Активность катионных каналов

Изобретение относится, частично, к функциональной характеристике мембраносвязанных белков,которые способствуют катионному потоку через биологические мембраны. Согласно данному изобретению было определено, что, по меньшей мере, некоторые полипептиды с повторами PQпетель способствуют потоку катионов через биологические мембраны.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ОСТРЭЙЛИАН СЕНТР ФОР ПЛАНТ ФАНКШЕНЛ ДЖЕНОМИКС ПТИ ЛТД. (AU) Заявление о приоритете Заявка на данный патент испрашивает приоритет согласно австралийской предварительной заявки на патент 2009904675, поданной 25 сентября 2009 г., содержание которой включено посредством ссылки. Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к функциональной характеристике мембраносвязанных белков, которые способствуют катионному потоку через биологические мембраны. Уровень техники Потенциалонечувствительные неселективные катионные каналы (viNSCC) наблюдаются во многих живых системах, например растениях, животных и дрожжах. Этот класс катионного канала описан как имеющий относительно низкую способность различения между одновалентными катионами (например,Na+, K+, NH4+, Li+ и т.д.) и ингибируемый двухвалентными катионами, такими как Са 2+ и Mg2+. Потенциалонечувствительность не является строго применяемым термином. Белок, обнаруживающий некоторую чувствительность к потенциалу (напряжению), может все еще рассматриваться в пределах класса viNSCC. Вследствие этого, хотя эти белки обнаруживают некоторую слабую потенциалозависимость, их все еще называют viNSCC. Обширные данные были получены о белках viNSCC посредством применения электрофизиологии. Считается, что viNSCC являются вескими кандидатами, превосходящими наблюдаемые потоки катионов низкой аффинности в биологических системах. Они включают быстрое поступление Na+, наблюдаемое в растениях, подвергнутых действию условий засоленной почвы, и поступление NH4+ в растения при подвергании их корневых систем действию физиологически высоких концентраций NH4+. В то время как соленость является основным термином, относящимся ко всем солям в почве, наиболее релевантной солью для большинства систем земледелия является NaCl. Засоленность может влиять на приспособляемость растений через вызывание изменений в осмотической среде и через ионную токсичность. Первичный поток Na+ в растение облегчается неизвестным белком. Быстрое накапливание Na+ наблюдали в побегах растений, когда корни подвергали действию условий засоления. Были получены корреляции между накапливанием Na+ в побегах и симптомами Na+-токсичности. Этот поток является результатом облегченного движения Na+ через клеточные мембраны. В то время как многие белки, облегчающие поток Na+ через мембраны растений, были описаны, молекулярная идентичность белка, который делает возможным поток Na+ способом, наблюдаемым в экспериментах с накапливанием Na+, остается неизвестной. Таким образом, желательной была бы идентификация и характеристика мембраносвязанных белков, которые способствуют потоку Na+ или другого катиона через биологические мембраны. Ссылка на любой известный уровень техники в этом описании не является признанием и не должна считаться признанием или любой формой предположения, что этот известный уровень образует часть обычного общего знания в любой стране. Сущность изобретения Данное изобретение основано, частично, на функциональной характеристике мембраносвязанных белков, которые способствуют катионному потоку через биологические мембраны. Таким образом, в первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ модуляции скорости,уровня или паттерна потока катионов через мембрану клетки, предусматривающий модуляцию экспрессии полипептида с повторами PQ-петель в клетке, содержащей клеточную мембрану. В некоторых вариантах осуществления этот полипептид с повторами PQ-петель включаетYDR352w-подобный полипептид с повторами PQ-петель. В другом варианте осуществления этот полипептид с повторами PQ-петель включает YOL092wподобный полипептид с повторами PQ-петель. Обычно полипептиды с повторами PQ-петель, рассматриваемые для применения в соответствии с данным изобретением, включают полипептиды с повторами PQ-петель, которые определяют потенциалонечувствительный неселективный катионный канал (viNSCC). В свете вышесказанного в некоторых вариантах осуществления полипептид с повторами PQ-петель включает транспортер одновалентных катионов. В других дополнительных вариантах осуществления транспорт одновалентных катионов при помощи полипептида с повторами PQ-петель может ингибироваться поливалентным катионом. В некоторых вариантах осуществления модуляция скорости, уровня или паттерна потока катионов через клеточную мембрану этой клетки модулирует толерантность или чувствительность к катионам этой клетки. В одном конкретном варианте осуществления этот способ может быть использован для увеличения толерантности клетки, такой как клетка растения, к Na+-катионам. Во втором аспекте данное изобретение обеспечивает клетку с модулированными скоростью, уровнем или паттерном катионного потока через мембрану этой клетки, где указанная модуляция является результатом модулированной экспрессии полипептида с повторами PQ-петель в этой клетке. В некоторых вариантах осуществления клетку второго аспекта этого изобретения получают в соответствии со способом первого аспекта этого изобретения. В третьем аспекте данное изобретение обеспечивает многоклеточную структуру, содержащую одну или более клеток второго аспекта этого изобретения. В четвертом аспекте данное изобретение обеспечивает конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту PQL. В некоторых вариантах осуществления эта конструкция является экспрессионной конструкцией, которая может быть использована для действия на экспрессию полипептида с повторами PQ-петель в клетке, как описано со ссылкой на первый аспект этого изобретения. В пятом аспекте данное изобретение обеспечивает генетически модифицированную клетку, содержащую конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор четвертого аспекта этого изобретения. Кроме того, в шестом аспекте данное изобретение обеспечивает многоклеточную структуру, содержащую одну или более клеток пятого аспекта этого изобретения. В седьмом аспекте данное изобретение обеспечивает способ выяснения чувствительности или толерантности организма к катионам, предусматривающий определение экспрессии полипептида с повторами PQ-петель в одной или более клетках этого организма. В некоторых вариантах осуществления относительно высокий уровень экспрессии ассоциируется с чувствительностью к катионам в этом организме. В другом варианте осуществления относительно низкий уровень экспрессии ассоциируется с толерантностью к катионам в этом организме. Следует понимать, что на протяжении этого описания, если контекст не требует иного, слово "содержат" или вариации, такие как "содержит" или "содержащий", обозначают включение указанного элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел, но не исключение любого другого элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности называют здесь по номеру-идентификатору последовательности (SEQ ID NO:). SEQ ID NO: соответствует в цифрах идентификаторам последовательностей 400 1 (SEQ ID NO:1), 400 2 (SEQ ID NO:2) и т.д. Суммирование идентификаторов последовательностей обеспечено в табл. 1. Список последовательностей обеспечен в конце этого описания. Таблица 1 Суммирование идентификаторов последовательностей Описание примерных вариантов осуществления Должно быть понятно, что следующее описание приведено только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначено для ограничения в отношении приведенного выше описания. Как представлено выше, данное изобретение основано, частично, на функциональной характеристике мембраносвязанных белков, которые способствуют катионному потоку через биологические мембраны. В соответствии с данным изобретением было определено, что, по меньшей мере, некоторые из полипептидов с повторами PQ-петель способствуют катионному потоку через биологические мембраны. Таким образом, в первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ модуляции скорости,уровня или паттерна потока катионов через мембрану клетки, предусматривающий модуляцию экспрессии полипептида с повторами PQ-петель в клетке, содержащей клеточную мембрану."Полипептиды с повторами PQ-петель", рассматриваемые здесь, характеризуются повторами остатков пролина и глутамина (PQ) перед внемембранной петлей. Этот мотив называют здесь "мотивом PQпетель". Обычно полипептид с повторами PQ-петель содержит 1, 2, 3, 4 или 5 мотивов с повторами PQпетель. Должно быть понятно, что в некоторых вариантах осуществления термин "полипептид с повто-5 022359 рами PQ-петель" включает полипептид, содержащий один или два мотива петель PQ. В некоторых вариантах осуществления полипептид с повторами PQ-петель содержит YOL092wподобный полипептид с повторами PQ-петель. В некоторых вариантах осуществления YOL092w-подобный полипептид с повторами PQ-петель может содержать один или более аминокислотных мотивов, выбранных из списка, состоящего изPQIXXNF (SEQ ID NO:5) где остаток 3 (I) может быть заменен L или V, остатки 4 и 5 (X), каждый, могут быть любым аминокислотным остатком или каждый или оба могут отсутствовать и остаток 7 (F) может быть заменен Y; илиGDIFNL (SEQ ID NO:6) где остаток 3 (I) может быть заменен V или F и остаток 6 (L) может быть заменен V; илиPQIXLNXKR (SEQ ID NO:7) где остаток 3 (I) может быть заменен А, остаток 4 (X) может быть любым аминокислотным остатком или может отсутствовать, остаток 5 (L) может быть заменен K или М, остаток 7 (X) может быть любым аминокислотным остатком или может отсутствовать, остаток 8 (K) может быть заменен R и остаток 9 (R) может быть заменен А. В некоторых вариантах осуществления YOL092w-подобный полипептид с повторами PQ-петель может содержать аминокислотные мотивы, представленные в SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6; аминокислотные мотивы, представленные в SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:7; аминокислотные мотивы, представленные в SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7; или аминокислотные мотивы, представленные в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7. В дополнительных вариантах осуществления YOL092w-подобный полипептид с повторами PQпетель может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична консенсусной последовательности YOL092w-подобного полипептида с повторами PQ-петель,представленной в SEQ ID NO:8. Еще в одном дополнительном варианте осуществления YOL092w-подобный полипептид с повторами PQ-петель может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична аминокислотной последовательности полипептида YOL092w с повторами PQ-петель, представленной в SEQ ID NO:9. Должно быть понятно, что ссылка в настоящем описании на "по меньшей мере 20% идентичность" включает также уровни идентичности, более высокие чем 20%, в том числе, например, по меньшей мере 30% идентичность, по меньшей мере 40% идентичность, по меньшей мере 50% идентичность, по меньшей мере 60% идентичность, по меньшей мере 70% идентичность, по меньшей мере 80% идентичность,по меньшей мере 90% идентичность или по меньшей мере 95% идентичность. При сравнении аминокислотных последовательностей сравниваемые последовательности должны сравниваться на протяжении окна сравнения по меньшей мере 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 аминокислотных остатков, по меньшей мере 300 аминокислотных остатков или на протяжении полной длины SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:9. Окно сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) приблизительно 20% или менее в сравнении со ссылочной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может проводиться компьютеризованными внедрениями алгоритмов,таких как семейство программ BLAST, таких как программы, описанные, например, Altschul et al. (Nucl.Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Подробное обсуждение анализа последовательностей может быть найдено в Unit 19. 3 Ausubel et al. ("Current Protocols in Molecular Biology" John WileySons Inc, 1994-1998,Chapter 15, 1998). Термин "YOL092w-подобный полипептид с повторами PQ-петель" относится также к "функциональным гомологам" полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9. Функциональные гомологи включают любой полипептид с повторами PQ-петель, который способен модулировать скорость, уровень или паттерн потока катионов через мембрану клетки. Несмотря на вышесказанное, этот функциональный гомолог может содержать, например, полипептид, который имеет одну или более инсерций, делеций или замен аминокислот относительно полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9; мутантную форму или аллельный вариант полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9; ортолог полипептида, содержащего аминокислотную последовательность,представленную в SEQ ID NO:9; аналог полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9; и т.п. Примеры YOL092w-подобных полипептидов с повторами PQ-петель включают полипептиды, имеющие следующие номера доступа: NP014549 (Saccharomyces cerevisiae YOL092w), EDN64758 (Saccharomyces cerevisiae YJM789), NP009705 (Saccharomyces cerevisiae YBR147w), NP594596 (Stm1Pp210671. В некоторых вариантах осуществления YOL092w-подобный полипептид с повторами PQ-петель содержит по меньшей мере 5 трансмембранных доменов. В некоторых вариантах осуществленияYOL092w-подобный полипептид с повторами PQ-петель содержит по меньшей мере 7 трансмембранных доменов. В дополнительных вариантах осуществления YOL092w-подобный полипептид с повторами PQпетель содержит 7 трансмембранных доменов вместе с цитоплазматической петлей, соединяющей трансмембранные домены 3 и 4. В некоторых вариантах осуществления полипептид с повторами PQ-петель содержит YDR352wподобный полипептид с повторами PQ-петель. В некоторых вариантах осуществления YDR352w-подобный полипептид с повторами PQ-петель может содержать один или более аминокислотных мотивов, выбранных из списка, состоящего изRLPQIXXN (SEQ ID NO:1) где остаток 2 (L) может быть заменен I, остаток 5 (I) может быть заменен V, F или L, остатки 6 и 7(X), каждый, могут быть любым аминокислотным остатком или каждый или оба могут отсутствовать и остаток 8 (N) может быть заменен С или I; илиYXLS (SEQ ID NO:2) где остаток 1 (Y) может быть заменен R, остаток 2 (X) может быть любым аминокислотным остатком или может отсутствовать, остаток 3 (L) может быть заменен F или I и остаток 4 (S) может быть заменен Т. В некоторых вариантах осуществления YDR352w-подобный полипептид с повторами PQ-петель может содержать, каждый, аминокислотные мотивы, представленные в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. В дополнительных вариантах осуществления YDR352w-подобный полипептид с повторами PQпетель может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична консенсусной последовательности YDR352w-подобного полипептида с повторами PQ-петель,представленной в SEQ ID NO:3. В другом дополнительном варианте осуществления YDR352w-подобный полипептид с повторамиPQ-петель может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична аминокислотной последовательности YDR352w-подобного полипептида с повторами PQпетель, представленной в SEQ ID NO:4. Ссылка в настоящем описании на "по меньшей мере 20% идентичность" включает также уровни идентичности, более высокие чем 20%, в том числе, например, по меньшей мере 30% идентичность, по меньшей мере 40% идентичность, по меньшей мере 50% идентичность, по меньшей мере 60% идентичность, по меньшей мере 70% идентичность, по меньшей мере 80% идентичность, по меньшей мере 90% идентичность или по меньшей мере 95% идентичность. При сравнении аминокислотных последовательностей сравниваемые последовательности должны сравниваться на протяжении окна сравнения по меньшей мере 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 аминокислотных остатков, по меньшей мере 300 аминокислотных остатков или на протяжении полной длины SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Окно сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) приблизительно 20% или менее в сравнении со ссылочной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может проводиться компьютеризованными внедрениями алгоритмов,таких как семейство программ BLAST, таких как программы, описанные, например, Altschul et al. (Nucl.Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Подробное обсуждение анализа последовательностей может быть найдено в Unit 19. 3 Ausubel et al. ("Current Protocols in Molecular Biology", John WileySons Inc, 1994-1998,Chapter 15, 1998). Термин "YD352w-подобный полипептид с повторами PQ-петель" включает также "функциональные гомологи" полипептида, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQID NO:4. Функциональные гомологи включают любой полипептид с повторами PQ-петель, который способен модулировать скорость, уровень или паттерн потока катионов через мембрану клетки. Несмотря на вышесказанное, этот функциональный гомолог может содержать, например, полипептид, который имеет одну или более инсерций, делеций или замен аминокислот относительно полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4; мутантную форму или аллельный вариант полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4; ортолог полипептида, содержащего аминокислотную последовательность,представленную в SEQ ID NO:4; аналог полипептида, содержащего аминокислотную последователь-7 022359 ность, представленную в SEQ ID NO:4; и т.п. Примеры YDR352w-подобных полипептидов с повторами PQ-петель включают полипептиды, имеющие следующие номера доступа: Обычно полипептиды с повторами PQ-петель, рассматриваемые для применения в соответствии с данным изобретением, включают полипептиды с повторами PQ-петель, которые определяют Потенциалонечувствительный неселективный катионный канал (viNSCC). Как указано в настоящем описании, "потенциалонечувствительным неселективным катионным каналом" или "viNSCC" называют полипептид катионного канала, имеющий относительно низкую способность различения между одновалентными катионами (например, Na+, K+, NH4+, Li+). В некоторых вариантах осуществления viNSCC может также ингибироваться поливалентными катионами, такими как Са 2+ и Mg2+. Термин "потенциалонечувствительность" не является строго применяемым термином при использовании со ссылкой на viNSCC. Как таковой, полипептид, обнаруживающий некоторую чувствительность к потенциалу, все еще считается находящимся в пределах класса viNSCC (например, см. Davenport and Tester, Plant Physiol. 122: 823-834, 2000). Таким образом, хотя полипептид с повторами PQпетель может обнаруживать некоторую слабую потенциалочувствительность, он может все еще рассматриваться как viNSCC в пределах данного изобретения. В соответствии с вышесказанным, viNSCC может также называться NSCC, и для целей этого описания эти два термина должны считаться синонимичными и взаимозаменяемыми. В свете вышесказанного, в некоторых вариантах осуществления полипептид с повторами PQ-петель содержит транспортер одновалентных катионов. В дополнительных вариантах осуществления этот одновалентный катион включает один или более из Na+, K+, NH4+, метиламмония, Tris+ или холина+. В других дополнительных вариантах осуществления транспорт одновалентного катиона полипептидом с повторами PQ-петель может быть ингибирован поливалентным катионом. Примеры поливалентных катионов, которые могут ингибировать транспорт одновалентных катионов белком с повторами PQ-петель, включают двухвалентные катионы, включающие Ве 2+, Mg2+, Ca2+,Sr2+, Ва 2+ и Ra2+, а также двухвалентные ионы металлов переходного ряда, такие как Zn2+, Fe2+ и т.п. В некоторых вариантах осуществления этим двухвалентным катионом может быть Са 2+. В некоторых вариантах осуществления поливалентный катион может быть трехвалентным катионом, таким как La3+. Как установлено выше, данное изобретение обеспечивает способ модуляции скорости, уровня или паттерна потока катионов через мембрану клетки. В данном контексте "клеточной мембраной" может быть любая мембрана клетки, через которую может быть желательной модуляция скорости, уровня или паттерна потока катионов. Примеры таких клеточных мембран включают, например, плазматическую мембрану или мембраны органелл, такие как мембраны хлоропластов, мембраны тилакоидов, митохондриальные мембраны (внутренняя или наружная), эндоплазматический ретикулум, мембраны аппарата Гольджи, вакуолярные мембраны, ядерные мембраны, акросомные мембраны, аутофагосомные мембраны, гликосомные мембраны, глиоксисомные мембраны, гидрогеносомные мембраны, лизосомные мембраны, меланосомные мембраны, митосомные мембраны, пероксисомные мембраны, мембраны пузырьков и т.п. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ модуляции скорости, уровня и паттерна потока катионов через плазматическую мембрану клетки. Клетки, рассматриваемые данным изобретением, могут включать любую клетку, содержащую мембрану, как обсуждалось выше. Таким образом, эта клетка может быть клеткой животного, в том числе клеткой млекопитающего, клеткой человека, клеткой птицы, клеткой насекомого, клеткой пресмыкающегося и т.п.; растительной клеткой, в том числе покрытосеменных или голосеменных высших растений,а также низших растений, таких какмохообразные, папоротниковые и хвощи; грибной клеткой, такой как дрожжи или мицелиальный гриб и т.п. Альтернативно, этой клеткой может быть также прокариотическая клетка, такая как бактериальная клетка (например, клетка Е. coli) или клетка архебактерии. В некоторых вариантах осуществления этой клеткой может быть, например, растительная клетка,клетка сосудистого растения, в том числе клетка однодольного или двудольного покрытосеменного растения или клетка голосеменного растения. В некоторых вариантах осуществления этой растительной клеткой может быть клетка однодольного растения. В некоторых вариантах осуществления этой клеткой может быть растительная клетка зерновой культуры. В данном контексте термин "зерновое культурное растение" включает членов Роасеае (семейство травянистых растений), которые продуцируют годное в пищу зерно для пищи человека и животных. Примеры зерновых культурных растений Роасеае включают ячмень, пшеницу, рис, кукурузу, просо, сорго, рожь, тритикале, овес, тэфф (полевичку абиссинскую), дикий рис, спельту (пшеничку) и т.п. Однако должно быть понятно, что термин "зерновое культурное растение" включает ряд видов, не принадлежащих к семейству Роасеае, которые также продуцируют годное в пищу зерно и известны как псевдозерновые, такие как амарант, гречиха и лебеда квиноа. В дополнительных вариантах осуществления этим растением может быть двудольное растение, в том числе, например, бобовые, такие как соя (Glycine spp.), различные виды гороха и клевера, другие двудольные масличные сельскохозяйственные культуры, такие как Brassica spp., и культурные растения семейства Solanaceae, такие как томаты, перец, перец стручковый, картофель, баклажан и т.п. В некоторых вариантах осуществления модуляция скорости, уровня или паттерна потока катионов через клеточную мембрану клетки модулирует толерантность или чувствительность клетки к катионам. Например, в некоторых вариантах осуществления полипептид с повторами PQ-петель в клетке может понижающим образом регулироваться для уменьшения потока конкретного катиона через плазматическую мембрану и, следовательно, или снижать чувствительность этой клетки к данному катиону, и/или увеличивать толерантность этой клетки к катионам окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления этот катион может быть одновалентным катионом. В других вариантах осуществления этот катион может содержать любой один или более из Na+, K+, NH4+, метиламмония, Tris+ или холина+. В некоторых вариантах осуществления этот способ может быть использован для увеличения толерантности клетки, такой как растительная клетка, к Na+-катионам. Напротив, данное изобретение рассматривает также увеличение потока катиона через клеточную мембрану. В этих вариантах осуществления экспрессия полипептида с повторами PQ-петель может быть увеличена в клетке. Как описано далее в примерах, увеличение мембранного потока катиона конститутивно во всех клетках организма может увеличивать толерантность этого организма в целом к этому катиону. Как установлено выше, данное изобретение основано, частично, на модуляции экспрессии полипептида с повторами PQ-петель в клетке. В данном контексте модуляция "экспрессии" полипептида с повторами PQ-петель включает модуляцию уровня и/или активности этого полипептида. Должно быть понятно, что модуляция "уровня" полипептида включает увеличение или уменьшение уровня или количества полипептида с повторами PQ-петель в клетке или конкретной части клетки. Подобным образом, должно быть понятно, что модуляция "активности" полипептида с повторами PQпетель включает увеличение или уменьшение, например, общей активности, конкретной активности,времени полужизни и/или стабильности полипептида в этой клетке. Под "увеличением" имеется в виду, например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 2-кратное,5-кратное, 10-кратное, 20-кратное, 50-кратное, 100-кратное увеличение в уровне активности полипептида с повторами PQ-петель в клетке. Под "уменьшением" имеется в виду, например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50,60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% уменьшение в уровне или активности полипептида с повторами PQ-петель в клетке. Должно быть также понятно, что "модуляция" включает введение конкретного полипептида с повторами PQ-петель в клетку, которая в норме не экспрессирует вводимый полипептид, или по существу полное ингибирование активности полипептида с повторами PQ-петель в клетке, которая в норме экспрессирует такой полипептид. Данное изобретение рассматривает любые средства, посредством которых может быть модулирована экспрессия полипептида с повторами PQ-петель в клетке. Это включает, например, такие способы, как применение агентов, которые модулируют активность полипептида с повторами PQ-петель в клетке, в том числе применение агонистов или антагонистов; применение агентов, которые имитируют активность полипептида с повторами PQ-петель в клетке; модуляция экспрессии нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид с повторами PQ-петель в этой клетке; выполнение экспрессии измененной или мутированной нуклеиновой кислоты в клетке, так что полипептид с повторами PQ-петель экспрессируется клеткой с увеличенной или уменьшенной специфической активностью, временем полужизни и/или стабильностью экспрессируется этой клеткой; или модуляция паттерна экспрессии и/или нацеливания полипептида с повторами PQ-петель в клетке, например, через модификацию регуляторной последовательности транскрипции и/или сигнального полипептида, ассоциированного с полипептидом с повторамиPQ-петель. В некоторых вариантах осуществления экспрессия этого полипептида модулируется модуляцией экспрессии нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид с повторами PQ-петель, в этой клетке. В данном контексте нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид с повторами PQ-петель("нуклеиновой кислотой PQL"), называют любую нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид с повторами PQ-петель или функциональный активный фрагмент или вариант такого полипептида. Конкретные примеры нуклеиновых кислот PQL включают нуклеиновые кислоты, которые кодируют описанные здесь выше полипептиды с повторами PQ-петель. Нуклеиновые кислоты PQL данного изобретения могут быть получены из любого источника. Например, нуклеиновые кислоты PQL могут быть получены из такого организма, как растение, животное или гриб. Альтернативно, нуклеиновая кислота PQL может быть синтетической нуклеиновой кислотой. Нуклеиновые кислоты PQL, рассматриваемые данным изобретением, могут также содержать один или более нетранслируемых областей, таких как 3'- и 5'-нетранслируемые области и/или интроны. Нуклеиновые кислоты PQL, рассматриваемые данным изобретением, могут содержать, например,последовательности мРНК, последовательности кДНК или геномные нуклеотидные последовательности. Термин "модуляция" в отношении экспрессии нуклеиновой кислоты PQL может включать увеличение или уменьшение транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты PQL в клетке. Под "увеличением" имеется в виду, например, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 2-кратное,5-кратное, 10-кратное, 20-кратное, 50-кратное, 100-кратное или большее увеличение транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты PQL. Под "уменьшением" имеется в виду, например, 1, 5, 10, 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% уменьшение транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты PQL. Модуляция включает также введение экспрессии PQL, в норме не обнаруживаемой в конкретной клетке; или по существу полное ингибирование (например, нокаут) экспрессии нуклеиновой кислоты PQL в клетке, которая в норме имеет такую активность. Данное изобретение рассматривает любые средства, посредством которых может модулироваться экспрессия нуклеиновой кислоты PQL. Например, примерные способы модуляции экспрессии нуклеиновой кислоты PQL включают, например, генетическую модификацию клетки для повышающей регуляции или понижающей регуляции эндогенной экспрессии нуклеиновой кислоты PQL; генетическую модификацию посредством трансформации нуклеиновой кислотой PQL; генетическую модификацию для увеличения копийности нуклеиновой кислоты PQL в клетке; введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, которая модулирует экспрессию эндогенной нуклеиновой кислоты PQL в этой клетке; и т.п. В некоторых вариантах осуществления экспрессия нуклеиновой кислоты PQL модулируется генетической модификацией клетки. Термин "генетически модифицированная" в данном контексте должен пониматься как включение любой генетической модификации, которая производит изменение в экспрессии нуклеиновой кислоты PQL в генетически модифицированной клетке относительно не модифицированной генетически формы этой клетки. Примерные типы генетической модификации включают неспецифический мутагенез, такой как транспозонный, химический, УФ- и фаговый мутагенез, вместе с отбором мутантов, которые сверхэкспрессируют или недостаточно экспрессируют эндогенную нуклеиновую кислоту PQL; транзиторное или стабильное введение одной или более молекул нуклеиновых кислот в клетку, которые управляют экспрессией и/или сверхэкспрессией нуклеиновой кислоты PQL в клетке; модуляцию эндогенного полипептида с повторами PQ-петель сайт-направленным мутагенезом эндогенной нуклеиновой кислоты PQL; введение одной или более молекул нуклеиновых кислот, которые ингибируют экспрессию эндогенной нуклеиновой кислоты PQL в клетке, например, косупрессионной конструкции или RNAi-конструкции; и т.п. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение рассматривает увеличение уровня полипептида с повторами PQ-петель в клетке введением экспрессии нуклеиновой кислоты PQL в клетку,повышающей регуляцией экспрессии нуклеиновой кислоты PQL в этой клетке и/или увеличением копийности нуклеиновой кислоты PQL в этой клетке. Способы трансформации и экспрессии введенной нуклеотидной последовательности в различных типах клеток хорошо известны в данной области, и данное изобретение рассматривает применение любого подходящего способа. Однако в качестве примера относительно трансформации клеток растений делается ссылка на Zhaoet al. (Mol. Breeding DOI 10.1007/sll032-006-9005-6, 2006), Katsuhara et al. (Plant Cell Physiol. 44(12): 13781383, 2003), Ohta et al. (FEBS Letters 532: 279-282, 2002) и Wu et al. (Plant Science 169: 65-73, 2005). В следующих вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает также способы понижающей регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты PQL в клетке. Например, с идентификацией последовательностей нуклеиновых кислот PQL, данное изобретение способствует также таким способам, как нокаут или нокдаун нуклеиновой кислоты PQL в клетке с использованием способов, включающих, например:(i) инсерционный мутагенез, включающий нокаут или нокдаун нуклеиновой кислоты в клетке гомологичной рекомбинацией с нокаут-конструкцией (в отношении разрушения гена-мишени см. Terada et(ii) посттранскрипционый сайленсинг гена (PTGS) или RNAi нуклеиновой кислоты в клетке (в отношении обзора PTGS и RNAi см. Sharp, Genes Dev. 15(5): 485-490, 2001; и Hannon, Nature 418: 244-51,2002);(iii) трансформацию клетки антисмысловой конструкцией, направленной против нуклеиновой кислоты (в отношении антисмысловой супрессии см. van der Krol et al., Nature 333: 866-869; van der Krol et(iv) трансформацию клетки косупрессионной конструкцией, направленной против нуклеиновой кислоты (в отношении примера косупрессии см. van der Krol et al., Plant Cell 2(4): 291-299);(v) трансформацию клетки конструкцией, кодирующей двухцепочечную РНК, направленной против нуклеиновой кислоты (в отношении примера dsRNA-опосредованного сайленсинга генов см. Waterhouse(vi) трансформацию клетки конструкцией, кодирующей siRNA или шпилечную РНК, направленной против нуклеиновой кислоты (в отношении примера опосредованного siRNA или шпилечной РНК сайленсинга генов см. Lu et al., Nucl. Acids Res. 32(21): e171; doi:10.1093/nar/gnh170, 2004); и(vii) инсертирование miRNA последовательности-мишени таким образом, что она находится в функциональной связи с нуклеиновой кислотой (в отношении примера miRNA-опосредованного сайленсинга генов см. Brown et al., Blood 110(13): 4144-4152, 2007). Данное изобретение облегчает также понижающую регуляцию нуклеиновой кислоты PQL в клетке посредством применения синтетических олигонуклеотидов, например, siRNA или микроРНК, направленных против нуклеиновой кислоты PQL (в отношении примеров опосредованного синтетической siRNA сайленсинга см. Caplen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747, 2001; Elbashir et al., Genes Dev. 15: 188-200, 2001; Elbashir et al., Nature 411: 494-498, 2001; Elbashir et al., EMBO J. 20: 6877-6888, 2001; иElbashir et al., Methods 26: 199-213, 2002). Наряду с примерами, описанными выше, вводимая нуклеиновая кислота может также содержать нуклеотидную последовательность, которая не относится непосредственно к нуклеиновой кислоте PQL,но тем не менее может прямо или опосредованно модулировать экспрессию нуклеиновой кислоты PQL в клетке. Примеры включают молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют факторы транскрипции или другие белки, которые стимулируют или подавляют экспрессию эндогенной молекулы нуклеиновой кислоты PQL в клетке; и другие нетранслируемые РНК, которые прямо или опосредованно стимулируют или подавляют экспрессию эндогенного полипептида с повторами PQ-петель, и т.п. Для осуществления экспрессии введенной нуклеиновой кислоты в генетически модифицированной клетке, в случае необходимости, вводимая нуклеиновая кислота может быть функционально соединена с одной или более регуляторными последовательностями и/или промоторами, такими как природный промотор нуклеиновой кислоты PQL или гетерологичный промотор. Должно быть понятно, что термин "регуляторная последовательность транскрипции" должен пониматься как включение любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая осуществляет транскрипцию функционально присоединенной нуклеиновой кислоты. Регуляторная последовательность транскрипции может включать, например, лидер, последовательность полиаденилирования, промотор,энхансер или повышающим образом активирующую последовательность и терминатор транскрипции. Обычно регуляторная последовательность транскрипции включает, по меньшей мере, промотор. Термин"промотор" описывает в данном контексте любую нуклеиновую кислоту, которая придает, активирует или усиливает экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в клетке. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна регуляторная последовательность транскрипции функционально соединена с нуклеиновой кислотой PQL. Для целей данного изобретения регуляторная последовательность транскрипции рассматривается как "функционально связанная" с конкретным геном или другой нуклеотидной последовательностью, когда эта регуляторная последовательность транскрипции способна стимулировать, ингибировать или иным образом модулировать транскрипцию этого гена или другой нуклеотидной последовательности. Промотор может регулировать экспрессию функционально связанной нуклеотидной последовательности конститутивно, или дифференциально, в отношении клетки, ткани, органа или стадии развития, в которой имеет место экспрессия, в ответ на наружные стимулы, такие как физиологический стресс,патогены или ионы металлов, среди прочих, или в ответ на один или более активаторов транскрипции. Как таковой, промотор, используемый в соответствии со способами данного изобретения, может включать, например, конститутивный промотор, индуцируемый промотор, тканеспецифический промотор или активируемый промотор. Данное изобретение рассматривает применение любого промотора, который является активным в представляющей интерес клетке. Таким образом, множество промоторов, которые являются активными в любых бактериях, грибах, клетках животных или растительных клетках могут быть легко определены квалифицированным в данной области специалистом. Однако в некоторых вариантах осуществления могут быть использованы растительные клетки. Таким образом, в этих вариантах осуществления могут быть использованы активные в растении конститутивные, индуцируемые, тканеспецифические или активируемые промоторы. Конститутивные промоторы растений обычно управляют экспрессией почти во всех тканях растения и являются в значительной степени независимыми от условий среды и факторов развития. Примеры конститутивных промоторов, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением,включают полученные из растительного вируса промоторы, такие как промоторы Вируса Мозаики Цветной капусты 35S и 19S (CaMV 35S и CaMV 19S); полученные из бактериального патогена растений промоторы, такие как опиновые промоторы, полученные из Agrobacterium spp., например, полученный изAgrobacterium промотор нопалинсинтазы (nos); и полученные из растений промоторы, такие как промотор гена малой субъединицы rubisco (rbcS), промотор убиквитина человека (Pubi) и промотор актина ри- 11022359"Индуцируемые" промоторы включают, но не ограничиваются ими, химически индуцируемые промоторы и физически индуцируемые промоторы. Химически индуцируемые промоторы включают промоторы, которые имеют активность, которая регулируется химическими соединениями, такими как спирты,антибиотики, стероиды, ионы металлов или другие соединения. Примеры химически индуцируемых промоторов включают регулируемые спиртом промоторы (см., например, европейский патент 637339); регулируемые тетрациклином промоторы (см., например, патент США 5851796 и патент США 5464758); реагирующие на стероиды промоторы, такие как промоторы рецептора глюкокортикоидов (например,см. патент США 5512483), промоторы рецептора эстрогена (см., например, заявку на европейский патент 1232273), промоторы рецептора экдизона (например, см. патент США 6379945) и т.п.; отвечающие на металл промоторы, такие как промоторы металлотионеина (например, см. патент США 4940661, патент США 4579821 и патент США 4601978); и связанные с патогенезом промоторы, такие как промоторы хитиназы или лизоцима (например, см. патент США 5654414) или промоторы белка PR (например, см. патент США 5689044, патент США 5789214, Австралийский патент 708850, патент США 6429362). Индуцируемый промотор может быть также физически регулируемым промотором, который регулируется не химическими факторами окружающей среды, такими как температура (как теплота, так и холод), свет и т.п. Примеры физически регулируемых промоторов включают промоторы теплового шока(например, см. патент США 5447858, Австралийский патент 732872, заявку на патент Канады 1324097); индуцируемые холодом промоторы (см., например, патент США 6479260, патент США 6184443 и патент США 5847102); индуцируемые светом промоторы (например, см. патент США 5750385 и патент Канады 1321563); подавляемые светом промоторы (см., например, патент Новой Зеландии 508103 и патент США 5639952)."Тканеспецифические промоторы" включают промоторы, которые преимущественно или специфически экспрессируются в одной или более конкретных клетках, тканях или органах в организме и/или в одной или более стадиях развития организма. Должно быть понятно, что тканеспецифический промотор также является конститутивным или индуцируемым. Примеры тканеспецифических промоторов включают специфические для корней промоторы, такие как промоторы, описанные в заявке на патент США 2001047525; специфические для плодов промоторы,в том числе специфические для завязи и специфические для цветоложа тканеспецифические промоторы,такие как промоторы, описанные в европейском патенте 316441, патенте США 5753475 и заявке на европейский патент 973922; и семеноспецифические промоторы, такие как промоторы, описанные в австралийском патенте 612326 и заявке на европейский патент 0781849 и австралийском патенте 746032. Промотор может быть также промотором, который является активируемым одним или более активаторами транскрипции, называемым в настоящем описании "активируемым промотором". Например,этот активируемый промотор может содержать минимальный промотор, соединенный с повышающим образом активирующей последовательностью (UAS), который содержит, inter alia, ДНК-связывающий сайт для одной или более транскрипционных активностей. Должно быть понятно, что данном контексте термин "минимальный промотор" включает, по меньшей мере, сайт связывания РНК-полимеразы и необязательно ТАТА-бокс и сайт инициации транскрипции и/или один или более сайтов СААТ. В некоторых вариантах осуществления, где этой клеткой является растительная клетка, минимальный промотор может быть получен из промотора Вируса Мозаики Цветной капусты 35S (CaMV 35S). Полученный из CaMV 35S минимальный промотор может содержать,например, последовательность, которая по существу совпадает с положениями -90 - +1 (сайтом инициации транскрипции) промотора CaMV 35S (также называемая как минимальный промотор -90 CaMV 35S),-60 -+1 промотора CaMV 35S (также называемая как минимальный промотор -60 CaMV 35S) или -45 - +1 промотора CaMV 35S (также называемая как минимальный промотор -45 CaMV 35S). Как установлено выше, активируемый промотор может содержать минимальный промотор, слитый с повышающим образом активирующей последовательностью (UAS). Эта UAS может быть любой последовательностью, которая может связывать активатор транскрипции для активации минимального промотора. Примерные активаторы промоторов включают, например, полученные из дрожжей активаторы транскрипции, такие как Gal4, Pdr1, Gcn4 и Ace1; полученный из вируса активатор транскрипции,VP16; Hapl (Hach et al., J. Biol. Chem. 278: 248-254, 2000); Gaf1 (Hoe et al., Gene 215(2): 319-328, 1998);Acids Res 28: 4291-4298, 2000); MafA (Kataoka et al., J. Biol. Chem. 277: 49903-49910, 2002); активирующий транскрипцию фактор 4 человека (Liang and Hai, J. Biol. Chem. 272: 24088-24095, 1997); Bc110 (Liu(Wu et al., Nat Genet 26: 484-489, 2000). В некоторых вариантах осуществления UAS содержит нуклеотидную последовательность, которая способна связываться, по меньшей мере, с ДНК-связывающим доменом активатора транскрипции GAL4. Регуляторная последовательность может также включать терминатор. Термин "терминатор" относится к ДНК-последовательности на конце транскрипционной единицы, которая передает сигнал терминации транскрипции. Терминаторы являются 3'-нетранслируемыми ДНК-последовательностями, обычно содержащими сигнал полиаденилирования, который способствует добавлению полиаденилатных последовательностей к 3'-концу первичного транскрипта. Как и в случае последовательностей промотора, терминатор может быть любой терминаторной последовательностью, которая является функциональной в клетках, тканях или органах, в которых она должна быть использована. Примеры подходящих терминаторных последовательностей, которые могут быть применимы в растительных клетках, включают терминатор нопалинсинтазы (nos), терминатор CaMV 35S, терминатор октопинсинтазы (ocs), терминаторы гена ингибитора протеиназы картофеля (pin), такие как pinII и pinIII и т.п. Во втором аспекте данное изобретение обеспечивает клетку с модулированной скоростью или модулированным паттерном потока катионов через мембрану этой клетки, где указанная модуляция является результатом модулированной экспрессии полипептида с повторами PQ-петель в этой клетке. Должно быть понятно, что термин "клетка" в данном контексте включает любой тип клеток, в том числе бактерии, архебактерии и эукариотические клетки, в том числе, например, животные, растительные и грибные клетки. В некоторых вариантах осуществления эти клетки могут включать, например,клетку растения, клетку однодольного растения или растительную клетку зерновой культуры. В некоторых вариантах осуществления клетку второго аспекта этого изобретения получают в соответствии со способом первого аспекта этого изобретения. В следующих вариантах осуществления, эта клетка второго аспекта этого изобретения является генетически модифицированной, как описано выше,со ссылкой на второй аспект этого изобретения. В данном аспекте термин "генетически модифицированная клетка" включает клетку, которая является генетически модифицированной относительно дикого типа этой клетки. Таким образом, генетически модифицированная клетка может быть клеткой, которая сама была генетически модифицирована,и/или потомством такой клетки, которое сохраняет модификацию относительно дикого типа этой клетки. В третьем аспекте данное изобретение обеспечивает многоклеточную структуру, содержащую одну или более клеток второго аспекта этого изобретения. В данном контексте "многоклеточная структура" включает любую агрегацию одной или более клеток. Таким образом, многоклеточная структура конкретно включает ткани, органы, целые организмы и их части. Кроме того, должно быть понятно, что многоклеточная структура включает многоклеточные агрегации культивируемых клеток, такие как колонии, каллусы растений, жидкие или суспензионные культуры и т.п. Как упоминалось выше, в некоторых вариантах осуществления эта клетка является растительной клеткой и, следовательно, это изобретение включает целое растение, ткань растения, орган растения,часть растения, репродуктивный материал или культивируемую ткань растения (например, каллус или суспензионную культуру), содержащие одну или более растительных клеток, в соответствии с третьим аспектом этого изобретения. В следующих вариантах осуществления эта клетка является однодольной клеткой или клеткой зерновой культуры и, следовательно, данное изобретение также включает конкретно целое растение, ткань растения, орган растения, часть растения, репродуктивный материал или культивируемую ткань растения (например, каллус или суспензионную культуру), содержащие одну или более клеток однодольных или зерновых культурных растений. В четвертом аспекте данное изобретение обеспечивает конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор, содержащие нуклеиновую кислоту PQL, как описано здесь ранее. Конструкция нуклеиновой кислоты или вектор данного изобретения может состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, который может быть немодифицированной РНК или ДНК или модифицированной РНК или ДНК. Например, эта конструкция или вектор может состоять из одно- и двухцепочечной ДНК, ДНК, которая является смесью одно-и двухцепочечных областей, одноили двухцепочечной РНК и RNA, которая является смесью одно- и двухцепочечных областей, гибридных молекул, содержащих ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, более типично,двухцепочечными, или смесью одно- и двухцепочечных областей. Кроме того, эта конструкция или вектор может содержать трехцепочечные области, содержащие РНК или ДНК или как РНК, так и ДНК. Эта конструкция или вектор может также содержать одно или более модифицированных оснований или ДНК- или РНК-скелетов (макромолекул), модифицированных в отношении стабильности или в отношении других причин. "Модифицированные основания" включают, например, тритилированные (или иным образом меченные) основания и необычные основания, такие как инозин. Различные модификации могут быть произведены в отношении ДНК и РНК; таким образом, термин "нуклеиновая кислота" включает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы. В некоторых вариантах осуществления эта конструкция является экспрессионной конструкцией,которая может быть использована для осуществления экспрессии полипептида с повторами PQ-петель в клетке, как описано со ссылкой на первый аспект этого изобретения. Таким образом, этот вектор или эта конструкция может содержать одно или более из следующего: сайт инициации репликации для одного или более хозяев; ген селектируемого маркера, который является активным в одном или более хозяевах; и/или одну или более регуляторных последовательностей транскрипции. В данном контексте термин "ген селектируемого маркера" включает любой ген, который придает клетке, в которой он экспрессируется, фенотип для облегчения идентификации и/или отбора клеток, которые трансфицированы или трансформированы генетической конструкцией. Некоторый диапазон нуклеотидных последовательностей, кодирующих подходящие селектируемые маркеры, известен в данной области. Примерные нуклеотидные последовательности, которые кодируют селектируемые маркеры, включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как гены устойчивости к ампициллину, гены устойчивости к тетрациклину, гены устойчивости к канамицину, генAURI-C, который придает устойчивость к антибиотику ауреобазидину А, гены неомицинфосфотрансферазы (например, nptI и nptII) и гены гигромицинфосфотрансферазы (например, hpt); гены устойчивости к гербицидам, включающие гены устойчивости к глюфосинату, фосфинотрицину или биалафосу, такие как кодирующие фосфотрицинацетилтрансферазу гены (например, bar), гены устойчивости к глифосату,включающие кодирующие 3-еноилпирувилшикимат-5-фосфатсинтазу гены (например, aroA), гены устойчивости к бромикснилу, включающие кодирующие бромикснилнитрилазу гены, гены устойчивости к сульфонамиду, включающие кодирующие дигидроптератсинтазу гены (например, sul) и гены устойчивости к сульфонилмочевине, включающие кодирующие ацетолактатсинтазу гены; кодирующие фермент репортерные гены, такие как кодирующие GUS и хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT) гены; флуоресцентные репортерные гены, такие как ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок; и репортерные гены на основе люминесценции, такие как ген люциферазы, среди прочих. Кроме того, следует отметить, что этот ген селектируемого маркера может быть отдельной рамкой считывания в этой конструкции или может экспрессироваться в виде слитого с другим полипептидом белка (например, полипептидом с повторами PQ-петель). Как установлено выше, конструкция нуклеиновой кислоты или вектор может также содержать одну или более регуляторных последовательностей транскрипции, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна регуляторная последовательность транскрипции функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты первого аспекта этого изобретения, как описано здесь выше. Как упоминалось выше, эти регуляторные последовательности могут также включать терминатор,как описано здесь выше. Эта конструкция может дополнительно включать нуклеотидные последовательности, предназначенные для поддержания и/или репликации этой генетической конструкции в прокариотах или эукариотах, и/или интеграции этой генетической конструкции или ее части в геноме эукариотической или прокариотической клетки. В некоторых вариантах осуществления этот вектор или конструкцию адаптируют, по меньшей мере, для частичного переноса в растительную клетку посредством Agrobacterium-опосредованной трансформации. Согласно некоторым вариантам осуществления эта конструкция может содержать левую и/или правую окаймляющие последовательности Т-ДНК. Подходящие окаймляющие последовательности Т-ДНК могут быть легко определены квалифицированным в данной области специалистом. Однако должно быть понятно, что термин "окаймляющие последовательности Т-ДНК" включает, например, любые по существу гомологичные или по существу непосредственно повторяемые нуклеотидные последовательности, которые определяют границу молекулы нуклеиновой кислоты, которая переносится из клетки Agrobacterium sp. в растительную клетку, восприимчивую к Agrobacterium-опосредуемой трансформации. В качестве примера делается ссылка на статью Peralta and Ream (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(15): 5112-5116, 1985) и обзор Gelvin (Microbiologyand Molecular Biology Reviews, 67(1): 16-37, 2003). В некоторых вариантах осуществления этот вектор или эту конструкцию адаптируют для перенесения в растение посредством Agrobacterium-опосредуемой трансформации. Однако данное изобретение рассматривает также любые подходящие модификации в отношении генетической конструкции, которая облегчает опосредуемое бактериями инсертирование в растительную клетку посредством бактерий, отличных от Agrobacterium sp., например, как описано в Broothaerts et al. (Nature 433: 629-633, 2005). Квалифицированным в данной области специалистам будет известно, как получать описанные здесь конструкции, и будут известны требования для получения их экспрессии в конкретной клетке или конкретном типе клеток. Генетические манипуляции, необходимые для осуществления данного изобретения, могут потребовать размножения описанной здесь генетической конструкции или ее производного в прокариотической клетке, такой как клетка Е. coli, или растительная клетка, или клетка животного. В пятом аспекте данное изобретение обеспечивает генетически модифицированную клетку, содержащую конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор четвертого аспекта этого изобретения. Нуклеиновая кислота может вводиться с использованием любого способа, известного в данной области, который подходит для используемого типа клеток. В вариантах, в которых эта клетка является растительной клеткой, подходящие способы для введения молекулы нуклеиновой кислоты могут включать, например, Agrobacterium-опосредуемую трансфор- 14022359 мацию, опосредуемую другими бактериями трансформацию (см. Broothaerts et al., 2005, выше), способы трансформации на основе бомбардировки "микрочастицами" (баллистической трансформации) и способы на основе прямого поглощения ДНК. Roa-Rodriguez et al. (Agrobacterium-mediated transformation ofplants, 3rd Ed. GAMBIA Intellectual Property Resource, Canberra, Australia, 2003) рассматривают множество подходящих Agrobacterium-опосредованных способов трансформации растений для широкого диапазона видов растений. Баллистическая трансформация может быть также использована для трансформации тканей растений и способов трансформации растений, в частности зерновых растений, и такие способы рассматриваются Casas et al. (Plant Breeding Rev. 13: 235-264, 1995). Протоколы прямого поглощения ДНК, такие как трансформация протопластов и электропорация, описаны подробно в Galbraith et al.(eds.), Methods in Cell Biology Vol. 50, Academic Press, San Diego, 1995). Наряду с вышеупомянутыми способами может быть использован также некоторый диапазон других протоколов трансформации. Они включают инфильтрацию, электропорацию клеток и тканей, электропорацию зародышей, микроинъекцию, путь с использованием пыльцевых трубок, опосредованную карбидом кремния и липосомами трансформацию. Подобные способы рассматриваются в обзоре Rakoczy-Trojanowska (Cell. Mol. Biol.Lett. 7: 849-858, 2002). Определенный диапазон других способов трансформации растений может быть очевидным квалифицированным в данной области специалистам. Вышеупомянутые конструкция или вектор могут сохраняться в клетке в виде молекулы ДНК, в виде части эписомы (например, плазмиды, космиды, искусственной хромосомы или т.п.) или они могут быть интегрированы в геномную ДНК клетки. Должно быть понятно, что в данном контексте термин "геномная ДНК" в его самом широком смысле включает любую и всю ДНК, которая составляет генетический комплемент клетки. Таким образом,должно быть понятно, что геномная ДНК клетки включает хромосомы, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, хлоропластную ДНК, эндогенную плазмидную ДНК и т.п. Таким образом, термин "геномно интегрированная" предполагает хромосомную интеграцию, интеграцию митохондриальной ДНК,интеграцию пластидной ДНК, интеграцию хлоропластной ДНК, эндогенную плазмидную интеграцию, и т.п. Должно быть понятно, что термин "клетка" в данном контексте включает любой тип клетки, в том числе бактерии, архебактерии и эукариотические клетки, включающие, например, клетки животного,растения и грибные клетки. В некоторых вариантах осуществления эта клетка может включать растительную клетку, клетку однодольного растения или клетку зернового культурного растения. Кроме того, в шестом аспекте данное изобретение обеспечивает многоклеточную структуру, содержащую одну или более клеток пятого аспекта этого изобретения. Как упоминалось выше, в некоторых вариантах осуществления эта клетка является растительной клеткой и, следовательно, данное изобретение включает целое растение, ткань растения, орган растения,часть растения, репродуктивный материал или культивируемую ткань растения (например, каллус или суспензионную культуру), содержащие одну или более растительных клеток, в соответствии с пятым аспектом этого изобретения. В следующих вариантах осуществления эта клетка является однодольной клеткой или клеткой зерновой культуры и, следовательно, данное изобретение включает конкретно целое растение, ткань растения, орган растения, часть растения, репродуктивный материал или культивируемую ткань растения (например, каллус или суспензионную культуру), содержащие одну или более клеток однодольных или зерновых культурных растений. В седьмом аспекте данное изобретение обеспечивает способ установления чувствительности или толерантности организма к катионам, предусматривающий определение экспрессии полипептида с повторами PQ-петель в одной или более клетках этого организма. В некоторых вариантах осуществления относительно высокий уровень экспрессии ассоциирован с чувствительностью к катионам в этом организме. В некоторых вариантах осуществления относительно высокий уровень экспрессии во всех клетках этого организма ассоциирован с толерантностью к катионам в этом организме. В другом варианте осуществления относительно низкий уровень экспрессии ассоциирован с толерантностью к катионам в этом организме. В данном контексте "определение экспрессии полипептида с повторами PQ-петель" включает определение уровня и/или активности самого полипептида с повторами PQ-петель и/или уровня, активности,транскрипции или трансляции нуклеиновой кислоты PQL. Способы определения уровня и/или паттерна экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида известны в данной области. Примерные способы детектирования экспрессии РНК включают такие способы, как количественная или полуколичественная ПЦР с использованием обратной транскриптазы (например, см. Burton et al.,Plant Physiology 134: 224-236, 2004), in-situ-гибридизация (см., например, Linnestad et al., Plant Physiology 118: 1169-1180, 1998); нозерн-блоттинг (например, см. Mizuno et al., Plant Physiology 132: 1989-1997,2003); и т.п. Примерные способы определения экспрессии полипептидов включают Вестерн-блоттинг 1994) и т.п. В другом варианте осуществления экспрессия нуклеиновой кислоты PQL может определяться определением количества нуклеиновых кислот PQL, присутствующих в геномной ДНК одной или более клеток этого организма. В некоторых вариантах осуществления способ седьмого аспекта этого изобретения адаптируют для установления чувствительности или толерантности к катионам растения. В следующих вариантах осуществления способ седьмого аспекта этого изобретения адаптируют для установления чувствительности или толерантности, например, однодольного растения или зернового культурного растения. В дополнительных вариантах осуществления способ седьмого аспекта этого изобретения может быть использован для установления чувствительности или толерантности организма к катионам и затем отбора отдельных организмов на основе установленного уровня чувствительности или толерантности к катионам. Например, в случае растений, растения, имеющие увеличенную толерантность к катионам,могут быть отобраны для посева в почвах с высоким уровнем катионов или могут быть отобраны для программ селекции для получения толерантных к катионам сортов этого растения. Наконец, делается ссылка на стандартные руководства по молекулярной биологии, которые содержат способы проведения основных методик, включенных в это изобретение, включающих рестрикцию и лигирование ДНК для генерирования различных описанных здесь генетических конструкций. См., например, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork, 1982) и Sambrook et al. (2000, выше). Данное изобретение описывается далее следующими неограничивающими примерами: Краткое описание фигур Фиг. 1 показывает 14 С-меченный поток МА в штамме S. cerevisiae 31019b, сверхэкспрессирующемthe National Academy of Sciences 92: 9373-9377, 1995, с модификацией по M. Shelden (неопубликованной, либо содержащей YDR352w, YOL092w, либо не имеющей инсерции. Клетки выращивали и ресуспендировали в 20 мМ KPO4 буфере при рН 7,0. 50 мМ 14 С-меченный МА добавляли при Т=0 и клетки собирали фильтрованием через мембрану 0,45 мкм. Содержание МА определяли относительно общего клеточного белка. Значимость данных определяли посредством двухфакторного ANOVA, и указанная значимость является величиной относительно контроля с пустым вектором. YDR352w и YOL092w значимо различаются только после 30 мин потока (n=5). ( = величина Р 0,005;= величина Р 0,001;= величина Р 0,0001). Фиг. 2 показывает зависимый от концентрации поток 14 С-меченного МА. Штамм S. cerevisiae 31019b (mep1, mep2, mep3, ura3) (Marini et al., выше) трансформировали pYES3 (Smith et al., 1995,выше), либо содержащей YDR352w, YOL092w, либо не содержащей инсерции. Клетки выращивали и ресуспендировали в 20 мМ KPO4 буфере при рН 7,0. 14 С-меченный МА добавляли при различных концентрациях и клетки собирали фильтрованием через мембрану 0,45 мкм. Содержание МА определяли относительно общего клеточного белка. Значимость данных определяли посредством двухфакторногоANOVA, и указанная значимость является величиной относительно контроля с пустым вектором (n=6). Фиг. 3 показывает данные зависимого от времени потока 22Na в штамм Saccharomyces cerevisiae 31019b. Штамм S. cerevisiae 31019b (mep1,2,3, ura3A) (Marini et al., 2000, выше) трансформировалиpYES3 (Smith et al., 1995, выше), либо содержащей YDR352w, YOL092w, либо не содержащей инсерции. Панель А показывает общие данные, тогда как панель В показывает Na+-накапливание выше контроля пустого вектора, рассчитанное вычитанием величин пустого вектора из величин дрожжей, экспрессирующих белки с повторами PQ-петель. Клетки выращивали и ресуспендировали в 20 мМ KPO4 буфере при рН 7,0. 50 мМ 22Na-меченный NaCl добавляли при Т=0 и клетки собирали фильтрованием через мембрану 0,45 мкм. Содержание МА определяли относительно общего клеточного белка. Значимость данных определяли посредством двухфакторного ANOVA, и указанная значимость является величиной относительно контроля с пустым вектором. Наиболее вероятно, более высокое варьирование существует в этих данных вследствие нативных проводящих Na+ белков. Фиг. 4 показывает оптимизацию растворов ванны для анализа потока катионов в ооцитах Xenopuslaevis, экспрессирующих YDR352w. Ооциты Xenopus laevis инъецировали либо кРНК YDR352w, либо не содержащей нуклеаз H2O. Ооциты подвергали стандартному потенциал-протоколу в различных растворах ванн. А) 100 мМ Холин Cl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 5 мМ MES/Tris рН 6,5; В) 200 мМ маннит, 2 мМMgCl2, 1 мМ CaCl2, рН 7,0 Tris; С) 200 мМ маннит, 2 мМ MgCl2, 2 мМ BaCl2, рН 7,0 Tris; D) 200 мМ маннит, 5 мМ MES/Tris рН 7,0. Буфер D) не показал наличия Са 2+-активированного канала Cl-, и его использовали в качестве фона (базового буфера) для дальнейших экспериментов (n = минимально 4). Фиг. 5 А-С показывают влияние концентрации наружного Na+ на проводимость тока ооцитов, экспрессирующих белки с повторами PQ-петель S. cerevisiae. Ооциты, инъецированные кРНК из YDR352w или YOL092w, сравнивали с ооцитами, инъецированными не содержащей нуклеаз водой на протяжении диапазона концентраций Na+. Концентрации были 100 мМ NaCl (A), 10 мМ NaCl (В) и 1 мМ NaCl (С), в каждом случае в стандартном буфере, описанном в примере 7. При увеличении концентраций Na+ Erev- 16022359 смещается в направлении теоретического ENa в отличие от ECl, подтверждая, что Na+ является протекающим ионом (n=5). Фиг. 5D и Е показывают сравнение индуцированных токов в ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих белки с повторами PQ-петель S. cerevisiae, в виде функции концентрации наружного Na+. Отношение I/V между ооцитами, экспрессирующими YDR352W (А) или YOL092w (В) в ваннах с буферами,содержащими разные концентрации Na+. Буферами являются буферы на основе маннит/MES с NaCl, добавляемым в случае необходимости. При увеличении концентраций наружного Na+ Erev смещается вправо, в направлении рассчитанной величины ENa. Это подтверждает, что переносимым ионом является Na+,в отличие от Cl-, который может заставить ERev смещаться влево по мере увеличения концентраций (n=5). Фиг. 6 показывает действие ТЕА+ на поток Na+ через YDR352W и YOL092w. Исследовали влияние блокатора канала K+ ТЕА+ на YDR352w и YOL092W. Присутствие TEA (Буфер (А): 10 мМ ТЕА-ОН, 90 мМ NaCl, 5 мМ MES/Tris pH 7,0) показывало более сильный ток в сравнении с этими ооцитами в присутствии только 90 мМ NaCl (буфер (В): 90 мМ NaCl, 5 мМ MES/Tris). Это может быть обусловлено потоком ТЕА+ через эти белки или является результатом действия ТЕА+ в качестве агониста в отношении природных NSCC. Фиг. 7 А показывает активность NSCC для ооцитов Xenopus laevis, экспрессирующих YDR352w илиYOL092w. Отношение I/V YOL092w (А) или YDR352w (В), экспрессируемых в ооцитах, находящихся в ваннах в буферах с разными катионами. Раствор ванны был основой 200 мМ маннита и 5 мМ MES/Tris при рН 7,0 с катионами, добавляемыми, как описано выше. Фиг. 7 В показывает активность NSCC в сравнении с инъецированным Н 2 О контролем. Сравнение токов катионов через ооциты, инъецированные кРНК YDR352w или YOL092w, или инъецированные Н 2 О контроли. Данные для растворов ванн, содержащих 100 мМ Na+ (А), 100 мМ NH4+ (С) и 100 мМ холин+ (D) являются значимо отличающимися от инъецированного водой контроля. Данные для ооцитов в ваннах со 100 мМ K+ (В) не являются значимо отличающимися от инъецированного водой контроля вследствие большой величины активности нативных ооцитов Xenopus (n=5 для (А), (В) и (D). Для (С)n=2). Фиг. 8 показывает, что изменение аниона с Cl- на SO42-влияет на траектории тока. Замена раствора ванны 100 мМ NaCl (буфер (А): 100 мМ NaCl, 5 мМ MES/Tris pH 7,0) раствором ванны 50 мМ Na2SO4(буфер (В): 50 мМ Na2SO4, 5 мМ MES/Tris pH 7,0) слегка влияла на поток Na+ через YOL092w, но не влияла на поток, катализируемый экспрессией YDR352w. Ингибирование потока YOL092w в (В) может быть результатом измененного потока SO42-через мембраны (n=5). Панели А, В и С фиг. 9 показывают влияние различных наружных концентраций Са 2+ на Na+проводимость через YDR352w или YOL092w, экспрессируемых в ооцитах Xenopus. Индуцируемый в результате Na+-потока ток уменьшался присутствием Са 2+ в растворе ванны. Ток при 0 мМ Са 2+ (криваяI/V (А): 100 мМ NaCl, 5 мМ MES/Tris pH 7,0) уменьшался на приблизительно 50% после замены раствора ванны 2 мМ Са 2+-буфером (кривая I/V (В): 100 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 5 мМ MES/Tris pH 7,0). Замена раствора ванны 10 мМ Са 2+-буфером (кривая I/V (С): 100 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2, 5 мМ MES/Tris) уменьшает ток еще на приблизительно 20%. В целом 60% начального 0 мМ Са 2+-потока элиминируются добавлением 10 мМ CaCl2. Во всех графиках кривая I/V для экспрессирующих полипептид с повторамиPQ-петель ооцитов является значимо отличающейся от инъецированного Н 2 О контроля, n=5. Панели D, Е и F фиг. 9 показывают действие концентрации Са 2+ на поток Na+ через YDR352w иYOL092w, экспрессируемые в ооцитах Xenopus. Поток Na+ через ооциты Xenopus, экспрессирующие либо YDR352w (А), либо YOL092w (В), измеряли фиксацией напряжения (вольт-кламп-способом) в 100 мМ NaCl-растворе для ванны с различными концентрациями Са 2+. Na+ поток был наибольшим в отсутствие Са 2+ и прогрессирующим образом уменьшался с добавлением буферов, содержащих 2 мМ CaCl2 или 10 мМ CaCl2. Обратные смещения потенциала в направлении положительных потенциалов вместе с увеличенными концентрациями Са 2+, в направлении теоретического ECa вместе с предыдущей индукцией Са 2+-активируемого Clканала предполагают, что Са 2+-ингибирование потока Na+ может быть функцией транспортируемого Са 2+ (n=5). Фиг. 10 показывает репрезентативные траектории для данных, показанных на фиг. 4. Репрезентативные траектории тока регистрировали в ооцитах, инъецированных кРНК YDR352w (А, В, С и D) или не содержащей нуклеаз Н 2 О (Е, F, G и Н). Траектории согласуются с кривыми I/V предыдущей фигуры с А и Е для буфера А фиг. 4, В и F для буфера В, С и G для буфера С и D и Н для буфера D. Фиг. 11 А показывает МА+-токсичность и поглощение в штамме S. cerevisiae 31019b, трансформированном пустым вектором pYES3. Штамм S. cerevisiae 31019b трансформировали пустым векторомpYES3-DEST и клетки выращивали и высевали. Минимальную среду Гренсона (Grenson, Biochimica etBiophysica Acta 127: 339-346, 1966) дополняли 0,1% L-пролином, 100 мМ МА и 2% галактозой с Са 2+ и рН, модулируемыми следующим образом: 1) 10 мМ Са 2+ рН 6,5; 2) 0,2 мМ Са 2+ рН 6,5; 3) 10 мМ Са 2+ рН 7, 0, 4) 0,2 мМ Са 2+ рН 7,0; 5) YNB + 2% глюкоза в качестве контрольной загрузки. Фиг. 11 В показывает МА+-токсичность и поглощение в штамме S. cerevisiae 31019b, трансформированном YDR352w в галактоза-индуцируемом векторе BG1805. Штамм S. cerevisiae 31019b трансформировали дрожжевым вектором BG1805, содержащим YDR352w. (А) Клетки выращивали и высевали. Ми- 17022359 нимальную среду Гренсона (Grenson, 1966, выше) дополняли 0,1% L-пролином, 100 мМ МА и 2% галактозой с Са 2+ и рН, модулируемыми следующим образом: 1) 10 мМ Са 2+ рН 6,5; 2) 0,2 мМ Са 2+ рН 6,5; 3) 10 мМ Са 2+ рН 7,0, 4) 0,2 мМ Са 2+ рН 7,0; 5) YNB + 2% глюкоза в качестве контрольной загрузки. (В) Трансформированные клетки 31019b инкубировали в реакционном буфере, содержащем 0,5 мМ 14 С-МА,20 мМ KPO4- и 2% D-галактозу при рН 7,0. Результирующее поглощение 14 С-МА измеряли в собранных клетках с использованием сцинтилляционного счетчика после 20 мин инкубирования. Данные представлены в виде среднегоSE (n=10). Фиг. 11 С показывает МА+-токсичность и поглощение в штамме S. cerevisiae 31019b, трансформированном YOL092w в галактоза-индуцируемом векторе BG1805. Штамм S. cerevisiae 31019b трансформировали дрожжевым вектором BG1805, содержащим YOL092w. (А) Клетки выращивали и высевали. Минимальную среду Гренсона (Grenson, 1966, выше) дополняли 0,1% L-пролином, 100 мМ МА и 2% галактозой с Са 2+ и рН, модулируемыми следующим образом: 1) 10 мМ Са 2+ рН 6,5; 2) 0,2 мМ Са 2+ рН 6,5; 3) 10 мМ Са 2+ рН 7,0, 4) 0,2 мМ Са 2+ рН 7,0; 5) YNB + 2% глюкоза в качестве контрольной загрузки. (В) Трансформированные клетки 31019b инкубировали в реакционном буфере, содержащем 0,5 мМ 14 С-МА,20 мМ KPO4- и 2% D-галактозу при рН 7,0. Результирующее поглощение 14 С-МА измеряли в собранных клетках с использованием сцинтилляционного счетчика после 20 мин инкубирования. Данные представлены в виде среднегоSE (n=10). Фиг. 12 показывает протокол напряжения для описанных здесь электрофизиологических данных. Фиг. 13 показывает сопоставление CLUSTAL-W YDR352w, YOL092w и YBR147w с повторами PQпетель S. cerevisiae, и предположительные представляющие интерес области отмечены. Аминокислотные последовательности YDR352w, YOL092w и очень сходного YBR147w сопоставляли с использованием алгоритма CLUSTAL-W. Имеется высокая степень консервативности последовательности, особенно в трансмембранных доменах и "PQ петля"-областях. Предположительные G-белоксвязывающие области предсказаны из Chung et al. (J. Biol. Chem. 276: 40190-40201, 2001). Трансмембранные домены предсказывали с использованием адаптированного Gene3D (Buchan et al., Genome Res. 12: 503-514, 2002) в SGD. Фиг. 14 показывает филогенетическую схему (кладограмму) белков Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae, Oryza sativa, Triticum aestivum, Schizosaccharomyces pombe и Homo sapiens, которые обнаруживают сходство последовательности с YDR352w. Последовательность белка YDR352w сравнивали с базами данных белковых последовательностей посредством алгоритма BLAST с использованием стандартных параметров для NCBI. Были найдены также дополнительные белковые последовательности аннотированных содержащих повторы PQ-петель белков. Последовательности белков сопоставляли с использованием алгоритма CLUSTAL-W и создавали филогенетическую схему (Mac Vector, USA). Фиг. 15 показывает репрезентативные зависимые от времени профили тока ооцитов, инъецированных кРНК YDR352w (А, В, С), кРНК YOL092w (D, E, F) или H2O (G, Н, I). Ооциты помещали в баню в базовый буфер (см. способы этой главы) с добавлением 1 мМ NaCl (A, D, G), 10 мМ NaCl (В, Е, Н) или 100 мМ NaCl (С, F, I). Фиг. 16 показывает репрезентативные зависимые от времени профили тока ооцитов, инъецированных кРНК YDR352w (А, В), кРНК YOL092w (С, D) или Н 2 О (Е, F). Ооциты помещали в баню в базовый буфер (см. способы этой главы) с добавлением 100 мМ NaCl (А, С, Е) или 50 мМ Na2SO4 (В, D, F). Фиг. 17 показывает филогенетическую схему белков, которые обнаруживают некоторую степень сходства с YDR352w и YOL092w при сравнении с публично доступными геномными базами данных. Фиг. 18 показывает кладограмму белковых последовательностей двух дрожжей (Yo1092wp иYdr352wp), шести Arabidopsis (AtPQL1-6), трех белковых последовательностей риса (Os01g16170,Os07g29610 и Os12gl8110), шести Physcomitrella patens (Рр 174957, Рр 182799, Рр 217317, Рр 210671,Рр 159185 и Рр 160065) и двух бактериальных (FtPQL и UpPQL) белков с повторами PQ-петель (для закрепления схемы). Белки с повторами PQ-петель высших растений подразделяются на клады I, II и III. Фиг. 19 является диаграммой, показывающей предсказанную топологию белков с PQ-петлями из дрожжей - Yo1092wp (верхняя левая панель) и Arabidopsis - AtPQL1, 2 и 3 (верхняя правая, нижняя левая, нижняя правая панели соответственно). Фиг. 20 иллюстрирует результаты анализа солечувствительности Saccharomyces cerevisiae, трансформированного AtPQL1, AtPQL2 или AtPQL3. Десятикратные серийные разведения наносили в виде пятен на SD-урацил-среду, дополненную 500 мМ NaCl и/или 10 мМ CaCl2. Чашки инкубировали при 30 С в течение 2 дней. Дрожжи, экспрессирующие AtPQL1, обнаруживают уменьшенную скорость роста в сравнении с контролем, которая восстанавливалась добавлением 10 мМ CaCl2. Дрожжи, экспрессирующие AtPQL2, обнаруживали также увеличенную солечувствительность в сравнении с контролем. Опять, эта чувствительность могла быть восстановлена 10 мМ CaCl2, что указывает на то, что Са 2+ может взаимодействовать с AtPQL2. Фиг. 21 является диаграммой, показывающей рост S. cerevisiae трансформированного AtPQL1,AtPQL2 или AtPQL3. Клетки росли в SD-урацил-среде, дополненной либо 0 мМ CaCl2, либо 10 мМCaCl2. Рост выражен в виде процента выше максимального роста контроля (n=3). Дрожжи, экспрессирующие AtPQL1, обнаруживают уменьшенную скорость роста в сравнении с контролем, которая восста- 18022359 навливается добавлением 10 мМ CaCl2. Фиг. 22 является диаграммой, показывающей уменьшение роста S. cerevisiae, трансформированногоCaCl2, либо 10 мМ CaCl2. Рост выражен в виде процента выше максимального роста контроля (n=3). Дрожжи, экспрессирующие AtPQL1, обнаруживают увеличение солечувствительности в сравнении с контролем. Эта чувствительность могла быть восстановлена 10 мМ CaCl2. Фиг. 23 А является диаграммой, показывающей накапливание биомассы выращиваемых в условиях гидропоники растений без добавления NaCl. K.О = линии с нокаутом гена, amiRNA = линии с нокдауном гена, 35S = сверхэкспрессирующие линии. Трансгенные линии являются расщепляющимися и, следовательно, содержат нули. Результаты представлены как среднеестандартная ошибка среднего. Фиг. 23 В является диаграммой, показывающей накапливание биомассы выращиваемых в условиях гидропоники растений после 3 дней добавления 50 мМ NaCl. K.О = линии с нокаутом гена, amiRNA = линии с нокдауном гена, 35S = сверхэкспрессирующие линии. Трансгенные линии являются расщепляющимися и, следовательно, содержат нули. Результаты представлены как среднее стандартная ошибка среднего. Фиг. 24 является диаграммой, показывающей солевыносливость выращиваемых в условиях гидропоники растений. Процент солевыносливости рассчитывали делением средней биомассы каждой линии,испытывающей стресс, вызванный засолением, на среднюю биомассу той же самой линии, находящейся в контрольных условиях. K.О = линии с нокаутом гена, amiRNA = линии с нокдауном гена, 35S = сверхэкспрессирующие линии. Трансгенные линии являются расщепляющимися и, следовательно, содержат нули. Фиг. 25 показывает концентрации натрия в расщепляющихся Т 2 35SOsPQL1 растениях риса, которые росли в условиях гидропоники в течение 2 недель перед добавлением 75 мМ NaCl в течение 12 дней. Пламенная фотометрия 3-го полностью распустившегося листа определила, что растения из обеих линий имели значимо более низкий Na+ в побегах, чем растения Nipponbare дикого типа (WT) (n=12). 35SOsPQL-A и 35S-OsPQL-B являются независимыми трансформантами каллусов риса, трансформированных той же самой конструкцией 35SOsPQL. Фиг. 26 показывает локализацию AtPQL1 в эпидермальных клетках табака. ДНК-конструкции с зеленым флуоресцентным белком (GFP), слитым с белком AtPQL1, были любезно предоставлены доктором Анной Антман (Университет Глазго) и были трансформированы в эпидермальные клетки табака. Локализацию GFP визуализировали с использованием конфокальной микроскопии. Пример 1. Белки с повторами PQ-петель в качестве предположительных viNSCC в Saccharomyces cerevisiae. Для идентификации предположительных viNSCC был разработан скрининг на основе Saccharomyces cerevisiae. Этот скрининг зависел от потока NH4+-аналога метиламмония (МА) через viNSCC для получения фенотипа токсичности в дрожжах. Посредством изменения концентрации Са 2+ и рН среды для выращивания авторы изобретения смогли выполнять отбор на белки, проявляющие фенотипы, ожидаемые от сверхэкспрессируемых viNSCC. Этот скрининг идентифицировал два белка класса с повторами PQ-петель, которые обнаруживали фенотипическую реакцию, проявляемую сверхэкспрессирующимися viNSCC в дрожжах (фиг. 11 А, В и С). Была разработана серия экспериментов для подтверждения, что эти белки ведут себя как viNSCC. Пример 2. Поток катионов в Saccharomyces cerevisiae, сверхэкспрессирующем YDR352w или YOL092w.YDR352w и YOL092w отбирали на основе их способности придавать фенотип токсичности в клетках штамма S. cerevisiae 31019b в присутствии токсических концентраций МА. Этот штамм не имеет функциональной экспрессии всех трех из его нативных высокоаффинных NH4+/MA-транспортеров, что позволяет ему выживать на средах, содержащих высокие концентрации МА. Сверхэкспрессия YDR352w и YOL092w приводила к фенотипу токсичности, который ослаблялся увеличенным Са 2+ (фиг. 11 А, В и С). Для подтверждения этого фенотипа измеряли результат увеличенного поступления МА, потока 14 С-меченого МА при наружной концентрации 0,5 мМ МА. Клетки, сверхэкспрессирующие либо YDR352w, либо YOL092w, приводили к увеличенному накапливанию МА на протяжении времени при сравнении с пустым вектором-контролем. Поглощение осуществлялось согласно арифметической регрессии и имело скорость накапливания в 2,5-3 раза большую, чем скорость накапливания пустого вектора-контроля, при 30 минутах (фиг. 1). Исследовали также зависимый от концентрации поток через эти белки (фиг. 2). Поглощение МА осуществлялось с ненасыщаемым профилем,значимо более высоким, чем пустой вектор-контроль. Клетки, сверхэкспрессирующие YDR352w, обнаруживают более высокую способность потока МА, чем клетки, сверхэкспрессирующие YOL092w, хотя каждый из них обнаруживает значимую активность LATS относительно пустого вектора-контроля. Исследование ионоселективности в клетках, экспрессирующих либо YDR352w, либо YOL092w,проводили с использованием анализа 22Na-потока (фиг. 3 А и В) Na+-поток был значимо большим в клетках, сверхэкспрессирующих YDR352w и YOL092w, в сравнении с клетками с пустым вектором- 19022359 контролем. Пример 3. Характеристика YDR352w- и YOL092w-опосредованного потока посредством экспрессии в ооцитахXenopus laevis. Ооциты Xenopus laevis применимы для исследования электрофизиологии мембраносвязанных белков. кРНК YDR352w использовали для оптимизации условий для анализа потока катионов через белки с повторами PQ-петель. Первоначальные эксперименты использовали холин-Cl в качестве преобладающего катиона в растворе ванны. Это позволяет получить хорошее протекание электрического тока без его транспорта вследствие его размера. Эти эксперименты выявили сильную индукцию тока в ооцитах, инъецированных кДНК YDR352w, при фиксации напряжения при гиперполяризующих потенциалах (фиг. 4,панель А и фиг. 10, панель А). Это является показателем нативного Са 2+-активированного ClканалаXenopus. Индукция этого тока предполагает, что либо экспрессируемый белок индуцирует нативный Са 2+-активируемый Clканал, либо YDR352w облегчает поток Са 2+ в ооциты и возбуждает ток этого Са 2+-активируемого Clканала. Этот ток будет препятствовать наблюдению входящего положительного тока и, следовательно, должен быть минимизирован. Для уменьшения потенциальных источников варьирования использовали минималистический раствор ванны, 200 мМ маннит, забуференный до рН 7,0, с минимальным количеством Tris-Cl. С 1 мМ CaCl2 и 2 мМ MgCl2 в этом базовом буфере (фиг. 4, панель В и фиг. 10, панель В) присутствовали токи, сходные с Са 2+-активируемым Clканалом, хотя гораздо меньшие в сравнении с траекториями с базовым буфером на основе холин-Cl. Это указывает на то, что либо более высокая концентрация наружного Cl- индуцировала Са 2+-активируемый Cl- канал, либо сам холин протекал через этот белок и способствовал общему потоку при отрицательных потенциалах мембраны, либо, возможно, на комбинацию обоих вариантов. Замена Са 2+ на Ва 2+ дополнительно уменьшала различие между инъецированными YDR352w ооцитами и инъецированными водой ооцитами (фиг. 4,панель С и фиг. 10, панель С), что предполагает, что присутствие Са 2+ индуцировало протекание электрического тока. Удаление всех двухвалентных катионов с оставлением только 5 мМ MES/Tris эффективно элиминировало входящий положительный/выходящий отрицательный ионный поток при отрицательных потенциалах (фиг. 4, панель D и фиг. 10, панель D). Вследствие низкого протекания электрического тока, наблюдаемого при отрицательных мембранных потенциалах, условиях, при которых может наблюдаться входящий поток катионов, этот буфер был выбран в качестве основы (базового буфера) для дальнейших экспериментов. Пример 4. Характеристика потока катионов в ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих YDR352w иYOL092w. Характеристика транспортеров/каналов в электрофизиологии обычно включает анализ аффинности молекулярных частиц и идентификации блокаторов. YDR352w и YOL092W исследовали с использованием таких способов. Поток Na+, холина+ и Са 2+ увеличивался в ооцитах X. laevis, инъецированных кРНК либо YDR352w, либо YOL092w, в сравнении с инъецированными водой контролями. Предварительные эксперименты также позволяют предположить, что поток МА+, NH4+ и K+ также модифицируется при экспрессии этих белков. Из катионов, используемых для тестирования экспрессии в X. laevis, Na+ оказался наиболее применимым. Природные токи в инъецированных водой контролях были относительно малыми, и испытанные белки вызывали большие индуцируемые Na+ токи. Для гарантии, что наблюдаемые токи обусловлены вхождением Na+, а не оттоком Cl-, использовали буферы, включающие ряд буферов с различающимися концентрациями NaCl (фиг. 5, панели А, В и С). По мере увеличений концентрации Na+ потенциал реверсии (Erev) построенной кривой I/V становился более положительным (фиг. 5, панели D и Е) в соответствии с притоком катиона в противоположность оттоку аниона Cl-. Значимо более высокий поток регистрировали как для поступления, так и для вытекания катионов в сравнении с инъецированным водой контролем для всех исследованных концентраций Na+ (фиг. 5, фиг. 15). В то время как было установлено, что направленный внутрь поток (входящий поток) является результатом Na+, отток катионов, наблюдаемый при положительном мембранном потенциале, не может быть следствием притока Na+. Наиболее вероятно, что этот наблюдаемый поток является следствием перемещения K+, так как он является доминантным одновалентным катионом в ооците. Подобный увеличенный направленный наружу поток наблюдается в инъецированных YDR352w ооцитах, когда фиксация напряжения наблюдается при положительных потенциалах в базовом буфере (фиг. 4, панель D и фиг. 10,панель D). Это согласуется с тем, что белки с повторами PQ-петель способствуют бинаправленному потоку катионов.K+ часто является доминантным катионом, участвующим в катионных потоках в экспрессионных системах дрожжей и ооцитов Xenopus, и может иногда способствовать потоку других катионов. Таким образом, он является релевантным для исследования влияния природных K+-транспортных систем на поток, регистрируемый из белков с повторами PQ-петель. Для этой цели использовали ТЕА+ в его роли в качестве блокатора K+-каналов. Добавление 10 мМ ТЕА+ к раствору ванны, содержащей 90 мМ NaCl, не изменяло общих тенденций потока, но действительно влияло на величину электрического тока (фиг. 6).- 20022359 Эти данные предполагают, что либо ТЕА+ переносится YOL092w и YDR352w, либо ТЕА+ действует в качестве агониста в отношении NSCC-индуцируемых траекторий, увеличивая их способность переносаNa+. Потенциалы реверсии не изменяются значимо добавлением ТЕА+, что предполагает, что ТЕА+ сам не переносится. Возможно, что любое различие в Erev затмевается присутствием гораздо более высоких внутренних концентраций Na+ и K+. Возможный поток ТЕА+ является интригующим при условии структурных сходств между ТЕА+, МА и NH4+ и наблюдаемых характеристик потоков МА и NH4+ (фиг. 1, 2 и 7). Влияние Cl- на наблюдаемые токи исследовали с заменой NaCl на Na2SO4 (фиг. 8). Токи были неизменными для ооцитов, экспрессирующих YDR352w, что позволяет предполагать, что на эти макроскопические токи не влияла наружная концентрация Cl-. Токи для YOL092w уменьшались заменой Cl- наSO42+. Это может быть обусловлено либо уменьшением Clиндуцируемого действия, либо реакцией на добавленный SO42+. Анализ селективности катионов предполагает, что белки с повторами PQ-петель имеют слабую способность различения между одновалентными катионами. Поток холина+, Na+, K+ и NH4+ увеличивается в ооцитах, экспрессирующих YDR352w или YOL092w (фиг. 7). Контрольные ооциты обнаруживали высокую степень потока K+, который маскировал любой потенциальный поток K+ через испытанные белки с повторами PQ-петель. NH4+ измеряли в ооцитах, инъецированных YDR352w и только H2O. С этими доступными данными можно с большой уверенностью предположить, что YDR352w способствует потоку NH4+. Исследовали также действие различных концентраций Са 2+ на поток Na+ в ооцитах, экспрессирующих YDR352w и/или YOL092w (фиг. 9). Значимое уменьшение как во входящем, так и в выходящем токе регистрировали с добавлением 2 мМ CaCl2 и, еще большее, с добавлением 10 мМ CaCl2. Пример 5. Анализ потока 14 С-меченного МА и потока 22Na-меченного Na+. Вектор pDONR (Invitrogen), содержащий либо YDR352w, либо YOL092W, использовали для рекомбинации представляющего интерес инсерта в вектор pYES2-DEST с использованием реакции LRклоназы (Invitrogen). Клетки, содержащие YDR352w или YOL092w в pYES3-DEST, или пустой вектор,выращивали до насыщения в жидкой YNB, дополненной 2% D-глюкозой (мас./об.), собирали центрифугированием при 4000g в течение 4 мин и использовали для инокуляции жидкой среды Гренсона при рН 6,5 с 0,1% L-пролином и 2% D-галактозой (мас./об.) до OD600=0,1. Клетки инокулировали в течение ночи при 28 С со встряхиванием при 200 об/мин и собирали при OD600=0,4-0,7 центрифугированием при 4000g, промывали дважды в воде MilliQ и ресуспендировали в 20 мМ KPO4 буфере рН 6,5 с 2%(мас./об.) D-галактозой с получением OD600 4-6. Исходный раствор 1 М MACl или NaCl добавляли к 20 мМ KPO4 буферу с рН 7,0 до требуемой концентрации и метили либо 14 С MA (Amersham), либо 22Na(Amersham). Полученный раствор добавляли к равному объему ресуспендированных клеток при t=0 и встряхивали непрерывно на протяжении эксперимента с анализом потоков. В указанное время брали пробы, пропускали их через нитроцеллюлозный фильтр 0,45 мкМ (Whatman) и промывали 10 мл охлажденного на льду 20 мМ KPO4 буфера для прекращения потока. Мембраны собирали, помещали в сцинтилляционные флаконы на 7 мл (Sarstedt) и добавляли 4 мл сцинтилляционной жидкости (Perkin Elmer). Пробы считали в жидкостном сцинтилляционном счетчике (Packard). Счет преобразовывали в эквивалентное количество МА+ или Na+ и пробы нормализовали в отношении общего белка, полученного с использованием модифицированного способа Лоури (Peterson, Analytical Biochemistry 83: 346-356, 1977). Пример 6. Синтез кРНК и инъекция в ооциты X. laevis. Ооциты Xenopus laevis получали, как в стандартных протоколах (Zhou et al., Plant, CellEnvironment 30: 1566-1577, 2007) с применением раствора Calcium Frog Ringers (96 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 5 мМMgCl2, 5 мМ HEPES, 0,6 мМ CaCl2) плюс 8% лошадиная сыворотка, 0,1 мг/мл тетрациклин, пенициллин 1000 единиц/мл и стрептомицин 0,1 мг/мл). Вектор pDONR (Invitrogen), содержащий либо YDR352w,либо YOL092w, использовали для рекомбинации представляющего интерес инсерта в вектор pGEMHE с использованием реакции LR-клоназы (Invitrogen). Вектор pGEMHE, содержащий представляющий интерес ген, расщепляли в течение ночи Sph1 (NEB) для линеаризации этой ДНК. Набор для транскрипцииmMessage mMachine 5'-кэппированной РНК (Ambion) использовали в соответствии с протоколом изготовителя для синтеза кРНК для представляющего интерес гена. Концентрацию кРНК нормализовали относительно 1 мкг/мкл и 46 нл инъецировали в каждый ооцит с использованием микроинъектора (Drummond"Nanoject II" automatic nanolitre injector, Drummond Scientific, Broomall, PA, USA). Контрольные ооциты инъецировали 46 нл не содержащей нуклеаз Н 2 О. Инъецированные ооциты инкубировали при 16 С в растворе Calcium Frog Ringers в течение 3 дней перед использованием. Пример 7. Электрофизиология белков с повторами PQ-петель S. cerevisiae, экспрессируемых в ооцитахXenopus laevis. Если нет иных указаний, фиксацию напряжения (вольт-кламп-способ) выполняли при 25 С в базо- 21022359 вом буфере, состоящем из 5 мМ MES/Tris при рН 7,0, с добавленными представляющими интерес ионами. Для поддержания осмолярности 200 мОсм использовали маннит. Сигнал усиливали с использованием усилителя Gene Clamp 500 voltage clamp amplifier (Axon Instruments, Molecular Devices, Sunnyvale, CA,USA) и изображали с использованием Clampex 8.2 (Axon Instruments). Ооциты прокалывали стеклянными капиллярами, заполненными 3 М KCl. Электроды, ответственные за поддержание фиксации напряжения и протекание электрического тока, помещали в этот раствор 3 М KCl. Используемым протоколом напряжения был протокол, показанный на фиг. 12. Пример 8. Обсуждение. Первоначально считалось, что потенциалонечувствительные NSCC являются токами "утечки" при наблюдении их в экспериментах с пэтч-клампом. Наблюдение опосредованного каналом тока через эти белки часто требует низкой концентрации наружного Са 2+, и, следовательно, считалось, что этот ток является результатом потери целостности мембраны. Детальное исследование установило, что поток одновалентных катионов превосходил поток двухвалентных катионов и, следовательно, расшифровало присутствие этих белков. С момента открытия этих белков проводился поиск генетической идентичности потенциалонечувствительных NSCC. Токи со свойствами viNSCC были зарегистрированы в клетках "пейсмекера" синусно-предсердного (синусного) узла сердец кроликов и могут играть важную роль в регуляции сердцебиения. Сходные токи были зарегистрированы также, например, в ооцитах Xenopus, многих видах растений и дрожжах. Поскольку эти белки катализируют поток одновалентных катионов высокой эффективности, они имеют потенциал значимого влияния на функцию клеток. Именно этот потенциал делает viNSCC сильными кандидатами для большого потока Na+, наблюдаемого в растениях при подвергании их действию условий засоления. До сих пор молекулярные идентичности viNSCC не были известными. Это обусловлено, вероятно,трудностями в использовании гетерологичных скринингов, так как viNSCC пассивно катализируют ионный поток и, следовательно, обнаруживают трудно уловимые фенотипы. Поток как 14 С-меченного МА+, так и 22Na+-меченный поток позволяли предположить, что YDR352w и YOL092w были каналами катионов. Поток 14 С-меченного МА обнаруживал стойко более высокую скорость потока МА в диапазоне для сверхэкспрессирующих YDR352w и YOL092w клеток в сравнении с пустым вектором в качестве контроля (фиг. 1). Профиль концентраций обнаружил, что эти белки проявляют ненасыщаемую кинетику поглощения МА в диапазон LATS дрожжей (фиг. 2). Эксперименты с 22Na+-потоком отображали данные потока МА+, показывая увеличенную скорость вхождения Na+ в клетки, сверхэкспрессирующие YDR352w или YOL092w, в сравнении с трансформированными пустым вектором контрольными клетками (фиг. 3 А и В). Увеличенная способность притока катионов, наблюдаемая в клетках, сверхэкспрессирующих какYDR352w, так и YOL092w, согласуется с увеличенной способностью, ожидаемой для сверхэкспрессируемых viNSCC. Поток как при 50 мМ МА+, так и при 50 мМ Na+ был большим, чем поток пустого вектора в качестве контроля. Поток становится значимо отличающимся от контроля-пустого вектора только после 5 мин потока с 50 мМ МА+ (фиг. 1) или после 15 мин с 50 мМ NaCl (фиг. 3 А и В). Подобным образом, разрешение между пустым вектором в качестве контроля и кандидатными белками в профилях концентрации МА было получено только при 25 мМ для YDR352w и 50 мМ для YOL092w. Природные белки дрожжей, которые имеют поток либо МА, либо Na+ (либо обоих), являются активными в этом штамме. Они включают YDR352w и YOL092w, кандидатные NSCC авторов этого изобретения. Таким образом, контроли с пустым вектором будут вести себя подобно клеткам, трансформированным кандидатными генами, причем различием является сверхэкспрессия кандидатного белка в этих трансформированных клетках. В результате ожидается и наблюдается слабое разрешение, особенно для потока Na+, так как все еще присутствуют транспортеры Na+. Разрешение для потока МА является, вероятно, лучшим, чем дляNa+, так как природные МЕР были делетированы из этого штамма. Тем не менее, значимые различия в профилях потока МА и Na+ наблюдаются в трансформированных кандидатным геном клетках в сравнении с контрольными клетками. Экспрессия кРНК YDR352w и YOL092w в Xenopus значимо увеличивала протекание электрического тока в ооцитах в содержащем Na+ растворе ванны. На величину тока влияла концентрация Na+ с более высоким током, наблюдаемым при более высоких концентрациях Na+ (фиг. 5). Чем более высокой была концентрация Na+, тем больше смещался положительно Erev. Это подтверждает, что регистрируемый ток был результатом потока Na+ в противоположность Cl-. Подтверждение этого признака достигалось посредством замены 100 мМ NaCl 50 мМ Na2SO4 (фиг. 8), обнаруживающим малое различие в Erev. Как YDR352w, так и YOL092w обнаруживают сходную физиологию как при сверхэкспрессии в дрожжах, так и при экспрессии в ооцитах Xenopus. Это не является неожиданным, так как они имеют много общих последовательностей и предсказанных структурных признаков. Трудно уловимые различия являются очевидными в этих данных, что предполагает дискретные роли для каждого белка. Эти белки обнаруживают различия, находясь в гиперполяризованной мембране. Отношение сила тока/напряжение- 22022359 является в не содержащем Са 2+ растворе ванны с Na+ приемлемо линейным для обоих белков в диапазоне исследованных потенциалов. Однако YOL092w обнаруживает потерю линейности при потенциалах -70 мВ и менее, отражая реакцию, показанную в инъецированных водой контрольных ооцитах. Наблюдаемые токи обнаруживали различные степени временной зависимости. В целом токи, возбуждаемые через YDR352w, обнаруживали малую зависимость от времени (фиг. 10, панели А, В и С и фиг. 15, панели А, В и С). Некоторую временную зависимость наблюдали при низких мембранных потенциалах при использовании SO42- в качестве связанного с Na+ аниона (фиг. 16, панели А и В). Поскольку этого не наблюдали, когда противоионом является Cl-, и различия также наблюдали как в инъецированных YOL092w (фиг. 16, панели С и D), так и в инъецированных водой ооцитах (фиг. 16, панели Е иF), это может быть артефактом присутствия SO42- в растворе ванны. YOL092w-возбуждаемые токи были наиболее независимыми от времени, за исключением случая, когда 100 мМ Na+ присутствовал в растворе ванны (фиг. 15, панели D, Е и F). При этих условиях токи, полученные при потенциалах -90 мВ и менее,обнаруживают зависимое от времени уменьшение, пока не достигается стационарное состояние после приблизительно 1,5 с. Измерения силы тока для генерирования кривых I/V брали в качестве среднего тока от 1,2 до 1,6 с в вольт-кламп-способе. Изменения в активности Са 2+ влияли на ток вследствие потока Na+ и слабо изменяли Erev (фиг. 9). Слабый положительный сдвиг Erev присутствует с увеличением концентрации Са 2+ в растворе ванны, что позволяет предположить, что Са 2+ может проходить через эти белки. Наблюдаемая активация Са 2+активируемого Cl- в ооцитах, экспрессирующих YDR352w (фиг. 4, панель А и фиг. 10, панель А), также позволяет предположить, что поток Са 2+ увеличивается. Ток уменьшался на приблизительно 50% во всех записях после перехода от содержащего 0 мМ Са 2+ раствора ванны к 2 мМ Са 2+-содержащему раствору ванны. Ток уменьшался дополнительно на 20% при увеличении концентрации Са 2+ с 2 мМ до 10 мМ. В целом добавление 10 мМ Са 2+ к ранее не содержащему Са 2+ раствору ванны уменьшает ток приблизительно на 60%. Слабая дискриминация между одновалентными катионами является определяющей характеристикой viNSCC. YDR352w и YOL092w исследовали в отношении селективности их каналов одновалентных катионов при экспрессии в ооцитах Xenopus laevis (фиг. 7 А и В). Поток холина+ и Na+ катализируется присутствием либо YDR352w, либо YOL092w. Предварительные данные в сильной степени предполагают, что потоки K+, NH4+ и МА+ также увеличиваются при экспрессии этих генов (фиг. 1, 2 и 7). Индукция Са 2+-активируемого Clканала, объединенная с ингибирующим действием Са 2+ на поток Na+, также предполагает, что поток Са 2+ также облегчается этими белками. Пример 9. Характеристика белков с повторами PQ-петель. Фенотипы роста на твердой среде (фиг. 11, панели А, В и С) и данные потока 14 С-меченного МА+(фиг. 1 и 2) предполагают, что YDR352w и YOL092w являются предположительными viNSCC. Оба эти белка относятся к классу белков с повторами PQ-петель. Таким образом, белки с повторами PQ-петель дрожжей являются наиболее вероятными кандидатами viNSCC. YDR352w и YOL092w, а также очень сходный YBR147w не имеют известной биологической или молекулярной функции в базе данных геномаSaccharomyces (SGD). YBR147w не был выбран поиском в базе данных генома, так как не было предсказано, что он является связанным с мембраной. Это, по-видимому, является ошибочным вследствие его сходства с другими белками с повторами PQ-петель. Белки с повторами PQ-петель характеризуются повторами пролина и глутамина (PQ) перед внемембранной петлей (фиг. 13). Они являются в значительной степени неаннотированными. Примерами охарактеризованных белков с повторами PQ-петель являются CTNS и MPDU1 человека, ERS1 S. cerevisiae и stm1+ из Schizosaccahromyces pombe. CTNS и ERS1 транспортируют L-цистин через биологические мембраны. Делеционные мутанты ERS1 в дрожжах предположительно участвуют в нарушении удерживания белков в ER. HsMPDU1 был ассоциирован с механизмом "флиппазы", включающим липидсвязанные олигонуклеотиды. Было показано, что Stm1 взаимодействует с G-белком и после этого обозначается как связанный с G-белком рецептор. Некоторая структурная информация была получена из исследованных белков с повторами PQпетель (фиг. 13). Петля 2 мотива PQ-петли может быть важной в локализации белка, как показано сHsCTNS. GFP-локализация других белков с повторами PQ-петель показала, что они интегрированы во множество мембран, причем показано, что петля 2 является жизненно важной для коррекции направленной миграции белков. Предсказано, что третий предсказанный домен Stm1 является сайтом взаимодействия G-белка. Это является особенно важным для любых каскадов передачи сигналов, в которых могут участвовать эти белки. BLAST-поиски YDR352w по всем доступным базам данных геномов выявил много сходных белков (фиг. 17), большинство из которых также являются неаннотированными, за исключением упомянутых ранее. Информация о профилях экспрессии доступна для ORF дрожжей через SGD. Исследование этих данных может дать некоторые представления о функции этих белков. На транскрипцию всех трех представляющих интерес генов влияет питательный статус дрожжей. Конкретно, сильные изменения регистрируются для дрожжей, которые находятся в стационарной фазе роста, множественного деления, N- 23022359 элиминации и Са 2+/Na+/кальциневрин-реакций. Эти реакции указывают на возможную связь с чувствительностью к ионам или транспортом ионов в клетке. Пример 10. Материалы и способы - фенотипы роста на твердых средах штамма S. cerevisiae 31019b, сверхэкспрессирующего кандидатные гены. Векторы с кандидатными генами получали из Open Biosysterns Yeast ORF Collection. Они состоят из отдельных ORF дрожжей, клонированных в вектор BG1805. Каждая ORF экспрессируется под контролем промотора Gall для высокой экспрессии, и она имеет стоп-кодон, удаляемый для включения метки в виде С-концевого белка НА (Gelperin et al., Genes and Development 19: 2816-2826, 2005). Каждый клон трансформировали в 31019b (Marini et al., Mol. Cell Biol. 17: 4282-4293, 1997) с использованием способа с ацетатом лития/полиэтиленгликолем (Gietz et al., Yeast 11: 355-360, 1995) и трансформанты отбирали на минимальной среде YNB. Трансформированные штаммы выращивали по отдельности в течение ночи в жидкой питательной базовой среде для дрожжей (BD biosciences, San Jose, USA; 0,67% (мас./об.), Dглюкоза 2% (мас./об.) рН 6,5) до поздней log-фазы. Клетки осаждали и промывали дважды в стерильной воде milliQ и ресуспендировали до OD600 0,3. Культуры серийно разводили до конечной OD600 0,003 и 5 мкл каждого разведения помещали на твердую минимальную среду для дрожжей (Grenson, Biochimica etBiophysica Acta 127: 339-346, 1966) с 0,1 М MA, 0,1% (мас./об.) L-пролином, 2% (мас./об.) D-галактозой при рН 7,0 либо с 0,2 мМ Са 2+, либо с 10 мМ Са 2+. Чашки инкубировали при 28 С в течение 5-7 дней и фенотипы роста подвергали мониторингу. Плазмиды, которые при экспрессии индуцировали фенотипы,показывающие увеличенную МА+-токсичность в клетках, отбирали и анализировали дополнительно. Пример 11. Растительные PQL - материалы и способы. Для исследования действия на Na+-накапливание в побегах AtPQL1 (At4g20100), AtPQL2(At2g41050) и AtPQL3 (At4g36850) конститутивно экспрессировали в Arabidopsis (табл. 2). Для исследования действия на Na+-накапливание в побегах OsPQL1 (Os01gl6170) конститутивно экспрессировали в рисе (табл. 2). AtPQL1, AtPQL2 и AtPQL3 экспрессировали также гетерологично в дрожжах. Таблица 2 Названия и номера доступа PQL-белков Arabidopsis и риса Экстракции ДНК и РНК и синтез кДНК. Геномную ДНК экстрагировали из молодых листьев Arabidopsis thaliana с использованием методологии Edwards et al. (Nucleic Acids Research 19: 1349, 1991). Вкратце, ткани побегов или корней растений мгновенно замораживали в жидком азоте и измельчали до тонкого порошка с использованием ступки и пестика. К этому порошку добавляли 400 мкл буфера Эдвардса (200 мМ Tris pH 8, 25 мМ ЭДТА, 250 мМNaCl и 0,5% ДСН) и эти пробы оставляли при комнатной температуре и выдерживали в течение 1 ч. Пробы центрифугировали при 13000g в течение 2 мин и супернатант удаляли. ДНК осаждали добавлением 300 мкл 100% изопропанола, инкубированием этих проб при комнатной температуре в течение 2 мин перед центрифугированием при 13000g в течение 5 мин. Осадки ДНК промывали 70% этанолом и давали высыхать на воздухе перед ресуспендированием в 100 мкл ТЕ-буфера. Общую РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), согласно протоколу, описанному в Chomczynski, BioTechniques 15: 532-537, 1993. ДНК-загрязнение удаляли с использованием не содержащего ДНК Ambion (Ambion, Madison, WI, USA) и 2 мкг общей РНК использовали для синтеза кДНК с использованием Superscript III (Invitrogen). Сверхэкспрессия AtPQL1-3 в Arabidopsis. Трансгенные растения Arabidopsis, конститутивно экспрессирующие гены AtPQL1, AtPQL2 иAtPQL3, использующие промотор 35S, получали от доктора Анны Амтман, University of Glasgow, UK. С использованием прямых праймеров целых генов AtPQL1, 2 или 3 и обратных праймеров целых геновAtPQL1, 2 или 3 (табл. 3), этот полный ген клонировали из геномной ДНК Arabidopsis Col-0 в исходный вектор pCR8 Gateway. Расщепление рестриктазами и секвенирование этой плазмиды использовали для подтверждения ориентации этого гена в данном векторе и для гарантии того, что нет ошибок в кодирующей последовательности клонированного гена. Затем для трансформации Arabidopsis этот ген переносили в целевой вектор pGWB2, с использованием реакции Gateway и трансформировали в Agrobacterium tumefaciens, штамм GV3101. Таблица 3 Последовательности пар праймеров, используемые для амплификации полного гена AtPQL1, 2 и 3 и OsPQL1SALK Т-ДНК нокаут. Все мутанты с нокаутом Т-ДНК получали из коллекции SALK через Nottingham Arabidopsis StockCentre (NASC, Nottingham, UK). Для отбора гомозигот растения выращивали индивидуально на почве и их зиготность испытывали выделением геномной ДНК и ПЦР с использованием праймеров, сконструированных Signal iSect tool (signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html) для детектирования инсерта Т-ДНК. Уровни транскрипта линий с нокаутом pql1-1 (SALK1108796) и pq13-1 (SALK044346) проверяли при помощи полуколичественной ПЦР с обратной транскрипцией. Нокдауны amiRNA. Поскольку AtPQL1-3 имеют высокую гомологию, возможно, что имеется избыточность в этом семействе генов. Для проверки этого, амиРНК-мутанты конструировали для нокдауна 2 или 3 генов(http://wmd2.weigelworld.org/cgi.bin/mirnatools.pl) использовали для идентификации двух содержащих 21 основание последовательностей, к которым могли быть сконструированы две независимые amiRNAконструкции, которые могли уменьшать экспрессию AtPQL12, AtPQL13, AtPQL23 илиAtPQL1,23. Праймеры (табл. 4), содержащие необходимые последовательности для генерирования содержащих 21 пару нуклеотидов amiRNA, включали в amiRNA-вектор MIR319a и цельные amiRNAконструкции клонировали вhttp://wmd2.weigelworld.org/cgi.bin/mirnatools.plpage=7. После секвенирования, для проверки на любые ошибки последовательности и для определения правильной ориентации этой последовательности выполняли Gateway LR для переноса этих amiRNA-конструкций в векторы pTOOL2, которые могут использовать промотор 35S для запуска экспрессии этих amiRNA. Таблица 4 Последовательности-мишени и праймеры amiRNA Трансформации Arabidopsis. Экотип Arabidopsis Col-0 трансформировали посредством способа погружения цветков (CloughBent, The Plant Journal 16: 735-743, 1998), с использованием Agrobacterium tumefaciens, штамма GV3101,с векторами pGWB2 или TOOL2, содержащими либо сверхэкспрессию 35S, либо конструкции amiRNA. Из трансформированных растений собирали семена и проращивали на искусственной почвенной среде(AgrEvo, Dusseldorf, Germany) для идентификации предположительных Ti-трансформантов. Трансформанты переносили в почву, поливали один раз в неделю 300 мл питательного раствора (2 мМ Ca(NO3), 15 мМ KNO3, 0,5 мМ MgSO4, 0,5 мМ NaH2PO4, 15 мМ NH4NO3, 2,5 мкМ NaFe-ЭДТА, 200 мкМ Н 3 ВО 3, 0,2 мкМ Na2MoO4, 0,2 мкМ NiCl2, 1 мкМ ZnSO4, 2 мкМ MnCl2, 2 мкМ CuSO4 и 0,2 мкМ CoCl2) и выращивали до цветения для сбора Т 2-семян. Анализы стресса Arabidopsis, вызванного засолением. Семена из мутантных линий (35S, Т-ДНК КО, или amiRNA, описанные выше) стерилизовали на поверхности замачиванием в 70% этаноле в течение 2 мин с последующими 5 промываниями в стерильной воде milli-Q, перед посевом отдельных семян в крышках микрофужных пробирок на 1,5 мл, заполненных раствором для проращивания Arabidopsis (табл. 5) с 0,8% Бактоагаром, рН 5,6. Эти крышки помещали в подносы для проращивания, находящиеся в растворе для проращивания Arabidopsis. Эти семена яровизировали в течение 2 дней при 4 С и затем переносили в камеру роста с фотопериодом 10 ч света/14 ч темноты, освещением 150 мкмоль/м 2 в секунду, и постоянной температурой 21 С. После 2-3 недель в подносах для проращивания растения переносили в постоянно аэрируемую емкость для гидропоники,содержащую раствор для гидропоники для Arabidopsis (табл. 5). рН питательного раствора для гидропоники подвергали мониторингу и поддерживали при рН 5,6. Стресс, вызываемый засолением, применяли спустя 1 неделю после помещения в резервуары для гидропоники добавлением 50 мМ NaCl с 4-часовыми пополнениями 25 мМ. Активность кальция в среде для выращивания поддерживали при 0,3 мМ при каждом внесении соли добавлением правильного количества кальция, рассчитанного с использованием Visual Minteq Version 2.3 (US Environmental Protection Agency, USA). Растения собирали после 3 дней солевой обработки. Последний полностью раскрывшийся лист удаляли, взвешивали и расщепляли 1% азотной кислотой в течение ночи при 85 С в Hot Block (Environmental Express, Mt Pleasant, South Carolina, USA). Концентрации Na+ и K+ в этом листе измеряли с использованием модели 420 пламенного фотометра (Sherwood, UK). Трансформация риса. Полноразмерный OsPQL1 клонировали из растений риса Nipponbare дикого типа в исходный векторpCR8 Gateway. Расщепление рестриктазами и секвенирование этой плазмиды использовали для подтверждения ориентации этого гена в данном векторе и для гарантии того, что нет ошибок в кодирующей последовательности клонированного гена. Затем для трансформации риса этот ген переносили в целевой вектор pMDC32, с использованием реакции Gateway. Эту плазмиду отсылали в CIRAD, Montpellier,France, для трансформации риса. Анализы стресса риса, вызванного засолением. Семена риса 35SOsPQL1 и Nipponbare дикого типа проращивали в течение 5 дней на увлажненной фильтровальной бумаге при 28 С/25 С день/ночь, влажности 80%/60% день/ночь и свете 600 мкмоль/м 2 в секунду с циклом свет/темнота 12 ч света/12 ч ночи. Проростки удаляли с фильтровальной бумаги и помещали в микрофужные пробирки на 1,5 мл, у которых были удалены нижние части для создания возможности выхода корней из пробирки. Каждую микрофужную пробирку осторожно помещали в штатив над 10-литровым резервуаром, наполненным питательным раствором ACPFG для риса (5 мМ NH4NO3,5,0 KNO3, 2 мМ Ca(NO3)2, 2,0 мМ MgSO4, 0,1 мМ K2HPO4, 50 мкм NaFe(III) ЭДТА, 10 мкМ Н 3 ВО 3, 5 мкМMnCl2, 5 мкМ ZnSO4, 0,5 мкМ CuSO4 и 0,1 мкМ Na2MoO3), делая возможным доступ корней проростков к среде. Проростки выращивали в течение двух недель при 28 С/25 С день/ночь, влажности 80%/60% день/ночь и свете 600 мкмоль/м 2 в секунду с циклом свет/темнота 12 ч света/12 ч ночи, с питательным раствором, сменяемым каждые 5 дней. Спустя 14 дней после проращивания, половину этих проростков переносили в питательный раствор, содержащий 75 мМ NaCl, дополненный 0,24 мМ CaCl2. Чтобы не создать стресс для этих растений, внесение соли производили в виде трех 12-часовых внесений 25 мМNaCl и 0,8 мМ CaCl2. Растениям давали расти в течение дополнительных 12 дней перед сбором. 3-й полностью раскрывшийся лист удаляли из каждого растения, его сырую массу регистрировали и затем его инкубировали при 65 С в течение 48 ч с получением высушенной ткани для измерений сухой массы. После получения измерений массы эту ткань расщепляли в 1% азотной кислоте в течение ночи при 85 С. Измерения Na+ и K+ для каждого листа определяли пламенной фотометрией. Трансформация дрожжей. С использованием прямых праймеров целых генов AtPQL1, 2 или 3 и обратных праймеров целых генов AtPQL1, 2 или 3 (табл. 3, выше), этот полный ген клонировали из геномной ДНК Arabidopsis Col-0 в исходный вектор pCR8 Gateway. Расщепление рестриктазами и секвенирование этой плазмиды использовали для подтверждения ориентации этого гена в данном векторе и для гарантии того, что нет ошибок в кодирующей последовательности клонированного гена. Затем каждый ген трансформировали в S. cerevisiae способом с использованием ацетата лития/полиэтиленгликоля. (Gietz et al., Yeast 11: 355-360, 1995) и трансформанты отбирали на минимальной среде SD (0,67% (мас./об.) Difco Yeast nitrogen base без аминокислот, 1 г/л гистидин), (-урацил). Трансформированные клетки выращивали по отдельности в течение ночи в минимальной среде SD (-урацил), 2% (мас./об.) D-галактоза до поздней log-фазы. Анализы чашек. Клетки осаждали и ресуспендировали до OD600 0,3. Культуры серийно разводили до конечногоOD600 0,0003 и 10 мкл каждого разведения помещали на минимальную среду SD (-урацил), 2% (мас./об.)D-галактоза, 2% (мас./об.) агар, с 0 мМ NaCl + 0 мМ CaCl2, 0 мМ NaCl + 10 мМ CaCl2, 500 мМ NaCl + 0 мМ CaCl2 или 500 мМ NaCl + 10 мМ CaCl2. Чашки инкубировали при 30 С в течение 2-3 дней и фенотипы роста подвергали мониторингу. Анализы жидких культур. Клетки добавляли к жидким культурам для достижения OD600 0,1. Каждые 10 мл культуры содержали минимальную среду SD (-урацил), 2% (мас./об.) D-галактозу, с 0 мМ NaCl + 0 мМ CaCl2, 0 мМ NaCl+ 10 мМ CaCl2, 500 мМ NaCl + 0 мМ CaCl2, или 500 мМ NaCl + 10 мМ CaCl2. Пробы 200 мкл брали каждые 24 часа в течение до 4 дней для использования для измерений OD600. Пример 12. Гены PQ-петель в растениях. В результате поисков в базе данных геномов Arabidopsis, риса и Physcomitrella patens очевидно, что гомологии для генов PQ-петель (называемых так двух консервативных пар аминокислот пролина (Р) и глутамина (Q) в каждой последовательности) из дрожжей существуют во всех трех геномах, в частности,для гена дрожжей, Yo1092wp. Arabidopsis и Physcomitrella содержат шесть генов PQ-петель, тогда как рис содержит только три гомологии. Интересно, что эти гены подразделяются на три отдельных клада(фиг. 18). Геном Arabidopsis содержит три гена в кладе I, два гена в кладе II и единственный ген в кладеIII. Геном риса содержит единственный ген в каждом кладе. Геном Physcomitrella содержит один ген в кладе I, два в кладе II, один в кладе III и два, которые являются более близкородственными со вторым геном дрожжей (Ydr352wp), группой, которая не обнаружена в высших растениях. Таким образом, для обнаружения генов viNSCC в высших растениях, гены, наиболее близкородственные в отношении гена дрожжей Yo1092wp, являются наиболее подходящими. Гены клада I являются наиболее близкородственными Yo1092wp и, следовательно, являются наиболее логичными кандидатами. Дополнительно, топологический анализ (использующий консенсус из нескольких предсказывающих программ, в том числе HMMTOP, PRED-TMR и Kyte-Doolittle plot) предположительных белковых структур белков с PQ-петлями из дрожжей и растений выявил гораздо большее сходство между Yo1092w и членами растений, обнаруженными в кладах II и III. Белки клада I имеют 7 трансмембранных доменов(TMD) и одну большую цитоплазматическую петлю неизвестной функции, которая соединяет TMD 3 и 4(фиг. 19). Это противоречит белкам клада II, которые имеют только 5 TMD, и белкам клада III, которые имеют только очень малые петли между этими TMD. Поскольку Arabidopsis содержит три гена в кладе I, потенциально имеется некоторый уровень избыточности в этом кладе, которая указывает на то, что анализ множественных нокаутов и/или нокдаунов генов могут быть необходимы для наблюдения фенотипа при работе по выяснению функции этих генов в этом кладе. Существует также вероятность того, что белки этого клада будут собираться в мультимеры,и, если они являются гетеромерными, может потребоваться фенотипический анализ множественных нокдаунов генов. Предположительно, белки PQL кодируют неселективный катионный канал, обнаруживаемый на плазматической мембране растительной клетки. Предполагается, что эти каналы облегчают приток Na+ в клетки. Предполагается что они экспрессируются в клетках корней, возможно, в наружных клетках корней. Предполагается, что они участвуют в первоначальном притоке Na+ в корни растений. Дрожжи, экспрессирующие ген AtPQL1, демонстрируют небольшое уменьшение роста при выращивании на 0 мМ NaCl в сравнении с дрожжами, трансформированными вектором-контролем (wt) (фиг. 20 и 21). Дрожжи, экспрессирующие ген AtPQL1, демонстрируют значимое уменьшение роста при выращивании на 500 мМ NaCl, наводя на мысль о том, что этот ген кодирует белок, который облегчает вхождение Na+ в клетку (фиг. 20 и 22). Это уменьшение в росте является значимо большим, чем в дрожжах с вектором-контролем (wt). Это действие частично элиминируется добавлением 10 мМ CaCl2, что позволяет предположить, что этот белок участвует в неселективном катионном канале (NSCC). NSCCактивность может быть ингибирована добавлением Са 2+ (фиг. 20-22). Поскольку было предположено, что белки PQL могут участвовать в первоначальном вхожденииNa+ в корень и оттуда этот Na+ перемещается в побег, amiRNA-нокдауны и Т-ДНК-нокауты генов AtPQL получали для исследования, может ли уменьшение экспрессии этих генов уменьшать накапливание Na+ в побеге. Было определено, что как amiRNA-нокдаун множественных генов AtPQL, так и Т-ДНК-нокауты отдельных генов AtPQL приводили к уменьшению накапливания Na+ в побеге, что позволяет предположить, что они действительно являются ответственными за первоначальное вхождение Na+ в клетки корня растения. При 0 мМ NaCl трансгенные растения с нокаутом отдельных генов PQL, с нокаутом множественных генов или со сверхэкспрессией отдельных генов PQL имеют слегка более высокую биомассу, чем биомасса контрольных растений дикого типа (фиг. 23 А). Единственным исключением является, повидимому, нокаут AtPQL3.