Фитазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения

ФИТАЗЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Изобретение относится к фитазам, кодирующим их полинуклеотидам, применениям полинуклеотидов и полипептидов по изобретению, а также к получению и выделению таких полинуклеотидов и полипептидов. В частности, изобретение относится к полипептидам,обладающим фитазной активностью в условиях высоких температур, и фитазам, которые сохраняют активность после воздействия высоких температур. Изобретение дополнительно относится к фитазам, которые обладают повышенной лабильностью в желудке. Фитазы по изобретению можно применять в пищевых продуктах для повышения питательной ценности богатых фитатом ингредиентов. Фитазы по изобретению могут быть приготовлены в виде пищевых продуктов или кормов или пищевых или кормовых добавок, например, чтобы фитазы способствовали расщеплению фитата. Родственные заявки По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно 35 U.S.С. 119 (е) на основании предварительной заявки на выдачу патента США с регистрационным номером ("USSN") 61/180283, поданной 21 мая 2009. Вышеупомянутая заявка непосредственно включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме и для всех целей. Ссылка на список последовательностей, представленный с помощью EFS-WEB Настоящая заявка подана в электронном виде на сервере USPTO EFS-WEB, что признано законным и указано в МРЕР 1730 II.В.2(а)(А), и такой электронный документ включает представленный в электронном виде список последовательностей (SEQ ID). Полное содержание такого списка последовательностей включено в настоящее описание в виде ссылки для всех целей. Список последовательностей обозначен в поданном в электронном виде текстовом файле следующим образом: Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к фитазам, кодирующим их полинуклеотидам, к применению полинуклеотидов и полипептидов по изобретению, а также к получению и выделению таких полинуклеотидов и полипептидов. В частности, изобретение относится к полипептидам, обладающим фитазной активностью в условиях высокой температуры, и к фитазам, которые сохраняют активность после воздействия высоких температур. Изобретение, кроме того, относится к фитазам, которые обладают повышенной лабильностью в желудке. Фитазы по изобретению можно использовать в продуктах питания для повышения пищевой ценности богатых фитатом ингредиентов. Фитазы по изобретению могут быть получены в виде продуктов питания или кормов или пищевых или кормовых добавок, например, для содействия в расщеплении фитата. Продукты питания или корма по изобретению могут быть в форме гранул,жидкостей, порошков и тому подобного. В одном из аспектов фитазы по изобретению стабильны по отношению к термической денатурации во время гранулирования; и такое свойство снижает стоимость фитазного продукта при сохранении эффективности in vivo и выявлении активности в кормах. Уровень техники Минеральные вещества являются необходимыми элементами для роста всех организмов. Поступающие с пищей минеральные вещества могут быть получены из множества источников, включая растения. Например, семена растений являются богатым источником минеральных веществ, так как они содержат ионы, которые находятся в комплексе с фосфатными группами молекул фитиновой кислоты. Такие связанные с фитатами минеральные вещества в некоторых случаях могут удовлетворять пищевые потребности у некоторых видов используемых в сельском хозяйстве организмов, таких как жвачные животные с многокамерным желудком. Соответственно, в некоторых случаях жвачным животным требуется меньше добавок в рацион неорганического фосфата и минералов, поскольку микроорганизмы в рубце продуцируют ферменты, которые катализируют превращение фитата (миоинозитгексафосфата) в инозит и неорганический фосфат. В ходе указного процесса минералы, которые были в комплексе с фитатом,высвобождаются. Однако большинство видов используемых в сельском хозяйстве организмов неспособны эффективно утилизировать связанные с фитатом минеральные вещества. Поэтому, например, при производстве животноводческой продукции с использованием животных с однокамерным желудком (например, свиней, птиц и рыб) в корм обычно добавляют минеральные вещества и/или антибиотики, которые изменяют среду флоры в пищеварительном тракте потребляющего организма, увеличивая скорость роста. В связи с вышесказанным существует множество обременяющих проблем - связанных с питанием,стадиями переработки ex vivo, здравоохранением и медициной, сохранением окружающей среды и использованием ресурсов - которые связаны с недостаточным гидролизом фитата при многих применениях. Ниже приведены неограничивающие примеры следующих проблем. 1) Добавление в рацион неорганических минералов является дорогостоящим. 2) Присутствие негидролизованного фитата нежелательно и создает проблемы при многих применениях ex vivo (например, вызывая нежелательный осадок). 3) Добавление в рацион антибиотиков создает угрозу для здоровья человека и животных, подобную увеличению распространенности устойчивых к антибиотикам патогенов. 4) Выделение с экскрементами не всасываемых минералов в окружающую среду нарушает и повреждает экосистемы окружающих почв, воды в рыбоводческом хозяйстве и в целом поверхностных вод. 5) Ценные питательные возможности многих потенциальных пищевых продуктов в значительной степени остаются неиспользованными и растраченными впустую. Следовательно, содержащие фитаты пищевые продукты требуют добавления экзогенных питательных веществ и/или источника фитазной активности для повышения недостаточных пищевых возможностей при потреблении очень большим количеством видов организмов. Следовательно, существует необходимость в средствах достижения эффективного и экономичного-1 021178 гидролиза фитата при различных применениях. В частности, существует необходимость в средствах оптимизации гидролиза фитата при коммерческих применениях. В конкретном аспекте существует необходимость в оптимизации коммерческих способов обработки, которые повышают питательные возможности содержащих фитаты пищевых продуктов, используемых для потребления человеком и сельскохозяйственными животными. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к полипептидам, обладающим фитазной активность, к кодирующим их полинуклеотидам, к применениям полинуклеотидов и полипептидов по изобретению и способам получения и выделения таких полинуклеотидов и полипептидов. В одном из аспектов изобретение относится к полипептидам, обладающим фитазной активностью в условиях высокой температуры, и к фитазам, которые сохраняют активность после воздействия высоких температур. Фитазы по изобретению можно использовать в продуктах питания для повышения пищевой ценности богатых фитатом ингредиентов. Фитазы по изобретению могут быть получены в виде продуктов питания или кормов или пищевых или кормовых добавок, например, для содействия в расщеплении фитата. Продукты питания или корма по изобретению могут быть в форме гранул, таблеток, пилюль, жидкостей, порошков, спреев и тому подобного. В одном из аспектов фитазы по изобретению стабильны по отношению к термической денатурации во время гранулирования; и такое свойство снижает стоимость фитазного продукта при сохранении эффективности in vivo и выявлении активности в кормах. Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим(a) (i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, обладающий фитазной активностью, и которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% или более идентична последовательности SEQ ID NO:1, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию, указанную в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание;(ii) полинуклеотид, кодирующий полипептид, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% или более идентичен последовательности SEQ ID NO:2, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию, указанную в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание; или(a) (i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, обладающий фитазной активностью, и которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99%, или более идентична последовательности SEQ ID NO:1, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию, указанную в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание;(ii) полинуклеотид, кодирующий полипептид, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% или более идентичен последовательности SEQ ID NO:2, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию, указанную в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание; или(iii) последовательность нуклеиновой кислоты по (i) или (ii), при этом идентификационную информацию о последовательности получают в результате анализа с использованием алгоритма сравнения последовательностей или визуального просмотра, и, необязательно, алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм BLAST, версию 2.2.2, при этом используют следующие настройки фильтра blastall-р blastp-d"nr pataa" -F F, и все другие параметры устанавливают по умолчанию;(b) нуклеиновую кислоту по п.(а), где по меньшей мере одной мутацией является мутация: A109V,А 232 Р, А 236 Н, А 236 Т, A248L, А 248 Т, A274F, A274I, A274L, А 274 Т, A274V, А 429 Р, С 155Y, D139Y,Е 113 Р, F147Y, F194L, G171M, G171S, G257A, G257R, G353C, G395E, G395I, G395L, G395Q, G395T,G67A, Н 263 Р, H272W, I107H, I107P, I108A, I108Q, I108R, I108S, I108Y, I174F, I174P, I427G, I427S, I427T,К 151 Н, К 151 Р, L126R, L146R, L146T, L150T, L150Y, L157C, L157P, L167S, L192F, L216T, L235I, L244S,L269I, L269T, L296T, L379S, L379V, L50W, М 51 А, M51G, M51L, N148K, N148M, N148R, N161K, N266P,N339E, N348K, N348W, Р 100 А, P145L, P149L, P149N, P217D, P217G, P217L, P217S, P254S, P269L,Р 343 Е, P343I, P343L, P343N, P343R, P343V, Q137F, Q137L, Q137V, Q137Y, Q246W, Q247H, Q275H,Q309P, Q377R, Q381S, Q86H, S102A, S102Y, S173G, S173H, S173V, S197G, S208P, S211H, S218I, S218Y,S389H, S389V, Т 163 Р, Т 282 Н, T291V, T291W, T341D, T48F, Т 48 Н, T48I, Т 48 К, T48L, Т 48 М, T48V,T48W, T48Y, V162L, V162T, V191A, V422M, W265L, Y79H, Y79N, Y79S или Y79W;(c) нуклеиновую кислоту по п.(b), где полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну из мутаций: C226D, D164R, G179R, N159V, Q275V, T163R или T349Y; или (d) последовательности, полностью комплементарные указанным. Все указанные нуклеиновые кислоты являются "нуклеиновыми кислотами по изобретению", кодирующими "полипептиды по изобретению". В одном из аспектов алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритмBLAST, версию 2.2.2, где используют установки фильтра blastall-p blastp-d "nr pataa"-FF, и все другие параметры устанавливают по умолчанию. В одном из аспектов в последовательностях нуклеиновых кислот по изобретению отсутствует гомологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальную последовательность,последовательность пробелка или последовательность промотора. В другом аспекте нуклеиновые кислоты по изобретению дополнительно содержат гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты,при этом, необязательно, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состо-2 021178 ит из последовательности, кодирующей гетерологичную сигнальную последовательность, метку, эпитоп или последовательность промотора. В другом аспекте гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует гетерологичную сигнальную последовательность, содержащую или состоящую из Nконцевого и/или С-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ЭС) или эндомембрану или в эндоплазматическую сеть (ЭС) или систему эндомембран растений, или гетерологичная последовательность кодирует сайт рестрикции. В еще одном аспекте гетерологичная промоторная последовательность содержит или состоит из конститутивного или индуцируемого промотора или специфичного для типа клеток промотора или специфичного для растения промотора или специфичного для кукурузы промотора. В одном из аспектов фитазная активность включает катализ преобразования фитата (миоинозитгексафосфата) в инозит и неорганический фосфат; или гидролиза фитата (миоинозитгексафосфата). В другом аспекте фитазная активность включает катализ гидролиза фитата в корме, пищевом продукте или напитке или в корме, пищевом продукте или напитке, содержащем корм для животных на основе зерновых культур, сусле или пиве, тесте, фруктах или овощах; или катализ гидролиза фитата в клетке микроорганизма, клетке гриба, клетке млекопитающего или клетке растения. В одном из аспектов фитазы по изобретению являются термоустойчивыми и, необязательно, полипептид сохраняет фитазную активность после воздействия температуры в диапазоне примерно от -100 С до примерно -80 С, примерно от -80 С до примерно -40 С, примерно от -40 С до примерно -20 С, примерно -20 С до примерно 0 С, примерно от 0 С до примерно 37 С, примерно от 0 С до примерно 5 С,примерно от 5 С до примерно 15 С, примерно от 15 С до примерно 25 С, примерно от 25 С до примерно 37 С, примерно от 37 С до примерно 45 С, примерно от 45 С до примерно 55 С, примерно от 55 С до примерно 70 С, примерно от 70 С до примерно 75 С, примерно от 75 С до примерно 85 С, примерно от 85 С до примерно 90 С, примерно от 90 С до примерно 95 С, примерно от 95 С до примерно 100 С,примерно от 100 С до примерно 105 С, примерно от 105 С до примерно 110 С, примерно от 110 С до примерно 120 С, или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113,114, 115 С или выше. В одном из аспектов фитазы по изобретению являются термостабильными, и, необязательно, фитаза сохраняет активность при температуре в диапазоне примерно от -100 С до примерно-80 С, примерно от -80 С до примерно -40 С, примерно от -40 С до примерно -20 С, примерно от -20 С до примерно 0 С, примерно от 0 С до примерно 3 7 С, примерно от 0 С до примерно 5 С, примерно от 5 С до примерно 15 С, примерно от 15 С до примерно 25 С, примерно от 25 С до примерно 37 С, примерно от 37 С до примерно 45 С, примерно от 45 С до примерно 55 С, примерно от 55 С до примерно 70 С, примерно от 70 С до примерно 75 С, примерно от 75 С до примерно 85 С, примерно от 85 С до примерно 90 С, примерно от 90 С до примерно 95 С, примерно от 95 С до примерно 100 С, примерно от 100 С до примерно 105 С, примерно от 105 С до примерно 110 С, примерно от 110 С до примерно 120 С, или при 95, 96, 97, 98 С, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,115 С или выше. В другом варианте фитазы по изобретению являются термоустойчивыми или термоактивными при кислом рН - примерно рН 6,5, рН 6, рН 5,5, рН 5, рН 4,5, рН 4,0, рН 3,5, рН 3,0 или меньше, или полипептид фитазы является термоустойчивым или термоактивным примерно при рН 7, рН 7,5, рН 8,0, рН 8,5,рН 9, рН 9,5, рН 10, рН 10,5, рН 11,0, рН 11,5, рН 12,0, рН 12,5 или выше. Изобретение относится к кассетам экспрессии, векторам, носителям для клонирования, векторам экспрессии и клонирующим векторам, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению или имеющим входящую в их состав нуклеиновую кислоту по изобретению (которые включают нуклеиновые кислоты,кодирующие полипептиды по изобретению), при этом, необязательно, кассета экспрессии, носитель для клонирования или вектор содержит или является вирусным вектором, плазмидой, фагом, фагмидой, космидой, фосмидой, бактериофагом или искусственной хромосомой, вирусный вектор содержит или является аденовирусным вектором, ретровирусным вектором или вектором на основе аденоассоциированного вируса, или кассета экспрессии, носитель для клонирования или вектор содержит или является бактериальной искусственной хромосомой (ВАС), полученным из бактериофага Р 1 вектором (РАС), дрожжевой искусственной хромосомой (YAC) или искусственной хромосомой млекопитающих (MAC). Изобретение относится к трансформированным клеткам, трансдуцированным клеткам, клеткамхозяевам и тому подобному, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению или имеющим находящуюся в них нуклеиновую кислоту по изобретению (включая нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению) или кассету экспрессии, вектор, носитель для клонирования, вектор экспрессии или клонирующий вектор по изобретению, при этом, необязательно, клетка является бактериальной клеткой, клеткой млекопитающего, клеткой гриба, дрожжевой клеткой, клеткой насекомого или растительной клеткой. Изобретение относится к трансгенным животным, отличным от человека, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению или имеющим находящуюся в них нуклеиновую кислоту по изобретению(включая нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению) или кассету экспрессии,вектор, носитель для клонирования, вектор экспрессии или клонирующий вектор по изобретению, при этом, необязательно, животным является мышь, крыса, коза, кролик, овца, свинья или корова.-3 021178 Изобретение относится к трансгенным растениям (включая части растений, например, обработанные или собранные, например, листья, стебли, корни или плоды) или семенам, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению или имеющим находящуюся в них нуклеиновую кислоту по изобретению(включая нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению) или кассету экспрессии,вектор, носитель для клонирования, вектор экспрессии или клонирующий вектор по изобретению, при этом, необязательно, растение является растением кукурузы, растением картофеля, растением томата,растением пшеницы, растением масличной культуры, растением рапса, растением сои или растением табака, и, необязательно, семя является семенем кукурузы, зерном пшеницы, семенем масличной культуры, семенем рапса, семенем сои, ядром кокосового ореха, семенем подсолнечника, семенем кунжута,арахиса или семенем растения табака. В альтернативных вариантах растение или семя, полученное из семени или растения по изобретению, или растение или семя по изобретению могут включать зерновые культурные растения, например кукурузу, люцерну, подсолнечник, Brassica, сою, сахарный тростник,хлопчатник, сафлор, арахис, сорго, пшеницу, овес, рожь, просо, ячмень, рис, хвойные растения, бобовые культуры, например горох, бобы и сою, содержащие крахмал клубни/корни, например картофель, батат,маниок, колоказию, канну и сахарную свеклу и тому подобное, или растением может быть растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение масличной культуры, растение рапса, растение сои или растение табака или фуражное и/или кормовое растение для животного или для жвачного животного, или растение может быть или включает фуражное или кормовое растение, например сенокосное растение, кукурузу, просо, сою, пшеницу, гречиху, ячмень, люцерну, рожь, однолетние травы, сорго, суданскую траву, травы саванны или ценхрус реснитчатый; или семя представляет собой семя кукурузы, зерно пшеницы, семя масличной культуры, семя рапса, семя сои, ядро кокосового ореха, семя подсолнечника, семя кунжута, арахис или семя арахиса, семя люцерны, семя хлопчатника,семя сафлора, семя сорго, зерно овса, семя ржи, семя проса, семя ячменя, зерно риса, семя гороха или семя растения табака, или растением является кукуруза, люцерна, подсолнечник, Brassica, соя, сахарный тростник, хлопчатник, сафлор, арахис, сорго, пшеница, овес, рожь, просо, ячмень, рис, хвойные растения, горох, бобы, соя, картофель, батат, маниок, колоказию, канну или сахарную свеклу. Изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, содержащим нуклеиновую кислоту,которая является антисмысловой по отношению к нуклеиновой кислоте по изобретению и кодирующей по меньшей мере одну мутацию, указанную в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание, при этом, необязательно, антисмысловой олигонуклеотид имеет длину примерно от 10 до 50, примерно от 20 до 60, примерно от 30 до 70, примерно от 40 до 80, примерно от 60 до 100 или примерно от 50 до 150 оснований. Изобретение также относится к рибозимам и/или интерферирующей РНК (например, ми-РНК или микроРНК), содержащей антисмысловые последовательности по изобретению. Изобретение относится к способам ингибирования трансляции мРНК фитазы в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида по изобретению. Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим(a) (i) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновыми кислотами по изобретению;(ii) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности SEQ ID NO:2, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию, указанную в таблице 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание; или(iii) полипептид по п.(i) или (ii), при этом идентификационную информацию о последовательности получают в результате анализа с использованием алгоритма сравнения последовательностей или с помощью визуального просмотра;(b) полипептид по п.(а), при этом по меньшей мере одной мутацией является мутация: A109V,А 232 Р, А 236 Н, А 236 Т, A248L, А 248 Т, A274F, A274I, A274L, А 274 Т, A274V, А 429 Р, C155Y, D139Y,Е 113 Р, F147Y, F194L, G171M, G171S, G257A, G257R, G353C, G395E, G395I, G395L, G395Q, G395T,G67A, Н 263 Р, H272W, I107H, I107P, I108A, I108Q, I108R, I108S, I108Y, I174F, I174P, I427G, I427S, I427T,К 151 Н, К 151 Р, L126R, L146R, L146T, L150T, L150Y, L157C, L157P, L167S, L192F, L216T, L235I, L244S,L269I, L269T, L296T, L379S, L379V, L50W, М 51 А, M51G, M51L, N148K, N148M, N148R, N161K, N266P,N339E, N348K, N348W, Р 100 А, P145L, P149L, P149N, P217D, P217G, P217L, P217S, P254S, P269L,Р 343 Е, P343I, P343L, P343N, P343R, P343V, Q137F, Q137L, Q137V, Q137Y, Q246W, Q247H, Q275H,Q309P, Q377R, Q381S, Q86H, S102A, S102Y, S173G, S173H, S173V, S197G, S208P, S211H, S218I, S218Y,S389H, S389V, Т 163 Р, Т 282 Н, T291V, T291W, T341D, T48F, Т 48 Н, T48I, T48K, T48L, Т 48 М, T48V,T48W, T48Y, V162L, V162T, V191A, V422M, W265L, Y79H, Y79N, Y79S или Y79W; или(c) полипептид по п.(b), при этом полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну из мутаций: C226D, D164R, G179R, N159V, Q275V, T163R или T349Y. В одном из аспектов фитазная активность включает катализ превращения фитата (миоинозитгексафосфата) в инозит и неорганический фосфат; или гидролиза фитата (миоинозитгексафосфата). В другом аспекте фитазная активность включает катализ гидролиза фитата в корме, пищевом продукте или напитке или в корме, пищевом продукте или напитке, содержащем корм для животных на основе зерновых-4 021178 культур, сусло или пиво, тесто, фрукты или овощи; или катализ гидролиза фитата в клетке микроорганизма, клетки гриба, клетке млекопитающего или клетке растения. Изобретение относится к полипептидам по изобретению, которые обладают фитазной активностью,активность которых является термоустойчивой и, необязательно, полипептид сохраняет фитазную активность после воздействия температуры в диапазоне примерно от -100 С до примерно -80 С, примерно-80 С до примерно -40 С, примерно от -40 С до примерно -20 С, примерно от -20 С до примерно 0 С,примерно от 0 С до примерно 5 С, примерно от 5 С до примерно 15 С, примерно от 15 С до примерно 25 С, примерно от 25 С до примерно 37 С, примерно от 37 С до примерно 45 С, примерно от 45 С до примерно 55 С, примерно от 55 С до примерно 70 С, примерно от 70 С до примерно 75 С, примерно от 75 С до примерно 85 С, примерно от 85 С до примерно 90 С, примерно от 90 С до примерно 95 С, примерно от 95 С до примерно 100 С, примерно от 100 С до примерно 105 С, примерно от 105 С до примерно 110 С, примерно от 110 С до примерно 120 С, или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105,106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 С или выше. Термоустойчивые полипептиды по изобретению могут сохранять активность, например, фитазную активность, после воздействия температуры в диапазоне примерно от -100 С до примерно -80 С, примерно от -80 С до примерно -40 С, примерно от 40 С до примерно -20 С, примерно от -20 С до примерно 0 С, примерно от 0 С до примерно 5 С, примерно от 5 С до примерно 15 С, примерно от 15 С до примерно 25 С, примерно от 25 С до примерно 37 С, примерно от 37 С до примерно 45 С, примерно от 45 С до примерно 55 С, примерно от 55 С до примерно 70 С, примерно от 70 С до примерно 75 С, примерно от 75 С до примерно 85 С, примерно от 85 С до примерно 90 С, примерно от 90 С до примерно 95 С, примерно от 95 С до примерно 100 С,примерно от 100 С до примерно 105 С, примерно от 105 С до примерно 110 С, примерно от 110 С до примерно 120 С, или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113,114, 115 С или выше. В некоторых вариантах термоустойчивые полипептиды по изобретению сохраняют активность, например, фитазную активность, после воздействия температуры в описанных выше диапазонах, примерно при рН 3,0, примерно рН 3,5, примерно рН 4,0, примерно рН 4,5, примерно рН 5,0, примерно рН 5,5, примерно рН 6,0, примерно рН 6,5, примерно рН 7,0, примерно рН 7,5, примерно рН 8,0,примерно рН 8,5, примерно рН 9,0, примерно рН 9,5, примерно рН 10,0, примерно рН 10,5, примерно рН 11,0, примерно рН 11,5, примерно рН 12,0 или выше. Изобретение относится к полипептидам по изобретению, которые обладают фитазной активностью,активность которых является термостабильной. Например, полипептид по изобретению может быть термостабильным. Термостабильный полипептид по изобретению может сохранять связывающую и/или ферментативную активность, например, фитазную активность, в условиях, включающих диапазон температур примерно от -100 С до примерно -80 С, примерно от -80 С до примерно -40 С, примерно от-40 С до примерно -20 С, примерно от -20 С до примерно 0 С, примерно от 0 С до примерно 37 С, примерно от 0 С до примерно 5 С, примерно от 5 С до примерно 15 С, примерно от 15 С до примерно 25 С,примерно от 25 С до примерно 37 С, примерно от 37 С до примерно 45 С, примерно от 45 С до примерно 55 С, примерно от 55 С до примерно 70 С, примерно от 70 С до примерно 75 С, примерно от 75 С до примерно 85 С, примерно от 85 С до примерно 90 С, примерно от 90 С до примерно 95 С, примерно от 95 С до примерно 100 С, примерно от 100 С до примерно 105 С, примерно от 105 С до примерно 110 С,примерно от 110 С до примерно 120 С, или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 С или выше. Термостабильные полипептиды по изобретению могут сохранять активность, например фитазную активность, в диапазоне температур примерно от -100 С до примерно -80 С, примерно от -80 С до примерно -40 С, примерно от -40 С до примерно -20 С, примерно от -20 С до примерно 0 С, примерно от 0 С до примерно 5 С, примерно от 5 С до примерно 15 С, примерно от 15 С до примерно 25 С, примерно от 25 С до примерно 37 С, примерно от 37 С до примерно 45 С, примерно от 45 С до примерно 55 С, примерно от 55 С до примерно 70 С, примерно от 70 С до примерно 75 С, примерно от 75 С до примерно 85 С, примерно от 85 С до примерно 90 С, примерно от 90 С до примерно 95 С, примерно от 95 С до примерно 100 С, примерно от 100 С до примерно 105 С,примерно от 105 С до примерно 110 С, примерно от 110 С до примерно 120 С, или 95, 96, 97, 98, 99,100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 С или выше. В некоторых вариантах термостабильные полипептиды по изобретению сохраняют активность, например фитазную активность, при температурах в описанных выше диапазонах примерно при рН 3,0, примерно рН 3,5, примерно рН 4,0, примерно рН 4,5, примерно рН 5,0, примерно рН 5,5, примерно рН 6,0, примерно рН 6,5,примерно рН 7,0, примерно рН 7,5, примерно рН 8,0, примерно рН 8,5, примерно рН 9,0, примерно рН 9,5, примерно рН 10,0, примерно рН 10,5, примерно рН 11,0, примерно рН 11,5, примерно рН 12,0 или выше. Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность по изобретению и (а) не имеющим гомологичной сигнальной последовательности (лидерного пептида) или последовательности пробелка; (b) не имеющим сигнальной последовательности (лидерного пептида) и дополнительно содержащим гетерологичную сигнальную последовательность (лидерный пептид); (с) аминокислотную последовательность по п.(а) или(b) и дополнительно содержащим гетерологичную последовательность, при этом, необязательно, гетеро-5 021178 логичная последовательность содержит или состоит из гетерологичной сигнальной последовательности или метки или эпитопа, или гетерологичная последовательность содержит пептид для идентификации. В одном из аспектов гетерологичная сигнальная последовательность содержит или состоит из N-концевого и/или С-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ЭС) или эндомембрану, или в эндоплазматическую сеть (ЭС) или эндомембранную систему растения, или гетерологичная аминокислотная последовательность содержит или состоит из сайта-мишени фермента. В другом аспекте полипептид по изобретению дополнительно содержит дополнительные аминокислотные остатки между сигнальной последовательностью (лидерной последовательностью или лидерным пептидом) и ферментом. В одном из аспектов фитазная активность любого полипептида по изобретению включает (имеет) удельную активность: примерно при 37 С в диапазоне примерно от 100 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка; или, примерно от 500 до примерно 750 единиц на миллиграмм белка; или при 37 С в диапазоне примерно от 500 до примерно 1200 единиц на миллиграмм белка; или при 37 С в диапазоне примерно от 750 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка. В одном из аспектов термоустойчивая фитазная активность включает удельную активность после воздействия температуры примерно 37 С в диапазоне примерно от 100 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность примерно от 500 до примерно 750 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность при 37 С в диапазоне примерно от 500 до примерно 1200 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность при 37 С в диапазоне примерно от 750 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка. В одном из аспектов термостабильная фитазная активность включает удельную активность в условиях, включающих температуру примерно 37 С, в диапазоне примерно от 100 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность примерно от 500 до примерно 750 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность при 37 С в диапазоне примерно от 500 до примерно 1200 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность при 37 С в диапазоне примерно от 750 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка. В одном из аспектов полипептид по изобретению гликозилирован или содержит по меньшей мере один участок гликозилирования, при этом, необязательно, гликозилирование является N-связанным гликозилированием или О-связанным гликозилированием, и, необязательно, полипептид гликозилируется после экспрессии в дрожжах, которые, необязательно, являются дрожжами P. pastoris или S. pombe. В одном из аспектов полипептид сохраняет фитазную активность в условиях, включающих значение рН примерно рН 6,5, рН 6, рН 5,5, рН 5, рН 4,5, рН 4,0, рН 3,5, рН 3,0 или меньшее (более кислое значение) рН. Альтернативно полипептид по изобретению может сохранять фитазную активность в условиях, включающих значение рН примерно рН 7,5, рН 8, рН 8,5, рН 9, рН 9,5, рН 10,0, рН 10,5, рН 11,0,рН 11,5, рН 12, рН 12,5 или более высокое (более щелочное) значение рН. Изобретение относится к препаратам белка, содержащим полипептид по изобретению, при этом препарат белка содержит жидкость, взвесь, порошок, спрей, суспензию, лиофилизированную композицию/препарат, твердое вещество, гелеобразные таблетки, пилюли, имплантат, гель; или фармацевтический препарат, пищевой продукт, корм, пищевую добавку, кормовую добавку, добавку к пище, добавку к корму, питательную добавку или добавку в рацион. Изобретение относится к гетеродимерам, содержащим полипептид по изобретению, и в одном из аспектов гетеродимер содержит второй домен, при этом, необязательно, второй домен представляет собой полипептид и гетеродимер, является слитым белком, и, необязательно, второй домен является эпитопом или меткой. Изобретение относится к иммобилизованным полипептидам, содержащим полипептид по изобретению, при этом иммобилизованный полипептид может содержать гомодимер или гетеродимер по изобретению, при этом, необязательно, полипептид иммобилизован внутри или на клетке, везикуле, липосоме,пленке, мембране, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице,шарике, геле, планшете, матрице, капиллярной трубке, кристалле, таблетке, пилюли, капсулы, порошке,агломерате, поверхности или пористой структуре. В одном из аспектов изобретение относится к матрицам (например, микроматрицам), содержащим иммобилизованный полипептид, при этом полипептид содержит полипептид по изобретению или гетеродимер по изобретению, или нуклеиновую кислоту по изобретению или их сочетание. Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с полипептидом по изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по изобретению, при этом, необязательно, антитело является моноклональным или поликлональным антителом. Изобретение относится к гибридомам, содержащим антитело по изобретению. Изобретение относится к способам получения рекомбинантного полипептида, включающим: (а) получение нуклеиновой кислоты, при этом нуклеиновая кислота содержит последовательность по изобретению; и (b) экспрессию нуклеиновой кислоты по п.(а) в условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии полипептида, с получением при этом рекомбинантного полипептида, и, необязательно, способ дополнительно включает трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой по п.(а) с после-6 021178 дующей экспрессией нуклеиновой кислоты по п.(а) с получением при этом рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке-хозяине. В альтернативном варианте нуклеиновую кислоту функционально связывают с промотором перед трансформацией клетки-хозяина. Изобретение относится к способам идентификации полипептида, обладающего фитазной активностью, включающим: (а) получение полипептида по изобретению; (b) получение субстрата фитазы; и (с) осуществление контакта полипептида или его фрагмента или варианта по п. (а) с субстратом по п. (b) и выявление уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, при этом уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции является показателем присутствия полипептида, обладающего фитазной активностью. Изобретение относится к способам идентификации субстрата фитазы, включающим: (а) получение полипептида по изобретению; (b) получение тестируемого субстрата; и (с) осуществление контакта полипептида по п.(а) с тестируемым субстратом по п.(b) и выявление уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, при этом уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции позволяет идентифицировать тестируемый субстрат как субстрат фитазы. Изобретение относится к способам определения того, связывается ли соединение специфично с полипептидом, включающим: (а) экспрессию нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, обеспечивающих возможность трансляции нуклеиновой кислоты в полипептид,при этом нуклеиновая кислота содержит последовательность по изобретению; (b) осуществление контакта полипептида с тестируемым соединением; и (с) определение того, связывается ли тестируемое соединение специфично с полипептидом, тем самым определяют, связывается ли соединение специфично с полипептидом. Изобретение относится к способам идентификации модулятора фитазной активности, включающим: (а) получение полипептида фитазы по изобретению; (b) получение тестируемого соединения; (с) осуществление контакта полипептида по п.(а) с тестируемым соединением по п.(b) и измерение активности фитазы, при этом изменение фитазной активности, измеренной в присутствии тестируемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствие тестируемого соединения обеспечивает определение того, что тестируемое соединение модулирует фитазную активность, при этом, необязательно, фитазную активность измеряют, получая субстрат фитазы и определяя увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции, и, необязательно, уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции в отсутствие тестируемого соединения свидетельствует о том, что тестируемое соединение является активатором фитазной активности, и, необязательно, увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции в отсутствие тестируемого соединения свидетельствует о том, что тестируемое соединение является ингибитором фитазной активности. Изобретение относится к способам гидролиза инозитгексафосфата до инозита и неорганического фосфата, включающим: (а) получение полипептида, обладающего фитазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность по изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению; (b) получение композиции, содержащей инозитгексафосфат, и(с) осуществление контакта полипептида по п.(а) с композицией по п.(b) в условиях, в которых полипептид гидролизует инозитгексафосфат с образованием инозита и неорганического фосфата, при этом, необязательно, условия включают температуру примерно от 37 С до примерно 70 С, примерно от 50 С до примерно 80 С, или примерно от 60 С до примерно 90 С, и, необязательно, композиция содержит фитиновую кислоту. Изобретение относится к способам дегуммирования масла, включающим: (а) получение полипептида, обладающего фитазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность по изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению; (b) получение композиции, содержащей растительное масло; и (с) осуществление контакта полипептида по п.(а) и растительного масла по п.(b) в условиях, в которых полипептид может расщеплять связь между инозитом и неорганическим фосфатом, таким образом осуществляя дегуммирование растительного масла. Изобретение относится к способам получения корма, или продукта питания, или кормовой, или пищевой добавки, или добавки к пищевому продукту или корму, или добавки питательного вещества,или добавки в рацион, включающим: (а) трансформацию растения, части растения или растительной клетки полинуклеотидом, кодирующим полипептид фермента фитазы, при этом фитаза содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по изобретению, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по изобретению; (b) культивирование растения, части растения или растительной клетки в условиях, в которых экспрессируется фермент фитаза, и (с) превращение растения, частей растения или растительной клетки в композицию, подходящую для продукта питания, корма, пищевой добавки, кормовой добавки, добавки к пище, добавки в корм, добавки питательного вещества или добавки в рацион, или добавление культивируемого растения, части растения или растительной клетки в-7 021178 пищевой продукт, корм, пищевую добавку, кормовую добавку, добавку к пище, добавку к корму, добавку питательного вещества или добавку в рацион с получением таким образом продукта питания, корма,пищевой добавки, кормовой добавки, добавки к пище, добавки в корм, добавки питательного вещества или добавки в рацион, при этом, необязательно, полинуклеотид находится в векторе экспрессии, и, необязательно, вектор содержит последовательность регуляции экспрессии, способную экспрессировать нуклеиновую кислоту в растительной клетке, и, необязательно, пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, добавка к пище, добавка в корм, добавка питательного вещества или добавка в рацион предназначены для животного, и, необязательно, при этом животное является животным с однокамерным желудком, и, необязательно, животным является жвачное животное, и, необязательно, пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, добавка к пище, добавка в корм, добавка питательного вещества или добавка в рацион имеет форму матрикса для доставки, гранулы, таблетки, геля, жидкостей, спрея, молотого зерна или порошка. В одном из аспектов фермент фитаза гликозилирован, чтобы обеспечить термоустойчивость или термостабильность в условиях гранулирования, и, необязательно,матрикс для доставки образуют гранулированием смеси, содержащей зародыш зерна и фермент фитазу,получая частицу, и, необязательно, гранулы получают в условиях, включающих применение пара, необязательно, гранулы получают в условиях, включающих применение температуры свыше 80 С в течение примерно 5 мин, и, необязательно, гранула содержит фермент фитазу, который имеет удельную активность по меньшей мере от 350 до примерно 900 единиц на миллиграмм фермента. Изобретение относится к способам доставки добавки фермента фитазы в организм животного или человека, при этом указанный способ включает: (а) получение съедобного матрикса для доставки, содержащей съедобный носитель и фермент фитазу, содержащий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по изобретению, при этом матрикс легко распределяется и высвобождает фермент фитазу при помещении в водную среду, и (b) введение съедобного матрикса для доставки фермента животному или человеку, при этом, необязательно, съедобный матрикс для доставки содержит гранулированный съедобный носитель, и, необязательно, съедобный матрикс для доставки имеет форму гранул,таблеток, гелей, жидкостей, спреев или порошков, и, необязательно, съедобный носитель включает носитель, выбранный из группы, состоящей из зародыша зерна, сена, люцерны, тимофеевки, соевой шелухи,муки из семян подсолнечника, кукурузной муки, соевой муки и пшеничной муки, и, необязательно, съедобный носитель содержит зародыш зерна, который обеднен в отношении масла. Изобретение относится к пищевому продукту, корму, пищевой добавке, кормовой добавке, добавке к пище, добавке в корм, добавке питательного вещества или добавке в рацион для животного или человека, содержащему полипептид по изобретению или гомодимер или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован, и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной. В одном из аспектов пищевой продукт, корм, пищевую добавку,кормовую добавку, добавку к пище, добавку в корм, добавку питательного вещества или добавку в рацион производят в виде гранулы, пилюли, таблетки, капсулы, геля, гелеобразной таблетки, спрея, порошка,лиофилизированного препарата, фармацевтического препарата, жидкой формы, в виде суспензии или взвеси, или получают, используя покрытые полимером добавки, или производят в гранулированной форме, или получают с использованием распылительной сушки. Изобретение относится к съедобному или рассасываемому матриксу (матриксам) для доставки фермента, содержащему полипептид по изобретению или гомодимер или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован, и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной. В одном из аспектов съедобный матрикс для доставки содержит гранулу, или съедобный или рассасываемый матрикс для доставки фермента производят в виде гранулы,пилюли, таблетки, капсулы, геля, гелеобразной таблетки, спрея, порошка, лиофилизированного препарата, фармацевтического препарата, жидкой формы, в виде суспензии или взвеси или получают, используя покрытые полимером добавки, или производят в гранулированной форме или получают с использованием распылительной сушки. Изобретение относится к съедобным или рассасываемым гранулам, содержащим гранулированный съедобный или рассасываемый носитель и полипептид по изобретению или гомодимер или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован, и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной, и, необязательно, гранулу производят в форме гранулы или в виде пилюли, таблетки, капсулы, геля, гелеобразной таблетки, спрея, порошка, лиофилизированного препарата, фармацевтического препарата, в жидкой форме, в виде суспензии или взвеси,или получают с использованием покрытых полимером добавок или производят в гранулированной форме или получают с использованием распылительной сушки. Изобретение относится к продуктам питания, например соевому продукту, содержащему полипептид по изобретению или гомодимер или гетеродимер по изобретению, и, необязательно, продукт питания, например, соевый продукт питания, производят в виде гранулы, пилюли, таблетки, капсулы, геля,гелеобразной таблетки, спрея, порошка, лиофилизированного препарата или в жидкой форме. Изобретение относится к способам повышения устойчивости полипептида фитазы к ферментативной инактивации в пищеварительной системе животного, при этом способ включает гликозилирование-8 021178 полипептида фитазы, содержащего полипептид по изобретению, и таким образом повышение устойчивости полипептида фитазы к ферментативной инактивации в пищеварительной системе животного, и, необязательно, гликозилирование является N-связанным гликозилированием, и, необязательно, полипептид фитазы гликозилирован в результате экспрессии in vivo в клетке полинуклеотида, кодирующего фитазу,и, необязательно, клетка является эукариотической клеткой, и, необязательно, эукариотическая клетка является клеткой гриба, клеткой растения или клеткой млекопитающего. Изобретение относится к способам обработки зерна кукурузы и сорго, включающим: (а) получение полипептида, обладающего фитазной активностью, при этом полипептид содержит полипептид по изобретению; (b) получение композиции, содержащей жидкий кукурузный экстракт или жидкий экстракт сорго; и (с) осуществление контакта полипептида по п. (а) и композиции по п. (b) в условиях, в которых полипептид может расщеплять связь инозита с неорганическим фосфатом. Изобретение относится к фармацевтическим препаратам или диетическим препаратам, содержащим полипептид или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован, и,необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной; и, необязательно,фармацевтический или диетический препарат приготовлен в виде гранулы, пилюли, таблетки, капсулы,гелеобразной таблетки, спрея, порошка, лосьона или жидкой формы, или получен с использованием покрытых полимером добавок или в виде имплантата или произведен в гранулированной форме или получен с использованием распылительной сушки. Изобретение относится к композициям, содержащим полипептид или гетеродимер по изобретению; и (b) любой продукт, который указан в табл. 2, или любую из композиций, указанных в табл. 1; при этом,необязательно, полипептид гликозилирован и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной. Изобретение относится к индивидуальному пайку в виде набора готовых к употреблению продуктов для одноразового приема пищи (MRE), напитку или гидратирующему средству, содержащему полипептид или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной. Изобретение относится к способам облегчения (замедления прогрессирования, лечения или профилактики) остеопороза, включающим введение индивидууму, нуждающемуся в таком облегчении, эффективного количества (дозы) композиции, содержащей полипептид или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован, и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной. Изобретение относится к способам повышения лабильности фитазы в желудке, включающим получение полипептида, обладающего фитазной активностью, и замену одной или нескольких аминокислот в последовательности, кодирующей полипептид, аргинином, гистидином, пролином, лейцином, серином,треонином или тирозином. Кроме того, изобретение относится к характерным фитазам для использования в способе, например, с последовательностью SEQ ID NO:2 или другим фитазам по изобретению, которые подробно описаны в примере 2 ниже. Изобретение относится к способам изменения по меньшей мере двух разных свойств фермента, которые подробно описаны в примере 2 ниже, включающим (а) получение полипептида, обладающего ферментативной активностью; (b) создание вариантов из полипептида по п.(а), при этом каждый вариант имеет одно аминокислотное изменение по сравнению с полипептидом по п.(а); (с) скрининг вариантов по п.(b) в отношении двух разных свойств; (d) отбор требуемых вариантов по п.(с) и идентификацию одного аминокислотного изменения в каждом выбранном варианте; (е) создание новых вариантов, содержащих разные сочетания выбранных отдельных аминокислотных изменений по п.(d); (f) скрининг вариантов по п.(е) в отношении двух измененных свойств; и (d) отбор требуемых вариантов по п.(f) с двумя измененными свойствами. Изобретение относится к альтернативным способам изменения по меньшей мере двух разных свойств фермента, включающим (а) получение полипептида, обладающего ферментативной активностью; (b) создание вариантов из полипептида по п.(а), при этом каждый вариант имеет одно аминокислотное изменение по сравнению с полипептидом по п.(а);(c) скрининг вариантов по п.(b) в отношении одного измененного свойства;(d) скрининг вариантов по п.(b) в отношении другого измененного свойства; (е) отбор требуемых вариантов по п.(с) и (d) и идентификацию одного аминокислотного изменения в каждом выбранном варианте;(f) создание новых вариантов, содержащих разные сочетания выбранных отдельных аминокислотных изменений по пп.(с) и (d);(g) скрининг вариантов по п.(f) в отношении двух измененных свойств; и(h) отбор требуемых вариантов по п.(g) с двумя измененными свойствами. Изобретение, кроме того, относится к характерным способам создания вариантов, например, с использованием методики GSSM-эволюции, эволюции посредством вторичной сборки генов (GeneReassembly) и/или ТМСА-эволюции. Изобретение относится к способам разделения стабильности фитазы в желудке и термоустойчивости фитазы, как подробно описано в примере 2 ниже, включающим (а) получение полипептида, обла-9 021178 дающего фитазной активностью; (b) создание вариантов фитазы из полипептида по п.(а), при этом каждый вариант имеет одно аминокислотное изменение по сравнению с полипептидом по п.(а); (с) скрининг вариантов фитазы по п.(b) в отношении измененной стабильности в желудке и измененной термоустойчивости; (d) отбор вариантов по п.(с) с требуемой стабильностью в желудке и термоустойчивостью, и идентификацию отдельного аминокислотного изменения в каждом выбранном варианте; (е) создание новых вариантов фитазы, содержащих разные сочетания выбранных отдельных аминокислотных изменений по п.(d); (f) скрининг вариантов по п.(е) в отношении измененной стабильности в желудке и измененной термоустойчивости; и (d) отбор вариантов по п.(f) с требуемой стабильностью в желудке и термоустойчивостью. Изобретение относится к альтернативным способам разделения стабильности в желудке и термоустойчивости фитазы, включающим (а) получение полипептида, обладающего фитазной активностью; (b) создание вариантов фитаз из полипептида по п.(а), при этом каждый вариант имеет одно аминокислотное изменение по сравнению с полипептидом по п.(а); (с) скрининг вариантов фитазы по п.(b) в отношении измененной стабильности в желудке; (d) скрининг вариантов фитазы по п.(b) в отношении измененной термоустойчивости; (е) отбор вариантов по пп.(с) и (d) с требуемой стабильностью в желудке или термоустойчивостью, и идентификацию отдельного аминокислотного изменения в каждом выбранном варианте; (f) создание новых вариантов фитазы, содержащих разные сочетания выбранных отдельных аминокислотных изменений по пп.(с) и (d); (g) скрининг вариантов по п.(f) в отношении измененной стабильности в желудке и измененной термоустойчивости; и (h) отбор вариантов по п.(d) с требуемой стабильностью в желудке и термоустойчивостью. Изобретение, кроме того, относится к типичным способам создания вариантов, например, с использованием методики GSSM-эволюции, эволюции посредством вторичной сборки генов (GeneReassembly) и/или ТМСА-эволюции. Изобретение относится к характерным фитазам для применения в способах, например, с последовательностью SEQ IDNO:2, и другим фитазам по изобретению. Изобретение относится к характерным мутациям, которые разделяют стабильность в желудке и термоустойчивость, например, мутациям, указанным в табл. 4, 5, 6, 7,9, или любому их сочетанию. Изобретение относится к фитазам, которые являются лабильными в желудке и термоустойчивыми,подробно описанным в примере 2 ниже, при этом фитаза полностью разрушается в стимулированном желудочном соке (SGF) менее чем за 10 мин, менее чем за 8 мин, менее чем за 6 мин, менее чем за 4 мин или менее чем за 2 мин, и фитаза сохраняет активность после воздействия температуры в диапазоне примерно от 75 С до примерно 85 С, примерно от 85 С до примерно 90 С, примерно от 90 С до примерно 95 С, или примерно от 80 С до примерно 86 С, например, фитазы по изобретению, которые подробно описаны в примере 2 ниже. В одном из аспектов лабильные в желудке и термоустойчивые фитазы по изобретению полностью разрушаются в стимулированном желудочном соке (SGF) менее чем за 4 мин и фитаза сохраняет активность после воздействия температуры в диапазоне примерно от 80 С до примерно 86 С. Подробности одного или нескольких аспектов изобретения указаны на сопровождающих чертежах и в описании ниже. Другие признаки, цели и преимущества изобретения будут очевидны из описания и чертежей и из формулы изобретения. Все публикации, патенты, заявки на выдачу патентов, последовательности в GenBank и депозиты в АТСС, указанные в настоящем описании, тем самым специально включены в виде ссылки для всех целей. Краткое описание чертежей Следующие далее чертежи являются иллюстративными по отношению к аспектам изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения, который определен формулой изобретения. Фиг. 1 иллюстрирует суммарные данные об остаточной активности очищенных полипептидов по изобретению, примеров последовательностей с единичными мутациями по изобретению после тепловой обработки при разных температурах в течение 30 мин; при этом фитазную активность анализировали с использованием флуоресцирующего субстрата и скорости сравнивали со скоростями для каждого соответствующего необработанного образца; как подробно описано в примере 1, ниже. Фиг. 2 иллюстрирует суммарные данные об остаточной активности очищенных полипептидов по изобретению, содержащих "смешанные" отдельные мутации остатков (фитазы, содержащие множественные мутации), после тепловой обработки в термоциклере; при этом фитазную активность анализировали с использованием флуоресцирующего субстрата, и скорости сравнивали со скоростями для каждого соответствующего необработанного образца; как суммарно показано на фиг.1; и как подробно описано в примере 1, ниже. На фиг. 3 графически суммированы данные, используемые для построения графика на фиг. 1, которые подробно описаны в примере 1, ниже. Фиг. 4 иллюстрирует последовательность исходной фитазы SEQ ID NO:2 и созданные с использованием сайт-направленного насыщающего мутагенеза генов (GSSM) модификации последовательности,выбранные для конструирования библиотеки GeneReassembly, которые подробно описано ниже. Фиг. 5 иллюстрирует примеры фитаз, имеющих модификации нескольких остатков по сравнению с исходной последовательностью SEQ ID NO:2, которые подробно описаны в настоящем описании.- 10021178 Фиг. 6 иллюстрирует примеры фитаз, имеющих модификации одного остатка по сравнению с исходной последовательностью SEQ ID NO:2, которые подробно описаны в настоящем описании. Фиг. 7 схематично иллюстрирует анализ примеров фитаз по изобретению с использованием флуоресцирующего субстрата 4-метилумбеллиферилфосфата (MeUMB-фосфата); как подробно описано в примере 1 ниже. Фиг. 8 схематично иллюстрирует анализ примеров фитаз по изобретению, в котором используют флуоресцирующий субстрат MeUMB-фосфат; как подробно описано в примере 1, ниже. Фиг. 9 схематично иллюстрирует протокол примера скрининга библиотеки, как описано на фигуре 8 и как подробно описано в примере 1 ниже. Фиг. 10 иллюстрирует пример способа получения спирта, который может включать применение фитазы по настоящему изобретению. Фиг. 11 и 11 В иллюстрируют суммарные данные о термостабильности и лабильности в SGF фитазы аррА (GenBank, номер доступа М 58708), промежуточных продуктов appA-SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:2,которые подробно описано в примере 2 ниже. Фиг. 12 иллюстрирует влияние his-метки на стабильность в SGF, которую определяли в анализахSGF с очищенными имеющими his-метку и не имеющими his-метку вариантами исходной фитазы (SEQID NO:2), как подробно описано в примере 2 ниже. Фиг. 13 иллюстрирует термоустойчивость не имеющих гликозилирования вариантов последовательности SEQ ID NO:2 (варианты GLY1-GLY4) и двух контролей SEQ ID NO:2, как подробно описано в примере 2 ниже. Фиг. 14 иллюстрирует стабильность в SGF вариантов SEQ ID NO:2-HIS и SEQ ID NO:2-6X, как подробно описано в примере 2 ниже. Фиг. 15 иллюстрирует утрату активности в SGF мутантов, отобранных с использованием методики искусственной GSSM-эволюции последовательности SEQ ID NO:2, как подробно описано в примере 2 ниже. Фиг. 16 иллюстрирует влияние разных аминокислот на лабильность в SGF, как подробно описано в примере 2 ниже. Фиг. 17 иллюстрирует горячие точки мутаций, влияющих на лабильность в SGF, как подробно описано в примере 2 ниже. Фиг. 18 иллюстрирует лабильность в SGF SEQ ID NO:2-HIS и варианта О при разных дозах пепсина, как подробно описано в примере 2 ниже. Фиг. 19 иллюстрирует время полужизни последовательности SEQ ID NO:2-HIS и варианта О, как подробно описано в примере 2 ниже. Фиг. 20 иллюстрирует остаточную активность лабильных в SGF вариантов фитазы, как подробно описано в примере 2 ниже. Фиг. 21 иллюстрирует удельную активность лабильного в SGF варианта фитазы по сравнению сSEQ ID NO:2, как подробно описано в примере 2 ниже. Сходными условными обозначениями на разных чертежах указаны подобные элементы. Подробное описание изобретения Изобретение относится к фитазным полипептидам, имеющим модификации конкретных остатков по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:2, которая описана выше, и к кодирующим их полинуклеотидам (например, содержащим модификации конкретных пар оснований по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:1, которая описана выше), а также к способам применения полинуклеотидов и полипептидов. Фиг. 6 иллюстрирует примеры фитаз, имеющих одиночные модификации остатков по сравнению с исходной последовательностью SEQ ID NO:2, и фиг. 5 иллюстрирует примеры фитаз, имеющих множественные модификации остатков по сравнению с исходной последовательностью SEQ IDNO:2. Фитазная активность полипептидов по изобретению может включать ферменты, обладающие фитазной активностью, например ферменты, способные катализировать расщепление фитата, например катализ расщепления фитата (миоинозитгексафосфата) до инозита и неорганического фосфата. Фитазы по изобретению включают термоустойчивые и терморезистентные ферменты. Фитазы и полинуклеотиды, кодирующие фитазы по изобретению, применимы в ряде процессов,способов и композиций. Например, как обсуждается выше, фитазу можно использовать в корме для животных и кормовых добавках, а также при обработках, чтобы разрушить или удалить избыток фитата из окружающей среды или образца. Другие применения будут очевидны для специалистов в данной области на основе руководства, представленного в настоящем описании, включая руководства, обсуждаемые выше. В одном из аспектов молекулы фитазы по изобретению - либо отдельно, либо в сочетании с другими реагентами (включая без ограничения ферменты, такие как протеазы, амилазы и тому подобные) применяют при обработке продуктов питания, например для предотвращения нежелательного кукурузного осадка, и в других применениях, при которых требуется гидролиз фитата. В одном из аспектов молекулы фитазы по изобретению применяют для исключения или уменьше- 11021178 ния присутствия негидролизованного фитата, особенно когда негидролизованный фитат приводит к проблемным последствиям в способах ex vivo, включая без ограничения обработку продуктов питания. В одном из аспектов молекулы фитазы по изобретению применяют в способах, которые описаны в ЕР 0321004-В 1 (Vaara et al.), включая стадии обработки зерна кукурузы и сорго, при этом твердые зерна замачивают в воде для их размягчения. Растворимые в воде вещества, которые вымываются в ходе указанного процесса, становятся частью жидкого кукурузного экстракта, который концентрируют выпариванием. Негидролизованная фитиновая кислота в жидком кукурузном экстракте, главным образом в форме солей кальция и магния, связана с фосфором и осаждается в виде нежелательных осадков с белками и ионами металлов. Такой осадок создает проблемы при выпаривании, транспортировке и хранении жидкого кукурузного экстракт. Молекулы фитазы по изобретению применяют для гидролиза такого осадка. В одном из аспектов фитазы по изобретению могут обеспечивать значительно более высокую прибыльность производства, чем ранее идентифицированные молекулы фитазы, например молекулы фитазы, полученные из грибов. В одном из аспектов ферменты по изобретению могут иметь активность примерно 4400 единиц/мг или больше чем примерно от 50 до 100, или от 50 до 1000, или от 100 до 4000 единиц/мг белка. Изобретение также относится к способам изменения свойств фитазы по изобретению с помощью мутагенеза и другого способа, как подробно обсуждается ниже. Создание и обработка нуклеиновых кислот Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды и фитазы по изобретению. Изобретение также относится к кассетам экспрессии, векторам, таким как векторы экспрессии или клонирующие векторы, носителям для клонирования, таким как вирусный вектор, плазмида, фаг,фагмида, космида, фосмида, бактериофаг или искусственная хромосома, которые могут содержать или имеют находящуюся в них нуклеиновую кислоту по изобретению. Изобретение также относится к способам обнаружения новых фитазных последовательностей с использованием нуклеиновых кислот по изобретению. Также предлагаются способы модификации нуклеиновых кислот по изобретению, например, с использованием вторичной сборки синтезированных последовательностей с использованием реакции лигирования, оптимизированной системы направленной эволюции и/или насыщающего мутагенеза. В одном из аспектов изобретение относится к роду нуклеиновых кислот, которые являются синтетически созданными вариантами исходной последовательности SEQ ID NO:1, при этом такие нуклеиновые кислоты по изобретению имеют по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с "исходной" последовательностью SEQ ID NO:1, и кодируют по меньшей мере одну мутацию,указанную в таблице 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание. Для информации исходная последовательность SEQ ID NO:1 представляет собой следующую последовательность:- 12021178 Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены, выделены и/или обработаны, например, с использованием клонирования и экспрессии библиотек кДНК, амплификации мРНК или геномной ДНК в ПЦР, и тому подобного. При практическом осуществлении способов по изобретению гомологичные гены могут быть модифицированы в результате обработки матричной нуклеиновой кислоты, как описано в настоящей публикации. Изобретение может быть осуществлено на практике в сочетании с любым способом или протоколом или устройством, известным в данной области, которые хорошо описаны в научной и патентной литературе. Общие способы Нуклеиновые кислоты, используемые при практическом осуществлении настоящего изобретения,будь то РНК, интерферирующая РНК, антисмысловая нуклеиновая кислота, кДНК, геномная ДНК, векторы, вирусы или их гибриды, могут быть выделены из множества источников, генетически сконструированы, амплифицированы и/или экспрессированы/созданы с помощью рекомбинации. Рекомбинантные полипептиды, созданные из таких нуклеиновых кислот, могут быть по отдельности выделены или клонированы и тестированы в отношении требуемой активности. Можно использовать любую систему экспрессии рекомбинантов, включая системы экспрессии в клетках бактерий, млекопитающих, дрожжей,насекомых или растений. Альтернативно такие нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы in vitro хорошо известными способами химического синтеза, которые описаны, например, в публикациях Adams (1983), J. Am. Chem.Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859; патенте США No. 4458066. Способы обработки нуклеиновых кислот, такие как, например, субклонирование, мечение зондами(например, случайно праймируемое мечение с использованием полимеразы Кленова, ник-трансляция,амплификация), секвенирование, гибридизация и тому подобные, хорошо описаны в научной и патентной литературе, смотри, например, Sambrook, ed., Molecular Cloning: a Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John WileySons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: HybridizationWith Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993). Другим используемым способом получения и обработки нуклеиновых кислот, используемых при практическом осуществлении способов по изобретению, является клонирование из геномных образцов, и при необходимости скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных,например, из геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемой в способах по изобретению, включают библиотеки геномой или кДНК, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (MAC), смотри, например, патенты США 5721118, 6025155; искусственных хромосомах человека, смотри, например, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15: 333-335; искусственных хромосомах дрожжей (YAC); искусственных хромосомах бактерий (ВАС); искусственных хромосомах Р 1, смотри, например, Woon (1998) Genomics 50: 306-316; полученных из Р 1 векторах (РАС), смотри, например,Kern (1997) Biotechniques 23: 12 0-124; космидах, рекомбинантных вирусах, фагах или плазмидах. В альтернативных аспектах фразы "нуклеиновая кислота" или "последовательность нуклеиновой кислоты" относятся к олигонуклеотиду, нуклеотиду, полинуклеотиду или к фрагменту любого из ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК) геномного или синтетического происхождения, которые могут быть однонитевыми или двунитевыми и могут представлять смысловую или антисмысловую нить, к пептидонуклеиновой кислоте (PNA) или к любому ДНК-подобному или РНК-подобному материалу, природного или синтетического происхождения, включая, например, интерферирующую РНК (i-PHK), рибонуклеопротеины (например, i-RNP). Термин охватывает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды,содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также охватывает подобные нуклеиновым кислотам структуры с синтетическими остовами, смотри, например, Mata (1997) Toxicol. Appl.Pharmacol. 144: 189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6: 153-156. В одном из аспектов рекомбинантные полинуклеотиды по изобретению содержат последовательности вблизи нуклеиновой кислоты "остова", с которыми она не соседствует в своем природном окружении. В одном из аспектов нуклеиновые кислоты составляют 5% или большее количество вставок нуклеиновых кислот в популяции "молекул нуклеиновой кислоты остова". "Молекулы остова" по изобретению включают нуклеиновые кислоты, такие как векторы экспрессии, самореплицирующиеся нуклеиновые кислоты, вирусы, интегрируемые нуклеиновые кислоты и другие векторы или нуклеиновые кислоты,используемые для поддержания или обработки представляющей интерес вставки нуклеиновой кислоты. В одном из аспектов обогащенные нуклеиновые кислоты составляют 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или большее количество вставок нуклеиновых кислот в популяции рекомбинантных молекул остова. В одном из аспектов нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по изобретению, находится в сборке в соответствующей фазе с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслированного полипептида или его фрагмента. Изобретение относится к слитым белкам и кодирующим их нуклеиновым кислотам. Полипептид по- 13021178 изобретению может быть слит с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как N-концевые пептиды для идентификации, которые придают требуемые свойства, такие как повышенная стабильность или упрощенная очистка. Пептиды и полипептиды по изобретению также могут быть синтезированы и экспрессированы в виде слитых белков с одним или несколькими связанными с ними дополнительными доменами, например, для получения более иммуногенного пептида, для более легкого выделения рекомбинантно синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и экспрессирующих антитела В-клеток и тому подобного. Домены, облегчающие выявление и очистку, включают, например, хелатирующие металлы пептиды, такие как полигистидиновые участки и гистидин-триптофановые модули,которые способствуют очистке на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые способствуют очистке на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе удлиненияFLAG/аффинной очистки (Immunex Corp, Seattle WA) . Включение отщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор Ха или энтерокиназа (Invitrogen, San Diego CA), между доменом для очистки и содержащим мотив пептидом или полипептидом для облегчения очистки. Например, вектор экспрессии может содержать кодирующую эпитоп последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с шестью остатками гистидина, за которыми следует тиоредоксин и сайт расщепления энтерокиназой(смотри, например, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12: 404414). Остатки гистидина облегчают выявление и очистку, тогда как сайт расщепления энтерокиназой обеспечивает средство очистки эпитопа из остальной части слитого белка. Методики, имеющие отношение к векторам, кодирующим слитые белки, и применению слитых белков хорошо описаны в научной и патентной литературе, смотри, например, Kroll (1993) DNA Cell. Biol, 12: 441-53. В одном из аспектов термин "выделенный" означает, что материал удалили из его исходного окружения (например, природного окружения, если он встречается в природе). Например, природный полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом организме животного, не является выделенным,но такой же полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех существующих совместно с ним материалов в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут составлять часть вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут составлять часть композиции и при этом оставаться выделенными, в том смысле, что вектор или композиция не являются частью их природного окружения. В одном из аспектов термин "очищенный" не требует абсолютной чистоты; при этом имеется в виде относительное определение. Отдельные нуклеиновые кислоты, полученные из библиотеки, были обычным способом очищены до электрофоретической гомогенности. Последовательности, полученные из таких клонов, могут быть получены непосредственно либо из библиотеки, либо из суммарной ДНК человека. Очищенные нуклеиновые кислоты по изобретению очищали от остальной части геномной ДНК в организме по меньшей мере в 104-106 раз. В альтернативных аспектах термин"очищенный" также включает нуклеиновые кислоты, которые были очищены от остальной части геномной ДНК или от других последовательностей в библиотеке или от другого окружения по меньшей мере на один порядок, или альтернативно на два или три порядка, или на четыре или пять порядков. Последовательности регуляции транскрипции и трансляции Изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты (например, ДНК) по изобретению, функционально связанным с последовательностью(ями) регуляции экспрессии (например, транскрипции или трансляции), например, промоторами или энхансерами, для того чтобы управлять или модулировать синтез/экспрессию РНК. Последовательность регуляции экспрессии может находится в векторе экспрессии. Примеры бактериальных промоторов включают lacI, lacZ, Т 3, Т 7, gpt, PR лямбда, PL иtrp. Примеры эукариотических промоторов включают немедленный ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промотор SV40, LTR из ретровируса и промотор металлотионеина I мыши. Промоторы, подходящие для экспрессии или сверхэкспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы lac или trp E. coli, промотор lacI, промотор lacZ, промотор Т 3, промотор Т 7, промотор gpt,промотор PR лямбда, промотор PL лямбда, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицераткиназа (PGK), и промотор кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор SV40, LTR из ретровирусов и промотор металлотионеина-I мыши. Также могут быть использованы другие промоторы, которые, как известно, регулируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах. Векторы экспрессии и носители для клонирования Изобретение относится к системам экспрессии, например, кассетам экспрессии, векторам, носителям для клонирования и тому подобным, содержащим нуклеиновые кислоты по изобретению, например последовательности, кодирующие фитазы по изобретению, для экспрессии и сверхэкспрессии полипептидов по изобретению (и нуклеиновых кислот, например, антисмысловых). Векторы экспрессии и носители для клонирования по изобретению могут включать вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды,фагмиды, космиды, фосмиды, бактериальные искусственные хромосомы, вирусную ДНК (например, вируса осповакцины, аденовируса, поксвирус птиц, вируса псевдобешенства и производных SV40), основанные на Р 1 искусственные хромосомы, дрожжевые плазмиды, дрожжевые искусственные хромосомы и- 14021178 любые другие векторы, специфичные для конкретных представляющих интерес хозяев (такие как Bacillus, Aspergillus и дрожжи). Векторы по изобретению могут включать хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК. Большие количества подходящих векторов известны специалистам в данной области и коммерчески доступны. Примеры векторов включают: бактериальные: векторыpQE (Qiagen), плазмиды pBluescript, векторы pNH, векторы лямбда-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3,pDR540, pRIT2T (Pharmacia); эукариотические: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG,pSVLSV40 (Pharmacia). Однако можно использовать любую другую плазмиду или другой вектор, при условии, что они реплицируются и жизнеспособны в хозяине. Низкокопийные или высококопийные векторы могут быть использованы в настоящем изобретении. В качестве характерных примеров векторов экспрессии, которые можно использовать, можно отметить вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, бактериальные искусственные хромосомы, вирусную ДНК (например, вируса осповакцины, аденовируса, поксвирус птиц,вируса псевдобешенства и производных SV40), основанные на Р 1 искусственные хромосомы, дрожжевые плазмиды, дрожжевые искусственные хромосомы и любые другие векторы, специфичные для конкретных представляющих интерес хозяев (таких как Bacillus, Aspergillus и дрожжи). Таким образом, например, ДНК может быть включена в любой из множества векторов экспрессии для экспрессии полипептида. Такие векторы содержат хромосомные, внехромосомные и синтетические последовательности ДНК. Большие количества подходящих векторов известны специалистам в данной области и коммерчески доступны. Следующие векторы предлагаются в качестве примера: бактериальные: векторы pQE (Qiagen), плазмиды pBluescript, векторы pNH, векторы лямбда-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540,pRIT2T (Pharmacia); эукариотические: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Однако можно использовать любую другую плазмиду или другой вектор, при условии, что они реплицируются и жизнеспособны в хозяине. Низкокопийные или высококопийные векторы могут быть использованы в настоящем изобретении. Характерный вектор, используемый в настоящем изобретении, содержит точку начала репликацииf-фактора. f-фактор (или фактор фертильности) в Е. coli представляет собой плазмиду, которая с высокой частотой осуществляет свой перенос во время конъюгации и с меньшей частотой перенос бактериальной хромосомы. В одном из аспектов используют клонирующие векторы, называемые "фосмидами" или векторами на основе бактериальных искусственных хромосом (ВАС). Такие векторы получены из f-фактора Е. coli, который способен стабильно интегрировать большие участки геномной ДНК. В случае интеграции с ДНК из смешанного некультивируемого образца из окружающей среды можно получить крупные геномные фрагменты в форме стабильной "библиотеки ДНК окружающей среды". Другим типом вектора, используемым в настоящем изобретении, является космидный вектор. Космидные векторы исходно конструировали для клонирования и размножения крупных участков геномной ДНК. Клонирование в космидных векторах подробно описано в "Molecular Cloning: A laboratory Manual"(Sambrook et al., 1989). Последовательность ДНК в векторе экспрессии функционально связана с соответствующей последовательностью(ями) регуляции экспрессии (промотором) для управления синтезом РНК. Конкретные известные бактериальные промоторы включают lacI, lacZ, Т 3, Т 7, gpt, PR лямбда, PL и trp. Эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промоторы SV40, LTR из ретровируса и промотор металлотионеина-I мыши. Выбор подходящего вектора и промотора хорошо известен специалистам в данной области. Вектор экспрессии также содержит сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор также может содержать последовательности, подходящие для усиления экспрессии. Области промотора могут быть выбраны из любого требуемого гена с использованием векторов с геном CAT (хлорамфениколтрансферазы) или других векторов с селектируемыми маркерами. Кроме того, векторы экспрессии могут содержать один или несколько селектируемых маркерных генов для обеспечения фенотипического свойства для селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как ген дигидрофолатредуктазы или ген резистентности к неомицину в случае культуры эукариотических клеток или ген резистентности к тетрациклину или ампициллину в случае Е. coli. В одном из аспектов кассеты экспрессии по изобретению содержат последовательность по изобретению и нуклеотидную последовательность, которая способна осуществлять экспрессию структурного гена (т.е., последовательность, кодирующую белок, такой как фитаза по изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Кассеты экспрессии включают, по меньшей мере, промотор,функционально связанный с кодирующей полипептид последовательностью; и, необязательно, с другими последовательностями, например сигналами терминации транскрипции. Также могут быть использованы дополнительные факторы, необходимые или полезные для осуществления экспрессии, например энхансеры. В одном из аспектов термин "функционально связанный", который использован в настоящем описании, относится к связи промотора выше по ходу транскрипции последовательности ДНК, так что промотор опосредует транскрипцию последовательности ДНК. Таким образом, кассеты экспрессии также включают плазмиды, векторы экспрессии, рекомбинантные вирусы, любую форму рекомбинантного вектора с "голой" ДНК и тому подобные. В одном из аспектов "вектор" содержит нуклеиновую кислоту,- 15021178 которая может инфицировать, трансфицировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. Вектор может быть в виде "голой" нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты в комплексе с белком или липидом. Вектор, необязательно, содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты,и/или белки, и/или мембраны (например, клеточную мембрану, липидную оболочку вирусов и т.д.). В одном из аспектов векторы содержат, без ограничения, репликоны (например, РНК-репликоны, бактериофаги), с которыми фрагменты ДНК могут быть связаны и могут стать реплицируемыми. В одном из аспектов векторы содержат, без ограничения, РНК, автономно самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы, и тому подобное, смотри, например, патент США 5217879), и включают как экспрессирующие, так и неэкспрессирующие плазмиды. В том случае, когда рекомбинантный микроорганизм или культура клеток описаны как содержащие "вектор экспрессии", они содержат как внехромосомные кольцевые и линейные ДНК, так и ДНК, которые были включены в хромосому(мы) хозяина. В том случае, когда вектор поддерживается клеткой-хозяином, вектор может либо стабильно реплицироваться в клетках во время митоза в виде автономной структуры,либо может быть включен в геном хозяина. Вектор экспрессии может содержать промотор, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор также может включать последовательности, подходящие для усиления экспрессии. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать точку начала репликации,любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах могут быть использованы последовательности ДНК,полученные из сайтов сплайсинга и полиаденилирования SV40, чтобы обеспечить требуемые нетранскрибируемые генетические элементы. В одном из аспектов векторы экспрессии содержат один или несколько селектируемых маркерных генов, чтобы обеспечить возможность селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селектируемые маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие резистентность к неомицину в случае культуры эукариотических клеток, гены, придающие резистентность к тетрациклину или ампициллину клеткам Е. coli, и ген TRP1 S. cerevisiae. Области промотора могут быть выбраны из любого требуемого гена с использованием векторов с геном хлорамфениколтрансферазы(CAT) или других векторов с селектируемыми маркерами. Векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках также могут содержать энхансеры для повышения уровней экспрессии. Энхансеры представляют собой цисдействующие элементы ДНК, обычно длиной примерно от 10 до примерно 300 п.н., которые действуют на промотор, увеличивая его транскрипцию. Примеры включают энхансер SV40, находящийся со стороны поздних генов от начала репликации от 100 до 270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы, находящийся со стороны поздних генов от начала репликации, и энхансеры аденовирусов. Последовательность ДНК может быть встроена в вектор различными способами. В общем, последовательность ДНК лигируют в требуемом положении в вектор после расщепления вставки и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Альтернативно могут быть лигированы тупые концы вставки и вектора. В данной области известно множество способов клонирования, например способы, описанные Ausubel и Sambrook. Специалистам в данной области понятно, что описанные и другие способы входят в объем изобретения. Вектор может быть в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, производные SV40; бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, дрожжевые плазмиды, векторы, полученные из сочетания плазмид и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц и вируса псевдобешенства. Множество клонирующих векторов и векторов экспрессии, используемых в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны, например, Sambrook. Конкретные бактериальные векторы, которые могут быть использованы, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы, включая хорошо известные клонирующие векторы pBR322 (ATCC 37017), рКК 223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), GEM1 (PromegaBiotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A,pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia),pKK232-8 и pCM7. Конкретные эукариотические векторы включают pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL (Pharmacia). Однако можно использовать любой другой вектор,при условии, что он реплицируется и является жизнеспособным в клетке-хозяине. Клетки-хозяева и трансформированные клетки Изобретение также относится к трансформированной клетке, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению, например последовательность, кодирующую фитазу по изобретению,или содержащей кассету экспрессии, вектор, носитель для клонирования, вектор экспрессии или клонирующий вектор по изобретению. Клеткой-хозяином могут быть любые клетки-хозяева, известные специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как бак- 16021178 териальные клетки, клетки грибов, дрожжевые клетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Примеры бактериальных клеток включают клетки любого вида из родов Escherichia,Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas, Lactococcus и Staphylococcus, включая, например, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Pseudomonasfluorescens. Примеры клеток грибов включают любой вид Aspergillus, включая Aspergillus niger. Примеры дрожжевых клеток включают любой вид Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Schwanniomyces, включая Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe. Примеры клеток насекомых включают любой вид Spodoptera или Drosophila, включая Drosophila S2 и Spodoptera Sf9. Примеры клеток насекомых включают Drosophila S2 и Spodoptera Sf9. Примеры дрожжевых клеток включают Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe. Примеры клеток животных включают клетки СНО, COS или меланомы Боуэса или любую линию клеток мыши или человека. Специалисты в данной области могут выбрать подходящего хозяина. Вектор может быть введен в клетки-хозяева с использованием любого из множества способов,включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, генную пушку или Tiопосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция,трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, липофекцию или электропорацию (Davis, L., Dibner,M., Battey, L., Basic Methods in Molecular Biology, (1986. В соответствующем случае сконструированные клетки-хозяева можно культивировать в обычной питательной среде, модифицированной соответствующим образом для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов по изобретению. После трансформации подходящей линии хозяина и выращивания линии хозяина до соответствующей плотности клеток выбранный промотор можно индуцировать подходящими способами (например, сдвигом температуры или посредством химической индукции), и клетки можно культивировать в течение дополнительного периода времени, чтобы обеспечить для них возможность продуцирования требуемого полипептида или его фрагмента. Клетки могут быть собраны центрифугированием, разрушены физическими или химическими способами, и полученный неочищенный экстракт сохраняют для дальнейшей очистки. Клетки микроорганизмов, используемые для экспрессии белков, могут быть разрушены любым обычным способом, включая циклы замораживания-размораживания, обработку ультразвуком, механическое разрушение или использование средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент могут быть извлечены и очищены из культур рекомбинантных клеток разными способами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом,экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию,хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. При необходимости можно использовать стадии рефолдинга белка для получения полной конфигурации полипептида. При необходимости можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) на конечных стадиях очистки. Конструкции в клетках-хозяевах можно использовать обычным способом для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от используемого хозяина в способе получения рекомбинантов полипептиды, продуцируемые клетками-хозяевами, содержащими вектор, могут быть гликозилированы или могут быть не гликозилированы. Полипептиды по изобретению также могут включать или не включать начальный остаток аминокислоты метионина. Также могут быть использованы бесклеточные системы трансляции для получения полипептида по изобретению. Бесклеточные системы трансляции могут использовать мРНК, транскрибированные с конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах конструкция ДНК может быть линеаризована перед проведением реакции трансляции in vitro. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с соответствующим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, чтобы получить требуемый полипептид или его фрагмент. Векторы экспрессии могут содержать один или несколько селектируемых маркерных генов, чтобы получить фенотипический признак для селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как ген дигидрофолатредуктазы или резистентности к неомицину в случае культуры эукариотических клеток, или таких как ген резистентности к тетрациклину или ампициллину в случае Е. coli. Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть экспрессированы или сверхэкспрессированы в любой системе экспрессии in vitro или in vivo. Можно использовать любые системы культур клеток, чтобы экспрессировать или сверхэкспрессировать рекомбинантный белок, включая культуры бактерий, насекомых, дрожжей, грибов или млекопитающих. Сверхэкспрессия может быть осуществлена при соответствующем выборе промоторов, энхансеров, векторов (например, использование векторов на основе репликонов, двухцистронных векторов (смотри, например, Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229: 295-8, сред, систем культивирования и тому подобного. В одном из аспектов используют амплификацию генов с использованием маркеров для селекции, например, глутаминсинтетазы (смотри, например, Sanders (1987) Dev. Biol. Stand. 66: 55-63), в клеточных системах для сверхэкспрессии полипептидов- 17021178 по изобретению. Различные системы культур клеток млекопитающих можно использовать для экспрессии рекомбинантного белка, примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии COS-7 фибробластов почки обезьяны, описанные в публикации "SV40-transformed simian cells support the replication of earlySV40 mutants" (Gluzman, 1981), и другие линии клеток, способные экспрессировать совместимый вектор,например, линии клеток С 127, 3 Т 3, СНО, HeLa и ВНК. Векторы экспрессии млекопитающих будут содержать точку начала репликации, подходящий промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. Последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсинга и полиаденилирования SV40, могут быть использованы для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов. Клетки-хозяева, содержащие интересующие полинуклеотиды, можно культивировать в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов. Условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобные, представляют собой условия, ранее используемые для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и такие условия будут очевидны для специалиста в данной области. Клоны, которые идентифицированы как клоны, обладающие активностью конкретного фермента, затем могут быть секвенированы, чтобы идентифицировать полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, обладающий повышенной активностью. Амплификация нуклеиновых кислот При практическом осуществлении изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению, или модифицированные нуклеиновые кислоты могут быть репродуцированы, например,в результате амплификации. Изобретение относится к паре последовательностей праймеров для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие фитазной активностью, или их подпоследовательностям,при этом пара праймеров способна амплифицировать последовательности нуклеиновых кислот, включая иллюстративную последовательность SEQ ID NO:1, и по меньшей мере одну из конкретных модификаций последовательности, указанных выше. Специалист в данной области может сконструировать пару последовательностей праймеров амплификации, например, для любой части или для полноразмерных последовательностей."Исходная" последовательность SEQ ID NO:1 показана выше. Таким образом, пара последовательностей праймеров амплификации для амплификации данной исходной последовательности или одной из иллюстративных последовательностей по изобретению, имеющих по меньшей мере одну из конкретных модификаций последовательности, указанных в настоящем описании, могут представлять собой остатки 1-21 последовательности SEQ ID NO:1 (т.е., ATGAAAGCGATCTTAATCCCA) и комплементарную нить последних 21 остатка последовательности SEQ ID NO:1 (т.е., нить, комплементарную TGCAGTTTGAGATCTCATCTA). Реакции амплификации также могут быть использованы для оценки количества нуклеиновой кислоты в образце (например, количества мРНК в образце клеток), мечения нуклеиновой кислоты (например, чтобы использовать ее на матрице или блоте), для выявления нуклеиновой кислоты или оценки количества конкретной нуклеиновой кислоты в образце. В одном из аспектов изобретения амплифицируют мРНК, выделенную из клетки или библиотеки кДНК. Специалист в данной области может выбрать и сконструировать подходящие олигонуклеотидные праймеры для амплификации. Способы амплификации также хорошо известны в данной области и включают, например, полимеразную цепную реакцию, ПЦР(1990) и PCR strategies (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., лигазную цепную реакцию (LCR)(смотри, например, Wu (1989) Genomics 4: 560; Landegren (1988) Science 241: 1077; Barringer (1990) Gene 89: 117); транскрипционную амплификацию (смотри, например, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173); и самоподдерживаемую репликацию последовательностей (смотри, например, Guatelli (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874); амплификацию с использованием репликазы Q-бета (смотри, например, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 1477-1491), автоматизированный анализ амплификации с использованием репликазы Q-бета (смотри, например, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257-271) и другие опосредованные РНК-полимеразой способы (например, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); смотри также Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 3 07-316; Sambrook; Ausubel; патенты США 4683195 и 4683202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563-564. Определение степени идентичности последовательностей Изобретение относится к выделенной, синтетической или рекомбинантной нуклеиновой кислоте,содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 70, 71, 72, 73, 74,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более высоко идентична последовательности SEQ ID NO:1 и включающей по меньшей мере одну из конкретно указанных модификаций по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:1, обсуждаемых выше. В одном из аспектов степень идентичности последовательностей (гомологии) можно определить, использую лю- 18021178 бую компьютерную программу и соответствующие параметры, включая программы, описанные в настоящей публикации, такие как BLAST 2.2.2. или FASTA, версию 3.0t78, с параметрами по умолчанию. Гомологичные последовательности также включают последовательности РНК, в которых уридины заменяют тимины в последовательностях нуклеиновых кислот. Гомологичные последовательности могут быть получены с использованием любого из способов, описанных в настоящей публикации, или могут возникать в результате коррекции ошибки секвенирования. В настоящем аспекте изобретения используют различные программы для сравнения последовательностей, указанные в описании. Идентичность (гомологию) последовательностей белков и/или нуклеиновых кислот можно оценить, используя любой (любую) из множества алгоритмов и программ для сравнения последовательностей, известных в данной области. Такие алгоритмы и программы включают без ограничения TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA и CLUSTALW (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad.Mol. Biol. 215(3) :403-410, 1990, Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993. Гомология или идентичность может быть измерена с использованием компьютерной программы для анализа последовательностей (например, пакета компьютерных программ для анализа последовательностей из Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Такая компьютерная программа подбирает пары сходных последовательностей посредством определения степени гомологии в случае различных делеций, замен и других модификаций. Термины "гомология" и "идентичность" в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют конкретный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального соответствия на протяжении окна сравнения или определенной области, который измеряют, используя любое количество алгоритмов сравнения последовательностей или используя выравнивание вручную и визуальный просмотр. В случае сравнения последовательностей одна последовательность может действовать в качестве эталонной последовательности (иллюстративная последовательность по изобретению), с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости указывают координаты подпоследовательности и устанавливают параметры программы алгоритма для сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы, установленные по умолчанию, или можно устанавливать альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет идентичность последовательностей в процентах для тестируемых последовательностей по отношению к эталонной последовательности на основе параметров программы."Окно сравнения" в используемом в настоящем описании смысле включает обращение к любому одному из ряда участков непрерывно следующих друг за другом остатков. Например, в альтернативных аспектах изобретения непрерывно следующие друг за другом остатки в диапазоне от 20 до полной длины иллюстративных последовательностей по изобретению сравнивают с эталонной последовательностью с таким же количеством непрерывно следующих друг за другом положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Если эталонная последовательность имеет необходимую идентичность последовательности с иллюстративными последовательностями по изобретению, например, 98% идентичность последовательности с последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, и последовательности имеют одну из специфичных модификаций последовательности, указанных выше, то такая последовательность входит в объем изобретения. В альтернативных вариантах подпоследовательности длиной в диапазоне примерно от 20 до 600, примерно от 50 до 200 и примерно от 100 до 150 сравнивают с эталонной последовательностью с таким же количеством непрерывно следующих друг за другом положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с использованием алгоритма локальной гомологии Смита и Ватермана (Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981), алгоритма выравнивания в отношении гомологии Нидлемана и Вунша (J. Mol. Biol., 48: 443, 1970), в результате поиска сходства способом Пирсона и Липмана (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988), с использованием компьютеризованных воплощений таких алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете компьютерных программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или посредством выравнивания вручную и визуального просмотра. Другие алгоритмы для определения гомологии или идентичности включают,например, кроме программы BLAST (основное средство поиска при локальном выравнивании, the National Center for Biological Information, такие как BLAST, BLAST2, BLASTN и BLASTX), ALIGN, AMAS(анализ множественных выровненных последовательностей), AMPS (множественное выравнивание последовательностей белка), ASSET (средство статистической оценки выровненных участков), BANDS,BESTSCOR, BIOSCAN (узел сравнительного анализа биологических последовательностей), BLIMPSComp. App. Biosci. 6: 237-245, 1990), FNAT (средство принудительного выравнивания нуклеотидов),Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (пакет программ для анализа последовательностей(программа локального содержания), MACAW (автоматизированное средство для конструирования и анализа множественного выравнивания), MAP (программа множественного выравнивания), MBLKP,MBLKN, PIMA (индуцированное структурой множественное выравнивание последовательностей), SAGA (выравнивание последовательностей на основе генетического алгоритма) и WHAT-IF. Другие программы и базы данных, используемые при практическом осуществлении изобретения, включают без ограничения: MacPattern (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), CatalystAvailable Chemicals Directory (содержащая рекомендации по доступным химическим веществам), база данных MDL Drug Data Report, содержащая информацию о лекарственных средствах, универсальная база данных по медицинской химии, база данных международных обозначений лекарственных средств Дервент, база данных BioByteMasterFile, база данных GenBank, база данных GenSeq и база данных GenomeQuest. Многие другие программы и базы данных могут быть очевидны для специалиста в данной области на основании настоящего описания. Такие программы выравнивания также можно использовать для скрининга геномных баз данных, чтобы идентифицировать полинуклеотидные последовательности,имеющие, по существу, идентичные последовательности. Некоторые геномные базы данных доступны,например, на веб-сайте NCBI (National Center for Biotechnology Information). Базы данных, содержащие информацию о геномах с комментариями, содержащими некоторую функциональную информацию, поддерживаются другими организациями и доступны в Интернете. Алгоритмы BLAST, BLAST 2.0 и BLAST 2.2.2 также используют при практическом осуществлении изобретения. Такие алгоритмы описаны, например, в Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Компьютерная программа для осуществления анализов BLAST общедоступна из Национального центра биотехнологической информации. Такой алгоритм включает сначала идентификацию пар последовательностей с максимальным сходством (HSP) посредством идентификации коротких слов длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают,либо удовлетворяют некоторой пороговой оценке Т с положительным значением при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т называют порогом оценки слов в окружении (Altschul (1990), выше). Такие начальные совпадения слов в окружении действуют как затравка для инициации поисков, чтобы найти содержащие их более длинные HSP. Совпадения слов продлевают в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока кумулятивная оценка выравнивания может увеличиваться. Кумулятивные оценки вычисляют, используя нуклеотидные последовательности, параметры М (награда в баллах для пары совпадающих остатков; всегда 0). В случае аминокислотных последовательностей используют матрицу для оценки, чтобы вычислить кумулятивную оценку в баллах. Удлинение совпадений слов в каждом направлении прекращают, когда: кумулятивная оценка выравнивания снижается на количество X от своего максимального достигнутого значения; кумулятивная оценка подходит к нулю или ниже нуля, вследствие накопления одного или нескольких отрицательно оцениваемых выравниваний остатков; или достигается конец любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программеBLASTN (для нуклеотидных последовательностей) используют по умолчанию длину слова (W) 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих нитей. Для аминокислотных последовательностей программаBLASTP использует по умолчанию длины слова 3 и ожидание (Е) 10 и матрицу для подсчета BLOSUM62(смотри Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915), выравнивания (В) 50, ожидание (E) 10, M=5, N=-4, и сравнение обеих нитей. Алгоритм BLAST также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (смотри, например, Karlin and Altschul (1993) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873). Одной мерой сходства, определяемой алгоритмом BLAST, является наименьшее суммарное правдоподобие (P(N, которое обеспечивает показатель вероятности, с которой случайно может встречаться совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновая кислота считается сходной с эталонной последовательностью, если наименьшее суммарное правдоподобие при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее чем примерно 0,2, менее чем примерно 0,01, или менее чем примерно 0,001. В одном из аспектов гомологи последовательностей белков и нуклеиновых кислот оце- 20021178 нивают, используя основное средство поиска при локальном выравнивании ("BLAST"). Например, можно использовать пять конкретных программ BLAST, чтобы решить следующую задачу: (1) BLASTP иBLAST3 сравнивают запрашиваемую аминокислотную последовательность с базой данных последовательностей белков; (2) BLASTN сравнивает запрашиваемую нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей; (3) BLASTX сравнивает концептуальные продукты трансляции шести рамок в запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обеих нитях) с базой данных последовательностей белков; (4) TBLASTN сравнивает запрашиваемую последовательность белка с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслированных во всех шести рамках считывания(обе нити); и (5) TBLASTX сравнивает трансляции шести рамок запрашиваемой нуклеотидной последовательности с трансляциями шести рамок нуклеотидных последовательностей в базе данных. ПрограммыBLAST идентифицируют гомологичные последовательности посредством идентификации сходных участков, которые называют в настоящем описании "пары участков с максимальным сходством", между запрашиваемой аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты и тестируемой последовательностью, которая может быть получена из базы данных последовательностей белков или нуклеиновых кислот. Пары участков с максимальным сходством могут быть идентифицированы (т.е., выровнены) с помощью матриксов для подсчета, многие из которых известны в данной области. Примером используемой матрицы для подсчета является матрица BLOSUM62 (Gonnet et al., Science 256: 1443-1445, 1992; Henikoff and Henikoff, Proteins 17: 49-61, 1993). Альтернативно можно использовать матрицы РАМ или РАМ 250 (смотри, например, Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for DetectingFoundation). В одном из аспектов изобретения для того, чтобы определить, обладает ли нуклеиновая кислота необходимой идентичностью последовательности, чтобы входить в объем изобретения, используют программы BLAST 2.2.2 NCBI с опциями по умолчанию blastp. Существует примерно 38 устанавливаемых параметров в программе BLAST 2.2.2. В этом иллюстративном аспекте изобретения используют все значения по умолчанию, за исключением установок фильтра по умолчанию (т.е., все параметры устанавливают по умолчанию, за исключением фильтрования, которое установлено в положении OFF); вместо этого используют установку "-F F", которая отменяет фильтрование. Использованием фильтрования по умолчанию часто приводит к ошибкам Карлина-Альтшуля вследствие короткой длины последовательности. Значения по умолчанию, используемые в таком иллюстративном аспекте изобретения, включают:"фильтр для низкой сложности: ON." Другие установки по умолчанию: фильтр для низкой сложности OFF, размер слова 3 для белка,матрица BLOSUM62, штраф за существование делеции -11 и штраф за удлинение делеции -1. В некоторых аспектах алгоритм сравнения последовательностей можно использовать для сравнения последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности по изобретению с эталонной последовательностью. Например, алгоритм сравнения последовательностей может сравнивать нуклеотидные последовательности или аминокислотные последовательности по изобретению с "исходной" последовательностью SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:2, или с эталонными последовательностями,чтобы идентифицировать гомологи или структурные мотивы. Сравнение последовательностей можно осуществлять для определения того, является ли первая последовательность такой же, как и вторая последовательность. Важно отметить, что такой тип сравнения не ограничен осуществлением точного сравнения новой последовательности и первой последовательности в базе данных. Хорошо известные способы известны специалистам в данной области для сравнения двух нуклеотидных или белковых последовательностей, даже если они не являются идентичными. Например, могут быть введены делеции в одну последовательность, чтобы повысить уровень гомологии между двумя тестируемыми последовательностями. Параметры, которые контролируют, введены ли делеции или другие признаки в последовательность во время сравнения, обычно вводит пользователь алгоритмом сравнения. После осуществления сравнения двух последовательностей определяют, являются ли две последовательности одинаковыми. Конечно, термин "одинаковые" не ограничен последовательностями, которые являются абсолютно идентичными. Сравнение последовательностей может показывать уровни идентичности последовательностей между сравниваемыми последовательностями или идентифицировать структурные мотивы, или может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые сравнивают с такими кодами нуклеиновых кислот и кодами полипептидов. Уровень идентичности последовательностей определяют в результате вычисления доли признаков последовательностей, которые являются одинаковыми, в общем количестве последовательностей в первой последовательности. Таким образом, если каждый признак в первой 100-нуклеотидной последовательности, выровненный в каждым- 21021178 признаком во второй последовательности, то уровень идентичности последовательности может составлять 100%. Альтернативно алгоритм может сравнивать эталонную последовательность с последовательностью по изобретению, чтобы определить отличаются ли последовательности в одном или нескольких положениях. Результат сравнения может показывать длину и идентичность встроенных, делетированных или замененных нуклеотидов или аминокислотных остатков по отношению к любой из последовательностей,либо эталонной, либо по изобретению. В других аспектах алгоритм можно использовать для идентификации признаков в нуклеиновой кислоте или полипептиде по изобретению. Например, идентифицируемый признак может включать открытую рамку считывания (ОРС), "кодон инициации" (например, кодон"ATG"), "ТААТАА-бокс" или такие мотивы как альфа-спирали, бета-слои или функциональные мотивы полипептидов, такие как активные участки ферментов, мотивы спираль-петля-спираль, лейциновые молнии, участки гликозилирования, сайты убиквитинилирования, альфа-спирали, бета-слои, сигнальные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые направляют секрецию кодируемых белков, последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции, такие как гомеобоксы, кислые участки, активные участки ферментов, участки связывания субстрата и участки расщепления ферментами, а также другие мотивы, известные специалистам в данной области. Ингибирование экспрессии фитазы Изобретение, кроме того, относится к нуклеиновым кислотам, комплементарным (например, антисмысловым последовательностям) последовательностям нуклеиновых кислот по изобретению, включая нуклеиновые кислоты, содержащие антисмысловые последовательности, i-PHK, рибозимы. Антисмысловые последовательности способны ингибировать транспорт, сплайсинг или транскрипцию кодирующих фитазы генов. Ингибирование может осуществляться посредством целенаправленного воздействия на геномную ДНК или матричную РНК. Транскрипция или функция целевой нуклеиновой кислоты может быть ингибирована, например, в результате гибридизации и/или расщепления. Одна особенно используемая группа ингибиторов, предлагаемых в настоящем изобретении, включает олигонуклеотиды,которые способны связывать либо ген фитазы, либо мРНК, в любом случае предотвращая или ингибирование продукции или функции фермента фитазы. Связь может осуществляться благодаря специфичной гибридизации последовательностей. Другой используемый класс ингибиторов включает олигонуклеотиды, которые вызывают инактивацию или расщепление мРНК фитазы. Олигонуклеотид может обладать ферментативной активностью, которая вызывает такое расщепление, например, рибозимы. Олигонуклеотид может быть химически модифицирован или конъюгирован с ферментом или композицией, способной расщеплять комплементарную нуклеиновую кислоту. Можно проводить скрининг пула множества таких разных олигонуклеотидов в отношении олигонуклеотидов с требуемой активностью. Антисмысловые олигонуклеотиды Изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, содержащим новые модификации последовательности фитазы по изобретению, при этом такие антисмысловые олигонуклеотиды способны связывать мРНК фитазы, что может ингибировать фитазную активность посредством целенаправленного воздействия на мРНК. Способы конструирования антисмысловых олигонуклеотидов хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может сконструировать такие фитазные олигонуклеотиды, используя новые регенты по изобретению. Например, протоколы прогулки по генам/картирования РНК для скрининга эффективных антисмысловых олигонуклеотидов хорошо известны в данной области, смотри, например, публикацию Но (2000) Methods Enzymol. 314: 168-183, в которой описан анализ с использованием картирования РНК, который основан на стандартных молекулярных способах, для получения простого и надежного способа отбора эффективных антисмысловых последовательностей. Смотри также Smith (2000) Euro. J. Pharm. Sci. 11: 191-198. Природные нуклеиновые кислоты используют в качестве антисмысловых олигонуклеотидов. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть любой длины; например, в альтернативных аспектах антисмысловые олигонуклеотиды имеют длину примерно от 5 до 100, примерно от 10 до 80, примерно от 15 до 60, примерно от 18 до 40. Оптимальная длина может быть определена обычным скринингом. Антисмысловые олигонуклеотиды могут присутствовать в любой концентрации. Оптимальная концентрация может быть определена обычным скринингом. Известно широкое множество синтетических, не встречающихся в природе нуклеотидных аналогов и аналогов нуклеиновых кислот, которые могут решить такую возможную проблему. Например, можно использовать пептидонуклеиновые кислоты (PNA), содержащие неионные остовы, такие как N-(2-аминоэтил)глициновые единицы. Также могут быть использованы антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие фосфоротиоатные связи, которые описаны в WO 97/03211;(Humana Press, Totowa, N. J., 1996). Антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие синтетические аналоги остовов ДНК, предлагаемые в изобретении, также могут включать нуклеиновые кислоты, содержащие фосфородитиоат, метилфосфонат, фосфорамидат, сложный алкилфосфотриэфир, сульфамат, 3'тиоацеталь, метилен(метилимино), 3'-N-карбамат и морфолинокарбамат, которые описаны выше. Способы комбинаторной химии можно использовать для создания огромного количества олигонуклеотидов, которые могут быть легко подвергнуты скринингу в отношении специфичных олигонуклеоти- 22021178 дов, которые обладают соответствующими аффинностями и специфичностями связывания по отношению к любой мишени, такой как смысловые и антисмысловые фитазные последовательности по изобретению (смотри, например, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270: 13581-13584). Ингибирующие рибозимы Изобретение относится к рибозимам, содержащим новые модификации последовательности фитазы по изобретению, при этом рибозимы по изобретению способны связывать мРНК фитазы, что может ингибировать активность фермента фитазы посредством целенаправленного воздействия на мРНК. Способы конструирования рибозимов и отбора специфичной для фитазы антисмысловой последовательности для целенаправленного воздействия хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может сконструировать такие рибозимы, используя новые регенты по изобретению. Рибозимы действуют, связывая РНК-мишень посредством части рибозима, связывающей РНК-мишень,которая находится в непосредственной близости с ферментативной частью РНК, которая расщепляет РНК-мишень. Таким образом, рибозим распознает и связывает РНК-мишень РНК посредством спаривания комплементарных оснований и после связывания с правильным участком действует ферментативно,расщепляя и инактивируя РНК-мишень. Расщепление РНК-мишени таким образом будет нарушать ее способность направлять синтез кодируемого белка, если расщепление происходит в кодирующей последовательности. После того как рибозим связывается и расщепляет свою РНК-мишень, он обычно высвобождается из такой РНК и, следовательно, может многократно связывать и расщеплять новые мишени. В некоторых случаях ферментативная природа рибозима может обеспечивать преимущества перед другими методиками, такими как методика на основе антисмысловых молекул (когда молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с нуклеиновой кислотой-мишенью, блокируя ее транскрипцию,трансляцию или связь с другой молекулой), так как эффективная концентрация рибозима, необходимая для осуществления терапевтического лечения, может быть ниже, чем концентрация антисмыслового олигонуклеотида. Такое потенциальное преимущество отражает способность рибозима действовать ферментативно. Таким образом, одна молекула рибозима способна расщеплять много молекул РНК-мишени. Кроме того, рибозим обычно является высоко специфичным ингибитором, при этом специфичность ингибирования зависит не только от механизма связывания на основе спаривания оснований, но также от механизма, благодаря которому молекула ингибирует экспрессию РНК, с которой он связывается. То есть ингибирование вызывается расщеплением РНК-мишени и, следовательно, специфичность определяют в виде отношения скорости расщепления РНК-мишени к скорости расщепления РНК, не являющейся мишенью. Такой механизм расщепления зависит от факторов дополнительных по отношению к факторам, вовлеченным в спаривание оснований. Таким образом, специфичность действия рибозима может быть выше, чем специфичность действия антисмыслового олигонуклеотида, связывающего такой же участок РНК. Ферментативная молекула рибозимной РНК может быть образована в виде мотива головки молота,но также может быть образована в виде мотива шпильки, вируса гепатита дельта, интрона группы I или РНК, подобной РНКазе Р (в ассоциации с гидовой последовательностью РНК). Примеры таких мотивов в виде головки молота описаны в публикации Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8: 183; мотивы в виде шпильки описаны в Hampel (1989) Biochemistry 28: 4929, и Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18: 299; мотив вируса гепатита дельта описан в Perrotta (1992) Biochemistry 31: 16; мотив РНК-азы Р описан в Guerrier-Takada (1983) Cell 35: 849; и интрон группы I описан Cech в патенте СШАNo. 4987071. Перечисление таких конкретных мотивов не предназначено для ограничения; специалистам в данной области будет понятно, что молекула ферментативной РНК по настоящему изобретению имеет участок специфичного связывания субстрата, комплементарный одной или нескольким областям РНК генамишени, и имеет нуклеотидную последовательность в данном участке связывания субстрата и вокруг него, которая придает молекуле активность в расщеплении РНК. Интерференция РНК (РНК-и) В одном из аспектов изобретение относится к ингибирующей молекуле РНК, так называемой молекуле "РНК-и", содержащей ферментативную последовательность по изобретению. Молекула РНК-и содержит молекулу двунитевой РНК (днРНК). Молекула РНК-и, например, ми-РНК и/или микро-РНК, может ингибировать экспрессию гена фермента фитазы. В одном из аспектов молекула РНК-и, например ми-РНК и/или микро-РНК, имеет длину примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше нуклеотидов в дуплексе. Хотя изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом действия, РНК-и может проникать в клетку и вызывать распад однонитевых РНК (онРНК) со сходными или идентичными последовательностями, включая эндогенные мРНК. Когда клетку подвергают воздействию двунитевой РНК(днРНК), мРНК гомологичного гена избирательно разрушается в ходе процесса, называемого интерференцией РНК (РНК-и). Возможным механизмом, лежащим в основе РНК-и, является разрушение двунитевой РНК (днРНК), совпадающей с последовательностью конкретного гена, на короткие кусочки, называемые короткими (малыми) интерферирующими РНК, которые запускают разрушение мРНК, которая совпадает с их последовательностью. В одном из аспектов РНК-и по изобретению используют для терапевтических средств, вызывающих сайленсинг генов, смотри, например, Shuey (2002) Drug Discov. Today- 23021178 7: 1040-1046. В одном из аспектов изобретение относится к способам избирательного разрушения РНК с использованием молекул РНК-и, например, ми-РНК и/или микро-РНК, по изобретению. В одном из аспектов ингибирующая микро-РНК (микро-РНК) ингибирует трансляцию, и ми-РНК ингибирует транскрипцию. Способ может быть осуществлен на практике in vitro, ex vivo или in vivo. В одном из аспектов молекулы РНК-и по изобретению можно применять для создания мутации с утратой функции в клетке,органе или в организме животного. Способы получения и использования молекул РНК-и, например, миРНК и/или микро-РНК, для избирательного разрушения РНК хорошо известны в данной области, смотри, например, патенты США 6506559, 6511824, 6515109, 6489127. Модификация нуклеиновых кислот Изобретение относится к способам создания вариантов нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновых кислот, кодирующих фермент фитазу. Такие способы можно повторять или использовать в различных сочетаниях, чтобы создать фитазные ферменты, обладающие измененной или другой активностью или измененной или другой стабильностью, отличными от активности и стабильности фитазы, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой. Такие способы также можно повторять или использовать в различных сочетаниях, например, чтобы создать варианты экспрессии гена/мРНК, трансляции мРНК или стабильности мРНК. В другом аспекте генетический состав клетки изменяют, например, модификацией гомологичного гена ex vivo с последующем повторным встраиванием в клетку. Изобретение также относится к способам изменения характерных свойств фитазы по изобретению посредством мутагенеза и другого способа, включая направленную эволюцию, например, патентованные способы Diversa Corporation (San Diego, CA); например, DirectEvolution; (смотри, например, патент США 5830696; насыщающий мутагенез генных сайтов (GSSM) (смотри, например, патенты США 6171820 и 6579258), опосредованную экзонуклеазой сборку генов в ходе направленной эволюции (смотри, например, патенты США 6361974 и 6352842), селекцию концов при направленной эволюции(смотри, например, патенты США 6358709 и 6238884), основанную на рекомбинации перетасовку в ходе синтеза (смотри, например, патенты США 5965408 и 6440668 и патент АвстралииAU724521) и направленную эволюцию термофильных ферментов (см., например, патенты США 5830696 и 6335179). В одном из аспектов характерные признаки фитазы модифицируют, используя протокол DirectEvolution, включающий: а) осуществление мутагенеза одной или нескольких молекулярных матриц, например, нуклеиновых кислот фитазы по изобретению с созданием новых молекул, и b) отбор среди таких полученных в результате видов новых молекул с более желательными признаками. Эффективность направленной эволюции зависит от начального выбора исходных матриц (например, "исходной" последовательности SEQ ID NO:1 или любой последовательности по настоящему изобретению), а также от выбранного способа(ов) мутагенеза и используемого способа(ов) скрининга. Таким образом, изобретение относится к новым высоко активным, физиологически эффективным и экономичным источникам фитазной активности, включая новые фитазы, которые: а) обладают наилучшими активностями в случае одного или нескольких конкретных применений, таких как высокотемпературное производство продуктов питания, и, следовательно, применимы для оптимизации таких конкретных применений; b) применимы в качестве матриц для направленной эволюции с целью получения еще более улучшенных новых молекул; и с) применимы в качестве средств идентификации дополнительных родственных молекул такими способами, как способы, основанные на гибридизации. Нуклеиновая кислота по изобретению может быть изменена любыми способами. Например, с использованием случайных или стохастических способов или нестохастических способов или способов"направленной эволюции". Способы создания случайной мутации в генах хорошо известны в данной области, смотри, например, патент США 5830696. Например, можно использовать мутагены, чтобы вызвать случайные мутации гена. Мутагены включают, например, ультрафиолетовый свет или гаммаизлучение или химический мутаген, например, митомицин, азотистую кислоту, фотоактивируемые псоралены, отдельно или в сочетании, чтобы индуцировать разрывы ДНК, поддающиеся репарации посредством рекомбинации. Другие химические мутагены включают, например, бисульфит натрия, азотистую кислоту, гидроксиламин, гидразин или муравьиную кислоту. Другие мутагены являются аналогами предшественников нуклеотидов, например, нитрозогуанидин, 5-бромурацил, 2-аминопурин или акридин. Такие средства могут быть добавлены в реакционную смесь для ПЦР вместо предшественника нуклеотида, таким образом вызывая мутации в последовательности. Также можно использовать интеркалирующие средства, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и тому подобные. Можно использовать любой способ молекулярной биологии, например, случайный мутагенез на основе ПЦР, смотри, например, Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5467-5471; или комбинаторный множественный кассетный мутагенез, смотри, например, Crameri (1995) Biotechniques 18: 194-196. Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например, гены, могут быть подвергнуты повторной сборке после случайной или "стохастической" фрагментации, смотри, например, патенты США 6291242, 6287862,6287861, 5955358, 5830721, 5824514, 5811238, 5605793. В альтернативных аспектах модификации, добавления или делеции вводят с использованием склонной к ошибкам ПЦР, перетасовки, сайтспецифичного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, ПЦР-сборки, основанного на ПЦР мута- 24021178 генеза, имитирующего половой процесс, мутагенеза in vivo, кассетного мутагенеза, рекурсивного множественного мутагенеза, экспоненциального множественного мутагенеза, сайт-специфичного мутагенеза,вторичной сборки генов, насыщающего мутагенеза генных сайтов (GSSM), вторичной сборки синтезированных последовательностей с использованием реакции лигирования (SLR), рекомбинации, рекурсивной рекомбинации последовательностей, мутагенеза модифицированной фосфотиоатом ДНК, мутагенеза с использованием содержащей урацил матрицы, мутагенеза содержащих пробелы дуплексов, мутагенеза по механизму репарации точечных ошибочных спариваний, мутагенеза с использованием дефицитного по репарации штамма хозяина, химического мутагенеза, радиогенного мутагенеза, делеционного мутагенеза, мутагенеза на основе рестрикции-селекции, мутагенеза на основе рестрикции-очистки, синтеза искусственных генов, множественного мутагенеза, создания химерных мультимеров нуклеиновых кислот и/или сочетания указанных и других способов. В следующих публикациях описано множество методик и/или способов рекурсивной рекомбинации, которые могут быть включены в способы по изобретению: Stemmer (1999) "Molecularform large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391; and Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751. Основанные на мутагенезе способы создания разнообразия включают, например, сайтспецифичный мутагенез (Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioateVerlag, Berlin; мутагенез с использованием содержащих урацил матриц (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel etZollerSmith (1987) "Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154:329-350); мутагенез модифицированной фосфоротиоатом ДНК mutagenesis (Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al. (1985) "TheNucl. Acids Res. 16: 803-814); мутагенез с использованием дуплексной ДНК с пробелами (Kramer et al.without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res, 16: 6987-6999). Дополнительные протоколы, используемые в способах по изобретению, включают репарацию точечных ошибочных спариваний (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38: 879-887), мутагенез с использованием дефицитных по репарации линий хозяев(Carter et al. (1985) "Improved oligonucleotideoligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382-403), делеционный мутагенез (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to generate large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), рестрикцию-селекцию и рестрикцию-селекцию и рестрикцию-очистку (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), мутагенез посредством общего синтеза гена (Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding"Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale "shot-gun" gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 33053316), репарацию двунитевых разрывов (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusualrepair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7177-7181). Дополнительные подробности или альтернативные протоколы многих описанных выше способов можно найти в публикации Method in Enzymology V. 154, в которой также описаны применимые контроли для решении проблем поиска ошибок при различных способах мутагенеза. Смотри также патент США 5605793, Stemmer (25 февраля 1997), "Methods for In Vitro Recombination"; патент США 5811238,Stemmer et al., (22 сентября 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics byIterative Selection and Recombination"; патент США 5830721, Stemmer et al., (3 ноября 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; патент США 5834252, Stemmer et al., (10 ноября 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction"; патент США 5837458, Minshull et al., (17 ноября 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; WO 95/22625, Stemmer andBorchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling", and WO 98/42727 by Pati and Zarling",Sequence Alterations using Homologous Recombination." В заявках на выдачу патентов США приведены дополнительные подробности или альтернативные протоколы, имеющие отношение к различным способам создания разнообразия, включая "Shuffling ofsimulations", Selifonov and Stemmer, поданную 18 января 2000 (PCT/US00/01138); и "Single-stranded nucleic acid template-mediated recombination and nucleic acid fragment isolation", Affholter, поданную 6 сентября 2000 (США, номер регистрации 09/656549). Нестохастические способы или способы "направленной эволюции" включают, например, насыщающий мутагенез генных сайтов (GSSM), вторичную сборку синтезированных последовательностей с использованием реакции лигирования (SLR) или их сочетание, используют для модификации нуклеиновых кислот по изобретению, чтобы создать фитазы с новыми или измененными свойствами (например,активность в высоко кислотных или щелочных условиях, при высоких или низких температурах и тому подобных). Полипептиды, кодируемые модифицированными нуклеиновыми кислотами, могут быть подвергнуты скринингу в отношении активности перед тестированием в отношении фитазной или другой активности. Можно использовать любой способ или протокол тестирования, например, использовать капиллярные матрицы. Смотри, например, патенты США 6361974, 6280926, 5939250. Насыщающий мутагенез или GSSM Изобретение также относится к способам получения фермента с использованием насыщающего мутагенеза генных сайтов или GSSM, описанного в настоящей публикации, а также в патентах США 6171820 и 6579258. В одном из аспектов используют кодонные праймеры, содержащие вырожденную последовательность N,N,G/T, чтобы ввести мутации в полинуклеотид, например, фермент фитазу или антитело по изобретению, так чтобы создать набор получаемых в результате полипептидов, в котором представлен полный диапазон одиночных аминокислотных замен в каждом положении аминокислоты, например, может быть модифицирован остаток аминокислоты на активном участке фермента или на участке связывания лиганда. Такие олигонуклеотиды могут содержать следующие друг за другом первую гомологичную последовательность, вырожденную последовательность N,N,G/T и, необязательно, вторую гомологичную последовательность. Дочерние получаемые в результате использования таких олигонуклеотидов закодированные ниже продукты трансляции включают все возможные аминокислотные изменения в каждом аминокислотном сайте вдоль полипептида, поскольку вырожденность последовательности N,N,G/T включает кодоны для всех 20 аминокислот. В одном из аспектов один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий, например, одну вырожденную кассету N,N,G/T) используют для того, чтобы подвергнуть каждый оригинальный кодон в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. В другом аспекте используют по меньшей мере две вырожденных кассеты - либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо нет, для того, чтобы подвергнуть по меньшей мере два оригинальных кодона в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Например, в одном олигонуклеотиде может находиться более одной последовательности N,N,G/T, чтобы ввести аминокислотные мутации в более чем одном участке. Несколько таких последовательностей N,N,G/T могут непосредственно соседствовать или могут быть разделены одной или несколькими дополнительными нуклеотидными последовательностями. В другом аспекте олигонуклеотиды, пригодные для введения добавлений и делеций, могут быть использованы либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность N,N,G/T, чтобы ввести любое сочетание или перетасовку аминокислотных добавлений, делеций и/или замен. В одном из аспектов одновременный мутагенез в двух или более следующих друг за другом положениях аминокислот осуществляют, используя олигонуклеотид, который содержит следующие друг за другом триплеты N,N,G/T, т.е. вырожденную последовательность (N,N,G/T)n. В другом аспекте используют вырожденные кассеты, имеющие меньшую вырожденность, чем последовательность N,N,G/T. Например, в некоторых случаях может требоваться использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной последовательности триплета, содержащей только один N, при этом указанный N может быть в первом, втором или третьем положении триплета. Любые другие основания, включая любые их сочетания и перестановки, можно использовать в остальных двух положениях триплета. Альтернативно в некоторых случаях может требоваться использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности N,N,N. В одном из аспектов использование вырожденных триплетов (например, триплетов N,N,G/T) обеспечивает возможность системного и простого создания полного диапазона возможных природных аминокислот (всего 20 аминокислот) во всех без исключения аминокислотных положениях в полипептиде (в альтернативных аспектах способы также включают создание не всех возможных замен в одном положении аминокислотного остатка или кодона). Например, в случае полипептида длиной 100 аминокислот можно создать 2000 разных видов (т.е. 20 возможных аминокислот на одно положение X 100 положений аминокислот). В результате использования олигонуклеотида или группы олигонуклеотидов, содержащих вырожденный триплет N,N,G/T, 32 индивидуальных последовательности могут кодировать все 20 возможных природных аминокислот. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходную полинук- 27021178 леотидную последовательность подвергают насыщающему мутагенезу с использованием по меньшей мере одного такого олигонуклеотида, создают 32 отдельных дочерних полинуклеотида, кодирующих 20 отдельных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида в сайтспецифичном мутагенезе приводит к образованию только одного дочернего полипептидного продукта в реакционном сосуде. Невырожденные олигонуклеотиды, необязательно, можно использовать в сочетании с описанными вырожденными праймерами; например, невырожденные олигонуклеотиды можно использовать для создания специфичных точечных мутаций в рабочем полинуклеотиде. Такой подход обеспечивает средство создания специфичных молчащих точечных мутаций, точечных мутаций, приводящих к соответствующим аминокислотным изменениям, и точечных мутаций, которые вызывают образование стоп-кодонов и соответствующую экспрессию фрагментов полипептида. В одном из аспектов каждый реакционный сосуд для насыщающего мутагенеза содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 дочерних полипептидных молекул (например, фермента фитазы), такие что, все 20 природных аминокислот представлены в одном конкретном положении аминокислоты, соответствующем положению кодона, подвергнутого мутагенезу в исходном полинуклеотиде (в других аспектах используют не все 20 природных сочетаний). 32-кратные вырожденные дочерние полипептиды, созданные в каждом реакционном сосуде для насыщающего мутагенеза, могут быть подвергнуты клональной амплификации (например, клонированы в подходящем хозяине, например, хозяине Е.coli, с использованием, например, вектора экспрессии) и подвергнуты скринингу экспрессии. Когда при скрининге обнаруживают, что индивидуальный дочерний полипептид проявляет подходящее изменение свойства (по сравнению с исходным полипептидом, такое как повышенная активность в гидролизе глюкана в щелочных или кислых условиях), полипептид может быть секвенирован, чтобы идентифицировать имеющуюся в нем соответствующую благоприятную аминокислотную замену. В одном из аспектов после мутагенеза всех без исключения положений аминокислот в исходном полипептиде с использованием насыщающего мутагенеза, как описано в настоящей публикации, благоприятные аминокислотные изменения могут быть идентифицированы в более чем одном аминокислотном положении. Могут быть созданы одна или несколько новых дочерних молекул, которые содержат сочетание всех или части таких благоприятных аминокислотных замен. Например, если идентифицированы 2 конкретных благоприятных аминокислотных изменения в каждом из 3 положений аминокислот в полипептиде, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменения по сравнению с исходной аминокислотой и каждое из двух благоприятных изменений) и 3 положения. Таким образом,всего существует 333 или 27 возможностей, включая 7, которые были исследованы ранее 6 одиночных точечных мутаций (т.е., 2 в каждом из трех положений) и без изменения в любом положении. В еще одном аспекте мутагенез с насыщением сайтов можно использовать вместе с перетасовкой,химеризацией, рекомбинацией и другими способами мутагенеза наряду с использованием скрининга. Настоящее изобретение относится к применению любого способа(ов) мутагенеза, включая насыщающий мутагенез, альтернативным образом. В одном из примеров используют многократное применение любого способа(ов) мутагенеза в сочетании со скринингом. Изобретение также относится к применению собственных кодонных праймеров (содержащих вырожденную последовательность N,N,N), чтобы ввести точечные мутации в полинуклеотид, так чтобы создать группу дочерних полипептидов, в которых представлен полный диапазон одиночных аминокислотных замен в каждом аминокислотном положении (насыщающий мутагенез генных сайтов (GSSM. Используемые олигонуклеотиды состоят из следующих друг за другом первой гомологичной последовательности, вырожденной последовательности N,N,N и в одном из аспектов, но не обязательно, второй гомологичной последовательности. Дочерние закодированные ниже продукты трансляции, полученные в результате использования таких олигонуклеотидов, включают все возможные аминокислотные изменения в каждом аминокислотном сайте вдоль полипептида, поскольку вырожденность последовательностиN,N,N включает кодоны для всех 20 аминокислот. В одном из аспектов один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий одну вырожденную кассету N,N,N) используют для того, чтобы подвергнуть каждый оригинальный кодон в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. В другом аспекте используют по меньшей мере две вырожденных кассеты N,N,N - либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо в разных, для того, чтобы подвергнуть по меньшей мере два оригинальных кодона в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Таким образом, в одном олигонуклеотиде может находиться более одной последовательности N,N,N, чтобы ввести аминокислотные мутации в более чем одном участке. Несколько таких последовательностей N,N,N могут непосредственно соседствовать или могут быть разделены одной или несколькими дополнительными нуклеотидными последовательностями. В другом аспекте олигонуклеотиды, пригодные для введения добавлений и делеций, могут быть использованы либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность N,N,N, чтобы ввести любое сочетание или перетасовку аминокислотных добавлений, делеций и/или замен. В конкретном примере возможен одновременный мутагенез в двух или более следующих друг за другом положениях аминокислот с использованием олигонуклеотида, который содержит следующие друг за другом триплеты N,N,N, т.е. вырожденную последовательность (N,N,N)n.- 28021178 В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению вырожденных кассет, имеющих меньшую вырожденность, чем последовательность N,N,N. Например, в некоторых случаях может требоваться использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной последовательности триплета, содержащей только один N, при этом указанный N может быть в первом, втором или третьем положении триплета. Любые другие основания, включая любые их сочетания и перестановки, можно использовать в остальных двух положениях триплета. Альтернативно в некоторых случаях может требоваться использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной последовательности триплета N,N,N, последовательности триплета N,N,G/T или N,N,G/C. Однако понятно, что использование вырожденного триплета (такого как последовательность триплета N,N,G/T или N,N,G/C), которое раскрыто в настоящем изобретении, имеет преимущества по нескольким причинам. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам систематичного и довольно простого получения замены полного диапазона возможных аминокислот (всего 20 аминокислот) во всех без исключения аминокислотных положениях в полипептиде. Таким образом, в случае полипептида длиной 100 аминокислот изобретение обеспечивает путь систематического и довольного простого создания 2000 разных видов (т.е. 20 возможных аминокислот на одно положение X 100 положений аминокислот). Понятно, что благодаря использованию олигонуклеотида, содержащего вырожденную последовательность триплета N,N,G/T или N,N,G/C, получают 32 индивидуальных последовательности,которые кодируют 20 возможных природных аминокислот. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходную полинуклеотидную последовательность подвергают насыщающему мутагенезу с использованием одного такого олигонуклеотида, создают 32 отдельных дочерних полинуклеотида, кодирующих 20 отдельных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида в сайт-специфичном мутагенезе приводит к образованию только одного дочернего полипептидного продукта в реакционном сосуде. Настоящее изобретение также относится к применению невырожденных олигонуклеотидов, которые, необязательно, могут быть использованы в сочетании с описанными вырожденными праймерами. Понятно, что в некоторых случаях, предпочтительно, использование невырожденных олигонуклеотидов,чтобы создать специфичные точечные мутации в рабочем полинуклеотиде. Такой подход обеспечивает средство создания специфичных молчащих точечных мутаций, точечных мутаций, приводящих к соответствующим аминокислотным изменениям, и точечных мутаций, которые вызывают образование стопкодонов и соответствующую экспрессию фрагментов полипептида. Таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения каждый реакционный сосуд для насыщающего мутагенеза содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 дочерних полипептидных молекул, таких что все 20 аминокислот представлены в одном конкретном положении аминокислоты, соответствующем положению кодона, подвергнутого мутагенезу в исходном полинуклеотиде. 32 кратные вырожденные дочерние полипептиды, созданные в каждом реакционном сосуде для насыщающего мутагенеза, могут быть подвергнуты клональной амплификации (например, клонированы в подходящем хозяине Е. coli, с использованием вектора экспрессии) и подвергнуты скринингу экспрессии. Когда при скрининге обнаруживают, что индивидуальный дочерний полипептид проявляет подходящее изменение свойства (по сравнению с исходным полипептидом), полипептид может быть секвенирован,чтобы идентифицировать имеющуюся в нем соответствующую благоприятную аминокислотную замену. Понятно, что после мутагенеза всех без исключения положений аминокислот в исходном полипептиде с использованием насыщающего мутагенеза, как описано в настоящей публикации, благоприятные аминокислотные изменения могут быть идентифицированы в более чем одном аминокислотном положении. Могут быть созданы одна или несколько новых дочерних молекул, которые содержат сочетание всех или части таких благоприятных аминокислотных замен. Например, если идентифицированы 2 конкретных благоприятных аминокислотных изменения в каждом из 3 положений аминокислот в полипептиде, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменения по сравнению с исходной аминокислотой и каждое из двух благоприятных изменений) и 3 положения. Таким образом, всего существует 333 или 27 возможностей, включая 7, которые были исследованы ранее 6 одиночных точечных мутаций (т.е., 2 в каждом из трех положений) и без изменения в любом положении. Таким образом, в не ограничивающем примере настоящее изобретение относится к применению насыщающего мутагенеза в сочетании с дополнительными способами мутагенеза, такими как способ,при котором два или более родственных полинуклеотида вводят в подходящую клетку-хозяина, так что образуется гибридный полинуклеотид в результате рекомбинации и редукционной пересортировки. Кроме осуществления мутагенеза вдоль полной последовательности гена в настоящем изобретении предлагается применение мутагенеза для замены каждого из любого количества оснований в полинуклеотидной последовательности, при этом количество оснований, подвергаемых мутагенезу, в одном из аспектов является любым целым числом от 15 до 100000. Таким образом, вместо мутагенеза каждого положения вдоль молекулы можно подвергать мутагенезу любое или определенное количество оснований (в одном из аспектов группу, насчитывающую от 15 до 100000). В одном из аспектов отдельный нуклеотид используют для мутагенеза каждого положения или группы положений вдоль полинуклеотидной последовательности. Группой из 3 положений, подвергаемых мутагенезу, может быть кодон. Му- 29