Продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств

Настоящее изобретение относится к продуктам слияния лекарственных средств, которые имеют улучшенные периоды полувыведения из сыворотки. Эти продукты слияния и конъюгаты содержат полипептиды, единичные вариабельные домены иммуноглобулина (антитела) и молекулы GLP(глюкагоноподобный пептид) и/или эксендина. Изобретение также относится к применениям,препаратам, композициям и устройствам, содержащим такие продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB) Настоящее изобретение относится к продуктам слияниям и конъюгатам лекарственных средств, которые имеют улучшенные периоды полувыведения из сыворотки. Эти продукты слияния и конъюгаты содержат единичные вариабельные домены иммуноглобулина (антитела) и молекулы GLP (глюкагоноподобный пептид) и/или эксендина. Изобретение также относится к применениям, препаратам, композициям и устройствам, содержащим такие продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств. Предшествующий уровень техники Многие лекарственные средства, обладающие активностями, которые могут быть полезны для терапии и/или диагностики, имеют ограниченное значение, поскольку они быстро выводятся из организма при введении. Например, многие полипептиды, которые обладают терапевтически полезными активностями, быстро выводятся из кровотока через почки. Соответственно, для получения желаемого терапевтического эффекта следует вводить большую дозу. Существует потребность в улучшенных терапевтических и диагностических агентах, которые имеют улучшенные фармакокинетические свойства. Один из таких классов лекарственных средств, которые имеют короткий период полувыведения из организма или системного кровотока, представляет собой инкретиновые гормоны, такие как глюкагоноподобный пептид 1 или пептид YY, а также эксендин, например эксендин-4. Глюкагоноподобный пептид (GLP)-1 представляет собой инкретиновый гормон с сильными глюкозозависимым инсулинотропным и глюкагоностатическим действиями, трофическими эффектами на клетки поджелудочной железы и ингибиторными эффектами на желудочно-кишечную секрецию и моторику, которые приводят к снижению концентрации глюкозы в плазме и уменьшению колебаний уровня глюкозы. Кроме того, благодаря его способности усиливать насыщение, GLP-1 снижает потребление пищи, ограничивая таким образом увеличение массы тела, и может даже вызывать потерю массы. Взятые вместе, эти действия дают уникальный профиль GLP-1, который считается весьма желательным для антидиабетического агента, в частности, поскольку зависимость его антигипергликемических эффектов от глюкозы должна минимизировать риск развития тяжелой гипогликемии. Однако его фармакокинетический/фармакодинамический профиль является таким, что нативный GLP-1 не является терапевтически полезным. Таким образом, хотя GLP-1 является наиболее эффективным при постоянном введении, однократные подкожные инъекции оказывают кратковременные эффекты. GLP-1 является очень чувствительным к ферментативной деградации in vivo, и расщепление дипептидилпептидазой IV (DPP-IV) является возможно наиболее подходящим, поскольку это происходит быстро и приводит к образованию неинсулинотропного метаболита. Поэтому стратегии использования терапевтического потенциала GLP-1,основанные на понимании факторов, влияющих на его метаболическую стабильность и фармакокинетический/фармакодинамический профиль, были в центре интенсивных исследований. Была проделана большая работа с целью ингибирования пептидазы или модификации GLP-1 таким образом, чтобы замедлить его деградацию при сохранении биологической активности. В WO 05/027978 описаны производные GLP-1, имеющие пролонгированный профиль действия. В WO 02/46227 описаны гетерологичные слитые белки, содержащие полипептид (например, альбумин), слитый с GLP-1 или аналогами (описание этих аналогов включено в данную заявку посредством ссылки в виде примеров аналогов GLP-1, которые можно использовать в настоящем изобретении). В WO 05/003296, WO 03/060071,WO 03/059934 описан амино-слитый белок, где GLP-1 был подвергнут слиянию с альбумином с целью увеличения периода полувыведения гормона. Однако, несмотря на эти усилия, активный GLP-1 длительного действия не был получен. Фактически, особенно в области диабета и ожирения, имеется огромная потребность в улучшенных пептидах GLP-1 или других агентах, таких как эксендин-4 или PYY, которые сходным образом оказывают инсулинотропный эффект, пригодный, в частности, для лечения диабета и ожирения. Таким образом,существует потребность в модификации GLP-1, эксендина-4 и других инсулинотропных пептидов для обеспечения более длительного действия in vivo, при сохранении их низкой токсичности и терапевтических преимуществ. Краткое изложение сущности изобретения В настоящем изобретении предложена композиция, которая представляет собой продукт слияния или конъюгат и которая содержит или состоит из (а) инсулинотропного агента или молекулы, или инкретинового лекарственного средства или молекулы,которые могут представлять собой, например, эксендин-4, PYY, например 3-26 PYY, или GLP-1, например мутант GLP-1 (7-37) A8G, присутствующего в виде продукта слияния или конъюгата с (б) dAb, которое специфически связывается с сывороточным альбумином (AlbudAb ТМ), выбранным из (1) доменного антитела (dAb) DOM7h-14 (аминокислотная последовательность DOM7h-14 представлена на фиг. 1(h): SEQ ID NO: 8), (2) доменного антитела (dAb)NO: 26) или dAb, которое имеет вплоть до 4 аминокислотных различий от последовательности dAbDOM7h-14-10; и (3) dAb DOM7h-11-15 (аминокислотная последовательность DOM7h-11-15 представлена на фиг. 1(р): SEQ ID NO: 27) или (4) доменного антитела (dAb) DOM7h-14-10 R108C (аминокислотная последовательность DOM7h-14-10 представлена на фиг. 1(r. Аминокислотный или химический линкер также возможно может присутствовать, соединяя инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство, например эксендин-4 и/или GLP-1, илиPYY с dAb, например с DOM7h-14 dAb, DOM7h-14-10 dAb, DOM7h-11-15 dAb. Линкер может представлять собой, например, спиральный линкер, например спиральный линкер с последовательностью, представленной на фиг. 1(k): SEQ ID NO: 11, или он может представлять собой gly-ser линкер, например, с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 1(l): SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях продукты слияния (или конъюгаты) по изобретению могут содержать дополнительные молекулы, например дополнительные пептиды или полипептиды. Инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство (например, эксендин и/илиGLP-1) может присутствовать в виде продукта слияния (или конъюгата) либо с N-концом, либо с Сконцом dAb. В некоторых воплощениях в изобретении предложен полипептид, содержащий или состоящий из слитой молекулы, которая выбрана из следующего:(а) продукт слияния 2(GLP)-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb (DAT0114, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(a): SEQ ID NO: 1),(б) продукт слияния эксендина-4 (G4S линкер)3 DOM7h-14 dAb (DAT0115, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(b): SEQ ID NO: 2),(в) продукт слияния эксендин-4 - DOM7h-14 dAb (DAT0116, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(c): SEQ ID NO: 3),(г) продукт слияния эксендина-4, спирального линкера, DOM7h-14 dAb (DAT0117, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(d): SEQ ID NO: 4),(д) продукт слияния GLP-1 (7-37) A8G (G4S линкер)3 DOM7h-14 dAb (DAT0118, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(e): SEQ ID NO: 5),(е) продукт слияния GLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb (DAT0119, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(f): SEQ ID NO: 6),(ж) продукт слияния GLP-1 (7-37) A8G, спирального линкера, DOM7h-14 dAb (DAT0120, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(g): SEQ ID NO: 7),(з) продукт слияния эксендина-4, (G4S)3 линкера, DOM7h-14-10 (DMS7139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(m): SEQ ID NO: 24),(и) продукт слияния эксендина-4, (G4S)3 линкера, DOM7h-11-15 (DMS7143, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(n): SEQ ID NO: 25). В изобретении также предложены молекулы конъюгата, содержащие или состоящие из аминокислотных последовательностей молекул, описанных выше, т.е. молекул с аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID NO: 1-7 и SEQ ID NO: 24-25. В некоторых воплощениях в изобретении предложен полипептид, содержащий или состоящий из молекулы конъюгата, которая представляет собой DOM7h-14-10 (R108C) AlbudAb, конъюгированное с амидированным по С-концу PYY3-36 посредством лизина (введенного в положение 10 PYY) и линкера из 4 повторов ПЭГ (полиэтиленгликоль). Аминокислотная последовательность и структура этого пептидного конъюгата представлена на фиг. 14. В изобретении также предложен полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности продукта слияния эксендина-4, (G4S)3 линкера, DOM7h-14-10 (DMS7139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(m): SEQ ID NO: 24), или молекулы продукта слияния или конъюгата, которая имеет вплоть до 4 аминокислотных изменений из аминокислотной последовательности DMS7139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(m).DOM7h-14 представляет собой единичный вариабельный домен иммуноглобулина человека илиdAb (Vk), которые связываются с сывороточным альбумином, и его аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(h): SEQ ID NO: 8. CDR-области DOM7h-14 dAb подчеркнуты в аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1(h): SEQ ID NO: 8.DOM7h-14-10 представляет собой единичный вариабельный домен иммуноглобулина человека илиdAb, которые связываются с сывороточным альбумином, и его аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(о): SEQ ID NO: 26. CDR-области DOM7h-14-10 dAb подчеркнуты в аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1(о): SEQ ID NO: 26.DOM7h-11-15 представляет собой единичный вариабельный домен иммуноглобулина человека илиdAb, которые связываются с сывороточным альбумином, и его аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(р): SEQ ID NO: 27. CDR-области DOM7h-11-15 dAb подчеркнуты в аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1(р): SEQ ID NO: 27. Как использовано в данной заявке, "продукт слияния" относится к слитому белку, который содержит DOM7h-14 dAb, или DOM7h-14-10 dAb, или DOM7h-11-15 dAb, которое связывает сывороточный альбумин, в качестве первой группировки и инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство в качестве второй группировки. dAb, которое связывает сывороточный альбумин, и лекарственное средство или агент присутствуют в виде отдельных частей (группировок) единичной непрерывной полипептидной цепи. Первая (dAb) и вторая (инкретиновое лекарственное средство или инсулинотропный агент) группировки могут быть непосредственно связаны друг с другом посредством пептидной связи или связаны через подходящую аминокислоту, или пептидный или полипептидный линкер. Дополни-2 021146 тельные группировки, например пептиды или полипептиды (например, третья, четвертая) и/или линкерные последовательности, могут быть представлены, при необходимости. Первая группировка может иметь N-концевую, С-концевую или внутреннюю локализацию относительно второй группировки. В некоторых воплощениях слитый белок содержит одну или более чем одну (например, от одной до примерно 20) dAb группировок. Как использовано в данной заявке, "конъюгат" относится к композиции, содержащей dAb, которое связывает сывороточный альбумин, с которым инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство, например GLP-1, эксендин-4, PYY, например PYY 3-36, связаны ковалентно или нековалентно. Инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство могут быть ковалентно связаны сdAb прямо или опосредованно посредством подходящей линкерной группировки, например, ПЭГ линкерной группировки. Лекарственное средство или агент могут быть связаны с dAb в любом подходящем положении, таком как аминоконец, карбоксильный конец или подходящие аминокислотные боковые цепи (например, -аминогруппа лизина или тиольная группа цистеина). Альтернативно, лекарственное средство или агент могут быть нековалентно связаны с dAb прямо (например, электростатическое взаимодействие, гидрофобное взаимодействие) или опосредованно (например, посредством нековалентного связывания комплементарных партнеров по связыванию (например, биотина и авидина), где один партнер ковалентно связан с лекарственным средством или агентом, и комплементарный партнер по связыванию ковалентно связан с dAb). В изобретении также предложен (по существу) чистый мономер любого из конъюгатов или продуктов слияния по изобретению, например, DAT0114, DAT0115, DAT0116, DAT0117, DAT0118, DAT0119 иDAT120, DMS7139, или DMS7143, или DMS7143. В одном воплощении он представляет собой по меньшей мере 98, 99, 99,5 или 100% чистого мономера. В изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие продукты слияния, описанные в данной заявке, например, нуклеиновые кислоты, кодирующие DAT0114, DAT0115, DAT0116,DAT0117, DAT0118, DAT0119 и DAT120, DMS7139 или DMS7143, и, например, где последовательности нуклеиновых кислот представлены на фиг. 2 (SEQ ID NO: 13-32). Предложены также клетки-хозяева,которые содержат эти нуклеиновые кислоты. В изобретении также предложены аминокислоты, кодирующие dAbs, которые связываются с сывороточным альбумином (AlbudAbs TM), выбранные из DOM7h-14 (SEQ ID NO: 8), DOM7h-14-10 (SEQ IDNO: 26), DOM7h-11-15 (SEQ ID NO: 27) и DOM7h-14-10R108C (SEQ ID NO: 42). В изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие dAbs, которые связываются с сывороточным альбумином, выбранные из DOM7h-14 (SEQ ID NO: 23), DOM7h-14-10 (SEQ ID NO: 31),DOM7h-11-15 (SEQ ID NO: 32) и DOM7h-14-10R108C (SEQ ID NO: 44). В изобретении также предложен способ получения продукта слияния по настоящему изобретению,включающий поддержание клетки-хозяина, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту и/или конструкцию, которая кодирует продукт слияния по изобретению в условиях, подходящих для экспрессии упомянутой рекомбинантной нуклеиновой кислоты, посредством чего продуцируется продукт слияния. В изобретении также предложены композиции (например, фармацевтические композиции), содержащие продукт слияния или конъюгат по изобретению. В изобретении также предложен способ лечения индивидуума, имеющего заболевание или расстройство, такое как описано в данной заявке, например, метаболическое заболевание, такое как гипергликемия, нарушенная толерантность к глюкозе, дефицит бета-клеток, диабет (например, диабет 1 типа или 2 типа или гестационный диабет) или ожирение, или заболевания, характеризующиеся перееданием,например, его можно использовать для подавления аппетита, например, в случае синдрома ПрадераВилли, и который включает введение упомянутому индивидууму терапевтически эффективного количества продукта слияния или конъюгата по изобретению. Другие метаболические расстройства включают, но не ограничиваются этим, инсулинорезистентность, дефицит инсулина, гиперинсулинемию, гипергликемию, дислипидемию, гиперлипидемию, гиперкетонемию, гипертензию, болезнь коронарных артерий, атерослероз, почечную недостаточность, невропатию (например, автономную невропатию, парасимпатическую невропатию и полиневропатию), ретинопатию, катаракту, метаболические расстройства (например, расстройства метаболизма инсулина и/или глюкозы), эндокринные расстройства, ожирение, потерю массы, расстройства печени (например, заболевание печени, цирроз печени и расстройства, ассоциированные с трансплантацией печени), и состояния,ассоциированные с этими заболеваниями или расстройствами. Кроме того, состояния, ассоциированные с диабетом, которые можно предупредить или лечить соединениями по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются этим, гипергликемию, ожирение, диабетическую ретинопатию, мононевропатию, полиневропатию, атерослероз, язвы, болезни сердца, инсульт, анемию, гангрену (например, на ногах и руках), импотенцию, инфекцию, катаракту,плохую функцию почек, неправильное функционирование вегетативной нервной системы, нарушенную функцию лейкоцитов, туннельный синдром запястья, контрактуру Дюпюитрена и диабетический кетоацитоз. В изобретении также предложены способы лечения или предупреждения заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем глюкозы в крови, включающие введение по меньшей мере одной дозы конъюгатов или продуктов слияния и/или фармацевтических композиций по настоящему изобретению пациенту или субъекту. Изобретение также относится к способам регулирования восприимчивости к инсулину у пациента,а также способам увеличения поглощения глюкозы клеткой и способам регулирования чувствительности клетки к инсулину, с использованием конъюгатов или продуктов слияния по изобретению. Кроме того, предложены способы стимулирования синтеза и высвобождения инсулина, повышения чувствительности жировой, мышечной или печеночной ткани к поглощению инсулина, стимулирования поглощения глюкозы, замедления процесса пищеварения или блокирования секреции глюкагона у пациента, включающие введение указанному пациенту продукта слияния или конъюгата по изобретению,например, включающие введение по меньшей мере одной дозы конъюгата или продукта слияния лекарственных средств и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Продукты слияния или конъюгаты и/или фармацевтические композиции по изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с другими молекулами или группировками, например полипептидами, терапевтическими белками и/или молекулами (например, инсулином и/или другими белками (включая антитела), пептидами или небольшими молекулами, которые регулируют чувствительность к инсулину, массу, болезнь сердца, гипертензию, невропатию, клеточный метаболизм и/или уровни глюкозы,инсулина или других гормонов у пациента). В конкретных воплощениях конъюгаты или продукты слияния по изобретению вводят в комбинации с инсулином (или производным, аналогом, слитым белком или средством, усиливающим секрецию инсулина). В изобретении также предложено применение конъюгата или продукта слияния по изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, такого как любое из вышеупомянутых, например, метаболическое расстройство, такое как гипергликемия, диабет (1 или 2 типа или гестационный диабет) или ожирение. Изобретение также относится к применению продукта слияния или конъюгата, как описано в данной заявке, для применения в терапии, диагностике или профилактике. Продукты слияния или конъюгаты по изобретению, например, dAb компонент продукта слияния может быть дополнительно сформатирован для получения большего гидродинамического размера для последующего увеличения периода полувыведения, например, путем присоединения группы ПЭГ, сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его трансферринсвязывающей части, Fc-области антитела или путем конъюгирования с доменом антитела. Например,dAb, которое связывает сывороточный альбумин, может быть сформатировано в виде более крупного антиген-связывающего фрагмента антитела (например, сформатировано в виде Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2,IgG, scFv). В других воплощениях изобретения, описанных в данном описании, вместо применения "dAb" в продукте слияния по изобретению предполагается, что специалист может использовать домен, который содержит CDRs из dAb, например, CDRs из DOM7h-14, DOM7h-14-10 или DOM7h-11-15, которое связывает сывороточный альбумин (например, CDRs, перенесенные на подходящий белковый каркас или скелет, например, аффитело, SpA каркас, домен рецептора LDL класса А или домен EGF). Описание в целом следует истолковывать соответствующим образом для того, чтобы обеспечить описание таких доменов вместо dAb. В некоторых воплощениях в изобретении предложен продукт слияния или конъюгат согласно изобретению, которые содержат инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство и лиганд с двойной специфичностью или полиспецифический лиганд, который содержит первое dAb согласно изобретению, которое связывает сывороточный альбумин, например, DOM7h-14, DOM7h-14-10 илиDOM7h-11-15, и второе dAb, которое имеет такую же или другую специфичность связывания по сравнению с первым dAb и возможно, в случае полиспецифических лигандов, дополнительные dAbs. ВтороеdAb (или дополнительные dAbs) возможно могут связывать другую мишень, например, FgFr 1c или CD5 мишень. Таким образом, в одном аспекте в изобретении предложены продукты слияния или конъюгаты по изобретению для доставки посредством парентерального введения, например, посредством подкожной,внутримышечной или внутривенной инъекции, ингаляции, интраназальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента, ректальной доставки или доставки в глаза. В одном аспекте в изобретении предложено применение продуктов слияния или конъюгатов по изобретению в изготовлении лекарственного средства для доставки посредством подкожной инъекции, ингаляции, внутривенной доставки, интраназальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в ЖК тракт пациента, ректальной доставки или доставки в глаза. В одном аспекте в изобретении предложен способ доставки пациенту посредством подкожной инъекции, доставки в легкие, внутривенной доставки, интраназальной доставки, трансмукозальной доставки,пероральной доставки, доставки в желудочно-кишечный тракт пациента, ректальной доставки или доставки в глаза, включающий введение пациенту фармацевтически эффективного количества продукта слияния или конъюгата по изобретению. В одном аспекте в изобретении предложен препарат для пероральной доставки, доставки посредством инъекции, ингаляции, небулайзера или доставки в глаза, содержащий продукт слияния или конъюгат по изобретению. Препарат может представлять собой таблетку, пилюлю, капсулу, жидкость или сироп. В одном аспекте композиции можно вводить перорально, например, в виде напитка, например, продаваемого в виде напитка для снижения массы тела для лечения ожирения. В одном аспекте в изобретении предложен препарат для ректальной доставки пациенту, который может быть предложен, например, в виде суппозитория. Композиция для парентерального введения GLP-1 соединений может быть приготовлена, например,как описано в WO 03/002136 (включенной в данную заявку посредством ссылки). Композиция для интраназального введения некоторых пептидов может быть приготовлена, например, как описано в Европейском патенте 272097 (на имя Novo Nordisk A/S) или в WO 93/18785 (все включено в данную заявку посредством ссылки). Термин "субъект" или "индивидуум" определен в данной заявке как включющий животных, таких как млекопитающие, включая, но не ограничиваясь этим, приматов (например, людей), коров, овец, коз,лошадей, собак, кошек, кроликов, морских свинок, крыс, мышей или других видов крупного рогатого скота, овец, лошадей, собак, кошек, грызунов или мышей. В изобретении также предложен набор для применения при введении композиций согласно изобретению (например, конъюгатов или продуктов слияния по изобретению) субъекту (например, пациенту),содержащий композицию (например, конъюгат или продукт слияния по изобретению), устройство для доставки лекарственного средства и возможно инструкции по применению. Композиция (например,конъюгат или продукт слияния) может быть предложена в виде препарата, такого как лиофилизированный препарат. В некоторых воплощениях устройство для доставки лекарственного средства выбрано из группы, состоящей из шприца, ингалятора, устройства для интраназального введения или введения в глаза (например, генератора тумана, капельницы для глаз или носа) и устройства для безыгольной инъекции. Композиции (например, конъюгаты или слияния) по данному изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Может быть использован любой подходящий способ лиофилизации (например, сушка распылением, сушка до твердого остатка (cake drying и/или методы восстановления. Специалистам в данной области понятно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различным степеням потери активности антител и что уровни применения могут быть скорректированы для компенсации. В конкретном воплощении в изобретении предложена композиция, содержащая лиофилизированную (высушенную замораживанием) композицию (например, конъюгат лекарственного средства, продукт слияния лекарственного средства), как описано в данной заявке. Предпочтительно лиофилизированная (высушенная замораживанием) композиция (например, конъюгат лекарственного средства, продукт слияния лекарственного средства) теряет не более чем примерно 20%, или не более чем примерно 25%, или не более чем примерно 30%, или не более чем примерно 35%, или не более чем примерно 40%, или не более чем примерно 45%, или не более чем примерно 50% своей активности (например, связывающей активности в отношении сывороточного альбумина) при регидратации. Активность представляет собой количество композиции (например,конъюгата лекарственного средства, слияния лекарственного средства), необходимое для получения эффекта композиции перед тем, как она была лиофилизирована. Например, количество конъюгата или продукта слияния, необходимое для достижения и поддержания желаемой концентрации в сыворотке в течение желаемого периода времени. Активность композиции (например, конъюгата лекарственного средства, продукта слияния лекарственного средства) можно определить с использованием любого подходящего способа до лиофилизации, и активность можно определить с использованием того же способа после регидратации для определения потерянной активности. В изобретении также предложены композиции с замедленным высвобождением, содержащие продукты слияния или конъюгаты по изобретению, где композиции с замедленным высвобождением могут содержать продукт слияния или конъюгат по изобретению в комбинации, например, с гиалуроновой кислотой, микросферами или липосомами и другими фармацевтически или фармакологически приемлемыми носителями, эксципиентами и/или разбавителями. Такие композиции с замедленным высвобождением могут находиться в форме, например, суппозиториев. В одном аспекте в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая продукт слияния или конъюгат по изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель,эксципиент или разбавитель. В изобретении также предложена модифицированная лидерная последовательность, которая имеет на своем С-конце аминокислотную последовательность АМА или AWA, где лидерная последовательность не является последовательностью дикого типа. Модифицированная лидерная последовательность может представлять собой OmpA-АМА или -AWA; или OmpT-AMA или-AWA; или GAS-AMA или AWA. Модифицированная лидерная последовательность может быть использована для экспрессии гете-5 021146 рологичного полипептида в клетке-хозяине. Гетерологичный полипептид может содержать или состоять из инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства. Гетерологичный полипептид может содержать или состоять из доменного антитела (dAb), например dAb, которое связывает сывороточный альбумин. Гетерологичный полипептид для экспрессии с помощью модифицированной лидерной последовательности может представлять продукт слияния или конъюгат, содержащий или состоящий из (а) инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства, присутствующего в виде продукта слияния или конъюгата с (б) dAb, например dAb, которое связывает сывороточный альбумин, напримерdAb, выбранным из Vk доменного антитела (dAb) DOM7h-14, которое связывает сывороточный альбумин и которое имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1(h) (SEQ ID NO: 8),DOM7h-14-10 dAb, которое имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1(о)(SEQ ID NO: 26), и DOM7h-11-15 dAb, которое имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1(р) (SEQ ID NO: 27). Модифицированная лидерная последовательность также может быть использована для экспрессии гетерологичного полипептида, который содержит или состоит из продукта слияния, выбранного из следующего:(а) продукт слияния 2(GLP)-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb (DAT0114, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(a): SEQ ID NO: 1),(б) продукт слияния эксендина-4 (G4S линкер)3 DOM7h-14 dAb (DAT0115, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(b): SEQ ID NO: 2),(в) продукт слияния эксендина-4 - DOM7h-14 dAb (DAT0116, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(c): SEQ ID NO: 3),(г) продукт слияния эксендина-4, спирального линкера, DOM7h-14 dAb (DAT0117, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(d): SEQ ID NO: 4),(д) продукт слияния GLP-1 (7-37) A8G (G4S линкер)3 DOM7h-14 dAb (DAT0118, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(e): SEQ ID NO: 5),(е) продукт слияния GLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb (DAT0119, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(f): SEQ ID NO: 6),(ж) продукт слияния GLP-1 (7-37) A8G, спирального линкера, DOM7h-14 dAb (DAT0120, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(g): SEQ ID NO: 7),(з) продукт слияния эксендина-4, (G4S)3 линкера, DOM7h-14-10 (DMS7139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(m): SEQ ID NO: 24),(и) продукт слияния эксендина-4, (G4S)3 линкера, DOM7h-11-15 (DMS7143, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(n): SEQ ID NO: 25). Гетерологичный полипептид, подлежащий экспрессии с помощью модифицированной лидерной последовательности, также может содержать или состоять из молекул конъюгата с аминокислотными последовательностями, описанными выше, т.е. с аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID NO: 1-7 и SEQ ID NO: 24-25. Гетерологичный полипептид, подлежащий экспрессии с помощью модифицированной лидерной последовательности, также может содержать или состоять из аминокислотной последовательности продукта слияния эксендина-4, (G4S)3 линкера, DOM7h-14-10 (DMS7139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(m): SEQ ID NO: 24), или молекулы продукта слияния или конъюгата, которая имеет вплоть до 4 изменений аминокислот в аминокислотной последовательности DMS7139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(m). Клетка-хозяин для экспрессии может представлять собой микробную клетку-хозяина, прокариотическую клетку-хозяина, грамотрицательную бактериальную клетку-хозяина или Е. coli клетку-хозяина. Также предложен способ получения смеси (1) инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства; и (2) инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства без 2 аминокислот на N-конце инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства; включающий стадию экспрессирования (1) в клетке-хозяине с использованием лидерной последовательности,которая приводит к расщеплению перед положением 1 и расщеплению перед положением 3 инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства. Инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство может находиться в форме продукта слияния или конъюгата, например, с dAb,которое связывает сывороточный альбумин, как определено выше. В изобретении также предложены смеси, полученные или получаемые способом, описанным выше. Лидерная последовательность может представлять собой ompA, ompT, GAS или любую из модифицированных последовательностей, описанных выше. Способ может включать стадию продуцирования смеси в клетке-хозяине посредством гетерологичной экспрессии. Клетка-хозяин может представлять собой микробную клетку-хозяина, прокариотическую клетку-хозяина, грамотрицательную бактериальную клетку-хозяина или клетку-хозяина Е. coli. Инсулинотропные агенты и инкретиновые лекарственные средства, такие как GLP-1, имеют широкий спектр терапевтических эффектов, которые могут опосредоваться через GLP-1R (такие как эффекты,-6 021146 стимулирующие глюкозозависимую секрецию инсулина из поджелудочной железы). Также предположили, что имеется класс эффектов, которые могут опосредоваться продуктом расщепления DPPIV, GLP-1 936 амидом (или GLP-1 9-37). GLP-1 9-37 не является активным при стимуляции глюкозочувствительной секреции инсулина из поджелудочной железы, но, по-видимому, оказывает другие биологические эффекты, возможно, посредством механизма, не связанного с GLP-1R. Поскольку на сегодняшний день большинство клинических применений молекул класса GLP-1 нацелены на диабет, через GLP-1R поджелудочной железы, устойчивость к DPPIV была разработана в пептидах, либо с использованием нечеловеческого аналога GLP-1, такого как эксендин-4, либо посредством мутирования аминокислот 8 или 9 вGLP-1, таких как использованы в Albiglutide (Syncria), или посредством химических или синтетических модификаций на аминоконце пептида. Дополнительный подход заключался в глобальной блокаде активности DPPIV с использованием низкомолекулярных ингибиторов DPPIV, таких как вилдаглиптин (Galvus) и ситаглиптин (Januvia), которая пролонгирует период полувыведения любого эндогенного секретируемого GLP-1. Оба этих подхода эффективно уменьшают уровень DPPIV метаболита GLP-1 9-36 амида или GLP-1 9-37. Однако предположили, что DPPIV метаболит GLP-1 9-36 амид или GLP-1 9-37 оказывают желательный биологический эффект. Несколько исследований показали, что продукт расщепления DPPIVGLP-1 7-36 амид, а именно GLP-1 9-36 амид, который быстро образуется после секреции GLP-1 7-36 и является более обильным в нормальных условиях, чем GLP-1 7-37, может оказывать биологический эффект. Для этого механизма было предложено несколько различных путей действия, как указано ниже.GLP-1(9-37) представляет собой антагонист GLP-1R (см., например, Eur J Pharmacol. 1996 Dec 30; 318(23):429-35). Глюкагоноподобный пептид-1-(9-36) амид является основным метаболитом глюкагоноподобного пептида-1-(7-36) амида после введения in vivo собакам и действует в качестве антагониста на панкреатический рецептор (Knudsen L.B., Pridal L. J Biol Chem. 1997 Aug 22; 272(34): 21201-6) и высокоактивные антагонисты панкреатического рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (Montrose-Rafizadeh С., YangGLP-1 (9-37) передает сигнал посредством другого механизма на GLP-1 (7-37), посредством инсулиннезависимого механизма (Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002 Apr; 2, 82(4):E873-9). GLP-1-(9-36) амид уменьшает уровень глюкозы в крови у анестезированных свиней посредством механизма, который не вовлекает секрецию инсулина (Deacon C.F., Plamboeck A., Moller S., Hoist J.J.). Или посредством увеличения чувствительности к инсулину у лиц, страдающих ожирением (ObesityGLP-1 (9-36) амид, продукт расщепления GLP-1 (7-36) амида, является глюкорегуляторным пептидом (Elahi D., Egan J.M., Shannon R.P., Meneilly G.S., Khatri A., Habener J.F., Andersen D.K.). Эта активность не была показана для типов эксендина без двух аминокислот, поскольку они не образовывались в результате DPPIV расщепления, но возможно, что это также может быть в случае разновидностей эксендина-4 без двух аминокислот. Также было показано, что эксендин-4 действует черезMansoor Husain, MD). Это повышает вероятность того, что действительно могут быть сходные и параллельные активности как для полноразмерного эксендина, так и для форм эксендина без двух аминокислот. По меньшей мере, имеются два пути продуцирования смесей инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства и вариантов без двух аминокислот. Например, возможно раздельное продуцирование полноразмерного GLP-1 7-36 амида (в желательном формате с пролонгированным периодом полувыведения, таком как AlbudAb) и GLP-1 9-36 амид (или желательный слитый белок). Затем они могут быть смешаны с получением продукта с желательным соотношением молекул GLP-1 7-36 иGLP-1 9-36. Для получения смеси лекарственных средств можно использовать два параллельных GMP процесса. Альтернативный способ заключается в выборе сигнала секреции, для которого сигнальный пептидазный фермент, ответственный за удаление сигнальной последовательности, имеет не один сайт расщепления, а скорее два сайта расщепления. Их разрезают в соотношении, определяемом используемым сигналом секреции. Таким образом, в зависимости от выбранного сигнала секреции полученное соотношение может представлять собой 100% расщепление перед положением 1 с получением GLP-1 7-36 (или полноразмерной молекулы другого инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства); или 100% расщепление перед положением 3 с получением GLP-1 9-36 (или аминокислотной последовательности другого инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства минус две аминокислоты); или любой % от 0 до 100 для каждого полноразмерного варианта или вариантов минус две аминокислоты. Например, соотношение может представлять собой 90% полноразмерный:10% минус 2 аминокислоты; 80% полноразмерный:20% минус 2 аминокислоты; 75% полноразмерный:25% минус 2 аминокислоты; 50% полноразмерный:50% минус 2 аминокислоты; 25% полноразмерный:75% минус 2 аминокислоты; 20% полноразмерный:80% минус 2 аминокислоты; или 10% полноразмерный:90% минус 2 аминокислоты. Выбор подходящей лидерной последовательности для получения желательного соотношения позволит продуцировать из одной клетки-хозяина. Это является ключевым преимуществом с точки зренияGMP процесса. Это позволяет эксплуатировать потенциальные терапевтические эффекты обеих форм при сохранении устойчивости к эндогенным ферментам. Целый ряд других эндогенных пептидов и аналогов также подвергаются обработке аминоконцевыми дипептидазами, давая первоначальную полноразмерную молекулу и/или чувствительную к дипептидазе форму. Таким образом, этот подход может быть полезен для продукции любых пептидов и белка,где один раунд получения может давать определенную смесь двух форм, отличающихся в длину на несколько аминокислот, где различные аминокислоты содержат часть сайта распознавания для сигнальной пептидазы. Применение этого процесса возможно в клетках-хозяевах млекопитающих, эукариотических или прокариотических клетках-хозяевах, например в Е. coli. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 представляет иллюстрацию аминокислотных последовательностей (a) DAT0114 (SEQ ID NO: 1), (b) DAT0115 (SEQ ID NO: 2), (c) DAT0116 (SEQ ID NO: 3), (d) DAT0117 (SEQ ID NO: 4), (e) DAT0118NO: 28), (r) DOM7h-14-10R108C (SEQ ID NO: 42), (s) PYY 3-36 (с лизином в положении 10) (SEQ ID NO: 43). Фиг. 2 представляет иллюстрацию последовательностей нуклеиновых кислот: (a) DAT0114 (конструкция млекопитающего) (SEQ ID NO: 13), (b) DAT0115 (конструкция млекопитающего) (SEQ ID NO: 14), (с) DAT0115 (отимизировано для конструкции Е. coli) (SEQ ID NO: 15), (d) DAT0116 (конструкция млекопитающего) (SEQ ID NO: 16), (e) DAT0116 (оптимизировано для конструкции E. coli) (SEQ ID NO: 17), (f) DAT0117 (конструкция млекопитающего) (SEQ ID NO: 18), (g) DAT0117 (оптимизировано для конструкции E.coli) (SEQ ID NO: 19), (h) DAT0118 (конструкция млекопитающего) (SEQ ID NO: 20), (i)NO: 30), (n) DOM7h-14-10 (SEQ ID NO: 31) (dAb), (o) DOM7h-11-15 (SEQ ID NO: 32) (dAb), (p) сигнальный пептид Omp AWA (SEQ ID NO: 33), (q) DOM7h-14-10 R108C (dAb) (SEQ ID NO: 44), (r) кДНК яванского макака (SEQ ID NO: 45), (s) олигонуклеотид 1 (SEQ ID NO: 47), (t) олигонуклеотид 2 (SEQ ID NO: 48), (u) последовательность нуклеиновой кислоты DMS7139 для экспрессии в Е. coli (SEQ ID NO: 50). На фиг. 3 (а) показано дозозависимое уменьшение массы тела в мышиной модели ожирения при введении DAT0115, (b) показано суточное потребление пищи в мышиной модели ожирения при введении DAT0115. На фиг. 4 показана DSC (дифференциальная сканирующая калориметрия) DAT0115: сплошная линия - кривая для DAT0115, пунктирная линия соответствует необратимой модели двух состояний (non-2state model). На фиг. 5 показана DSC лизоцима: сплошная линия - кривая для лизоцима, пунктирная линия - соответствует необратимой модели двух состояний (non-2-state model) (кривые перекрываются, поэтому пунктирная линия не видна). На фиг. 6 показаны SEC MALLS (гель-фильтрация/многоугловое лазерное светорассеяние) дляDAT0115. На фиг. 7 показаны SEC MALLS для DAT0117. На фиг. 8 показаны SEC MALLS для DAT0120. На фиг. 9 показаны аминокислотные последовательности лидерных последовательностей: (а) ompA(Erwinia carotovora) (SEQ ID NO: 46), (j) Mai E (искусственная последовательность) (SEQ ID NO: 49). На фиг. 10 показано очищенное DMS7139, анализируемое с помощью масс-спектрометрии. На фиг. 11 показана статистически значимое снижение уровня глюкозы в крови, включающее сравнение между DAT0115 и контролем, DMS7139 и контролем и между DMS7139 и DAT0115, (а) показана схема исследования, и (b) графическое представление AUC для глюкозы. Доверительные интервалы, которые не перекрываются с горизонтальной линией, являются значимыми. На фиг. 12 показано, что повторная доза DMS7139 демонстрирует дозозависимое снижение HbA1c(гликозилированный гемоглобин) по сравнению с DOM7h-14 контролем. На фиг. 13 показано, что DAT0115 и DMS7139 демонстрирует дозозависимое уменьшение потребления пищи и массы тела по сравнению с DOM7h-14 контролем в мышиной модели DIO-ожирения (ожирения, индуцированной диетой). На графике мкг= микрограммы. На фиг. 14 показан пептидный конъюгат, который представлет собой DOM7h-14-10 (R108C) AlbudAb, конъюгированное с амидированным по С-концу PYY3-36 посредством лизина (введенного в положение 10 PYY) и линкера из 4 повторов ПЭГ. Линия представляет собой линкер, который ковалентно присоединен к свободному С-концевому цистеину DOM7h-14-10 (R108C) AlbudAb и лизину в положении 10 последовательности PYY. На фиг. 15 показано, что DMS7605 демонстрирует дозозависимое уменьшение массы тела по сравнению с контролем-растворителем. Подробное описание изобретения В пределах данного описания изобретение было описано со ссылкой на воплощения таким образом,чтобы сделать данное описание ясным и точным. Предполагается и следует понимать, что воплощения можно различным образом комбинировать или разделять, не выходя за рамки изобретения. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данной заявке,имеют такое же значение, как и обычно понятное специалисту в данной области (например, в культуре клеток, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, методах гибридизации и биохимии). Для молекулярных, генетических и биохимических способов используют стандартные методы (см. в основном Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor LaboratoryWileySons, Inc., которые включены в данную заявку посредством ссылки) и химические методы. Термин "инсулинотропный агент", используемый в данной заявке, означает соединение, которое способно стимулировать, или вызывать стимуляцию, синтез или экспрессию, или активность гормона инсулина. Известные примеры инсулинотропных агентов включают, но не ограничиваются этим, например, глюкозу, GIP, GLP, эксендин (например, эксендин-4 и эксендин-3), PYY и ОХМ. Термин "инкретин", используемый в данной заявке, означает тип желудочно-кишечного гормона,который вызывает увеличение количества высвобождаемого инсулина при нормальных уровнях глюкозы или, в частности, когда они повышаются. В качестве примера они включают GLP-1, GIP, ОХМ, PYY (например, PYY 3-36), VIP и РР (панкреатический полипептид). Термин "аналог", используемый в данной заявке, относящийся к полипептиду, означает модифицированный пептид, где один или более аминокислотных остатков пептида были заменены другими аминокислотными остатками, и/или где один или более аминокислотных остатков были делетированы из пептида, и/или где один или более аминокислотных остатков были добавлены к пептиду. Такое добавление или такая делеция аминокислотных остатков могут иметь место на N-конце пептида и/или на С-конце пептида, или они могут иметь место в пределах пептида. Для описания аналогов GLP-1 используют простую систему: например, GLP-1 A8G (аминокислоты 7-37) означает аналог GLP-1, где природный аланин в положении 8 был заменен остатком глицина. Формулы пептидных аналогов и их производных изображены с использованием стандартной однобуквенной аббревиатуры для аминокислот, используемой согласно номенклатуре IUPAC-IUB. Как использовано в данной заявке, "фрагмент", когда используется в ссылке на полипептид, означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является частью аминокислотной последовательности полноразмерного природного полипептида. Фрагменты могут быть "отдельно расположенными" или находящимися в пределах более крупного полипептида, из которого они образуют часть или участок в виде единого непрерывного участка в одном более крупном полипептиде. Так,например, фрагмент природного GLP-1 будет включать аминокислоты 7-36 из природных аминокислот 1-36. Кроме того, фрагменты полипептида также могут быть вариантами природной частичной последовательности. Например, фрагмент GLP-1, содержащий аминокислоты 7-30 природного GLP-1, также может быть вариантом, имеющим аминокислотные замены в пределах его частичной последовательности. Примеры подходящих инсулинотропных агентов по изобретению включают GLP-1, производныеGLP-1, аналоги GLP-1 или производное аналога GLP-1. Кроме того, они включают эксендин-4, аналоги эксендина-4 и производные или фрагменты эксендина-4, и эксендин-3, производные эксендина-3 и аналоги эксендина-3. Термин "GLP-1", используемый в данной заявке, означает GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-35),GLP-1 (7-38), GLP-1 (7-39), GLP-1 (7-40), GLP-1 (7-41), аналог GLP-1, пептид GLP-1, производное, или мутант, или фрагмент GLP-1, или производное аналога GLP-1. Такие пептиды, мутанты, аналоги и производные представляют собой инсулинотропные агенты. Например, GLP-1 может представлять собой мутант GLP-1 (7-37) A8G с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 1(i): SEQ ID NO: 9. Другие аналоги GLP-1 описаны в международной патентной заявке 90/11296 (The General Hospital Corporation), которая относится к пептидным фрагментам, которые содержат GLP-1 (7-36) и его функциональные производные и имеют инсулинотропную активность, которая превышает инсулинотропную активность GLP-1 (1-36) или GLP-1 (1-37), и к их применению в качестве инсулинотропных агентов(включенных в данную заявку посредством ссылки, в частности, посредством примеров лекарственных средств для применения в настоящем изобретении). В международной патентной заявкеWO 91/11457 (Buckley et al.) описаны аналоги активных пептидов GLP-1 7-34, 7-35, 7-36 и 7-37, которые могут быть полезны в качестве GLP-1 лекарственных средств согласно настоящему изобретению. Термин "эксендин-4 пептид", используемый в данной заявке, означает эксендин-4 (1-39), аналог эксендина-4, фрагмент пептида эксендина-4, производное эксендина-4 или производное аналога эксендина 4. Такие пептиды, фрагменты, аналоги и производные представляют собой инсулинотропные агенты. Аминокислотная последовательность эксендина-4 (1-39) представлена на фиг. 1(j) SEQ ID NO: 10. Дополнительные аналоги эксендина, которые полезны для настоящего изобретения, описаны в РСТ патентных публикациях WO 99/25728 (Beeley et al.), WO 99/25727 Beeley et al.), WO 98/05351 (Young etal.), WO 99/40788 (Young et al.), WO 99/07404 (Beeley et al.) и WO 99/43708 (Knudsen et al.) (все включены в данную заявку посредством ссылки, в частности, посредством примеров лекарственных средств для применения в настоящем изобретении). Как использовано в данной заявке, "пептид" относится к аминокислотам в количестве от примерно 2 до примерно 50, которые соединены между собой с помощью пептидных связей. Как использовано в данной заявке, "полипептид" относится по меньшей мере к примерно 50 аминокислотам, которые соединены между собой с помощью пептидных связей. Полипептиды обычно содержат третичную структуру и сворачиваются в функциональные домены. Как использовано в данной заявке, "дисплейная система" относится к системе, в которой коллекция полипептидов или пептидов доступна для селекции на основе желаемой характеристики, такой как физическая, химическая или функциональная характеристика. Дисплейная система может представлять собой подходящий репертуар полипептидов или пептидов (например, в растворе, иммобилизованном на подходящем носителе). Дисплейная система также может представлять собой систему, которая использует клеточную систему экспрессии (например, экспрессию библиотеки нуклеиновых кислот, например, в трансформированных, инфицированных, трансфицированных или трансдуцированных клетках и дисплей кодируемых полипептидов на поверхности клеток) или бесклеточную систему экспрессии (например,компартментализацию и дисплей с использованием эмульсии). Примерные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. При использовании такой дисплейной системы могут быть выбраны полипептиды или пептиды, которые имеют желаемые физические, химические и/или функциональные характеристики, и нуклеиновая кислота, кодирующая выбранный полипептид или пептид, может быть легко выделена или извлечена. Число дисплейных систем, которые связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, известны в данной области техники,например, бактериофаговый дисплей (фаговый дисплей, например, фагмидный дисплей), рибосомный дисплей, компартментализация и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, дисплей на плазмиде, ковалентный дисплей и тому подобное(Griffiths et al Как использовано в данной заявке, "функциональный" описывает полипептид или пептид, который имеет биологическую активность, такую как специфическая связывающая активность. Например, термин"функциональный полипептид" включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном с помощью его антигенсвязывающего сайта. Как использовано в данной заявке, "целевой лиганд" относится к лиганду, который специфически или селективно связывается полипептидом или пептидом. Например, когда полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, целевой лиганд может представлять собой любой желаемый антиген или эпитоп. Связывание с целевым антигеном зависит от того, является полипептид или пептид функциональным. Как использовано в данной заявке, антитело относится к IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или фрагменту(такому как Fab, F(ab')2, Fv, дисульфид-связанный Fv, scFv, полиспецифическое антитело с закрытой конформацией, дисульфид-связанный scFv, диатело), независимо от того, происходят ли они из видов,естественно продуцирующих антитело, или созданы с помощью технологии рекомбинантных ДНК; или выделены из сыворотки, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий. Как использовано в данной заявке, "антительный формат" относится к любой подходящей полипептидной структуре, в которой один или более вариабельных доменов антитела могут быть встроены таким образом, чтобы придать специфичность связывания в отношении антигена на структуре. Разнообразие подходящих форматов антитела известны в данной области техники, таких как химерные антитела, гу- 10021146 манизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых и/или легких цепей антитела, антигенсвязывающие фрагменты любого из вышеперечисленных (например, Fv-фрагмент(например, одноцепочечные Fv (scFv), дисульфид-связанные Fv), Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2 фрагмент), единичный вариабельный домен антитела (например, dAb, VH, VHH, VL) и модифицированные варианты любого из вышеуказанного (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера или гуманизированный VHH). Фраза "единичный вариабельный домен иммуноглобулина" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH, VL), который специфически связывает антиген или эпитоп, независимо от других Vобластей или доменов. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина может присутствовать в формате (например, гомо- или гетеро-мультимера) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для антигенного связывания единичным вариабельным доменом иммуноглобулина (т.е. когда единичный вариабельный домен иммуноглобулина связывает антиген независимо от дополнительных вариабельных доменов). "Доменное антитело" или "dAb" представляет собой то же самое, что и термин "единичный вариабельный домен иммуноглобулина", используемый в данной заявке. "Единичный вариабельный домен иммуноглобулина" представляет собой то же самое, что и термин "единичный вариабельный домен иммуноглобулина", используемый в данной заявке. "Единичный вариабельный домен антитела" представляет собой то же самое, что и термин "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен", используемый в данной заявке. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой в одном воплощении вариабельный домен человеческого антитела, но также включает единичные вариабельные домены антитела из других видов, таких как VHH dAbs грызунов (например, как описано в WO 00/29004, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте), акулы-няньки и верблюдовых. Верблюжьи VHH представляют собой полипептиды иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, которые происходят из видов, включающих верблюда, ламу, альпака, дромадера и гуанако, которые продуцируют антитела из тяжелых цепей, естественно лишенные легких цепей. VHH могут быть гуманизированными."Домен" представляет собой свернутую белковую структуру, которая имеет третичную структуру,независимую от остального белка. Как правило, домены отвечают за определенные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без потери функции оставшегося белка и/или домена. "Единичный вариабельный домен антитела" представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Поэтому он включает полноразмерные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более петель заменены последовательностями, которые не характерны для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые были укорочены или содержат N- или С-концевые удлинения, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена. Термин "библиотека" относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет одну полипептидную или нуклеиновокислотную последовательность. В этом смысле "библиотека" является синонимом термина "репертуар". Различия последовательностей между членами библиотеки отвечают за разнообразие, присутствующее в библиотеке. Библиотека может принимать форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть в форме организмов или клеток, например, бактерий, вирусов, животных или растительных клеток и тому подобного, трансформированных библиотекой нуклеиновых кислот. В одном воплощении каждый индивидуальный организм или клетка содержит только один или ограниченное число членов библиотеки. В одном воплощении нуклеиновые кислоты включены в экспрессирующие векторы с целью обеспечения экспрессии полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами. Поэтому в одном аспекте библиотека может принимать форму популяции организмов-хозяев, где каждый организм содержит одну или более копий экспрессирующего вектора, содержащего один член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может экспрессироваться для получения его соответствующего полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев имеет потенциал для кодирования большого репертуара разнообразных полипептидов. Используемый в данной заявке термин "доза" относится к количеству продукта слияния или конъюгата, вводимого субъекту единовременно (единица дозы) или за два или более введений в течение определенного временного интервала. Например, доза может относиться к количеству продукта слияния или конъюгата, вводимого субъекту в течение одних суток (24 ч) (суточная доза), двух суток, одной недели,двух недель, трех недель или одного или более месяцев (например, посредством одного введения или посредством двух или более введений). Интервал между дозами может составлять любое желаемое количество времени. Фраза "период полувыведения" относится к времени, необходимому для уменьшения на 50% концентрации продукта слияния или конъюгата в сыворотке или плазме in vivo, например, благодаря деградации и/или выведению или секвестрации природными механизмами. Продукты слияния или конъюгаты по изобретению стабилизированы in vivo, и их период полувыведения увеличен посредством связывания с молекулами сывороточного альбумина, например, человеческим сывороточным альбумином (HSA),которые демонстрируют устойчивость к деградации и/или выведению или секвестрации. Эти молекулы сывороточного альбумина представляют собой природные белки, которые сами по себе имеют продолжительный период полувыведения in vivo. Период полувыведения молекулы увеличивается, если его функциональная активность сохраняется in vivo в течение более продолжительного периода времени,чем у подобной молекулы, которая не является специфической в отношении молекулы, увеличивающей период полувыведения. Например, продукт слияния или конъюгат по изобретению, содержащие dAb,специфическое в отношении человеческого сывороточного альбумина (HSA), и инкретиновое лекарственное средство или инсулинотропный агент, такие как GLP-1 или эксендин, сравнивают с таким же лигандом, у которого специфичность к HSA отсутствует, т.е. он не связывает HSA, но связывает другую молекулу. Например, он может связывать третью мишень на клетке. Как правило, период полувыведения увеличивают на 10, 20, 30, 40, 50% или более. Возможны увеличения в диапазоне 2, 3, 4, 5, 10, 20,30, 40, 50, 100, 200, 300 или более относительно периода полувыведения. Альтернативно или дополнительно, возможны увеличения в диапазоне вплоть до 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150,200, 300, 400 относительно периода полувыведения. Как использовано в данной заявке, "гидродинамический размер" относится к кажущемуся размеру молекулы (например, белковой молекулы, лиганда) на основании диффуции молекулы через водный раствор. Диффузию или движение белка через раствор можно преобразовать для получения кажущегося размера белка, где размер задается "радиусом Стокса" или "гидродинамическим радиусом" белковой частицы. "Гидродинамический размер" белка зависит как от массы, так и формы (конформации), так что два белка, имеющих одинаковую молекулярную массу, могут иметь различные гидродинамические размеры на основании общей конформации белка. Расчеты "гомологии", или "идентичности", или "сходства" между двумя последовательностями(термины используются в данной заявке взаимозаменяемо) осуществляются следующим образом. Последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, в одну или обе первую и вторую аминокислотную или нуклеиновокислотную последовательность можно вводить бреши для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности можно не учитывать для целей сравнения). В воплощении длина ссылочной последовательности, выравниваемой для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70, 80, 90, 100% от длины ссылочной последовательности. Аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов затем сравнивают. Когда положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы идентичны по этому положению (как использовано в данной заявке, "гомология" аминокислот или нуклеиновой кислоты эквивалентна "идентичности" аминокислот или нуклеиновой кислоты). Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от числа идентичных положений, общих для этих последовательностей, с учетом числа брешей и длины каждой бреши, которые необходим вводить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Выравнивания аминокислотной и нуклеотидной последовательности и гомология, сходство или идентичность, как определено в данной заявке, могут быть получены и определены с использованием алгоритма BLAST 2 Sequences с использованием параметров по умолчанию (Tatusova, Т. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 774:187-188 (1999. Нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева Изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим продукты слияния по изобретению, которые описаны в данной заявке, например, кодируемые с помощью SEQ ID NO: 13-23. Нуклеиновые кислоты, называемые в данной заявке "выделенными", представляют собой нуклеиновые кислоты, которые были отделены от другого вещества (например, других нуклеиновых кислот,таких как геномная ДНК, кДНК и/или РНК) в их первоначальном окружении (например, в клетках или в смеси нуклеиновых кислот, таких как библиотека). Выделенная нуклеиновая кислота может быть выделена в виде части вектора (например, плазмиды). Нуклеиновые кислоты, называемые в данной заявке "рекомбинантными", представляют собой нуклеиновые кислоты, которые были получены с помощью методологии рекомбинантных ДНК, включая методы, которые основаны на искуственной рекомбинации, такие как клонирование в вектор или хромосому с использованием, например, рестрикционных ферментов, гомологичной рекомбинации, вирусов и тому подобного, и нуклеиновых кислот, полученных с использованием полимеразной цепной реакции(ПЦР). Изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяину, например, клетке млекопитающего или микробной клетке, которая содержит (одну или более чем одну) рекомбинантную нуклеиновую кислоту или экспрессирующую конструкцию, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую продукт слияния по изобретению, как описано в данной заявке. Также предложен способ получения продукта слияния по изобретению, как описано в данной заявке, включающий поддержание рекомбинантной клетки-хозяина по изобретению, например, клетки млекопитающего или микробной клетки, в условиях, подходящих для экспрессии слитого полипептида. Способ также может включать стадию выделения или извлечения продукта слияния, при необходимости. Например, молекулу нуклеиновой кислоты (т.е. одну или более молекул нуклеиновых кислот), кодирующую слитый полипептид по изобретению или экспрессирующую конструкцию (т.е. одну или более конструкций), содержащую такую(ие) молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, можно вводить в подходящую клетку-хозяина для создания рекомбинантной клетки-хозяина с использованием любого метода,подходящего для выбранной клетки-хозяина (например, трансформации, трансфекции, электропорации,инфекции), так что молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана(ы) с одним или более элементами, регулирующими экспрессию (например, в векторе, в конструкции, созданной с помощью процессов в клетке, интегрированной в геном клетки-хозяина). Полеченную рекомбинантную клеткухозяина можно поддерживать в условиях, подходящих для экспрессии (например, в присутствии индуктора, в подходящем животном, в подходящих культуральных средах, дополненных подходящими солями, ростовыми факторами, антибиотиками, пищевыми добавками и т.д.), посредством чего продуцируется кодируемый пептид или полипептид. При необходимости, кодируемый пептид или полипептид может быть выделен или извлечен (например, из животного, клетки-хозяина, среды, молока). Этот процесс охватывает экспрессию в клетке-хозяине трансгенного животного (см., например, WO 92/03918, GenPharmInternational). Слитые полипептиды по изобретению, описанные в данной заявке, также могут продуцироваться в подходящей системе экспрессии in vitro, например, посредством химического синтеза или любого другого подходящего способа. Как описано и проиллюстрировано в данной заявке, продукты слияния или конъюгаты по изобретению, как правило, связывают сывороточный альбумин с высокой аффинностью. Например, продукты слияния или конъюгаты по изобретению могут связывать человеческий сывороточный альбумин с аффинностью (KD; KD=Koff(kd)/Kon(ka) (как определено методом поверхностного плазмонного резонанса) от примерно от 5 мкмоль до примерно 100 пМ, например, от примерно 1 мкмоль до примерно 100 пМ, например примерно 5-50 нм, например примерно 10-30 нм, например примерно 2030 нм. Продукты слияния или конъюгаты по изобретению могут экспрессироваться в Е. coli или видахPichia (например, P. pastoris), и они также могут экспрессироваться в любых дрожжевых или грибковых клетках. В одном воплощении продукт слияния секретируется в количестве по меньшей мере примерно 0,5 мг/л при экспрессии в Е. coli или видах Pichia (например, Р. pastoris); или в клеточной культуре млекопитающего (например, клетках СНО или HEK 293). Хотя продукты слияния или конъюгаты, описанные в данной заявке, могут секретироваться при экспрессии в Е. coli или видах Pichia или клетках млекопитающих, их можно производить с использованием любого подходящего способа, такого как способы химического синтеза или способы биологического производства, которые не используют Е. coli или видыPichia. В некоторых воплощениях продукты слияния и конъюгаты по изобретению являются эффективными в животных моделях, таких как описанные в WO 2006/059106 (например, на с. 104-105 опубл. WO 2006/059106) или описанные в примерах в данной заявке при введении в эффективном количестве. Как правило, эффективное количество составляет от примерно 0,0001 до примерно 10 мг/кг (например, от примерно 0,001 до примерно 10 мг/кг, например, от примерно 0,001 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 0,1 мг/кг). Модели заболевания известны специалистам в данной области техники как предсказывающие терапевтическую эффективность у людей. Как правило, продукты слияния и конъюгаты по настоящему изобретению будут использоваться в очищенной форме вместе с фармакологически или физиологически подходящими носителями. Обычно эти носители могут включать водный или спиртовой/водный растворы, эмульсии или суспензии, в том числе физиологический раствор и/или забуференную среду. Парентеральные носители могут включать раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия и раствор Рингера с лактатом. Подходящие физиологически приемлемые адъюванты, если необходимо сохранить полипептидный комплекс в суспензии, могут быть выбраны из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты. Внутривенные носители включают жидкости и питательные вещества и электролиты, основанные,например, на декстрозе Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как противомикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). Можно использовать различные подходящие препараты,включая препараты с пролонгированным высвобождением. Путь введения фармацевтических композиций согласно изобретению может быть любым из широко известных специалистам в данной области техники. Для терапии продукты слияния или конъюгаты лекарственных средств по изобретению можно вводить любому пациенту в соответствии со стандартны- 13021146 ми методами. Введение может быть выполнено любым подходящим способом, в том числе парентерально, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, перорально, трансдермально, через легкие или же, соответственно, путем прямой инфузии с помощью катетера. Дозировка и частота введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, одновременного введения с другими лекарственными средствами,противопоказаний и других параметров, принимаемых во внимание врачом. Введение может быть локальным или системным, как указано. В одном воплощении в изобретении предложен препарат для доставки в легкие, который содержит(а) конъюгаты или продукты слияния по изобретению и (б) фармацевтически приемлемый буфер, и где композиция содержит жидкие капли, и примерно 40% или более, например 50% или более, жидких капель, присутствующих в композиции, имеют размер в диапазоне, который составляет менее чем примерно 6 мкм, например, от примерно 1 до примерно 6 мкм, например, менее чем примерно 5 мкм, например,от примерно 1 до примерно 5 мкм. Эти композиции особенно подходят, например, для введения субъекту посредством прямой локальной доставки в легкие. Эти композиции могут быть, например, введены непосредственно в легкие, например, посредством ингаляции, например, с использованием устройства небулайзера. Эти композиции для легочной доставки могут содержать физиологически приемлемый буфер, который имеет диапазон рН от примерно 4 до примерно 8, например, от примерно 7 до примерно 7,5, и вязкость, которая примерно равна вязкости раствора от примерно 2 до примерно 10% ПЭГ 1000 в 50 мМ фосфатном буфере, содержащем 1,2% (мас./об.) сахарозы. Продукты слияния или конъюгаты по данному изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Было показано, что этот метод является эффективным с обычными иммуноглобулинами и могут быть использованы известные в данной области техники методы лиофилизации и восстановления. Специалисту в данной области понятно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различной степени потери активности антитела (например, что касается традиционных иммуноглобулинов, то IgM антитела, как правило, имеют большую потерю активности, чем IgG антитела) и что используемые уровни следует корректировать в большую сторону для компенсации. Для профилактических применений, например, при введении индивидуумам с предиабетом или с инсулинорезистентностью, композиции, содержащие продукты слияния или конъюгаты по настоящему изобретению, также можно вводить в аналогичной или несколько более низкой дозе для предупреждения, ингибирования или замедления начала заболевания (например, для поддержания ремиссии или стабильности, или для предупреждения острой фазы). Опытный врач способен определять подходящий интервал дозировок для лечения, подавления или предупреждения заболевания. При введении продукта слияния или конъюгата по изобретению для лечения, подавления или предупреждения заболевания его можно вводить вплоть до четырех раз в день, двух раз в неделю, одного раза в неделю, одного раза каждые две недели, одного раза в месяц или одного раза каждые два месяца при дозе, например, от примерно 0,0001 до примерно 10 мг/кг (например, от примерно 0,001 до примерно 10 мг/кг, например, от примерно 0,001 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 0,1 мг/кг). Лечение или терапию, выполняемую с использованием композиций, описанных в данной заявке,считают "эффективной", если один или более симптомов уменьшаются (например, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на один пункт по шкале клинической оценки) относительно таких симптомов,присутствующих до лечения, или относительно таких симптомов у индивидуума (человека или модельного животного), которого не лечат такой композицией или другим подходящим контролем. Очевидно,что симптомы будут варьировать в зависимости от точной природы целевого заболевания или расстройства, но могут быть измерены обычным врачом или медицинским работником. Аналогично, профилактика, выполняемая с использованием композиции, описанной в данной заявке, является "эффективной", если появление или тяжесть одного или более симптомов замедляется,уменьшается или отменяется относительно таких симптомов у сходного индивидуума (человека или модельного животного), которого не лечат данной композицией. Продукты слияния и конъюгаты по настоящему изобретению можно использовать в виде отдельно вводимых композиций или их можно вводить вместе с другими терапевтическими или активными агентами, например, другими полипептидами или пептидами или небольшими молекулами. Эти дополнительные агенты могут включать различные лекарственные средства, такие как, например, метформин,инсулин, глитазоны (например, росиглитазон), иммунодепрессанты, иммуностимуляторы. Продукты слияния и конъюгаты по изобретению можно вводить и/или приготавливать в виде препарата вместе с одним или более дополнительными терапевтическими или активными агентами. Когда продукт слияния или конъюгат по изобретению вводят с дополнительным терапевтическим агентом, тогда продукт слияния или конъюгат можно вводить до, одновременно или после введения дополнительного агента. Как правило, продукт слияния или конъюгат по изобретению и дополнительный агент вводят способом, который обеспечивает перекрывание терапевтического эффекта. Период полувыведения Увеличенный период полувыведения инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства, например, GLP-1 или эксендинового лиганда полезен в применениях in vivo. Эта проблема решается в изобретении путем обеспечения увеличенного периода полувыведения инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства, например, GLP и эксендина, in vivo и, следовательно,более продолжительного времени персистенции в теле функциональной активности этих молекул. Как описано в данной заявке, композиции по изобретению (т.е. содержащие продукты слияния или конъюгаты, описанные в данной заявке) могут иметь значительно более пролонгированный период полувыведения из сыворотки или плазмы in vivo и/или увеличенную AUC и/или увеличенное среднее время удержания (MRT) по сравнению с одним только инсулинотропным агентом или инкретиновым лекарственным средством. Кроме того, активность инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства обычно, по существу, не изменяется в композиции по изобретению (например, конъюгата или продукта слияния). Однако некоторое изменение активности композиций по изобретению по сравнению с одним только инсулинотропным агентом или инкретиновым лекарственным средством является приемлемым и обычно компенсируется за счет улучшенных фармакокинетических свойств конъюгатов или продуктов слияния по изобретению. Например, конъюгаты или продукты слияния лекарственных средств по изобретению могут связывать лекарственную мишень с более низкой аффинностью, чем одно только лекарственное средство, но имеют примерно равную или более высокую эффективность по сравнению с одним только лекарственным средством вследствие улучшенных фармакокинетических свойств(например, пролонгированного периода полувыведения из сыворотки in vivo, большей AUC) композиции лекарственного средства. Кроме того, вследствие увеличенного периода полувыведения конъюгатов или продуктов слияния по изобретению их можно вводить менее часто, чем один только инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство, например, их можно давать пациентам один раз в месяц или один раз в неделю, и они также обепечивают более постоянный уровень инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства в крови, чем введение одного только инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства, достигая таким образом желаемого терапевтического или профилактического эффекта. Способы фармакокинетического анализа и определения периода полувыведения лиганда хорошо известны специалистам в данной области (подробности можно найти в Kenneth, A et al. Chemical Stabilityof Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists и в Peters et al., Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Ссылка также сделана на "Pharmacokinetics", M GibaldiD Perron, опубликованную Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982), в которой описаны фармакокинетические параметры, такие как периоды полувыведения t-альфа и t-бета и площадь под кривой (AUC. Периоды полувыведения (t1/2 альфа и t1/2 бета) и AUC и MRT можно определить из кривой концентрации лиганда в сыворотке или плазме относительно времени. Можно использовать пакет аналитических программ WinNonlin (доступный от Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, США), например, для моделирования кривой. В первой фазе (альфа-фазе) лиганд подвергается, главным образом, распределению в организме пациента, с некоторой элиминацией. Вторая фаза (бета-фаза) является конечной фазой,когда лиганд уже распределен и концентрация в сыворотке уменьшается, поскольку лиганд выводится из организма пациента. Период полувыведения t-альфа представляет собой период полувыведения для первой фазы, и период полувыведения t-бета представляет собой период полувыведения для второй фазы. Кроме того, для определения периода полувыведения можно использовать некомпартментную модель,хорошо известную в данной области техники. В одном воплощении в настоящем изобретении предложен продукт слияния или конъюгат согласно изобретению, которые имеют период полувыведения, например, у субъектов-людей в диапазоне примерно 12 ч или более, например, от примерно 12 ч до примерно 21 суток, например, от примерно 24 ч до примерно 21 суток, например, примерно 2-10 суток, например, примерно 3-4 суток. Продукты слияния или конъюгаты по изобретению также могут быть дополнительно сформатированы для того, чтобы иметь больший гидродинамический размер, например, путем присоединения ПЭГ группы, сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его трансферрин-связывающей части, Fc-области антитела или посредством конъюгирования с доменом антитела. Гидродинамический размер может быть определен с использованием способов, которые хорошо известны в данной области техники. Например, гель-фильтрационную хроматографию можно использовать для определения гидродинамического размера лиганда. Подходящие гель-фильтрационные матрицы для определения гидродинамических размеров лигандов, такие как сшитые агарозные матрицы, хорошо известны и легко доступны. Композиции по изобретению, т.е. композиции, содержащие продукты слияния и конъюгаты, описанные в данной заявке, обеспечивают несколько дополнительных преимуществ. Компонент доменное антитело является очень стабильным, небольшим относительно антител и других антигенсвязывающих фрагментов антител, может быть получен с высокими выходами посредством экспрессии в Е. coli или дрожжах (например, Pichia pastoris), и антигенсвязывающие фрагменты антител, которые связывают сы- 15021146 вороточный альбумин, можно легко выбрать из библиотек человеческого происхождения или любых желаемых видов. Соответственно, композиции по изобретению, которые содержат dAb, которое связывает сывороточный альбумин, можно получить легче, чем терапевтические средства, которые обычно получают в клетках млекопитающих (например, человеческие, гуманизированные или химерные антитела),и можно использовать dAbs, которые не являются иммуногенными (например, человеческое dAb можно использовать для лечения или диагностики заболевания у людей). Иммуногенность инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства можно уменьшить, когда инсулинотропный агент или инкретин является частью композиции лекарственного средства, которая содержит dAb, связывающее сывороточный альбумин. Соответственно, в изобретении предложены композиции продукта слияния или конъюгата, которые могут быть менее иммуногенными(чем, например, один только инсулинотропный агент или инкретин) или которые могут быть, по существу, неиммуногенными в контексте композиции лекарственного средства, которая содержит dAb, связывающее сывороточный альбумин. Таким образом, такие композиции можно вводить субъекту повторно в течение времени с минимальной потерей эффективности из-за образования антител против лекарственного средства иммунной системой субъекта. Кроме того, композиции конъюгата или продукта слияния, описанные в данной заявке, могут иметь профиль повышенной безопасности и незначительные побочные эффекты по сравнению с одним только инсулинотропным агентом или инкретином. Например, в результате связывающей активности dAb в отношении сывороточного альбумина продукты слияния и конъюгаты по изобретению имеют повышенное время пребывания в сосудистом кровотоке. Кроме того, продукты слияния и конъюгаты по изобретению,по существу, не способны пересекать гематоэнцефалический барьер и накапливаться в центральной нервной системе после системного введения (например, внутрисосудистого введения). Соответственно,продукты слияния или конъюгаты по изобретению можно вводить с большей безопасностью и уменьшенными побочными эффектами по сравнению с отдельно взятым инсулинотропным агентом или инкретиновым лекарственным средством. Аналогично, продукты слияния или конъюгаты могут иметь пониженную токсичность в отношении конкретных органов (например, почек или печени), чем отдельно взятое лекарственное средство. Примеры Пример 1. Экспрессия генетических продуктов слияния GLP-1 (A8G) или эксендина-4 и DOM7h-14AlbudAb. Эксендин-4 или GLP-1 (7-37) с аланином в положении 8, замененным на глицин ([Gly8] GLP-1),клонировали в виде продукта слияния с DOM7h-14 (доменное антитело (dAb), которое связывает сывороточный альбумин (AlbudAb) с аминокислотной последовательностью, показанной ниже) в вектор рТТ 5 (получаемый от CNRC, Канада). В каждом случае GLP-1 или эксендин-4 находился на 5'-конце конструкции, a dAb на 3'-конце. В целом, получили 7 конструкций (DAT0114, DAT0115, DAT0116, DAT0117,DAT0118, DAT0119, DAT0120) с аминокислотными последовательностями, показанными на фиг. 1 (AG). У них не было ни линкера, gly-ser линкера (G4S), ни спирального линкера (Arai, R., H. Ueda, et al.(2001). "Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein". Protein Eng 14(8): 529-32.456), ни линкера, состоящего из второй GLP-1 группировки между GLP-1 или эксендином-4 и dAb. Линкеры включали в виде спейсеров для разделения в пространстве GLP-1 или эксендина-4 отdAb для предупреждения пространственного затруднения в связывании между GLP-1 или эксендином-4 и рецептором GLP-1. Последовательности конструкций представлены на фиг. 1 (A-G). Свободную от эндотоксина ДНК готовили в Е. coli с использованием щелочного лизиса (используя набор свободной от эндотоксина плазмиды Giga, получаемый от Qiagen CA) и использовали для трансфекции клеток HEK 293 Е (получаемых от CNRC, Канада). Трансфекцию проводили в 250-мл флакон на клетках HEK 293 Е при 1,75106 клеток/мл с использованием 333 мкл 293 фектина (Invitrogen) и 250 мкг ДНК на флакон, и экспрессию проводили при 30 С в течение 5 суток. Супернатант собирали центрифугированием и очистку проводили посредством аффинной очистки на белке L. Белок периодически связывали со смолой, упаковывали в колонку и промывали 10 объемами колонки PBS. Белок элюировали 50 мл 0,1 М глицина рН 2 и нейтрализовали Трис рН 8. Белок ожидаемого размера идентифицировали на ПААГ-ДСН геле, и размеры показаны в табл. 1 ниже. Таблица 1. Молекулярные массы DAT0114, DAT0115, DAT0116,DAT0117, DAT0118, DAT0119, DAT0120 Пример 2. Показано, что продукты слияния GLP-1 и эксендин-4 AlbudAb связывают сывороточный альбумин. Продукты слияния GLP-1 и эксендин-4 AlbudAb анализировали методом поверхностного плазмонного резонанса (Biacore AB, полученный от GE Healthcare) для получения информации об аффинности. Анализ осуществляли с использованием СМ 5 Biacore чипа (матрица из карбоксиметилированного декстрана), который был покрыт сывороточным альбумином. Примерно 1000 резонансных единиц (RU) каждого тестируемого сывороточного альбумина (человеческого, крысиного и мышиного сывороточного альбумина) иммобилизовали в ацетатном буфере рН 5,5. Проточная кювета 1 Biocore AB представляла собой непокрытый, блокированный отрицательным контроль, проточную кювету 2 покрывали человеческим сывороточным альбумином (HSA) (815 RU), проточную кювету 3 покрывали крысиным сывороточным альбумином (RSA) (826 RU) и проточную кювету 4 покрывали мышиным сывороточным альбумином (MSA) (938 RU). Каждую тестируемую слитую молекулу экспрессировали в культуре ткани млекопитающего, как описано в примере выше. Диапазон концентраций слитой молекулы готовили (в диапазоне от 16 нМ до 2 мкМ) путем растворения в BIACORE HBS-EP буфере (0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% сурфактанта Р 20) и пропускали через чип BIACORE. Аффинность (KD) расчитывали из кривых BIACORE путем подгонки кривых скорости ассоциации и скорости диссоциации к кривым, образованным концентрациями dAb в области KD. Аффинности (KD) суммированы в следующей табл. 2. Таблица 2. Связывание GLP-1 и эксендина-4 AlbudAb с человеческим,крысиным и мышиным сывороточным альбумином Вышеприведенные результаты демонстрируют, что слитые молекулы сохраняют способность связываться со всеми типами сывороточного альбумина, и это показывает, что они, по-видимому, имеют пролонгированный период полувыведения in vivo. Пример 3. Продукты слияния GLP-1 и эксендин-4 AlbudAb активны в анализе связывания рецептора GLP-1 (GLP-1R ВА). Продукты слияния подвергали замене буфера на 100 мМ NaVI, 20 мМ цитрат рН 6,2. При этом клетки СНО 6CRE GLP1R (клетки СНО K1 (получаемые из Американской коллекции типовых культур,АТСС), стабильно трансфицированные 6 сАМР элементом ответа, запускающим люциферазный репортерный ген, а также человеческим рецептором GLP-1) сеяли в концентрации 2105 клеток/мл в среду для суспензии. Суспензионную культуру поддерживали в течение 24 ч. Клетки затем разбавляли в 15 мМHEPES буфере (получаемом от Sigma), содержащем 2 мМ L глутамина (2,5105 клеток/мл), и распределяли в 384-луночные планшеты, содержащие 10 мкл/лунку анализируемого соединения. После добавления аналитического контроля планшеты возвращали в инкубатор на 3 ч при 37 С и 5% СО 2. После инкубации в лунки добавляли субстрат для люциферазы steady glo (получаемый от Promega), как описано в наборе, и планшеты запечатывали с помощью самоклеющейся пленки для планшетов (Weber MarkingSystems Inc., кат.607780). Планшеты помещали в считывающее устройство (Viewlux, Perkin Elmer) и предварительно инкубировали в течение 5 мин перед считыванием флуоресценции и нанесения результатов на график. Соединение анализировали в диапазоне концентраций в присутствии и в отсутствие 10 мкМ альбумина, позволяя кривой "доза-ответ" согласовываться с присутствием и отсутствием альбумина. ЕС 50 рассчитывали и суммировали в следующей табл. 3. Таблица 3. Активность продуктов слияния GLP-1 и эксендин-4 AlbudAb в анализе связывания рецептора GLP-1 (GLP-1R ВА) Вышеприведенные результаты демонстрируют, что все тестируемые слитые молекулы сохраняют способность связываться с рецептором GLP-1. Результаты также демонстрируют, что эта способность сохраняется в присутствии сывороточного альбумина. Отсюда следует, что эти слитые молекулы, вероятно, будут сохранять способность связываться с рецептором GLP-1 in vivo. Пример 4. Экспрессия DAT0115, DAT0116, DAT0117 и DAT0120 в клетках млекопитающих HEK 293 с последующей очисткой посредством афинного захвата белком L и ионообменной хроматографии. Цель данного эксперимента заключалась в продукции белка для характеристики in vivo и in vitro. Белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающих в клетках HEK 293 Е с использованием вектора рТТ-5, как описано ранее. Кратко, свободную от эндотоксина ДНК получали, очищали и использовали для трансфекции клеток HEK 293 Е. Белок экспрессировали в течение 5 дней при 30 С в инкубаторе с качалкой и культуры осаждали и собирали супернатант (содержащий исследуемый белок). Белок очищали из супернатанта посредством аффинного захвата на аффинной смоле белок L-агароза streamline (смола GE Healthcare, белок L, конъюгированный производителем). Смолу затем промывали 10 объемами колонки PBS, и затем белок элюировали 5 объемами колонки 0,1 М глицина рН 2,0. Нейтрализацию осуществляли с помощью 1 объема колонки 1 М трис-глицина, рН 8,0. В этом случае (в отличие от предыдущего примера) осуществляли дополнительную очистку. Белок (в трис-глициновом буфере) подвергали замене буфера на 20 мМ ацетат рН 5,0 перед нанесением с использованием Akta на 1 (или 2 параллельно) 6-мл колонок resource S (GE healthcare), предварительно уравновешенных в 20 мМ ацетате рН 5,0. После промывания тем же буфером белок элюировали посредством градиента 0-0,75 М или 0-1 МNaCl в 20 мМ ацетате рН 5,0. Фракции правильного размера затем идентифицировали с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН и масс-спектрометрии и затем объединяли для того, чтобы получить конечный образец белка. Затем в белке меняли буфер на 20 мМ цитрат, рН 6,2, 100 мМ NaCl и концентрировали до концентрации от 0,5 до 5 мг/мл. Белок фильтровали через фильтр 0,2 мкМ для обеспечения стерильности. Затем белок использовали в примерах, описанных ниже. Пример 5. Сравнение устойчивости DAT0115, DAT0116, DAT0117 и DAT0120 к 1, 3 и 6 циклам замораживания-оттаивания. Цель этого исследования заключалась в сравнении устойчивости DAT0115, DAT0116, DAT0117 иDAT0120 к 1, 3 и 6 циклам замораживания-оттаивания. Каждый белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающего в клетках HEK 293 Е с вектора рТТ-5 и очищали на аффинной смоле с белком L с последующей ионообменной хроматографией, как описано выше. В белке заменяли буфер на 20 мМ цитрат, 100 мМ NaCl и разбавляли до 0,5 мг/мл с использованием того же буфера. 0,5 мл Аликвоты каждого белка (в пробирках Эппендорф) затем подвергали 0, 1, 3 или 6 циклам замораживания-оттаивания, где каждый цикл длится 3 мин на сухом льду и затем 2 мин в 37 С водяной бане. (Во время эксперимента наблюдали, что 2 мин при 37 С достаточно для полного оттаивания белкового раствора.) После завершения требуемого числа циклов замораживания-оттаивания образцы белка хранили при 2-8 С до последующего анализа. Белки затем подвергали анализу с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН, анализа связывания GLP-1R, эксклюзионной хроматографии на колонке Superdex 75 и масс-спектрометрии. Наблюдали, что профиль ПААГ-ДСН, активность в GLP-1R ВА и профиль масс-спектрометрии всех четырех белков, по существу, не менялись относительно исходного уровня в результате 1, 3 или 6 циклов замораживания-оттаивания. Максимальная высота пика в SEC (эксклюзионная хроматография) анализе менялась на 78, 86, 104 и 57% от максимальной высоты, поддерживаемой после 6 циклов замораживанияоттаивания для DAT0115, DAT-116, DAT0117 и DAT0120, соответственно. Установили, что DAT0120 было менее устойчивым к циклам замораживания-оттаивания, чем три других белка. Таблица 4. Результаты сравнения устойчивости DAT0115, DAT0116,DAT0117 и DAT0120 к 1, 3 и 6 циклам замораживания-оттаиванияmAU - единица оптической плотности Пример 6. Демонстрация продолжительности действия DAT0115 в модели диабета II типа на мышах db/db. Цель этого исследования заключалась в определении продолжительности действия DAT0115 на пероральную толерантность к глюкозе у мышей db/db. Животных сортировали по уменьшению уровней глюкозы за три дня до начала эксперимента и затем блокировали. Одно животное в пределах каждого блока направляли в каждую из 26 групп исследования. Это обеспечивало сходный средний начальный уровень глюкозы в каждой исследуемой группе.DAT0115 (полученный в клетках HEK 293 и очищенный, как описано выше) вводили подкожно по 1, 0,3 или 0,1 мг/кг за 5, 24, 48, 72, 96 или 120 ч до пероральной нагрузки глюкозой. (Не все дозы вводили в каждую временную точку, см. в таблице ниже для деталей). DAT0115 значительно уменьшало AUC для глюкозы в течение 2 ч теста на пероральную толерантность к глюкозе (OGTT) по сравнению с мышамиdb/db, обработанными носителем, за пределами и включая 24 ч для доз 0,1 и 0,3 мг/кг и за пределами и включая временную точку 72 ч для дозы 1 мг/кг. Эксендин-4, вводимый в качестве положительного контроля при 42 мкг/кг, также значительно уменьшал AUC для глюкозы после OGTT при введении за 5 ч до перорального болюса глюкозы. В табл. 5 ниже показано процентное уменьшение AUC для каждой из исследуемых групп DAT0115 по сравнению с носителем. Звездочка указывает Р 0,05 для сравнения DAT0115 с носителем с использованием коррекции уровня ложноположительных результатов. Таблица 5. Демонстрирует процентное уменьшение AUC для каждой из исследуемых групп DAT0115 по сравнению с носителем. (Звездочка указывает Р 0,05 для сравнения DAT0115 с носителем с использованием коррекции уровня ложноположительных результатов) Пример 7. Демонстрация эффективности DAT0115 в мышиной модели ожирения, индуцированного диетой (DIO). Цель данного исследования заключалась в применении признанной мышиной модели питания(мыши с ожирением, индуцированным диетой) для того, чтобы определить, влияет ли обработка с помощью DAT0115 на потребление пищи и, в результате, на массу тела. Это может быть прогнозом для людей. Самцов мышей C57BI/6 (приобретенных у Taconic) содержали на 60% ккал диете, содержащей обогащенную жирами и облученную пищу, в течение 12 недель и затем переводили в лабораторное помещение. По прибытии мышей индивидуально размещали на alpha-dri подстилках в комнате с контролируемой температурой и влажностью (70-72F (21,1-22,2C), влажность = 48-50%, световой цикл с 5 утра до 5 вечера). Диету меняли на диету, содержащую до 45% жиров, и животных подвергали акклиматизации в течение 18 суток. Перед введением тестируемого соединения мышам подкожно инъецировали физиологический раствор один раз в сутки в течение трех суток и контролировали потребление пищи. Мышей отгораживали и группировали таким образом, чтобы масса тела и потребление пищи не отличались между группами и в пределах групп. В сутки исследования группам из 8 мышей вводили подкожно дозы следующим образом, используя объем инъекции 5 мл/кг. Трем группам вводили DAT0115 (низкую,среднюю и высокую дозу), одной группе молекулу, являющуюся отрицательным контролем (DOM7h-14AlbudAb, но без эксендин-4 конъюгата), и одной группе - положительный контроль в отношении эксендина-4. Таблица 6. Протокол для определения эффективности DAT0115 в мышиной модели ожирения в случае ожирение, индуцированного диетой (DIO) Суточное потребление пищи и массу тела измеряли ежесуточно в течение 10 суток. DAT0115 показал дозозависимое уменьшение массы тела и потребление пищи по сравнению с DOM7h-14 контролем(см. фиг. 3 а и 3b). Поэтому можно заключить, что данные из этого исследования на мышах подтверждают гипотезу, что DAT0115 может быть хорошим клиническим кандидатом. Пример 8. Определение периода полувыведения из плазмы DAT0115, DAT0116 и DAT0117 в мышиной модели диабета II типа. Цель данного исследования заключается в определении профиля элиминации из плазмы DAT0115,DAT0116 и DAT0117 в мышиной модели диабета II типа (db/db мыши) и вычислении PK параметров на основании результатов. DAT0115, DAT0116 и DAT0117 белок готовили, как описано ранее. Кратко, белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающего с использованием клеток HEK 293 Е и очищали с использованием периодической абсорбции на афинной смоле protein L-agarose с последующей элюцией глицином при рН 2,0 и нейтрализацией с помощью Трис рН 8,0. За этим следовала ионообменная хроматография на колонке Resource S с использованием 0-1 М солевого градиента в 20 мМ ацетате рН 5,0. Фракции, содержащие желаемый белок, затем объединяли, и буфер меняли на 100 мМ NaCl, 20 мМ цитрат рН 6,2. Белок стерилизовали фильтрованием, меняли буфер, удаляли эндотоксин и тестировали перед использованием in vivo. Группам неголодающих самцов мышей db/db (гомозиготные мыши LEPr db с недостаточностью лептинового рецептора в связи с мутациями в гене лептинового рецептора (lepr вводили либо подкожно, либо внутривенно 1 мг/кг DAT0115, DAT0116 или DAT0117. В предварительной дозе через 0,25, 0,5,1, 4, 7, 12, 24, 36, 48 и 60 ч после введения внутривенных доз и предварительной дозе через 0,5, 1, 4, 7,12, 24, 36, 48 и 60 ч после введения подкожных доз собирали образцы крови посредством терминального забора крови и получали плазму. Образцы плазмы замораживали и позднее размораживали для анализа уровней DAT0115, DAT0116 или DAT0117 по мере необходимости посредством твердофазной экстракции и LC/MS/MS (жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией) для определения присутствия фрагмента белка (из эксендин-4 участка белка). Вычисленные уровни в плазме затем использовали для подгонки фармакокинетических параметров с использованием программного обеспеченияWinNonLin. Период полувыведения после подкожного и внутривенного введения и биодоступность представлены в таблице ниже. На основании результатов сделали вывод (см. табл. 7 ниже), что все три соединения демонстрируют желаемые фармакокинетические параметры в мышиной модели диабета II типа. Поэтому эти молекулы демонстрируют потенциал хороших PK параметров у людей, больных диабетом, в этом исследовании в пользу выбора DAT0115 или DAT0116 относительно DAT0117. Таблица 7. Период полувыведения из плазмы DAT0115, DAT0116 и DAT0117 в мышиной модели диабета II типа Пример 9. Определение периода полувыведения из плазмы DAT0115, DAT0116, DAT0117 у крыс. Цель данного исследования заключается в определении профиля элиминации из плазмы DAT0115,DAT0116 и DAT0117 у крыс и вычислении PK параметров на основании этих результатов. DAT0115,DAT0116 и DAT0117 белок получали, как описано ранее. Кратко, белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающего с использованием клеток HEK 293 Е и очищали с использованием периодической абсорбции на афинной смоле protein L-agarose с последующей элюцией глицином при рН 2,0 и нейтрализацией с помощью Трис рН 8,0. За этим следовала ионообменная хроматография на колонке Resource S с использованием 0-1 М солевого градиента в 20 мМ ацетате рН 5,0. Фракции, содержащие желаемый белок, затем объединяли и буфер меняли на 100 мМ NaCl, 20 мМ цитрат рН 6,2. Белок стерилизовали фильтрованием, буфер заменяли и тестировали (QCed) перед применением in vivo. Для того чтобы определить период полувыведения из плазмы, группам из 3 крыс делали однократную в/в или п/к/ инъекцию по 0,3 мг/кг (в/в) или 1,0 мг/кг (п/к) DAT0115, DAT0116 или DAT0117. Образцы плазмы получали путем периодического отбора крови из хвостовой вены в течение 72 ч и анализировали посредством LC/MS/MS для определения присутствия фрагмента продукта слияния (из эксендин-4 части продукта слияния). Вычисленные уровни в плазме затем использовали для подгонки фармакокинетических параметров с использованием программного обеспечения WinNonLin. Период полувыведения после подкожного и внутривенного введения и биодоступность представлены в табл. 8 ниже. На основании этих результатов сделали вывод, что все три соединения демонстрируют желаемые фармакокинетические параметры у крысы. Поэтому все эти молекулы демонстрируют потенциал для хорошихDAT0117. Таблица 8. Период полувыведения после подкожного и внутривенного введения и биодоступность Пример 10. Определение периода полувыведения из плазмы DAT0115 у яванского макака. Цель данного исследования заключалась в определении фармакокинетических параметров дляDAT0115 у примата, не являющегося человеком (яванский макак), для обеспечения аллометрического измерения параметров и наилучшего возможного указания, имеет ли DAT0115 подходящий PK профиль у людей. Продукт слияния DAT0115 эксендин-4 AlbudAb экспрессировали в клетках HEK 293 Е в культуре ткани млекопитающего и очищали, как описано ранее. Кратко, белок очищали с использованием периодической абсорбции на афинной смоле protein L-agarose с последующей элюцией глицином при рН 2,0 и нейтрализацией с помощью Трис рН 8,0. За этим следовала ионообменная хроматография на колонке Resource S с использованием 0-1 М солевого градиента в 20 мМ ацетате рН 5,0. Фракции, содержащие желаемый белок, затем объединяли и буфер меняли на 100 мМ NaCl, 20 мМ цитрат рН 6,2. Белок всесторонне тестировали (QCed) (включая ПААГ-ДСН, масс-спектрометрию, анализ активности: GLP-1R-BA, проверку рН, проверку осмолярности), стерилизовали фильтрованием и удаляли эндотоксин. Белок с подтвержденным низким эндотоксином (менее 0,05 EU (единицы эндотоксина)/мг белка) использовали для исследования in vivo. В этом исследовании использовали шесть самок яванского макака (Macaca fascicularis; Charles RiverLaboratories BRF, Houston, TX, Primate Products, Miami, FL и/или Covance Research Products, Inc., Alice,TX). Обезьяны были приблизительно в возрасте 2-9 лет (с диапазоном массы тела приблизительно 2-5 кг) в начале введения доз. Обезьян размещали индивидуально в клетках из нержавеющей стали в помещении(ях) с регулируемыми характеристиками окружающей среды (64F-84F; 30-70% относительной влажности) с 12-часовым циклом свет/темнота. Самкам обезьян давали приблизительно 6 штук печенья дважды в сутки из диеты для обезьян 5038 (PMI Nutrition International, Richmond, IN) и ежесуточную долю свежих фруктов. Каждому животному вводили исследуемое соединение (DAT0115) либо подкожно, либо внутривенно согласно дозовой группе (3 п/к и 3 в/в). Доза составляла 0,1 мг/кг. В сутки введения дозы первое кормление происходило в течение приблизительно 1 ч после дозы для каждой обезьяны (растягивалось вплоть до 2,5 ч после введения дозы, если связанные с исследованием процедуры требовали отсутствия животных в месте их локального размещения в течение длительного периода времени). Второе кормление проводили не ранее чем через 2 ч после первого кормления. В целях обогащения среды каждую обезьяну обеспечивали дополнительными фруктами, бобовыми и/или овощами (например, виноградом, морковью, арахисом) во время или примерно во время проверки жизнеспособности или в качестве награды после акклиматизации или процедур, связанных с исследованием. Фильтрованная водопроводная вода (поставляемая Aqua Pennsylvania, Inc. и периодически анализируемая) была доступна без ограничений. Образцы плазмы (приблизительно 2 мл) собирали из бедренного сосуда перед введением дозы (0 ч) и через примерно 5 мин (только в/в группа), 0,5, 4, 8, 24, 48, 96, 144, 192, 288, 336, 504 и 672 ч после введения дозы. (PK образцы у одного из животных в в/в группе были собраны к 24 ч, таким образом это животное было исключено из аппроксимации PK.) Анализ образцов проводили с помощью массспектрометрии и подгонку данных осуществляли с использованием программного обеспечения WinNonLin. PK параметры были следующими для в/в введения (n=2): T1/2 67 ч, MRT 46 ч, Vz 327 мл/кг и Cl 3,3 мл/ч/кг и для п/к введения (n=3): Т 1/2 68 ч, MRT 98 ч, Vz 306 мл/кг и Cl 3,1 мл/ч/кг. Биодоступность вычислили как 99%. На основании этого исследования сделали вывод (а также из данных по biacore связыванию с сывороточным альбумином яванского макака и человека), что 68 ч п/к период полувыведения DAT0115 у яванского макака (как описано выше) подтверждает, что период полувыведения той же молекулы у людей, по-видимому, будет достаточно продолжительным, чтобы коррелировать с требованием еженедельного (или менее частого) введения дозы. Пример 11. Определение PD DAT0115 у яванского макака. Исследование PK проводили на яванском макаке, как описано выше. Основная цель этого исследования заключалась в определении фармакокинетических параметров для DAT0115 у яванского макака(как описано в предыдущем примере), но вторая цель состояла в получении доказательства эффективности DAT0115 соединения у обезьян (без достаточной статистической значимости исследования). Для достижения этой второй цели во время исследования контролировали потребление обезьянами печенья. Было отмечено, что в следующие сутки после введения дозы наблюдалась тенденция уменьшения потребления пищи у всех обезьян. Сделали вывод, что это было вызвано, вероятно, хорошо документированным эффектом эксендин-4 части молекулы как средства для подавления аппетита. Таким образом,было показано, что DAT0115 является активным in vivo. Для обеспечения благополучия животных фрукты и угощения потреблялись в течение большинства суток, несмотря на потребление печенья. Таблица 9. Измерение печенья, потребляемого ежедневно яванским макаком (вместе с дозой DAT0115 на сутки 1) Пример 12. Продукт слияния DAT0115 эксендин-4 AlbudAb связывает сывороточный альбумин крысы, яванского макака и человека с использованием поверхностного плазмонного резонанса.DAT0115 экспрессировали, очищали и затем анализировали методом поверхностного плазмонного резонанса (Biacore, GE Healthcare) для получения информации об аффинности. Анализ осуществляли с использованием стрептавидинового чипа (SA), покрытого биотинилированным сывороточным альбумином. 200-1000 резонансных единиц (RU) каждого сывороточного альбумина иммобилизовывали на чипе. Проточная кювета 1 была без покрытия, проточную кювету 2 покрывали HSA, проточную кювету 3 покрывали RSA и проточную кювету 4 покрывали CSA. Готовили диапазон концентраций продукта слияния (в диапазоне от 15,6 нм до 2 мкМ путем разбавления в BIACORE HBS-EP буфере (0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% сурфактанта Р 20) и пропускали через BIACORE чип. Аффинность (KD) рассчитывали на основании BIACORE кривых путем подгонки кривых скорости ассоциации и скорости диссоциации с кривыми, полученными для концентраций dAb в пределах KD. Аффинности (KD) представлены в следующей таблице. Таблица 10. Аффинность (KD) для DAT0115 Пример 13. Характеристика тепловой денатурации DAT0115 посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Цель данного эксперимента состояла в контролировании тепловой денатурации DAT0115 посредством DSC (дифференциальная сканирующая калориметрия) с использованием капиллярного клеточного микрокалориметра VP-DSC (Microcal), оснащенного автоматической пипеткой. Белок диализовали в течение ночи в 20 мМ цитрата рН 6,2, 100 мМ NaCl, фильтровали и затем доводили до концентрации 1 мг/мл, как определено по поглощению при 280 нм. Профильтрованный диализный буфер использовали в качестве стандарта для всех образцов. DSC осуществляли при скорости нагревания 180 С/ч. Перед этим каждый образец в растворе подвергали деконтаминации (дегазации) до 1%, и затем вводили буфер для очистки клеток и обеспечения фонового уровня аппарата. Полученные кривые анализировали с использованием программного обеспечения Origin 7 Microcal. DSC кривую, полученную для стандарного буфера, вычитали из кривой для образца. Точную молярную концентрацию образца использовали для вычислений (выполняемых автоматически с помощью Origin). Базовые параметры для верхних и нижних базовых линейных участков до/после перехода выбирали и соединяли с использованием кубической функции связывания. Полученный график соответствует необратимой модели двух состояний (non-2-state model),дающей кажущуюся Тпл. и значения HHv. Кривая для DAT0115 соответствовала модели необратимого "non-2-state" перехода, с приблизит. Тпл. 56,3 С. Критерий согласованности был удовлетворительным (см. фиг. 4). Контрольная кривая для лизоцима, полученная с использованием того же оборудования, давала данные подходящего качества,как ожидалось с хорошим соответствием. (Приблизит. Тпл., полученная для лизоцима, составляла 76,2 С,что согласуется с литернатурными данными (см. фиг. 5).) Таким образом, сделали вывод, что эксперимент обеспечил надежные данные, показывающие, что DAT0115 представляет собой молекулу с температурой плавления 56,3 С, что является приемлемым для клинического кандидата. Пример 14. Характеристика DAT0115, DAT0117 и DAT0120 в состоянии раствора посредством SECMALLS. Цель данного эксперимента заключалась в определении состояния DAT0115, DAT0117 и DAT0120 в растворе посредством SEC MALLS. Образцы очищали и диализовали в соотвествующем буфере (PBS) и фильтровали после диализа, определяли концентрацию и доводили до 1 мг/мл. BSA и HSA приобретали в Sigma и использовали без дополнительной очистки. Детали оборудования Систему Shimadzu LC-20AD Prominence HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) с автоматическим пробозаборником (SIL-20A) и детектор SPD-20A Prominence UV/Vis соединяли с WyattMini Dawn Treos (MALLS, детектор многоуглового лазерного светорассеяния) и детектором Wyatt Optilab rEX DRI (дифференциальный показатель преломления). Детекторы соединяли в следующем порядкеLS-UV-RI. Оба измерительных прибора RI и LS работают при длине волны 488 нм. Использовали колонки TSK2000 (Tosoh корпорация) или BioSep2000 (Phenomenex) (обе колонки HPLC на основе диоксида кремния с похожим диапазоном разделения, 1-300 кДа) с подвижной фазой 50 или 200 мМ фосфатного буфера (с солью или без нее), рН 7,4 или 1PBS. Используемая скорость потока составляла 0,5 или 1 мл/мин, время прохождения корректировали для отражения различных скоростей потока (45 или 23 мин) и предполагают, что это не будет оказывать значительного влияния на разделение молекул. Белки готовили в PBS в концентрации 1 мг/мл и объем инжекции составлял 100 мкл. Детектор светорассеивания калибровали с помощью толуола согласно инструкциям производителя. Вывод UV детектора и вывод RI детектора соединяли с прибором измерения светорассеяния таким образом, чтобы сигналы от всех трех детекторов можно было одновременно собирать с помощью программного обеспечения Wyatt ASTRA. Несколько инжекций BSA в подвижную фазу PBS (0,5 или 1 мл/мин) пропускали через колонку TosohTSK2000 с получением UV, LS и RI сигналов, собираемых с помощью программного обеспечения Wyatt. Кривые затем анализировали с использованием программного обеспечения ASTRA, и сигналы нормировали, выравнивали и корректировали с учетом уширения полосы согласно инструкциям производителя. Калиброванные константы затем усредняли и вводили в качестве эталона, который использовали для следующих образцов. Расчеты абсолютной молярной массы 100 мкл 1 мг/мл Образца вводили в соответствующую предварительно уравновешенную колонку. После SEC колонки образец пропускали через 3 последовательных детектора: UV, MALLS (многоугловое лазерное светорассеяние) и DRI (дифференциальный показатель преломления), позволяющих определить абсолютную молярную массу. Разбавление, которое происходит на колонке, составляет примерно 10 раз, поэтому концентрация, при которой определяют состояние в растворе, составляет 100 мкг/мл или примерно 8 мкМ dAb. Основа расчетов в ASTRA, а также метода построения графиков по Зимму (Zimm), который часто осуществляют в периодическом методе анализа образцов, представляет собой уравнение из Zimm (J. где с представляет собой концентрацию по массе растворенных молекул в растворителе (г/мл); М представляет собой средневзвешенную молярную массу (г/моль); А 2 представляет собой второй вириальный коэффициент (моль мл/г 2);K = 4 р 2n02 (dn/dc)2l0-4NA-1 представляет собой оптическую константу, где n0 представляет собой показатель преломления растворителя при длине волны падающего излучения (вакуум), l0 представляет собой длину волны падающего излучения (вакуум), выраженную в нанометрах, NA представляет собой число Авогадро, равное 6,0221023 моль-1, и dn/dc представляет собой приращение дифференциального показателя преломления раствора "растворитель-растворенное вещество" применительно к изменению концентрации растворенного вещества, выраженному в мл/г (этот фактор должен быть измерен независимо с использованием dRI детектора).P(q) представляет собой теоретически полученный формфактор, приблизительно равный и r2 представляет собой среднеквадратичный радиус. P(q) представляет собой функцию zсреднего размера, формы и структуры молекул.Rq представляет собой избыточное отношение Рэлея (см-1). Данное уравнение предполагает вертикально поляризованный падающий свет и справедливо для порядка с 2. Для выполнения расчетов по методу выравнивания Зумма, который соответствуетRq/Kc против sin2(q/2), необходимо разложить соответствующее ур. 1 первого порядка по с. Для выполнения расчетов по методу выравнивания Зумма, который соответствуетRq/Kc против sin2(q/2), необходимо разложить соответствующее ур. 1 первого порядка по с: Соответствующие результаты в этом случае представляют собой Расчеты выполняли автоматически с помощью программного обеспечения ASTRA с получением графика с молярной массой, определенной для каждого из срезов (slices) (пособие Astra). Молярную массу, полученную из графика для каждого из пиков, наблюдаемую на хроматографии,сравнивали с ожидаемой молекулярной массой одной единицы белка. Это позволяет сделать вывод относительно состояния белка в растворе.DAT0115 100 мкл 1 мг/мл DAT0115 вводили в колонку Superdex 200, уравновешенную в 20 мМ цитрата, 0,1 М NaCl, pH 6,2. Скорость потока установили на 0,5 мл/мин. Белок, элюированный в одном пике, с MW(молекулярная масса) по всей ширине пика, составляет 17,4 кДа (ожидаемая MW для мономера составляет 16,9 кДа). Эффективность элюции составляет 100%. См. фиг. 6. (Контроль HSA вел себя, как ожидалось, подтверждая экспериментальные результаты для DAT0115. Он элюировался в виде двух пиков сMW 64 кДа (мономер) и 110 кДа (димер). MW димера HSA может быть не очень точной в связи с очень маленьким количеством белка в пределах этого пика).DAT0117 100 мкл 1 мг/мл DAT0117 вводили в колонку TSK2000, уравновешенную в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4. Скорость потока установили на 1 мл/мин. Примерно 50% инжектируемого количества DAT0117 элюировалось с колонки в двух перекрывающихся пиках с MW примерно 35-45 кДа (димер и выше), что демонстрирует сильную самоассоциацию в условиях, тестируемых в данной заяке. (Контроль BSA вел себя, как ожидалось, подтверждая экспериментальные результаты для DAT0117, давая два пика с молярной массой 61 и 146 кДа (мономер и димер.) См. фиг. 7 в отношении результатов SEC Mal.DAT0120 100 мкл 1 мг/мл DAT0117 вводили в колонку TSK2000, уравновешенную в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4. Скорость потока установили на 1 мл/мин. Примерно 50% инжектируемого количестваDAT0120 элюировалось с колонки GF в виде слегка ассиметричного пика с MW, определенным как примерно 25 кДа. Это указывает на самоассоциацию DAT0120 в условиях, тестируемых в данной заяке, белок, по-видимому, находится в быстром мономер-димерном равновесии. (Контроль BSA вел себя, как ожидалось, подтверждая экспериментальные результаты для DAT0120, давая два пика с молярной массой 61 и 146 кДа (мономер и димер).) См. фиг. 8 в отношении результатов SEC Mal. На основании вышеизложенных экспериментов сделали вывод, что DAT0115 демонстрирует значительно меньшую (возможно, никакую) самоассоциацию в условиях, используемых в данной заявке, по сравнению с двумя другими молекулами, которые демонстрируют значительную самоассоциацию. Мономерное состояние в растворе может быть предпочтительным относительно действия in vivo и предшествующего и последующего процесса во время получения, поэтому DAT0115 может быть наиболее идеальной молекулой для клинического продвижения, что касается состояния в растворе. Пример 15. Очистка после экспрессии в клетках млекопитающих без использования аффинной матрицы с белком L Оба DAT0120 и DAT0115 очищали из супернатантов HEK 293. Каждый белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающего в клетках HEK 293 Е с вектора рТТ-5. 1 мл Колонку со смолой МЕР Hypercel уравновешивали PBS, промывали 0,1 М гидроксидом натрия и затем повторно уравновешивалиPBS. 200 мл Супернатанта наносили на колонку при 2,5 мл/мин и затем колонку промывали PBS и элюировали 0,1 М глицином, рН 2. После элюции образец нейтрализовали путем добавления 1/5 й объема 1 М Трис, рН 8, и хранили при комнатной температуре. Образец демонстрировал слабую преципитацию после хранения и его фильтровали с использованием стерильного устройства перед обессоливанием. Две обессоливающие колонки 26/10 HiPrep уравновешивали 20 мМ ацетатом натрия, рН 5 (измеренный рН 5,3) при 10 мл/мин, промывали путем добавления 0,1 М NaOH и повторно уравновешивали 20 мМ ацетатом натрия, рН 5.DAT0115 подвергали обессоливанию в 20 мМ ацетата натрия, рН 5, перед нанесением на 1 мл HiTrap SPFF, уравновешенную в 20 мМ ацетата натрия, рН 5 (фактически 5,2). После промывания колонки его подвергали 0-100% градиенту с 20 мМ ацетатом натрия, рН 5, 1 М NaCl, и элюированные фракции с поглощением выше 5 mAus (единицы оптической плотности) собирали и анализировали с помощью ПААГ-ДСН. После хранения SP FF фракций в течение ночи образец фильтровали через 0,2-мкм мембрану и наносили на обессоливающие колонки 2X26/10 HiPrep, уравновешенные в 20 мМ цитрата натрия, рН 6,2,100 мМ NaCl. Элюат концентрировали в 20 мл центрифужном концентраторе, стерилизовали фильтрованием и тестировали на эндотоксин при разведениях 1/10 и 1/200. Эндотоксин тестировали в двух разведениях, разведение 1/10 дало значение 30 EU/мл со степенью извлечения 250. Тест 1/200 дал значение менее 10,8 EU/мл со степенью извлечения 126%. Образец подвергали MS (масс-спектрометрия) анализу с использованием ID 27823. Наблюдались низкие уровни примесей, видимые ниже 80 кДа маркера и между 110-160 кДа маркерами при высокой нагрузке. Чистота образца составляла более 95%. Пример 16. Экспрессия и очистка генетических продуктов слияния эксендина-4 и DOM7h-1410/DOM7h-11-15 AlbudAb Цель данного эксперимента заключалась в эффективной экспрессии DMS7139 и DMS7143.DMS7139 представляет собой продукт слияния эксендина-4 с DOM7h-14-10 (доменное антитело (dAb),- 24021146 которое связывает сывороточный альбумин, также известное как AlbudAb TM), и DMS7143 представляет собой продукт слияния эксендина-4 с DOM7h-11-15 (доменное антитело (dAb), которое связывает сывороточный альбумин, также известное как AlbudAb) в Е. coli с правильно процессированными N-концами. Продукт слияния затем может быть протестирован в отношении активности "эксендин-4" части и "AlbudAb" части в следующих экспериментах. Эксендин-4 клонировали в виде продукта слияния с DOM7h-14-10 или DOM7h-11-15, где эксендин 4 пептид находился на 5'-конце конструкции, а AlbudAb на 3'-конце. В целом получили две конструкции,где каждая включает (Gly4Ser)3 линкера между эксендин-4 пептидом и AlbudAb. Линкер включали в качестве спейсера для пространственного отделения эксендина 4 от dAb для предупреждения стерического затруднения при связывании между эксендином-4 и рецептором GLP-1. Последовательности конструкций показаны на фиг. 1(m) и 1(n). Чтобы обеспечить клонирование в экспрессирующий вектор,продукты слияния получали в виде совокупности ПЦР-продуктов (assembly PCRs) с сайтом рестрикции для Ndel на 6'-конце, затем модифицированным сигнальным пептидом OmpT (аминокислотная последовательность OmpT AWA представлена на фиг. 1(q), SEQ ID NO: 28) и с сайтом для BamHI на 3'-конце. Сигнальный пептид OmpT AWA имеет последние три кодона, измененные из дикого типа в "GCTTGGGCC" (показан на фиг. 2(р): SEQ ID NO: 33), который кодирует AWA вместо SFA. Это изменение улучшает процессинг в правильном сайте с помощью сигнальной пептидазы Е. coli. Кроме того, последовательность продукта слияния начинается сразу после сайта расщепления пептидазой. Был введен сайт расщепления для Ncol, который перекрывается с последним кодоном сигнального пептида и двумя первыми аминокислотами последовательности эксендина-4. Это изменение улучшает последующее субклонирование, а также приводит к получению продукта слияния со свободным Nконцом эксендина-4. Модифицированному экспрессирующему вектору рЕТ 12 а (векторы рЕТ, полученные из EMD Biosciences), содержащему перечисленные выше изменения, присвоили название pDOM35. Вектор и PCR-сборки переваривали рестрикционными эндонуклеазами Ndel и BamHI, с последующим лигированием вставки в вектор с использованием набора Quick Ligation (NEB). 2 мкл Этого лигирования использовали для трансформации клеток Machl. После периода восстановления роста клетки сеяли на чашки с агаром, содержащие карбенициллин, и инкубировали при 37 С в течение ночи. Колонии секвенировали и колонии, содержащие правильную последовательность, использовали для размножения и выделения плазмиды (Plasmid Mini Prep kit, Qiagen). Клетки BL21(DE3) трансформировали плазмидной ДНК, и полученные колонии использовали для инокуляции экспрессирующей культуры. Экспрессию осуществляли путем инокуляции 40,5 л культуральной среды ТВ Onex (дополненный растворами для аутоиндукции Overnight Express), 1 капли пеногасителя и 100 мкг на мл карбенициллина. Культуру инкубировали в течение 3 ночей при 30 С с перемешиванием 250 об/мин и затем культуральный супернатант осветляли посредством центрифугирования при 3700g в течение 1 ч. Экспрессируемый белок затем очищали из осветленного супернатанта с использованием protein L streamline (GE Healthcare, кат.28-4058-03, связанный с белком L) и элюировали с Protein L с использованием 0,1 М глицина рН 2,0,затем нейтрализовали с использованием 0,1 объема 1 М Трис рН 8,0. Следующий белок концентрировали и диализовали в буфере А (20 мМ ацетат натрия-уксусная кислота, рН 5,0) и очищали с помощью ионообменной хроматографии на AktaXpress (GE healthcare). Белок наносили на 6 мл колонку Resource S в буфере А (бессолевой буфер) и затем элюировали градиентом буфера В (20 мМ ацетат натрия-уксусная кислота рН 5,0 1 М NaCl) с 0-68% В в течение 65 мин по фракциям (для DMS7139). Фракции анализировали на ПААГ-ДСН и с помощью масс-спектрометрии, и фракции, имеющие правильную массу, объединяли. Конечный белок диализовали в буфере 20 мМ цитрат, 0,1 М NaCl, и идентичность подтверждали с помощью ПААГ-ДСН и масс-спектрометрии. Пример 17. Эксендин-4 AlbudAb продукты слияния DMS7139 и DMS7143 связывают сывороточный альбумин с использованием поверхностного плазмонного резонанса.DMS7139 и DMS7143 экспрессировали и очищали, как описано выше, и анализировали методом поверхностного плазмонного резонанса (Biacore, GE Healthcare) для получения информации об аффинности. Анализ осуществляли с использованием двух СМ 5 чипов (матрица карбоксиметилированного декстрана), которые были покрыты сывороточным альбумином. Примерно 500 резонансных единиц (RU) каждого сывороточного альбумина иммобилизовывали в ацетатном буфере рН 4,5. Первый чип имел проточную кювету 1, непокрытую и блокированную, и проточную кювету 2, покрытую MSA (560 RU). Второй чип имел проточную кювету 1, непокрытую и блокированную, проточную кювету 2 покрывалиHSA, проточную кювету 3 покрывали CSA и проточную кювету 4 покрывали RSA. Для всех сывороточных альбуминов задача заключалась в том, чтобы покрыть область 350 RU белка на чипе. Диапазон концентраций продукта слияния получали (в диапазоне от 55 нМ до 1 мкМ для DMS7139 и от 24 нМ до 4,4 мкМ для DMS7143) путем разбавления в BIACORE HBS-EP буфере (0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% сурфактанта Р 20) и пропускали через BIACORE чип. Аффинность(KD) расчитывали из BIACORE кривых посредством подгонки кривых скорости ассоциации и скорости диссоциации с кривыми, полученными с концентрациями dAb в области KD. Аффинности (KD) представлены в следующей табл. 11. Сделали вывод, что DMS7139 и DMS7143 имеют аффинность в отношении сывороточного альбумина, которая (за исключением аффинности DMS7143 в отношении RSA) находится в диапазоне 10-90 нМ. Это значительно выше, чем аффинность в отношении SA предыдущих продуктов слияния (например, DAT0115, которое представляет собой эксендин-4, связанный с DOM7h-14 AlbudAb с глицинсериновым линкером, которое имеет аффинности к этим сывороточным альбуминам в диапазоне 100 нМ). Более высокая аффинность новых продуктов слияния (в отношении сывороточного альбумина), повидимому, приводит к более продолжительным периодам полувыведения из плазмы in vivo, которые будут означать, что продукты слияния можно будет вводить реже с той же эффективностью и/или поддерживать более постоянный уровень лекарственного средства в плазме в течение времени, потенциально уменьшая нежелательную сМах-связанную токсичность или побочные эффекты. Пример 18. Продукты слияния DMS7139 и DMS7143 являются активными в анализе связывания рецептора GLP-1.GLP-1R представляет собой 7 ТМ G-белок-сопряженный рецептор, который для целей этого анализа экспрессируется на клетках СНО. Активация рецептора с помощью GLP-1 или аналогов приводит к превращению АТР в сАМР с помощью аденилатциклазы, которая сопряжена с рецептором. Клетки СНО стабильно трансфицируются репортерным геном 6CRE/luc. Поэтому при продукции сАМР после GLP-1 активации рецептора, промоторный ген (содержащий 6 копий сАМР отвечающего элемента - 6CRE) запускает экспрессию репортерного гена люциферазы. Это затем катализирует реакцию с люциферином для генерации света, который можно измерить на люминометре. Способ Клетки СНО 6CRE GLP1R быстро размораживали путем погружения флакона(ов) наполовину в 37 С водяную баню и содержимое флакона(ов) переносили в 50-мл пробирку Falcon и во флакон добавляли 10 мл среды RPMI (без фенолового красного) (Sigma, кат. R7509) + 2 мМ L-глутамина (Gibco, кат.25030) + 15 мМ HEPES (Sigma, кат.Н 0887). После подсчета и центрифугирования при 1200 об/мин в течение 5 мин клетки ресуспендировали в соответствующем объеме среды RPMI для получения 1106 клеток на мл и 50 мкл распределяли в каждую лунку белого 96-луночного плоскодонного планшета для культивирования (Costar 96-луночный планшет для культивирования тканей, белый стерильный, кат.3917). Клетки инкубировали в течение ночи при 37 С/5% СО 2. На следующий день клетки извлекали из инкубатора и добавляли в лунки 50 мкл предварительно приготовленного контроля/образца и планшет возвращали в инкубатор на 3 ч при 37 С и 5% CO2. Приготовление контроля эксендина-4 (Sigma, кат. Е 7144) В 96-луночный планшет с V-образным дном добавляли 2 мкл 1 мг/мл эксендина-4 к 198 мкл средыRPMI для получения 2,39 мкМ раствора. Добавляли 2 мкл 2,39 мкМ раствора к 237 мкл среды RPMI для получения 20 нМ раствора (для конечной концентрации в анализе 10 нМ). Серийное разведение контроля 1:10 размещали внизу планшета (15 мкл контроль + 135 мкл среды RPMI) для получения 8-точечной кривой. Приготовление неизвестных образцов Для приготовления неизвестных образцов используют те же принципы, что и для приготовления контроля. Готовят наибольшую концентрацию, в два раза большую, чем требуемая конечная концентрация, и разбавляют 1:10 внизу планшета. Приготовление люциферазы (Promega, кат.Е 2620) Вытащить требуемое число аликвот люциферазы Bright-Glo из морозильника и разморозить при комнатной температуре в темноте. Одного 5-мл флакона достаточно для одного анализируемого планшета. После инкубационного времени 50 мкл люциферазного реагента Bright-Glo добавляли во все лунки и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин для обспечения лизиса клеток. Люминесценцию (число импульсов в с) считывали с использованием считывающего устройства для микропланшетов М 5 е, считывая каждую лунку в течение 0,1 с. CPS (имп/с) фоновых лунок, содержащих только клетки, вычитали из всех других лунок. Контрольные лунки (GLP-1(7-36) или эксендин-4) должны демонстрировать максимальную стимуляцию при самых высоких концентрациях. Кривые эффекта концентрации неизвестных образцов аппроксимируют, после чего определяют ЕС 50 с использованием программного обеспечения GraphPad Prism или ExcelFit. Два продукта слияния эксендин-4 AlbudAb (DMS7139 и DMS7143) тестировали в анализе активности в GLP-1R ВА параллельно с эксендином-4. Результаты представлены в табл. 12 ниже. На основании вышеприведенных результатов сделали вывод, что DMS7139 и DMS7143 демонстрируют ожидаемую активность в GLP-1R ВА, и поэтому, вероятно, они будут активными против рецептораGLP-1 in vivo. Поэтому DMS7139 и DMS7143 являются хорошими кандидатами для дальнейшего доклинического исследования с целью продвижения в клинику в случае успеха. Пример 19. Вектор, экспрессирующий DAT0115 или DAT0117, трансформировали в штамм Е. coliB121-(DE3) (Novagen). 250-мл Флакон, содержащий 50 мл модифицированной обогащенной питательной среды (Sigma, кат.Т 0918), инокулировали при OD=0,1 и затем выращивали при 30 С в присутствии 50 мг/л канамицина. При А 600=0,5-1 клетки индуцировали IPTG (изопропилтиогалактозид) в конечной концентрации 50 мкМ, и рост продолжался при той же температуре в течение ночи. Культуру центрифугировали и DAT0115 или DAT0117 "вылавливали" из культурального супернатанта с использованием смолы с белком L (сделанной в лаборатории). Периодическое связывание наблюдали в течение ночи при 8 С, смолу промывали 10 объемами колонки PBS, и DAT0115 или DAT0117 элюировали со смолы тремя объемами колонки 0,1 М глицина, рН 2. Белок нейтрализовали путем добавления 1/5 объема 1 М Трис рН 8,0. Белок затем анализировали посредством ДСН-геля и масс-спектрометрии (MS) или посредством деградации по Эдману (Edman). Векторы, экспрессирующие DAT0117, которые отмечены звездочкойтрансформировали, культивировали и анализировали с использованием условий, изложенных в примере 16. Таблица 13 Продукт амплификации содержит конструкцию DMS7139 с N-концевой сигнальной последовательностью MalEMKIKTGARILALSALTTMMFSASALA (фиг. 9(j): SEQ ID NO: 49) и оставляет на ее 5'- и 3'-концах последовательности для распознавания Ndel и EcoRI, соответственно. Образующиеся генные фрагменты переваривали с помощью Ndel/EcoRI и лигировали в вектор рЕТ 30, переваренный с помощьюNdel/EcoRI (Invitrogen). Для проверки вставки клоны секвенировали с использованием Т 7-прямых и Т 7 обратных праймеров. Вектор, экспрессирующий DMS7139, трансформировали в штамм Е. coli BL21-(DE3) (Novagen), содержащий вектор pECO-pgl (см. Aon et al. applied and environmental microbiology feb. 2008 vol.74, No.2, pg 950-958) и культуры выращивали при 30 С в минимальной среде (см. Korz D.J. et al. J.Biotechnol. 1995,39, p. 59-65), дополненный 50 мг/л канамицина и 37,5 мг/л хлорамфеникола. При А 600 от 0,25 до 0,5,клетки (фактическое полученное значение 0,347) индуцировали с помощью IPTG до конечной концентрации 70 мкМ, и рост продолжался при 28 С в течение ночи. Культуру центрифугировали и DMS7139"вылавливали" из культурального супернатанта с использованием смолы с белком L (сделанной в лаборатории). Периодическое связывание происходило в течение ночи при 4 С, смолу промывали 10 объемами колонки PBS, и DMS7139 элюировали из смолы тремя объемами колонки 0,1 М глицина рН 2. Белок затем анализировали посредством ДСН-геля и масс-спектрометрии. Как показано на фиг. 10, массспектрометрия демонстрирует очень чистый DMS7139. Последовательность ДНК, кодирующая белок DMS7139, также может быть оптимизирована по кодонам для экспрессии в Е. coli, и эта последовательность представлена на фиг. 2(u) SEQ ID NO: 50. Пример 21. DMS7139 связывается с GLP-1R мыши, крысы, яванского макака и человека со сходной эффективностью. Для того чтобы определить относительную эффективность DMS7139 в отношении GLP-1R человека, мыши, крысы и яванского макака, использовали биоанализ с меланофор-функциональным GLP-1R(сходный с Jayawickreme et. al., Curr Protocols in Pharmacol. 2005). Транслокация меланосом посредством 7TM активации была хорошо задокументирована, и G-белки, расположенные внутри меланофорных клеток, как было показано, связаны с GPCRs способом, сходным с клеточными системами млекопитающих(Gross et al., J Cell Biol 2002; 156:855-865). В этом биоанализе используют меланофорную клеточную линию, происходящую из клеток кожи лягушки Xenopus laevis, которые обладают темным пигментом (меланином) и содержат органеллы, известные как меланосомы (Lerner, Trends Neurosci. 1994; 17:142-146). Изменения внутриклеточного уровня сАМР контролируют степень, с которой меланосомы агрегируют или распределены в пределах клетки, и, таким образом, плотность окрашивания меланофорных клеток непосредственно связана с уровнями сАМР. Дополнительные детали представлены ниже. Полноразмерные кДНК с открытой рамкой считывания, кодирующие рецепторы GLP-1 крысы,мыши и человека, клонировали в экспрессирующий вектор pJG3.6 или pcDNA3 с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Номера доступа в Genebank представлены ниже в табл. 14. Таблица 14. Номера доступа в Genebank Клон, кодирующий GLP-1R яванского макака, амплифицировали с кДНК, обратно транскрибируемой с тотальной РНК, выделенной из легкого, печени и головного мозга яванского макака, и субклонировали в рсДНК 3.2DGW. Подтвердили полноразмерную последовательность кДНК. Меланофоры поддерживали во флаконах Т 225 (Costar, кат.3000) в среде L-15 при 27 С и 0% СО 2 и пересевали один раз в неделю (1:10) с флакона с конфлюэнтным монослоем с помощью 0,7 трипсина с последующей двукратной подпиткой в неделю. кДНК яванского макака представлена на фиг. 2(r) (SEQ ID NO: 45). Для аналитических целей клетки промывали, подвергали трипсинизации и ресуспендировали в 0,7EPG PBS в концентрации 15106 клеток на мл. 800 мкл Клеток осторожно смешивали с 20-40 мкг кДНК и инкубировали на льду в течение 20 мин. После инкубации 800 мкл смеси клеток/кДНК пипетировали в кювете и подвергали электропорации при 500 В, 725 мкФ и 950 Ом. Затем клетки переносили из кюветы непосредственно во флакон Т 75, содержащий RFM (обычная среда для лягушек), и инкубировали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в течение ночи в инкубаторе (25 С, 0% СО 2). На следующий день клетки подвергали трипсинизации, подсчитывали и добавляли в 96 полулуночные планшеты Costar (кат.3697) при плотности 300000 клеток на мл. Через 2 ч их помещали в герметичном контейнере в инкубатор на ночь (25 С, 0% СО 2). На следующий день среду удаляли и в каждую лунку добавляли по 25 мкл МАВ (буфер для анализа меланофоров), содержащего 1% DMSO и 10 нМ мелатонина. Клетки инкубировали в течение 1 ч и фоновое пропускание измеряли на планшетридере SLT Spectra при 620 нм. Затем в каждую лунку непосредственно добавляли серийные разведения(меланоцитостимулирующий гормон) 200 нМ и МАВ, использовали для установления минимального,максимального и фонового уровней ответа в аналитической системе, соответственно. После добавления пептидов и стандартов планшеты инкубировали в течение 1 ч и измеряли пропускание, как указано выше. Данные анализировали с использованием Robosage (версия 7.3.2) путем вычисления (1-Tf/Ti), где Ti представляет собой исходное фоновое значение и Tf представляет собой значение ответа. Активация Gs-сопряженного 7 ТМ рецептора (т.е. GLP-1R) приводит к увеличению внутриклеточного сАМР, заставляя меланосомы, которые были предварительно агрегированы с использованием мелатонина, становиться более диспергированными, ответ, который измеряют по уменьшению светопропускания через клетку. Альтернативно, в условиях уменьшения сАМР меланосомы агрегируют, что приводит к увеличению светопропускания через клетку. Поэтому после трансфекции и временной экспрессии плазмидной конструкции, содержащей кДНК GLP-1R, в меланофорах, относительную эффективностьDMS7139 для активации GLP-1R можно вычислить из кривой доза-ответ. Результаты представлены ниже в табл. 15.DMS7139 тестировали в отношении эффективности в анализе с использованием меланофоров,трансфицированных GLP-1R человека, мыши, крысы и яванского макака, по меньшей мере в двух повторностях для каждого вида. рЕС 50 для дублирующих анализов представлены в табл. 15. Эффективности в рецепторах яванского макака, человека и крысы очень сходны с возможно несколько более низкой эффективностью для мышиного рецептора. В целом, эти данные, представленные в табл. 15, обеспечивают достоверное доказательство, что эффективность, наблюдаемая в мышиных моделях с этим лекарственным средством, по-видимому, воспроизводится в возможных таксономических видах (крыса и яванский макак), а также у человека. Пример 22. Эффективность и продолжительность действия DAT0115 и DMS7139 на db/db мышиной модели диабета II типа. Цель данного исследования заключалась в определении и сравнении продолжительности действияDAT0115 и DMS7139 на толерантность к пероральной глюкозе у 10-11-недельных мышей db/db (полученных из Jackson Labs). Животных рандомизировали по группам обработки в соответствии с уровнями глюкозы в крови, определенными за три дня до начала эксперимента. Это обеспечивало сходный средний начальный уровень глюкозы в каждой группе исследования. DAT0115 и DMS7139 вводили подкожно по 1 мг/кг за 120, 96, 72 или 48 ч до перорального введения глюкозы (показано на фиг. 11 А).AUC для глюкозы значительно уменьшалась в течение 2 ч в тесте на толерантность к перорально вводимой глюкозе (OGTT) по сравнению с мышами db/db, обработанными контролем, для всех временных точек вполь до 120 ч для DMS7139 и для всех временных точек вполь до 96 ч для DAT0115 (фиг. 1IB). Хотя нет статистического различия между DAT0115 и DMS7139, вводимыми в 72, 96 или 120 ч,DAT0115 снижало AUC для глюкозы значительно больше, чем DMS7139 в 48 ч. Сделали вывод, что более последовательное уменьшение AUC для глюкозы, продемонстрированноеDMS7139, было показателем более желательного профиля для лекарственного средства этого класса. Таким образом, хотя это исследование не обнаружило явного превосходства, DMS7139 выбрали в качестве ведущего на основании этих и других данных. Пример 23. Повторная доза DMS7139 демонстрирует дозозависимое снижение HbAlc по сравнению с контрольным DOM7h-14. Цель данного исследования заключалась в анализе снижения HbAlc после повторной дозыDMS7139 у 10-11-недельных мышей db/db (Jackson labs). HbAlc является гликозилированной формой гемоглобина, концентрацию которого используют в качестве косвенного показателя концентрации глюкозы в плазме в течение длительного периода времени. Чтобы обеспечить сходный средний начальный уровень HbAlc в каждой из исследуемых групп, db/db мышей рандомизировали на основании уровнейHbAlc за три дня до начала эксперимента. Животным вводили либо DMS7139 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 мг/кг),Byetta (0,0001, 0,001, 0,01, 0,1 мг/кг), либо DOM7h-14 (0,3 мг/кг) подкожно QD (ежедневно) в течение 2 недель. Измерения массы тела, потребления пищи и глюкозы проводили во время исследования одновременно с измерениями HbAlc, производимыми в конце 14 суток. Потребляемая с пищей глюкоза и HbAlc были значительно снижены в группе обработки DMS7139 при 0,03, 0,1 и 0,3 мг/кг по сравнению с контролем (DOM7h-14), хотя они не отличались значительно от контроля с физиологическим раствором (см. результаты на фиг. 12). Данные, полученные для контроля с физиологическим раствором, были ниже, чем ожидалось на основании данных, полученных с самой маленькой дозой эксендина-4 или DMS7139. Не наблюдалось никаких изменений с эксендином-4 по сравнению с контролем с физиологическим раствором. Также наблюдалось значительное снижение массы тела и потребления пищи в случае DMS7139. Эксендин-4 не продемонстрировал значительных эффектов на потребление пищи при самой высокой дозе. Сделали вывод, что повторное введение DMS7139 приводит к снижению HbAlc у мышей db/db, а также влияет на потребление пищи и массу тела. Эти изменения согласуются с ожидаемыми изменениями для агониста GLP-1R. Пример 24. DAT0115 и DMS7139 показали дозозависимое уменьшение потребления пищи и массы тела по сравнению с DOM7h-14 контролем при индуцированном диетой ожирении (DIO) в мышиной модели ожирения. Цель исследования, описанная в данной заявке, заключалась в том, чтобы определить, влияет ли