Получение гетерологичных полипептидов в микроводорослях, внеклеточные микроводорослевые тельца, композиции и способы их получения и применения

ПОЛУЧЕНИЕ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ В МИКРОВОДОРОСЛЯХ,ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ МИКРОВОДОРОСЛЕВЫЕ ТЕЛЬЦА, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Изобретение относится к рекомбинантным микроводорослевым клеткам и их применению для получения гетерологичного белка, способам получения гетерологичных полипептидов во внеклеточных микроводорослевых тельцах, внеклеточным микроводорослевым тельцам,содержащим гетерологичные полипептиды и к содержащим их композициям.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДиЭсЭм АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Область техники Настоящее изобретение относится к рекомбинантным микроводорослевым клеткам и их применению для получения гетерологичного полипептида, способам получения гетерологичных полипептидов во внеклеточных тельцах микроводорослей, внеклеточным тельцам микроводорослей, содержащим гетерологичные полипептиды, и композициям. Уровень техники Прогресс в биотехнологии и молекулярной биологии дал возможность получать в микробных, растительных и животных клетках белки, многие из которых ранее можно было получить лишь путем экстрагирования из тканей, крови или мочи людей и других животных. Биопрепараты, которые доступны для приобретения на сегодняшний день, обычно получают либо в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO), либо в микробных клетках, таких как линии клеток дрожжей или Е.coli. Получение белков путем культивирования микроорганизмов обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с существующими системами, например культурами клеток растений и животных. Например, процессы на основе культивирования микроорганизмов обеспечивают (i) быстрое получение высокой концентрации белка; (ii) возможность использования стерильных контролируемых условий продукции (например, условий надлежащей практики организации производства (GMP; (iii) возможность использования простых ростовых сред определенного химического состава, обеспечивающих более простое культивирование и меньшее количество примесей; (iv) отсутствие загрязнения патогенами человека или животных и (v) простоту очистки белка (например, путем выделения из культуральных сред). Кроме того, оборудование для культивирования микроорганизмов (ферментирования) обычно дешевле сконструировать, чем оборудование для клеточных культур. Микроводоросли, например траустохитриды, можно выращивать на стандартном оборудовании для культивирования микроорганизмов, с очень короткими циклами культивирования (например, 1-5 суток) с использованием недорогих сред определенного состава и минимальной очистки или без очистки. Кроме того, для некоторых микроводорослей, например Schizochytrium, продемонстрирована безопасность использования биомассы и липидов, выделенных из нее, для применения в качестве пищевых добавок. Например, обогащенное докозагексаеновой кислотой масло, содержащее триглицериды, полученное из этих микроорганизмов, получено от Управления по контролю продуктов питания и лекарственных средств США статус GRAS (общепризнанно безопасного). Было показано, что микроводоросли способны экспрессировать рекомбинантные белки. Например,в патенте США 7001772 описаны первые рекомбинантные конструкции, подходящие для трансформирования траустохитрид, включая представителя рода Schizochytrium. В данной публикации описаны,среди прочего, последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот для ацетолактатсинтазы, промоторных и терминаторных областей ацетолактатсинтазы, промотора альфа-тубулина, промотора из системы поликетидсинтазы (PKS) и промотора десатуразы жирных кислот Schizochytrium. Далее, в публикациях США 2006/0275904 и 2006/0286650, каждая из которых полностью включена в данное описание посредством ссылки, описаны последовательности промоторов и терминаторов актина, альфасубъединицы фактора элонгации трансляции 1 (EF1) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы(GAPDH) Schizochytrium. Сохраняется потребность в разработке способов экспрессии гетерологичных полипептидов в микроводорослях, а также в альтернативных композициях для применения в терапии. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к способу получения вирусного белка, выбранного из группы,состоящей из белка гемагглютинина (НА), белка нейраминидазы (NA), гибридного белка (F), гликопротеина (G), белка оболочки (Е-), гликопротеина размером 120 кДа (gp120), гликопротеина размером 41 кДа (gp41), белка матрикса и комбинаций перечисленных белков, включающий культивирование рекомбинантной микроводорослевой клетки в среде, причем рекомбинантная микроводорослевая клетка содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вирусный белок, с получением вирусного белка. В некоторых вариантах реализации вирусный белок секретируется. В некоторых вариантах реализации вирусный белок выделяют из среды. В некоторых вариантах реализации вирусный белок накапливается в микроводорослевой клетке. В некоторых вариантах реализации вирусный белок накапливается в мембране клетки микроводоросли. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой белок HA. В некоторых вариантах реализации последовательность белка HA по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка способна осуществлять посттрансляционный процессинг белка HA с получением полипептидов HA1 и HA2 в отсутствие экзогенной протеазы. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой белок NA. В некоторых вариантах реализации последовательность белка NA по меньшей мере на 90% идентична последовательностиSEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой гибридный белок. В некоторых вариантах реализации последовательность гибридного белка (F) по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 102. В некоторых вариантах реализации вирусный бе-1 022841 лок представляет собой G-белок. В некоторых вариантах реализации последовательность гликопротеина(G) по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 103. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка является представителем отряда Thraustochytriales. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка представляет собой Schizochythum илиThraustochytrium. В некоторых вариантах реализации полинуклеотидная последовательность, кодирующая вирусный белок, дополнительно включает мембранный домен HA. В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает полинуклеотидную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38,SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 и комбинаций перечисленных последовательностей. Настоящее изобретение относится к изолированному вирусному белку, полученному любым из описанных выше способов. Настоящее изобретение относится к рекомбинантной микроводорослевой клетке, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вирусный белок, выбранный из группы, состоящей из белка гемагглютинина (НА), белка нейраминидазы(NA), гибридного белка (гибридного белка), гликопротеина (G), белка оболочки (Е), гликопротеина размером 120 кДа (gp120), гликопротеина размером 41 кДа (gp41), белка матрикса и комбинаций перечисленных белков. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой белок HA. В некоторых вариантах реализации последовательность белка HA по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка способна осуществлять посттрансляционный процессинг белка HA с получением полипептидов HA1 и HA2 в отсутствие экзогенной протеазы. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой белок NA. В некоторых вариантах реализации последовательность белка NA по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой гибридный белок. В некоторых вариантах реализации последовательность гибридного белка (F) по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 102. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой G-белок. В некоторых вариантах реализации последовательность гликопротеина (G) по меньшей мере на 90% идентична последовательностиSEQ ID NO: 103. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка является представителем отряда Thraustochytriales. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка представляет собой Schizochytrium или Thraustochytrium. В некоторых вариантах реализации полинуклеотидная последовательность, кодирующая вирусный белок, дополнительно включает мембранный домен HA. В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45,SEQ ID NO: 46 и комбинаций перечисленных последовательностей. Настоящее изобретение относится к способу получения внеклеточного микроводорослевого тельца,содержащего гетерологичный полипептид, указанный способ включает (а) экспрессирование гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине, при этом указанный гетерологичный полипептид содержит мембранный домен; и (b) культивирование микроводорослевой клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих образование внеклеточного тельца, содержащего гетерологичный полипептид,при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной клетки-хозяина. Настоящее изобретение относится к способу получения композиции, содержащей внеклеточное микроводорослевое тельце и гетерологичный полипептид, причем указанный способ включает (а) экспрессию гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине, при этом указанный гетерологичный полипептид содержит мембранный домен; и (b) культивирование микроводорослевой клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих образование внеклеточного тельца, содержащего гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной клеткихозяина, причем указанную композицию получают в виде культурального супернатанта, содержащего внеклеточное тельце. В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает отделение культурального супернатанта от композиции и ресуспендирование внеклеточного тельца в водном жидком носителе. Настоящее изобретение направлено на композицию, полученную с помощью указанного способа. В некоторых вариантах реализации способ получения внеклеточного микроводорослевого тельца и гетерологичного полипептида или способ получения композиции, содержащей внеклеточное микроводорослевое тельце и гетерологичный полипептид, включает клетку-хозяина, которая представляет собой клетку-хозяина Labyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина Schizochytrium или Thraustochytrium. Настоящее изобретение относится к внеклеточному тельцу микроводоросли, содержащему гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной клетки микроводоросли. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой везикулу,мицеллу, фрагмент мембраны, агрегат мембран или их смесь. В некоторых вариантах реализации вне-2 022841 клеточное тельце представляет собой смесь везикулы и фрагмента мембраны. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой везикулу. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит мембранный домен. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой гликопротеин. В некоторых вариантах реализации гликопротеин включает олигосахариды с высоким содержанием маннозы. В некоторых вариантах реализации гликопротеин по существу свободен от сиаловой кислоты. Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей внеклеточное тельце согласно любому из описанных пунктов формулы изобретения и водный жидкий носитель. В некоторых вариантах реализации водный жидкий носитель представляет собой культуральный супернатант. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана полинуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 76), которая кодирует белок гемагглютинина (НА) вируса гриппа A (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1, которую кодоноптимизировали для экспрессии в Schizochytrium sp. ATCC 20888. На фиг. 2 показана карта плазмиды pCL0143. На фиг. 3 показана процедура, использовавшаяся для анализа клона CL0143-9. На фиг. 4 показана секреция белка HA трансгенным CL0143-9 Schizochytrium ("Е"). На фиг. 4 А показан выделенный рекомбинантный белок HA (указан стрелками) на окрашенных антителами против H1N1 иммуноблотах супернатанта, полученного путем низкоскоростного центрифугирования (т.е. бесклеточного супернатанта ("БКС", культуры, выращенной при различных температурах(25, 27, 29 С) и рН (5,5, 6,0, 6,5, 7,0). На фиг. 4 В показан выделенный рекомбинантный белок HA на окрашенных кумасси гелях ("Кумасси") и окрашенных антителами против H1N1 иммуноблотах ("ИБ: анти-H1N1") из фракции 60% сахарозы при невосстановительных или восстановительных условиях. На фиг. 5 показана гемагглютинирующая активность рекомбинантного белка HA из трансгенногоCL0143-9 Schizochytrium ("Е"). На фиг. 5 А показана гемагглютинирующая активность в бесклеточном супернатанте ("БКС"). На фиг. 5 В показана гемагглютинирующая активность в растворимой ("Р") и нерастворимой ("HP") фракциях."[белка]" обозначает концентрацию белка, снижающуюся слева направо с повышением разведения образцов;"+" обозначает положительный контроль гемагглютинина вируса гриппа;"С" обозначает отрицательный контроль штамма Schizochytrium sp. ATCC 20888 дикого типа;"ГАЕ" обозначает единицу гемагглютинирующей активности с учетом кратности разведения образцов слева направо;"2" обозначает двукратное разведение образца в первой лунке; в каждой последующей лунке слева направо кратность разведения удваивается по сравнению с предыдущей лункой, таким образом, что кратность разведения от первой к последней лунке слева направо составляет 2,4, 8, 16, 32, 64, 128, 256,512, 1024, 2048 и 4096. На фиг. 6 показана экспрессия и гемагглютинирующая активность белка HA, присутствующего во фракции 60% сахарозы, для трансгенного CL0143-9 Schizochytrium ("Е"). На фиг. 6 А показан выделенный рекомбинантный белок HA (указан стрелками) на окрашенном кумасси геле ("Кумасси") и окрашенном антителами против H1N1 иммуноблоте ("ИБ: анти-H1N1") из фракции 60% сахарозы. На фиг. 6 В показана соответствующая гемагглютинирующая активность."+" обозначает положительный контроль белка HA вируса гриппа;"С" обозначает отрицательный контроль штамма дикого типа Schizochytrium sp. ATCC 20888;"ГАЕ" обозначает единицу гемагглютинирующей активности с учетом кратности разведения образцов. На фиг. 7 показан анализ пептидной последовательности выделенного рекомбинантного белка HA,которая была определена по всего 27 пептидам (аминокислоты, относящиеся к указанным пептидам, выделены жирным шрифтом), покрывающим около 42% всей белковой последовательности HA(SEQ ID NO: 77). Полипептид HA1 был определен по всего 17 пептидам, а полипептид HA2 был определен по всего 9 пептидам. На фиг. 8 показан окрашенный кумасси гель ("Кумасси") и окрашенный антителами против H1N1 иммуноблот ("ИБ: анти-H1N1"), на которых представлено гликозилирование белка HA в Schizochytrium."EndoH" и "PNGase F" обозначают ферментативные обработки фракции 60% сахарозы трансгенного"БО" обозначает трансгенный CL0143-9 Schizochytrium, который инкубировали без обработки ферментами, но при тех же условиях, что и при обработке EndoH и PNGase F.-3 022841 На фиг. 9 показана концентрация общего белка из культурального супернатанта Schizochytrium sp.ATCC 20888 (г/л) с течением времени (ч). На фиг. 10 показан ПААГ/ДСН общего белка из культурального супернатанта Schizochytrium sp.ATCC 20888 на дорожках 11-15, где супернатант собирали в пять из шести моментов времени, показанных на фиг. 9, в часы 37-68, исключая час 52. Полоски, идентифицированные как актин и гельзолин (путем пептидного секвенирования с помощью масс-спектрометрии), отмечены стрелками. На дорожку 11 загружали 2,4 мкг общего белка; в оставшиеся лунки загружали 5 мкг общего белка. На фиг. 11 показаны негативно окрашенные везикулы из Schizochytrium sp. ATCC 20888("С: 20888") и трансгенного CL0143-9 Schizochytrium ("E: CL0143-9"). На фиг. 12 показан иммуноблоттинг с антителами против H1N1 с окрашиванием золотом везикул изSchizochytrium sp. ATCC 20888 ("С: 20888") и трансгенного CL0143-9 Schizochytrium ("E: CL0143-9"). На фиг. 13 показаны предсказанные на основании применения алгоритма SignalP сигнальные якорные последовательности, нативные для Schizochytrium. См., например, Bendsten et al., J., Mol. Biol. 340:783-795 (2004); Nielsen, H. и Krogh, A. Proc. Int. Conf. Intell. Syst. Mol. Biol. 6:122-130 (1998);(2007). На фиг. 14 показаны предсказанные мембранные белки I типа в Schizochytrium на основании поиска в BLAST по базам данных геномных и EST ДНК Schizochytrium для генов с гомологией с известными мембранными белками I типа из других организмов и обладающих пронизывающими мембрану участками в самых дальних С-концевых областях белков. Предполагаемые пронизывающие мембрану участки показаны жирным шрифтом. На фиг. 15 показана карта плазмиды pCL0120. На фиг. 16 показана таблица использования кодонов для Schizochytrium. На фиг. 17 показана карта плазмиды pCL0130. На фиг. 18 показана карта плазмиды pCL0131. На фиг. 19 показана карта плазмиды pCL0121. На фиг. 20 показана карта плазмиды pCL0122. На фиг. 21 показана полинуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 92), которая кодирует белок изомеразы ксилозы "XylA" Piromyces sp. E2, соответствующий номеру доступа в GenBankCAB76571, оптимизированная для экспрессии в Schizochytrium sp. АТСС 20888. На фиг. 22 показана полинуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 93), которая кодирует белок киназы ксилулозы "XylB" Piromyces sp. E2, соответствующий номеру доступа в GenBank AJ249910,оптимизированная для экспрессии в Schizochytrium sp. АТСС 20888. На фиг. 23 показана карта плазмиды pCL0132. На фиг. 24 показана карта плазмиды pCL0136. На фиг. 25 А показана карта плазмиды pCL0140. На фиг. 25 В показана карта плазмиды pCL0149. На фиг. 26 А показана полинуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 100), которая кодирует белок нейраминидазу (NA) вируса гриппа A (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1, оптимизированная для экспрессии в Schizochytrium sp. АТСС 20888. На фиг. 26 В показана полинуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 101), которая кодирует белок NA вируса гриппа A (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1 с меткой V5 на конце и полигистидиновой меткой, оптимизированная для экспрессии в Schizochytrium sp. АТСС 20888. На фиг. 27 показана схема процедуры, используемой для анализа клонов CL0140 и CL0149. На фиг. 28 показана нейраминидазная активность рекомбинантного белка NA из трансгенных штаммов CL0140-16, -17, -20, -21, -22, -23, -24, -26, -28 Schizochytrium. Активность определяли путем измерения флуоресценции 4-метилумбеллиферона, который возникает в результате гидролиза 4-метилумбеллиферил)D-N-ацетилнейрамината(Возб.): 365 нм, эмиссия (Эм.): 450 нм). Активность выражена в виде относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) на 1 мкг белка в концентрированном бесклеточном супернатанте (кБКС, самый левый столбик для каждого клона) и бесклеточном экстракте (БКЭ, самый правый столбик для каждого клона). Штамм дикого типа Schizochytrium sp. ATCC 20888 ("-") и ПЦР-отрицательный штамм Schizochytrium,трансформированный pCL0140 ("27"), которые выращивали и обрабатывали таким же способом, как и трансгенные штаммы, использовали в качестве отрицательных контролей. На фиг. 29 показана частичная очистка рекомбинантного белка NA из трансгенного штаммаCL0140-26 Schizochytrium. Нейраминидазная активность различных фракций показана на фиг. 29 А."КБКС" обозначает концентрированный бесклеточный супернатант;"кЭ" обозначает концентрированную фракцию элюата.-4 022841 На фиг. 29 В показан окрашенный кумасси гель ("Кумасси") с 12,5 мкл каждой фракции. Стрелка указывает на бэнд, идентифицированный как белок NA. Для разделения белков применяли ПААГ/ДСН на 12% бис-трис-гелях NuPAGE Novex в электродном буфере 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислотой (МОПС) и ДСН. На фиг. 30 показан анализ пептидной последовательности выделенного рекомбинантного белка NA,который был определен по всего 9 пептидам (выделены жирным красным шрифтом), покрывающим 25% белковой последовательности (SEQ ID NO: 100). На фиг. 31 показаны нейраминидазные активности трансгенных штаммов CL0149-10, -11, -12Schizochytrium и соответствующий окрашенный кумасси гель ("Кумасси") и иммуноблот, окрашенный антителами против V5 "Иммуноблот: анти-V5"). На фиг. 31 А показана нейраминидазная активность, которую определяли путем измерения флуоресценции 4-метилумбеллиферона, который возникает в результате гидролиза 4-MUNANA сиалидазами(Возб.: 365 нм, Эм.: 450 нм). Активность выражена в виде относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) на 1 мкг белка в бесклеточном супернатанте (БКС). Штамм дикого типа Schizochytrium sp. ATCC 20888("-"), который выращивали и обрабатывали таким же способом, как и трансгенный штамм, использовали в качестве отрицательного контроля. На фиг. 31 В показан окрашенный кумасси гель и соответствующий иммуноблот, окрашенный антителами против V5, с 12,5 мкл БКС для 3 трансгенных штаммов CL0149 Schizochytrium ("10", "11" и "12"). Контрольный белок Positope использовали в качестве положительного контроля для антитела ("+"). Штамм дикого типа Schizochytrium sp. ATCC 20888 ("-"), который выращивали и обрабатывали таким же способом, как и трансгенный штамм, использовали в качестве отрицательного контроля. На фиг. 32 показаны ферментативные активности HA и NA вируса гриппа в бесклеточном супернатанте трансгенного Schizochytrium, котрансформированного клонами CL0140 и CL0143. Результаты представлены для клонов CL0140-143-1, -3, -7, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20. На фиг. 32 А показана нейраминидазная активность, которую определяли путем измерения флуоресценции 4-метилумбеллиферона, который возникает в результате гидролиза 4-MUNANA сиалидазами(Возб.: 365 нм, Эм.: 450 нм). Активность выражена в виде относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) для 25 мкл БКС. Штамм дикого типа Schizochytrium sp. ATCC 20888 ("-"), который выращивали и обрабатывали таким же способом, как и трансгенный штамм, использовали в качестве отрицательного контроля. На фиг. 32 В показана гемагглютинирующая активность."+" обозначает положительный контроль HA вируса гриппа;"ГАЕ" обозначает единицу гемагглютинирующей активности с учетом кратности разведения образцов. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способу получения гетерологичных полипептидов в микроводорослевых клетках-хозяевах. Настоящее изобретение также относится гетерологичным полипептидам,полученныем указанными способами, к микроводорослевым клеткам, содержащим гетерологичные полипептиды, и к композициям, содержащим гетерологичные полипептиды. Настоящее изобретение также относится к получению гетерологичных полипептидов в микроводорослевых клетках-хозяевах, при этом гетерологичные полипептиды связаны с внеклеточными тельцами микроводорослей, которые не соединены с плазматической мембраной клеток-хозяев. Настоящее изобретение также относится к получению внеклеточных микроводорослевых телец, содержащих гетерологичные полипептиды, а также к получению содержащих их композиций. Настоящее изобретение дополнительно относится к внеклеточным тельцам микроводорослей, содержащим гетерологичные полипептиды, содержащим их композициям и их применению. Микроводорослевые клетки-хозяева. Микроводоросли, также известные как микроскопические водоросли, часто обнаруживают в пресной воде и морских системах. Микроводоросли являются одноклеточными, но могут также расти цепочками и группами. Отдельные клетки имеют размер в диапазоне от нескольких микрометров до нескольких сотен микрометров. Так как такие клетки способны расти в водных суспензиях, они имеют хороший доступ к питательным веществам и водному окружению. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой желтозеленую водоросль или страминопил. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой представителя типа Labyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин Labyrinthulomycota представляет собой представитель отряда Thraustochytriales или отряда Labyrinthulales. Согласно настоящему изобретению термин "траустохитрид" относится к любому представителю отрядаThraustochytriales, который включает семейство Thraustochytriaceae, и термин "лабиринтулид" относится к любому представителю отряда Labyrinthulales, который включает семейство Labyrinthulaceae. Предста-5 022841 вители семейства Labyrinthulaceae ранее считали представителями отряда Thraustochytriales, но при недавнем пересмотре таксономической классификации таких организмов семейство Labyrinthulaceae теперь считают представителем отряда Labyrinthulales. Как Labyrinthulales, так и Thraustochytriales считают представителями вида Labyrinthulomycota. Теоретики таксономии теперь обычно располагают обе данные группы микроорганизмов вместе с водорослями или с подобными водорослям протистами, происходящими от Stramenopile. Современное таксономическое положение траустохитрид и лабиринтулид резюмировано далее: Царство: Stramenopila (хромисты). Вид: Labyrinthulomycota (гетероконты). Класс: Labyrinthulomycetes (Labyrinthulae). Отряд: Labyrinthulales. Семейство: Labyrinthulaceae. Отряд: Thraustochytriales. Семейство: Thraustochytriaceae. Для целей настоящего изобретения штаммы, описанные как траустохитриды, включают следующие организмы: отряд: Thraustochytriales; семейство: Thraustochytriaceae; род: Thraustochythum (виды: sp.arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum,roseum, striatum), Ulkenia (виды: sp. amoeboidea, kerguelensis, minuta, profunda, radiata, sailens, sarkariana,schizochytrops, visurgensis, yorkensis), Schizochytrium (виды: sp. aggregatum, limnaceum, mangrovei,minutum, octosporum), Japonochytrium (виды: sp. marinum), Aplanochythum (виды: sp. haliotidis, kerguelensis, profunda, stocchinoi), Althornia (виды: sp. crouchii), или Elina (виды: sp. marisalba, sinorifica). Для целей настоящего изобретения, виды, описанные внутри рода Ulkenia, будут считать представителями родаThraustochytrium. Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Botryochytrium, Parietichytrium и Sicyoidochytrium представляют собой дополнительные роды, входящие в вид Labyrinthulomycota в настоящем изобретении. Штаммы, описанные в настоящем изобретении как лабиринтулы, включают следующие организмы: отряд: Labyrinthulales, семейство: Labyrinthulaceae, род: Labyrinthula (виды: sp. algeriensis, coenocystis,chattonii, macrocystis, macrocystis atlantica, macrocystis macrocystis, marina, minuta, roscoffensis, valkanovii,vitellina, vitellina pacifica, vitellina vitellina, zopfii), Labyrinthuloides (виды: sp. haliotidis, yorkensis),Labyrinthomyxa (виды: sp. marina), Diplophrys (виды: sp. archeri), Pyrrhosorus (виды: sp. marinus),Sorodiplophrys (виды: sp. stercorea) или Chlamydomyxa (виды: sp. labyrinthuloides, montana) (хотя на сегодняшний день нет согласия о точном таксономическом положении Pyrrhosorus, Sorodiplophrys илиChlamydomyxa). Клетки микроводорослей вида Labyrinthulomycota включают, но не ограничены перечисленными,депонированные штаммы РТА-10212, РТА-10213, РТА-10214, РТА-10215, РТА-9695, РТА-9696,РТА-9697, РТА-9698, РТА-10208, РТА-10209, РТА-10210, РТА-10211, микроорганизм, депонированный как SAM2179 (названный депонентом "Ulkenia SAM2179"), любые виды Thraustochytrium (включая бывшие виды Ulkenia, такие как visurgensis, U.amoeboida, U.sarkariana, U.profunda, U.radiata, U.minuta иroseum; и любые виды Japonochytrium. Штаммы Thraustochytriales включают, но не ограничены перечисленными, Thraustochytrium sp.Schizochytrium включают, но не ограничены перечисленными, Schizochytrium aggregatum,Schizochytrium limacinum, Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889),Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR 21), депонированный штамм АТСС 28209 и депонированный штамм IFO 32693 Schizochytrium limacinum. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой Schizochytrium или Thraustochytrium.Schizochytrium могут размножаться как последовательным делением, так и путем образования спорангия,который в конечном счете высвобождает зооспоры. Thraustochytrium, тем не менее, размножается исключительно путем образования спорангия, который затем высвобождает зооспоры. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собойLabyrinthulae (также называемые Labyrinthulomycetes). Labyrinthulae образуют уникальные структуры,называемые "эктоплазматическими сетями". Данные структуры представляют собой разветвленные,трубковидные удлинения плазматической мембраны, которые способствуют значительному увеличению площади поверхности плазматической мембраны. См., например, Perkins, Arch. Mikrobiol. 84:95-118(1972); Perkins, Can. J. Bot. 51:485-491 (1973). Эктоплазматические сети образуются из уникальной клеточной структуры, называемой сагеносомой или ботросомой. Эктоплазматическая сеть присоединяет клетки Labyrinthulae к поверхностям и способна проникать в поверхности. См., например, Coleman иVestal, Can. J. Microbiol. 53:841-843 (1987) и Porter, Mycologia. 84:298-299 (1992) соответственно. Например, наблюдали, что Schizochytrium sp. ATCC 20888 образовывали эктоплазматические сети, проникаю-6 022841 щие в агар, когда при выращивании на твердых средах (данные не представлены). В таких примерах эктоплазматическая сеть, по-видимому, действует как псевдоризоид. Дополнительно, было обнаружено,что актиновые филаменты в большом количестве присутствуют в некоторых мембранных удлинениях эктоплазматической сети. См., например, Preston, J. Eukaryot. Microbiol. 52:461-475 (2005). На основании значимости актиновых филаментов для структур цитоскелета в других организмах ожидают, что элементы цитоскелета, такие как актин, играют роль в образовании и/или сохранении целостности мембранных удлинений эктоплазматической сети. Дополнительные организмы, образующие псевдоризоидные удлинения, включают организмы, называемые хитридами, которые таксономически относят к различным группам, включаяChytridiomycota, или Phycomyces. Примеры родов включают Chytrdium, Chytrimyces, Cladochytium,Lacustromyces, Rhizophydium, Rhisophyctidaceae, Rozella, Olpidium и Lobulomyces. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин содержит удлинения на мембране. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин содержит псевдоризоид. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин содержит эктоплазматическую сеть. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин содержит сагеносому или ботросому. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой траустохитрид. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой клеткуSchizochytrium или Thraustochytrium. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой лабиринтулид. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой эукариота, способного осуществлять процессинг полипептидов посредством обычного секреторного пути, такого как представители вида Labyrinthulomycota, включая Schizochytrium, Thraustochytrium и другие траустохитриды. Например, выяснили, что представители вида Labyrinthulomycota продуцируют меньше секретируемых в больших количествах белков, чем клетки CHO, что обеспечивает преимущество примененияN-связанное гликозилирование, которое необходимо для биологической активности некоторых белков. Установили, что N-связанное гликозилирование, обнаруженное у траустохитрид, таких какSchizochytrium, больше, чем гликозилирование у дрожжей, напоминает паттерны гликозилирования млекопитающих. Эффективные условия культивирования для клетки-хозяина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены перечисленными, эффективные среды, биореактор, температуру, рН и содержание кислорода, которые позволяют получить продукцию белка и/или рекомбинацию. Эффективная среда относится к любой среде, в которой обычно культивируют клетку микроводоросли, такую как клетка Thraustochytriales, например клетка-хозяин Schizochytrium. Такая среда обычно включает водную среду, содержащую источники ассимилируемого углерода, азота и фосфата, а также подходящие соли,минералы, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины. Неограничивающие примеры подходящих сред и условий культивирования описаны в разделе "Примеры". Неограничивающие условия культивирования, подходящие для микроорганизмов Thraustochytriales, также описаны в патенте США 5340742, полностью включенном в данное описание посредством ссылки. Клетки согласно настоящему изобретению можно культивировать в обычных ферментационных биореакторах, встряхиваемых колбах, пробирках, микротитрационных планшетах и чашках Петри. Культивирование можно осуществить при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантной клетки. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин согласно настоящему изобретению сдержит рекомбинантный вектор, включающий последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую селекционный маркер. В некоторых вариантах реализации селекционный маркер позволяет осуществить селекцию трансформированных микроорганизмов. Примеры основных селекционных маркеров включают ферменты, которые разрушают соединения с антибиотической или фунгицидной активностью, такие как, например, ген Sh ble из Steptoalloteichus hindustanus, который кодирует "блеомицинсвязывающий белок", представленный в последовательности SEQ ID NO: 5. Другой пример доминантного селекционного маркера включает последовательность ацетолактатсинтазы траустохитрид, такую как мутированный вариант полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6. Ацетолактатсинтазу можно модифицировать, мутировать или другим образом выбрать, чтобы она была устойчива к ингибированию соединениями сульфонилмочевины, ингибиторами класса имидазолинонов и/или пиримидинилоксибензоатами. Типичные примеры последовательностей ацетолактатсинтазы траустохитрид включают,но не ограничены перечисленными, такие последовательности аминокислот, как SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, или последовательность аминокислот, которая отличается от SEQ ID NO: 7 делецией, вставкой или заменой аминокислоты в одном или более из следующих положений: 116G, 117 А, 192 Р, 200 А, 251K, 358 М, 383D, 592V, 595W или 599F, и такие полинуклеотидные последовательности, как SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13, а также последовательно-7 022841 сти, обладающие по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности любой из представленных последовательностей. Дополнительные примеры селекционных маркеров, которые можно включить в рекомбинантный вектор для трансформирования клеток микроводорослей, включают ZEOCIN, паромомицин,гигромицин, бластицидин или любой другой подходящий маркер устойчивости. Термин "трансформация" относится к любому способу, с помощью которого экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты (т.е. рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты) можно вставить в микробные клетки. В микробных системах термин "трансформирование" используют для описания наследуемого изменения в результате приобретения экзогенных нуклеиновых кислот микроорганизмом, и он, по существу, синонимичен термину "трансфекция". Подходящие методики трансформации для введения экзогенных молекул нуклеиновых кислот в микроводорослевые клетки-хозяева включают, но не ограничены перечисленными, бомбардировку частицами, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, адсорбцию, инфекцию и слияние протопластов. Например, экзогенные молекулы нуклеиновых кислот,включая рекомбинантные векторы, можно ввести в клетку микроводоросли, которая находится в стационарной фазе роста, во время экспоненциальной фазы роста или когда клетки микроводорослей достигают оптической плотности от 1,5 до 2 при 600 нм. Микроводорослевую клетку-хозяина также можно предварительно обработать ферментом, обладающим протеазной активностью, перед включением молекулы нуклеиновой кислоты в указанную клетку-хозяина путем электропорации. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин может быть генетически модифицирована путем введения или удаления генов, участвующих в биосинтетических путях, связанных с транспортом и/или синтезом углеводов, включая пути, участвующие в гликозилировании. Например, клетка-хозяин может быть модифицирована путем удаления эндогенных генов гликозилирования и/или встраивания генов гликозилирования человека или животного, чтобы обеспечить паттерны гликозилирования, которые более близко напоминают паттерны гликозилирования у людей. Описание изменения гликозилирования у дрожжей можно найти, например, в патенте США 7029872 и публикациях США 2004/0171826,2004/0230042, 2006/0257399, 2006/0029604 и 2006/0040353. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению также включает клетку, в которой элемент вирусной РНК используют для повышения или регулирования экспрессии генов. Системы экспрессии. Система экспрессии, использованная для экспрессии гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине, включает регуляторные элементы контроля, которые активны в клетках микроводорослей. В некоторых вариантах реализации система экспрессии включает регуляторные элементы контроля, которые активны в клетках Labyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации система экспрессии включает регуляторные элементы контроля, которые активны в клетках траустохитрид. В некоторых вариантах реализации система экспрессии включает регуляторные элементы контроля, которые активны в Schizochytrium или Thraustochytrium. Многие регуляторные элементы контроля, включая различные промоторы, активны во множестве различных видов. Следовательно, регуляторные последовательности можно использовать в типе клеток, идентичном клетке, из которой их выделили, или можно использовать в типе клеток, который отличен от клетки, из которой их выделили. При разработке и конструировании таких кассет экспрессии применяют стандартные методики молекулярной биологии, известные специалистам в данной области. См., например, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3-е изд В некоторых вариантах реализации система экспрессии, использованная для получения гетерологичного полипептида в клетках микроводорослей, включает регуляторные элементы, которые получены из последовательностей Labyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации система экспрессии, использованная для получения гетерологичных полипептидов в клетках микроводорослей, включает регуляторные элементы, которые получены из последовательностей, не принадлежащих Labyrinthulomycota,включая последовательности, полученные из последовательностей водорослей, не относящихся кLabyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации система экспрессии включает полинуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный полипептид, при этом указанная полинуклеотидная последовательность связана с любой последовательностью промотора, любой последовательностью терминатора и/или любыми другими регуляторными последовательностями, которые способны функционировать в микроводорослевой клетке-хозяине. Можно применять индуцибельные или конститутивно активные последовательности. Подходящие регуляторные элементы контроля также включают любые из регуляторных контролирующих элементов, связанных с молекулами нуклеиновых кислот, описанными в данном документе. Настоящее изобретение также относится к кассете экспрессии для экспрессии гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине. Настоящее изобретение также относится к любым из описанных выше клеток-хозяев, содержащих кассету экспрессии для экспрессии гетерологичного полипептида в указанной клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации система экспрессии включает кассету экспрессии, содержащую генетические элементы, такие как, по меньшей мере, промотор, кодирующая последовательность и терминаторный участок, функционально связанные таким образом, что-8 022841 они способны функционировать в клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации указанная кассета экспрессии включает по меньшей мере одну из выделенных молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, описанных в данном описании. В некоторых вариантах реализации все генетические элементы кассеты экспрессии представляют собой последовательности, связанные с выделенными молекулами нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации контролирующие последовательности представляют собой индуцибельные последовательности. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая гетерологичный полипептид, интегрируется в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая гетерологичный полипептид, стабильно интегрирована в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации выделенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая гетерологичный полипептид, который нужно экспрессировать, функционально связана с последовательностью промотора и/или с последовательностью терминатора, обе из которых способны функционировать в клетке-хозяине. Последовательность промотора и/или терминатора, с которой функционально связана выделенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая гетерологичный полипептид, который нужно экспрессировать, может включать любую последовательность промотора и/или терминатора, включая, но не ограничиваясь перечисленными, последовательности нуклеиновых кислот, описанные в данном документе, регуляторные последовательности, описанные в патенте США 7001772, регуляторные последовательности, описанные в публикациях США 2006/0275904 и 2006/0286650, регуляторную последовательность, описанную в публикации США 2010/0233760 и WO 2010/107709, или другие регуляторные последовательности, способные функционировать в клеткехозяине, которая ими трансформирована, которые функционально связаны с выделенной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая гетерологичный полипептид, кодоноптимизирована для использования в определенной микроводорослевой клетке-хозяине, чтобы максимизировать эффективность трансляции. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам, содержащим кассету экспрессии согласно настоящему изобретению. Рекомбинантные векторы включают, но не ограничены перечисленными, плазмиды, фаги и вирусы. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный вектор представляет собой линеаризованный вектор. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный вектор представляет собой вектор экспрессии. В данном описании формулировка "вектор экспрессии" относится к вектору, который подходит для получения кодируемого им продукта (например, интересующего белка). В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую продукт, который нужно получить, вставляют в рекомбинантный вектор для получения рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты. Последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую гетерологичный полипептид, который нужно получить, вставляют в вектор таким образом, что указанная последовательность нуклеиновых кислот оказывается функционально связанной с регуляторными последовательностями в векторе (например, с промотором Thraustochytriales), которые обеспечивают возможность транскрипции и трансляции последовательности нуклеиновых кислот внутри рекомбинантного микроорганизма. В некоторых вариантах реализации селектируемый маркер, включая любой из селектируемых маркеров, описанных в данном документе, позволяет осуществлять селекцию рекомбинантного микроорганизма, в который успешно включили рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый клеткойхозяином согласно настоящему изобретению, получают в промышленном масштабе. Промышленный масштаб включает получение гетерологичного полипептида из микроорганизма, которого выращивали в аэрируемом ферментере объемом 100, 1000, 10000 или 100000 л. В некоторых вариантах реализации получение в промышленном масштабе осуществляют в аэрируемом ферментере с перемешиванием. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый клеткойхозяином согласно настоящему изобретению, может накапливаться внутри клетки или может секретироваться из клетки, например, в культуральную среду в виде растворимого гетерологичного полипептида. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, полученный согласно настоящему изобретению, выделяют из клетки, из культуральной среды или из ферментационной среды, в которой выращивали указанную клетку. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой секретируемый гетерологичный полипептид, который выделяют из культуральных сред в виде растворимого гетерологичного полипептида. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой секретируемый белок, содержащий сигнальный пептид. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, полученный согласно настоящему изобретению, содержит нацеливающий сигнал, направляющий его прикрепление в эндоплазматическом ретикулуме, направляющий его внеклеточную секрецию или направляющий его в другие органеллы или клеточные компартменты. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит сигнальный пептид. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит сигнальный пептид транспортера Na/Pi-IIb2 или транспортного белка Sec1. В некоторых вариантах реализации-9 022841 сигнальный пептид включает последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, содержащий сигнальный пептид, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 37, секретируется в культуральную среду. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид отщепляется от белка в процессе секреции, в результате чего образуется зрелая форма белка. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый клеткойхозяином согласно настоящему изобретению, гликозилирован. В некоторых вариантах реализации паттерн гликозилирования гетерологичного полипептида, полученного согласно настоящему изобретению,более близко напоминает паттерны гликозилирования млекопитающего, чем у белков, полученных в дрожжах или Е.coli. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый микроводорослевой клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, включает паттернN-связанного гликозилирования. Гликозилированные белки, используемые для терапевтических целей, с меньшей вероятностью вызывают иммунные ответы против гликоформы, если их паттерны гликозилирования аналогичны паттернам гликозилирования, обнаруживаемым в испытуемом организме. Наоборот,гликозилированные белки обладающие связями или сахарами, которые не свойственны испытуемому организму, с большей вероятностью будут антигенными. Эффекторные функции также можно модулировать с помощью определенных гликоформ. Например, IgG может опосредовать про- или противовоспалительные реакции в зависимости от отсутствия или присутствия соответственно концевых сиаловых кислот на гликоформах Fc-области (Kaneko et al., Science, 313:670-3 (2006. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения рекомбинантного гетерологичного полипептида, причем указанный способ включает культивирование рекомбинантной микроводорослевой клетки-хозяина согласно настоящему изобретению при условиях, достаточных для экспрессии полинуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный гетерологичный полипептид секретируется из клетки-хозяина, и его выделяют из культуральной среды. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид,который секретируется из клетки, содержит сигнальный пептид для секреции. В зависимости от системы вектора и хозяина, используемой для его получения, рекомбинантный гетерологичный полипептид согласно настоящему изобретению может оставаться внутри рекомбинантной клетки, может секретироваться в ферментационную среду, может секретироваться в пространство между двумя клеточными мембранами или может оставаться на наружной поверхности клеточной мембраны. В данном описании формулировка "выделение белка" относится к сбору ферментационной среды, содержащей указанный белок,и не обязательно подразумевает дополнительные этапы разделения или очистки. Гетерологичные полипептиды, полученные способом согласно настоящему изобретению, можно очистить, применяя целый ряд стандартных методик очистки белка, таких как, но не ограничиваясь перечисленными, аффинная хроматография, ионообменная хроматография, фильтрация, электрофорез, хроматография гидрофобных взаимодействий, гель-фильтрационная хроматография, хроматография с обращенными фазами, хроматография по сродству конканавалина А, хроматофокусировка и дифференциальное растворение. В некоторых вариантах реализации гетерологичные полипептиды, полученные способом согласно настоящему изобретению, выделяли "по существу в чистом" виде. В данном описании "по существу чистый" относится к чистоте, которая позволяет эффективное использование гетерологичного полипептида в качестве промышленного продукта. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный гетерологичный полипептид накапливается внутри клетки, и его выделяют из клетки. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин согласно указанному способу представляет собой траустохитрид. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин согласно указанному способу представляет собой Schizochytrium или Thraustochytrium. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный гетерологичный полипептид представляет собой терапевтический белок, пищевой фермент или промышленный фермент. В некоторых вариантах реализации рекомбинантная микроводорослевая клетка-хозяин представляет собойSchizochytrium и рекомбинантный гетерологичный полипептид представляет собой терапевтический белок, который содержит сигнальную последовательность для секреции. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный вектор согласно настоящему изобретению представляет собой нацеливающий вектор. В данном описании формулировка "нацеливающий вектор" относится к вектору, который применяют для доставки определенной молекулы нуклеиновой кислоты в рекомбинантную клетку, при этом указанную молекулу нуклеиновой кислоты используют для удаления или инактивирования эндогенного гена внутри клетки-хозяина (т.е. используют для направленного разрушения гена или нокаутной технологии). Такой вектор также известен как "нокаутный" вектор. В некоторых вариантах реализации часть нацеливающего вектора обладает последовательностью нуклеиновых кислот, которая гомологична последовательности нуклеиновых кислот целевого гена в клетке-хозяине(т.е. гена, который направлен на удаление или инактивацию). В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты, вставленная в вектор (т.е. вставка), гомологична целевому гену. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновых кислот векторной вставки разработана таким образом, что она связывается с целевым геном так, что целевой ген и вставка подвергаются гомологичной рекомбинации, посредством которой эндогенный целевой ген удаляется, инактивируется или атте- 10022841 нуируется (т.е. путем мутирования или удаления по меньшей мере части эндогенного целевого гена). Изолированные молекулы нуклеиновых кислот/ В соответствии с настоящим изобретением изолированная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которую удалили из естественного окружения (т.е. которую подвергли манипулированию человеком), при этом ее естественное окружение представляет собой геном или хромосому, в которой указанная молекула нуклеиновой кислоты встречается в природе. По существу, "изолированная" не обязательно отражает степень, до которой молекула нуклеиновой кислоты была очищена, но указывает на то, что молекула не включает весь геном или всю хромосому, в которой указанная молекула нуклеиновой кислоты встречается в природе. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты может включать ДНК, РНК (например, мРНК) или производные либо ДНК, либо РНК (например, кДНК). Хотя формулировка "молекула нуклеиновой кислоты", главным образом, относится к физической молекуле нуклеиновой кислоты и формулировки "последовательность нуклеиновых кислот" или "полинуклеотидная последовательность", главным образом,относятся к последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты, указанные формулировки используют взаимозаменяемо, в частности, в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, полинуклеотидной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты, которая способна кодировать гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах реализации изолированную молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению получают, применяя технологию рекомбинантной ДНК (например, амплификацию путем полимеразной цепной реакции (ПЦР), клонирование) или химический синтез. Изолированные молекулы нуклеиновых кислот включают природные молекулы нуклеиновых кислот и их гомологи, включая, но не ограничиваясь перечисленными, природные аллельные варианты и модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, в которых нуклеотиды были вставлены,удалены, замещены и/или инвертированы таким образом, что такие модификации обеспечивают желательное влияние на последовательность, функцию и/или биологическую активность кодируемого гетерологичного полипептида. Последовательность нуклеиновых кислот, комплементарная последовательности промотора, последовательности терминатора, последовательности сигнального пептида или любой другой последовательности, относится к последовательности нуклеиновых кислот нити нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нити с последовательностью промотора, последовательностью терминатора, последовательностью сигнального пептида или любой другой последовательностью. Должно быть очевидно, что двунитевая ДНК включает однонитевую ДНК и комплементарную ей нить, обладающую последовательностью, которая комплементарна указанной однонитевой ДНК. По существу, молекулы нуклеиновых кислот могут быть либо двунитевыми, либо однонитевыми и включают такие молекулы нуклеиновых кислот, которые образуют стабильные гибриды в "жестких" условиях гибридизации с последовательностью согласно настоящему изобретению и/или с последовательностью, комплементарной последовательности согласно настоящему изобретению. Способы определения комплементарной последовательности известны специалистам в данной области. Термин "полипептид" включает однонитевые полипептидные молекулы, а также комплексы множества полипептидов, в которых отдельные составляющие комплекс полипептиды связаны с помощью ковалентных или нековалентных способов. Согласно настоящему изобретению изолированный полипептид представляет собой полипептид, который удалили от естественного окружения (т.е. который подвергли манипулированию человеком), и он может включать, например, очищенные белки, очищенные пептиды, частично очищенные белки, частично очищенные пептиды, полученные рекомбинантным способом белки или пептиды и полученные синтетическим способом белки или пептиды. В данном описании рекомбинантный микроорганизм обладает геномом, который был модифицирован (т.е. мутирован или изменен) по сравнению с нормальной (т.е. дикого типа или встречающейся в природе) формой путем применения рекомбинантной технологии. Рекомбинантный микроорганизм согласно настоящему изобретению может включать микроорганизм, в котором молекулы нуклеиновых кислот были вставлены, удалены или модифицированы (т.е. мутированы, например, путем вставки, делеции, замены и/или инверсии нуклеотидов) таким образом, что такая модификация или модификации обеспечивают желательный эффект в микроорганизме. В данном описании генетические модификации,которые приводят к снижению экспрессии генов, функции гена или функции продукта гена (т.е. белка,кодируемого данным геном), можно называть инактивацией (полной или частичной), делецией, нарушением, блокировкой или понижающей регуляцией гена. Например, генетическая модификация гена, которая приводит к снижению функции белка, кодируемого таким геном, может произойти в результате полной делеции гена (т.е. ген отсутствует в рекомбинантном микроорганизме и, следовательно, белок отсутствует в рекомбинантном микроорганизме), мутации в гене, которая приводит к неполной трансляции или отсутствию трансляции белка (например, белок не экспрессируется), или мутации в гене, которая снижает или нарушает природную функцию белка (например, экспрессируется белок, который обладает пониженной активностью или не обладает активностью (например, ферментативной активностью или действием. Генетические модификации, которые приводят к повышению экспрессии или функции генов, можно называть усилением, чрезмерной продукцией, чрезмерной экспрессией, активацией, стиму- 11022841 лированием, увеличением или повышающей регуляцией гена. Промоторы. Промотор представляет собой участок ДНК, который направляет транскрипцию связанного с ним кодирующего участка. В некоторых вариантах реализации промотор получен из микроорганизма вида Labyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации промотор получают из траустохитрид, включая, но не ограничиваясь перечисленными, микроорганизм, депонированный как SAM2179 (названный депонентом "UlkeniaSAM2179"), микроорганизм рода Ulkenia или Thraustochytrium, или Schizochytrium. Schizochytrium включают, но не ограничены перечисленными, Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum,Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889), Schizochytrium sp.(LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR 21), депонированный штамм ATCC 28209 Schizochytrium и депонированный штамм IFO 32693 Schizochytrium. Промотор может обладать промоторной активностью, по меньшей мере, у траустохитрид и включает полноразмерные последовательности промотора и их функциональные фрагменты, слитые последовательности и гомологи встречающегося в природе промотора. Гомолог промотора отличается от встречающегося в природе промотора тем, что по меньшей мере один, два, три или несколько нуклеотидов были удалены, вставлены, инвертированы, замещены и/или дериватизированы. Гомолог промотора может сохранять активность в качестве промотора, по меньшей мере, у траустохитрид, хотя активность может быть повышена, снижена или может стать зависимой от некоторых стимулов. Промоторы могут содержать один или более элементов последовательности, которые придают регуляторный контроль над экспрессией в зависимости от стадии развития и типа ткани. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты, описанная в данном документе, содержит промотор OrfC PUFA PKS ("промотор OrfC PKS"; также известный как промотор PFA3), как, например, полинуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 3. Промотор OrfC PKS включает гомолог промотора OrfC PKS, который достаточно схож с встречающейся в природе последовательностью промотора OrfC PKS, таким образом, что последовательность нуклеиновых кислот указанного гомолога способна гибридизоваться при умеренно, высоко или очень высоко жестких условиях с последовательностью, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот встречающегося в природе промотора OrfC PKS, такого как, например, SEQ ID NO: 3 или промотор OrfCpCL0001, депонированный в АТСС под номером доступа РТА-9615. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению содержит короткий промотор EF1 ("короткий EF1" или "EF1-K" промотор) или длинный промотор EF1 ("длинный EF1" или "EF1-Д" промотор), такой как, например, короткий промотор EF1, представленный последовательностью SEQ ID NO: 42, или длинный промотор EF1, представленный последовательностью SEQ ID NO: 43. Короткий или длинный промотор EF1 включает гомолог короткого или длинного промотора EF1, который достаточно схож с встречающейся в природе короткой и/или длинной последовательностью промотора EF1, соответственно, таким образом, что последовательность нуклеиновых кислот гомолога способна гибридизоваться при умеренно, высоко или очень высоко жестких условиях с последовательностью, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот встречающегося в природе короткого и/или длинного промотора EF1, такого как, например,SEQ ID NO: 42 и/или SEQ ID NO: 43 соответственно, или длинный промотор EF1 рАВ 0018, депонированный в АТСС под номером доступа РТА-9616. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению содержит короткий промотор 60S ("60S короткий" или "60S-K" промотор) или длинный промотор 60S ("60S длинный" или "60S-Д" промотор), такой как, например, короткий промотор 60S, представленный последовательностью SEQ ID NO: 44, или длинный промотор 60S, который имеет полинуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах реализации короткий или длинный промотор 60S включает гомолог короткого или длинного промотора 60S,который достаточно схож с встречающейся в природе последовательностью короткого или длинного промотора 60S соответственно, таким образом, что последовательность нуклеиновых кислот гомолога способна гибридизоваться при умеренно, высоко или очень высоко жестких условиях с последовательностью, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот встречающегося в природе короткого и/или длинного промотора 60S, такого как, например, SEQ ID NO: 44 и/или SEQ ID NO: 45 соответственно, или длинный промотор 60S рАВ 0011, депонированный в АТСС под номером доступа РТА-9614. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит промотор Sec1 ("промотор Sec1"), например, как полинуклеотидная последовательность, представленнаяSEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах реализации промотор Sec1 включает гомолог промотора Sec1,который достаточно схож с встречающейся в природе последовательностью промотора Sec1, таким образом, что последовательность нуклеиновых кислот гомолога способна гибридизоваться при умеренно,высоко или очень высоко жестких условиях с последовательностью, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот встречающегося в природе промотора Sec1, такого как, например,SEQ ID NO: 46, или промотор Sec1 pAB0022, депонированный в АТСС под номером доступа РТА-9613.- 12022841 Терминаторы. Терминаторный участок представляет собой участок генетической последовательности, который отмечает конец последовательности гена в геномной ДНК для транскрипции. В некоторых вариантах реализации терминаторный участок получен из микроорганизма видаLabyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации терминаторный участок получен из траустохитрид. В некоторых вариантах реализации терминаторный участок получен из Schizochytrium илиThraustochytrium. Schizochytrium включают, но не ограничены перечисленными, Schizochytrium(ATCC 20889), Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR 21), депонированный штамм АТСС 28209 и депонированный штамм IFO 32693. В некоторых вариантах реализации терминаторный участок представляет собой гетерологичный терминаторный участок, такой как, например, гетерологичный терминаторный участок SV40. Терминаторный участок может обладать терминирующей активностью, по меньшей мере, у траустохитрид и включает полноразмерные последовательности терминатора и их функциональные фрагменты, слитые последовательности и гомологи встречающегося в природе участка терминатора. Гомолог терминатора отличается от встречающегося в природе терминатора тем, что по меньшей мере один или несколько, но не ограничиваясь одним или несколькими, нуклеотидов были удалены, вставлены, инвертированы, замещены и/или дериватизированы. В некоторых вариантах реализации гомологи терминатора сохраняют активность в качестве участков терминатора, по меньшей мере, в траустохитридах, хотя эта активность может быть повышена, снижена или может быть зависимой от каких-либо стимулов. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать терминаторный участок гена OrfC PUFA PKS ("терминаторный участок OrfC PKS", также известный как терминатор PFA3) как, например, полинуклеотидная последовательность, представленнаяSEQ ID NO: 4. Терминаторный участок, описанный в последовательности SEQ ID NO: 4, представляет собой встречающуюся в природе последовательность терминатора (дикого типа) из микроорганизма траустохитриды и, в частности, представляет собой терминаторный участок OrfC PKS Schizochytrium и назван "терминирующий элемент 1 OrfC". В некоторых вариантах реализации терминаторный участок OrfCPKS включает гомолог участка терминатора OrfC PKS, который достаточно схож с встречающимся в природе участком терминатора OrfC PUFA PKS, таким образом, что последовательность нуклеиновых кислот гомолога способна гибридизоваться при умеренно, высоко или очень высоко жестких условиях с последовательностью, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот встречающегося в природе участка терминатора OrfC PKS, такого как, например, SEQ ID NO: 4 или терминаторный участок OrfC pAB0011, депонированный в АТСС под номером доступа РТА-9614. Сигнальные пептиды. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид секретируемого белка из микроорганизма вида Labyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации микроорганизм представляет собой траустохитрид. В некоторых вариантах реализации микроорганизм представляет собойSchizochytrium или Thraustochytrium. Сигнальный пептид может обладать активностью сигнала секреции в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида. Гомолог сигнального пептида отличается от встречающегося в природе сигнального пептида тем, что по меньшей мере одна или несколько, но не ограничиваясь одной или несколькими, аминокислот были удалены (например, укороченная версия белка, такая как пептид или фрагмент), вставлены, инвертированы, замещены и/или дериватизированы (например, путем гликозилирования, фосфорилирования, ацетилирования, миристилирования, пренилирования, пальмитирования, амидирования и/или добавления гликозилфосфатидилинозита). В некоторых вариантах реализации гомологи сигнального пептида сохраняют активность в качестве сигнала, по меньшей мере, в траустохитридах, хотя эта активность может быть повышена, снижена или может стать зависимой от некоторых стимулов. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид белка-транспортера Na/Pi-IIb2. Сигнальный пептид белка-транспортера Na/Pi-IIb2 обладает сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для белка-транспортера Na/Pi-IIb2, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида белка-транспортера Na/Pi-IIb2. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид белка-транспортера Na/Pi-IIb2 имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид белкатранспортера Na/Pi-IIb2 имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностьюSEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью SEQ ID NO: 1 илиSEQ ID NO: 15, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белкатранспортера Na/Pi-IIb2, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность SEQ ID NO: 2. Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида транспортера Na/Pi-IIb2. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа-1,6-маннозилтрансферазы(ALG12). Сигнальный пептид ALG12 может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для белка ALG12, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида ALG12. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид ALG12 имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью SEQ ID NO: 59. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью SEQ ID NO: 59, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белка ALG12, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность SEQ ID NO: 60. Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида ALG12. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид связывающего иммуноглобулин белка (BiP). Сигнальный пептид BiP может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для белка BiP, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида BiP. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид BiP имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью SEQ ID NO: 61. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью SEQ ID NO: 61, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белка BiP, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность SEQ ID NO: 62. Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида BiP. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа-1,3-глюкозидазы (GLS2). Сигнальный пептид GLS2 может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере,для белка GLS2, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептидаGLS2. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид GLS2 имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью SEQ ID NO: 63, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белка GLS2, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность SEQ ID NO: 64. Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида GLS2. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа-1,3-1,6-маннозидазаподобного белка. Сигнальный пептид альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка,по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностьюSEQ ID NO: 65, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность- 14022841 Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа-1,3-1,6-маннозидазаподобного белка 1. Сигнальный пептид альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1 может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида альфа 1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид альфа 1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1 имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностьюSEQ ID NO: 67, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательностьSEQ ID NO: 68. Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка. Сигнальный пептид альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью SEQ ID NO: 69. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью SEQ ID NO: 69, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность SEQ ID NO: 70. Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид бета-ксилозидаза-подобного белка. Сигнальный пептид бета-ксилозидаза-подобного белка может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для бета-ксилозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида бета-ксилозидаза-подобного белка. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид бета-ксилозидаза-подобного белка имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью SEQ ID NO: 71, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для бета-ксилозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность SEQ ID NO: 72. Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида бета-ксилозидаза-подобного белка. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид каротин-синтазы. Сигнальный пептид каротин-синтазы может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для белка каротин-синтазы, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида каротин-синтазы. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид каротин-синтазы имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью SEQ ID NO: 73. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью SEQ ID NO: 73, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белка каротин-синтазы, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательностьSEQ ID NO: 74. Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида каротин-синтазы. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид белка Sec1 ("Sec1"). Сигнальный пептид Sec1 может обладать сигнальной секреторной активностью, по меньшей мере, для белка Sec1, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида Sec1. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид Sec1 представлен последовательностью SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью SEQ ID NO: 37, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белка Sec1, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательностьSEQ ID NO: 38. Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида Sec1. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность промотора, последовательность терминатора и/или последовательность сигнального пептида, которая по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична любой из последовательностей промотора, терминатора и/или сигнального пептида, описанного в данном документе. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает промотор OrfC, короткий промотор EF1, длинный промотор EF1, короткий промотор 60S, длинный промотор 60S, промотор Sec1, терминаторный участок OrfC PKS, последовательность, кодирующую сигнальный пептид белка-транспортера Na/Pi-IIb2, или последовательность, кодирующую сигнальный пептид транспортного белка Sec1, которые функционально связаны с 5'-концом последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей гетерологичный полипептид. Рекомбинантные векторы (включая, но не ограничиваясь, векторы экспрессии), кассеты экспрессии и клетки-хозяева также могут содержать промоторOrfC, короткий промотор EF1, длинный промотор EF1, короткий промотор 60S, длинный промотор 60S,промотор Sec1, терминаторный участок OrfC PKS, последовательность, кодирующую сигнальный пептид белка-транспортера Na/Pi-IIb2, или последовательность, кодирующую сигнальный пептид транспортного белка Sec1, которые функционально связаны с 5'-концом последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей гетерологичный полипептид. В данном описании, если не указано иное, указание процента (%) идентичности (и % идентичный) относится к оценке гомологии, которую осуществляют, применяя (1) поиск гомологии в BLAST 2.0 BasicBLAST с помощью blastp для поиска аминокислот и blastn для поиска нуклеиновых кислот со стандартными параметрами по умолчанию, при этом запрашиваемую последовательность фильтруют по умолчанию на участки низкой сложности (см., например, Altschul, S., et al., Nucleic Aacid Res. 25:3389-3402(1997), которая полностью включена в данное описание посредством ссылки); (2) выравнивание с помощью BLAST 2, используя параметры, описанные ниже; (3) и/или PSI-BLAST (BLAST с позиционноспецифичными итерациями) со стандартными параметрами по умолчанию. Стоит отметить, что вследствие некоторых различий в стандартных параметрах между BLAST 2.0 Basic BLAST и BLAST 2, у двух определенных последовательностей может обнаружиться существенная гомология при применении программы BLAST 2, тогда как поиск, выполненный в BLAST 2.0 Basic BLAST с применением одной из последовательностей в качестве запрашиваемой последовательности может не идентифицировать вторую последовательность среди максимально совпадающих. Кроме того, в PSI-BLAST предусмотрена автоматизированная, удобная в обращении версия "профиля" поиска, что обеспечивает более чувствительный способ определения гомологов последовательностей. Программа сначала осуществляет поиск в базе данных с помощью BLAST с использованием гэпов. Программа PSI-BLAST использует полученную информацию о любых существенных выравниваниях для создания позиционно-специфичной матрицы замен, которая заменяет запрашиваемую последовательность для следующего раунда поиска в базе данных. Следовательно, должно быть очевидно, что процент идентичности можно определить, применяя любую из данных программ. Две определенные последовательности можно выровнять друг с другом, применяя выравнивание последовательностей BLAST 2, как описано, например, у Tatusova и Madden, FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250 (1999), которая полностью включена в данное описание посредством ссылки. Выравнивание последовательностей с помощью BLAST 2 осуществляют, применяя blastp или blastn, используя алгоритм BLAST 2.0 для осуществления поиска в BLAST с использованием гэпов (BLAST 2.0) гомологии между двумя последовательностями, с позволением включения гэпов (делеций и вставок) в полученном в результате этого выравнивании. В некоторых вариантах реализации выравнивание последовательностей в BLAST 2 осуществляют, применяя стандартные параметры по умолчанию, описанные далее.- 16022841 Для blastn, с применением матрицы 0 BLOSUM62: Награда за совпадение = 1. Штраф за несовпадение = -2. Штрафы за открытие гэпа (5) и продление гэпа (2), сокращение гэпа на(50), ожидается (10), длина слова (11), фильтр (включен). Для blastp, с применением матрицы 0 BLOSUM62: Штрафы за открытие гэпа (11) и продление гэпа (1), сокращение гэпа на(50), ожидается (10),длина слова (3), фильтр (включен). В данном описании условия гибридизации относятся к стандартным условиям гибридизации, в которых молекулы нуклеиновых кислот используют для идентификации аналогичных молекул нуклеиновых кислот. См., например, Sambrook J. и Russell D. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-e изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, которое полностью включено в данное описание посредством ссылки. Вдобавок, формулы для вычисления подходящих условий гибридизации и промывки, чтобы добиться гибридизации, позволяющей различные степени несовпадения нуклеотидов, описаны, например, у Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138:267-284 (1984), которая полностью включена в данное описание посредством ссылки. Специалист в данной области может применять формулы, описанные у Meinkoth et al., например, для вычисления подходящих условий гибридизации и промывки, чтобы добиться определенных уровней несовпадения нуклеотидов. Такие условия будут изменяться в зависимости от того, образовались ли гибриды ДНК:РНК или ДНК:ДНК. Рассчитанные температуры плавления для гибридов ДНК:ДНК меньше на 10 С, чем для гибридов ДНК:РНК. В определенных вариантах реализации строгие условия гибридизации для гибридов ДНК:ДНК включают гибридизацию при ионной силе 6 Х SSC (0,9 М Na+) и при температуре между 20 и 35 С (низкая строгость), между 28 и 40 С (большая строгость) и между 35 и 45 С (еще большая строгость), при подходящих условиях промывки. В определенных вариантах реализации строгие условия гибридизации для гибридов ДНК:РНК включают гибридизацию при ионной силе 6 Х SSC (0,9 М Na+) и при температуре между 30 и 45 С, между 38 и 50 С и между 45 и 55 С, при условиях промывки аналогичной строгости. Данные значения получают на основании вычисления температуры плавления для молекул, больших приблизительно 100 нуклеотидов, при 0% формамида и при содержании G+C пар приблизительно 40%. В качестве альтернативы Tm можно рассчитать опытным путем, как описано у Sambrook et al. Обычно условия промывки должны быть настолько строгими, насколько это возможно, и должны подходить для выбранных условий гибридизации. Например, условия гибридизации могут включать комбинацию условий содержания соли и температуры, которая приблизительно на 20-25 С ниже рассчитанной Tm для конкретного гибрида, и условия промывки обычно включают комбинацию условий содержания соли и температуры,которая приблизительно на 12-20 С ниже рассчитанной Tm для конкретного гибрида. Один пример условий гибридизации, подходящих для применения для гибридов ДНК:ДНК, включает гибридизацию в течение 2-24 ч в 6 Х SSC (50% формамида) при 42 С, а затем этапы промывки, которые включают одну или более промывок при комнатной температуре в 2 Х SSC, а затем дополнительные промывки при более высоких температурах и более низкой ионной силе (например, по меньшей мере одну промывку при 37 С в 0,1 Х-0,5 Х SSC, а затем по меньшей мере одну промывку при 68 С в 0,1 Х-0,5 Х SSC). Гетерологичные полипептиды. Термин "гетерологичный" в данном документе относится к последовательности, которая не встречается в природе в микроводорослевой клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации гетерологичные полипептиды, продуцируемые рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены перечисленными, терапевтические белки. "Терапевтический белок" в данном документе включает белки, которые полезны для лечения или предупреждения заболеваний, состояний или расстройств у животных и людей. В некоторых вариантах реализации терапевтические белки включают, но не ограничены перечисленными, биологически активные белки, например ферменты, антитела или антигенные белки. В некоторых вариантах реализации гетерологичные полипептиды, продуцируемые рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены промышленными ферментами. Промышленные ферменты включают, но не ограничены перечисленными, ферменты, которые используют при производстве, получении, сохранении, мобилизации питательных веществ или переработке продуктов, включая пищевые, медицинские, химические, механические и другие промышленные продукты. В некоторых вариантах реализации гетерологичные полипептиды, продуцируемые рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, включают ауксотрофный маркер, доминантный селекционный маркер (такой как, например, фермент, который снижает активность антибиотика) или другой белок, вовлеченный в селекцию трансформантов, белок, который функционирует как репортер,фермент, вовлеченный в гликозилирование белка, и фермент, вовлеченный в метаболизм клетки. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, включает вирусный белок, выбранный из группы,- 17022841 состоящей из белка Н или HA (гемагглютинина), белка N или NA (нейраминидазы), гибридного белкаgp41 (гликопротеина размером 41 кДа). В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид,продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, представляет собой вирусный белок матрикса. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, представляет собой вирусный белок матрикса, выбранный из группы, состоящей из M1, M2 (мембранный белок канала), Gag и комбинации перечисленных. В некоторых вариантах реализации HA, NA, F, G, E, gp120, gp41 или белок матрикса получены из вирусного источника, например из вируса гриппа или вируса кори. Грипп представляет собой основную причину смертей у человека, связанных с заражением респираторным вирусом. Обычные симптомы включают жар, боль в горле, одышку и мышечную боль и др. Вирусы гриппа представляют собой оболочечные вирусы, которые отпочковываются от плазматической мембраны инфицированных клеток млекопитающих и птиц. Их классифицируют на типы А, В или С на основании присутствующих нуклеопротеидов и антигенных белков матрикса. Вирусы гриппа типа А дополнительно подразделяются на подтипы в зависимости от комбинации присутствующих поверхностных гликопротеинов HA и NA. HA представляет собой антигенный гликопротеин и играет роль в связывании вируса с клетками, которые становятся инфицированными. NA удаляет концевые остатки сиаловой кислоты из гликановых цепей на клетке-хозяине и белках вирусной поверхности, что предотвращает аггрегацию вируса и способствует подвижности вируса. Белок вируса гриппа HA представляет собой гомотример с карманом, связывающим рецептор, на глобулярной головке каждого мономера, и белок вируса гриппа NA представляет собой тетрамер с ферментативно активным сайтом на головке каждого мономера. На сегодняшний день идентифицировано 16 подтипов HA (H1-H16) и 9 подтипов NA (N1-N9). Каждый вирус гриппа типа А презентирует один тип гликопротеина HA и один тип гликопротеина NA. Как правило, каждый подтип проявляет видоспецифичность; например, известно, что все подтипы HA и NA заражают птиц, тогда как было показано, что только подтипы H1, Н 2, Н 3, Н 5, Н 7, Н 9, Н 10, N1, N2, N3 и N7 заражают людей. Вирусы гриппа характеризуют по типу HA и NA, которые они несут, например H1N1, H5N1, H1N2, H1N3, H2N2, H3N2, H4N6,H5N2, H5N3, H5N8, H6N1, H7N7, H8N4, H9N2, H10N3, H11N2, H11N9, H12N5, H13N8, H15N8, H16N3 и т.д. Подтипы дополнительно подразделяются на штаммы; каждый выделенный генетически отличный вирус, как правило, считают отдельным штаммом, например грипп A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1) и грипп A/Vietnam/1203/2004(H5N1). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения HA получают из вируса гриппа, например HA получают из вируса гриппа типа А, вируса гриппа типа В или из подтипа вируса гриппа типа А, выбранного из группы, состоящей из H1, Н 2, Н 3, Н 4, Н 5, Н 6,Н 7, Н 8, Н 9, Н 10, Н 11, Н 12, Н 13, Н 14, Н 15 и Н 16. В другом варианте реализации HA получают из вируса гриппа типа А, выбранного из группы, состоящей из H1, Н 2, Н 3, Н 5, Н 6, Н 7 и Н 9. В одном варианте реализации HA получают из подтипа вируса гриппа Н 1N1. Белок HA вируса гриппа транслируется в клетках в виде единого белка, который после отщепления сигнального пептида представляет собой белок с молекулярной массой приблизительно 62 кДа (согласно предсказанной трансляции), называемый HA0 (т.е. белок-предшественник гемагглютинина). Для активации вируса белок-предшественник гемагглютинина (НА 0) должен быть расщеплен трипсин-подобной сериновой эндопротеазой в определенном сайте, обычно кодируемом одной основной аминокислотой(обычно аргинином) между полипептидами HA1 и HA2 белка. В конкретном примере штамма A/PuertoRico/8/34 такое расщепление осуществляют между аргинином в положении 343 и глицином в положении 344. После расщепления двух связанных дисульфидной связью полипептидов получают зрелые формы субъединиц белка, что является необходимым условием для конформационного изменения, необходимого для слияния, и, следовательно, для инфекционной способности вируса. В некоторых вариантах реализации белок HA согласно настоящему изобретению расщепляется, например белок HA0 согласно настоящему изобретению расщепляется на HA1 и HA2. В некоторых вариантах реализации экспрессия белка HA в микроводорослевой клетке-хозяине, такой как Schizochytrium,приводит к правильному расщеплению белка HA0 на способные функционировать полипептиды HA1 иHA2 без добавления экзогенной протеазы. Такое расщепление гемагглютинина в системе экспрессии беспозвоночных без добавления экзогенной протеазы ранее не было продемонстрировано. Вирусный гибридный белок может содержать трансмембранный домен, один раз пронизывающий мембрану, рядом с С-концом. гибридный белок можно расщепить на два пептида в сайте расщепления фурином (аминокислота 109). Первая часть белка, обозначенная F2, включает N-концевой участок целого гибридного белка. Оставшуюся часть вирусного гибридного белка, содержащую С-концевой участок гибридного белка, обозначают F1. К участкам F1 и/или F2 можно отдельно присоединить гетерологичные последовательности, такие как, например, последовательность, кодирующая гетерологичный сигнальный пептид. Векторы, содержащие участки F1 и F2 вирусного гибридного белка, можно экспрессировать отдельно или в комбинации. Вектор, экспрессирующий целый гибридный белок, можно экспрессировать совместно с ферментом фурином, который расщепит белок в сайте расщепления фурином. В качестве альтернативы, последовательность, кодирующую сайт расщепления фурином гибридного белка,- 18022841 можно заменить на последовательность, кодирующую сайт расщепления альтернативной протеазой, которая распознается и расщепляется отличной протеазой. Гибридный белок, содержащий сайт расщепления альтернативной протеазой, можно экспрессировать совместно с соответствующей протеазой, которая распознает и расщепляет сайт расщепления альтернативной протеазой. В некоторых вариантах реализации HA, NA, F, G, E, gp120, gp41 или белок матрикса представляет собой полноразмерный белок, его фрагмент, вариант, производное или аналог. В некоторых вариантах реализации HA, NA, F, G, E, gp120, gp41 или белок матрикса представляет собой полипептид, содержащий последовательность аминокислот, или полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий последовательность аминокислот по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99 или на 100% идентичную известной последовательности соответствующих вирусных белков, при этом указанный полипептид способен узнаваться антителом, которое специфично связывается с известной последовательностью. Последовательность HA, например, может представлять собой полноразмерный белок HA, который состоит, по существу, из внеклеточного (ECD) домена, трансмембранного (ТМ) домена и цитоплазматического (CYT) домена; или фрагмент целого белка HA, который состоит, по существу, из полипептида HA1 и полипептида HA2, например, полученный в результате расщепления полноразмерного HA; или фрагмент целого белка HA, который состоит, по существу, из полипептида HA1, полипептида HA2 и домена ТМ; или фрагмент целого белка HA, который состоит, по существу, из домена CYT; или фрагмент целого белка HA, который состоит, по существу, из домена ТМ; или фрагмент целого белка HA, который состоит, по существу, из полипептида HA1; или фрагмент целого белка HA, который состоит, по существу, из полипептида HA2. Последовательность HA также может включать сайт расщепления HA1/НА 2. Сайт расщепления HA1/НА 2 может располагаться между полипептидами HA1 и HA2, но также может располагаться в любом порядке относительно других последовательностей полинуклеотидной или полипептидной конструкции. Вирусные белки можно получить из патогенного штамма вируса. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид согласно настоящему изобретению представляет собой гибридный полипептид, включающий полноразмерный HA, NA, F, G, E, gp120, gp41 или белок матрикса, или его фрагмент, вариант, производное или аналог. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой гибридный полипептид, включающий полипептид HA0, полипептид HA1, полипептид HA2, домен ТМ, их фрагменты и комбинации. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид включает комбинации двух или более из полипептида HA1, полипептида HA2, домена ТМ или их фрагментов из различных подтипов или различных штаммов вируса, например, из различных подтипов или штаммов вируса гриппа. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид включает комбинации двух или более из полипептида HA1, полипептида HA2, домена ТМ или их фрагментов из различных вирусов, например, из вируса гриппа и вируса кори. Гемагглютинирующую активность можно определить путем измерения агглютинации эритроцитов. Гемагглютинация и последующая преципитацияэритроцитов происходит в результате адсорбции гемагглютининов на поверхности эритроцитов. В процессе гемагглютинации образуются кластеры эритроцитов, различимые невооруженным глазом как скопления, комки и/или сгустки. Гемагглютинация вызывается взаимодействием агглютиногенов, присутствующих в эритроцитах, с плазмой, которая содержит агглютинины. Каждому агглютиногену соответствует определенный агглютинин. Реакцию гемагглютинации используют, например, для определения активности антисыворотки или типа вируса. Различают активную гемагтлютинацию, которая вызывается непосредственным действием агента на красные кровяные клетки, и пассивную гемагглютинацию, вызванную антисывороткой, специфичной к антигену,ранее адсорбированному на эритроцитах. Величину гемагглютинирующей активности в образце можно измерить, например, в единицах гемагглютинирующей активности (ГАЕ). Гемагглютинация может быть вызвана, например, полисахаридами бактерий, вызывающих туберкулез, чуму и туляремию, полисахаридами кишечной палочки и вирусами гриппа, свинки, пневмонии белой мыши, гриппом свиней и лошадей, противооспенной вакциной, желтой лихорадкой и другими вызывающими гемагглютинацию заболеваниями. Внеклеточные микроводорослевые тельца. Настоящее изобретение также относится к внеклеточному тельцу микроводоросли, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной. Под формулировкой "не соединено с плазматической мембраной" понимают, что внеклеточное микроводорослевое тельце не присоединено к плазматической мембране клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой мембрану. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой везикулу, мицеллу, фрагмент мембраны, агрегат мембран или их смесь. Термин "везикула" в данном описании относится к замкнутой структуре, содержащей липидный бислой (элементарной мембране), например к пузырьковой структуре, образованной клеточной мембраной. Термин "агрегат мембран" в данном описании относится к любому скоплению мембранных структур, которые соединились в единую массу. Агрегат мембран может представлять собой скопление одного типа мембранных структур,- 19022841 таких как, но не ограничиваясь перечисленными, скопление мембранных везикул, или может представлять собой скопление более чем одного типа мембранных структур, таких как, но не ограничиваясь перечисленными, скопление по меньшей мере двух из везикулы, мицеллы или фрагмента мембраны. Термин"фрагмент мембраны" в данном описании относится к любой части мембраны, способной включать гетерологичный полипептид, описанный в данном документе. В некоторых вариантах реализации фрагмент мембраны представляет собой мембранный слой. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой смесь везикулы и фрагмента мембраны. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой везикулу. В некоторых вариантах реализации везикула представляет собой схлопнувшуюся везикулу. В некоторых вариантах реализации везикула представляет собой подобную вирусу частицу. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой агрегат биологических материалов, содержащий нативные и гетерологичные полипептиды, продуцированные клеткой-хозяином. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой агрегат нативных и гетерологичных полипептидов. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой агрегат гетерологичных полипептидов. В некоторых вариантах реализации эктоплазматическая сеть микроводорослевой клетки-хозяина фрагментируется в процессе культивирования микроводорослевой клетки-хозяина, что приводит к образованию внеклеточного микроводорослевого тельца. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце образуется путем фрагментации эктоплазматической сети микроводорослевой клетки-хозяина в результате действия гидродинамических сил в перемешиваемых средах, которые физически срезают мембранные удлинения эктоплазматической сети. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце образуется при выпячивании мембраны микроводоросли, например, но не ограничиваясь перечисленными, при выпячивании плазматической мембраны, эктоплазматической сети, псевдоризоида или их комбинации, при этом выпяченная мембрана отделяется от плазматической мембраны. В некоторых вариантах реализации внеклеточные микроводорослевые тельца представляют собой везикулы или мицеллы, обладающие различными диаметрами, фрагменты мембран, обладающие различными длинами, или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой везикулу, обладающую диаметром 10-2500 нм, 10-2000 нм, 10-1500 нм, 10-1000 нм, 10-500 нм, 10-300 нм, 10-200 нм,10-100 нм, 10-50 нм, 20-2500 нм, 20-2000 нм, 20-1500 нм, 20-1000 нм, 20-500 нм, 20-300 нм, 20-200 нм,20-100 нм, 50-2500 нм, 50-2000 нм, 50-1500 нм, 50-1000 нм, 50-500 нм, 50-300 нм, 50-200 нм, 50-100 нм,100-2500 нм, 100-2000 нм, 100-1500 нм, 100-1000 нм, 100-500 нм, 100-300 нм, 100-200 нм, 500-2500 нм,500-2000 нм, 500-1500 нм, 500-1000 нм, 2000 нм или менее, 1500 нм или менее, 1000 нм или менее,500 нм или менее, 400 нм или менее, 300 нм или менее, 200 нм или менее, 100 нм или менее или 50 нм или менее. Неограничивающие условия ферментации для получения внеклеточных микроводорослевых телец из траустохитридовых клеток-хозяев представлены в таблице. Обычные условия культивирования для получения внеклеточных микроводорослевых телец описаны далее: В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце получают в клеткехозяине Labyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце получают в клетке-хозяине Labyrinthulae. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводо- 21022841 рослевое тельце получают в траустохитридной клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце получают в Schizochytrium или Thraustochytrium. Настоящее изобретение также направлено на внеклеточное микроводорослевое тельце, содержащее гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной микроводорослевой клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце согласно настоящему изобретению содержит полипептид, который также связан с плазматической мембраной микроводорослевой клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации полипептид, связанный с плазматической мембраной микроводорослевой клетки-хозяина, включает нативный мембранный полипептид, гетерологичный полипептид и их комбинацию. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержится внутри внеклеточного микроводорослевого тельца. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит мембранный домен. Термин "мембранный домен" в данном описании относится к любому домену внутри полипептида, который нацеливает полипептид на заякоревание в мембране и/или позволяет полипептиду поддерживать связь с мембраной, и включает, но не ограничен перечисленными, трансмембранный домен (например,участок, один или множество раз пронизывающий мембрану), интегральный монотопный домен, сигнальную якорную последовательность, сигнальную последовательность доставки в ЭР, N-концевой, или внутренний, или С-концевой сигнал остановки процесса переноса, гликозилфосфатидилинозитоловый якорь и комбинации перечисленных. Мембранный домен может быть расположен в любом положении в полипептиде, включая N-конец, С-конец или середину полипептида. Мембранный домен может обеспечивать постоянное или временное присоединение полипептида к мембране. В некоторых вариантах реализации мембранный домен можно отщепить от мембранного белка. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой сигнальную якорную последовательность. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой любую из сигнальных якорных последовательностей, показанных на фиг. 13, или якорную последовательность, полученную из них. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой вирусную сигнальную якорную последовательность. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой полипептид,который по природе содержит мембранный домен. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид по природе не содержит мембранный домен, но был рекомбинантно слит с мембранным доменом. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой в противном случае растворимый белок, который был слит с мембранным доменом. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен микроводорослей. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен Labyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен траустохитрид. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен Schizochytrium или Thraustochytrium. В некоторых вариантах реализации мембранный домен включает сигнальную якорную последовательность из альфа-1,3-маннозил-бета 1,2-G1cNac-трансфераза-1-подобного белка 1Schizochytrium (SEQ ID NO: 84). В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой мембранный белок. Термин "мембранный белок" в данном описании относится к любому белку, присоединенному или связанному с клеточной мембраной. У Chou и Elrod, Proteins: Structure, Function and Genetics, 34:137153 (1999), описано, например, что мембранные белки можно классифицировать на различные основные типы. 1) Мембранные белки I типа: данные белки содержат один трансмембранный домен в зрелом белке.N-конец внеклеточный, а С-конец - цитоплазматический. N-конец таких белков обычно содержит классическую последовательность сигнального пептида, которая направляет белок на импорт в ЭР. Указанные белки подразделяются на тип Ia (содержащий отщепляемую сигнальную последовательность) и типIb (без отщепляемой сигнальной последовательности). Примеры мембранных белков I типа включают,но не ограничены перечисленными, HA вируса гриппа, рецептор инсулина, гликофорин, рецептор ЛПНП и вирусные G-белки. 2) Мембранные белки II типа: у данных белков, содержащих один трансмембранный домен,С-конец внеклеточный, а N-конец - цитоплазматический. На N-конце может находиться сигнальная якорная последовательность. Примеры белков этого типа включают, но не ограничены перечисленными,нейраминидазу вируса гриппа, галактозилтрансферазу аппарата Гольджи, сиалилтрансферазу аппарата Гольджи, предшественник сахаразы-изомальтазы, асиалогликопротеиновый рецептор и рецептор трансферрина. 3) Белки, множество раз пронизывающие мембрану: в мембранных белках I и II типа полипептид- 22022841 пересекает липидный бислой один раз, тогда как в белках, множество раз пронизывающих мембрану,полипептид пересекает мембрану множество раз. Трансмембранные белки, множество раз пронизывающие мембрану, также подразделяются на типы IIIa и IIIb. Белки типа IIIa содержат отщепляемые сигнальные последовательности. Аминоконцы белков типа IIIb выходят на внешнюю поверхность мембраны, но не содержат отщепляемой сигнальной последовательности. Белки типа IIIa включают, но не ограничены перечисленными, пептиды М и L фотореакционного центра. Белки типа IIIb включают, но не ограничены перечисленными, цитохром Р 450 и лидерную пептидазу Е.coli. Дополнительные примеры трансмембранных белков, множество раз пронизывающих мембрану, представляют собой мембранные транспортеры, такие как транспортеры сахаров (глюкозы, ксилозы) и ионные транспортеры. 4) Мембранные белки, заякоренные с помощью липидной цепи: данные белки связаны с мембранным бислоем посредством одной или более ковалентно присоединенных цепей жирных кислот или других типов липидных цепей, называемых пренильными группами. 5) ГФИ-заякоренные мембранные белки: данные белки связаны с мембраной посредством гликозилфосфатидилинозитолового якоря (ГФИ). 6) Периферические мембранные белки: данные белки связаны с мембраной не напрямую, путем нековалентных взаимодействий с другими мембранными белками. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен белка HA. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит нативную сигнальную якорную последовательность или нативный мембранный домен из полипептида дикого типа, соответствующего гетерологичному полипептиду. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид слит с гетерологичной сигнальной якорной последовательностью или гетерологичным мембранным доменом, которые отличны от нативной сигнальной якорной последовательности или нативного мембранного домена. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит гетерологичную сигнальную якорную последовательность или гетерологичный мембранный домен, тогда как полипептид дикого типа, соответствующий указанному гетерологичному полипептиду, не содержит какой-либо сигнальной якорной последовательности или мембранного домена. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит сигнальную якорную последовательностьSchizochytrium. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит мембранный домен HA. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой терапевтический полипептид. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен из любого из мембранных белков I типа, показанных на фиг. 14, или мембранный домен, полученный из него. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид согласно настоящему изобретению представляет собой гибридный полипептид, содержащий пронизывающий мембрану участок на С-конце из любого из мембранных белков, показанных на фиг. 14. В некоторых вариантах реализации С-концевая сторона пронизывающего мембрану участка дополнительно модифицирована путем замены на аналогичный участок из вирусного белка. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой гликопротеин. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид обладает паттерном гликозилирования,характерным для экспрессии в клетке Labyrinthulomycota. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид обладает паттерном гликозилирования, характерным для экспрессии в клетке траустохитрид. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, который экспрессируется в микроводорослевой клетке-хозяине, представляет собой гликопротеин, обладающий паттерном гликозилирования, который более близко напоминает паттерны гликозилирования у млекопитающего, чем паттерны у белков, полученных в дрожжах или Е.coli. В некоторых вариантах реализации паттерн гликозилирования включает паттерн N-связанного гликозилирования. В некоторых вариантах реализации гликопротеин включает олигосахариды с высоким содержанием маннозы. В некоторых вариантах реализации гликопротеин, по существу свободен от сиаловой кислоты. Термин "по существу свободен от сиаловой кислоты" в данном описании означает содержание сиаловой кислоты менее чем 10%, менее чем 9%, менее чем 8%, менее чем 7%, менее чем 6%, менее чем 5%, менее чем 4%, менее чем 3%, менее чем 2% или менее чем 1%. В некоторых вариантах реализации сиаловая кислота отсутствует в гликопротеине. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце согласно настоящему изобретению, содержащее гетерологичный полипептид, получают в коммерческом или промышленном масштабе. Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей любое из внеклеточных микроводорослевых телец согласно настоящему изобретению, описанных в данном документе, и водный жидкий носитель. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце согласно настоящему изобретению, содержащее гетерологичный полипептид, выделяют из культуральной среды или ферментационной среды, в которой выращивали микроводорослевую клетку-хозяина. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце согласно настоящему изобретению можно выделить"по существу чистом" в виде. В данном описании "по существу чистый" относится к чистоте, которая позволяет эффективное применение внеклеточного микроводорослевого тельца в качестве коммерческого или промышленного продукта. Настоящее изобретение также относится к способу получения внеклеточного микроводорослевого тельца, содержащего гетерологичный полипептид, указанный способ включает:(a) экспрессию гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине, при этом указанный гетерологичный полипептид содержит мембранный домен; и(b) культивирование клетки-хозяина в условиях культивирования, обеспечивающих образование внеклеточного микроводорослевого тельца, содержащего гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной клетки-хозяина. Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции, содержащей внеклеточное микроводорослевое тельце и гетерологичный полипептид, указанный способ включает:(а) экспрессирование гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине, при этом указанный гетерологичный полипептид содержит мембранный домен; и(b) культивирование клетки-хозяина в условиях культивирования, обеспечивающих образование внеклеточного микроводорослевого тельца, содержащего гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной клетки-хозяина, и при этом указанную композицию получают в виде культурального супернатанта, содержащего внеклеточное тельце. В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает удаление культурального супернатанта и ресуспендирование внеклеточного тельца в водном жидком носителе. В некоторых вариантах реализации композицию применяют в качестве вакцины. Внеклеточные микроводорослевые тельца, содержащие вирусные полипептиды. Белки оболочки вируса представляют собой мембранные белки, которые формируют наружный слой вирусных частиц. При синтезе данных белков используют мембранные домены, такие как клеточные нацеливающие сигналы, чтобы направить белки на плазматическую мембрану. Белки оболочки подразделяются на несколько основных групп, которые включают, но не ограничены перечисленными, белки Н или HA (гемагглютинин), белки N или NA (нейраминидазу), F (гибридные белки), G (гликопротеин), белок Е или env (белок оболочки), gp120 (гликопротеин размером 120 кДа) и gp41 (гликопротеин размером 41 кДа). Структурные белки, которые обычно называют белками "матрикса", служат для стабилизации вируса. Белки матрикса включают, но не ограничены перечисленными, M1, M2 (мембранный белок канала) и Gag. Как белки оболочки, так и белки матрикса могут участвовать в сборке и функционировании вируса. Например, экспрессия белков оболочки вируса отдельно или в сочетании с вирусными белками матрикса может привести к образованию вирусоподобных частиц (ВПЧ). Вирусные вакцины часто получают из инактивированных или аттенуированных препаратов вирусных культур в соответствии с заболеванием, которое они должны предотвращать, и, как правило, в них сохраняется вирусный материал, такой как вирусный генетический материал. Как правило, вирус культивируют в том же типе клеток, который вирус может заразить в природе, или в близком типе клеток. Такая культура клеток дорого стоит и часто ее сложно получать в промышленном масштабе. Для решения данной проблемы некоторые определенные вирусные антигены, вместо этого, экспрессируют в трансгенном хозяине, которого может быть дешевле культивировать и легче получать в промышленном масштабе. Тем не менее, вирусные белки обычно представляют собой интегральные мембранные белки,присутствующие в вирусной оболочке. Так как мембранные белки очень трудно получать в больших количествах, данные вирусные белки, как правило, модифицируют, чтобы получить растворимую форму белков. Данные белки оболочки вируса важны для формирования иммунитета у хозяина, но многие попытки экспрессировать их целиком или частично в гетерологичных системах имели ограниченный успех,предположительно потому, что белок должен быть презентирован иммунной системе в составе вирусной оболочки, чтобы быть достаточно иммуногенным. Таким образом, существует потребность в новых системах гетерологичной экспрессии, таких как системы экспрессии согласно настоящему изобретению,которые можно применять в промышленном масштабе и которые способны презентировать вирусные антигены, свободные или по существу свободные от связанного вирусного материала, такого как вирусный генетический материал, отличного от желательных вирусных антигенов. Термин "по существу свободный от связанного вирусного материала" в данном описании означает количество связанного вирусного материала менее чем 10%, менее чем 9%, менее чем 8%, менее чем 7%, менее чем 5%, менее чем 4%, менее чем 3%, менее чем 2% или менее чем 1%. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце включает гетерологичный полипептид, который представляет собой вирусный гликопротеин, выбранный из группы, состоящей из белка Н или HA (гемагглютинина), белка N или NA (нейраминидазы), гибридного белка (F),G (гликопротеина), белка Е или env (белка оболочки), gp120 (гликопротеина размером 120 кДа) и gp41(гликопротеина размером 41 кДа) и комбинации перечисленных белков. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце содержит гетерологичный полипептид, который представляет собой вирусный белок матрикса. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце содержит вирусный белок матрикса, выбранный из группы, состоящей из M1, M2 (мембран- 24022841 ного белка канала) Gag и комбинации перечисленных. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце содержит комбинацию двух или более вирусных белков, выбранных из группы, состоящей из белка Н или HA (гемагглютинина), белка N или NA (нейраминидазы), гибридного белка (F), G (гликопротеина), белка Е или env (белка оболочки), gp120 (гликопротеина размером 120 кДа) иgp41 (гликопротеина размером 41 кДа) и вирусного белка матрикса. В некоторых вариантах реализации внеклеточные микроводорослевые тельца согласно настоящему изобретению содержат вирусные гликопротеины, в которых отсутствует сиаловая кислота, которая, в противном случае, препятствовала бы накоплению или функционированию белка. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце представляет собой ВПЧ. Термин "ВПЧ" в данном описании относится к частицам, которые морфологически сходны с инфекционным вирусом, и которые могут образовываться путем спонтанной самосборки вирусных белков,когда вирусные белки экспрессируются в избыточном количестве. ВПЧ были получены в клетках дрожжей, насекомых и млекопитающих и оказались эффективным и более безопасным типом субъединичной вакцины, так как они имитируют полную структуру вирусных частиц, но при этом не содержат инфекционный генетический материал. Данный тип системы доставки вакцины эффективно стимулировал клеточные и гуморальные ответы. Исследования на парамиксовирусах показали, что полученные при совместном экспрессировании вирусных белков ВПЧ были очень похожи по размеру и плотности на настоящие вирионы. Экспрессия белка матрикса (M) отдельно была необходима и достаточна для образования ВПЧ. Для парамиксовируса экспрессия HN отдельно приводила к очень низкой эффективности образования ВПЧ. Других белков отдельно было недостаточно для отпочковывания вируса ньюкаслской болезни (ВНБ). HN представляет собой мембранный гликопротеин II типа, который присутствует на вирионе и поверхностях инфицированных клеток в виде тетрамерного выступа. См., например, Collins P.L. и Mottet G., J. Virol. 65:23622371 (1991); Mirza A.M. et al., J. Biol. Chem. 268:21425-21431 (1993) и Ng D. et al., J. Cell. Bio. 109:32733289 (1989). Взаимодействия с M-белком отвечали за включение белков HN и NP в ВПЧ. См., например,Pantua et al., J. Virology, 50:11062-11073 (2006). ВПЧ вируса гепатита В (HBV) или вируса папилломы человека (HPV) представляют собой простые ВПЧ, которые не имеют оболочки и которые продуцируются в результате экспрессии одного или двух капсидных белков. Более сложные ВПЧ, которые не имеют оболочки, включают такие частицы, как ВПЧ, разработанные для африканской катаральной лихорадки. В данном случае, четыре из основных структурных белков вируса африканской катаральной лихорадки (BTV, семейство Reoviridae) экспрессировали одновременно в клетках насекомых. Также были получены ВПЧ из вирусов с липидными оболочками (например, вируса гепатита С и гриппа А). Также существуют ВПЧ-подобные структуры, такие как самособирающиеся полипептидные наночастицы (SAPN), которые могут повторно представлять антигенные эпитопы. Их использовали для разработки потенциальной вакцины против малярии. См., например, Kaba S.A. et al., J. Immunol. 183 (11):7268-7277 (2009). ВПЧ обладают существенными преимуществами, состоящими в том, что они способны вызывать иммунитет, сравнимый с живыми аттенуированными или инактивированными вирусами, кроме того, их считают высокоиммуногенными благодаря тому, что они имеют форму частиц, и тому, что они презентируют поверхностные эпитопы плотно повторяющимся массивом. Например, предполагают, что В-клетки специфично распознают антигены в форме частиц с расстояниями между эпитопами от 50 до 100 как чужеродные. См. Bachman et al., Science, 262:1448 (1993). ВПЧ также обладают размером частиц, который считают значительно способствующим их поглощению дендритными клетками и макрофагами. Вдобавок, частицы от 20 до 200 нм свободно диффундируют в лимфатические узлы, тогда как частицы от 500 до 2000 нм не могут туда проникнуть. Существует по меньшей мере две одобренные для применения людьми вакцины ВПЧ: вакцина против вируса гепатита В (HBV) и вакцина против вируса папилломы человека (HPV). Тем не менее, ВПЧ на основе вируса, такие как ВПЧ на основе бакуловируса, часто содержат большие количества вирусного материала, что требует дополнительной очистки ВПЧ. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце представляет собой ВПЧ, содержащую вирусный гликопротеин, выбранный из группы, состоящей из белка Н или HA (гемагглютинина), белка N или NA (нейраминидазы), гибридного белка (гибридного белка), G-белка (гликопротеина), белка Е или env (белка оболочки), gp120 (гликопротеина размером 120 кДа) и gp41 (гликопротеина размером 41 кДа) и комбинации перечисленных белков. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце представляет собой ВПЧ, содержащую вирусный белок матрикса. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце представляет собой ВПЧ, содержащую вирусный белок матрикса, выбранный из группы, состоящей из M1, М 2 (мембранного белка канала), Gag и комбинации перечисленных белков. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце представляет собой ВПЧ, содержащую комбинацию двух или более вирусных белков, выбранных из группы, состоящей из белка Н или HA (гемагглютинина), белка N или NA- 25022841 Способы применения внеклеточных микроводорослевых телец. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце согласно настоящему изобретению можно применять в качестве носителя для белковой активности или функции. В некоторых вариантах реализации белковая активность или функция связана с гетерологичным полипептидом, присутствующим внутри или на поверхности внеклеточного тельца. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой мембранный белок. В некоторых вариантах реализации белковая активность или функция связана с полипептидом, который связывается с мембранным белком,присутствующим во внеклеточном тельце. В некоторых вариантах реализации белок не способен функционировать в растворимой форме, но способен функционировать, являясь частью внеклеточного тельца согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце, содержащее транспортер сахара (такой как, например, транспортер ксилозы, сахарозы или глюкозы), можно применять для очистки от следовых количеств сахара сред, содержащих смеси сахаров или других низкомолекулярных растворенных веществ, путем захвата сахара внутрь везикул, которые затем можно отделить с помощью различных способов, включая фильтрацию или центрифугирование. Настоящее изобретение также включает применение любого из внеклеточных микроводорослевых телец согласно настоящему изобретению, содержащих гетерологичный полипептид, и композиций с ними, в терапии животных или людей, от предупредительной терапии до лечения заболеваний. Термины "лечить" и "лечение" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам, при этом задачей является предупреждение или замедление(уменьшение) нежелательного физиологического состояния, заболевания или нарушения, или получение полезных или желательных клинических результатов. Для целей настоящего изобретения полезные или желательные клинические результаты включают, но не ограничены перечисленными, облегчение или устранение симптомов или признаков, связанных с состоянием, заболеванием или нарушением; уменьшение степени развития состояния, заболевания или нарушения; стабилизирование состояния, заболевания или нарушения (т.е. когда состояние, заболевание или расстройство не ухудшается); задержку начала или прогрессирования состояния, заболевания или нарушения; снижение выраженности состояния, заболевания или нарушения; ремиссию (либо частичную, либо полную, и либо детектируемую, либо недетектируемую) состояния, заболевания или нарушения; или коррекцию или улучшение состояния, заболевания или нарушения. Лечение включает получение клинически значимого ответа без возникновения избыточных побочных эффектов. Лечение также включает продление времени выживания по сравнению с ожидаемым при отсутствии лечения. В некоторых вариантах реализации любое из внеклеточных микроводорослевых телец согласно настоящему изобретению, содержащих гетерологичный полипептид, получают в культуральном супернатанте для непосредственного применения в качестве вакцины для животного или человека. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце, содержащее гетерологичный полипептид, очищают согласно требованиям целевого способа применения, например введения в качестве вакцины. Для применения в качестве обычной вакцины у человека супернатант, полученный путем низкоскоростного центрифугирования, подвергнут первичной очистке путем концентрирования(например, с помощью тангенциальной поточной фильтрации, а затем ультрафильтрации), хроматографического разделения (например, с помощью анионообменной хроматографии), гель-фильтрации и стерилизации (например, путем фильтрации через стерильный 0,2 мкм фильтр). В некоторых вариантах реализации в вакцине согласно настоящему изобретению отсутствуют потенциально аллергенные белки,такие как, например, яичный белок. В некоторых вариантах реализации в вакцине, содержащей внеклеточное тельце согласно настоящему изобретению, отсутствует любой вирусный материал, отличный от вирусного полипептида, связанного с внеклеточным тельцем. Согласно описанным способам внеклеточное микроводорослевое тельце, содержащее гетерологичный полипептид, или композицию, содержащую тельце, можно вводить, например, внутримышечным(в/м), внутривенным (в/в), подкожным (п/к) или внутрилегочным путями. Другие подходящие пути введения включают, но не ограничены перечисленными, введение внутритрахеальным, трансдермальным,внутриглазным, интраназальным, ингаляционным, внутриполостным, внутрипротоковым (например, в поджелудочную железу) и интрапаренхиматозным (например, в любую ткань) путем. Трансдермальная доставка включает, но не ограничена внутрикожным (например, в дерму или эпидерму), трансдермальным (например, чрескожным) и чресслизистым (например, в или через кожу или слизистую ткань) введением. Внутриполостное введение включает, но не ограничено введением в ротовую, вагинальную, ректальную, назальную, перитонеальную и кишечную полости, а также, интратекальным (например, в позвоночный канал), интравентрикулярным (например, в желудочки мозга или в желудочки сердца), внутрипредсердным (например, в предсердие) и субарахноидальным (например, в субарахноидальное пространство мозга) введением. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение включает композиции, содержащие внеклеточное микроводорослевое тельце, которое содержит гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах реализации композиция содержит водный жидкий носитель. В дополнительных вариантах реализации водный жидкий носитель представляет собой культуральный супернатант. В некоторых ва- 26022841 риантах реализации композиции согласно настоящему изобретению содержат обычные фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, известные в данной области, такие как, но не ограничиваясь перечисленными, человечий сывороточный альбумин, ионообменники, оксид алюминия, лецитин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия и соли или электролиты,такие как сульфат протамина, а также вспомогательные вещества, перечисленные, например, вRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21-e изд. (2005). Любой из вариантов реализации, описанных в данном документе, который направлен на внеклеточное микроводорослевое тельце, в качестве альтернативы может быть направлен на внеклеточное тельце хитриды. Наиболее эффективный способ введения и схема приема лекарственного средства для композиций согласно настоящему изобретению зависит от тяжести и течения заболевания, состояния здоровья субъекта и его реакции на лечение, а также от мнения лечащего врача. Соответственно, дозировки композиций должны титроваться в зависимости от конкретного субъекта. Тем не менее, эффективная доза композиций согласно настоящему изобретению может находиться в диапазоне 1-2000 мг/кг, 1-1500 мг/кг,1-1000 мг/кг, 1-500 мг/кг, 1-250 мг/кг, 1-100 мг/кг, 1-50 мг/кг, 1-25 мг/кг, 1-10 мг/кг, 500-2000 мг/кг,500-1500 мг/кг, 500-1000 мг/кг, 100-2000 мг/кг, 100-1500 мг/кг, 100-1000 мг/кг или 100-500 мг/кг. После прочтения описания настоящего изобретения в целом дополнительное понимание можно получить путем обращения к примерам, приведенным в данном описании. Данные примеры приведены исключительно для иллюстрирования и не предполагаются ограничивающими настоящее изобретение. Пример 1. Конструирование вектора экспрессии pCL0143. Синтезировали вектор экспрессии pCL0143 (фиг. 2) и последовательность проверили путем секвенирования по Сенгеру с помощью DNA 2.0 (Менло Парк, Калифорния). Вектор pCL0143 содержал промотор из гена фактора элонгации-1 (EF1) Schizochytrium, чтобы направлять экспрессию трансгена HA,терминатор OrfC (также известный как терминатор PFA3), следующий за трансгеном HA, и кассету с селекционным маркером, придающим устойчивость к антибиотику паромомицину.(H1N1. Белковая последовательность совпадает с последовательностью в GenBank под номером доступа ААМ 75158. Определенную последовательность нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 76 подвергали оптимизации кодонов и синтезировали для экспрессии в Schizochytrium с помощью DNA 2.0, руководствуясь таблицей использования кодонов Schizochytrium, показанной на фиг. 16. Также получали конструкт,используя альтернативный сигнальный пептид, при этом сигнальный пептид с последовательностьюSEQ ID NO: 76 (первый 51 нуклеотид) удаляли и заменяли на полинуклеотидную последовательность,кодирующую сигнальный пептид Sec1 Schizochytrium (SEQ ID NO: 38). Пример 2. Экспрессия и исследование белка HA, продуцируемого в Schizochytrium.Schizochytrium sp. ATCC 20888 использовали в качестве клетки-хозяина для трансформации вектором pCL0143 с помощью устройства для бомбардировки частицами Biolistic (BioRad, Геркулес, Калифорния). Вкратце, культуры Schizochytrium sp. ATCC 20888 выращивали в среде М 2 В, состоящей из 10 г/л глюкозы, 0,8 г/л (NH4)2SO4, 5 г/л Na2SO4, 2 г/л MgSO47H2O, 0,5 г/л KH2PO4, 0,5 г/л KCl, 0,1 г/лCaCl22H2O, 0,1 М MES (рН 6,0), 0,1% композиции металлов РВ 26 Metals и 0,1% композиции витаминов РВ 26 Vitamins (об./об.). Витамины РВ 26 состояли из 50 мг/мл витамина В 12, 100 мкг/мл тиамина и 100 мкг/мл Са-пантотената. рН металлов РВ 26 подводили до 4,5, и металлы РВ 26 состояли из 3 г/лFeSO47H2O, 1 г/л MnCl24H2O, 800 мг/мл ZnSO47H2O, 20 мг/мл CoCl26H2O, 10 мг/мл Na2MoO42H2O,600 мг/мл CuSO45H2O и 800 мг/мл NiSO46H2O. Концентрированные растворы РВ 26 отдельно стерилизовали путем фильтрации и добавляли в питательную среду после автоклавирования. Глюкозу, KH2PO4 иCaCl22H2O автоклавировали отдельно от остальных ингредиентов питательной среды перед смешиванием, чтобы предотвратить выпадение солей и карамелизацию углеводов. Все ингредиенты среды приобретали в Sigma Chemical (Сент-Луис, Миссури). Культуры Schizochytrium выращивали до логарифмической фазы и трансформировали с помощью устройства для бомбардировки частицами Biolistic(BioRad, Геркулес, Калифорния). Процедура трансформации Biolistic была, по существу, такой же, как описано ранее (см. Apt et al., J. Cell. Sci. 115 (Pt. 21):4061-9 (1996) и патент США 7001772). Селекцию первичных трансформантов проводили на твердых средах М 2 В, содержащих 20 г/л агара (VWR, Западный Честер, Пенсильвания), 10 мкг/мл сульфометурон-метила (SMM) (Chem. Service, Западный Честер,Пенсильвания) после 2-6 дней инкубирования при 27 С. Геномную ДНК из первичных трансформантов pCL0143 экстрагировали, очищали и использовали в качестве матрицы для ПЦР, чтобы проверить присутствие трансгена. Протокол экстрагирования геномной ДНК Schizochytrium. Трансформанты Schizochytrium выращивали в 50 мл среды. 25 мл культуры в стерильных условиях переносили пипеткой в 50 мл коническую пробирку и центрифугировали в течение 4 мин при 3000g для получения осадка. Супернатант удаляли и осадок хранили при -80 С до использования. Осадок ресуспендировали приблизительно в 4-5 объемах раствора, состоящего из 20 мМ Tris рН 8, 10 мМ EDTA, 50 мМ NaCl, 0,5% ДСН и 100 мкг/мл протеиназыK в 50 мл конической пробирке. Осадок инкубировали при 50 С при плавном покачивании в течение 1 ч.- 27022841 После лизирования добавляли 100 мкг/мл РНКазы А и раствор оставляли на качалке в течение 10 мин при 37 С. Затем добавляли 2 объема смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт и раствор оставляли на качалке при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем центрифугировали при 8000g в течение 15 мин. Переносили супернатант в чистую пробирку. Снова добавляли 2 объема смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт и раствор оставляли на качалке при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем центрифугировали при 8000g в течение 15 мин и переносили супернатант в чистую пробирку. К полученному супернатанту добавляли равный объем хлороформа и раствор оставляли на качалке при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор центрифугировали при 8000g в течение 15 мин и переносили супернатант в чистую пробирку. К полученному супернатанту добавляли равный объем хлороформа и раствор оставляли на качалке при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор центрифугировали при 8000g в течение 15 мин и переносили супернатант в чистую пробирку. В супернатант добавляли 0,3 объема 3 М NaOAc и 2 объема 100% EtOH, затем оставляли на качалке в течение нескольких минут. ДНК наматывали на стерильную стеклянную палочку и погружали в 70 % EtOH на 1-2 мин. ДНК переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл и позволяли ей высохнуть на воздухе в течение 10 мин. В ДНК добавляли до 0,5 мл предварительно нагретого ЕВ и помещали ее на 4 С на ночь. Замороженные маточные растворы трансгенного Schizochytrium (трансформированного pCL0143) выращивали в М 50-20 до достижения конфлюэнтности, а затем оставляли размножиться во встряхиваемых 50 мл колбах с отбойниками при 27 С, 200 об/мин в течение 48 ч, если не указано иное, в среде, содержащей следующие компоненты (на 1 л): Объем доводили до 900 мл деионизованной H2O и рН подводили до 6,5, если не указано иное, перед автоклавированием в течение 35 мин. Затем добавляли в среду стерилизованные путем фильтрации глюкозу (50 г/л), витамины (2 мл/л) и металлические микроэлементы (2 мл/л) и подводили объем до одного литра. В растворе витаминов содержалось 0,16 г/л витамина В 12, 9,75 г/л тиамина и 3,33 г/л Сапантотената. В растворе металлических микроэлементов (рН 2,5) содержался 1,00 г/л лимонной кислоты,5,15 г/л FeSO47 Н 2 О, 1,55 г/л MnCl24H2O, 1,55 г/л ZnSO47H2O, 0,02 г/л CoCl26H2O, 0,02 г/лNa2MoO42H2O, 1,035 г/л CuSO45H2O и 1,035 г/л NiSO46H2O. Культуры Schizochytrium переносили в 50 мл конические пробирки и центрифугировали при 3000g или 4500g в течение 15 мин. См. фиг. 3. Супернатант, полученный в результате такого центрифугирования, названный "бесклеточным супернатантом" (БКС), использовали для анализа методом иммуноблоттинга и анализа гемагглютинирующей активности. Бесклеточный супернатант (БКС) дополнительно подвергали ультрацентрифугированию при 100000g в течение 1 ч. См. фиг. 3. Полученный в результате этого осадок (нерастворимая фракция или"HP"), содержащий белок HA, ресуспендировали в ФБР, рН 7,4. Полученную суспензию центрифугировали (120000g,18 ч, 4 С) в ступенчатом градиенте плотности сахарозы, содержащем растворы сахарозы от 15 до 60%. См. фиг. 3. Фракцию с 60% сахарозой, содержащую белок HA, использовали для анализа пептидной последовательности, анализа гликозилирования, а также анализа методом электронной микроскопии. Анализ методом иммуноблоттинга. Экспрессию рекомбинантного белка HA из трансгенного CL0143-9 Schizochytrium ("E") проверили путем анализа методом иммуноблоттинга в соответствии со стандартной процедурой иммуноблотинга. Белки из бесклеточного супернатанта (БКС) разделяли путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ/ДСН) на 12% бис-трис-геле NuPAGE Novex (Invitrogen,Карлсбад, Калифорния) при восстановительных условиях с электродным буфером МОПС-ДСН, если не указано иное. Белки затем окрашивали кумасси бриллиантовым синим (SimplyBlue Safe Stain, Invitrogen,Карлсбад, Калифорния) или переносили на поливинилиденфторидную мембрану и исследовали на присутствие белка HA с помощью антисыворотки кролика против вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)(разведение 1:1000, подарок от доктора Albert D.M.E. Osterhaus; Fouchier R.A.M. et al., J. Virol. 79:28142822 (2005, а затем вторичного антитела против IgG (Fc) кролика, связанного с щелочной фосфатазой- 28022841 раствором 5-бром-4-хлор-3-индоил-фосфат/нитросинего тетразолия (BCIP/NBT), следуя инструкции производителя (KPL, Гейтерсберг, Мэриленд). Окрашенные антителами против H1N1 иммуноблоты трансгенной CL0143-9 Schizochytrium ("E"), которую выращивали при различных рН (5,5, 6,0, 6,5 и 7,0) и различных температурах (25, 27, 29 С), показаны на фиг. 4 А. В качестве отрицательного контроля ("С") использовали штамм дикого типа Schizochytrium sp. АТСС 20888. Рекомбинантный белок HA обнаружили в бесклеточном супернатанте при рН 6,5 (фиг. 4 А) и наибольшую гемагглютинирующую активность обнаружили при рН 6,5, 27 С (фиг. 4 А). Гели, окрашенные кумасси бриллиантовым синим ("Кумасси"), и соответствующие окрашенные антителами против H1N1 иммуноблоты ("ИБ: анти-Н 1N1") для CL0143-9("Е"), который выращивали при рН 6,5, 27 С, показаны на фиг. 4 В, при невосстановительных и восстановительных условиях. В качестве отрицательного контроля ("С") использовали штамм дикого типаSchizochytrium sp. ATCC 20888. Активность HA. Активность белка HA, продуцированного Schizochytrium, оценивали путем анализа гемагглютинирующей активности. Функциональный белок HA проявляет гемагглютинирующую активность, которую легко обнаружить с помощью стандартного анализа гемагглютинирующей активности. Вкратце, в 96-луночном микротитрационном планшете готовили 50 мкл двукратные разведения в ФБР супернатанта, полученного путем низкоскоростного центрифугирования. Затем в каждую лунку добавляли равный объем приблизительно 1% раствора эритроцитов цыпленка (Fitzgerald Industries, Актон, Массачусетс) на ФБР, рН 7,4, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем визуально анализировали степень агглютинации. Единицу гемагглютинирующей активности (ГАЕ) определяли как наибольшее разведение, которое вызывало видимую гемагглютинацию в лунке. Типичная обнаруженная активность составляла порядка 512 ГАЕ в бесклеточном супернатанте трансгенного CL0143-9 Schizochytrium ("Е") (фиг. 5 А). ФБР ("-") или штамм дикого типа Schizochytriumsp. ATCC 20888 ("С"), который выращивали и получали таким же способом, как и трансгенные штаммы,использовали в качестве отрицательных контролей, и у них не обнаружили гемагглютинирующей активности. Рекомбинантный белок HA из вируса гриппа A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (Protein SciencesCorporation, Мериден, Коннектикут, разведение 1:1000 на ФБР) использовали в качестве положительного контроля ("+"). Исследование растворимых и нерастворимых фракций бесклеточного супернатанта трансгенного штамма CL0143-9 Schizochytrium путем анализа гемагглютинации показал, что белок HA обнаруживается преимущественно в нерастворимой фракции (фиг. 5 В). Типичная обнаруженная активность составляла порядка 16 ГАЕ в растворимой фракции ("Р") и 256 ГАЕ в нерастворимой фракции ("HP"). Уровни активности белка HA в 2 л культурах продемонстрировали активность, близкую к активности для культур в качалочных колбах при культивировании в тех же средах при постоянном рН, равном 6,5. В отдельном эксперименте нативный сигнальный пептид HA удаляли и заменяли на сигнальный пептид Sec1 Schizochytrium (SEQ ID NO: 37, кодируемый SEQ ID NO: 38). Трансгенный Schizochytrium,полученный с использованием данной альтернативной конструкции, проявил гемагглютинирующую активность и распределение рекомбинантного белка, аналогичные наблюдаемым для трансгенногоSchizochytrium, содержащего конструкцию pCL0143 (данные не представлены). Анализ пептидной последовательности. Нерастворимую фракцию ("HP"), полученную в результате центрифугирования бесклеточного супернатанта при 100000g, дополнительно фракционировали на градиенте плотности сахарозы и фракции,содержащие белок HA, что определяли путем анализа гемагглютинирующей активности (фиг. 6 В), разделяли с помощью электрофореза в ПААГ/ДСН и окрашивали кумасси бриллиантовым синим или переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану и осуществляли иммуноблотинг с антисывороткой кролика против H1N1 (фиг. 6 А), как описано выше. Полоски, соответствующие перекрестной реакции на иммуноблоте (HA1 и HA2), вырезали из окрашенного кумасси бриллиантовым синим геля и осуществляли анализ пептидной последовательности. Вкратце, интересующие полоски промывали/обесцвечивали в 50% этаноле, 5% уксусной кислоте. Кусочки геля затем обезвоживали в ацетонитриле, сушили в центрифужном вакуумном концентраторе SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс) и расщепляли трипсином путем добавления 5 мкл 10 нг/мкл трипсина в 50 мМ бикарбонате аммония и инкубирования в течение ночи при комнатной температуре. Образовавшиеся пептиды экстрагировали из полиакриламида двумя аликвотами по 30 мкл 50% ацетонитрила с 5% муравьиной кислотой. Полученные экстракты объединяли и выпаривали до 10 мкл в SpeedVac, а затем ресуспендировали в 1% уксусной кислоте до получения конечного объема, приблизительно равного 30 мкл, для анализа методом ЖХ/МС. Для ЖХ/МС использовали систему масс-спектрометра на основе линейной ионной ловушки Finnigan LTQTM (Thermo Electron Corporation, Уолтем, Массачусетс). Для ВЭЖХ использовали заполненную колонку размером 9 см 75 мкм С 18 для капиллярной хроматографии с обращенными фазами Phenomenex Jupiter (Phenomenex, Торранс, Калифорния). Затем наносили мкл объемы экстракта и элюировали пептиды с колонки с помощью градиента ацетонитрил/0,1 % муравьиная кисло- 29