНК (см., например, Welch et al., патент США 5037743; Holland et al., патент США 5143830). Секреторные сигнальные последовательности, пригодные для применения в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя, например, полинуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки 1-35 изSEQ ID NO: 14 или аминокислотные остатки 1-22 из SEQ ID NO: 18. Ожидается, что экспрессия полипептидных слитых молекул в секреторном пути клетки-хозяина приведет к продуцированию димерных белков. Соответственно, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к димерным белкам, содержащим первую и вторую полипептидные слитые молекулы, как описано выше (например, к димерному белку, содержащему первая и вторая полипептидные слитые молекулы, в которых каждая из первой и второй полипептидных слитых молекул содержит, от аминоконца до карбоксильного конца, P1-L1-D1-L2-P2, или в которых каждая из первой и второй полипептидных слитых молекул содержит, от аминоконца до карбоксильного конца, P2-L2-P1-L1-D, и в которых димерный белок характеризуется способностью специфично связываться с внеклеточным доменом CD155 (например, аминокислотные остатки 28-343 из SEQ ID NO: 22. Димеры также могут собираться от vitro при инкубации компонентных полипептидов в приемлемых условиях. В целом, сборка invitro будет предполагать инкубацию белковой смеси при денатурирующих и восстанавливающих условиях с последующим рефолдингом и повторным окислением полипептидов с образованием димеров. Извлечение и сборка белков, экспрессируемых в бактериальных клетках, раскрыты ниже. Культивируемые клетки млекопитающих являются подходящими хозяевами для применения в соответствии с настоящим изобретением. Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева млекопитающих предусматривают опосредованную фосфатом кальция трансфекцию (Wigler et al., Cell 14:725,1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456,1973), электропорацию (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию (Ausubel et al. выше) и опосредованную липосомами трансфекцию (Hawley-Nelson et al.,- 18022932Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). Продуцирование рекомбинантных полипептидов в культивируемых клетках млекопитающих раскрыто, например, Levinson et al., патент США 4713339;Hagen et al., патент США 4784950; Palmiter et al., патент США 4579821; а также Ringold, патент США 4656134. Подходящими культивируемыми клетками млекопитающих являются клеточные линии COS-1 ( доступа в АТСС CRL 1650), COS-7 ( доступа в АТСС CRL 1651), BHK ( доступа в АТСС CRL 1632), BHK 570 ( доступа в АТСС CRL 10314), 293 ( доступа в АТСС CRL 1573; Grahamet al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), а также линии клеток яичники китайского хомячка (например, СНОK1,доступа в АТСС CCL 61; СНО-DG44, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980). В уровне техники известны и доступны из национальных хранилищ, таких как Американская коллекция типовых культур, Manassas, Virginia, дополнительные подходящие клеточные линии. Могут быть использованы сильные промоторы транскрипции, такие как промоторы из SV-40, цитомегаловируса или вируса миелопролиферативной саркомы. См., например, патент США 4956288 и заявку на выдачу патента США 20030103986. Другими подходящими промоторами являются промоторы из генов металлотионеинов (патенты США 4579821 и 4601978) и основной поздний промотор аденовируса. Векторы экспрессии для использования в клетках млекопитающих включают в себя pZP-1, pZP-9 и pZMP21,которые были депонированы в Американской коллекции типовых культур, 10801, University Blvd., Manassas, VA, USA под инвентарными номерами 98669, 98668 и РТА-5266, соответственно, а также производные этих векторов. Для отбора культивируемых клеток млекопитающих, в которых была встроена чужеродная ДНК,обычно используется селекция с применением лекарственных препаратов. Такие клетки обычно называются "трансфектантами". Клетки, которые культивировались в присутствии селектирующего средства и способные передавать представляющий интерес ген, своим потомкам, называются "стабильными трансфектантами". Типичным селективным маркером является ген, кодирующий устойчивость к антибиотику неомицину. Отбор проводится в присутствии лекарственного средства неомицинового типа, такого какG-418 или подобного ему. Также могут использоваться селекционные системы для повышения уровня экспрессии представляющего интерес гена, процесса, называемого "амплификацией". Амплификация выполняется посредством культивирования трансфектантов при низком содержании селектирующего средства с последующим увеличением количества селектирующего средства с целью отбора клеток, которые продуцируют самые высокие уровни продуктов введенных генов. Типичным амплифицируемым селективным маркером является дигидрофолатредуктаза, которая обеспечивает устойчивость к метотрексату. Также могут быть использованы другие гены устойчивости к лекарственным средствам (например, устойчивости к гигромицину, устойчивости к нескольким лекарственным средствам, пуромицинацетилтрансферазы). Маркеры клеточной поверхности и другие фенотипические селективные маркеры могут быть использованы с целью облегчения идентификации трансфицированных клеток (например, с помощью сортинга клеток с активацией флуоресценции), и они включают, например, CD8, CD4, рецептор фактора роста нервов, зеленый флуоресцентный белок и т.п. В качестве хозяев могут быть также использованы клетки других высших эукариот, в том числе клетки насекомых, растений и птиц. Применение Agrobacterium rhizogenes в качестве вектора для экспрессии генов в клетках растений было рассмотрено Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. Трансформация клеток насекомых и продуцирование чужеродных полипептидов в них раскрыта Guarinoet al., патент США 5162222 и публикация WIPO WO 94/06463. Клетки насекомых можно инфицировать рекомбинантным бакуловирусом, как правило, ведущим происхождение от вируса ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). См. King and Possee, TheExpression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press., New York, 1994; а также Richardson,Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ, 1995. Рекомбинантные бакуловирусы также можно получить путем применения системы на основе транспозона,описанной Luckow et al. (J. Virol. 67:4566-4579, 1993). Такая система, в которой используются векторы переноса, коммерчески доступна в виде набора (набора ВАС-ТО-ВАС; Life Technologies, Gaithersburg,MD). Вектор переноса (например, PFASTBAC1; Life Technologies) содержит транспозон Tn7 для перемещения ДНК, кодирующей представляющий интерес белок, в геном бакуловируса, поддерживающийся в Е.coli в виде большой плазмиды, называемой "бакмидой." См. Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; и Chazenbalk and Rapoport, J. Biol.Chem. 270:1543-1549, 1995. С использованием известных в уровне техники методов вектор переноса,кодирующий полипептидную слитую молекулу, трансформируется в клетки-хозяева Е.coli, и эти клетки подвергаются скринингу на предмет наличия бакмид, содержащих прерванный ген lacZ, указывающий на рекомбинантный бакуловирус. Бакмидная ДНК, содержащая геном рекомбинантного бакуловируса,выделяется с использованием стандартных методов и используется для трансфекции клеток Spodopterafrugiperda, таких как клетки Sf9. После этого продуцируется рекомбинантный вирус, который экспрессирует полипептидную слитую молекулу. Штаммы рекомбинантных вирусов создаются способами, как правило, используемыми в уровне техники. Для продуцирования белков используется рекомбинантный вирус с целью инфицирования клеток- 19022932 хозяев, в типичном случае клеточной линии, ведущей происхождение от совки травяной Spodoptera frugiperda (например, клеток Sf9 или Sf21) или Trichoplusia ni (например, клеток HIGH FIVE; Invitrogen,Carlsbad, CA). В целом, см. Glick и Pasternak выше. См. также патент США 5300435. Для выращивания и поддержания клеток используются не содержащие сыворотки крови среды. Подходящие составы сред известны в уровне техники и могут быть получены от коммерческих поставщиков. Клетки выращиваются при плотности инокуляции от приблизительно 2-5105 клеток до плотности 1-2106 клеток, при этом вносится штамм рекомбинантного вируса с множественностью заражения (MOI) от 0,1 до 10, чаще всего около 3. Используемые процедуры обычно описаны в доступных лабораторных справочниках (например, King и Possee выше; O'Reilly et al. выше; Richardson выше). Клетки грибов, в том числе клетки дрожжей, также могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Видами дрожжей, представляющими особый интерес в этом отношении, являются Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Pichia methanolica. Способы трансформации клеток S. cerevisiae экзогенной ДНК и получения рекомбинантных полипептидов из них раскрыты, например, Kawasaki, патент США 4599311; Kawasaki et al., патент США 4931373; Brake, патент США 4870008;Welch et al., патент США 5037743; и Murray et al., патент США 4845075. Трансформированные клетки отбираются по фенотипу, определяемому с помощью селективного маркера, как правило, устойчивости к лекарственному средству или способности расти в отсутствии определенного питательного вещества (например, лейцина). Типичной векторной системой для использования в Saccharomyces cerevisiae является векторная система РОТ 1, раскрытая Kawasaki et al. (патент США 4931373), которая обеспечивает рост подлежащих отбору трансформированных клеток в содержащих глюкозу средах. Подходящие промоторы и терминаторы для использования в дрожжах включают в себя промоторы и терминаторы генов гликолитических ферментов (см., например, Kawasaki, патент США 4599311; Kingsmanet al., патент США 4615974; и Bitter, патент США 4977092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США 4990446; 5063154; 5139936 и 4661454. В уровне технике известны системы трансформации для других дрожжей, в том числе Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe,Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, PichiaCregg, патент США 4882279; а также Raymond et al., Yeast 14:11-23, 1998. Могут быть использованы клетки Aspergillus в соответствии со способами McKnight et al., патент США 4935349. Способы трансформации Acremonium chrysogenum раскрыты Sumino et al., патент США 5162228. Способы трансформации Neurospora раскрыты Lambowitz, патент США 4486533. Продуцирование рекомбинантных белков в Pichia methanolica раскрыто в патентах США 5716808; 5736383; 5854039 и 5888768. Прокариотические клетки-хозяева, в том числе штаммы бактерий Escherichia coli, Bacillus и других родов, также являются применимыми клетками-хозяевами в соответствии с настоящим изобретением. Методы для трансформации таких хозяев и экспрессии чужеродных последовательностей ДНК, клонированных в них, хорошо известны в уровне техники (см., например, Sambrook et al. выше). При экспрессии полипептидной слитой молекулы в бактериях, таких как Е.coli, полипептид может оставаться в цитоплазме, обычно в виде нерастворимых гранул, или может направляться в периплазматическое пространство с помощью бактериальной секреторной последовательности. В первом случае клетки лизируются, а гранулы извлекаются и денатурируются с использованием, например, гуанидина HCl или мочевины. Затем денатурированный полипептид может быть свернут заново и димеризован при разбавлении денатурирующим средством, например, путем диализа против раствора мочевины и сочетания восстановленного и окисленного глутатиона с последующим диализом против забуференного солевого раствора. В альтернативном случае белок может извлекаться из цитоплазмы в растворимой форме и выделяться без применения денатурирующих средств. Белок извлекается из клетки в виде водного экстракта, например в фосфатном забуференном солевом растворе. Для захвата представляющего интерес белка экстракт вносится непосредственно в хроматографическую среду, такую как иммобилизованное антитело, или на гепарин-сефарозную колонку. Секретируемые полипептиды могут быть извлечены из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения клеток (например, ультразвуком или осмотическим шоком) и извлечения белка, вследствие чего отпадает необходимость в денатурации и рефолдинге. См., например, Lu et ai, J. Immunol. Meth. 267:213-226, 2002. Трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева культивируются в соответствии с общепринятыми процедурами в культуральной среде, содержащей питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. В уровне техники области известен ряд подходящих сред, в том числе установленных сред и составных сред, которые, как правило, содержат источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минералы. При необходимости среды также могут содержать такие компоненты, как ростовые факторы или сыворотка крови. Как правило, ростовая среда будет отбирать клетки, содержащие экзогенную ДНК, например, посредством отбора лекарственным средством или дефицитом незаменимого питательного вещества, которое восполняется селективным маркером, находящимся в векторе экспрессии или котрансфицированным в клеткухозяина. Белки в соответствии с настоящим изобретением очищаются с помощью стандартных способов очистки белка, как правило, с помощью комбинации хроматографических методов. См., в целом, AffinityChromatography: PrinciplesMethods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988; и Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994. Белки, содержащие полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина, могут быть очищены аффинной хроматографией на иммобилизованном белке А. Могут быть использованы дополнительные стадии очистки, такие как гель-фильтрация,для получения желаемого уровня чистоты или для обеспечения обессоливания, замены буфера и т.п. Например, для получения полипептидных слитых молекул и димерных белков в соответствии с настоящим изобретением, полученных из рекомбинантных клеток-хозяев, могут быть использованы фракционирование и/или стандартные способы очистки. В целом, для фракционирования образцов можно использовать преципитацию сульфатом аммония и кислотную или хаотропную экстракцию. Примеры стадий очистки могут включать в себя гироксиапатитную эксклюзионную FPLC и обращенно-фазную высокоэффективную жидкостную хроматографию. Подходящие хроматографические среды содержат производные декстранов, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные оксиды кремния и т.п. Приемлемыми являются производные PEI, DEAE, QAE и Q. Типичными хроматографическими средами являются среды, дериватизированные фенильной, бутильной или октальной группами, такие как фенилсефароза FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), октил-сефароза(Pharmacia) и т.п., или полиакриловые смолы, такие как Amberchrom CG 71 (Toso Haas) и т.п. Подходящие твердые подложки включают в себя стеклянные гранулы, смолы на основе оксида кремния, целлюлозные смолы, агарозные гранулы, сшитые агарозные гранулы, полистирольные гранулы, сшитые полиакриламидные смолы и т.п., которые нерастворимы при условиях их предназначенного применения. Эти подложки можно модифицировать химически активными группами, которые обеспечивают присоединение белков через аминогруппы, карбоксильные группы, сульфгидрильные группы, гидроксильные группы и/или углеводные части. Примеры химических реакций соединения предусматривают активацию бромистым цианом, активацию N-гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, активацию сульфгидрилом, активацию гидразидом, а также производными, содержащими карбоксильные группы и аминогруппы для химических реакций соединения с карбодиимидом. Эти и другие твердые среды хорошо известны, широко используются в уровне техники и доступны от коммерческих поставщиков. Выбор конкретного способа выделения и очистки полипептида является предметом стандартного плана и отчасти определяется свойствами выбранной подложки. См, например, Affinity Chromatography: PrinciplesMethods (Pharmacia LKBBiotechnology 1988); и Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996). Специалисты в данной области техники могут разработать дополнительные вариации выделения и очистки белков. Например, антитела, которые специфично связывают полипептидную слитую молекулу или димерный белок, как описано в настоящем документе (например, антитело, которое специфично связывает полипептидный сегмент, соответствующий цитокину или внеклеточному домену рецептора клеточной поверхности), могут использоваться с целью выделения больших количеств белка посредством иммуноаффинной очистки. Белки в соответствии с настоящим изобретением могут быть также выделены с использованием их особых свойств. Например, адсорбционная хроматография с иммобилизованными ионами металлов(IMAC) может использоваться для очистки богатых гистидином белков, в том числе содержащих полигистидиновые метки. Вкратце, гель сначала заряжается двухвалентными ионами металлов для формирования хелата (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1, 1985). Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этой матрице с различными степенями аффинности в зависимости от используемого иона металла и будут элюироваться посредством конкурентной элюции, снижения рН или с помощью сильных хелатирующих средств. Другие способы очистки предусматривают очистку гликозилированных белков лектинаффинной хроматографией и ион-обменной хроматографией (см., например, М. Deutscher, (ed.), Meth.Enzymol. 182:529, 1990). В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения для облегчения очистки может быть сконструирована слитая молекула представляющего интерес полипептида и аффинной метки (например, связывающего мальтозу белка, иммуноглобулинового домена). Более того,для очистки можно использовать связывающие рецептор или лиганд свойства димерного белка. Например, димерный белок VSTM3 может быть выделен с использованием аффинной хроматографии, при которой CD155 связывается с колонкой, а димерный белок VSTM3 связывается, а затем элюируется с использованием стандартных способов хроматографии. Полипептиды в соответствии с настоящим изобретением обычно очищены до по меньшей мере около 80% чистоты, в более типичных случаях до меньшей мере около 90% чистоты и предпочтительно до по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% чистоты в отношении контаминирующих макромолекул, в частности других белков и нуклеиновых кислот, и не содержат инфекционных и пирогенных агентов. Полипептиды в соответствии с настоящим изобретением также могут быть очищены до состояния фармацевтической чистоты, что соответствует более чем 99,9% чистоты. В некоторых препаратах очищенный полипептид практически не содержит других полипептидов, в частности, других полипептидов жи- 21022932IV. Способы применения и фармацевтические композиции. Димерные белки в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для диагностики,терапии или исследования с целью обеспечения одного или нескольких видов активности, связанной с полипептидами Р 1 и Р 2. Такие виды активности предусматривают без ограничения связывание с рецептором, активацию рецептора и связывание с лигандом. Специалистам в данной области техники будет очевиден спектр областей применения таких белков. Применения в терапевтических целях предусматривают, например, применение в качестве антагонистов цитокинов, например, для лечения злокачественных заболеваний или иммунологических нарушений, а также в качестве агонистов фактора роста, например, для обеспечения роста или заживления ткани или для обеспечения развития сосудистой сети или другой ткани. Применения в диагностических целях предусматривает, например, применение их в качестве нацеливающих средств для радиоизотопов или других меток для выявления наличия молекул на поверхностях клеток или в биологических жидкостях, или в экстрактах, или в качестве контролей при анализах in vitro. В исследовательских целях белки в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы, например, для мечения клеток, анализа наличия рецепторов клеточной поверхности или растворимых молекул, а также для изучения биологии цитокинов или рецепторных полипептидов или соединений, которые они связывают. Согласно отдельному аспекту настоящее изобретение относится к способам лечения опосредованного Т-клетками иммунного нарушения. Способы, как правило, предусматривают введение субъекту с опосредованным Т-клетками иммунным нарушением эффективного количества димерного белка VSTM3(B7R1), как описано в настоящем документе. Опосредованными Т-клетками иммунными нарушениями,поддающимися лечению в соответствии с настоящим изобретением, являются, например, аутоиммунные заболевания, реакция трансплантата против хозяина (GVHD) и отторжение трансплантата. Примеры опосредованных Т-клетками аутоиммунных заболеваний включают в себя ревматоидный артрит, рассеянный склероз (PC) (например, спинооптический PC, первичный прогрессирующий PC (ППРС) и ремитирующий-рецидивирующий PC (PPPC, инсулинзависимый сахарный диабет (IDDM), системную красную волчанку (SLE), глютеновую болезнь, неврит, полимиозит, псориаз, псориатический артрит, витилиго, синдром Шегрена, аутоиммунный панкреатит, воспалительное заболевание кишечника (например,болезнь Крона, язвенный колит), активный хронический гепатит, гломерулонефрит, склеродермию, саркоидоз, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, гранулематоз Вегенера, миастению гравис, астму, болезнь Эддисона, аутоиммунный увеоретинит, обыкновенную пузырчатку, первичный билиарный цирроз печени, пернициозную анемию, симпатическую офтальмию, увеит, аутоиммунную гемолитическую анемию, фиброз легких, хроническую бериллиевую болезнь и идиопатический фиброз легких, и это только некоторые из них. При использовании в терапевтических целях димерный белок, как описано в настоящем документе,доставляется способом, согласующимся с общепринятыми методиками, связанными с контролем заболевания или нарушения, для которого ведется поиск метода лечения. В соответствии с описанием настоящего документа эффективное количество димерного белка вводится субъекту, нуждающемуся в таком лечении, на протяжении периода времени и при условиях, достаточных для профилактики или лечения заболевания или нарушения. Субъектами для введения димерных белков, как описано в настоящем документе, являются пациенты с высокой степенью риска развития конкретного заболевания или нарушения, а также пациенты с уже проявившимся заболеванием или нарушением. Согласно определенным вариантам осуществления субъекту поставлен диагноз заболевания или нарушения, для которого ведется поиск метода лечения. Далее субъекты могут находиться под наблюдением во время курса лечения на предмет каких-либо изменений в заболевании или нарушении (например, усиления или ослабления клинических симптомов заболевания или нарушения). Также, согласно некоторым вариантам субъект не страдает другим заболеванием или нарушением, требующим лечения, которое предусматривает введение цитокина или рецепторного полипептида, соответствующего полипептидному сегменту Р 1 или Р 2 димерного белка. При использовании в профилактических целях фармацевтические композиции или медицинские препараты вводятся пациенту с восприимчивостью к конкретному заболеванию или с риском его развития в количестве, достаточном для устранения или снижения риска развития заболевания или задержки начала заболевания. При использовании в терапевтических целях композиции или медицинские препараты вводятся пациенту, у которого подозревают наличие такого заболевания, или который уже страдает от такого заболевания, в количестве, достаточном для излечения или по меньшей мере частичной приостановки симптомов заболевания и его осложнений. Количество, адекватное для достижения данной задачи,считается терапевтически или фармацевтически эффективными дозой или количеством. И при профилактическом, и при терапевтическом режимах применения средства обычно вводятся несколькими дозировками до достижения удовлетворительного ответа (например, ингибирования нежелательных ответов Т-клеток). Обычно за ответом наблюдают и, если желаемый ответ начинает угасать, вводят повторные дозировки. Для выявления пациентов-субъектов лечения в соответствии со способами настоящего изобретения можно использовать принятые способы скрининга для определения факторов риска, ассоциированных со специфическим заболеванием, или для определения статуса существующего заболевания, выявленного у субъекта. Такие способы могут предусматривать, например, определение, имеет ли индивидуум родственников, которым был поставлен диагноз конкретного заболевания. Способы скрининга также могут предусматривать, например, стандартные обследования с целью определения семейного статуса конкретного заболевания, о котором известно, что оно имеет наследственный компонент. С этой целью для выявления индивидуумов, несущих генетические маркеры, ассоциированные с конкретным представляющим интерес заболеванием, можно традиционно применять нуклеотидные зонды. Кроме того, в уровне техники известен широкий ряд иммунологических способов, которые являются применимыми для идентификации маркеров специфических заболеваний. Скрининг может выполняться по показаниям известных симптомов пациента, возрастных факторов, сопутствующих факторов риска и т.д. Эти способы позволяют врачу традиционными методами отбирать пациентов, нуждающихся в лечении способами,описанными в настоящем документе. Согласно этим способам лечение с использованием димерного белка в соответствии с настоящим изобретением (например, лечение с использованием димерного белкаVSTM3 для ингибирования нежелательных ответов Т-клеток) может осуществляться в виде независимой программы лечения или в виде последующего, вспомогательного или координированного режима лечения по отношению к другим методам лечения. Для введения димерный белок в соответствии с настоящим изобретением составляется в виде фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция, содержащая димерный белок, может быть составлена в соответствии с известными способами с целью приготовления фармацевтически применимых композиций, в которых терапевтическая молекула комбинируется в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. В композиции носитель является "фармацевтически приемлемым носителем", если его введение переносится пациентом-реципиентом. Стерильный фосфатный забуференный солевой раствор является одним из примеров фармацевтически приемлемого носителя. Другие приемлемые носители хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Gennaro (ed.), Remington'sPharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995. Составы могут дополнительно содержать один или несколько наполнителей, консервантов, солюбилизаторов, буферных средств, альбумин для предотвращения потерь белка на поверхностях флаконов и т.д. Фармацевтическая композиция, содержащая димерный белок в соответствии с настоящим изобретением, вводится субъекту в эффективном количестве. Димерный белок может вводиться субъектам различными путями введения, в том числе, например, внутримышечный, подкожный, внутривенный, в предсердие, внутрисуставной, парентеральный, интраназальный, внутрилегочный, трансдермальный,внутриплевральный, интратекальный и пероральный пути введения. В целях профилактики и лечения димерный белок может вводиться субъекту однократной болюсной доставкой, непрерывной доставкой(например, непрерывной трансдермальной доставкой) на протяжении длительного периода времени или по протоколу повторных введений (например, ежечасно, ежедневно или каждую неделю). Определение эффективных дозировок в этом контексте обычно основывается на исследованиях на животных моделях, после которых следуют клинические испытания с участием людей, и при этом руководствуются определением эффективных дозировок и протоколов введения, которые значимо снижают частоту возникновения или тяжесть рассматриваемого заболевания или нарушения субъекта у модельных субъектов. Эффективные дозы композиций в соответствии с настоящим изобретением варьируют в зависимости от множества различных факторов, в том числе средств введения, целевого участка, физиологического состояния пациента, от того, является ли пациент человеком или животным, других вводимых медицинских препаратов, от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим, а также от специфичной активности самой композиции и от ее способности вызывать желаемый ответ у индивидуума. Как правило, пациент является человеком, но в случае некоторых заболеваний пациентом может быть отличное от человека млекопитающее. В типичных случаях режимы введения корректируются с целью обеспечения оптимального терапевтического ответа, т.е. для оптимизации безопасности и эффективности. Соответственно, терапевтически или профилактически эффективное количество является также таким количеством, при котором положительные эффекты перевешивают любые нежелательные побочные эффекты (например, в случае димерного белка VSTM3 положительные эффекты ингибирования опосредованных Т-клетками иммунных ответов с участием димерного белка VSTM3 перевешивают любые нежелательные побочные эффекты). При введении димерного белка в соответствии с настоящим изобретением, такого как, например, димерный белок VSTM3, дозировка обычно варьирует от около 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг или от 1 мкг/кг до около 50 мг/кг, чаще от 10 мкг/кг до 5 мг/кг массы тела субъекта. В более специфических вариантах осуществления эффективное количество средства составляет от около 1 мкг/кг и до около 20 мг/кг, от около 10 мкг/кг до около 10 мг/кг или от около 0,1 до около 5 мг/кг. Дозировки в этом диапазоне могут быть достигнуты в результате однократного или многократных введений, в том числе, например, многократных введений в течение суток или каждый день, каждую неделю, один раз в две недели или каждый месяц. Например, согласно некоторым вариантам режим предусматривает первоначальное введение, после которого следуют многократные последующие введения через интервалы равные одной неделе или двум неделям. Другой режим предусматривает первоначаль- 23022932 ное введение, после которого следуют многократные последующие введения через интервалы равные одному месяцу или двум месяцам. Альтернативно, введения могут производиться нерегулярно, если это показано, исходя из наблюдения за клиническими симптомами заболевания или нарушения и/или из наблюдения за биомаркерами заболевания или другими параметрами, коррелирующимися с заболеванием(например, активность Т-клеток в случае опосредованного Т-клетками иммунного нарушения). Лечащий врач может менять дозировку фармацевтической композиции с целью поддержания желаемой концентрации на целевом участке. Например, при выборе внутривенного пути введения локальная концентрация средства в кровяном русле возле ткани-мишени может быть составлять около 1-50 наномолей композиции на литр (нмоль/л), иногда от около 1,0 до 10, 15 или 25 нмоль/л в зависимости от статуса субъекта и предусматриваемой измеряемой ответной реакции. Исходя из пути доставки, могут быть выбраны более высокие или более низкие концентрации, например, трансэпидермальная доставка по сравнению с доставкой на поверхность слизистой. Дозировку также следует корректировать в зависимости от скорости высвобождения вводимого состава, например, назального спрея по сравнению с порошком, доставляемых перорально с замедленным высвобождением или доставляемых инъекцией частиц, трансдермальных составов и т.д. Например, для достижения одинакового уровня концентрации в сыворотке крови частицы с замедленным высвобождением со скоростью высвобождения 5 нмоль (при стандартных условиях) будут вводиться приблизительно в двойной дозировке по отношению к частицам со скоростью высвобождения 10 нмоль. Фармацевтическая композиция, содержащая димерный белок, как описано в настоящем документе(например, димерный белок VSTM3), может поставляться в жидкой форме, в виде аэрозоля или в твердой форме. Примерами жидких форм служат растворы для инъекций, аэрозоли, капли, топологические растворы и пероральные суспензии. Типичные твердые формы предусматривают капсулы, таблетки и формы с контролируемым высвобождением. Иллюстративным примером последней формы являются миниосмотические насосы и имплантаты (см, например, Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239, 1997;Injectable Implant," в Protein Delivery: Physical Systems 93-117 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997. Другие твердые формы предусматривают кремы, пасты, другие средства для топологического применения и т.п. Липосомы представляют одно из средств доставки терапевтических полипептидов субъекту, например, путем внутривенного, внутрибрюшинного, интратекального, внутримышечного, подкожного или перорального введения, ингаляции или интраназального введения. Липосомы представляют собой микроскопические везикулы, которые состоят из одного или нескольких липидных бислоев, окружающих водные компартменты (см., в целом, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12(Suppl. 7;:S61, 1993; Kim, Drugs 46:618, 1993; Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," в Drug Delivery Systems 3-24 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995).) Липосомы сходны по композиции с клеточными мембранами, являются биоразлагаемыми и, благодаря этому, могут безопасно вводится. В зависимости от способа приготовления липосомы могут быть однослойными или многослойными и варьировать по размеру, имея диаметры от 0,02 до более чем 10 мкм. В липосомах может быть инкапсулирован ряд средств: гидрофобных средств, распределенных в бислоях, и гидрофильных средств, распределенных во внутреннем(их) водном(ых) пространстве(ах) (см., например, Machy et al.,Liposomes In Cell Biology and Pharmacology (John Libbey 1987); Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576, 1989). Более того, можно контролировать терапевтическую доступность инкапсулированного средства посредством изменения размера липосом, числа бислоев, липидного состава, а также заряда и характеристик поверхности липосом. Липосомы могут поглощаться практически любым типом клеток и затем медленно высвобождать инкапсулированное средство. Альтернативно, абсорбированная липосома может подвергаться эндоцитозу клетками, которые являются фагоцитирующими. За эндоцитозом следует внутрилизосомальное разрушение липосомальных липидов внутри липосом и высвобождение инкапсулированных средств (см.Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368, 1985). После внутривенного введения мелкие липосомы(0,1-1,0 мкм) обычно захватываются клетками ретикулоэндотелиальной системы, локализованными в основном в печени и селезенке, тогда как липосомы крупнее 3,0 мкм попадают в легкие. Такой предпочтительный захват липосом меньшего размера клетками ретикулоэндотелиальной системы был использован для доставки химиотерапевтических средств к макрофагам и опухолям печени. Ретикулоэндотелиальную систему можно обойти несколькими способами, в том числе насыщением большими дозами липосомных частиц или селективной инактивацией макрофагов фармакологическими средствами (см. Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428, 1984). Кроме того, было показано, что включение гликолипидных или полиэтиленгликолевых производных фосфолипидов в мембраны липосом приводит к значительному уменьшению захвата ретикулоэндотелиальной системой (см. Allen et al.,Biochim. Biophys. Acta 1068:133, 1991; Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993). Липосомы также можно приготовить нацеленными на конкретные клетки или органы путем варьи- 24022932 рования фосфолипидной композиции или путем включения рецепторов или противорецепторов в липосомы. Например, липосомы, приготовленные с высоким содержанием неионного поверхностноактивного вещества, использовались для нацеливания на печень (см., например, Japanese Patent 04244,018 to Hayakawa et al.; Kato et al., Biol Pharm. Bull. 16:960, 1993). Эти составы получали путем смешивания соевого фосфатидилхолина, -токоферола и этоксилированного гидрогенизированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, концентрирования смеси под вакуумом и последующего восстановления смеси водой. Было показано, что липосомный состав из дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) со стерилгликозидной смесью из сои (SG) и холестерином (Ch) также нацелен на печень (см. Shimizu etal., Biol Pharm. Bull 20:881, 1997). Альтернативно, с поверхностью липосом можно связывать различные нацеливающие противорецепторы, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки. Например,для нацеливания на печень липосомы можно модифицировать производными галактозиллипидов разветвленного типа, при этом мишенью являются асиалогликопротеиновые (галактозные) рецепторы, которые экспрессируются исключительно на поверхности клеток печени (см. Kato and Sugiyama, Crit. Rev.Ther. Drug Carrier Syst. 14:287, 1997; Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259, 1997). При более общем подходе к нацеливанию на ткани клетки-мишени предварительно метятся биотинилированными антителами, специфичными к противорецептору, экспрессируемому клеткой-мишенью (см. Harasym et al., Adv.Drug Deliv. Rev. 32:99, 1998). После удаления из плазмы свободных антител вводятся конъюгированные со стрептавидином липосомы. При другом подходе нацеливающие антитела прикрепляются непосредственно к липосомам (см. Harasym et al. выше). Полипептиды могут быть инкапсулированы в липосомах с использованием стандартных методов микроинкапсуляции белков (см., например, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099, 1981; Anderson et al.,Cancer Res. 50:1853, 1990; Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95, 1991; Alving et al. "Preparation andPress, 2nd ed. 1993); Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124, 1987). Как отмечено выше, терапевтически применимые липосомы могут содержать ряд компонентов. Например, липосомы могут содержать липидные производные поли(этиленгликоля) (см. Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993). Были разработаны деградируемые полимерные микросферы с целью поддержания высоких системных уровней терапевтических белков. Микросферы, в которых белки заключаются в полимер, получаются из деградируемых полимеров, таких как поли(лактида-со-гликолид) (PLG), полиангидриды, поли(ортоэфиры), а также из небиодеградируемых этилвинилацетатов (см., например, Gombotz and Pettit,Bioconjugate Chem. 6:332, 1995; Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery," в Drug Delivery Systems 5193 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled ReleaseSystems Useful for Protein Delivery," в Protein Delivery: Physical Systems 45-92 (Sanders and Hendren, eds.,Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161, 1998; Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153,1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548, 1998). Покрытые полиэтиленгликолем (PEG) наносферы также могут являться носителями для внутривенного введения терапевтичесих белков (см., например, Grefet al., Pharm. Biotechnol 10:167, 1997). Специалисты в данной области техники могут разработать другие формы дозировки, как показано,например, Ansel и Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (LeaFebiger, 5thVSTM3 (B7R1), могут быть использованы в генной терапии. Генная терапия в широком смысле слова определяется как перенос генетического материала в клетку с целью временного или постоянного изменения клеточного фенотипа. Разрабатываются многочисленные способы доставки цитокинов, противоопухолевых средств и дополнительных костимулирующих молекул в определенные участки пациентов с опухолями методами генной терапии (см., в целом, Rosenberg (ed.), Principles and practice of the biologictherapy of cancer (Lippincott WilliamsWilkins, Philadelphia, PA, 3rd ed. 2000. Эти технологии могут быть адаптированы для применения ДНК или РНК, кодирующих полипептидные слитые молекулы в соответствии с настоящим изобретением. Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления заболевание или нарушение у субъекта лечат введением нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидную слитую молекулу, как описано в настоящем документе. Например, согласно определенным вариантам осуществления опосредованные Т-клетками ответы у субъекта ингибируются введением нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидную слитую молекулу VSTM3 (B7R1), как описано в настоящем документе; с использованием таких кодирующих VSTM3 нуклеиновых кислот можно лечить опосредованные Т-клетками иммунные нарушения, как в целом обсуждалось выше. В случае лечения нуклеиновыми кислотами полипептидная слитая молекула, как описано в настоящем документе, экспрессируется и секретируется клетками с формированием димерного белка, который оказывает терапевтический эффект подобного типа, что и димерный белок в соответствии с настоящим изобретением, который непосредственно вводится субъекту, как описано выше (например, в случае нуклеиновой кислоты, кодирующей VSTM3, полипептидная слитая молекула VSTM3, как описано в настоящем документе, экспрессируется и секретируется с формированием димерного белка VSTM3, который ингибирует опосредованные Т-клетками эффекты аналогичным образом, что и димерный белок VSTM3, который непосредственно вводится субъекту). Альтернативно, полипептидная слитая молекула в соответствии с настоящим изобретением может экспрессироваться в формате, который сохраняет связь с поверхностью клетки, в которой данный белок экспрессируется (например, с функциональным трансмембранным доменом или со связыванием GPI); такие варианты осуществления особенно применимы для облегчения нацеливания на конкретные клетки или ткани для поддержания локальных терапевтических эффектов (таких как, например, локальное ингибирование опосредованных Т-клетками ответов посредством экспрессии димерного белка VSTM3). Нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептиды для использования в способах лечения, могут быть ДНК или РНК. Сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий полипептидную слитую молекулу,как описано в настоящем документе, в типичном случае соединен с регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, которые обеспечивают экспрессию сегмента ДНК в предполагаемых клеткахмишенях пациента. Например, для экспрессии в клетках крови, что желательно для ингибирования опосредованных Т-клетками ответов посредством экспрессии полипептидов VSTM3, для направления экспрессии пригодны промоторный и энхансерный элементы из генов легкой или тяжелой цепей иммуноглобулинов или основной промежуточный ранний промотор и энхансер CMV. Соединенные регуляторные элементы и кодирующие последовательности часто клонируются в векторе. Доступен ряд вирусных векторных систем, в том числе ретровирусные системы (см., например,Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109, 1993); аденовирусные векторы (см., например,Bett et al., J. Virol. 67, 5911, 1993); аденоассоциированные вирусные векторы (см., например, Zhou et al., J.Exp. Med. 179, 1867, 1994), вирусные векторы из семейства поксвирусов, в том числе вируса коровьей оспы и вируас птичьей оспы, вирусные векторы из рода альфавирусов, такие как полученные из вируса Синдбиса и вируса леса Семлики (см., например, Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519, 1996), а также папилломавирусы (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333, 1995; WO 94/12629 (Woo et al.); XiaoBrandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622, 1996). ДНК, кодирующая полипептидную слитую молекулу в соответствии с настоящим изобретением,или вектор, содержащий такую ДНК, могут быть упакованы в липосомы. Подходящие липиды и родственные аналоги описаны в патентах США 5208036, 5264618, 5279833 и 5283185. Векторы и ДНК,кодирующие полипептидную слитую молекулу, могут также адсорбироваться на носителях в форме частиц или связываться с ними, примеры которых включают в себя полиметилметакрилатные полимеры и полилактиды, а также поли(лактид-со-гликолиды) (см., например, McGee et al., J. Micro Encap., 1996). Векторы генной терапии или "оголенная" ДНК могут доставляться in vivo посредством введения конкретному пациенту, как правило, путем системного введения (например, внутривенной, внутрибрюшинной, назальной, желудочной, интрадермальной, внутримышечной, подкожной или интракраниальной инфузией) или местного нанесения (см., например, патент США 5399346). ДНК также может вводиться с использованием генной пушки (см. Xiao и Brandsma выше). ДНК, кодирующая полипептид, преципитируется на поверхности микроскопических металлических гранул. Эти микроскопические снаряды ускоряются ударной волной или расширяющимся гелием и проникают в ткани на глубину нескольких клеточных слоев. Например, приемлемым является средство генной доставки Accel, выпускаемое Agacetus, Inc. Middleton, WI. Альтернативно, "оголенная" ДНК может проходить сквозь кожу в кровяное русло просто при нанесении ДНК на кожу с химическим или механическим раздражением (см., например, WO 95/05853). Фармацевтические композиции, как описано в настоящем документе, также могут использоваться в комбинированном лечении. Используемый в настоящем документе термин "комбинированное лечение" означает, что субъекту вводится по меньшей мере одна терапевтически эффективная доза димерного белка, как описано в настоящем документе, и другое терапевтическое средство. Фармацевтические композиции могут поставляться в виде набора, содержащего контейнер с полипептидной слитой молекулой, димерным белком или полинуклеотидом, как описано в настоящем документе. Терапевтические молекулы могут быть представлены, например, в форме раствора для инъекций для однократной или многократных доз или в виде стерильного порошка, который будет восстанавливаться перед инъекцией. Альтернативно, такой набор может содержать диспергатор сухих порошков,генератор жидкого аэрозоля или распылитель для введения терапевтического белка или полинуклеотида. Такой набор может дополнительно содержать письменную информацию по показаниям и использованию фармацевтической композиции. Например, согласно конкретным вариантам осуществления набора, содержащего композицию VSTM3 (B7R1), такая информация может содержать указание, что композицияVSTM3 противопоказана пациентам с известной гиперчувствительностью к VSTM3. Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими неограничивающими примерами. Пример 1. Конструирование и экспрессия мышиной конфигурации "восьмерка" B7R1 (конфигурации "восьмерка" mB7R1). Плазмиду экспрессии, содержащую mB7R1-mFc2-mB7R1 (конфигурацию "восьмерка" mB7R1 с нативной лидерной последовательностью mB7R1; полинуклеотидную последовательность, показанную вSEQ ID NO: 9; кодированную полипептидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10), конструировали путем гомологичной рекомбинации в ходе двухстадийного процесса. Стадия 1. Сначала фрагмент ДНК, содержащий последовательность для слитого белка mB7R1-mFc2 (мышиного внеклеточного домена (ECD) B7R1, слитого с Fc-фрагментом мыши (mFc2, получали с помощью ПЦР-амплификации с использованием предварительно образованного клона в качестве матрицы. Фрагмент mB7R1-mFc2 характеризовался перекрыванием последовательностей в pZMP42 и был получен с использованием праймеров zc60639 (SEQ ID NO: 36), zc60643 (SEQ ID NO: 37) и zc60645 (SEQ ID NO: 38). Этот фрагмент создавали при следующих условиях ПЦР: 1 цикл, 94 С, 5 мин; 35 циклов, 94 С, 1 мин, затем 58 С, 2 мин, затем 72 С, 3 мин; 1 цикл, 72 С, 10 мин. Реакционные смеси ПЦР прогоняли на 1% агарозном геле, а полосу, соответствующую размерам вставок, экстрагировали из геля с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK (Qiagen, по каталогу 28704). Плазмида pZMP42 представляет собой вектор экспрессии млекопитающего, содержащий кассету экспрессии, содержащую промотор MPSV, несколько сайтов рестрикции для вставки кодирующих последовательностей и сигнальную пептидную последовательность otPA; элемент сайта внутренней посадки рибосомы (IRES) из вируса гепатита С, а также внеклеточный домен CD8, укороченный на Сконцевом конце трансмембранного домена; элемент сайта внутренней посадки рибосомы (IRES) из полиовируса, ген DHFR и терминатор SV40; точку начала репликации Е.coli; а также последовательностиURA3 и CEN-ARS, необходимые для отбора и репликации в S. cerevisiae. Ее конструировали из pZMP21(публикация заявки на выдачу патента США 2003/0232414 А 1) (депонирована в Американской коллекции типичных культур, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, обозначена как АТСС РТА-5266). Плазмиду pZMP42 разрезали BglII перед рекомбинацией в дрожжах с фрагментом ПЦР. Сто микролитров компетентных дрожжевых (S. cerevisiae) клеток независимо комбинировали с 10 мкл ДНКвставки и 100 нг разрезанного вектора pZMP42, а смесь переносили в 0,2 см кювету для электропорации. На смесь дрожжей с ДНК воздействовали электрическими импульсами с использованием источника энергии (BioRad Laboratories, Hercules, CA) с установками 0,75 кВ (5 кВ/см),Ом и 25 мкФ. В кювету добавляли шестьсот мкл 1,2 М сорбита, дрожжи высевали в 100 мкл и 300 мкл аликвотах в две чашкиURA-D и инкубировали при 30 С. Через приблизительно 72 ч Ura+ дрожжевые трансформанты из одной чашки повторно суспендировали в 1 мл Н 2 О и недолго центрифугировали до образования осадка дрожжевых клеток. Клеточный осадок повторно суспендировали на вортексе в 0,1 мл буфера для лизиса (2%Miniprep Kit, Qiagen,по каталогу 27106) с 10 единицами добавленной зимолиазы (Zymo Research,по каталогу Е 1002). Дрожжевую суспензию инкубировали в течение 10 мин в водяной бане при 37 С. Из дрожжей выделяли ДНК с использованием стандартного протокола QIAPREP Spin Miniprep Kit(Qiagen,по каталогу 27106), начиная со стадии добавления реагента Р 2. Трансформацию электрокомпетентных клеток-хозяев Е.coli (DH12S) выполняли с использованием 5 мкл препарата дрожжевой ДНК и 50 мкл клеток. На клетки воздействовали электрическими импульсами при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляли 1 мл SOC (2% ВАСТО TryptoneMgSO4, 20 мМ глюкозы), а затем клетки высевали в 50 мкл и 200 мкл аликвотах в две чашки LB AMP(LB-бульон (Lennox), 1,8% ВАСТО агара (Difco), 100 мг/л ампициллина). Вставки нескольких клонов для конструкции подвергали анализу последовательностей и выбирали один клон, содержащий корректную последовательность. Плазмидную ДНК в более крупном масштабе выделяли с использованием коммерчески доступного набора (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Конструкцию использовали как основу для второй стадии конструирования. Стадия 2. Вторая стадия конструирования предусматривает образование фрагмента ECD mB7R1 с использованием предварительно образованного клона в качестве матрицы. Фрагмент ECD mB7R1 характеризовался сайтом расщепления BspEI рестрикции, добавленным на 5'-конце фрагмента, и сайтом Bsu36I, добавленным на 3'-конце фрагмента, и был получен с использованием праймеров zc60642 (SEQ ID NO: 39) и zc60641 (SEQ ID NO: 40). Этот фрагмент создавали с использованием следующих условий ПЦР: 1 цикл, 94 С, 5 мин; 35 циклов, 94 С, 1 мин, затем 58 С, 2 мин, затем 72 С, 3 мин; 1 цикл, 72 С, 10 мин. Реакционные смеси ПЦР прогоняли на 1% агарозном геле, а полосу, соответствующую размерам вставок, экстрагировали из геля с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK (Qiagen, по каталогу 28704). Обе конструкции из фрагмента ECD mB7R1 первой стадии и второй стадии расщепляли с использованием BspEI и Bsu36I. Расщепленную ДНК для конструкции первой стадии и фрагмент ECD mB7Rl второй стадии прогоняли на 1% агарозном геле, а полосу, соответствующую размерам ДНК, экстрагиро- 27022932 вали из геля с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK (Qiagen,по каталогу 28704). Затем два очищенных препарата ДНК лигировали вместе с использованием способов, известных в уровне техники. Трансформацию электрокомпетентных клеток-хозяев Е.coli (DH12S) выполняли с использованием 1 мкл препарата для лигирования и 50 мкл клеток. На клетки воздействовали электрическими импульсами при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляли 1 мл SOC (2% ВАСТО TryptoneMgSO4, 20 мМ глюкозы), а затем клетки высевали в 50 мкл и 200 мкл аликвотах в две чашки LB AMP(LB-бульон (Lennox), 1,8% ВАСТО агара (Difco), 100 мг/л ампициллина). Вставки нескольких клонов для конструкции подвергали анализу последовательностей и выбирали один клон, содержащий корректную последовательность. Плазмидную ДНК в более крупном масштабе выделяли с использованием коммерчески доступного набора (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Этот клон обозначали 1863. Нуклеотид полной длины, кодирующий последовательность, и соответствующая аминокислотная последовательность для конфигурации "восьмерка" mB7R1 с нативной сигнальной последовательностью показаны в SEQ ID NO: 9 и 10 соответственно. Зрелая форма конфигурации "восьмерка" mB7R1 соответствует аминокислотам 26-489 из SEQ ID NO: 10 (кодированным нуклеотидами 76-1467 из SEQ ID NO: 9). Экспрессия конфигурации "восьмерка" mB7R1. Каждый из трех наборов по 200 мкг конструкции 1863 расщепляли 200 единицами Pvu I при 37 С в течение трех часов, а затем осаждали с IPA и центрифугировали в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке. С осадка сливали супернатант, а осадок промывали 1 мл 70% этанола и обеспечивали инкубацию в течение 5 мин при комнатной температуре. Пробирку вращали в микроцентрифуге в течение 10 мин при 14000 об/мин и с осадка сливали супернатант. Затем осадок повторно суспендировали в 750 мкл средыZF1 в стерильных условиях, обеспечивали инкубацию при 60 С в течение 10 мин и обеспечивали охлаждение до комнатной температуры. 5106 клеток DXB11 5SA CHO центрифугировали в каждой из трех пробирок и повторно суспендировали с использованием раствора среды ДНК. Смесь ДНК и клеток помещали в 0,4 см щелевую кювету и электропорировали с использованием следующих параметров: 950 мкФ, высокая емкость и 300 В. Затем содержимое кювет удаляли, объединяли, разбавляли до 25 мл средой ZF1 и помещали в 125 мл встряхиваемую колбу. Колбу помещали в инкубатор на встряхиватель при 37 С, 6% СО 2 и встряхивали при 120 об/мин. Клеточную линию подвергали отбору по питательным веществам, а затем стадии амплификации при 200 нМ метотрексата (МТХ). Экспрессию подтверждали с помощью вестерн-блоттинга, клеточную линию наращивали, а затем очищали белок. Пример 2. Конструирование и экспрессия конфигурации "восьмерка" B7R1 человека (конфигурации "восьмерка" B7R1). Плазмиду экспрессии, содержащую B7R1-Fc5-B7R1 (конфигурацию "восьмерка" B7R1 с нативной лидерной последовательностью B7R1; полинуклеотидную последовательность, показанную в SEQ IDNO: 5; кодированную полипептидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6), конструировали путем гомологичной рекомбинации в ходе двухстадийного процесса. Стадия 1. Сначала фрагмент ДНК, содержащий последовательность для слитого белка B7R1-Fc5 (внеклеточного домена B7R1 человека (ECD), слитого с Fc-фрагментом Fc5 без эффекторной функции), получали с помощью ПЦР-амплификации и рекомбинации. Фрагмент ECD B7R1 и фрагмент Fc5 получали с использованием предварительно образованных клонов в качестве матриц. Фрагмент ECD B7R1 характеризовался перекрыванием последовательностей в Fc5 и был получен с использованием праймеров zc53051 (SEQB7R1, линкер GGGSG, множественную область клонирования, содержащую сайт BspEI и сайт BglII в 5'3' направлении, а также перекрывание последовательностей с последовательностью вектора pZMP42 и был получен с использованием праймеров zc60386 (SEQ ID NO: 43), zc59433 (SEQ ID NO: 44) и zc59434(SEQ ID NO: 45). Эти два фрагмента создавали при следующих условиях ПЦР: 1 цикл, 94 С, 5 мин; 35 циклов, 94 С, 1 мин, затем 58 С, 2 мин, затем 72 С, 3 мин; 1 цикл, 72 С, 10 мин. Реакционные смеси ПЦР прогоняли на 1% агарозном геле, а полосу, соответствующую размерам вставок, экстрагировали из геля с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK (Qiagen, по каталогу 28704). Плазмида pZMP42 представляет собой вектор экспрессии млекопитающего, содержащий кассету экспрессии, содержащую промотор MPSV, несколько сайтов рестрикции для вставки кодирующих последовательностей и сигнальную пептидную последовательность otPA; элемент сайта внутренней посадки рибосомы (IRES) из вируса гепатита С, а также внеклеточный домен CD8, укороченный на Сконцевом конце трансмембранного домена; элемент сайта внутренней посадки рибосомы (IRES) из полиовируса, ген DHFR и терминатор SV40; точку начала репликации Е.coli; а также последовательностиURA3 и CEN-ARS, необходимые для отбора и репликации в S. cerevisiae. Ее конструировали из pZMP21(публикация заявки на выдачу патента США 2003/0232414 А 1) (депонирована в Американской коллекции типичных культур, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, обозначена как АТСС РТА-5266). Плазмиду pZMP42 разрезали BglII перед рекомбинацией в дрожжах с фрагментом ПЦР. Сто микролитров компетентных дрожжевых (S. cerevisiae) клеток независимо комбинировали с 10 мкл ДНКвставки и 100 нг разрезанного вектора pZMP42 и смесь переносили в 0,2 см кювету для электропорации. На смесь дрожжей с ДНК воздействовали электрическими импульсами с использованием источника энергии (BioRad Laboratories, Hercules, CA) с установками 0,75 кВ (5 кВ/см),Ом и 25 мкФ. В кювету добавляли шестьсот мкл 1,2 М сорбита, дрожжи высевали в 100 мкл и 300 мкл аликвотах в две чашкиURA-D и инкубировали при 30 С. Через приблизительно 72 ч Ura+ дрожжевые трансформанты из одной чашки повторно суспендировали в 1 мл H2O и недолго центрифугировали до образования осадка дрожжевых клеток. Клеточный осадок повторно суспендировали на вортексе в 0,1 мл буфера для лизиса (2%Miniprep Kit, Qiagen,по каталогу 27106) с 10 единицами добавленной зимолиазы (Zymo Research,по каталогу Е 1002). Дрожжевую суспензию инкубировали в течение 10 мин в водяной бане при 37 С. Из дрожжей выделяли ДНК с использованием стандартного протокола QIAPREP Spin Miniprep Kit(Qiagen,по каталогу 27106), начиная со стадии добавления реагента Р 2. Трансформацию электрокомпетентных клеток-хозяев Е.coli (DH12S) выполняли с использованием 5 мкл препарата дрожжевой ДНК и 50 мкл клеток. На клетки воздействовали электрическими импульсами при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляли 1 мл SOC (2% ВАСТО TryptoneMgSO4, 20 мМ глюкозы), а затем клетки высевали в 50 мкл и 200 мкл аликвотах в две чашки LB AMP(LB-бульон (Lennox), 1,8% ВАСТО агара (Difco), 100 мг/л ампициллина). Вставки нескольких клонов для конструкции подвергали анализу последовательностей и выбирали один клон, содержащий корректную последовательность. Плазмидную ДНК в более крупном масштабе выделяли с использованием коммерчески доступного набора (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Конструкцию обозначали 1795 и использовали как основу для второй стадии конструирования. Стадия 2. Конструкцию 1795 конструировали как в первой стадии с построением вектора конфигурации"восьмерка" B7R1 человека в pZMP42. 1795 содержит фрагмент Fc5 B7R1 в векторе pZMP42, который содержит добавление 3', состоящее из линкерной последовательности, и множественную область клонирования, содержащую сайты рестрикции BspEI и BglII. Вторая стадия конструирования предусматривает образование фрагмента ECD B7R1 с использованием предварительно образованного клона в качестве матрицы. Фрагмент ECD B7R1 характеризовался сайтом расщепления BspEI рестрикции, добавленным на 5'-конце фрагмента, и сайтом BglII, добавленным на 3'-конце фрагмента, и был получен с использованием праймеров zc59435 (SEQ ID NO: 77),zc60392 (SEQ ID NO: 78) и zc59434 (SEQ ID NO: 45). Этот фрагмент создавали с использованием следующих условий ПЦР: 1 цикл, 94 С, 5 мин; 35 циклов, 94 С, 1 мин, затем 58 С, 2 мин, затем 72 С, 3 мин; 1 цикл, 72 С, 10 мин. Реакционные смеси ПЦР прогоняли на 1% агарозном геле, а полосу, соответствующую размерам вставок, экстрагировали из геля с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK (Qiagen, по каталогу 28704). И конструкцию 1795, и фрагмент ECD B7R1 второй стадии расщепляли с использованием BspEI иBglII. Расщепленную ДНК для конструкции 1795 и фрагмент ECD B7R1 второй стадии прогоняли на 1% агарозном геле, а полосу, соответствующую размерам ДНК, экстрагировали из геля с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK (Qiagen,по каталогу 28704). Затем два очищенных препарата ДНК лигировали вместе с использованием способов, известных в уровне техники. Трансформацию электрокомпетентных клеток-хозяев Е.coli (DH12S) выполняли с использованием 1 мкл препарата для лигирования и 50 мкл клеток. На клетки воздействовали электрическими импульсами при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляли 1 мл SOC (2% ВАСТО TryptoneMgSO4, 20 мМ глюкозы), а затем клетки высевали в 50 мкл и 200 мкл аликвотах в две чашки LB AMP(LB-бульон (Lennox), 1,8% ВАСТО агара (Difco), 100 мг/л ампициллина). Вставки нескольких клонов для конструкции подвергали анализу последовательностей и выбирали один клон, содержащий корректную последовательность. Плазмидную ДНК в более крупном масштабе выделяли с использованием коммерчески доступного набора (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Этот клон обозначали 1812. Нуклеотид полной длины, кодирующий последовательность, и соответствующая аминокислотная последовательность для конфигурации "восьмерка" B7R1 с нативной сигнальной последовательностью показаны в SEQ ID NO: 5 и 6 соответственно. Зрелая форма конфигурации "восьмерка" B7R1 соответст- 29