Антитело к склеростину и его применение
Номер патента: 21539
Опубликовано: 30.07.2015
Авторы: Лоусон Эластэйр, Лэтам Джон, Грэхам Кевин, Генри Элистер Джеймс, Робинсон Мартин Ким, Поупплвелл Энди, Уинклер Дэвид, Пашти Кристофер, Шэнь Вэньянь, Лу Сиэн Сэнь, Хоффманн Келли Сью, Уинтерс Аарон Джордж
Формула / Реферат
1. Выделенное антитело или его фрагмент, которые перекрестно блокируют связывание по меньшей мере одного эталонного антитела, выбранного из группы, состоящей из раскрытых в описании антител Ab-A, Ab-B, Ab-1, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-12, Ab-19, Ab-20, Ab-23 и Ab-24 со склеростином, где антитело или его фрагмент содержат по меньшей мере одну последовательность CDR, по меньшей мере на 75% идентичную CDR, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 239, 240, 241, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 269, 270, 271, 351, 352, 353, 358, 359 и 360.
2. Выделенное антитело или его фрагмент, связывание которых со склеростином перекрестно блокируется по меньшей мере одним эталонным антителом, выбранным из группы, состоящей из раскрытых в описании антител Ab-A, Ab-B, Ab-1, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-12, Ab-19, Ab-20, Ab-23 и Ab-24, где антитело или его фрагмент содержат по меньшей мере одну последовательность CDR, по меньшей мере на 75% идентичную CDR, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 239, 240, 241, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 269, 270, 271, 351, 352, 353, 358, 359 и 360.
3. Антитело или его фрагмент по п.1 или 2, где способность указанного антитела или его фрагмента перекрестно блокировать или быть перекрестно блокированным выявляют в анализе Biacore или в анализе ELISA.
4. Антитело или его фрагмент по п.1 или 2, где указанное антитело или его фрагмент могут увеличивать по меньшей мере один из параметров: остеогенез, минеральную плотность костей, содержание минеральных веществ в костях, костную массу, качество костей и прочность костей у млекопитающего, и/или могут блокировать ингибирующее действие склеростина в анализе минерализации, который осуществляется на клетках.
5. Антитело или его фрагмент по п.1 или 2, содержащие:
a) последовательности CDR SEQ ID NO: 51, 52 и 53;
b) последовательности CDR SEQ ID NO: 54, 55 и 56;
c) последовательности CDR SEQ ID NO: 57, 58 и 59;
d) последовательности CDR SEQ ID NO: 60, 61 и 62;
e) последовательности CDR SEQ ID NO: 78, 79 и 80;
f) последовательности CDR SEQ ID NO: 245, 246 и 247;
g) последовательности CDR SEQ ID NO: 81, 99 и 100;
h) последовательности CDR SEQ ID NO: 248, 249 и 250;
i) последовательности CDR SEQ ID NO: 101, 102 и 103;
j) последовательности CDR SEQ ID NO: 251, 252 и 253;
k) последовательности CDR SEQ ID NO: 104, 105 и 106;
l) последовательности CDR SEQ ID NO: 254, 255 и 256;
m) последовательности CDR SEQ ID NO: 107, 108 и 109;
n) последовательности CDR SEQ ID NO: 257, 258 и 259;
о) последовательности CDR SEQ ID NO: 110, 111 и 112;
р) последовательности CDR SEQ ID NO: 260, 261 и 262;
q) последовательности CDR SEQ ID NO: 113, 114 и 115;
r) последовательности CDR SEQ ID NO: 263, 264 и 265;
s) последовательности CDR SEQ ID NO: 239, 240 и 241;
t) последовательности CDR SEQ ID NO: 269, 270 и 271;
u) последовательности CDR SEQ ID NO: 351, 352 и 353 или
v) последовательности CDR SEQ ID NO: 358, 359 и 360.
6. Антитело или его фрагмент по п.1 или 2, содержащие:
a) последовательности CDR SEQ ID NO: 54, 55 и 56 и последовательности CDR SEQ ID NO: 51, 52 и 53;
b) последовательности CDR SEQ ID NO: 60, 61 и 62 и последовательности CDR SEQ ID NO: 57, 58 и 59;
c) последовательности CDR SEQ ID NO: 78, 79 и 80 и последовательности CDR SEQ ID NO: 245, 246 и 247;
d) последовательности CDR SEQ ID NO: 81, 99 и 100 и последовательности CDR SEQ ID NO: 248, 249 и 250;
e) последовательности CDR SEQ ID NO: 101, 102 и 103 и последовательности CDR SEQ ID NO: 251, 252 и 253;
f) последовательности CDR SEQ ID NO: 104, 105 и 106 и последовательности CDR SEQ ID NO: 254, 255 и 256;
g) последовательности CDR SEQ ID NO: 107, 108 и 109 и последовательности CDR SEQ ID NO: 257, 258 и 259;
h) последовательности CDR SEQ ID NO: 110, 111 и 112 и последовательности CDR SEQ ID NO: 260, 261 и 262;
i) последовательности CDR SEQ ID NO: 113, 114 и 115 и последовательности CDR SEQ ID NO: 263, 264 и 265;
j) последовательности CDR SEQ ID NO: 239, 240 и 241 и последовательности CDR SEQ ID NO: 269, 270 и 271 или
k) последовательности CDR SEQ ID NO: 351, 352 и 353 и последовательности CDR SEQ ID NO: 358, 359 и 360.
7. Выделенное антитело или его фрагмент, которые связывают склеростин и содержат по меньшей мере одну последовательность CDR, имеющую по меньшей мере 75%-ную идентичность с CDR, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 245, 246, 247, 78, 79, 80, 269, 270, 271, 239, 240 и 241.
8. Выделенное антитело или его фрагмент, которые связывают склеростин и содержат по меньшей мере одну последовательность CDR, имеющую по меньшей мере 75%-ную идентичность с CDR, выбранной из CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-H1 имеет последовательность SEQ ID NO: 245 или SEQ ID NO: 269, CDR-H2 имеет последовательность SEQ ID NO: 246 или SEQ ID NO: 270, CDR-H3 имеет последовательность SEQ ID NO: 247 или SEQ ID NO: 271, CDR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 78 или SEQ ID NO: 239, CDR-L2 имеет последовательность SEQ ID NO: 79 или SEQ ID NO: 240 и CDR-L3 имеет последовательность SEQ ID NO: 80 или SEQ ID NO: 241.
9. Антитело или его фрагмент по п.8, содержащие три CDR, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где
(a) CDR-H1 имеет последовательность SEQ ID NO: 245, CDR-H2 имеет последовательность SEQ ID NO: 246 и CDR-H3 имеет последовательность SEQ ID NO: 247 или
(b) CDR-H1 имеет последовательность SEQ ID NO: 269, CDR-H2 имеет последовательность SEQ ID NO: 270 и CDR-H3 имеет последовательность SEQ ID NO: 271.
10. Антитело или его фрагмент по п.8, содержащие три CDR: CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где
(a) CDR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 78, CDR-L2 имеет последовательность SEQ ID NO: 79 и CDR-L3 имеет последовательность SEQ ID NO: 80 или
(b) CDR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 239, CDR-L2 имеет последовательность SEQ ID NO: 240 и CDR-L3 имеет последовательность SEQ ID NO: 241.
11. Антитело или его фрагмент по п.8, в которых CDR-H1 имеет последовательность SEQ ID NO: 245, CDR-H2 имеет последовательность SEQ ID NO: 246, CDR-H3 имеет последовательность SEQ ID NO: 247, CDR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 78, CDR-L2 имеет последовательность SEQ ID NO: 79 и CDR-L3 имеет последовательность SEQ ID NO: 80.
12. Антитело или его фрагмент по п.8, в которых CDR-H1 имеет последовательность SEQ ID NO: 269, CDR-H2 имеет последовательность SEQ ID NO: 270, CDR-H3 имеет последовательность SEQ ID NO: 271, CDR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO: 239, CDR-L2 имеет последовательность SEQ ID NO: 240 и CDR-L3 имеет последовательность SEQ ID NO: 241.
13. Антитело или его фрагмент по любому из пп.5-12, содержащие тяжелую цепь, включающую полипептид, имеющий по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 378; SEQ ID NO: 327 или SEQ ID NO: 366.
14. Антитело или его фрагмент по любому из пп.5-12, содержащие легкую цепь, включающую полипептид, имеющий по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 332; SEQ ID NO: 376; SEQ ID NO: 314 или SEQ ID NO: 364.
15. Антитело или его фрагмент по любому из пп.5-12, содержащие и тяжелую цепь, и легкую цепь, где
(а) тяжелая цепь содержит полипептид, имеющий по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 378, и легкая цепь содержит полипептид, имеющий по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 376; или
(b) тяжелая цепь содержит полипептид, имеющий по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 327, и легкая цепь содержит полипептид, имеющий по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 314; или
(c) тяжелая цепь содержит полипептид, имеющий по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 366, и легкая цепь содержит полипептид, имеющий по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 364.
16. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-15, которые содержат константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи.
17. Антитело или его фрагмент по п.16, которые содержат константную область IgG4 или IgG2.
18. Выделенное антитело или его фрагмент, которые связывают склеростин и содержат тяжелую цепь, включающую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 137, 145 или 392 или ее вариант, содержащий последовательности CDR, по меньшей мере на 75% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 245, 246 и 247, и легкую цепь, включающую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 133 или 141 или ее вариант, содержащий последовательности CDR, по меньшей мере на 75% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 78, 79 и 80.
19. Выделенное антитело или его фрагмент, которые связывают склеростин и содержат тяжелую цепь, включающую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 331, 335, 345 или 396 или ее вариант, содержащий последовательности CDR, по меньшей мере на 75% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 269, 270 и 271, и легкую цепь, включающую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 334 или SEQ ID NO: 341 или ее вариант, содержащий последовательности CDR, по меньшей мере на 75% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 239, 240 и 241.
20. Выделенное антитело или его фрагмент, которые связывают склеростин и содержат:
(a) тяжелую цепь, включающую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 137, и легкую цепь, содержащую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 133;
(b) тяжелую цепь, включающую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 145 или 392, и легкую цепь, содержащую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 141;
(c) тяжелую цепь, включающую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 335, и легкую цепь, содержащую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 334;
(d) тяжелую цепь, включающую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 331, и легкую цепь, содержащую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 341; или
(e) тяжелую цепь, включающую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 345 или 396, и легкую цепь, содержащую полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 341.
21. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-20, которые связываются со склеростином человека с аффинностью связывания (KD), равной или меньшей чем 1´10-7 M, равной или меньшей чем 1´10-8 M, равной или меньшей чем 1´10-9 M, равной или меньшей чем 1´10-10 M, равной или меньшей чем 1´10-11 M или равной или меньшей чем 1´10-12 M.
22. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-21, которые представляют собой антитело IgG.
23. Фрагмент антитела по любому из пп.1-21.
24. Фрагмент по п.23, который содержит вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc или фрагмент Fd.
25. Выделенное моноклональное антитело, содержащее последовательности CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 245, 246 и 247 и последовательности CDR легкой цепи SEQ ID NO: 78, 79 и 80, где антитело связывает склеростин, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, с аффинностью связывания (KD), равной или меньшей чем 1´10-7 M.
26. Моноклональное антитело по п.25, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 378, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 376.
27. Выделенное моноклональное антитело, содержащее последовательности CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 269, 270 и 271 и последовательности CDR легкой цепи SEQ ID NO: 239, 240 и 241, где антитело связывает склеростин, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, с аффинностью связывания (KD), равной или меньшей чем 1´10-7 M.
28. Моноклональное антитело по п.29, в котором тяжелая цепь содержит последовательность SEQ ID NO: 366, и легкая цепь содержит последовательность SEQ ID NO: 364.
29. Моноклональное антитело по любому из пп.25-28, где антитело связывает склеростин, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, с аффинностью связывания (KD), равной или меньшей чем 1´10-8 M.
30. Выделенное антитело, содержащее тяжелые цепи, каждая из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145 или SEQ ID NO: 392, и легкие цепи, каждая из которых имеет SEQ ID NO: 141, где антитело связывает склеростин.
31. Выделенное антитело, содержащее тяжелые цепи, каждая из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 345 или SEQ ID NO: 396 и легкие цепи каждая из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 341, где антитело связывает склеростин.
32. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-31, которое является ренкомбинантным.
33. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-32, с которыми связана одна или несколько эффекторных или репортерных молекул.
34. Изолированный полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагмент по любому из пп.1-32.
35. Клонирующий или экспрессирующий вектор, содержащий один или несколько полинуклеотидов по п.34.
36. Вектор по п.35, содержащий по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 308, 310, 312, 342, 344, 346, 348, 349, 365, 367, 377 и 379.
37. Клетка-хозяин, содержащая один или несколько клонирующих или экспрессирующих векторов по п.35 или 36.
38. Способ получения антитела или его фрагмента по любому из пп.1-32, включающий культивирование клетки-хозяина по п.37 и выделение антитела или его фрагмента.
39. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп.1-32 в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями.
40. Применение антитела или его фрагмента по любому из пп.1-32 для лечения или профилактики патологического нарушения, которое опосредовано склеростином или которое связано с повышенным уровнем склеростина.
41. Применение фармацевтической композиции по п.39 для лечения или профилактики патологического нарушения, которое опосредовано склеростином или которое связано с повышенным уровнем склеростина.
42. Применение фармацевтической композиции по п.39 для приготовления лекарственного средства для увеличения остеогенеза, содержания минеральных веществ в костях, костной массы, минеральной плотности костей, качества костей или прочности костей у млекопитающего.
43. Применение фармацевтической композиции по п.39 для приготовления лекарственного средства для лечения дисплазии, остеопении, остеопороза и потери костной массы.
44. Применение фармацевтической композиции по п.39 для приготовления лекарственного средства для лечения потери костной массы у пациентов с ахондроплазией, ключично-черепным дизостозом, эхондроматозом, фиброзной дисплазией, болезнью Гоше, гипофосфатемическим рахитом, синдромом Марфана, множественными наследственными экзостозами, нейрофиброматозами, несовершенным остеогенезом, остеопетрозом, остеопойкилозом, склеротическими повреждениями, псевдоартрозом, пиогенным остеомиелитом, заболеванием периодонта, индуцированной противоэпилептическими средствами потерей костной массы, первичным и вторичным гиперпаратиреоидизмом, синдромами семейного гиперпаратиреоидизма, индуцированной невесомостью потерей костной массы, остеопорозом у мужчин, постклимактерической потерей костной массы, остеоартритом, нефрогенной остеодистрофией, инфильтративными заболеваниями костей, потерей массы костей ротовой полости, остеонекрозом челюсти, ювенильной формой болезни Педжета, мелореостозом, метаболическими заболеваниями костей, мастоцитозом, серповидноклеточной анемией, потерей костной массы, связанной с трансплантацией органа, потерей костной массы, связанной с трансплантацией почки, системной красной волчанкой, анкилозирующим спондилитом, эпилепсией, поражениями кожи у детей ревматического происхождения, талассемией, мукополисахаридозами, болезнью Фабри, синдромом Тернера, синдромом Дауна, синдромом Кляйнфелтера, проказой, болезнью Пертеса, подростковым идиопатическим сколиозом, многосистемным воспалительным заболеванием у детей, синдромом Винчестера, болезнью Менкеса, болезнью Вильсона, ишемическим заболеванием костей, болезнью Легга-Кальве-Пертеса, регионарным мигрирующим остеопорозом, анемическими состояниями, состояниями, вызванными стероидами, индуцированной глюкокортикоидами потерей массы костей, индуцированной гепарином потерей массы костей, заболеваниями костного мозга, цингой, недостаточным питанием, дефицитом кальция, остеопорозом, остеопенией, алкоголизмом, хроническим заболеванием печени, постклимактерическим состоянием, хроническими воспалительными состояниями, ревматоидным артритом, воспалительным заболеванием кишечника, язвенным колитом, воспалительным колитом, болезнью Крона, олигоменореей, аменореей, беременностью, сахарным диабетом, гипертиреоидизмом, расстройствами щитовидной железы, расстройствами паратиреоидной железы, болезнью Кушинга, акромегалией, гипогонадизмом, лишением подвижности или бездействием, синдромом симпатической рефлекторной дистрофии, регионарным остеопорозом, остеомаляцией, потерей костной массы, связанной с заменой сустава, связанной с ВИЧ потерей костной массы, потерей костной массы, связанной со снижением уровня гормона роста, потерей костной массы, связанной с кистозным фиброзом, связанной с химиотерапией потерей костной массы, индуцированной опухолью потерей костной массы, связанной со злокачественной опухолью потерей костной массы, потерей костной массы при гормональном разрушении, множественной миеломой, индуцированной лекарственными средствами потерей костной массы, нервной анорексией, связанной с заболеванием потерей массы костей лицевой части черепа, связанной с заболеванием потерей массы костей мозговой части черепа, связанной с заболеванием потерей костной массы челюсти, связанной с заболеванием потерей костной массы черепа, потерей костной массы, связанной со старением, потерей массы костей лицевой части черепа, связанной со старением, потерей массы костей мозговой части черепа, связанной со старением, потерей костной массы челюсти, связанной со старением, потерей массы костей черепа, связанной со старением, и потерей костной массы, связанной с полетом в космос.
45. Применение фармацевтической композиции по п.39 для приготовления лекарственного средства для улучшения исхода лечения млекопитающего, подвергаемого стоматологической процедуре, проводимой на зубах, имплантационной хирургии, замене сустава, костной пластики, косметической хирургии на костях и восстановлению костей, например, при срастании переломов, заживлении несросшихся переломов, заживлении при медленном срастании или при реконструкции лица.
46. Диагностический набор, содержащий антитело или его фрагмент по любому из пп.1-32.
Текст
Пашти Кристофер (US), Робинсон Мартин Ким (GB), Грэхам Кевин(US), Генри Элистер Джеймс (GB),Хоффманн Келли Сью, Лэтам Джон(US), Лоусон Эластэйр (GB), Лу Сиэн Сэнь, Поупплвелл Энди, Шэнь Вэньянь, Уинклер Дэвид, Уинтерс Аарон Джордж (US) Медведев В.Н. (RU) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение главным образом относится к эпитопам белка склеростина, включая белок склеростина человека, и связывающим агентам (таким как антитела), способным связываться со склеростином или его фрагментами. Уровень техники На протяжении жизни человека наблюдаются две или три различные фазы изменений костной массы (см. Riggs, West J., Med. 154:63-77 (1991. Первая фаза наступает у мужчин и женщин и продолжается до достижения пика костной массы. Указанная первая фаза достигается посредством линейного роста хрящевых ростовых пластинок и радиального роста вследствие определенной степени утолщения надкостницы. Вторая фаза начинается примерно в возрасте 30 лет в случае трабекулярной кости (плоские кости, такие как позвонки и кости таза) и в возрасте примерно 40 лет в случае трубчатой кости (например,длинных костей, имеющихся в конечностях) и продолжается до старости. Данная фаза характеризуется медленной потерей костной массы и происходит как у мужчин, так и у женщин. У женщин также имеет место третья фаза потери костной массы, наиболее вероятно вследствие постменопаузной недостаточности эстрогенов. Во время указанной фазы женщины могут дополнительно терять костную массу из трубчатых костей и из трабекулярной части (см. Riggs выше). Потеря содержания минеральных веществ в костях может быть вызвана широким множеством состояний и может приводить к существенным медицинским проблемам. Например, остеопороз является подрывающим здоровье заболеванием человека и характеризуется заметным снижением массы и минеральной плотности костей скелета, повреждением структуры костей, включая разрушение микроархитектуры костей, и соответствующим увеличением ломкости костей (т.е. снижением прочности костей) и чувствительности к переломам у страдающих заболеванием людей. Остеопорозу у людей обычно предшествует клиническая остеопения (минеральная плотность костей, которая более чем на одно стандартное отклонение, но менее чем на 2,5 стандартных отклонений ниже среднего значения для костей взрослых молодых людей), состояние, встречающееся примерно у 25 млн людей в Соединенных Штатах Америки. У других 7-8 млн людей в США диагностирован клинический остеопороз (определяемый как состояние, при котором содержание минеральных веществ в костях более чем на 2,5 стандартных отклонения ниже, чем в костях взрослых молодых людей). Частота встречаемости остеопороза в популяции человека увеличивается с возрастом. Среди европеоидов остеопороз преобладает у женщин, которые в США составляют 80% от всех пациентов, больных остеопорозом. Повышенная ломкость и чувствительность к переломам костей скелета у пожилых людей усугубляются более высоким риском случайных падений в данной популяции. Переломы бедра, запястья и позвонков являются наиболее распространенными повреждениями, связанными с остеопорозом. Переломы бедра, в частности, вызывают наибольший дискомфорт, и их лечение является дорогостоящим для пациента, а для женщин переломы бедра коррелируют с высоким уровнем смертности и заболеваемости. Хотя остеопороз рассматривают как увеличение риска переломов вследствие пониженной массы костей, некоторые имеющиеся в настоящее время способы лечения заболеваний скелета могут увеличивать плотность костей у взрослых людей, и большинство доступных в настоящее время способов лечения главным образом действуют посредством ингибирования дальнейшей резорбции костей, а не за счет стимуляции образования новой костной ткани. В настоящее время назначают эстроген для того, чтобы замедлить потерю костной массы. Однако существуют некоторые расхождения во мнениях по поводу того, получают ли пациенты какую-либо долговременную пользу и оказывает ли эстроген какое-либо влияние на пациентов старше 75 лет. Кроме того, полагают, что применение эстрогена увеличивает риск развития рака молочной железы и эндометриального рака. Для женщин в постменопаузный период также предлагали кальцитонин, остеокальцин с витамином K или высокие дозы кальция в продуктах питания с витамином D или без него. Однако высокие дозы кальция часто имеют нежелательные побочные эффекты в желудочно-кишечном тракте, и необходимо постоянно контролировать уровни кальция в сыворотке и моче (например, Khosla and Riggs, Mayo Clin. Proc. 70:978982, 1995). Другие современные терапевтические способы лечения остеопороза включают применение бифосфонатов (например, Fosamax , Actonel, Bonviva , Zometa , олпадронат, неридронат, скелид, бонефос), паратиреоидного гормона, кальцийлитиков, миметиков кальция (например, цинакальцета), статинов, анаболических стероидов, солей лантана и стронция и фторида натрия. Однако такие терапевтические средства часто связаны с нежелательными побочными эффектами (см. Khosla and Riggs выше). Склеростин, продукт гена SOST, отсутствует при склеростеозе, заболевании скелета, характеризующемся чрезмерным ростом костей и высокой плотностью костей (Brunkow et al., Am. J. Hum. Genet.,68:577-589, 2001; Balemans et al., Hum. Mol. Genet., 10:537-543, 2001). Аминокислотная последовательность склеростина человека сообщается в Brunkow et al., там же, и указана в данном описании в видеSEQ ID NO: 1. Сущность изобретения В данном описании раскрыты композиции и способы, которые могут быть использованы для увеличения по меньшей мере одного признака: остеогенеза, минеральной плотности костей, содержания минеральных веществ в костях, костной массы, качества костей и прочности костей, и которые поэтому можно применять для лечения широкого множества состояний, при которых требуется увеличение по меньшей мере одного из признаков: остеогенеза, минеральной плотности костей, содержания минеральных веществ в костях, костной массы, качества костей и прочности костей. Настоящее изобретение также обеспечивает другие связанные преимущества, указанные в данном описании. Изобретение относится к областям (эпитопам) склеростина человека, узнаваемым связывающими агентами, описанными в данном описании, к способам применения таких эпитопов и способам получения таких эпитопов. Изобретение также относится к эпитопам, специфичным к области склеростина, идентифицированной в виде петли 2, и к связывающим агентам, которые специфично связываются с данной областью. Изобретение также относится к эпитопам, специфичным к области цистинового узла склеростина, и к связывающим агентам, таким как антитела, специфично связывающиеся с такой областью. Изобретение относится к связывающим агентам, таким как антитела, которые специфично связываются со склеростином. Связывающие агенты можно характеризовать по их способности перекрестно блокировать связывание по меньшей мере одного антитела, раскрытого в данном описании, со склеростином и/или перекрестно блокироваться в отношении связывания со склеростином по меньшей мере одним антителом, раскрытым в данном описании. Антитела и другие связывающие агенты также можно охарактеризовать по картине связывания с пептидами склеростина человека в "анализе конкурентного связывания пептидных эпитопов склеростина человека", который описан в данном изобретении. Изобретение относится к связывающим агентам, таким как антитела, которые могут увеличивать по меньшей мере один из признаков: остеогенез, минеральную плотность костей, содержание минеральных веществ в костях, костную массу, качество костей и прочность костей у млекопитающего. Изобретение относится к связывающим агентам, таким как антитела, которые могут блокировать ингибирующее действие склеростина в анализе минерализации, основанном на клетках. Изобретение, кроме того, относится к конструкциям полипептидов, содержащим два, три или четыре полипептидных фрагмента, связанных по меньшей мере одной дисульфидной связью, представляющих собой коровую область цистинового узла склеростина, и к антителам, способным специфично связываться с ними. Изобретение относится к способам получения эпитопов, подходящих для применения в качестве иммуногенов для образования у млекопитающих связывающих агентов, таких как антитела, способные специфично связываться со склеростином; в некоторых вариантах образованные связывающие агенты способны нейтрализовать активность склеростина in vivo. Изобретение относится к композиции, вызывающей образование антитела, специфичного по отношению к склеростину, при введении композиции животному, при этом композиция содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 или SEQ ID NO: 69. Изобретение также относится к композиции, вызывающей образование антитела, специфичного по отношению к склеростину при введении композиции животному, при этом композиция содержит по меньшей мере один полипептид, по существу состоящий из аминокислотной последовательности SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5; композиция может содержать по меньшей мере две или по меньшей мере три аминокислотных последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 4 и SEQ ID NO: 5, и композиция может содержать все четыре аминокислотные последовательностиSEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5. Изобретение, кроме того, относится к композиции, вызывающей образование антитела, специфичного по отношению к склеростину, при введении композиции животному, при этом композиция содержит полипептид, имеющий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 4 и SEQ ID NO: 5, в котором последовательности SEQ ID NO: 2 и 4 связаны дисульфидной связью в положениях аминокислот 57 и 111 относительно SEQ ID NO: 1, и SEQ ID NO: 3 и 5 связаны по меньшей мере одной связью из (а) дисульфидной связи в положениях аминокислот 82 и 142 относительно SEQ IDNO: 1, и (b) дисульфидной связи в положениях аминокислот 86 и 144 относительно SEQ ID NO: 1; полипептид может сохранять третичную структуру соответствующей области полипептида склеростина человека с последовательностью SEQ ID NO: 1. Изобретение также относится к полипептиду Т 20.6, по существу, состоящему из многократно укороченного белка склеростина человека с последовательностью SEQ ID NO: 1, в котором аминокислоты 1-50, 65-72, 91-100, 118-137 и 150-190 последовательности полипептида SEQ ID NO: 1 отсутствуют; такой полипептид может быть получен расщеплением склеростина человека трипсином, и белок может быть выделен ВЭЖХ-фракционированием. Изобретение, кроме того, относится к иммуногенной части Т 20.6 склеростина человека, содержащей аминокислоты 51-64, 73-90, 101-117 и 138-149 последовательности SEQ ID NO: 1, при этом иммуногенная часть содержит по меньшей мере одну из связей:(a) дисульфидную связь между аминокислотами 57 и 111;(b) дисульфидную связь между аминокислотами 82 и 142 и(c) дисульфидную связь между аминокислотами 86 и 144; иммуногенная часть может иметь по меньшей мере две из указанных дисульфидных связей; и иммуногенная часть может иметь все три ди-2 021539 сульфидных связи. Изобретение, кроме того, относится к иммуногенной части Т 20.6, полученной из склеростина человека, содержащей аминокислоты 57-64, 73-86, 111-117 и 138-144 последовательности SEQ ID NO: 1, при этом иммуногенная часть содержит по меньшей мере одну из связей:(a) дисульфидную связь между аминокислотами 57 и 111;(b) дисульфидную связь между аминокислотами 82 и 142 и(c) дисульфидную связь между аминокислотами 86 и 144; иммуногенная часть может иметь по меньшей мере две из указанных дисульфидных связей; и иммуногенная часть может иметь все три дисульфидных связи. Изобретение также относится к полипептиду, по существу, состоящему из белка склеростина человека с последовательностью SEQ ID NO:1, укороченной на С-конце и N-конце, при этом в полипептиде отсутствуют аминокислоты 1-85 и 112-190 последовательности SEQ ID NO: 1. Изобретение также относится к иммуногенной части склеростина человека, содержащей аминокислоты 86-111 последовательности SEQ ID NO: 1, при этом иммуногенная часть в основном может состоять из непрерывно связанных аминокислот CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO: 6). Изобретение, кроме того, относится к иммуногенной части склеростина крыс, содержащей аминокислоты 92-109 последовательности SEQ ID NO: 98, при этом иммуногенная часть в основном может состоять из непрерывно связанных аминокислот PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96). Изобретение также относится к иммуногенной части склеростина крысы, содержащей аминокислоты 99-120 последовательности SEQ ID NO: 98, при этом иммуногенная часть в основном может состоять из непрерывно связанных аминокислот KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97). Изобретение относится к способу получения иммуногенной части склеростина человека, включающему стадии:(a) обработки склеростина человека для получения полного расщепления трипсином;(b) сбора образца после расщепления трипсином, имеющего среднюю молекулярную массу 7122,0 Да (теоретическая масса 7121,5 Да) или время удержания примерно 20,6 мин, определяемое при элюировании с колонки для обращенно-фазовой ВЭЖХ с линейным градиентом от 0,05% трифторуксусной кислоты до 90% ацетонитрила в 0,05% TFA со скоростью потока 0,2 мл/мин; и(c) очистки иммуногенной части. Изобретение относится к способу получения антитела, способного специфично связываться со склеростином, включающему:(b) сбор сыворотки от животного и(c) выделение из сыворотки антитела, способного специфично связываться со склеростином. Изобретение также относится к способу получения антитела, способного специфично связываться со склеростином, включающему:(b) сбор сыворотки от животного и(с) выделение из сыворотки антитела, способного специфично связываться со склеростином. Изобретение, кроме того, относится к способу выявления антитела против склеростина в биологическом образце, включающему стадии:(a) контактирования биологического образца с полипептидом, по существу, состоящим из последовательности SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 96 или SEQ ID NO: 97, в условиях, обеспечивающих образование комплекса между антителом и полипептидом; и(b) выявления присутствия или отсутствия комплекса, при этом присутствие комплекса свидетельствует о том, что биологический образец содержит антитело против склеростина. Изобретение также относится к способу выявления антитела против склеростина в биологическом образце, включающему стадии:(a) контактирования биологического образца с полипептидом Т 20.6 или производным Т 20.6 в условиях, обеспечивающих образование комплекса между антителом и полипептидом; и(b) выявления присутствия или отсутствия комплекса, при этом присутствие комплекса свидетельствует, что биологический образец содержит антитело против склеростина. Изобретение, кроме того, относится к связывающему склеростин агенту, такому как антитело, который перекрестно блокирует связывание по меньшей мере одного из антител Ab-A, Ab-B, Ab-С или AbD с белком склеростином. Связывание связывающего склеростин агента со склеростином также может быть перекрестно блокировано по меньшей мере одним из антител Ab-A, Ab-B, Ab-С или Ab-D. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть поликлональным антителом, моноклональным антителом, гуманизированным антителом, антителом человека, химерным антителом или тому подобным. Изобретение, кроме того, относится к связывающему склеростин агенту, такому как антитело, связывание которого со склеростином перекрестно блокируется по меньшей мере одним из антител Ab-A,Ab-B, Ab-C или Ab-D. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть поликлональным антителом, моноклональным антителом, гуманизированным антителом, антителом человека, химерным антителом или т.п. Изобретение, кроме того, относится к связывающему склеростин агенту, такому как изолированное антитело, которое перекрестно блокирует связывание по меньшей мере одного из антител 1-24 (Ab-1-Ab24) с белком склеростином. Связывание связывающего склеростин агента со склеростином также может быть перекрестно блокировано по меньшей мере одним из антител 1-24 (Ab-1-Ab-24). Изолированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом может быть поликлональное антитело, моноклональное антитело, гуманизированное антитело, антитело человека или химерное антитело. Изобретение, кроме того, относится к связывающему склеростин агенту, такому как изолированное антитело, связывание которого со склеростином перекрестно блокируется по меньшей мере одним из антител 1-24 (Ab-1-Ab-24), при этом изолированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом может быть поликлональное антитело, моноклональное антитело, гуманизированное антитело, антитело человека или химерное антитело. Изобретение, кроме того, относится к связывающему агенту, такому как изолированное антитело,которое проявляет картину связывания с пептидами склеростина человека в "анализе конкурентного связывания пептидных эпитопов склеростина человека", сходную с картиной связывания, проявляемой по меньшей мере одним из антител Ab-A, Ab-B, Ab-С или Ab-D, при этом изолированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом может быть поликлональное антитело, моноклональное антитело,гуманизированное антитело, антитело человека или химерное антитело. Изобретение также относится к способу лечения заболевания костей, связанного по меньшей мере с одним из признаков: недостаточным остеогенезом, низкой минеральной плотностью костей, низким содержанием минеральных веществ в костях, низкой костной массой, низким качеством костей и низкой прочностью костей у млекопитающего, который включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, количества связывающего агента против склеростина, достаточного для увеличения по меньшей мере одного из признаков: остеогенеза, минеральной плотности костей, содержания минеральных веществ в костях, костной массы, качества костей и прочности костей, при этом связывающий против склеростина агент включает антитело или его связывающий склеростин фрагмент. Изобретение также относится к изолированному полипептиду склеростина или его фрагментам, при этом полипептид содержит 6 консервативных остатков цистеина, и его фрагменты содержат от 7 до 14 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 2, от 8 до 17 аминокислот последовательности SEQ IDSEQ ID NO: 5; и полипептид или его фрагменты стабилизированы дисульфидными связями между последовательностями SEQ ID NO: 2 и 4 и между последовательностями SEQ ID NO: 3 и 5, полипептид или фрагменты могут содержать 10-14 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 2, от 14 до 17 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 3, от 13 до 18 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 4 и от 8 до 12 остатков последовательности SEQ ID NO: 5; и полипептид или фрагменты могут содержать последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5. В настоящем изобретении предлагаются антитела, которые специфично связываются со склеростином человека. Антитела характеризуются их способностью перекрестно блокировать связывание по меньшей мере одного антитела, указанного в данном описании, со склеростином человека и/или характеризуются перекрестным блокированием их связывания со склеростином человека по меньшей мере одним антителом, указанным в данном описании. Также предлагается изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые могут увеличивать по меньшей мере один из признаков: остеогенез, минеральную плотность костей, содержание минеральных веществ в костях, костную массу, качество костей и прочность костей у млекопитающего. Также предлагается изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые могут блокировать ингибирующее действие склеростина в анализе минерализации, основанном на клетках. Также предлагается связывающий агент, такой как антитело, который специфично связывается со склеростином человека и имеет по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из SEQ IDNO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99,100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241,242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263,264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285,286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 и 360, и их вариантов,при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует склеростин. Также предлагается связывающий агент, такой как антитело, который специфично связывается со склеростином человека и имеет по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из SEQ ID 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241,242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263,264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285,286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 и 360 и их вариантов. Также предлагаются области склеростина человека, которые имеют важное значение для активности белка in vivo. Указанные и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидными при обращении к следующему подробному описанию и прилагаемым чертежам. Все ссылки, приведенные в данном описании, включены при этом в виде ссылки в полном объеме, также как в случае, когда каждую ссылку включают по отдельности. Краткое описание чертежей На фиг. 1 изображены аминокислотные последовательности зрелой формы (после отщепления сигнальных пептидов) легкой цепи (фиг. 1 А) (SEQ ID NO: 23) и тяжелой цепи (фиг. 1B) (SEQ ID NO: 27) антитела против склеростина человека и против склеростина мыши Ab-A. На фиг. 2 изображены аминокислотные последовательности зрелой формы (после отщепления сигнальных пептидов) легкой цепи (фиг. 2 А) (SEQ ID NO: 31) и тяжелой цепи (фиг. 2 В) (SEQ ID NO: 35) антитела против склеростина человека и против склеростина мыши Ab-B. На фиг. 3 изображены аминокислотные последовательности зрелой формы (после отщепления сигнальных пептидов) легкой цепи (фиг. 3 А) (SEQ ID NO: 15) и тяжелой цепи (фиг. 3 В) (SEQ ID NO: 19) антитела против склеростина человека и против склеростина мыши Ab-C. На фиг. 4 изображены аминокислотные последовательности зрелой формы (после отщепления сигнальных пептидов) легкой цепи (фиг. 4 А) (SEQ ID NO: 7) и тяжелой цепи (фиг. 4 В) (SEQ ID NO: 11) антитела против склеростина человека и против склеростина мыши Ab-D. На фиг. 5 показана минеральная плотность костей у мышей, измеренная в двух местах скелета (поясничные позвонки и метафиз большеберцовой кости) после 3 недель обработки наполнителем, РТН (134), Ab-А или Ab-B. На фиг. 6 показана минеральная плотность костей у мышей, измеренная в двух местах скелета (поясничные позвонки и метафиз большеберцовой кости) после 2 недель обработки наполнителем, РТН (134) или Ab-C. На фиг. 7 показана минеральная плотность костей у мышей, измеренная в двух местах скелета (поясничные позвонки и метафиз большеберцовой кости) после 3 недель обработки наполнителем или Ab-D. На фиг. 8 изображена аминокислотная последовательность зрелой формы (после отщепления сигнального пептида) склеростина человека (SEQ ID NO: 1). Также изображена нуклеотидная последовательность кодирующей области склеростина человека, которая кодирует зрелую форму склеростина человека. Восемь цистеинов пронумерованы от С 1 до С 8. Цистиновый узел образован тремя дисульфидными связями (С 1-С 5; С 3-С 7; С 4-С 8). С 2 и С 6 также образуют дисульфидную связь, однако данный дисульфид не является частью цистинового узла. На фиг. 9 показана схема основной структуры склеростина человека. Имеется N-концевое плечо (от первого Q до С 1) и С-концевое плечо (от С 8 до концевого Y). Между указанными плечами находится структура цистинового узла (образованного тремя дисульфидами: С 1-С 5; С 3-С 7; С 4-С 8) и три петли,которые обозначены петля 1, петля 2 и петля 3. Дистальные области петли 1 и петли 3 связаны С 2-С 6 дисульфидом. Указаны потенциальные сайты расщепления трипсином (аргинин=R и лизин=K). Указаны некоторые потенциальные сайты расщепления AspN (показаны только остатки аспарагиновой кислоты(D. На фиг. 10 показаны полученные посредством ВЭЖХ пептидные карты склеростина человека после расщепления либо трипсином, либо AspN. Показаны пептиды склеростина человека, образованные при расщеплении трипсином (Т 19.2, Т 20, Т 20.6 и Т 21-22), также как пептиды склеростина человека, образованные при расщеплении AspN (AspN14.6, AspN18.6 и AspN22.7-23.5). На фиг. 11 показана информация о последовательности и массе изолированных связанных дисульфидной связью пептидов склеростина человека, образованных при расщеплении трипсином. Пол послед. = положение в последовательности. Набл. = наблюдаемая. Наблюдаемую массу определяли в ESI-ЖХ-МСанализе. На фиг. 12 показана информация о последовательности и массе изолированных пептидов склеростина человека, образованных при расщеплении AspN. Пептид AspN22.7-23.5 содержит 4 дисульфидные связи. Пол.послед. = положение в последовательности. Набл. = наблюдаемая. Наблюдаемую массу определяли в ESI-ЖХ-МС-анализе. На фиг. 13 показана линейная схема четырех пептидов склеростина человека (Т 19.2, Т 20, Т 20.6 и Т 21-22), образованных при расщеплении трипсином. На фиг. 14 показана линейная схема пяти пептидов склеростина человека (AspN14.6, AspN18.6 иAspN22.7-23.5), образованных при расщеплении AspN. Пик ВЭЖХ AspN14.6 состоит из трех пептидов,не связанных дисульфидными связями. На фиг. 15 показан резонансный сигнал в единицах (Ru) в основанном на Biacore "анализе конку-5 021539 рентного связывания пептидных эпитопов склеростина человека". Оценивали относительное связывание мАт с различными пептидами склеростина человека (в растворе) по сравнению со связыванием мАт с интактной зрелой формой склеростина человека (иммобилизованного на чипе Biacore). Данные показаны для Ab-А. Использовали следующие пептиды склеростина человека: Т 19.2, Т 20, Т 20.6, Т 21-22, AspN14.6,AspN18.6 и AspN22.7-23.5. На фиг. 16 показан резонансный сигнал в единицах (Ru) в основанном на Biacore "анализе конкурентного связывания пептидных эпитопов склеростина человека". Оценивали относительное связывание мАт с различными пептидами склеростина человека (в растворе) по сравнению со связыванием мАт с интактной зрелой формой склеростина человека (иммобилизованной на чипе Biacore). Данные показаны для Ab-В. Использовали следующие пептиды склеростина человека Т 19.2, Т 20, Т 20.6, Т 21-22, AspN14.6,AspN18.6 и AspN22.7-23.5. На фиг. 17 показан резонансный сигнал в единицах (Ru) в основанном на Biacore "анализе конкурентного связывания пептидных эпитопов склеростина человека". Оценивали относительное связывание мАт с различными пептидами склеростина человека (в растворе) по сравнению со связыванием мАт с интактной зрелой формой склеростина человека (иммобилизованной на чипе Biacore). Данные показаны для Ab-С. Использовали следующие пептиды склеростина человека Т 19.2, Т 20, Т 20.6, Т 21-22, AspN14.6,AspN18.6 и AspN22.7-23.5. На фиг. 18 показан резонансный сигнал в единицах (Ru) в основанном на Biacore "анализе конкурентного связывания пептидных эпитопов склеростина человека". Оценивали относительное связывание мАт с различными пептидами склеростина человека (в растворе) по сравнению со связыванием мАт с интактной зрелой формой склеростина человека (иммобилизованной на чипе Biacore). Данные показаны для Ab-D. Использовали следующие пептиды склеростина человека Т 19.2, Т 20, Т 20.6, Т 21-22, AspN14.6,AspN18.6 и AspN22.7-23.5. На фиг. 19 показаны два связывающих мАт эпитопа склеростина человека. На фиг. 19 А показана последовательность эпитопа петли 2 для связывания Ab-А и Ab-В со склеростином человека (SEQ IDNO:6). На фиг. 19 В показаны последовательность, дисульфидные связи и схема эпитопа Т 20.6 для связывания Ab-С и Ab-D со склеростином человека (SEQ ID NO:2-5). На фиг. 20 изображены полученные посредством ВЭЖХ пептидные карты склеростина человека после расщепления трипсином. На фиг. 20 А показано расщепление комплекса склеростина человека иAb-D. На фиг. 20 В показано расщепление склеростина человека отдельно. Указаны пики пептидов Т 19.2,Т 20, Т 20.6 и Т 21-22. На фиг. 21 показаны последовательность, дисульфидные связи и схема эпитопа "производного 1 Т 20.6 (цистиновый узел + 4 плеча)" для связывания Ab-D со склеростином человека (SEQ ID NO: 70-73). На фиг. 22 показаны результаты анализа минерализации клеточной линии остеобластов MC3T3-E1BF, используемого для идентификации нейтрализующих мАт против склеростина. Использовали склеростин мыши (Sc1) в концентрации 1 мкг/мл. Моноклональные антитела использовали в концентрации 10 и 5 мкг/мл. Количественно оценивали степень минерализации (различные типы нерастворимого фосфата кальция), измеряя уровень кальция. На фиг. 23 изображены результаты анализа минерализации клеточной линии остеобластов MC3T3E1-BF, используемого для идентификации нейтрализующих мАт против склеростина. Использовали склеростин человека (Scl) в концентрации 1 мкг/мл. Моноклональные антитела использовали в концентрации 8 и 4 мкг/мл. Количественно оценивали степень минерализации (различные типы нерастворимого фосфата кальция), измеряя уровень кальция. На фиг. 24 показаны результаты анализа минерализации клеточной линии остеобластов MC3T3-E1BF, используемого для идентификации нейтрализующих мАт против склеростина. Использовали склеростин человека (Scl) в концентрации 1 мкг/мл. Моноклональные антитела использовали в концентрации 10 мкг/мл. Количественно оценивали степень минерализации (различные типы нерастворимого фосфата кальция), измеряя уровень кальция. На фиг. 25 изображены результаты, полученные в модели индуцированной воспалением потери массы костей у мышей SCID. Обработка Ab-А защищала мышей от связанной с воспалением потери массы при колите, которую измеряли по общей минеральной плотности костей (фиг. 25 А), плотности костной ткани позвонков (фиг. 25 В) и плотности бедренной кости (фиг. 25 С). Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к областям белка склеростина человека, которые содержат эпитопы, узнаваемые антителами, которые также связываются с полноразмерным склеростином, и к способам получения и применения таких эпитопов. Изобретение также относится к связывающим агентам (таким как антитела), которые специфично связываются со склеростином или частями склеростина, и к способам применения таких связывающих агентов. Связывающие агенты применимы для блокирования или уменьшения связывания склеростина человека с одним или несколькими лигандами. Рекомбинантный склеростин человека/SOST коммерчески доступен из RD Systems (Minneapolis,MN, USA; 2006,в каталоге 1406-ST-025). Кроме того, коммерчески доступен рекомбинантный склеростин мыши/SOST из RD Systems (Minneapolis, MN, USA; 2006,в каталоге 1589-ST-025). Очищен-6 021539 ные для исследования связывающие склеростин моноклональные антитела коммерчески доступны изRD Systems (Minneapolis, MN, USA; мышиное моноклональное: 2006,в каталоге МАВ 1406; моноклональное крысы: 2006,в каталоге МАВ 1589). Патенты США 6395511 и 6803453 и публикации патентов США 20040009535 и 20050106683, в общем, относятся к антителам против склеростина. В используемом в данном описании смысле подразумевается, что термин склеростин человека включает белок с последовательностью SEQ ID NO: 1 и его аллельные варианты. Склеростин может быть очищен из клеток-хозяев 293 Т, которые были трансфицированы геном, кодирующим склеростин,посредством элюирования профильтрованного надосадка культуральной жидкости клеток-хозяев на колонке с гепарином HP, используя градиент соли. Получение и последующая очистка с использованием катионообменной хроматографии описаны в примерах 1 и 2. Связывающие агенты согласно изобретению предпочтительно представляют собой антитела, которые определены в данном описании. Термин "антитело" относится к интактному антителу или его связывающему фрагменту. Антитело может содержать полную молекулу антитела (включая варианты в виде поликлонального, моноклонального, химерного, гуманизированного или антитела человека, имеющего полноразмерные тяжелые и/или легкие цепи) или может содержать его антигенсвязывающий фрагмент. Фрагменты антител включают F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc и Fd-фрагменты, и они могут быть включены в однодоменные антитела, одноцепочечные антитела, максиантитела, миниантитела, внутриклеточные антитела, димерные антитела, тримерные антитела, тетрамерные антитела, v-NAR и bis-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Полипептиды антител также описаны в патенте США 6703199, включая полипептидные моноантитела против фибронектина. Другие полипептиды антител описаны в публикации патента США 2005/0238646, которые представляют собой одноцепочечные полипептиды. Антигенсвязывающие фрагменты, получаемые из антитела, могут быть получены, например, протеолитическим гидролизом антитела, например расщеплением пепсином или папаином целых антител обычными способами. В качестве примера фрагменты антител могут быть получены ферментативным расщеплением антител пепсином с образованием 5S-фрагмента, названного F(ab')2. Указанный фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием восстанавливающего тиол агента с получением моновалентных 3,5S Fab'-фрагментов. Необязательно реакцию расщепления можно осуществлять с использованием группы, блокирующей сульфгидрильные группы, которые образуются в результате расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы ферментативное расщепление с использованием папаина непосредственно дает два моновалентных Fab-фрагмента и Fc-фрагмент. Указанные способы описаны, например, Goldenberg в патенте США 4331647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967) и Andrews, S.M. and Titus, J.A. Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al., eds), John Wileyand Sons, New York (2003), стр. 2.8.1-2.8.10 и 2.10A.1-2.10A.5. Также можно применять другие способы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей, с образованием моновалентных фрагментов,состоящих из легкой и тяжелой цепей (Fd), дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы, при условии, что фрагменты связываются с антигеном, который узнается интактным антителом. Фрагмент антитела также может представлять собой любой синтетический или генетически сконструированный белок. Например, фрагменты антител включают изолированные фрагменты, состоящие из вариабельной области легкой цепи, Fv-фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей связаны пептидным линкером (scFv-белки). Другой формой фрагмента антитела является пептид, содержащий одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) антитела. CDR (также называемые "минимальными единицами узнавания" или "гипервариабельной областью") могут быть получены конструированием полинуклеотидов, которые кодируют представляющие интерес CDR. Такие полинуклеотиды получают, например, используя полимеразную цепную реакцию, чтобы синтезировать вариабельную область, используя мРНК из продуцирующих антитела клеток в качестве матрицы (см., например, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995) и Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", inMonoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995. Таким образом, в одном варианте связывающий агент содержит по меньшей мере одну CDR, которая описана в данной публикации. Связывающий агент может содержать по меньшей мере две, три, четыре, пять или шесть CDR, которые описаны в данной публикации. Связывающий агент, кроме того,может содержать по меньшей мере один домен вариабельной области антитела, указанного в данном описании. Домен вариабельной области может быть любого размера или иметь любой аминокислотный состав и, как правило, будет содержать по меньшей мере одну последовательность CDR, ответственную за связывание со склеростином человека, например CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 и/или CDR легкой цепи,специально описанные в данной публикации, которая расположена рядом или в рамке считывания с од-7 021539 ной или несколькими каркасными последовательностями. В общих чертах домен вариабельной (V) области может иметь любую подходящую структуру вариабельных доменов тяжелой (VH) и/или легкой(VL) цепи иммуноглобулина. Таким образом, например, домен V-области может быть мономерным и может быть VH-доменом или VL-доменом, который способен независимо связывать склеростин человека с аффинностью по меньшей мере равной 110-7 М или меньшей, как описано ниже. Альтернативно доменV-области может быть димерным и может содержать димеры VH-VH, VH-VL или VL-VL. Димер V-области содержит по меньшей мере одну VH- и по меньшей мере одну VL-цель, которые могут быть нековалентно связаны (в дальнейшем называемые FV). При желании цепи могут быть ковалентно связаны либо непосредственно, например, дисульфидной связью между двумя вариабельными доменами, либо через линкер, например, пептидный линкер, с образованием одноцепочечного FV (scFV). Доменом вариабельной области может быть любой встречающийся в природе вариабельный домен или его сконструированный вариант. Под сконструированным вариантом подразумевается домен вариабельной области, который был создан с использованием методики конструирования рекомбинантной ДНК. Такие сконструированные варианты включают варианты, созданные, например, из вариабельной области специфичного антитела посредством инсерций, делеций или замен в аминокислотных последовательностях специфичного антитела. Конкретные примеры включают сконструированные домены вариабельной области, содержащие по меньшей мере одну CDR и, необязательно, одну или несколько аминокислот каркаса из первого антитела и остальную часть домена вариабельной области из второго антитела. Домен вариабельной области может быть ковалентно связан С-концевой аминокислотой по меньшей мере с одним другим доменом антитела или его фрагментом. Таким образом, например VH-домен,который присутствует в домене вариабельной области, может быть связан с доменом СН 1 иммуноглобулина или его фрагментом. Подобным образом VL-домен может быть связан с CK-доменом или его фрагментом. Таким образом, антитело может представлять собой, например, Fab-фрагмент, в котором антигенсвязывающий домен содержит ассоциированные VH- и VL-домены, ковалентно связанные на своих Сконцах с доменом СН 1 и CK соответственно. Домен СН 1 может быть удлинен дополнительными аминокислотами, например, чтобы получить шарнирную область или часть домена шарнирной области, которая имеется в Fab'-фрагменте, или чтобы получить дополнительные домены, такие как домены СН 2 и СН 3 антитела. Как описано в данной публикации, связывающие агенты содержат по меньшей мере одну из CDR. Например, одна или несколько CDR могут быть введены в известные каркасные области антител (IgG1,IgG2 и т.д.) или конъюгированы с подходящим носителем, чтобы увеличить время их полужизни. Подходящие носители включают без ограничения Fc, полиэтиленгликоль (ПЭГ), альбумин, трансферрин и тому подобное. Указанные и другие подходящие носители известны в данной области. Такие конъюгированные пептиды CDR могут быть в мономерной, димерной, тетрамерной или другой форме. В одном варианте один или несколько растворимых в воде полимеров связаны в одном или нескольких конкретных положениях, например, на аминоконце, связывающего агента. В некоторых предпочтительных вариантах связывающий агент содержит один или несколько связанных растворимых в воде полимеров, включая без ограничения полиэтиленгликоль, полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль. См., например, патенты США 4640835, 4496689, 4301144,4670417, 4791192 и 4179337. В некоторых вариантах производный связывающий агент содержит один или несколько полимеров: монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу или другие основанные на углеводах полимеры, поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля,сополимер полипропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и поливиниловый спирт, а также смеси таких полимеров. В некоторых вариантах один или несколько растворимых в воде полимеров случайным образом связаны с одной или несколькими боковыми цепями. В некоторых вариантах ПЭГ может действовать, улучшая терапевтическую способность связывающего агента, такого как антитело. Некоторые такие способы обсуждаются, например, в патенте США 6133426, который включен в данное описание в виде ссылки для любых целей. Будет понятно, что связывающий агент согласно настоящему изобретению может иметь по меньшей мере одну аминокислотную замену, при условии, что связывающий агент сохраняет специфичность связывания. Таким образом, модификации структур связывающих агентов входят в объем изобретения. Модификации могут включать аминокислотные замены, которые могут быть консервативными или неконсервативными, которые не нарушают способность связывающего агента связывать склеростин. Консервативные аминокислотные замены могут включать не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые обычно вводят с помощью химического синтеза пептидов, а не синтезом в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие обратные или инвертированные формы аминокислотных остатков. Консервативная аминокислотная замена также может включать замену нативного аминокислотного остатка стандартным остатком так, чтобы она оказывала небольшое влияние или не оказывала влияния на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении. Неконсервативные замены могут включать замену представителем одного класса аминокислот или миметиками аминокислот представителя из другого класса с другими физическими свойствами (например, размером, полярностью, гидрофобностью, зарядом). Такие замены остатков могут быть введены в области антитела человека, которые гомологичны антителам животных, отличных от человека, или в негомологичные области молекулы. Кроме того, специалист в данной области может создать варианты для тестирования, содержащие одну аминокислотную замену в каждом требуемом положении аминокислот. Затем варианты могут быть подвергнуты скринингу с использованием анализов активности, известных специалистам в данной области. Такие варианты могут быть использованы для получения информации о подходящих вариантах. Например, если обнаружено, что замена на конкретный аминокислотный остаток приводит к нарушенной, нежелательно пониженной или неподходящей активности, то от вариантов с такой заменой можно отказаться. Другими словами, на основании информации, полученной в результате таких обычных экспериментов, специалист в данной области легко может определить аминокислоты, дополнительные замены которых либо отдельно, либо в комбинации с другими мутациями необходимо избегать. Специалист в данной области может определить подходящие варианты полипептида, который указан в данном описании, используя хорошо известные способы. В некоторых вариантах специалист в данной области может идентифицировать подходящие области молекулы, которые могут быть изменены без нарушения активности целенаправленным воздействием на области, которые не считаются важными для активности. В некоторых вариантах можно идентифицировать остатки и части молекулы, которые являются консервативными в сходных полипептидах. В некоторых вариантах даже те области, которые могут быть важными для биологической активности или для структуры, могут быть подвергнуты консервативным аминокислотным заменам без нарушения биологической активности или без неблагоприятного влияния на структуру полипептида. Кроме того, специалист в данной области может проанализировать исследования структурыфункции, в которых в сходных полипептидах идентифицированы остатки, важные для активности или структуры. На основе такого сравнения можно предсказать значение аминокислотных остатков в белке,которые соответствуют аминокислотным остаткам, которые имеют важное значение для активности или структуры в сходных белках. Специалист в данной области может выбрать химически сходные аминокислотные замены для таких предсказанных важных аминокислотных остатков. Специалист в данной области также может проанализировать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность в сравнении с трехмерной структурой сходных полипептидов. На основании такой информации специалист в данной области может предсказать положение аминокислотных остатков антитела относительно трехмерной структуры. В некоторых вариантах специалист в данной области может предпочесть не делать радикальных изменений аминокислотных остатков, которые, судя по прогнозу, находятся на поверхности белка, так как такие остатки могут быть вовлечены в важные взаимодействия с другими молекулами. Ряд научных публикаций был посвящен предсказанию вторичной структуры. См. Moult J., Curr. Op.in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry,113 (2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al.,Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 и Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Кроме того, в настоящее время доступны компьютерные программы, помогающие предсказывать вторичную структуру. Один из способов предсказания вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например, два полипептида или белка, которые имеют последовательность, идентичную более чем на 30% или сходную более чем на 40%, часто имеют сходную структурную топологию. Увеличение базы данных о структуре белков (PDB) в настоящее время обеспечило более высокую предсказуемость вторичной структуры,включая возможное количество изгибов в структуре полипептида или белка. См. Holm et al., Nucl. Acid.Res., 27(1):244-247 (1999). Было сделано предположение (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369376 (1997, что существует ограниченное количество изгибов в данном полипептиде или белке и что после того, как будет выяснено критическое количество структур, структурное прогнозирование станет значительно более точным. Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают "протягивание нити"Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13):4355-4358 (1987 и "эволюционное связывание" (см. Holm,выше, (1999), и Brenner, выше (1997. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты связывающих агентов включают варианты гликозилирования, в которых количество и/или тип сайтов гликозилирования изменено по сравнению с аминокислотными последовательностями исходного полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты содержат большее или меньшее количество N-связанных сайтов гликозилирования, чем в нативном белке. N-связанный сайт гликозилирования характеризуется последовательностью: Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где аминокислотный остаток, обозначенный X, может представлять собой любой аминокислотный остаток, за исключением пролина. Замена аминокислотных остатков с образованием такой последовательности создает потенциальный новый сайт для добавления Nсвязанной углеводной цепи. Альтернативно, замены, которые устраняют такую последовательность, будут удалять существующую N-связанную углеводную цепь. Также предлагается перестановка N-9 021539 связанных углеводных цепей, при которой удаляют один или несколько N-связанных сайтов гликозилирования (обычно сайтов гликозилирования, встречающихся в природе) и создают один или несколько новых N-связанных сайтов. Дополнительные предпочтительные варианты антител включают варианты по цистеину, в которых один или несколько остатков цистеина делетированы или заменены другой аминокислотой (например, серином) по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью. Цистеиновые варианты могут быть применимы в том случае, когда антитела должны быть подвергнуты рефолдингу с образованием биологически активной конформации, например, после выделения нерастворимых телец включения. Цистеиновые варианты, как правило, имеют меньше остатков цистеина, чем нативный белок, и обычно имеют четное количество, чтобы минимизировать взаимодействия из-за наличия неспаренных цистеинов. Требуемые аминокислотные замены (либо консервативные, либо неконсервативные) могут быть определены специалистами в данной области, когда такие замены потребуются. В некоторых вариантах аминокислотные замены могут быть использованы для идентификации важных остатков антител к склеростину или для увеличения или уменьшения аффинности антител к склеростину, указанных в данном описании. Согласно некоторым вариантам предпочтительными аминокислотными заменами являются замены,которые: (1) уменьшают чувствительность к протеолизу, (2) уменьшают чувствительность к окислению,(3) изменяют аффинность связывания для образования комплексов с белками, (4) изменяют аффинности связывания и/или (4) придают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких полипептидов. Согласно некоторым вариантам одиночные или множественные аминокислотные замены (в некоторых вариантах консервативные аминокислотные замены) могут быть осуществлены в природной последовательности (в некоторых вариантах в части полипептида вне домена(ов),образующего межмолекулярные контакты). В некоторых вариантах консервативная аминокислотная замена обычно существенно не изменяет структурные признаки исходной последовательности (например,замена аминокислоты не должна вести к разрушению спирали, которая имеется в исходной последовательности, или разрушению других типов вторичной структуры, которые характерны для исходной последовательности). Примеры известных в данной области вторичных и третичных структур полипептидов описаны в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company,New York (1984; Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, NewYork, N.Y. (1991 и Thornton et al. Nature 354:105 (1991), каждая из публикаций включена в данное описание в виде ссылки. В некоторых вариантах связывающие агенты согласно изобретению могут быть химически связаны с полимерами, липидами или другими остатками. Связывающие агенты могут содержать по меньшей мере одну из CDR, описанных в данной публикации, введенную в биосовместимую каркасную структуру. В одном примере биосовместимая каркасная структура содержит полипептид или его часть, которая является достаточной для образования конформационно стабильной структурной опоры или каркаса или скелета, которая способна выводить одну или несколько последовательностей аминокислот, которые связываются с антигеном (например, CDR, вариабельная область и т.д.), на локализованной области поверхности. Такие структуры могут представлять собой встречающийся в природе полипептид или "укладку" полипептида (структурный мотив) или могут иметь одну или несколько модификаций, таких как добавления, делеции или замены аминокислот по сравнению с природным полипептидом или "укладкой". Такие каркасы могут быть получены из полипептида любого вида (или более чем одного вида), такого как человек, другое млекопитающее, другое позвоночное, беспозвоночное, растение, бактерия или вирус. Обычно биосовместимые каркасные структуры основаны на каркасах или скелетах белков, отличных от доменов иммуноглобулинов. Например, можно использовать каркасные структуры, основанные на фибронектине, анкирине, липокалине, неокарциностатине, цитохроме b, цинковом пальце СР 1, PST1,двойной спирали, LACI-D1, Z-домене и доменах тендрамизата (см., например, Nygren and Uhlen, 1997,Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469). В предпочтительных вариантах будет понятно, что связывающие агенты согласно изобретению включают гуманизированные антитела, описанные в данной публикации. Гуманизированные антитела,такие как антитела, указанные в данном описании, могут быть получены с использованием способов,известных специалистам в данной области (Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42 (12): 1445-1451,2005; Hwang W. et al., Methods, 36(1):35-42, 2005; Dall'Acqua W.F., et al., Methods, 36(l):43-60, 2005 иClark, M., Immunology Today. 21(8):397-402, 2000). Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что подходящие связывающие агенты включают части указанных антител, такие как одна или несколько CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1,CDR-L2 и CDR-L3, которые специально описаны в данной публикации. По меньшей мере одна из областей CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 может иметь по меньшей мере одну аминокислотную замену при условии, что связывающий агент сохраняет специфичность связывания не содержащей замен CDR. Не относящаяся к CDR часть связывающего агента может представлять собой небелковую молекулу, при этом связывающий агент перекрестно блокирует связывание антитела, раскрытого в данном описании, со склеростином и/или нейтрализует склеростин. Не относящаяся к CDR часть связывающего агента может представлять собой небелковую молекулу, при этом связывающий агент имеет картину связывания с пептидами склеростина человека в "анализе конкурентного связывания пептидных эпитопов склеростина человека", сходную с картиной связывания, которую имеет по меньшей мере одно из антител Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11,Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 и Ab-24, и/или нейтрализует склеростин. Не относящаяся к CDR часть связывающего агента может состоять из аминокислот, при этом связывающий агент представляет собой рекомбинантный связывающий белок или синтетический пептид, и рекомбинантный связывающий белок перекрестно блокирует связывание антитела,раскрытого в данном описании, со склеростином и/или нейтрализует склеростин. Не относящаяся к CDR часть связывающего агента может состоять из аминокислот, при этом связывающий агент представляет собой рекомбинантный связывающий белок, и рекомбинантный связывающий белок имеет картину связывания с пептидами склеростина человека в анализе конкурентного связывания пептидных эпитопов склеростина человека (описанном ниже), сходную с картиной связывания по меньшей мере одного из антител Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 и Ab-24, и/или нейтрализует склеростин. В том случае, когда антитело содержит одну или несколько CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1,CDR-L2 и CDR-L3, которые описаны выше, его можно получить экспрессией в клетке-хозяине, содержащей ДНК, кодирующую указанные последовательности. ДНК, кодирующую каждую последовательность CDR, можно определить на основе аминокислотной последовательности CDR и синтезировать вместе с любыми требуемыми последовательностями ДНК каркаса вариабельной области антитела и константной области, используя методику синтеза олигонуклеотидов, способы сайт-направленного мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соответствующих случаях. ДНК, кодирующая каркасы вариабельной области и константные области, широко доступна специалистам в данной области из баз данных генетических последовательностей, таких как GenBank. Каждая из указанных выше CDR, как правило, будет расположена в каркасе вариабельной области в положениях 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDRH2) и 95-102 (CDR-H3) тяжелой цепи и в положениях 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2) и 89-97 (CDR-L3) легкой цепи согласно системе нумерации Кабата (Rabat et al., 1987, в Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA). После синтеза ДНК, кодирующая антитело согласно изобретению или его фрагмент, может быть размножена и экспрессирована согласно любому из множества хорошо известных способов вырезания нуклеиновой кислоты, лигирования, трансформации и трансфекции с использованием ряда известных экспрессирующих векторов. Таким образом, в некоторых вариантах экспрессия фрагмента антитела может быть предпочтительно осуществлена в прокариотической клетке, такой как Escherichia coli (см., например, Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515). В некоторых других вариантах экспрессия антитела или его фрагмента может быть предпочтительно осуществлена в эукариотической клеткехозяине, включая дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и Pichia pastoris), клетки животных (включая клетки млекопитающих) или клетки растений. Примеры подходящих клеток животных включают без ограничения клетки миеломы (такие как мышиная линия NSO), COS,CHO или клетки гибридомы. Примеры растительных клеток включают клетки табака, кукурузы, сои и риса. Можно получить один или несколько реплицируемых экспрессирующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую вариабельную и/или константную область антитела, и использовать для трансформации подходящей линии клеток, например непродуцирующей линии клеток миеломы, такой как линияNSO мыши, или бактерий, таких как Е. coli, в которых будет происходить продуцирование антитела. Чтобы получить эффективную транскрипцию и трансляцию, последовательность ДНК в каждом векторе должна содержать подходящие регуляторные последовательности, в частности промотор и лидерную последовательность, функционально связанные с последовательностью вариабельного домена. Конкретные способы получения антител, таким образом, как правило, хорошо известны и применяются в повседневной практике. Например, основные способы молекулярной биологии описаны Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989; см. такжеManiatis et al., 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001. Секвенирование ДНК можно осуществить, как описано в Sanger et al. (PNAS 74:5463, (1977 и в руководстве по секвенированию Amersham International plc, и сайт-направленный мутагенез можно осуществить согласно способам, известным в данной области (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987); руководство Anglian BiotechnologyLtd) . Кроме того, в многочисленных публикациях описаны способы, подходящие для получения антител посредством обработки ДНК, создания экспрессирующих векторов и трансформации и культивирования подходящих клеток (Mountain A. and Adair, J.R. в Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. В том случае, когда требуется улучшить аффинность антител согласно изобретению, содержащих одну или несколько из указанных выше CDR, можно использовать ряд протоколов созревания аффинности, включая сохранение CDR (Yang et al., J. Mol. Biol, 254, 392-403, 1995), перестановку цепей (Marks etal., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), применение мутантных штаммов E.coli (Low et al., J. Mol. Biol.,250, 350-368, 1996), перетасовку ДНК (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), фаговый дисплей (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) и "половую" ПЦР (Crameri, et al., Nature, 391, 288291, 1998). Все указанные способы созревания аффинности обсуждаются Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). Другие антитела согласно изобретению могут быть получены обычными способами иммунизации и слияния клеток, которые описаны в данной публикации и известны в данной области. Моноклональные антитела согласно изобретению могут быть созданы с использованием различных известных способов. В общем, моноклональные антитела, которые связываются со специфичными антигенами, могут быть получены способами, известными специалистам в данной области (см., например, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley and Sons 1991); патенты СШАRE 32011, 4902614, 4543439 и 4411993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: AA Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al.,"Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli", в DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995. Из них могут быть получены фрагменты антител с использованием любого подходящего стандартного способа, такого как протеолитическое расщепление, или, необязательно, посредством протеолитического расщепления (например, с использованием папаина или пепсина) с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты также могут быть созданы способами рекомбинантной генетической инженерии, которые описаны в данной публикации. Моноклональные антитела могут быть получены посредством инъекции животному, например крысе, хомячку, кролику или предпочтительно мыши, включая, например, трансгенных или нокаутированных животных, которые известны в данной области, иммуногена, содержащего склеростин человека с последовательностью SEQ ID NO: 1 или его фрагмент, способами, известными в данной области и описанными в данной публикации. Можно наблюдать наличие продукции специфичных антител после первой инъекции и/или после бустер-инъекции, получая образец сыворотки и выявляя присутствие антитела, которое связывается со склеростином человека или пептидом, с использованием любого из нескольких способов иммунологического анализа, известных в данной области и описанных в данной публикации. Из организма животных, продуцирующих требуемые антитела, извлекают лимфоидные клетки, чаще всего клетки из селезенки или лимфатического узла, чтобы получить В-лимфоциты. Затем Влимфоциты сливают с сенсибилизованными лекарственным средством клетками миеломы, являющимися партнерами для слияния, предпочтительно клетками, которые являются сингенными по отношению к иммунизируемому животному и которые необязательно обладают другими требуемыми свойствами (например, не способны экспрессировать эндогенные продукты генов Ig, например Р 3 Х 63-Ag 8.653 (АТССCRL 1580); NSO, SP20), чтобы получить гибридомы, которые представляют собой бессмертные линии эукариотических клеток. Лимфоидные клетки (например, клетки селезенки) и клетки миеломы можно объединять в течение нескольких минут с агентом, стимулирующим слияние мембран, таким как полиэтиленгликоль или неионогенный детергент, и затем высевать при низкой плотности на селективную среду, которая поддерживает рост клеток гибридомы, но не поддерживает рост неслитых клеток миеломы. Предпочтительной селективной средой является среда HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). После достаточного периода времени, обычно от одной до двух недель, наблюдают колонии клеток. Отдельные колонии выделяют, и антитела, продуцируемые клетками, можно тестировать в отношении активности связывания со склеростином человека, используя любой из множества иммуноанализов, известных в данной области и описанных в данной публикации. Гибридомы клонируют (например, клонированием на основе лимитирующего разведения или выделением бляшек на мягком агаре), и позитивные клоны, которые продуцируют антитело, специфичное по отношению к склеростину, отбирают и культивируют. Моноклональные антитела из культур гибридом могут быть выделены из надосадков культур гибридом. Альтернативный способ получения мышиного моноклонального антитела заключается в инъекции клеток гибридом в брюшную полость сингенной мыши, например мыши, которая была подвергнута обработке (например, примированы пристаном), стимулирующей образование асцитной жидкости,содержащей моноклональное антитело. Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены различными хорошо известными способами. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию на белок А-сефарозе, эксклюзионную хроматографию по размеру и ионообменную хроматографиюG (IgG)", в Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992. Моноклональные антитела могут быть очищены аффинной хроматографией с использованием подходящего лиганда, выбранного на основе конкретных свойств антитела (например, изотипа тяжелой или легкой цепи,специфичности связывания и т.д.). Примеры подходящих лигандов, иммобилизованных на твердой под- 12021539 ложке, включают белок А, белок G, антитело против константной области (легкой цепи или тяжелой цепи), антиидиотипическое антитело и белок, связывающий TGF-, или их фрагмент или вариант. Антитело согласно настоящему изобретению также может быть моноклональным антителом человека. Моноклональные антитела человека могут быть созданы любым из ряда способов, которые будут известны специалистам в данной области. Такие способы включают без ограничения трансформацию вирусом Эпштейна-Барра (EBV) клеток периферической крови человека (например, содержащих Влимфоциты), иммунизацию in vitro В-клеток человека, слияние клеток селезенки от иммунизированных трансгенных мышей, несущих встроенные гены иммуноглобулинов человека, выделение из фаговых библиотек V-областей иммуноглобулинов человека или другие способы, которые известны в данной области и описаны в данной публикации. Например, моноклональные антитела человека могут быть получены от трансгенных мышей, которые были сконструированы так, чтобы получить специфичные антитела человека в ответ на антигенную стимуляцию. Способы получения антител человека от трансгенных мышей описаны, например, в Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994;Taylor et al., Jnt. Immun. 6:579, 1994; в патенте США 5877397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:525-35. При использовании такого способа элементы локуса тяжелой и легкой цепи человека вводят в линии мышей, полученные из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат целенаправленные нарушения эндогенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи (см. также Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997. Например, трансгены иммуноглобулинов человека могут представлять собой конструкции минигенов или транслокулы в искусственных дрожжевых хромосомах, которые подвергаются специфичной для Вклеток реаранжировке и гипермутированию ДНК в лимфоидной ткани мышей. Моноклональные антитела человека могут быть получены иммунизацией трансгенных мышей, которые после этого могут продуцировать антитела человека, специфичные для склеростина. Лимфоидные клетки иммунизированных трансгенных мышей можно использовать для получения секретирующих антитела человека гидридом способами, описанными в данной публикации. Также из крови иммунизированных животных могут быть получены поликлональные сыворотки, содержащие антитела человека. Другой способ создания антител человека согласно изобретению заключается в иммортализации клеток периферической крови человека трансформацией EBV. См., например, патент США 4464456. Такая линия иммортализованных В-клеток (или линия лимфобластоидных клеток), продуцирующих моноклональное антитело, которое специфично связывается со склеростином, может быть идентифицирована способами иммунологического анализа, которые предлагаются в данном описании, напримерELISA, и затем выделена стандартными способами клонирования. Стабильность линии лимфобластоидных клеток, продуцирующих антитело против склеростина, может быть повышена слиянием трансформированной линии клеток с миеломой мышей с получением линии гибридных клеток мышь-человек согласно способам, известным в данной области (см., например, Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989. Еще одним способом создания моноклональных антител человека является иммунизация in vitro, которая заключается в примировании В-клеток селезенки человека склеростином человека с последующим слиянием примированных В-клеток с партнером для слияния, дающего гетерогибридомы. См., например,Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147:86-95. В некоторых вариантах отбирают В-клетку, которая продуцирует антитело против склеростина человека, и из В-клетки клонируют вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи способами молекулярной биологии, известными в данной области (WO 92/02551; патент США 5627052; Babcook et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996 и описанными в данной публикации. В-клетки иммунизированного животного могут быть выделены из селезенки, лимфатического узла или образца периферической крови в результате отбора клеток, которые продуцируют антитело, которое специфично связывается со склеростином. В-клетки также могут быть выделены из организма человека, например из образца периферической крови. Способы выявления отдельных В-клеток, которые продуцируют антитело требуемой специфичности, хорошо известны в данной области, например образование бляшек, активируемая флюоресценцией сортировка клеток, стимуляция in vitro с последующей регистрацией специфичного антитела и т.п. Способы отбора В-клеток, продуцирующих специфичные антитела, включают, например,получение суспензии отдельных В-клеток в мягком агаре, который содержит склеростин человека. Связывание специфичного антитела, продуцируемого В-клеткой, с антигеном, приводит к образованию комплекса, который может быть видимым в виде иммунопреципитата. После отбора В-клеток, продуцирующих требуемое антитело, гены специфичных антител могут быть клонированы посредством выделения и амплификации ДНК или мРНК согласно способам, известным в данной области и описанным в данной публикации. Другим способом получения антител согласно изобретению является фаговый дисплей. См., например, Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57:191-280. Комбинаторные библиотеки генов вариабельных областей иммуноглобулинов человека или мыши могут быть созданы в фаговых векторах, которые могут быть подвергнуты скринингу для отбора фрагментов Ig(Fab, Fv, sFv или их мультимеров), которые специфично связываются с белком, связывающим TGF-,- 13021539 или с его вариантом или фрагментом. См., например, патент США 5223409; Huse et al., 1989, Science 246:1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al., 1991, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al.,1992, J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch et al., 1997, Hybridoma 16:47-52 и ссылки, цитированные в указанных публикациях. Например, библиотека, содержащая множество полинуклеотидных последовательностей, кодирующих фрагменты вариабельной области Ig, может быть встроена в геном нитчатого бактериофага, такого как М 13 или его вариант, в рамке с последовательностью, кодирующей белок оболочки фага. Слитый белок может представлять собой слияние белка оболочки с доменом вариабельной области легкой цепи и/или доменом вариабельной области тяжелой цепи. Согласно некоторым вариантам Fab-фрагменты иммуноглобулина также могут быть представлены на поверхности фаговой частицы(см., например, патент США 5698426). Библиотеки, экспрессирующие кДНК тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, также могут быть получены в фаге , например, с использованием векторов ImmunoZap (H) и ImmunoZap (L) (Stratagene, La Jolla, California). Коротко, мРНК выделяют из популяции В-клеток и используют для создания библиотек, экспрессирующих кДНК тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, в векторахImmunoZap(H) и ImmunoZap(L). Указанные векторы могут быть подвергнуты скринингу отдельно или могут быть экспрессированы совместно с образованием Fab-фрагментов или антител (см. Huse et al., выше; см. также Sastry et al., выше). Позитивные бляшки могут быть затем преобразованы в нелитическую плазмиду, которая обеспечивает высокий уровень экспрессии фрагментов моноклональных антител в Е.coli. В одном варианте в гибридоме вариабельные области гена, экспрессирующего представляющее интерес моноклональное антитело, амплифицируют с использованием нуклеотидных праймеров. Указанные праймеры могут быть синтезированы специалистом в данной области или могут быть приобретены из коммерчески доступных источников (см., например, Stratagene (La Jolla, California), которые продают праймеры для вариабельных областей мыши и человека, включая наряду с другими праймеры для областей VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VL и CL). Указанные праймеры могут быть использованы для амплификации вариабельных областей тяжелой или легкой цепи, которые затем могут быть встроены в векторы, такие как ImmunoZAPH или ImmunoZAPL (Stratagene) соответственно. Указанные векторы затем могут быть введены в системы экспрессии, основанные на Е. coli, дрожжах или млекопитающих. С использованием указанных способов могут быть получены большие количества одноцепочечного белка, содержащего слияние доменов VH и VL (см. Bird et al., Science 242:423-426, 1988). После получения клеток, продуцирующих антитела согласно изобретению, с использованием любого из описанных выше способов иммунизации и других способов гены специфичных антител могут быть клонированы посредством выделения и амплификации ДНК или мРНК стандартными способами, которые описаны в данной публикации. Антитела, получаемые с таких генов, могут быть секвенированы и могут быть идентифицированы CDR, а ДНК, кодирующие CDR, могут быть подвергнуты обработке, как описано ранее, чтобы получить другие антитела согласно изобретению. Предпочтительно связывающие агенты специфично связываются со склеростином. Как и в случае всех других связывающих агентов и анализов связывания, специалисту в данной области будет понятно,что различные остатки, с которыми связывающий агент не должен явно связываться, чтобы быть терапевтически эффективным и подходящим, трудно и нецелесообразно перечислять. Поэтому в случае связывающего агента, раскрытого в данном описании, термин "специфично связывается" относится к способности связывающего агента связываться со склеростином, предпочтительно склеростином человека, с более высокой аффинностью, чем он связывается с неродственным контрольным белком. Предпочтительно контрольным белком является лизоцим яичного белка кур. Предпочтительно связывающие агенты связываются со склеростином с аффинностью, которая по меньшей мере в 50, 100, 250, 500, 1000 или 10000 раз выше, чем аффинность по отношению к контрольному белку. Связывающий агент может обладать аффинностью связывания по отношению к склеростину человека, меньшей или равной 110-7 М,меньшей или равной 110-8 м, меньшей или равной 110-9 М, меньшей или равной 110-10 М, меньшей или равной 110-11 М или меньшей или равной 110-12 М. Аффинность можно определить анализом аффинности в ELISA. В некоторых вариантах аффинность можно определить в анализе BIAcore. В некоторых вариантах аффинность можно определить кинетическим способом. В некоторых вариантах аффинность можно определить способом уравновешивания/растворения. Такие способы описаны более подробно в данном описании или известны в данной области. Связывающие склеростин агенты согласно настоящему изобретению предпочтительно модулируют функцию склеростина в анализе, основанном на клетках, описанном в данной публикации, и/или в анализе in vivo, описанном в данной публикации, и/или связываются с одним или несколькими эпитопами,описанными в данной публикации, и/или перекрестно блокируют связывание одного из антител, описанных в данной заявке, и/или их связывание со склеростином перекрестно блокируется одним из антител,описанных в данной заявке. Соответственно, такие связывающие агенты могут быть идентифицированы с использованием анализов, описанных в данной публикации. В некоторых вариантах связывающие агенты образованы первыми идентифицирующими антителами, которые связываются с одним или несколькими эпитопами, предлагаемыми в данном описании,и/или нейтрализуют в основанных на клетках анализах и/или в анализах in vivo, описанных в данной публикации, и/или перекрестно блокируют антитела, описанные в данной заявке, и/или их связывание со склеростином перекрестно блокируется одним из антител, описанных в данной заявке. CDR-области из указанных антител затем используют для встраивания в подходящие биосовместимые каркасы, чтобы создать связывающие склеростин агенты. Не относящаяся к CDR часть связывающего агента может состоять из аминокислот или может представлять собой небелковую молекулу. Анализы, описанные в данной публикации, позволяют характеризовать связывающие агенты. Предпочтительно связывающие агенты согласно настоящему изобретению представляют собой антитела, которые определены в данном описании. Специалисту в данной области будет понятно, что некоторые белки, такие как антитела, могут подвергаться разнообразным посттрансляционным модификациям. Тип и степень таких модификаций часто зависят от линии клеток-хозяев, используемой для экспрессии белка, а также от условий культивирования. Такие модификации могут включать варианты гликозилирования, окисление метионина, образование дикетопиперазина, изомеризацию аспартата и дезамидирование аспарагина. Частой модификацией является потеря основного остатка на карбоксильном конце (такого как лизин или аргинин) в результате действия карбоксипептидаз (которые описаны в Harris, R.J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Антитела, называемые Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D и Ab-1, описаны ниже. "НС" относится к тяжелой цепи, и "LC" относится к легкой цепи. В случае некоторых указанных ниже антител CDR заключены в прямоугольники, а константные (С) области показаны жирным курсивом.Ab-D. Антитело D (также называемое в данном описании Ab-D и Mab-D) является мышиным антителом,которое имеет высокую аффинность связывания со склеростином. Картина связывания в анализе BIAcore для Ab-D показана на фиг. 18. Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) легкой цепи Ab-D Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) LC Ab-D, показана ниже Последовательность нуклеиновой кислоты LC Ab-D, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) тяжелой цепи НС Ab-D показана ниже Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-D Последовательность нуклеиновой кислоты НС Ab-D, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Последовательности CDR (определяющей комплементарность области) в вариабельной области тяжелой цепи Ab-D показаны ниже Последовательности CDR вариабельной области легкой цепи Ab-DAb-C. Антитело С (также называемое в данном описании Ab-С и Mab-С) является мышиным антителом,которое имеет высокую аффинность связывания со склеростином. Картина связывания в анализе BIAcore для Ab-С показана на фиг. 17. Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) легкой цепи Ab-С показана ниже Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) LC Ab-C Последовательность нуклеиновой кислоты LC Ab-С, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Тяжелая цепь Ab-C. Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-C Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-С, показана ниже Аминокислотная последовательность НС Ab-С, включая сигнальный пептид Последовательность нуклеиновой кислоты НС Ab-С, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Последовательности CDR (определяющей комплементарность области) в вариабельной области тяжелой цепи Ab-С показаны ниже Последовательности CDR вариабельной области легкой цепи Ab-CAb-A. Антитело А (также называемое в данном описании Ab-А и Mab-A) представляет собой химерное антитело кролика-мыши, которое имеет высокую аффинность связывания со склеростином. Картина связывания в анализе BIAcore для Ab-А показана на фиг. 15. Легкая цепь Ab-A. Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) LC Ab-A Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) LC Ab-A Последовательность нуклеиновой кислоты LC Ab-А, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-A Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-A Аминокислотная последовательность НС Ab-А, включая сигнальный пептид Последовательность нуклеиновой кислоты НС Ab-А, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Последовательности CDR (определяющей комплементарность области) в вариабельной области тяжелой цепи Ab-А показаны ниже Последовательности CDR вариабельной области легкой цепи Ab-AAb-А гуманизировали, и оно названо антителом 1 (также называемым в данном описании Ab-1),имеющим следующие последовательности. Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области LC Ab-1, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Аминокислотная последовательность вариабельной области LC Ab-1, включая сигнальный пептид Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области НС Ab-1, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Аминокислотная последовательность вариабельной области НС Ab-1, включая сигнальный пептид Последовательности CDR (определяющей комплементарность области) в вариабельной области тяжелой цепи Ab-1 показаны ниже Последовательности CDR вариабельной области легкой цепи Ab-1Ab-B. Антитело В (также называемое в данном описании Ab-В и Mab-В) представляет собой антитело мыши, которое имеет высокую аффинность связывания со склеростином. Картина связывания в анализеBIAcore для Ab-В показана на фиг. 16. Легкая цепь Ab-B. Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) LC Ab-B Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) LC Ab-B Последовательность нуклеиновой кислоты LC Ab-В, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Тяжелая цепь Ab-B. Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-B Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-B Аминокислотная последовательность НС Ab-В, включая сигнальный пептид Последовательность нуклеиновой кислоты НС Ab-В, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Последовательности CDR (определяющей комплементарность области) в вариабельной области тяжелой цепи Ab-В показаны ниже Последовательности CDR вариабельной области легкой цепи Ab-B Антитела, раскрытые в данном описании, связываются с областями склеростина человека, которые важны для активности белка in vivo. Связывание антитела со склеростином может коррелировать, например, с увеличением минеральной плотности костей, достигаемой в случае применения антитела invivo, например, как описано в примерах 5 и 9 (мыши) и примере 12 (обезьяны). Увеличение по меньшей мере одного из показателей: остеогенеза, содержания минеральных веществ в костях, костной массы,качества костей и прочности костей, также может быть достигнуто в случае применения антитела in vivo,например, как описано в примерах 5 и 9 (мыши) и примере 12 (обезьяны). Так как связывание антитела со склеростином главным образом определяется последовательностями CDR, то антитело для практического осуществления изобретения может быть получено со всеми или некоторыми из описанных последовательностей CDR в подходящем каркасе, при этом антитело сохраняет способность специфично связываться со склеростином, и можно ожидать, например, что будет достигнуто увеличение минеральной плотности костей. Такие антитела применимы для лечения состояний человека или животного, которые вызваны, связаны или приводят по меньшей мере к одному из последствий: низкому остеогенезу, низкой минеральной плотности костей, низкому содержанию минеральных веществ в костях, низкой костной массе, низкому качеству костей и низкой прочности костей. Способы конструирования и экспрессии антител и их фрагментов, содержащих CDR согласно настоящему изобретению, известны специалистам в данной области. Таким образом, настоящее изобретение в одном варианте осуществления относится к изолированному антителу, включая Ab-A, или к его антигенсвязывающему фрагменту, который специфично связывается со склеростином и в котором вариабельный домен тяжелой цепи содержит по меньшей мере однуCDR-H2 и SEQ ID NO: 53 для CDR-H3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, в котором CDR состоят по меньшей мере из одного из пептидов с последовательностями SEQ ID NO: 51 для CDR-Hl, SEQ ID NO: 52 для CDR-H2 и SEQ ID NO: 53 дляCDR-H3. В том случае, когда в антителах согласно изобретению присутствует легкая цепь, легкая цепь может представлять собой любую подходящую комплементарную цепь и, в частности, может быть выбрана из легкой цепи, в которой вариабельный домен содержит по меньшей мере одну CDR, имеющую последовательности, приведенные в виде SEQ ID NO: 54 для CDR-L1, SEQ ID NO: 55 для CDR-L2 и SEQ IDNO: 56 для CDR-L3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный домен легкой цепи, в котором CDR состоят по меньшей мере из одного из пептидов с последовательностями SEQ ID NO: 54 для CDR-L1, SEQ ID NO: 55 для CDR-L2 и SEQ ID NO: 56 для CDR-L3. Настоящее изобретение, кроме того, относится к изолированному антителу, включая Ab-В, или к его антигенсвязывающему фрагменту, который специфично связывается со склеростином и в котором вариабельный домен тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну CDR, имеющую последовательности, указанные в виде SEQ ID NO: 57 для CDR-H1, SEQ ID NO: 58 для CDR-Н 2 и SEQ ID NO: 59 дляCDR-H3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, в котором CDR состоят по меньшей мере из одного из пептидов с последовательностями SEQID NO: 57 для CDR-H1, SEQ ID NO: 58 для CDR-H2 и SEQ ID NO: 59 для CDR-H3. В том случае, когда в антителах согласно изобретению присутствует легкая цепь, легкая цепь может представлять собой подходящую комплементарную цепь и в частности может быть выбрана из легкой цепи, в которой вариабельный домен содержит по меньшей мере одну CDR, имеющую последовательности, указанные в виде SEQ ID NO: 60 для CDR-L1, SEQ ID NO: 61 для CDR-L2 и SEQ ID NO: 62 для CDR-L3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный домен легкой цепи, в котором CDR состоят по меньшей мере из одного из пептидов с последовательностямиSEQ ID NO: 60 для CDR-L1, SEQ ID NO: 61 для CDR-L2 и SEQ ID NO: 62 для CDR-L3. Настоящее изобретение также относится к изолированному антителу, включая Ab-С, или к его антигенсвязывающему фрагменту, который специфично связывается со склеростином и в котором вариабельный домен тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну CDR, имеющую последовательности, указанные в виде SEQ ID NO: 45 для CDR-H1, SEQ ID NO: 46 для CDR-H2 и SEQ ID NO: 47 для CDR-H3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, в котором CDR состоят по меньшей мере из одного из пептидов с последовательностями SEQ ID NO: 45 для CDR-H1, SEQ ID NO: 46 для CDR-H2 и SEQ ID NO: 47 для CDR-H3. В том случае, когда в антителах согласно изобретению присутствует легкая цепь, легкая цепь может представлять собой любую подходящую комплементарную цепь и, в частности, может быть выбрана из легкой цепи, в которой вариабельный домен содержит по меньшей мере одну CDR, имеющую последовательности, указанные в виде SEQ ID NO: 48 для CDR-L1, SEQ ID NO: 49 для CDR-L2 и SEQ ID NO: 50 для CDR-L3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный домен легкой цепи, в котором CDR состоят по меньшей мере из одного из пептидов с последовательностямиSEQ ID NO: 48 для CDR-L1, SEQ ID NO: 49 для CDR-L2 и SEQ ID NO: 50 для CDR-L3. Настоящее изобретение также относится к изолированному антителу, включая Ab-D, или к его антигенсвязывающему фрагменту, который специфично связывается со склеростином и в котором вариабельный домен тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну CDR, имеющую последовательности, указанные в виде SEQ ID NO: 39 для CDR-H1, SEQ ID NO: 40 для CDR-H2 и SEQ ID NO: 41 для CDR-H3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, в котором CDR состоят по меньшей мере из одного из пептидов с последовательностями SEQ ID NO: 39 для CDR-H1, SEQ ID NO: 40 для CDR-H2 и SEQ ID NO: 41 для CDR-H3. В том случае, когда в антителах согласно изобретению присутствует легкая цепь, легкая цепь может представлять собой любую подходящую комплементарную цепь и, в частности, может быть выбрана из легкой цепи, в которой вариабельный домен содержит по меньшей мере одну CDR, имеющую последовательности, указанные в виде SEQ ID NO: 42 для CDR-L1, SEQ ID NO: 43 для CDR-L2 и SEQ ID NO: 44 для CDR-L3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный домен легкой цепи, в котором CDR состоят по меньшей мере из одного из пептидов с последовательностямиSEQ ID NO: 42 для CDR-L1, SEQ ID NO: 43 для CDR-L2 и SEQ ID NO: 44 для CDR-L3. Дополнительные антитела против склеростина описаны ниже. Для некоторых аминокислотных последовательностей области, определяющие комплементарность (CDR) заключены в прямоугольники, а константные области показаны жирным курсивом.Ab-2. Последовательности LC и НС антитела 2 (также называемого Ab-2) показаны ниже Легкая цепь Ab-2. Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) LC Ab-2 Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) LC Ab-2 Последовательность нуклеиновой кислоты LC Ab-2, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Тяжелая цепь Ab-2. Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-2 Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-2 Аминокислотная последовательность НС Ab-2, включая сигнальный пептид Последовательность нуклеиновой кислоты НС Ab-2, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептидAb-3. Последовательности LC и НС антитела 3 (также называемого в данном описании Ab-3) показаны ниже. Легкая цепь Ab-3. Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) LC Ab-3 Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) LC Ab-3 Последовательность нуклеиновой кислоты LC Ab-3, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид Тяжелая цепь Ab-3. Аминокислотная последовательность зрелой формы (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-3 Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелую форму (с удаленным сигнальным пептидом) НС Ab-3 Аминокислотная последовательность НС Ab-3, включая сигнальный пептид
МПК / Метки
МПК: C07K 14/51, C07K 16/18
Метки: антитело, применение, склеростину
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-21539-antitelo-k-sklerostinu-i-ego-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Антитело к склеростину и его применение</a>
Антитела к склеростину, композиции, их содержащие, и их применение
Номер патента: 18756
Опубликовано: 30.10.2013
Авторы: Халлё Кристин, Сюй Шоуих, Дифенбах-Штрайбер Беате, Прасслер Йозеф, Кнайссель Михаэла
МПК: A61P 19/10, C07K 16/18, C12N 15/13...
Метки: антитела, склеростину, содержащие, композиции, применение
Формула / Реферат:
1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связывают полипептид склеростина, содержащие:(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, включающую аминокислотную последовательность, которая состоит из SEQ ID NO: 4;(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, включающую аминокислотную последовательность, которая состоит из SEQ ID NO: 15;(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, включающую аминокислотную последовательность,...
Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающиеся с полипептидом il-22ra, гуманизированное антитело, полученное из указанного антитела, гибридомы, продуцирующие антитело, и применение указанного антитела
Номер патента: 15706
Опубликовано: 31.10.2011
Авторы: Диллон Стейси Р., Сиадак Энтони У., Ленер Джойс М., Киндсвогель Уэйн Р., Сивакумар Паллавур В., Чандрасекер Ясмин А., Сюй Вэньфэн, Мур Маргарет Д.
МПК: A61K 39/395, C07K 16/28, C07K 14/715...
Метки: указанного, продуцирующие, антитела, моноклональное, антитело, применение, il-22ra, фрагмент, полипептидом, гибридомы, гуманизированное, полученное, связывающиеся
Формула / Реферат:
1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые экспрессируются гибридомой, выбранной из группы, состоящей из:a) гибридомного клона 280.46.3.4 АТСС РТА - 6284;b) гибридомного клона 281.73.49.1.1 АТСС РТА - 6285;c) гибридомного клона 283.4.1.2 АТСС РТА - 6287;d) гибридомного клона 283.52.5.4 АТСС РТА - 6311 иe) гибридомного клона 283.108.2.3 АТСС РТА - 6286,где указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент связываются с IL-22RA...
Антитело к cd38 человека и его применение
Номер патента: 15584
Опубликовано: 31.10.2011
Авторы: Винкел Ян Ван Де, Верс Мишель Де, Паррен Пауль Паррен, Опринс Юдит, Граус Иво, Вюгт Мартин Ван
МПК: A61K 39/395, A61P 37/00, A61P 35/00...
Метки: антитело, человека, применение
Формула / Реферат:
1. Антитело, связывающееся с CD38 человека, или его фрагмент, содержащее:(а) вариабельные участки легкой и тяжелой цепи антитела человека, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:6 соответственно; или(б) вариабельные участки легкой и тяжелой цепи антитела человека, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:16 соответственно; или(в) вариабельные участки легкой и тяжелой цепи антитела...
Штамм гибридных клеток мыши, продуцирующий моноклональное антитело 14f7 против ганглиозидов ngcgm3, моноклональное антитело 14f7, фармацевтическая композиция и реактив, содержащие указанное антитело
Номер патента: 3318
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Мулет Сьерра Айлетте, Масорра Херрера Сайма, Васкес Лопес Ана Мария, Карр Перес Адриана, Перес Родригес Роландо, Фернандес Молина Луис Энрике
МПК: A61K 39/395, A61K 51/10, A61K 47/48...
Метки: продуцирующий, содержащие, антитело, клеток, фармацевтическая, против, композиция, моноклональное, гибридных, 14f7, штамм, реактив, указанное, мыши, ngcgm3, ганглиозидов
Формула / Реферат:
1. Штамм гибридных клеток мыши 14F7 ECACC 98101901, продуцирующий моноклональное антитело 14F7 против ганглиозидов NGcGM3. 2. Моноклональное антитело 14F7, продуцируемое штаммом гибридных клеток по п.1, специфично распознающее олигосахаридную последовательность N-гликолилированная галактоза-глюкоза-сиаловая кислота в ганглиозиде NGcGM3 и обладающее цитолитической активностью по отношению к опухолевым клеткам, содержащим указанную...
Антитело к il-23 и его применение
Номер патента: 13506
Опубликовано: 30.06.2010
Авторы: Маркис Дэвид Мэттью, Дикинсон Крейг Дуэйн, Вассеро Ален Филипп, Бидлер Кэтрин Бротигэм, Брайт Стюарт Уиллис, Кикли Кристин Кей
МПК: A61K 39/395, C07K 16/24, A61P 25/00...
Метки: il-23, применение, антитело
Формула / Реферат:
1. Антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с р19 субъединицей IL-23 между аминокислотными остатками 129-159 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:60, нейтрализуют активность IL-23, имеют KD, составляющую от приблизительно 45 до приблизительно 160 пМ, и имеют IC50, составляющий от приблизительно 1 до приблизительно 20 пМ.2. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, которые являются...
Предыдущий патент: Ингибиторы вируса гепатита с
Следующий патент: Применение комбинации тестостерона и тадалафила для лечения половой дисфункции у женщин
Случайный патент: Система, способ и компьютерный программный код для оптимизации характеристик силовой системы