Получение закрытой линейной днк

In vitro способ получения закрытой линейной дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК включает в себя: (а) контактирование ДНК-матрицы, содержащей по меньшей мере одну протеломеразную последовательность-мишень, по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой в присутствии одного или более праймеров при условиях, способствующих амплификации указанной матрицы; и(b) контактирование амплифицированной ДНК, полученной в (а), по меньшей мере с одной протеломеразой при условиях, способствующих получению закрытой линейной ДНК. В наборе предоставлены компоненты, необходимые для осуществления способа. Область техники Настоящее изобретение относится к in vitro бесклеточному способу получения закрытой линейной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Предпосылки изобретения Традиционные способы крупномасштабной амплификации ДНК с использованием клеток являются затратными. Например, использование бактерий требует их роста в больших объемах в дорогостоящих ферментерах, которые необходимо содержать в стерильных условиях для предупреждения загрязнения культуры. Бактерии также необходимо лизировать для высвобождения амплифицированной ДНК, и ДНК нуждается в очистке от других бактериальных компонентов. В частности, при производстве ДНК-вакцин или других терапевтических ДНК-агентов требуется высокая степень чистоты для удаления эндотоксинов, являющихся токсичными для млекопитающих. В дополнение к стоимости процесса использование бактерий во многих случаях может затруднять точность амплификации. В комплексном биохимическом окружении бактериальной клетки сложно осуществлять контроль качества и выхода желательного ДНК-продукта. Бактерия может случайно изменить представляющий интерес ген, клонированный в амплифицируемой ДНК, и сделать его бесполезным для заданной цели. Рекомбинация также может вызвать проблемы в точности продукции представляющей интерес ДНК. Бесклеточные ферментативные способы амплификации ДНК позволяют избежать необходимости использовать клетки-хозяева и поэтому являются предпочтительными. Например, производство ДНК-кассет для медицинского применения практически без исключений основано на их встраивании в бактериальные плазмиды и их амплификации в процессах бактериальной ферментации. Текущее состояние способов получения ДНК в данной области различным образом ограничивает возможности улучшения производства таких терапевтических средств на основе ДНК. Кроме того, плазмидный продукт является, по существу, "неочищенной" молекулой ДНК, в том смысле, что он содержит нуклеотидные последовательности, не требуемые для терапевтической функции молекулы ДНК. Соответственно, в области производства ДНК-продуктов, таких как терапевтические средства на основе ДНК,существует необходимость в улучшенных способах амплификации ДНК в больших количествах. В частности, существует необходимость в улучшенных способах амплификации конкретных форм ДНК, таких как закрытая линейная ДНК. Закрытые линейные молекулы ДНК особенно пригодны для применения в терапии благодаря своей более высокой стабильности и лучшей безопасности относительно других форм ДНК. Краткое изложения сущности изобретения Настоящее изобретение относится к способу in vitro бесклеточного получения линейной ковалентно закрытой ДНК (закрытой линейной ДНК). Этот способ позволяет улучшить получение линейной ковалентно закрытой ДНК по сравнению с текущими методиками, включающими в себя клеточные способы и амплификацию в плазмидах. Этот способ значительно увеличивает выход продукта, одновременно снижая стоимость его очистки. По настоящему изобретению линейную ковалентно закрытую ДНК на основе ДНК-матрицы получают ферментативно в отсутствие клеток-хозяев. ДНК-матрица содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень протеломеразы. Матричная ДНК контактирует по меньшей мере с одной ДНКполимеразой в присутствии одного или более праймеров в условиях, способствующих амплификации матрицы. ДНК, амплифицированная с матрицы, контактирует по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих получению закрытой линейной ДНК. Соответственно, настоящее изобретение относится к in vitro бесклеточному способу получения закрытой линейной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), включающему в себя:(а) контактирование ДНК-матрицы, содержащей по меньшей мере одну последовательностьмишень протеломеразы, по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой в присутствии одного или более праймеров в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы; и(b) контактирование амплифицированной ДНК, полученной в (а), по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих получению закрытой линейной ДНК. Изобретение дополнительно относится к набору, обеспечивающему компоненты, необходимые в способе по изобретению. Таким образом, изобретение относится к набору, содержащему по меньшей мере одну ДНК-полимеразу и по меньшей мере одну протеломеразу и инструкции по использованию в способе по изобретению. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - репликация линейной ковалентно закрытой ДНК в бактериофагах и роль протеломеразы. А. Изображение внехромосомной линейной ковалентно закрытой ДНК бактериофага;- центр палиндромной последовательности теломеры; R-последовательность представляет собой инвертированный палиндромный повтор L-последовательности. В. Репликация ДНК бактериофага в хозяине: овал указывает репликацию цепи ДНК; синтез цепи,комплементарной R и L, приводит к идентичным двухцепочечным RL-последовательностям. С. Продукты, образующиеся в результате действия протеломеразы. Протеломераза связывается сRL-последовательностью и разрезает и лигирует противоположные цепи в центральной точке палиндромной последовательности, повторно образуя теломеры и завершая репликацию исходной линейной ковалентно закрытой ДНК. Фиг. 2 - действие протеломеразы фага N15 из Escherichia coli (TelN) на кольцевую двухцепочечную ДНК, содержащую ее сайт-мишень telRL. TelRL представляет собой инвертированный палиндром с 28 нуклеотидными правым (telR) и левым (telL) плечами, указанными стрелками. Подчеркнутые последовательности указывают несовершенство в палиндроме telRL. Центральный 22-нуклеотидный совершенный инвертированный палиндром TelO необходим для связывания фермента TelN. TelN расщепляет эту 22 нуклеотидную последовательность в центре и соединяет концы комплементарных цепей, образуя ковалентно закрытые концы. Фиг. 3 - сравнение протеломеразных последовательностей-мишеней, найденных в различных организмах. Последовательности в рамке показывают длину совершенной или несовершенной палиндромной последовательности. Подчеркнуты несовершенства в палиндроме. Выделенные цветом последовательности пар оснований являются общими для всех протеломеразных последовательностей-мишеней, что указывает на их важность для связывания и действия протеломеразы. А. Фаг N15 из Escherichia coli. В. ФагPhi K02 из Klebsiella. С. Фаг Ру 54 из Yersinia. D. Фаг Phi HAP из Halomonas. E. Фаг VP882 из Vibrio. F. Плазмида lpB31.16 из Borrelia burgdorferi. Последовательности в рамке показывают длину совершенной или несовершенной палиндромной последовательности для каждого бактериофага. G. Показана консенсусная инвертированная палиндромная последовательность для связывания и действия протеломеразы бактериофага. Она представляет собой последовательность 22-нуклеотидного совершенного инвертированного повтора (по 11 пар оснований в обе стороны от места расщепления). Консенсусная последовательность выведена из выделенных цветом консервативных остатков, показанных на А-Е. Указаны консервативные пары оснований и их позиции в палиндроме. Тире указывают на гибкость состава последовательности, то есть когда основания могут представлять собой любой нуклеотид N (А, Т, С или G). Фиг. 4 - конкретный способ in vitro амплификации линейной двухцепочечной ковалентно закрытой ДНК с использованием ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи по типу катящегося кольца(RCA) в комбинации с протеломеразой TelN. А. Закрытая линейная ДНК-матрица. R и L представляют собой ДНК-последовательности правого или левого плеча последовательности связывания протеломеразы TelN. В. Денатурация исходной матрицы с образованием кольцевой одноцепочечной ДНК. С. Связывание праймера. D-E. Амплификация по типу катящегося кольца на одноцепочечной ДНК-матрице с помощью ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи по типу RCA. F. Образование длинных конкатемерных двухцепочечных ДНК, содержащих одиночные элементы амплифицированной матрицы, разделенные последовательностями связывания протеломеразы (RL). G. Контактирование с протеломеразойTelN, специфичной к RL-последовательности. Протеломераза расщепляет конкатемерную ДНК по RLсайту и лигирует комплементарные цепи, давая амплифицированные копии исходной линейной ковалентно закрытой ДНК-матрицы. Фиг. 5 - вырезание ДНК-кассеты, экспрессирующей представляющий интерес ген, из длинной двухцепочечной молекулы ДНК для создания закрытой линейной ДНК-кассеты. А. Линейная двухцепочечная молекула ДНК, содержащая ДНК-кассету, включающую в себя представляющий интерес ген,фланкированный протеломеразными последовательностями-мишенями. В. Вырезание ДНК-кассеты в качестве линейной ковалентно закрытой молекулы ДНК. Фиг. 6 - амплификация закрытой линейной ДНК и экспрессия репортерного гена с использованием экспрессионной кассеты в форме "собачьей косточки".A. Подтверждение с помощью электрофореза в агарозном геле расщепления с помощью TelN RCAамплифицированных конкатемеров с образованием закрытой линейной ДНК. В дорожках 1-3 показанаRCA-амплифицированная плазмида pUC18. Дорожка 1: 3 мкл RCA-амплифицированной нерасщепленной pUC18. Дорожка 2: 2 мкл RCA-амплифицированной плазмиды pUC18, расщепленной PvuI. Дорожка 3: 2 мкл RCA-амплифицированной плазмиды pUC18, обработанной TelN (отрицательный контроль). В дорожках 4-6 показана RCA-амплифицированная плазмида pUC18-telRL. Дорожка 4: 3 мкл RCAамплифицированной нерасщепленной pUC18-telRL. Дорожка 5: 1 мкл RCA-амплифицированной плазмиды pUC18-telRL, расщепленной PvuI. Дорожка 6: 4 мкл RCA-амплифицированной плазмиды pUC18telRL, обработанной TelN. Указана закрытая линейная ДНК размером 2,7 т.п.о., образующаяся в результате обработки TelN. Фланкирующие дорожки являются маркерами размера ДНК.B. LOC-анализ (Lab-On-A-Chip, анализ с использованием микрочипа), показывающий устойчивость закрытой линейной ДНК к температурной денатурации. Дорожка 1: маркер размеров ДНК. Дорожки 2 и 3: 100 нг продукта PCR DOG. Дорожки 4 и 5: 100 нг денатурированного продукта PCR DOG. Дорожки 6 и 7: ДНК в форме "собачьей косточки" - 100 нг pGL DOG, обработанной TelN. Дорожки 6 и 7: ДНК в форме "собачьей косточки" - 100 нг pGL DOG, обработанной TelN и денатурированной. С. Подтверждение экспрессии закрытой линейной ДНК в клетках с помощью трансфекции. Ось у: среднее соотношение интенсивности люминесценции люциферазы из светлячка (Firefly) и люциферазы из кораллового полипа (Renilla); ось х: линейные конструкции ДНК, используемые в трансфекции. PCRPCR DOG: открытый линейный ПЦР-фрагмент, амплифицированный на матрице pGL DOG с использованием праймеров, фланкирующих сайты telRL. "Собачья косточка", мини-преп: закрытая линейная ДНК из плазмиды pGL DOG, выделенная с помощью набора для мини-выделений ДНК (мини-препа), расщепленная PvuI (для удаления контаминирующей векторной ДНК) и расщепленная TelN. "Собачья косточка", RCA: закрытая линейная ДНК из плазмиды pGL DOG, амплифицированная с помощью RCA, расщепленная PvuI и расщепленная TelN. Описание последовательностейSEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность ДНК-полимеразы бактериофага phi29 из Bacillus.SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность ДНК-полимеразы бактериофага phi29 из Bacillus, кодируемую SEQ ID NO: 1.SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность ДНК-полимеразы DeepSEQ ID NO: 4 представляет собой нуклеотидную последовательность ДНК-полимеразы I из BacillusSEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность ДНК-полимеразы I из Bacillus stearothermophilus, кодируемую SEQ ID NO: 4.SEQ ID NO: 6 представляет собой нуклеотидную последовательность протеломеразы фага phiHAP1 из Halomonas.SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность протеломеразы фагаSEQ ID NO: 8 представляет собой нуклеотидную последовательность протеломеразы фага PY54 изSEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность протеломеразы фага PY54 из Yersinia, кодируемую SEQ ID NO: 8.SEQ ID NO: 10 представляет собой нуклеотидную последовательность протеломеразы фага phiK02 из Klebsiella.SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность протеломеразы фагаSEQ ID NO: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность протеломеразы фага VP882 из Vibrio.SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность протеломеразы фагаSEQ ID NO: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность протеломеразы бактериофага N15 из Escherichia coli (telN) и нуклеотидную последовательность вторичного иммунного репрессораSEQ ID NO: 15 представляет собой аминокислотную последовательность протеломеразы бактериофага N15 из Escherichia coli (telN), кодируемую SEQ ID NO: 14.SEQ ID NO: 16 представляет собой консенсусную нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора, присутствующего в последовательности-мишени протеломеразы бактериофага.SEQ ID NO: 17 представляет собой 22-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага N15 из Е. coli и фага phiK02 из Klebsiella.SEQ ID NO: 18 представляет собой 22-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага PY54 из Yersinia.SEQ ID NO: 19 представляет собой 22-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага phiHAP-1 из Halomonas.SEQ ID NO: 20 представляет собой 22-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага VP882 из Vibrio.SEQ ID NO: 21 представляет собой 14-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из плазмиды lpB31.16 из Borrelia burgdorferi.SEQ ID NO: 22 представляет собой 24-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага VP882 из Vibrio.SEQ ID NO: 23 представляет собой 42-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага PY54 из Yersinia.SEQ ED NO: 24 представляет собой 90-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага phiHAP-1 из Halomonas.SEQ ID NO: 25 представляет собой нуклеотидную последовательность из фага N15 из Е. coli, содержащую протеломеразную последовательность-мишень.SEQ ID NO: 26 представляет собой нуклеотидную последовательность из фага phiK02 из Klebsiella,содержащую протеломеразную последовательность-мишень.SEQ ID NO: 27 представляет собой нуклеотидную последовательность из фага PY54 из Yersinia, со-3 021069SEQ ID NO: 28 представляет собой нуклеотидную последовательность из фага VP882 из Vibrio, содержащую протеломеразную последовательность-мишень.SEQ ID NO: 29 представляет собой нуклеотидную последовательность из плазмиды lpB31.16 изSEQ ID NO: 30 представляет собой модифицированный олигонуклеотидный праймер, используемый в амплификации TelN.SEQ ID NO: 31 представляет собой модифицированный олигонуклеотидный праймер, используемый в амплификации TelN.SEQ ID NO: 32 представляет собой синтетический олигонуклеотид, содержащий сайт узнаванияSEQ ID NO: 33 представляет собой синтетический олигонуклеотид, содержащий сайт узнаванияSEQ ID NO: 34 представляет собой последовательность праймера, используемого в амплификации фрагмента PCR DOG.SEQ ID NO: 35 представляет собой последовательность праймера, используемого в амплификации фрагмента PCR DOG. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способам получения линейной двухцепочечной ковалентно закрытой ДНК, то есть закрытых линейных молекул ДНК. Закрытые линейные молекулы ДНК обычно содержат ковалентно соединенные концы, также описываемые как шпилечные петли, в которых отсутствует образование пар между основаниями комплементарных цепей ДНК. Шпилечные петли соединяют концы комплементарных цепей ДНК. Структуры этого типа обычно образуются на теломерных концах хромосом для защиты от утери или повреждения хромосомной ДНК путем соединения концевых нуклеотидов в закрытую структуру. В примерах закрытых линейных молекул ДНК, описанных в настоящем документе, шпилечные петли фланкируют комплементарные спаренные цепи ДНК, образуя структуру в форме "собачьей косточки" (показанной на фиг. 1). Способы по настоящему изобретению относятся к высокопроизводительному получению закрытых линейных молекул ДНК путем включения отдельной стадии обработки, превращающей амплифицированную ДНК в закрытую линейную ДНК. В дополнение способы по настоящему изобретению проводятin vitro в бесклеточной среде, и как таковые они не ограничены использованием ДНК-матриц с дополнительными последовательностями, необходимыми для размножения бактерий. Поэтому, как указано ниже, способ по изобретению можно использовать для получения закрытых линейных молекул ДНК, которые не имеют векторных последовательностей, вызывающих проблемы, и особенно подходят для терапевтического применения. Закрытые молекулы ДНК особенно применимы в качестве терапевтических агентов, то есть лекарственных средств на основе ДНК, которые можно использовать для in vivo экспрессии продукта гена. Это обусловлено тем, что их ковалентно закрытая структура предупреждает атаку ферментами, такими как экзонуклеазы, приводя к повышению стабильности и продолжительности экспрессии гена по сравнению с "открытыми" молекулами ДНК с экспонированными концами ДНК. Было продемонстрировано,что линейные двухцепочечные кассеты с открытыми концами не эффективны в отношении экспрессии генов при введении этих кассет в ткани-хозяева. Полагают, что причиной является нестабильность кассеты вследствие действия экзонуклеаз во внеклеточном пространстве. Изолирование концов ДНК в ковалентно закрытых структурах также имеет другие преимущества. Предупреждается интеграция концов ДНК в геномную ДНК, так что закрытые линейные молекулы ДНК имеют большую безопасность. Также закрытая линейная структура предупреждает конкатемеризацию молекул ДНК в клетках-хозяевах, и поэтому уровень экспрессии продукта гена можно регулировать более точно. Настоящее изобретение относится к in vitro бесклеточному способу получения закрытых линейных молекул ДНК, который включает в себя ДНК-амплификацию на матрице и специфичную обработку амплифицированной ДНК протеломеразой. Обычно способ по изобретению можно использовать для получения ДНК для in vitro экспрессии в клетке-хозяине, в частности в ДНК-вакцинах. ДНК-вакцины обычно кодируют модифицированную форму ДНК инфекционного организма. ДНК-вакцины вводят субъекту, в котором они затем экспрессируют конкретный белок инфекционного организма, вызывая иммунный ответ против белка, который обычно является защитным. ДНК-вакцины могут также кодировать опухолевый антиген в противораковой иммунотерапии. ДНК-вакцина может включать в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген, для лечения или предупреждения ряда патологических состояний, в том числе, но не ограниченных этим,рак, аллергические реакции, токсическое действие и инфекцию патогенов, таких как, но не ограниченных этим, грибки, вирусы, в том числе вирус папилломы человека (HPV), HIV, HSV2/HSV1, вирус гриппа (типы А, В и С), полиовирус, респираторный синцитиальный вирус, риновирусы, ротавирусы, вирус гепатита А, группа вирусов Норволк, энтеровирусы, астровирусы, вирус кори, вирус парагриппа, вирус бактерии, вызывающие донованоз (Klebsiella granulomatis) и актиномицеты; грибковые патогены, включая вызывающие кандидоз и аспергиллез; паразитарные патогены, включая ленточных червей, сосальщиков, круглых червей, возбудителя амебиаза, возбудителя гиардиаза, Cryptosporidium, Schistosoma,Pneumocystis carinii, возбудителя трихомониаза и трихинеллеза. ДНК-вакцины могут содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие антиген вируса из семейства аденовирусов (включая, например, аденовирус человека), герпесвирусов (включая, например,HSV-1, HSV-2, EBV, CMV и VZV), паповавирусов (включая, например, HPV), поксвирусов (включая,например, вирус оспы и вакциния вирус), парвовирусов (включая, например, парвовирус В 19), реовирусов (включая, например, ротавирус), коронавирусов (включая, например, вирус SARS), флавивирусов(включая, например, вирус желтой лихорадки, вирус Западного Нила, вирус лихорадки денге, вирус гепатита С и вирус клещевого энцефалита), пикорнавирусов (включая полиовирус, риновирус и вирус гепатита А), тогавирусов (включая, например, вирус краснухи), филовирусов (включая, например, вирус Марбург и Эбола), парамиксовирусов (включая, например, вирус парагриппа, респираторный синцитиальный вирус, вирусы паротита и кори), рабдовирусов (включая, например, вирус бешенства), буньявирусов (включая, например, вирус Ганта), ортомиксовирусов (включая, например, вирусы гриппа А, В и С), ретровирусов (включая, например, HIV и HTLV) и гепаднавирусов (включая, например, вирус гепатита В). Антиген может относиться к патогену, ответственному за ветеринарное заболевание, и, в частности,относится к вирусному патогену, включая, например, реовирус (такой как вирус африканской болезни лошадей или вирус инфекционной катаральной лихорадки овец) и герпесвирусы (включая вирус герпеса лошадей). Антигеном может быть антиген вируса болезни "ног и рта", вируса клещевого энцефалита,вируса лихорадки денге, вируса SARS, вируса лихорадки Западного Нила и вируса Хантаан. Антиген может относиться к вирусу иммунодефицита и может быть, например, из SIV или вируса кошачьего иммунодефицита. ДНК-вакцины, получаемые способом по изобретению, могут также содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую опухолевые антигены. Примеры антигенов, ассоциированных с опухолями, включают, но не ограничены, антигены рака яичек, такие как члены MAGE-семейства (MAGE 1, 2,3 и т.д.), NY-ESO-1 и SSX-2, антигены дифференцировки, такие как тирозиназа, gp100, PSA, Her-2 и СЕА, мутированные собственные антигены и вирусные опухолевые антигены, такие как Е 6 и/или Е 7 из онкогенных типов HPV. Дополнительные примеры конкретных опухолевых антигенов включают MART1, Melan-А, р 97, бета-HCG, GaINAc, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-4, MAGE-12, MUC1, MUC2, MUC3,MUC4, MUC18, СЕА, DDC, Р 1 А, EpCam, меланомный антиген gp75, Hker 8, высокомолекулярный меланомный антиген, K19, Tyr1, Tyr2, члены семейства генов pMel 17, c-Met, PSM (муциновый антиген простаты), PSMA (специфичный для простаты мембранный антиген), секреторный белок простаты, альфафетопротеин, СА 125, СА 19.9, TAG-72, антигены BRCA-1 и BRCA-2. Также с помощью способа по изобретению можно получать другие типы терапевтических молекул ДНК, например, используемых в генной терапии. Например, такие молекулы ДНК можно использовать для экспрессии функционального гена в случае, когда субъект имеет генетическое нарушение, вызванное нефункциональной версией этого гена. Примеры таких заболеваний включают мышечную дистрофию Дюшенна, кистозный фиброз, болезнь Гоше и недостаточность аденозиндезаминазы (ADA). Другие заболевания, при которых может применяться генная терапия, включают воспалительные заболевания,аутоиммунные, хронические и инфекционные заболевания, включая такие заболевания, как СПИД, рак,неврологические заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, гиперхолестеринемию, различные заболевания крови, включая различные анемии, талассемию и гемофилию, и эмфизему. Для лечения солидных опухолей можно экспрессировать гены, кодирующие токсические пептиды (например, химиотерапевтические агенты, такие как рицин, дифтерийный токсин и фактор из яда кобры), гены опухолевых супрессоров, таких как р 53, гены, кодирующие последовательности мРНК, являющихся антисмысловыми к трансформирующим онкогенам, антинеопластические пептиды, такие как фактор некроза опухолей(TNF) и другие цитокины, или трансдоминантно-негативные мутанты трансформирующих онкогенов. Также предусмотрено получение способом по изобретению других типов терапевтических молекул ДНК. Например, по способу по изобретению можно получать молекулы ДНК, которые транскрибируются в активные формы РНК, например малые интерферирующие РНК (миРНК). В вариантах осуществления изобретения, направленных на получение молекул ДНК, имеющих терапевтическое применение, ДНК-матрица будет обычно включать в себя экспрессионную кассету, содержащую один или более промоторных или энхансерных элементов и ген или другую кодирующую последовательность, которые кодируют представляющие интерес РНК или белок. В конкретных вариантах осуществления изобретения, направленных на создание молекул ДНК-вакцины или молекул ДНК для генной терапии, ДНК-матрица включает в себя экспрессионную кассету, состоящую из эукариотического промотора, функционально соединенного с последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок, и, необязательно, с энхансерной последовательностью и/или эукариотической последовательностью терминации транскрипции. Обычно ДНК-матрица может находиться в форме вектора, обычно используемого для содержания гена, например, внехромосомного генетического элемента, такого как плазмида."Промотор" представляет собой нуклеотидную последовательность, которая инициирует и регулирует транскрипцию полинуклеотида. Промоторы могут включать в себя индуцируемые промоторы (когда экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируется веществом, определяемым при анализе, кофактором, регуляторным белком и т.д.), репрессируемые промоторы (когда экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, подавляется (репрессируется) химическим соединением, кофактором, регуляторным белком и т.д.) и конститутивные промоторы. Предполагается, что термин "промотор" или "контролирующий элемент" включает полноразмерные промоторные области и функциональные сегменты этих областей(например, которые контролируют транскрипцию или трансляцию)."Функционально соединенный" относится к расположению элементов, при котором описываемые компоненты скомпонованы для выполнения своих обычных функций. Таким образом, данный промотор,функционально соединенный с нуклеотидной последовательностью, способен осуществлять экспрессию этой последовательности в присутствии соответствующих ферментов. Промотор не обязательно должен быть соединен непосредственно с последовательностью, при условии что он осуществляет его экспрессию. Поэтому, например, возможно присутствие промежуточных нетранслируемых, но транскрибируемых последовательностей между промоторной последовательностью и нуклеотидной последовательностью, и промоторную последовательность все еще можно считать "функционально соединенной" с кодирующей последовательностью. Поэтому предполагается, что термин "функционально соединенные" охватывает любое пространственное расположение или ориентацию промоторного элемента и представляющей интерес последовательности ДНК, которые позволяют инициировать транскрипцию представляющей интерес последовательности ДНК после узнавания промоторного элемента транскрипционным комплексом. По настоящему изобретению закрытые линейные молекулы ДНК получают в результате действия протеломеразы на ДНК, амплифицированную на ДНК-матрице, содержащей по меньшей мере одну последовательность-мишень протеломеразы. Последовательность-мишень протеломеразы представляет собой последовательность ДНК, присутствие которой в матрице ДНК позволяет ее превращение в закрытую линейную ДНК в результате ферментативной активности протеломеразы. Другими словами, последовательность-мишень протеломеразы необходима для расщепления и последующего лигирования двухцепочечной ДНК протеломеразой с образованием ковалентно закрытой линейной ДНК. Обычно последовательность-мишень протеломеразы содержит любые совершенные палиндромные последовательности, то есть любую последовательность двухцепочечной ДНК, имеющую осевую симметрию вращения 2-го порядка, также описываемую в настоящем документе, как совершенный инвертированный повтор. Как показано на фиг. 3, все последовательности-мишени протеломераз из различных мезофильных бактериофагов и бактериальных плазмид имеют общий признак - присутствие совершенного инвертированного повтора. Длина совершенного инвертированного повтора отличается в зависимости от конкретного организма. У Borrelia burgdorferi совершенный инвертированный повтор имеет длину 14 пар оснований. У различных мезофильных бактериофагов совершенный инвертированный повтор имеет длину 22 пары оснований или больше. Также в некоторых случаях, например в случае бактериофага N15 из Е. coli, центральный совершенный инвертированный палиндром фланкирован последовательностями инвертированных повторов, то есть представляет собой центральную часть более крупного несовершенного инвертированного палиндрома (см. фиг. 2 и 3; подчеркнутые основания указывают места,в которых нарушена симметрия инвертированных повторов). Последовательность-мишень протеломеразы, используемая в изобретении, предпочтительно содержит двухцепочечную палиндромную последовательность (совершенный инвертированный повтор) длиной по меньшей мере 14 пар оснований. Предпочтительные последовательности совершенных инвертированных повторов включают последовательности SEQ ID NO: 16-21 и их варианты. SEQ ID NO: 16(NCATNNTANNCGNNTANNATGN) представляет собой 22-нуклеотидную консенсусную последовательность совершенного инвертированного повтора из мезофильного бактериофага. Как показано на фиг. 3, определенные нуклеотидные позиции совершенного инвертированного повтора консервативны между различными бактериофагами, в то время как в других позициях последовательность может отличаться. Таким образом, SEQ ID NO: 16 представляет собой минимальную консенсусную последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразой бактериофага в способе по настоящему изобретению. Для консенсусной последовательности, определенной SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 (CCATTATACGCGCGTATAATGG) представляет собой особенно предпочтительную последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразами фага N15 из Е. coli (SEQ ID являются особенно предпочтительными последовательностями совершенных инвертированных повторов для использования, соответственно, с протеломеразами фага PY54 из Yersinia (SEQ ID NO: 9), фагаphiHAP-1 из Halomonas (SEQ ID NO: 7) и фага VP882 из Vibrio (SEQ ID NO: 13). SEQ ID NO: 21 (ATTATATATATAAT) представляет собой особенно предпочтительную последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразой из Borrelia burgdorferi. Эта последовательность совершенного инвертированного повтора находится в линейной ковалентно закрытой плазмидеlpB31.16, содержащейся в Borrelia burgdorferi. Эта 14-нуклеотидная последовательность короче 22 нуклеотидного консенсусного совершенного инвертированного повтора для бактериофагов (SEQ ID NO: 16), что указывает на то, что бактериальные протеломеразы могут отличаться по специфичным последовательностям-мишеням от бактериальных протеломераз. Однако все последовательности-мишени протеломераз несут общий структурный мотив совершенного инвертированного повтора. Последовательность совершенного инвертированного повтора может иметь длину больше 22 нуклеотидов в зависимости от требований конкретной протеломеразы, используемой в способе по изобретению. Поэтому в некоторых вариантах осуществления изобретения длина совершенного инвертированного повтора может составлять по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 60, по меньшей мере 80 или по меньшей мере 100 пар оснований. Примеры таких последовательностей совершенных инвертированных повторов включают SEQ ID NO: 22-24 и их варианты.SEQ ID NO: 22-24 и их варианты особенно предпочтительны для использования, соответственно, с протеломеразами фага VP882 из Vibrio (SEQ ID NO: 13), фага PY54 из Yersinia (SEQ ID NO: 9) и фагаphiHAP-1 из Halomonas (SEQ ID NO: 7). Совершенный инвертированный повтор может фланкироваться дополнительными последовательностями инвертированных повторов. Фланкирующие инвертированные повторы могут представлять собой совершенные или несовершенные повторы, то есть могут быть полностью симметричными или частично симметричными. Фланкирующие инвертированные повторы могут примыкать непосредственно к центральному палиндрому или могут быть отделены от него. Протеломеразная последовательность-мишень может включать в себя последовательность несовершенного инвертированного повтора, которая содержит последовательность совершенного инвертированного повтора длиной по меньшей мере 14 пар оснований. Примером является SEQ ID NO: 29. Последовательность несовершенного инвертированного повтора может содержать последовательность совершенного инвертированного повтора длиной по меньшей мере 22 пары оснований. Примером является SEQ ID NO: 25. Особенно предпочтительные протеломеразные последовательности-мишени включают в себя последовательности SEQ ID NO: 25-29 или их варианты. Последовательности SEQ ID NO: 25-29 содержат последовательности совершенных инвертированных повторов, описанных выше, и дополнительно содержат фланкирующие последовательности из соответствующих организмов. Последовательность-мишень протеломеразы, содержащая последовательность SEQ ID NO: 25 или ее вариант, предпочтительна для использования совместно с протеломеразой TelN (фаг N15 из Е. coli) с последовательностью SEQ ID NO: 15 или ее вариантами. Последовательность-мишень протеломеразы,содержащая последовательность SEQ ID NO: 26 или ее вариант, предпочтительна для использования совместно с протеломеразой фага PhiK02 из Klebsiella с последовательностью SEQ ID NO: 11 или ее вариантами. Последовательность-мишень протеломеразы, содержащая последовательность SEQ ID NO: 27 или ее вариант, предпочтительна для использования совместно с протеломеразой фага PY54 из Yersinia с последовательностью SEQ ID NO: 9 или ее вариантами. Последовательность-мишень протеломеразы,содержащая последовательность SEQ ID NO: 28 или ее вариант, предпочтительна для использования совместно с протеломеразой фага VP882 из Vibrio с последовательностью SEQ ID NO: 13 или ее вариантами. Последовательность-мишень протеломеразы, содержащая последовательность SEQ ID NO: 29 или ее вариант, предпочтительна для использования совместно с протеломеразой Borrelia burgdorferi. Варианты любой палиндромной последовательности или последовательности-мишени протеломеразы, описанных выше, включают их гомологи и мутанты. Мутанты включают укороченные последовательности, замены или делеции в последовательности относительно нативной последовательности. Вариант последовательности представляет собой любую последовательность, присутствие которой в ДНКматрице позволяет ее превращение в закрытую линейную ДНК в результате ферментативной активности протеломеразы. Это легко можно определить, используя соответствующий метод анализа образования закрытой линейной ДНК. Можно использовать любой подходящий метод анализа, описанный в данной области. Пример подходящего метода анализа описан в Deneke et al., PNAS (2000) 97, 7721-7726. Предпочтительно указанный вариант обеспечивает связывание и активность протеломеразы, которые сравнимы со свойствами и активностью, наблюдаемыми в случае нативной последовательности. Примеры предпочтительных вариантов палиндромных последовательностей, описанных в настоящем документе,включают в себя укороченные палиндромные последовательности, в которых сохранена структура совершенного повтора и которые сохраняют способность обеспечивать образование закрытой линейной ДНК. Однако варианты последовательностей-мишеней протеломеразы могут быть модифицированы таким образом, что они не сохраняют структуру совершенного палиндрома при условии, что они способны действовать в качестве субстратов для действия протеломеразы. Следует понимать, что опытный специалист легко определит подходящие последовательностимишени протеломеразы для использования в изобретении, исходя из структурных принципов, указанных выше. Потенциальные последовательности-мишени протеломеразы можно скринировать на их способность обеспечивать образование закрытой линейной ДНК, используя описанные выше методы анализа. ДНК-матрица может содержать больше одной протеломеразной последовательности-мишени, например две, три, четыре, пять, десять или больше протеломеразных последовательностей-мишеней. Использование множества протеломеразных последовательностей-мишеней может позволить вырезать короткие закрытые линейные ДНК, содержащие представляющие интерес последовательности, из более крупной молекулы ДНК. В частности, одна или более представляющих интерес последовательностей в матрице ДНК могут фланкироваться с двух сторон (то есть с 5' и 3') последовательностью-мишенью протеломеразы. Две фланкирующие последовательности-мишени протеломеразы могут затем опосредовать вырезание каждой короткой представляющей интерес последовательности из амплифицированной ДНК в качестве закрытой линейной ДНК, объекта действия протеломеразы (как показано на фиг. 5). ДНКматрица может содержать одну или более представляющих интерес последовательностей (предпочти-8 021069 тельно экспрессионных кассет), фланкированных с двух сторон последовательностями-мишенями протеломеразы. ДНК-матрица может включать в себя две, три, четыре, пять или более представляющих интерес последовательностей, фланкированных протеломеразными последовательностями-мишенями, описанными выше. В предпочтительном варианте осуществления изобретения в способе по изобретению используют матрицу ДНК, содержащую экспрессионную кассету, фланкированную с двух сторон последовательностью-мишенью протеломеразы. Предпочтительно, чтобы экспрессионная кассета содержала эукариотический промотор, функционально соединенный с представляющей интерес кодирующей последовательностью и, необязательно, с эукариотической последовательность терминации транскрипции. В этом варианте осуществления изобретения после амплификации матрицы ДНК и контактирования с протеломеразой по изобретению экспрессионная кассета высвобождается из амплифицированной матрицы в качестве закрытой линейной ДНК. Как результат, из продукта одновременно удаляются излишние последовательности в матрице ДНК. Такие излишние или дополнительные последовательности (также описываемые как бактериальные или векторные последовательности) могут включать в себя бактериальную точку инициации репликации, бактериальные селективные маркеры (например, гены устойчивости к антибиотикам) и неметилированные CpG-динуклеотиды. Удаление таких последовательностей создает "минимальную" экспрессионную кассету, которая не содержит дополнительного генетического материала. Также вышеописанные бактериальные последовательности могут быть проблематичными для некоторых терапевтических подходов. Например, в клетках млекопитающих бактериальная/плазмидная ДНК может вызывать "выключение" экспрессии клонированного гена, что делает невозможным получение продолжительной экспрессии представляющего интерес белка. Также используемые при размножении бактерий гены устойчивости к антибиотикам могут представлять собой фактор риска для здоровья человека. Кроме того, бактериальная плазмидная/векторная ДНК может запустить нежелательный неспецифичный иммунный ответ. Определенные характеристики последовательностей бактериальной ДНК, присутствие неметилированных цитозин-гуаниновых динуклеотидов, обычно известных как CpG-мотивы, также может привести к нежелательным иммунным ответам. В некоторых вариантах осуществления изобретения, особенно, если продукт - закрытая линейная ДНК - представляет собой ДНК-вакцину, CpG-мотивы можно сохранить в последовательности продукта. Это обусловлено тем, что они обеспечивают выгодный адъювантный эффект на иммунный ответ на кодируемый белок. Поэтому изобретение относится к in vitro способу получения закрытой линейной экспрессионной ДНК-кассеты. Этот способ включает в себя: а) контактирование матрицы ДНК, содержащей по меньшей мере одну экспрессионную кассету, фланкированную с двух сторон последовательностью-мишенью протеломеразы, по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой в присутствии одного или более праймеров в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы; и b) контактирование амплифицированной ДНК, полученной в а), по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих образованию закрытой линейной экспрессионной ДНК-кассеты. Продукт - закрытая линейная экспрессионная ДНК-кассета - может содержать, состоять из или состоять, по существу, из эукариотического промотора, функционально соединенного с представляющей интерес кодирующей последовательностью и,необязательно, с эукариотической последовательностью терминации транскрипции. В продукте - закрытой линейной экспрессионной ДНК-кассете - дополнительно могут отсутствовать одна или более бактериальных или векторных последовательностей, обычно выбранных из группы, состоящей из:(i) бактериальной точки инициации репликации; (ii) бактериальных селективных маркеров (обычно генов устойчивости к антибиотикам) и (iii) неметилированных CpG-мотивов. Как указано выше, любую ДНК-матрицу, содержащую по меньшей мере одну последовательностьмишень протеломеразы, можно амплифицировать по способу по изобретению. Поэтому, хотя предпочтительным является продукция ДНК-вакцин и других терапевтических молекул ДНК, способ по изобретению можно использовать для получения любого типа закрытой линейной ДНК. ДНК-матрица может быть двухцепочечной (дц) или одноцепочечной (оц) ДНК. Двухцепочечная ДНК-матрица может быть открытой кольцевой двухцепочечной ДНК, закрытой кольцевой двухцепочечной ДНК, открытой линейной двухцепочечной ДНК или закрытой линейной двухцепочечной ДНК. Предпочтительно, чтобы матрица была закрытой кольцевой двухцепочечной ДНК. Закрытые кольцевые дцДНК-матрицы особенно предпочтительны для использования с RCA-ДНК-полимеразами. Кольцевая дцДНК-матрица может представлять собой плазмиду или другой вектор, обычно используемый для содержания гена при размножении бактерий. Поэтому способ по изобретению можно использовать для амплификации любой доступной в продаже плазмиды или другого вектора, таких как доступное в продаже лекарственное средство на основе ДНК, и затем для превращения амплифицированной векторной ДНК в закрытую линейную ДНК. Открытую кольцевую дцДНК можно использовать в качестве матрицы, когда ДНК-полимераза представляет собой полимеразу с активностью вытеснения цепи, которая может инициировать амплификацию с цепи ДНК, имеющей разрыв. В этом варианте осуществления изобретения матрицу можно пред-9 021069 варительно инкубировать с одним или более ферментами, которые вносят одноцепочечные разрывы в цепь ДНК в матрице в одном или более местах. Закрытую линейную дцДНК также можно использовать в качестве матрицы. Закрытая линейная дцДНК-матрица (стартовый материал) может быть идентична продукту закрытой линейной ДНК. При использовании в качестве матрицы закрытой линейной ДНК ее можно инкубировать при денатурирующих условиях для образования одноцепочечной кольцевой ДНК перед внесением в условия или в условиях, способствующих амплификации матричной ДНК. Как указано выше, ДНК-матрица обычно включает в себя экспрессионную кассету, описанную выше, то есть содержит, состоит из или, по существу, состоит из эукариотического промотора, функционально связанного с последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок, и, необязательно, с эукариотической последовательностью терминации транскрипции. Необязательно, экспрессионная кассета может представлять собой минимальную экспрессионную кассету, определенную выше, то есть в которой отсутствуют одна или более бактериальных или векторных последовательностей, обычно выбранных из группы, состоящей из: (i) бактериальной точки инициации репликации; (ii) бактериальных селективных маркеров (обычно генов устойчивости к антибиотикам) и (iii) неметилированных CpGмотивов. ДНК-матрица может быть предоставлена в количестве, достаточном для использования в процессе по любому способу, известному в данной области. Например, ДНК-матрицу можно получить с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Если ДНК-матрица является дцДНК, то в амплификации ее используют в виде денатурированной одноцепочечной ДНК, получаемой предварительной инкубацией при температуре по меньшей мере 94 С. Поэтому способ по изобретению предпочтительно включает в себя стадию денатурации дцДНК-матрицы для получения одноцепочечной ДНК. В качестве альтернативы дцДНК может быть предоставлена в двухцепочечной форме. В реакции может амплифицироваться вся ДНК-матрица или ее избранный участок. Осуществляют контакт ДНК-матрицы по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы. Можно использовать любую ДНК-полимеразу. Любая доступная в продаже ДНК-полимераза подходит для использования в способе по изобретению. Можно использовать две, три, четыре, пять или более различных ДНК-полимераз, например одну, которая обеспечивает корректирующую функцию, и одну или более других, которые не имеют корректирующей функции. Можно использовать ДНК-полимеразы с различными механизмами действия, например полимеразы с активностью вытеснения цепи, и ДНК-полимеразы, реплицирующие ДНК другими способами. Подходящим примером ДНК-полимеразы, которая не имеет активности вытеснения цепи, является ДНКполимераза фага Т 4. Предпочтительной является высокая стабильность ДНК-полимеразы, чтобы ее активность значительно не снижалась в результате продолжительной инкубации в условиях проведения способа. Поэтому предпочтительно, чтобы фермент имел большое время полужизни в диапазоне условий проведения способа, включающих в себя, но не ограниченных этим, температуру и рН. Также предпочтительно, чтобы ДНК-полимераза имела одну или более характеристик, подходящих для способа изготовления. Предпочтительно, чтобы ДНК-полимераза имела высокую точность, например, благодаря корректирующей активности. Кроме того, предпочтительна высокая процессивность ДНК-полимеразы, высокая активность вытеснения цепи и низкие величины Km для dNTP и DNA. ДНК-полимераза способна использовать в качестве матрицы кольцевую и/или линейную ДНК. ДНК-полимераза способна использовать в качестве матрицы дцДНК или оцДНК. Предпочтительно, чтобы ДНК-полимераза не проявляла неспецифичной экзонуклеазной активности. Опытный специалист может определить, имеет ли данная ДНК-полимераза характеристики, описанные выше, путем сравнения со свойствами, проявляемыми коммерчески доступными ДНКполимеразами, например, phi29, Deep Vent и ДНК-полимеразой I из Bacillus stearothermophilus (Bst),последовательности которых приведены в SEQ ID NO: 2, 3 и 5 соответственно. Bst ДНК-полимераза I доступна в продаже от компании New England Biolabs, Inc. Высокая процессивность обычно относится к среднему числу нуклеотидов, добавляемых ферментом ДНК-полимеразой на ассоциацию/диссоциацию с матрицей, то есть длине фрагмента, синтезируемого с праймера, получаемой в одном событии ассоциации. Предпочтительны полимеразы с активностью вытеснения цепи. Предпочтительными полимеразами с активностью вытеснения цепи являются Phi29 (SEQ ID NO: 2), Deep Vent (SEQ ID NO: 3) и Bst ДНКполимераза I (SEQ ID NO: 5) или варианты любой из них. Варианты последовательностей SEQ ID NO: 2,3 и 5 могут представлять собой варианты, которые описаны ниже для протеломеразных ферментов. Термин "вытеснение цепи" используют в настоящем документе для описания способности ДНК-полимеразы замещать комплементарные цепи при встрече с областью двухцепочечной ДНК в ходе синтеза ДНК. Следует понимать, что способы амплификации с вытеснением цепи отличаются от способов на основе ПЦР тем, что для эффективной амплификации ДНК не требуются циклы денатурации, поскольку двухцепочечная ДНК не является препятствием для непрерывного синтеза новых цепей ДНК. В отличие от этого, ПЦР требует циклов денатурации в ходе процесса амплификации (то есть повышения температу- 10021069 ры до 94 С или выше) для расплавления двухцепочечной ДНК и получения новых одноцепочечных матриц. Предпочтительно, чтобы ДНК-полимераза с активностью вытеснения цепи, используемая в способе по изобретению, имела процессивность (длину фрагмента, синтезируемого с праймера) по меньшей мере 20 т.п.о., более предпочтительно по меньшей мере 30 т.п.о., по меньшей мере 50 т.п.о. или по меньшей мере 70 т.п.о. или больше. В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения ДНКполимераза с активностью вытеснения цепи имеет процессивность, сравнимую с процессивностью ДНКполимеразы phi29, или более высокую процессивность. Предпочтительным способом репликации с вытеснением цепи является амплификация по типу катящегося кольца (RCA). Термин RCA описывает способность ДНК-полимераз RCA-типа (также именуемых в настоящем описании RCA-полимеразами) непрерывно продвигаться по кольцевой цепи ДНКматрицы, одновременно удлиняя гибридизованный праймер. Это приводит к образованию линейных одноцепочечных продуктов с множественными повторами амплифицированной ДНК. Эти линейные одноцепочечные продукты служат в качестве основания для множественных событий гибридизации, удлинения праймера и вытеснения цепи, приводя к образованию продуктов конкатемерных двухцепочечных ДНК, также содержащих множественные повторы амплифицированной ДНК. Таким образом, в продуктах конкатемерных двухцепочечных ДНК присутствуют множественные копии каждого амплифицированного одиночного элемента ДНК.RCA-полимеразы особенно предпочтительны для использования в способе по настоящему изобретению. Продукты способов репликации с вытеснением цепи по типу RCA обычно требуют сложной обработки для высвобождения одиночных элементов ДНК. Настоящее изобретение выгодно тем, что использование каталитических функций протеломеразы позволяет провести эту обработку в одну стадию. Использование протеломеразы также напрямую генерирует желательную закрытую структуру ДНК без необходимости в дополнительных стадиях обработки для образования молекул, имеющих эту структуру. Для проведения амплификации по изобретению предпочтительно, чтобы ДНК-матрица также контактировала с одним или более праймерами. Праймеры могут быть неспецифичными (например, со случайной последовательностью) или могут быть специфичными к одной или более последовательностям,содержащимся в ДНК-матрице. Предпочтительно, чтобы праймеры имели случайную последовательность для возможности неспецифической инициации в любом участке ДНК-матрицы. Это дает высокую эффективность амплификации в результате множественных реакций инициации с каждой матричной цепи. Примерами праймеров со случайной последовательностью являются гексамеры, гептамеры, октамеры, нонамеры, декамеры или последовательности большей длины, например 12, 15, 18, 20 или 30 нуклеотидов в длину. Праймер со случайной последовательностью может быть от 6 до 30, от 8 до 30 или от 12 до 30 нуклеотидов в длину. Праймеры со случайной последовательностью обычно поставляются в виде смеси олигонуклеотидов, которые представляют собой все возможные комбинации, например, гексамеров, гептамеров, октамеров или нонамеров в матрице ДНК. В других вариантах осуществления изобретения праймеры являются специфичными. Это означает,что они имеют последовательность, комплементарную последовательности ДНК-матрицы, с которой желательно инициировать амплификацию. В этом варианте осуществления изобретения пару праймеров можно использовать для специфичной амплификации участка ДНК-матрицы, который является внутренним относительно участков связывания двух праймеров. Праймеры могут быть немеченными или могут включать в себя одну или более меток, например радионуклидов или флуоресцентных красителей. Праймеры могут также содержать химически модифицированные нуклеотиды. Длину и последовательность праймеров обычно можно выбрать, исходя из температуры отжига, то есть способности связывать матрицу при температуре, используемой на стадии амплификации. Контактирование ДНК-матрицы с ДНК-полимеразой и одним или более праймерами происходит в условиях, способствующих отжигу праймеров на ДНК-матрице. Условия включают присутствие одноцепочечной ДНК, позволяющее гибридизацию праймеров. Условия также включают температуру и буфер,позволяющие отжиг праймера на матрице. Соответствующие условия отжига/гибридизации можно выбрать в зависимости от природы праймера. Пример предпочтительных условий отжига, используемых в настоящем изобретении, включает буфер: 30 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 20 мМ KCl, 8 мМ MgCl2. Отжиг можно проводит после денатурации постепенным охлаждением до желаемой температуры реакции. После контакта ДНК-матрицы с ДНК-полимеразой и одним или более праймерами следует стадия инкубации в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы. Предпочтительно, чтобы условия способствовали амплификации указанной матрицы путем вытеснения реплицированных цепей посредством репликации другой цепи по типу вытеснения цепи. Условия включают использование любой температуры, позволяющей амплификацию ДНК, обычно в пределах от 20 до 90 С. Предпочтительный температурный диапазон может составлять от примерно 20 до примерно 40 или от примерно 25 до примерно 35 С. Обычно соответствующую температуру выбирают исходя из температуры, при которой конкретная ДНК-полимераза имеет оптимальную активность. Эта информация обычно известна и входит в объем общих знаний опытного специалиста. Например, при использовании ДНК-полимеразы phi29 подходя- 11021069 щий температурный диапазон будет составлять от примерно 25 до примерно 35 С, предпочтительно примерно 30 С. Опытному специалисту будет просто определить подходящую температуру для эффективной амплификации по способу по изобретению. Например, способ можно проводить в диапазоне температур и контролировать выход амплифицированной ДНК для идентификации оптимального температурного диапазона для данной ДНК-полимеразы. Другие условия, способствующие амплификации ДНК-матрицы, включают в себя присутствие ДНК-полимеразы и одного или более праймеров. Условия также включают в себя присутствие всех четырех дезоксирибонуклеотидов (dNTP), ATP, TTP, CTP и GTP, соответствующие буферные агенты/рН и другие факторы, которые требуются для работы фермента или стабильности. Подходящие условия включают любые условия, обеспечивающие активность ДНК-полимераз, известных в данной области. Например, рН может находиться в диапазоне от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 8 или составлять примерно 7, например примерно 7,5. рН можно поддерживать в этом диапазоне, используя один или более буферный агент. Такие буферы включают, но не ограничены этим, MES, Bis-Tris, ADA, ACES,PIPES, MOBS, MOPS, MOPSO, Bis-Tris Propane, BES, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, Trizma, HEPPSO,POPSO, TEA, EPPS, Tricine, Gly-Gly, Bicine, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP,CAPS, CABS, фосфатный буфер, буфер лимонная кислота-гидрофосфат натрия, буфер уксусная кислотацитрат натрия, буфер ацетат натрия-уксусная кислота, имидазольный буфер и буфер карбонат натриябикарбонат натрия. Реакция может также содержать соли двухвалентных металлов, таких как, но не ограниченных ими, соли магния (Mg2+) и марганца (Mn2+), включая хлориды, ацетаты и сульфаты. Также можно включать соли одновалентных металлов, таких как соли натрия и соли калия, например хлорид калия. Другими солями, которые могут быть включены, являются соли аммония, в частности сульфат аммония. Также могут быть включены детергенты. Примеры подходящих детергентов включают Triton X100, Tween 20 и производные любого из них. В реакцию можно также включить стабилизирующие агенты. Можно использовать любой стабилизирующий агент, в частности бычий сывороточный альбумин(БСА), и другие стабилизирующие белки. Реакционные условия также можно улучшить добавлением агентов, раскручивающих спираль ДНК и делающих более легкой денатурацию матрицы. Такие агенты включают, например, диметилсульфоксид (ДМСО), формамид, глицерин и бетаин. Следует понимать, что опытный специалист способен модифицировать и оптимизировать условия амплификации и инкубации для способа по изобретению, исходя из своих общих знаний. Аналогичным образом, определенные концентрации конкретных агентов можно выбрать на основе предшествующих примеров в данной области и дополнительно оптимизировать их, исходя из общих сведений. Например,подходящим реакционным буфером в способах на основе RCA в данной области является буфер: 50 мМTris-HCl, pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 20 мМ (NH4)2SO4, 5% глицерина, 0,2 мМ БСА, 1 мМ dNTP. Предпочтительным реакционным буфером, используемым в RCA-амплификации по изобретению, является буфер: 35 мМ Tris-HCl, 50 мМ KCl, 14 мМ MgCl2, 10 мМ (NH4)2SO4, 4 мМ DTT, 1 мМ dNTP. Этот буфер особенно подходит для использования с RCA-полимеразой phi29. Реакционные условия могут также включать в себя использование одного или более дополнительных белков. ДНК-матрицу можно амплифицировать в присутствии по меньшей мере одной пирофосфатазы, такой как дрожжевая неорганическая пирофосфатаза. Можно использовать две, три, четыре, пять или более различных пирофосфатаз. Эти ферменты способны разрушать пирофосфат, образуемый ДНКполимеразой из dNTP в процессе репликации цепи. Накопление пирофосфата в реакции может ингибировать ДНК-полимеразу и снижать скорость и эффективность ДНК-амплификации. Пирофосфатазы могут расщеплять пирофосфат до неингибирующего фосфата. Примером подходящей пирофосфатазы для использования в способе по настоящему изобретению является пирофосфатаза из Saccharomyces cerevisiae, доступная в продаже от компании New England Biolabs, Inc. В способе по изобретению для стабилизации одноцепочечной ДНК можно использовать любой белок, связывающий одноцепочечную ДНК (SSBP). Белки SSBP являются необходимыми компонентами живых клеток и участвуют во всех процессах, включающих оцДНК, таких как репликация, восстановление и рекомбинация ДНК. В этих процессах SSBP связывают временно образующуюся оцДНК и могут способствовать стабилизации структуры оцДНК. Примером подходящего SSBP для использования в процессе по настоящему изобретению является белок гена 32 фага Т 4, доступный в продаже от New England Biolabs, Inc. В дополнение к стадии амплификации способ по изобретению также включает в себя стадию продукции закрытой линейной ДНК. Амплифицированная ДНК контактирует по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих продукции закрытой линейной ДНК. Эта простая стадия обработки, основанная на свойствах протеломеразы, дает преимущество относительно других способов, используемых для продукции молекул закрытой линейной ДНК. Стадии амплификации и обработки можно проводить одновременно или последовательно. Однако предпочтительно последовательное проведение стадий амплификации и обработки, причем стадию обработки проводят после стадии амплификации (то есть на амплифицированной ДНК). Используемой в изобретении протеломеразой является любой полипептид, способный расщеплять и повторно соединять матрицу, содержащую сайт-мишень протеломеразы, для получения молекулы ковалентно закрытой линейной ДНК. Таким образом, протеломераза имеет функции расщепления и лигирования ДНК. Ферменты, имеющие протеломеразную активность, также были описаны как теломеррезолвазы (например, в Borrelia burgdorferi). Типичным субстратом протеломеразы является кольцевая двухцепочечная ДНК. Если такая ДНК содержит сайт-мишень протеломеразы, то фермент может разрезать ДНК по этому сайту и лигировать концы, создавая линейную двухцепочечную ковалентно закрытую молекулу ДНК. Требования к сайтам-мишеням протеломеразы описаны выше. Также, как указано выше,способность данного полипептида катализировать продукцию закрытой линейной ДНК из матрицы, содержащей сайт-мишень протеломеразы, можно определить с помощью любого соответствующего метода анализа, описанного в данной области. Протеломеразы также описаны у бактериофагов. В некоторых лизогенных бактериях бактериофаги существуют в качестве внехромосомной ДНК, представляющей собой линейные двухцепочечные молекулы с ковалентно закрытыми концами. Репликация этой ДНК и сохранение ковалентно закрытых концов (или теломерных концов) зависят от активности фермента протеломеразы. Роль протеломеразы в репликации вирусной ДНК проиллюстрирована на фиг. 1. Примером этой каталитической активности является активность фермента TelN из бактериофага N15, который инфицирует Escherichia coll. TelN распознает определенную нуклеотидную последовательность в кольцевой двухцепочечной ДНК. Эта последовательность представляет собой немного несовершенную инвертированную палиндромную структуру, называемую telRL, содержащую две половины, telR и telL, фланкирующие 22-нуклеотидный инвертированный совершенный повтор (telO) (см. фиг. 2). Два сайта telRL образуются в кольцевой двухцепочечной ДНК в результате исходной активности специфичной ДНК-полимеразы, действующей на линейной ДНК профага. TelN превращает эту кольцевую ДНК в две идентичные линейные молекулы ДНК профага, завершая цикл репликации. telR и telL содержат закрытые концы линейной ДНК профага,давая возможность дальнейшей репликации ДНК аналогичным образом. Способ по изобретению требует использования по меньшей мере одной протеломеразы. Способ по изобретению может включать в себя использование более одной протеломеразы, например двух, трех,четырех, пяти или более различных протеломераз. Примеры подходящих протеломераз включают протеломеразы из бактериофагов, таких как phiHAP-1 из Halomonas aquamarina (SEQ ID NO: 7), PY54 из Yersinia enterolytica (SEQ ID NO: 9), phiK02 из Klebsiella oxytoca (SEQ ID NO: 11) и VP882 из Vibrio sp. (SEQID NO: 13) и N15 из Escherichia coli (SEQ ID NO: 15) или варианты любой из них. Особенно предпочтительно использование протеломеразы бактериофага N15 (SEQ ID NO: 15) или ее варианта. ВариантыSEQ ID NO: 7, 9, 11, 13 и 15 включают их гомологи и мутанты. Мутанты включают укороченные последовательности, замены или делеции в последовательности относительно нативной последовательности. Вариант должен продуцировать закрытую линейную ДНК из матрицы, содержащей сайт-мишень протеломеразы, описанный выше. Любые упоминаемые в настоящем документе гомологи обычно являются функциональными гомологами и обычно имеют гомологию по меньшей мере 40% с соответствующей областью нативного белка. Гомологию можно определить с помощью известных способов. Например, в пакете программ UWGCGPackage находится программа BESTFIT, которую можно использовать для вычисления гомологии (например, используя ее настройки по умолчанию) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387395). Алгоритмы PILEUP и BLAST можно использовать для вычисления гомологии или выравнивания последовательностей (обычно с их настройками по умолчанию), например, как описано в Altschul S.F.(1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul, S.F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Программное обеспечение для проведения анализа последовательностей с помощью алгоритма BLAST общедоступно в Национальном Центре Биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Алгоритм BLAST выполняет статистический анализ подобия между двумя последовательностями; см., например, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Одним из параметров подобия, обеспечиваемых алгоритмом BLAST, является наименьшая вероятность суммы (P(N, которая указывает вероятность, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями произойдет случайно. Например, последовательность считается подобной другой последовательности, если наименьшая вероятность суммы в сравнении первой последовательности со второй последовательностью меньше примерно 1, предпочтительно меньше примерно 0,1, более предпочтительно меньше примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше примерно 0,001. Вариант полипептида содержит последовательность (или состоит из последовательности), которая имеет по меньшей мере 40% идентичности с нативным белком. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения вариант последовательности может иметь по меньшей мере 55, 65, 70, 75, 80, 85,90% и более предпочтительно по меньшей мере 95, 97 или 99% гомологии с конкретной областью нативного белка на протяжении по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 30, например, по меньшей мере 40, 60, 100, 200, 300, 400 или больше непрерывных аминокислот или даже на протяжении всей последовательности варианта. В качестве альтернативы вариант последовательности может иметь по меньшей мере 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95, 97 или 99% гомологии с полноразмерным нативным белком. Обычно вариант последовательности отличается от значимой области нативного белка по меньшей мере или не более чем 2, 5, 10, 20, 40, 50 или 60 мутациями(каждая из которых может быть заменой, вставкой или делецией). Вариант последовательности по изобретению может иметь процент идентичности с конкретной областью полноразмерного нативного белка,который совпадает с любым из определенных процентных значений гомологии (то есть он может иметь по меньшей мере 40, 55, 80 или 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95, 97 или 99% идентичности) по любой длине последовательности, описанной выше. Варианты нативного белка также включают укорачивание последовательности. Можно использовать любое укорачивание последовательности при условии, что вариант все еще способен продуцировать закрытую линейную ДНК, описанную выше. Укорачивание последовательности обычно осуществляют для удаления последовательностей, которые не являются необходимыми для каталитической активности и/или не влияют на конформацию свернутого белка, в частности на сворачивание активного сайта. Укорачивание последовательности также выбирают для улучшения растворимости полипептида протеломеразы. Подходящие укороченные последовательности можно легко идентифицировать систематическим удалением последовательностей разной длины с N- или С-конца. Варианты нативного белка дополнительно включают мутанты, которые имеют одну или более, например 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-40 или больше аминокислотных вставок, замен или делеций относительно конкретной области нативного белка. Делеции и вставки предпочтительно проводить вне каталитического домена. Вставки обычно проводят на N- или С-концах последовательности, полученной из нативного белка, например, для рекомбинантной экспрессии. Замены также обычно проводят в областях, которые не являются необходимыми для каталитической активности и/или не влияют на конформацию свернутого белка. Такие замены можно осуществить для улучшения растворимости или других характеристик фермента. Хотя обычно это не является предпочтительным, также можно осуществить замены в активном сайте или во "второй сфере", то есть осуществить замены остатков, которые влияют или контактируют с позицией или ориентацией одной или более аминокислот в активном сайте. Эти замены могут проводиться для улучшения каталитических свойств. Замены предпочтительно вводят в одно или более консервативных изменений, при которых аминокислоты замещают другими аминокислотами с аналогичной химической структурой, аналогичными химическими свойствами или аналогичными боковыми цепями. Введенные аминокислоты могут иметь полярность, гидрофильность, гидрофобность, основность, кислотность, нейтральность или заряд, аналогичные аминокислотам, которые они замещают. В качестве альтернативы консервативная замена может вводить другую аминокислоту, которая является ароматической или алифатической, вместо ранее присутствующей ароматической или алифатической аминокислоты. Консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области и их можно подобрать в соответствии со свойствами 20 основных аминокислот, описанных в табл. А. Таблица А Химические свойства аминокислот Особенно предпочтительно, чтобы вариант был способен продуцировать закрытую линейную ДНК,описанную выше, с эффективностью, сравнимой или одинаковой с нативным белком. Как указано выше, предпочтительно, чтобы амплификация ДНК по способу по изобретению проводилась ДНК-полимеразой с активностью вытеснения цепи, более предпочтительно с RCA-ДНКполимеразой. Комбинация RCA-ДНК-полимеразы и протеломеразы в in vitro бесклеточном способе обеспечивает удивительную эффективность и простоту получения закрытой линейной ДНК. Как отмечалось выше, длинные линейные одноцепочечные молекулы ДНК исходно образуются в реакциях вытеснения цепи, которые затем служат в качестве новых матриц, в результате чего образуются двухцепочечные молекулы (фиг. 4). Двухцепочечные молекулы содержат непрерывные серии тандемных единиц амплифицированной ДНК, образуемой в результате процессивного действия полимераз с активностью вытеснения цепи (конкатемер). Эти конкатемерные ДНК-продукты содержат многочисленные повторы амплифицированной матричной ДНК. Конкатемер, генерируемый в способе по изобретению,поэтому содержит множество единиц последовательности, амплифицированной с ДНК-матрицы. Конкатемер может содержать 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 или больше единиц амплифицированной последовательности в зависимости от длины одной амплифицируемой единицы. Размер конкатемера может составлять по меньшей мере 5 т.п.о., по меньшей мере 10 т.п.о., по меньшей мере 20 т.п.о., более предпочтительно по меньшей мере 30 т.п.о., по меньшей мере 50 т.п.о., по меньшей мере 70 т.п.о. или больше. Во многих вариантах осуществления изобретения, например в производстве лекарственных средств на основе ДНК, требуется использование одиночных элементов амплифицированной ДНК. Поэтому для высвобождения одиночных элементов амплифицированной ДНК необходима обработка таких конкатемеров. Для превращения этой конкатемерной ДНК в одиночные элементы амплифицированной ДНК ее необходимо разрезать в определенной позиции, а концы парных цепей необходимо повторно лигировать. Обычно это можно осуществить, включая сайты эндонуклеаз рестрикции в матрицу ДНК. Таким образом, для расщепления сайтов узнавания рестрикционных эндонуклеаз и высвобождения одиночных элементов можно инкубировать рестрикционные эндонуклеазы с конкатемером. Образующуюся в результате действия рестрикционных эндонуклеаз открытую линейную двухцепочечную ДНК затем можно инкубировать с ферментом ДНК-лигазой для того, чтобы ковалентно соединить (закрыть) одиночные элементы ДНК. В соответствии с настоящим изобретением превращение конкатемерной ДНК в закрытые линейные одиночные элементы ДНК достигается использованием всего одного фермента протеломеразы. Это обеспечивает предпочтительные простоту и экономичность способа получения закрытых линейных молекул ДНК. Во-первых, расщепление и последующее лигирование одиночных элементов достигается в результате инкубации с единственным ферментом. Во-вторых, одиночные элементы также высвобождаются, имея желаемую закрытую линейную структуру, и, таким образом, не требуются дополнительные стадии обработки для получения этой структуры (то есть из ковалентно закрытого кольцевого одиночного элемента ДНК). ДНК, амплифицированную на матрице ДНК, инкубируют по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих продукции закрытой линейной ДНК. Другими словами, условия способствуют расщеплению и последующему лигированию двухцепочечной ДНК, содержащей последовательность-мишень протеломеразы, с образованием ковалентно закрытой линейной ДНК с концами в форме шпильки. Условия, способствующие продукции закрытой линейной ДНК, включают в себя использование любой температуры, позволяющей продукцию закрытой линейной ДНК, обычно в диапазоне от 20 до 90 С. Предпочтительно температура может находиться в диапазоне от 25 до 40 С, например от примерно 25 до примерно 35 С, или составлять примерно 30 С. Соответствующую температуру для конкретной протеломеразы можно выбрать, исходя из указанных выше принципов относительно температурных условий для ДНК-полимераз. Подходящая температура для использования протеломеразы TelN из бактериофага Е. coli (последовательность SEQ ID NO: 15) составляет от примерно 25 до примерно 35 С, например около 30 С. Условия, способствующие получению закрытой линейной ДНК, также включают в себя присутствие протеломеразы и соответствующих буферных агентов/рН и других факторов, которые необходимы для работы фермента и его стабильности. Подходящие условия включают любые условия, используемые для обеспечения активности протеломеразных ферментов, известных в данной области. Например, при использовании протеломеразы TelN бактериофага N15 из Е. coli подходящим буфером может быть: 20 мМ Tris-HCl, pH 7,6; 5 мМ CaCl2; 50 мМ глутамат калия; 0,1 мМ EDTA; 1 мМ дитиотреитол (DTT). Агенты и условия для поддержания оптимальной активности и стабильности можно также выбрать из условий, приведенных для ДНК-полимераз. В некоторых вариантах осуществления изобретения возможно использовать условия, обеспечивающие активность протеломеразы, одинаковые с условиями, используемыми для амплификации ДНК. В частности, использование одинаковых условий описано для случая, когда амплификация ДНК и обработка протеломеразой проводятся одновременно или последовательно. В других вариантах осуществления изобретения может быть необходимо изменение реакционных условий, если условия, используемые для обеспечения оптимальной активности ДНК-полимеразы, приводят к субоптимальной активности протеломеразы. Удаление конкретных агентов и изменение реакционных условий можно осуществить с помощью фильтрации, диализа и других способов, известных в данной области. Опытному специалисту будет легко определить условия, дающие оптимальную активность ДНК-полимеразы и/или активность протеломеразы. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения при использовании в амплификации ДНК RCA-ДНК-полимеразы, предпочтительно phi29, амплификацию ДНК проводят в буфере,по существу, идентичном или, по существу, состоящем из 35 мМ Tris-HCl, 50 мМ KCl, 14 мМ MgCl2, 10 мМ (NH4)2SO4, 4 мМ DTT, 1 мМ dNTP; при температуре от 25 до 35 С, например около 30 С. Стадию обработки протеломеразой можно затем выполнить, предпочтительно используя TelN, и/или предпочтительно в буферных условиях, по существу, идентичных или, по существу, состоящих из 20 мМ Tris-HCl,pH 7,6; 5 мМ CaCl2; 50 мМ глутамата калия; 0,1 мМ EDTA; 1 мМ дитиотреитола (DTT); при температуре от 25 до 35 С, например около 30 С. Все ферменты и белки для использования в способе по изобретению можно получать рекомбинантно, например, в бактериях. Можно использовать все способы рекомбинантной экспрессии, известные опытному специалисту. Плазмиду или другую форму рекомбинантного вектора, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, можно ввести в бактерии,чтобы они экспрессировали кодируемый белок. Например, для экспрессии последовательностей SEQ IDNO: 2, 5, 7, 9, 11, 13 или 15 вектор, соответственно, может содержать последовательности SEQ ID NO: 1,4, 6, 8, 10, 12 или 14. Затем экспрессированный белок обычно очищают, например, используя аффинную метку, в достаточном количестве и переводят в форму, подходящую для использования в способе по изобретению. Методики получения рекомбинантных белков входят в общий объем знаний опытного специалиста. Вышеописанное распространяется на любой белок, описанный в настоящем документе. Амплифицированную ДНК, полученную в результате контактирования ДНК-матрицы с ДНКполимеразой, можно очистить перед контактом с протеломеразой. Таким образом, способ по изобретению может дополнительно включать в себя стадию очистки ДНК, амплифицированной на ДНК-матрице. Однако в предпочтительном варианте осуществления изобретения способ проводят без очистки амплифицированной ДНК перед контактированием с протеломеразой. Это означает, что стадии амплификации и обработки можно проводить последовательно, обычно в одной емкости или растворе. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения способ включает в себя добавление буфера, обеспечивающего активность протеломеразы, то есть обеспечивающего условия, способствующие образованию закрытой линейной ДНК. После получения закрытой линейной ДНК в результате действия протеломеразы способ по изобретению может дополнительно включать в себя стадию очистки линейного ковалентно закрытого ДНКпродукта. Вышеупомянутую очистку обычно проводят для удаления нежелательных продуктов. Очистку можно проводить любыми средствами, известными в данной области. Например, обработка амплифицированной ДНК или линейной ковалентно закрытой ДНК может включать в себя фенол/хлороформную очистку нуклеиновых кислот или использование колонок, селективно связывающих нуклеиновые кислоты, таких как доступные в продаже от компании Qiagen. Опытный специалист может легко определить подходящие методики очистки для использования при выделении амплифицированной ДНК. После получения и очистки линейной ковалентно закрытой ДНК в достаточном количестве способ может дополнительно включать в себя ее введение в ДНК-композицию ("композицию, содержащую ДНК"), например в терапевтическую ДНК-композицию. Терапевтической ДНК-композицией будет упомянутый выше тип терапевтической молекулы ДНК. Такая композиция будет содержать терапевтически эффективное количество ДНК в форме, подходящей для введения желаемым путем, например, в виде аэрозоля, в виде композиции для инъекций или состава,подходящего для перорального введения, введение через слизистые или местного введения. Введение ДНК в стандартный фармацевтический препарат можно осуществить, используя стандартные химические методы и методики для изготовления фармацевтических составов, которые известны опытному специалисту в данной области. Можно использовать любой фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Вспомогательные материалы, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН-буферные вещества и т.п., могут присутствовать в эксципиенте или носителе. Эти эксципиенты, носители и вспомогательные материалы, в общем, представляют собой фармацевтические агенты, которые можно вво- 16021069 дить без неспецифической токсичности и которые в случае вакцинных композиций не будут вызывать иммунный ответ у индивидуума, получающего композицию. Подходящим носителем может быть липосома. Фармацевтически приемлемые эксципиенты включают, но не ограничены этим, жидкости, такие как вода, солевой раствор, полиэтиленгликоль, гиалуроновая кислота, глицерин и этанол. Также в настоящую композицию могут быть включены фармацевтически приемлемые соли, например соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Также предпочтительно, хотя и не обязательно, чтобы препарат содержал фармацевтически приемлемое эксципиент, который служит стабилизатором, в частности, для пептида, белка или других подобных молекул, если они должны быть включены в композицию. Примеры подходящих носителей, которые действуют также в качестве стабилизаторов для пептидов, включают, без ограничения, фармацевтического качества декстрозу, сахарозу,лактозу, трегалозу, маннит, сорбит, инозит, декстран и т.п. Другие подходящие носители включают, без ограничения, крахмал, целлюлозу, фосфаты натрия или кальция, лимонную кислоту, винную кислоту,глицин, высокомолекулярные полиэтиленгликоли(ПЭГ) и их комбинации. Исчерпывающее описание фармацевтически приемлемых эксципиентов, носителей и вспомогательных материалов находится в издании REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991), которое включено в настоящее описание путем ссылки. Способ по изобретению проводят in vitro в бесклеточном окружении. Поэтому способ проводят в отсутствии клеток-хозяев, и он обычно включает в себя использование очищенных ферментативных компонентов. Соответственно, амплификацию матричной ДНК и обработку протеломеразой обычно проводят посредством контактирования компонентов реакции в растворе в подходящей емкости. Необязательно, отдельные компоненты могут находиться в иммобилизованной форме, например могут быть присоединены к твердой подложке. Следует понимать, что способ по изобретению можно проводить в любом масштабе. Однако предпочтительно проведение способа амплификации ДНК в коммерческом или промышленном масштабе, то есть получение амплифицированной ДНК в миллиграммах или в большем количестве. Предпочтительно,чтобы с помощью способа можно было получить по меньшей мере 1 мг, по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 20 мг, по меньшей мере 50 мг или по меньшей мере 100 мг амплифицированной ДНК. Также предпочтительно получение конечного продукта, закрытой линейной ДНК, из амплифицированной ДНК в миллиграммовых или больших количествах. Предпочтительно, чтобы с помощью способа можно было получить по меньшей мере 1 мг, по меньшей мере 2 мг, по меньшей мере 5 мг, по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 20 мг, по меньшей мере 50 мг или по меньшей мере 100 мг закрытой линейной ДНК. Изобретение дополнительно относится к набору, содержащему компоненты, требуемые для проведения способа по изобретению Этот набор включает в себя по меньшей мере одну ДНК-полимеразу, по меньшей мере одну протеломеразу и, необязательно, инструкции по использованию их в способе, описанном в настоящем документе. Набор может содержат две, три, четыре, пять или более различных ДНКполимераз. Предпочтительно, чтобы набор содержал по меньшей мере одну ДНК-полимеразу с активностью вытеснения цепи, еще более предпочтительно RCA-ДНК-полимеразу. Особенно предпочтительно, чтобы набор содержал ДНК-полимеразу phi29 (SEQ ID NO: 2), ДНК-полимеразу Deep Vent (SEQ ID NO: 3) или ДНК-полимеразу Bst 1 (SEQ ID NO: 5) или вариант любой из них. В некоторых вариантах осуществления изобретения также могут быть включены ДНК-полимеразы, которые реплицируют ДНК другими способами. Набор включает в себя по меньшей мере одну протеломеразу. Набор может включать в себя две, три, четыре или более различных протеломераз. Протеломеразы можно выбрать из любой из SEQ IDNO: 5, 7, 9, 11, 13 или 15, или их вариантов. Особенно предпочтительно, чтобы набор включал протеломеразу TelN бактериофага N15 из Е. coli (SEQ ID NO: 15) или ее вариант. Набор может также включать в себя по меньшей мере один белок, связывающий одноцепочечную ДНК (SSBP). Предпочтительным SSBP является белок гена 32 фага Т 4, доступный в продаже от NewEngland Biolabs, Inc. В набор могут быть включены два, три, четыре или более различных SSBP. Набор может дополнительно включать в себя пирофосфатазу. Предпочтительной пирофосфатазой является пирофосфатаза из S. cerevisiae, доступная в продаже от New England Biolabs, Inc. В набор могут быть включены две, три, четыре, пять или более различных пирофосфатаз. Набор может включать в себя любые ДНК-полимеразу, протеломеразу, SSBP или пирофосфатазу, описанные в настоящем документе. Набор может также включать в себя dNTP, соответствующие буферы и другие факторы, которые необходимы для активности или стабильности ДНК-полимеразы и/или протеломеразы, описанных выше. Примеры Пример 1. Экспрессия TelN и создание векторных конструкций, содержащих последовательностимишени протеломеразы.TelN амплифицировали из доступного в продаже вектора для клонирования, pJAZZ (Lucigen), с использованием модифицированных олигонуклеотидных праймеров для направленного клонирования с сохранением рамки считывания в доступный в продаже вектор, pQE30 (Qiagen). Эта система дает возможность индуцируемой экспрессии белков с 6 остатками His на Nконце под контролем lac-промотора, одновременно обеспечивая сильную транс-репрессию с плазмидыpREP4, экспрессирующей ген lacI. Ряд возможных рекомбинантных клонов был идентифицирован в штамме М 15 Е. coli, и с помощью секвенирования подтверждено встраивание TelN с сохранением рамки считывания. Шесть клонов были дополнительно охарактеризованы в мелкомасштабных экспериментах по индукции экспрессии. Все клоны экспрессировали белок с весом 74,5 кД, который соответствовал молекулярному весу рекомбинантной протеломеразы TelN.TelN экспрессировали в штамме М 15 Е. coli/pREP4, индуцируя экспрессию белка с плазмиды pQE30 с помощью IPTG; а клетки после индукции обрабатывали ультразвуком (6 пульсов по 30 с на 100% мощности) и центрифугировали (30 мин при 25000g), что давало нерастворимую и растворимую фракцию клеточного лизата. Анализ с помощью электрофореза в геле показал присутствие TelN в растворимой фракции. Очистку TelN проводили на колонке HisTrap, используя хроматографическую систему Akta Prime (GE Healthcare) с элюцией в 0-100% (0,5 М) градиенте имидазола. Очищенную TelN диализовали для удаления имидазола и хранили в буфере: 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 75 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,1 мМEDTA и 50% глицерина. Векторные конструкции для подтверждения активности TelN были созданы направленным клонированием синтетических олигонуклеотидов, содержащих сайт узнавания TelN, telRL в сайты BamHI и HindIII плазмид pUC18 и pBR329. PUC18 имеет номер доступа в базе данных Genbank L09136, и ее можно приобрести в компании Fermentas, каталожныйSD0051; pBR329 имеет номер доступа в базе данных Genbank - J01753, и ее можно приобрести в компании DSMZ, каталожный 5590. Дополнительно для трансфекционных исследований две копии сайтов узнавания (telRL) были клонированы в вектор для экспрессии люциферазы, плазмиду pGL4.13 (Promega) в уникальные сайты рестрикции Sad и BamHI, фланкирующие экспрессионную кассету для гена люциферазы из светлячка. Первый сайт telRL был клонирован в уникальный сайт SacI выше SV40-промотора после отжига синтетических олигонуклеотидов telRL с перекрывающимися концами для SacI. Второй сайт telRL был клонирован в уникальный сайт BamHI ниже сигнала полиаденилирования SV40, используя синтетические олигонуклеотиды telRL с перекрывающимися концами для BamHI. Полученная конструкция была названа pGLDOG, поскольку она позволяет образование ковалентно закрытой линейной (в виде сахарной "собачьей" косточки) ДНК, кодирующей люциферазу для экспрессии в клетках млекопитающих. Пример 2. Подтверждение способности TelN расщеплять ДНК. Было подтверждено расщепление суперскрученных кольцевых векторных конструкций pUC18telRL и pGL DOG с помощью TelN. 100 нг каждого субстрата инкубировали с 4,5 пмоль TelN в течение 1 ч 40 мин при 30 С. Реакцию проводили в буфере для TelN [10 мМ Tris-HCl, pH 7,6, 5 мМ CaCl2, 50 мМ глутамата калия, 0,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT]. Продукты расщепления визуализировали с помощью электрофореза в агарозном геле в нативных условиях. Инкубация суперскрученной кольцевой pUC18 telRL с TelN высвобождала линейный фрагмент размером 2,7 т.п.о., что указывало на расщепление. Инкубация суперскрученной кольцевой pGLDOG с TelN высвобождала два фрагмента размером 2,4 т.п.о., указывая на расщепление по двум сайтамtelRL. Дополнительно pUC18 telRL и pGL DOG линеаризовали расщеплением рестрикционными ферментами, а затем их инкубировали с TelN для дополнительного подтверждения специфичного расщепления по сайту telRL. 100 нг pUC18 telRL линеаризовали с помощью XmnI и затем инкубировали с TelN. Эта реакция высвобождала ожидаемые фрагменты размером 1,9 т.п.о. и 0,8 т.п.о. 100 нг pGL DOG линеаризовали с помощью PvuI и затем инкубировали с TelN. Это высвобождало ожидаемые фрагменты размером 2,4 т.п.о., 1,6 т.п.о. и 0,7 т.п.о. Аналогичным образом, линеаризация pGL DOG с помощью PstI и последующая инкубация с TelN высвобождала фрагменты размером 2,4 т.п.о., 1,1 т.п.о и другой фрагмент 1,1 т.п.о. Эти эксперименты демонстрируют эндонуклеазную активность TelN на кольцевых или линейных ДНК-субстратах, содержащих последовательность-мишень протеломеразы. В предварительной оценке активности расщепления ДНК было найдено, что избыток TelN до 3,4 пмоль разрезает по меньшей мере 200 нг pUC18 telRL в течение 1 ч. В экспериментах по определению зависимости расщепления от времени такое же количество ДНК расщеплялось в течение примерно 10 мин. Пример 3. Подтверждине лигирующей активности TelN и образования закрытой линейной ДНК. Подтверждение закрытой линейной структуры ДНК продуктов расщепления с помощью TelN проводили с использованием гель-электрофореза в денатурирующих условиях. pGL DOG инкубировали сTelN как в примере 3. Синтетический ПЦР-продукт (PCR DOG), соответствующий области, содержащейся в последовательности "собачьей косточки", но имеющий открытые концы ДНК, использовали в качестве контроля. Линейный фрагмент PCR DOG амплифицировали с использованием праймеров,фланкирующих сайты telRLEDTA)], продукт 2,4 т.п.о., полученный в результате инкубации 100 нг pGL DOG с TelN, мигрировал на аналогичное расстояние, что и PCR DOG (2,7 т.п.о.), поскольку оба продукта оставались двухцепочечными. Однако при разделении в денатурирующем агарозном геле [разделение в 1% агарозе в Н 2 О в присутствии 50 мМ NaOH, 0,1 мМ EDTA и нейтрализация после разделения в 1 М Tris-HCl, pH 7,6, 1,5 МNaCl], позволяющем денатурацию и разделение двухцепочечной ДНК на одноцепочечные ДНК, фрагмент в форме "собачьей косточки", полученный в результате обработки TelN, мигрировал с более высоким молекулярным весом [приблизительно 5 т.п.о.], чем ПЦР-контроль с открытыми концами или pUC18telRL, линеаризованная XmnI (оба фрагмента с размером 2,7 т.п.о.). Эта разница в миграции указывала на образование закрытой линейной структуры в форме "собачьей косточки" в результате действия TelN. Денатурация структуры в форме "собачьей косточки" будет давать одноцепочечные открытые кольца, которые мигрируют значительно медленнее через гель по сравнению с линейными одноцепочечными молекулами, высвобождаемыми при денатурации линейного ПЦР-продукта с открытыми концами. Подтверждение образования закрытой линейной структуры продуктов в результате действия TelN также было показано анализом температурной денатурации с использованием капиллярного электрофореза в микрочипе (LOC-электрофореза). LOC-анализ представляет собой платформу для капиллярного электрофореза для скоростного разделения биологических молекул. Agilent Bioanalyzer с чипами DNA 7500 (Agilent, UK) может использоваться для разделения и приблизительного определения размера фрагмента ДНК длинной до 7000 п.о. Эта система с использованием микрочипа не детектирует одноцепочечную ДНК. Тепловая денатурация (95 С в течение 5 мин) и быстрое (1 С/с) охлаждение со скоростью 1 С/с стандартной двухцепочечной ДНК в низкой соли, например, в Н 2 О, дает в результате одноцепочечную ДНК, которую невозможно визуализировать в LOC-системе. Однако ДНК-концы, которые ковалентно соединены в ДНК в форме "собачьей косточки" (получаемой в результате расщепления TelN), не могут разделиться после денатурации и поэтому повторно отжигаются, образуя двухцепочечную ДНК, которая остается видимой. Сравнение денатурированной с помощью температуры и быстро охлажденной ДНК поэтому позволяет отличить ковалентно закрытую ДНК в форме "собачьей косточки" (ccl) и обычную открытую линейную(ol) двухцепочечную ДНК. Образцы ДНК (100 нг) в Н 2 О денатурировали (95 С в течение 5 мин), быстро охлаждали (1 С/с) до 4 С в тонкостенных ПЦР-пробирках в термоциклере (Biorad I-cycler, Biorad, UK). Для сравнения с расщеплением TelN образцы сначала инкубировали в IX буфере для TelN с 1 мкл очищенной протеломеразы при 30 С в течение 10 мин. Контрольные образцы обрабатывали также, но без фермента. Образцы (1 мкл) анализировали с использованием Agilent Bioanalyser и чипов DNA 7500, следуя инструкциям изготовителя. Результаты показаны на фиг. 6 В. Они показывают, что закрытая линейная ДНК в форме "собачьей косточки", полученная в результате инкубации pGL DOG с TelN, устойчива к температурной денатурации по сравнению с эквивалентной стандартной открытой линейной ДНК (PCR DOG). Равная устойчивость относительно тепловой денатурации также была получена с использованием RCAамплифицированной ДНК в форме "собачьей косточки", полученной в результате RCA-амплификации и расщепления TelN. В других экспериментах расщепление TelN проводили на фрагменте PCR DOG с открытыми концами. Это приводило к образованию термостабильного продукта расщепления, ДНК в форме "собачьей косточки" с размером 2,8 т.п.о, и термостабильных концов в форме "собачьей косточки" с размерами 0,09 и 0,14 т.п.о. Установленные в LOC-анализе размеры фрагмента в форме "собачьей косточки" и PCR DOG находились в диапазоне от 2,8 до 3,0 т.п.о. и 3,1-3,5 т.п.о. соответственно, по сравнению с данными на основе нуклеотидной последовательности, предполагающими приблизительные размеры 2,4 и 2,7 т.п.о. Это отражает разницу в размере, вызванную конформационными отличиями в миграции, которые возникают в неденатурирующем LOC-анализе. Пример 4. Образование закрытой линейной ДНК из конкатемерной ДНК, полученной с помощьюRCA (амплификации по типу катящегося кольца). Был проведен in vitro бесклеточный способ амплификации ДНК-матрицы и превращения амплифицированной ДНК в закрытые линейные молекулы ДНК в форме "собачьей косточки". Для амплификации ковалентно закрытых плазмидных матриц, в которых присутствовал или отсутствовал сайт telRL, использовали методику RCA с использованием фермента phi29 фага phi29 из Bacillus subtilis и случайные гексамеры в качестве праймеров при различных условиях проведения реакции. Это давало амплификацию конкатемерной ДНК в результате процессивной активности вытеснения цепи полимеразы phi29. Первые эксперименты проводились с использованием набора TempliPhi (GE Healthcare) согласно инструкциям изготовителя. Однако этот набор впоследствии был заменен на способ, разработанный авторами(с использованием полимеразы phi29 от компании NEB), который давал более высокий выход продукта с более высокой чистотой. Денатурацию 40 пг - 200 нг закрытой кольцевой матрицы и отжиг праймеров проводили в 10 мкл буфера для отжига/денатурации: 30 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 20 мМ KCl, 8 мМ MgCl2, 20 мкМ гексамеров со случайной последовательностью. Денатурацию и отжиг проводили прогреванием при 95 в течение 1 мин с последующем охлаждением до комнатной температуры в течение 30 мин. Затем к 10 мл реакционной смеси, содержащей отожженные ДНК/праймер, добавляли 10 мкл реакционного буфера [35 мМ Tris-HCl, 50 мМ KCl, 14 мМ MgCl2, 10 мМ (NH4)2SO4, 4 мМ DTT, 10 Ед. phi29,0,002 Ед. PPi (неорганической пирофосфатазы из дрожжей), 1 мМ dNTPs]. Реакционную смесь объемом 20 мкл инкубировали при 30 С в течение 18 ч. Образец разделяли электрофорезом в геле для проверки образования конкатемеров и затем реакционную смесь расщепляли ферментом рестрикции или TelN для проверки продуктов. Конкатемерную ДНК, амплифицированную с помощью RCA, затем инкубировали с TelN. ОбычноRCA-амплифицированный ДНК-субстрат разводили в воде и 10 буфере для TelN до конечного объема 20 мкл. Результаты для pUC18 telRL показаны на фиг. 6 А. Как видно из дорожки 1 геля, нерасщепленная конкатемерная амплифицированная ДНК образует ячеистую структуру, которая не входит в гель. Однако TelN была способна расщепить RCA-материал,приводя в результате к высвобождению фрагмента размером 2,7 т.п.о. в форме "собачьей косточки" (дорожка 6). Подтверждение, что ДНК, амплифицированная с помощью RCA, была исходной матрицей,используемой в реакции, получали рестрикцией с помощью PvuI (дорожки 2 и 5). pUC18 (без telRL) служила в качестве отрицательного контроля для активности TelN (дорожка 3). Аналогичным образом, в других экспериментах полученные с помощью RCA конкатемеры pGLDOG также расщепляли TelN. Соответственно было показано, что способ по изобретению является эффективным для амплификации закрытой линейной ДНК на исходной матрице. Кроме того, возможно амплифицировать закрытую линейную ДНК простым способом, используя последовательные стадии с участием RCA-полимеразы и протеломеразы без необходимости промежуточной очистки амплифицированной ДНК. Пример 5. Экспрессия амплифицированной закрытой линейной ДНК. Для исследования экспрессии репортерного гена люциферазы из закрытой линейной ДНК в форме"собачьей косточки", полученной по изобретению, были проведены эксперименты по трансфекции с использованием клеток линии HeLa. В качестве контроля использовали ковалентно закрытую кольцевую ДНК и линейный контрольный фрагмент PCR DOG. Трансфекцию проводили при конфлюэнтности клеток 60% в лунках диаметром 20 мм в среде RPMI с использованием реагента Transfectam (Promega) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для каждой трансфекции использовали 400 нг ДНК-конструкции. Эффективность трансфекции нормализовали в пределах одного эксперимента и между экспериментами, включая в каждую трансфекцию внутренний контроль, 40 нг плазмиды pGL4.73, экспрессирующей люциферазу Renilla (содержащей ген hRluc изRenilla reniformis). Активность люциферазы светлячка (фермент, отвечающий за люминесценцию насекомых Photinus pyralis) и люциферазы Renilla измеряли последовательно, используя набор DualLuciferase Reporter (DLR) Assay System (Promega). Относительные единицы свечения измеряли, используя люминометр GloMax Multi Luminometer (Promega) и результаты выражали как соотношение интенсивности свечения люциферазы светлячка к люциферазе Renilla. Все эксперименты проводили в трех повторах. В трансфекционных экспериментах тестировали следующие конструкции: Контрольная ДНК pGL4.13 luc"Собачья косточка", мини-преп (pGL-DOG, выделенная с помощью набора для мини-выделений ДНК (мини-препа), расщепленная PvuI (для удаления контаминирующей векторной ДНК) с последующим расщеплением TelN).RCA pGL DOG (конкатемерная ДНК, полученная в результате исходной RCA-амплификации плазмиды pGL DOG). Результаты показаны на фиг. 6C. Было показано, что закрытая линейная ДНК, включая ту, что была амплифицирована с помощью RCA, экспрессирует люциферазу на более высоком уровне относительно открытых линейных ПЦР-конструкций. Это демонстрирует, что закрытую линейную ДНК, полученную по изобретению, можно использовать для успешной экспрессии люциферазы при введении в клетки млекопитающих. Последовательности по изобретению Таблица А ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Бесклеточный способ получения закрытой линейной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) in(a) приведение ДНК-матрицы, содержащей по меньшей мере одну протеломеразную последовательность-мишень, в контакт по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой, в присутствии одного или нескольких праймеров в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы; и(b) приведение амплифицированной ДНК, полученной в (а), в контакт по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих получению закрытой линейной ДНК. 2. Способ по п.1, в котором указанную ДНК-матрицу инкубируют в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы путем вытеснения реплицированных цепей посредством репликации другой цепи по типу вытеснения цепи, необязательно, в котором амплификацию указанной матрицы проводят с помощью амплификации по типу катящегося кольца (RCA). 3. Способ по п.1 или 2, в котором:(a) указанные праймеры являются праймерами со случайной последовательностью; и/или(b) указанная ДНК-полимераза представляет собой phi29 с последовательностью SEQ ID NO: 2 или ее вариант и/или указанная протеломераза представляет собой TelN бактериофага N15 с последовательностью SEQ ID NO: 15 или ее вариант; и/или(c) амплифицированная ДНК, полученная в (а), содержит конкатемеры, включающие тандемные единицы последовательности ДНК, амплифицированные с указанной ДНК-матрицы,необязательно, в котором указанные конкатемеры разделяют на одиночные единицы амплифицированной последовательности ДНК с помощью указанной протеломеразы. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанная протеломеразная последовательность-мишень содержит ДНК-последовательность совершенного инвертированного повтора. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором:(а) указанная ДНК-матрица представляет собой закрытую кольцевую ДНК или(b) указанная ДНК-матрица представляет собой закрытую линейную ДНК,предпочтительно в котором указанную ДНК-матрицу инкубируют при денатурирующих условиях для образования закрытой кольцевой ДНК. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанная ДНК-матрица содержит экспрессионную кассету, содержащую эукариотический промотор, функционально соединенный с представляющей интерес кодирующей последовательностью, и, необязательно, эукариотической последовательностью терминации транскрипции; в котором указанная представляющая интерес кодирующая последовательность, необязательно, представляет собой кодирующую последовательность человека или кодирующую последовательность из патогена, инфицирующего человека, и, необязательно, в котором указанная экспрессионная кассета фланкирована с каждой стороны последовательностью-мишенью протеломеразы, причем предпочтительно указанный способ служит для получения закрытой линейной экспрессионной ДНК-кассеты. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором:(I) указанный способ дополнительно включает очистку закрытой линейной ДНК, полученной в (b); и/или(a) приведение одноцепочечной указанной ДНК-матрицы, имеющей последовательность-мишень протеломеразы, которая расщепляется и повторно соединяется протеломеразой TelN с последовательностью SEQ ID NO: 15, в контакт с ДНК-полимеразой phi29 с последовательностью SEQ ID NO: 2 или ее вариантом при температуре от примерно 25 до примерно 35 С в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы с помощью указанной ДНК-полимеразы; и(b) приведение конкатемеров, полученных на стадии (а), в контакт с указанной протеломеразойTelN или ее вариантом при температуре от примерно 25 до примерно 35 С в условиях, способствующих активности указанной протеломеразы; необязательно, в котором указанная последовательность-мишень протеломеразы включает последовательность SEQ ID NO: 25 или ее вариант. 8. Бесклеточный способ получения фармацевтической композиции, содержащей закрытую линейную молекулу ДНК, включающий:(a) приведение ДНК-матрицы, содержащей по меньшей мере одну протеломеразную последовательность-мишень, в контакт по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой в присутствии одного или более праймеров в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы;(b) приведение амплифицированной ДНК, полученной в (а), в контакт по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих получению закрытой линейной ДНК; и(c) введение полученной закрытой линейной ДНК в состав с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. 9. Набор, содержащий по меньшей мере одну ДНК-полимеразу и по меньшей мере одну протеломе- 28021069 разу и, необязательно, инструкции по применению в способе по любому одному из предшествующих пунктов. 10. Способ индукции иммунного ответа против антигена в организме хозяина, причем способ включает осуществление способа по любому из пп.1-8 с использованием указанной ДНК-матрицы, кодирующей указанный антиген, и введение полученной закрытой линейной ДНК, кодирующей указанный антиген, указанному хозяину так, что указанный антиген экспрессируется в указанном хозяине и вызывает иммунный ответ против указанного антигена.